タンパク質生産速度の変更方法
タンパク質、例えば抗体の細胞分泌速度を改変する方法およびこの方法によって作成される改変細胞が開示される。この方法および改変細胞は、治療、診断または研究目的のための高レベルのタンパク質を生産するために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の細胞分泌速度の変更方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、例えば抗体の大規模生産は、典型的には、培養される生産細胞系からのタンパク質の分泌に依存する。培養細胞によって生産される分泌タンパク質は、周囲の細胞培養培地から容易に回収かつ精製することができる。
【０００３】
タンパク質の細胞分泌速度は、バイオリアクターまたは他のシステムからの分泌タンパク質の生産および精製に影響を与える重要なファクターである。一般に、より高い精製タンパク質の収量は、細胞分泌速度が比較的高い場合に達成することができる。反対に、細胞分泌速度が低すぎる場合は、タンパク質精製は実行不可能であろう。
【０００４】
低分泌性細胞の問題を回避する１つのアプローチは、低分泌性細胞の集団から高分泌性のサブクローン細胞を単離することであった。典型的には、これは、高分泌性細胞系の連続希釈、スクリーニングおよび選択を限定するという数回の、かつ労力集中的なラウンドを必要とする。あるいはまた、新しい細胞系が高分泌系であろうという希望において、問題のタンパク質を生産する完全に新しい細胞系が生成される。
【０００５】
高分泌性細胞系を生成する従来の各アプローチは限界を有する。例えば、低分泌性細胞の集団からサブクローニングによって高分泌性細胞系を同定することは、集団における高分泌性細胞が相対的に希少であること、ならびにいずれかの高分泌性細胞の同定に要求される広大な量の時間と労力によって制約される。
【０００６】
さらに、問題の抗体またはタンパク質を生産する新しい細胞系の生成は、新しい細胞系が高分泌性ではない可能性、ならびに抗体産生細胞を再生し、そして高分泌性細胞を同定するために要求される多大な量の努力によって制約される。若干の例では、低下した分泌速度をもたらす細胞の小胞体（ＥＲ）内でのタンパク質のミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）により、低分泌性細胞系のみが得られることもある。
【０００７】
かくして、タンパク質の細胞分泌速度を変化させる有効な方法への要求が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の１つの態様は、細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し；そして細胞を培養する段階を含んでなる、タンパク質の細胞分泌速度の変更方法である。
【０００９】
本発明のその他の態様は、細胞において少なくとも１種のアンフォールド型（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質応答（ＵＰＲ）経路構成要素の活性を調節し；そして細胞を培養する段階を含んでなる、タンパク質の細胞分泌速度を改変することによって生成される、変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞である。
【００１０】
本発明のその他の態様は、細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し、そして細胞を培養することによって生成される、変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞を含有するトランスジェニック動物である。
【００１１】
本発明のその他の態様は、配列番号：１５または配列番号：１６において示される配列
を有する単離された核酸である。
【００１２】
限定されるものではないが、本明細書において引用される特許および特許出願を含む、すべての公表物は、完全な記述をとおして引用によって本明細書に組み入れられている。
【００１３】
本明細書で使用されるところの用語「抗体」は、広範な意味において意味され、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体および抗体フラグメントまたは変異体を含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。抗体は形質細胞によって構成的に発現され、そして分泌される分泌タンパク質である。また抗体は、標準的方法、例えばハイブリドーマ生成によるか、または不死化されたＢ細胞、例えば骨髄腫細胞または他の細胞種、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞への抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子のトランスフェクションによって、不死化された形質細胞を用いて生産することができる。
【００１４】
抗体フラグメントまたは変異体は、ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント、重鎖フラグメント、軽鎖フラグメント、および少なくとも１種の抗体ペプチド鎖の一部を含有する分子を含む。そのような部分は、抗体の可変、ヒンジもしくは定常部ペプチド鎖に対応してもよい。
【００１５】
本明細書で使用されるような用語「ミメティボディ」は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１（ｎ）−Ｐｅｐ（ｎ）−Ｆｌｅｘ（ｎ）−Ｖ２（ｎ）−ｐＨｉｎｇｅ（ｎ）−ＣＨ２（ｎ）−ＣＨ３（ｎ））（ｍ） （Ｉ）
［式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変部のＮ末端の少なくとも１部分であり、Ｐｅｐはエピトープに結合する少なくとも１種の生物活性ペプチドであり、Ｆｌｅｘは、ミメティボディをもう一方の方向づけと結合特性をもつようにさせることによって構造的柔軟性を与えるポリペプチドであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の少なくとも１部分であり、ｐＨｉｎｇｅは免疫グロブリンヒンジ部の少なくとも１部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常部の少なくとも１部分であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常部の少なくとも１部分であり、ここでｎおよびｍは整数１〜１０であってもよい］
を有するタンパク質を意味する。ミメティボディは、構築物に存在する重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような免疫グロブリン分子の異なるタイプの特性および機能を模倣できる。
【００１６】
本明細書で使用されるところの用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異性であり、典型的には単一な抗原決定基に対向される。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えば、マウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）のハイブリドーマ法によって作成することができる。アクセプター抗体（典型的には、ヒトのようなその他の哺乳動物種）由来の軽鎖および重鎖定常部に関連してドナー抗体（典型的には、マウス）由来の軽鎖および重鎖可変部を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示された方法によって調製されてもよい。非ヒト・ドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）由来のＣＤＲおよび場合によっては結合親和力を維持するように改変されたフレームワーク・サポート残基を有する１種以上の免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来の部分を有する、ヒト化ｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：１００２９−１００３２，（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，（１９９１）において開示された技術によって得ることができる。
【００１７】
いずれの非ヒト配列も欠く完全にヒトのｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１，（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６，（１９９７）において引用される技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製されてもよい。ヒトｍＡｂはまた、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，（２０００）およびＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４，（２００１）において引用される技術によってファージ・ディスプレイライブラリーから調製され、そして最適化されてもよい。
【００１８】
本明細書で使用されるところの用語「細胞分泌速度」は、細胞が特定のタンパク質を分泌する速度を意味する。そのような速度は、時間の変化当たりの培養培地中に存在するタンパク質の量における変化として記述されてもよく、または細胞数に標準化され、そして単位「ｐｇ／細胞／日」で表されてもよい。
【００１９】
本明細書で使用されるところの用語「短い干渉性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」は、標的遺伝子転写物の切断を媒介する核酸配列を意味する。短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖でもまたは短いヘアピン型であってもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡは、２本の個々の、逆平行の、アニールされたＲＮＡ鎖または両ＲＮＡおよびＤＮＡを含有するアニールされた核酸鎖（例えば、５’−ＴＴＴＴＵＵＵＵ−３’にアニールされた５’−ＴＴＴＴＵＵＵＵ−３’または５’−ＵＵＵＵ−３’にアニールされた５’−ＴＴＴＴ−３’）からなってもよい。短いヘアピン型のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとして有効なステム・ループ構造または他の二次構造を形成することができる単一ＲＮＡ鎖または単一ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖からなってもよい。当業者は、ｓｉＲＮＡが、他の改変体、例えばヌクレオシド類似体、バックボーン改変体、および改変ｓｉＲＮＡ核酸に標的遺伝子転写物の切断をなお媒介させる他の改変体を含んでもよいことを認識している。
【００２０】
本明細書で使用されるところの用語「低分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、アミノ酸残基または核酸残基のみからはならない２４，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量をもつ化合物を意味する。
【００２１】
本明細書で使用されるところの用語「転写制御配列」は、遺伝子の転写に必要である核酸配列または遺伝子の転写を増大または減少させる核酸配列を意味する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの用語「ＵＰＲ経路構成要素」は、ＵＰＲ経路を介するシグナル伝達を媒介するか、またはＵＰＲを活性化する、ペプチド鎖または核酸配列、例えば転写制御配列を意味する。
【００２３】
本発明は、細胞によるタンパク質の細胞分泌速度を改変するために有用な方法を提供する。本発明の方法の代表的使用は、治療、診断または研究目的に有用であるタンパク質、例えば抗体のための分泌速度の増進である。
【００２４】
細胞系における低いタンパク質分泌速度は、ＵＰＲを介して分泌過程を減速または停止する、細胞ＥＲにおけるミスフォールド（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の蓄積によって惹起できる。ＥＲ膜におけるストレス感受性タンパク質は、アンフォールド型タンパク質の過剰を検出し、そしてＵＰＲの引き金を引く。続いて、複雑なシグナル伝達カスケードを介して、シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）タンパク質Ｂｉｐおよび転写因子ＸＢＰ
−１およびＣＨＯＰが上方調節される。
【００２５】
シャペロンタンパク質はアンフォールド型タンパク質に結合し、そして正確な折り畳みを助ける。転写因子ＣＨＯＰは、一般に細胞増殖、分化および生存のネガティブレギュレーターとされる。ＣＨＯＰの上方調節は細胞周期の停止を惹起し、その結果、ＵＰＲ誘導に関与する好ましくない条件に対抗する時間を細胞に与えることが観察された。
【００２６】
転写因子ＸＢＰ−１は、形質細胞、大量の免疫グロブリンを分泌する分化したＢリンパ球を生成するために要求される。形質細胞は変化されたＵＰＲを現し、ここでは免疫グロブリン合成の前に若干のＵＰＲ遺伝子の上方調節が起きる。これらは、ＸＢＰ−１、Ｂｉｐ、Ｇｒｐ９４およびｐ５０ＡＴＦ６αを含み、そしてそれらの上方調節は形質細胞の分化と適当な分泌のために必須である。（Ｇａｓｓ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７，４９０４７−４９０５４（２００２））。これに対して、ＣＨＯＰはこの推移において上方調節されず、このことは異なる種類のＵＰＲを示唆している。これらの分子の上方調節は、細胞タンパク質分泌速度における増大またはアポトーシスのいずれかを惹起する有利または有害な効果を有する。参照、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１２１１−１２３３（１９９９）およびＣｕｄｎａ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１，５６−６５（２００３）。 本発明の方法では、タンパク質の細胞分泌速度は、細胞における少なくとも１個のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し、そして細胞を培養することによって改変される。本発明の方法は、抗体のようなタンパク質の細胞分泌速度の増大または減少に備える。
【００２７】
本発明の実施態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸により細胞を安定してトラスフェクトすることによって増大される。ＵＰＲ経路構成要素は、ポリペプチドまたは核酸配列、例えば転写制御配列であってもよく、これらはＵＰＲ経路をとおしてシグナル伝達を媒介するか、またはＵＰＲを活性化する。ＵＰＲ経路構成要素の例は、Ｂｉｐ、ＸＢＰおよびＣＨＯＰならびに類似の活性を有する変異体を含む。ＵＰＲ経路構成要素の他の例は、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、シャペロン、および類似の活性を有する変異体を含む（参照、例えば、Ｃｕｄｎａ ａｎｄ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１，５６−６５（２００２））。転写制御配列の例は、シス作用ＵＰＲ要素（ＵＰＲＥ）および種々のＵＰＲ遺伝子のプロモーター中に同定されたＥＲＳＥである。当業者は他のＵＰＲ経路構成要素および転写制御配列も認識できるであろう。ＵＰＲ経路構成要素は、配列番号：２（マウスＢｉｐ）、配列番号：４（マウスＸＢＰ−１、スプライスされた形態）、配列番号：６（マウスＸＢＰ−１、スプライスされてない形態）、配列番号：８（マウスＣＨＯＰ−１０）、配列番号：１０（ヒトＢｉｐ）、配列番号：１２（ヒトＸＢＰ−１）または配列番号：１４（ヒトＣＨＯＰ−１０）において示されるアミノ酸配列を有してもよい。ＵＰＲ経路構成要素核酸は、配列番号：１（マウスＢｉｐ ｍＲＮＡ）、配列番号：３（マウスＸＢＰ−１、スプライスされた形態 ｍＲＮＡ）、配列番号：５（マウスＸＢＰ−１、スプライスされてない形態，ｍＲＮＡ）、配列番号：７（マウスＣＨＯＰ−１０ ｍＲＮＡ）、配列番号：９（ヒトＢｉｐ ｍＲＮＡ）、配列番号：１１（ヒトＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ）、配列番号：１３（ヒトＣＨＯＰ−１０ ｍＲＮＡ）において示される配列を有してもよい。
【００２８】
親分子に類似の活性を有するこれらの配列のバリアントもまた、本発明の方法において有用であろう。例えば、親分子に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異分子は類似の活性を有することが期待できる。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントは、フィルタリングをターンオフ（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）し、そしてすべて他のデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）セッティングを変化しないＢＲＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定することができる。ポリペプチドの種々のイソ型、ポリペプチドの優性なネガティブバージョン、またはポリペプチドの共有的に改変された形態物は、親分子のバリアントの若干の例である。
【００２９】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度はＵＰＲ経路構成要素の発現を減少させることによって減少できる。ＵＰＲ経路構成要素、例えばＢｉｐまたはＣＨＯＰのような遺伝子の発現は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子またはアンチセンス分子による細胞の によって減少できる。
【００３０】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、低分子の投与をとおしてＵＰＲ経路構成要素を調節することによって増大される。低分子の例は、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ＵＰＲ誘導剤である（Ｌｉｔｔｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６，１７０６７−１７０７１（１９９１））。そのような低分子の他の例は、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｓｉｎ）およびリポ多糖を含む。
【００３１】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、細胞を静止増殖期に置くことによって増大される。細胞は栄養利用度を制限するか、細胞の老廃物を蓄積させるか、または細胞培養培地のｐＨを変化させることによって静止増殖期に置かれてもよい。当業者はまた、静止増殖期に細胞を置く他の方法を認識できる。
【００３２】
本発明の方法において、代表的な細胞は、形質細胞、すなわち、抗体を分泌する分化したＢ細胞である。形質細胞はマウス、ヒトまたは他の動物起源から単離されてもよい。典型的には、形質細胞は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスによるウイルス感染のような標準技術か、または例えば、放射線学的もしくは化学的変異誘発のような他の方法によって不死化された。不死化される形質細胞はまたがん性であってもよく、そして鉱油またはその他の化合物を動物の腹腔内に注射することによって得られてもよい。
【００３３】
本発明の１つの態様では、不死化される融合パートナーは、「骨髄腫細胞」として当該技術分野において既知であるものである。骨髄腫は、一般に、多発性骨髄腫、骨髄がんを罹患している生物体から得られる不死化融合パートナーと脾臓細胞の融合により形成される。生物体は鳥類、魚類、爬虫類、哺乳類および他の動物であってもよい。骨髄腫細胞系の例は、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）、およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）細胞系を含み、これらはマウスから得られた。ヒトから得られる骨髄腫細胞系の例は、Ｕ２６６細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。当業者は他の骨髄腫細胞系も認識することができる。
【００３４】
本発明の１つの態様では、骨髄腫細胞はＤＮＡ分子により安定してトランスフェクトされる。安定してトランスフェクトされる骨髄腫細胞は、当業者には周知のトランスフェクション、スクリーニングおよび選択の方法によって作成されてもよい。細胞を安定してトランスフェクトするために使用されるＤＮＡは、骨髄腫細胞中に任意に組み込まれてもよく、また部位特異的方式で組み込まれてもよい。そのようなＤＮＡ配列はＵＰＲ経路構成要素をコードしていてもよい。あるいはまた、安定してトランスフェクトされた核酸配列は、挿入により不活性化してもよく、またＵＰＲ構成要素、例えばＵＰＲ遺伝子または転写制御配列を欠失してもよい。
【００３５】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸配列により細
胞を安定してトランスフェクトすることによって増大される。そのようなｓｉＲＮＡは、ＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的としてもよい。代表的なＣＨＯＰタンパク質は、配列番号：８または配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を有するものである。マウスＣＨＯＰ−１０をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸配列による安定なトランスフェクションが有用である。代表的なマウスＣＨＯＰ−１０遺伝子転写物特異的ｓｉＲＮＡは、配列番号：１５または配列番号：１６において示されるヌクレオチド配列を含有する。当業者は、ＵＰＲ遺伝子転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている他の核酸を認識できる。
【００３６】
本発明の方法において有用な他の細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、昆虫細胞および植物細胞を含む。
【００３７】
本発明のその他の態様では、非トランスジェニック動物に較べて上昇したレベルにおいてＵＰＲタンパク質を構成的または誘導的に発現するトランスジェニック動物が作成できる。トランスジェニック動物を作成する技術は当該技術分野において既知である。
【００３８】
本発明の方法では、細胞が培養される。細胞は懸濁液において、または付着培養物として培養されてもよい。細胞は、例えば、バイオリアクター、細胞バッグ（ｂａｇ）、培養プレート、フラスコおよび当業者には周知の他の容器を含む、種々の容器において培養されてもよい。細胞は化学的に定義された培地調合物を含むすべての適当な培地において培養されてもよい。細胞培養に適当な周囲条件、例えば温度および雰囲気組成は、また当業者には周知である。細胞の培養方法もまた当業者には周知である。
【００３９】
また本発明は、本発明の方法によって生成される変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞を提供する。形質細胞は、短い干渉ＲＮＡをコードしている安定してトランスフェクトされた核酸により、ＵＰＲ経路構成要素の活性を調節することによって生成されてもよい。ｓｉＲＮＡは、ＣＨＯＰタンパク質のようなＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的としてもよい。提供される形質細胞は、例えば、Ｃ２−８またはＣ２−１８細胞のようなＳＰ２／０由来の細胞であってもよい。そのような形質細胞は精製されるべき抗体または他のポリペプチドを分泌するであろう。
【００４０】
本発明は、次に示す特定の、限定されない実施例に関連してここに記述できる。
【実施例１】
【００４１】
高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、低い速度で同一ｍＡｂを分泌する細胞系と比較されてＵＰＲ遺伝子転写物のレベルについて解析された。試験された細胞系は高分泌系Ｃ５０５Ｂ、Ｃ５０５ＣおよびＣ５０５Ｄを含んだ。試験された低分泌系はＣ５０５Ａ系およびＳＰ２／０、Ｃ５０５Ａ，Ｂ，ＣおよびＤの親の骨髄腫細胞系であった。これらの系統のすべてが、αｖ−インテグリンに対して特異的なヒトＩｇＧ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖をコードしているＤＮＡによりトランスフェクトされた。Ｃ５０５Ｂ、Ｃ５０５ＣおよびＣ５０５Ｄ細胞系は、ｍＡｂ分泌の高い速度に関して、連続してサブクローニング、スクリーニングおよび選択によって同定された。
【００４２】
抗体分泌速度は、細胞培養培地中に２４時間の間に分泌されたｍＡｂの量を測定し、そして生存細胞数をカウントして、「ｐｇ／生存細胞／日」の単位をもつ細胞分泌速度を生成することによって決定された。Ｃ５０５Ａ細胞系は、５〜７ｐｇ／生存細胞／日の低速度で抗体を分泌し、これは約５〜１０μｇ／ｍＬ／７日の濃度に相当する。Ｃ５０５Ｂ系は、約１５ｐｇ／生存細胞／日の速度で抗体を生産し、Ｃ５０５Ｃは、約１３ｐｇ／生存細胞／日の速度で生産し、そしてＣ５０５Ｄは、約１５ｐｇ／生存細胞／日の速度で生産
する。
【００４３】
全ｍＡｂ分泌性細胞系および親骨髄腫細胞系は、５％ＣＯ２の雰囲気中で、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸塩を含有するＩＭＤＭ培地中３７℃における懸濁液において培養された。ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌおよびキサンチン５０ｍｇ／Ｌを含有する１ＸＭＨＸ選択培地もまた培地には存在した。
【００４４】
高発現細胞系と低発現細胞系との間のＵＰＲ遺伝子転写物レベルにおける差異は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により調査された。細胞は対数増殖期まで増殖され、そして総ＲＮＡがＲＮＥａｓｙＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲは標準の２段階反応を用いて実施された。ｃＤＮＡ合成段階は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびランダムヘキサマープライマーを用い、製造者によって特定された反応条件を用いて実施された。次いで、ＴａｑｍａｎＴＭＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が、製造者による特定されるように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７０００ＨＴまたは７９００ＨＴ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって実施された。ＲＮＡ ５，０００ｐｇが各Ｑ−ＰＣＲ反応において使用された。Ｑ−ＰＣＲのために使用されるＢｉｐ，ＣＨＯＰおよびＸＢＰ特異的プライマーおよびプローブ組み合わせ物は、Ｐｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して設計された。ｃＤＮＡレベルは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ハウスキーピング遺伝子の転写物レベルに対して標準化され、次いで、適当な親細胞系のｃＤＮＡ／ＧＡＰＤＨ転写物値に対して標準化された。ＰＣＲの初期対数期におけるデータの収集および転写物の定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ＨＴまたは７９００ＨＴ機器および関連するソフトウエアを用いて実施された。
【００４５】
結果は図１において示され、そしてＢｉｐおよびＸＢＰ−１ ＵＰＲ遺伝子転写物レベルは、低分泌性細胞におけるよりも高分泌性細胞系において約３〜４倍大きかったことを表している。ＣＨＯＰレベルにおける相違はほとんど断定されなかった。
【実施例２】
【００４６】
静止増殖期の細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルおよび抗体分泌速度
静止増殖期の細胞が、対数増殖期の細胞に比較して、ＵＰＲ遺伝子転写物レベルおよびｍＡｂ分泌速度について解析された。Ｃ１６８Ｊ細胞系は、ＳＰ２／０親骨髄腫細胞系由来のトランスフェクトーマであり、そして２５〜３０ｐｇ／細胞／日の速度でＩｇＧ１ ｍＡｂを分泌する。Ｃ５０５Ａは実施例１において既に記述されたとおりである。
【００４７】
Ｃ５０５Ａ、Ｃ１６８ＪおよびＳＰ２／０細胞系のＩｇＧ１ ｍＡｂ分泌速度は、実施例１で記述されたように、Ｔ−７５またはＴ−１５０フラスコにおいて５ｘ１０６細胞を接種、培養することによって調査された。３日後、細胞は対数増殖期にあり、そして６日目に細胞は静止増殖期にあった。総細胞数および生存細胞数が両増殖期の細胞について決定された。両増殖期の細胞からの培養培地が、標準の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってヒトＩｇＧについてアッセイされた。Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１に特異的なＱ−ＰＣＲが、先の実施例１に記述されたように、対数および静止増殖期細胞について実施された。
【００４８】
表１に示される結果は、Ｃ５０５ＡおよびＣ１６８Ｊ系がＩｇＧ１ ｍＡｂ分泌速度を増大したことを例証している（表１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】
さらに、図２に示される結果は、対数期増殖に比較して、発育停止期増殖のＣ５０５Ａ、Ｃ１６８ＪおよびＳＰ２／０において増大したＵＰＲ遺伝子転写物レベルを例証している。
【実施例３】
【００５１】
親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
ＳＰ２／０、ＮＳＯ、ＦＯおよびＡｇ６５３親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルが試験されて、高分泌性細胞系が、より高いレベルのＵＰＲ遺伝子を含有するか否か決定された。ＳＰ２／０、ＮＳＯ、ＦＯおよびＡｇ６５３細胞は、先の実施例１で記述されたように、対数増殖期まで増殖され、総ＲＮＡが５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲおよび解析もまた実施例１に記述されたように実施された。図３に示される結果は、試験された全細胞において匹敵するＢｉｐおよびＣＨＯＰ転写物レベルを示している。しかしながら、ＸＢＰ−１転写物レベルは、試験された他の細胞タイプに比較してＦＯおよびＮＳＯ細胞において上昇していた。
【実施例４】
【００５２】
高分泌性細胞系および親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、それらの親の細胞系と比較されてＵＰＲ遺伝子転写物のレベルについて解析された。図４〜６に示される細胞系が、先の実施例１で記述されたように、対数増殖期まで増殖され、そして総ＲＮＡが５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲおよび解析もまた実施例１に記述されたように実施された。
【００５３】
図４〜６に示される結果は、高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、それらのＳＰ２／０、ＦＯおよびＡｇ６５３親骨髄腫細胞系に較べて、より高いＵＰＲ遺伝子転写物レベルを有することを示している。これらの結果は、増大されたＵＰＲ遺伝子発現が、使用された親骨髄腫細胞系の同一性とは無関係に、増大された抗体分泌速度と共役されて、高分泌性細胞を生成することを示唆している。
【実施例５】
【００５４】
ＵＰＲ誘導後のＵＰＲタンパク質の発現
低分泌性細胞および親骨髄腫細胞系に較べて高分泌性細胞におけるＵＰＲタンパク質の発現が、薬理学的作用物タプシガルギンによるＵＰＲ誘導後に解析された。タプシガルギンは、筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプを遮断し、そしてＥＲ内腔におけるカルシウム枯渇をもたらすＡＴＰアーゼ阻害剤である。
【００５５】
細胞はタプシガルギンの１００ｎＭで処理され、そしてＸＢＰ−１およびＣＨＯＰに特異的なウエスタン・ブロットが調製された。細胞は、放射線免疫沈降（ＲＩＰＡ）溶解バ
ッファー（１ｘＰＢＳ，１％Ｎ−Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、およびＲｏｃｈｅ製プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１８３６１５３））において定められた時点で溶解され、そして清澄溶解液におけるタンパク質濃度が、標準のビシンコニニック・アシド（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｂ９６４３）を用いて定量された。ウエスタン・ブロットでは、各溶解物２０μｇが標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開され、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランに転移され、そしてＸＢＰ−１またはＣＨＯＰに特異的な抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）によりプローブされた。
【００５６】
結果（未掲示）は、高分泌性細胞におけるＵＰＲタンパク質が、低分泌性細胞および親骨髄腫細胞系に較べて高レベルで発現されることを示した。ＸＢＰ−１に特異的なウエスタン・ブロットは、ＸＢＰ−１タンパク質発現が、タプシガルギン処理された高分泌性Ｃ１６８ｊ細胞において強く誘導されることを示している。このＸＢＰ−１発現の誘導は、ＵＰＲの薬理学的誘導７時間後にもっとも明確であり、そして処置後２時間くらいの初期に見ることができる。ＣＨＯＰに特異的なウエスタン・ブロットは、ＣＨＯＰタンパク質発現が、タプシガルギン処理された高分泌性Ｃ１６８ｊ細胞において強く誘導されることを示している。ＣＨＯＰは２時間目に最初に出現し、４〜７時間に最大に発現され、そして２２時間では非常に低下される。
【実施例６】
【００５７】
ＵＰＲタンパク質発現レベルの増大
細胞は、ＢｉｐおよびＸＢＰ−１発現ベクターを用い、これらのＵＰＲタンパク質の細胞発現レベルを高めることを試みて一過性にトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）細胞が、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で付着培養物として増殖され、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸塩を含有するＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｂｅｌｃｃｏの最小必須培地（ＩＭＤＭ）培地において培養された。ＸＢＰ−１イソ型１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０２７９６３）、ＸＢＰ−１イソ型２（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ４４３１９２）またはＢｉｐをコードしているｃＤＮＡが、標準的方法を用いて一過性トランスフェクション実験のために有用なベクター中にサブクローン化された。ベクターはＣＭＶプロモーターの制御下でＺｓＧｒｅｅｎ１タンパク質を発現し、かつＣＭＶプロモーターの制御下でさらなるコーディング領域の導入のための多数のクローニング部位を有する。カナマイシン耐性遺伝子は細菌の選択のために使用された。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞が、いずれかトランスフェクトされずに残されるか、あるいは空のベクターのみ、ＸＢＰ−１イソ型１発現ベクター、ＸＢＰ−１イソ型２発現ベクターまたはＢｉｐ発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションは、製造者によって指示されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて実施された。トランスフェクション後４８時間に、細胞はＲＩＰＡ溶解バッファーにおいて溶解され、そして清澄溶解液の等しい細胞当量がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷された。次いで、ウエスタンブロットが調製され、先の実施例５に記述されたようにプローブされた。次いでブロットが除去され、アクチン特異抗体で再プローブされて各列に負荷された同じタンパク質を確認した。
【００５８】
結果（未掲示）は、ＸＢＰ−１イソ型１（「ＸＢＰ−１」を標識された列）およびＸＢＰ−１イソ型２（「Ｘ５４｝を標識された列）発現レベルが、これらのＸＢＰ−１イソ型をコードしている発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた細胞において上昇されたことを例証した。さらに、データ（未掲示）は、Ｂｉｐ発現レベルが、Ｂｉｐをコードしている発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた細胞において上昇され、そしてトランスフェクトされずに残されたか、または空のベクターのみでトランスフェクトされた細胞では、Ｂｉｐ発現が検出されなかったことを示した。
【実施例７】
【００５９】
抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルの影響
抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルの影響が解析された。Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１遺伝子転写物を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、Ａｍｂｉｏｎのインターネットに基づくｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を用いて設計され、そしてＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＴＸ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１１６２０）を用いて合成された。２種のｓｉＲＮＡが各標的転写物のために設計された。標準条件下で培養された３ｘ１０６Ｃ１６８Ｊ細胞が、図１０に示されるようなこれらの各二本鎖ｓｉＲＮＡの３μｇを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた。エレクトロポレートされた細胞は、先の実施例１に記述されたようにＩＭＤＭ培地２ｍｌに懸濁され、次いで、Ｔ−１２プレートにおいて培養された。生存細胞濃度は８日後に測定された。またＩｇＧ１ｍＡｂ濃度も、標準比濁分析技術を用いて８日後に測定された。
【００６０】
図７における結果は、抗体分泌速度が、抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルを改変することによって調節できることを示している。ＲＮＡ転写物からＵＰＲ遺伝子Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１イソ型の発現を妨げることが可能な短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による高分泌性Ｃ１６８Ｊ細胞のトランスフェクションは、Ｃ１６８Ｊ細胞のＩｇＧ１分泌速度を減少させた。
【実施例８】
【００６１】
ＵＰＲ遺伝子転写物および発現レベルを増大することによる抗体分泌速度の増大
ＵＰＲタンパク質の過剰発現が、細胞によるｍＡｂのようなタンパク質の分泌速度を増大できる。タンパク質分泌性細胞系、例えばｍＡｂ分泌性細胞系は、Ｂｉｐ、ＣＨＯＰ、ＸＢＰ−１および他のＵＰＲ関連のタンパク質をコードしている発現ベクターによりトランスフェクトされて、これらのタンパク質の過剰発現に影響を与えられた。細胞が、単独でも、また組み合わせてもこれらの発現ベクターを用いてトランスフェクトされる。適当なタンパク質分泌速度、例えば抗体分泌速度は、標準技術を用いてトランスフェクション後２、４および６日目に決定された。トランスフェクトされた細胞におけるタンパク質分泌速度が、トランスフェクトされない対照細胞の分泌速度に比較された。タンパク質分泌速度は、１種以上のＵＰＲタンパク質を過剰発現する細胞において、より高いことが期待される。ＢｉｐまたはＸＢＰ−１の構成的な過剰発現が、最終的にこれらの細胞においてアポトーシスを誘導する事象では、これらの遺伝子が、誘導プロモーターの下流に置かれ、そして必要な場合にのみ活性化されてもよい。
【実施例９】
【００６２】
ＣＨＯＰ−１０エンコ−ディングｓｉＲＮＡにより安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞における抗体分泌速度の増大
ＣＨＯＰ−１０に特異的なｓｉＲＮＡを生産するＤＮＡ構築物によるＣ４６５Ａ骨髄腫細胞の安定なトランスフェクションは、抗体分泌速度を増大した（図８）。ＣＨＯＰ−１０遺伝子転写物を標的とする２種の異なるｓｉＲＮＡ分子が、Ａｍｂｉｏｎのインターネットに基づくｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を用いて設計された。設計されたｓｉＲＮＡ分子は短いヘアピン型であった。これらのｓｉＲＮＡをコードしている核酸（配列番号：１５および配列番号：１６）が合成され、ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏベクター（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＴＸ，）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位中に標準法を用いてクローン化された。ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏ中への配列番号：１５において示される核酸配列のクローニングはｐＣＨＯＰ１を生成し、一方、このベクター中への配列番号：１６において示される配列のクローニングはｐＣＨＯＰ２を生成した。ｐＣＨＯＰ１、ｐＣＨＯＰ２およびｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏプラスミドＤＮＡが、次に、各々別々にエレクトロポレーションによってＣ４６５Ａ骨髄腫細胞中にトランスフェクトされた。これらのベクターを含有する安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞が、次に、１０％ＦＢＳおよびＧ４１８ ３００μｇ／ｍｌを含有するＳＦＭ８培地において５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃での培養によって選択された。また、この選択培地は、ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌおよびキサンチン５０ｍｇ／Ｌを含有する１ＸＭＨＸ選択培地を含有して、Ｃ４６５Ａ細胞による安定な抗体発現を維持した。
【００６３】
図８に示される各細胞系は、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＭＨＸおよびＧ４１８ ３００μｇ／ｍｌを含有するＳＦＭ８培地において６日間懸濁液において増殖された。生存細胞濃度および抗体タイターはこの６日間の間毎日決定された。生存細胞濃度は、標準の色素排除アッセイによってアッセイされ、そして培養培地中の抗体タイターは標準の比濁分析技術によってアッセイされた。Ｃ４６５Ａ骨髄腫細胞系はＳＰ２／０骨髄腫細胞系から得られ、ＩｇＧ１κイソ型のヒトＴＮＰ−α特異的マウスｍＡｂを安定して発現する。Ｃ２−８骨髄腫細胞系は、ｐＣＨＯＰ１により安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系である。Ｃ２−１８骨髄腫細胞系は、ｐＣＨＯＰ２により安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系である。Ｖ１１およびＶ１２細胞系は、ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏのみにより安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系であり；両系統は独立して生成された。
【００６４】
得られたデータは、ｐＣＨＯＰ１およびｐＣＨＯＰ２によってコードされるＣＨＯＰ−１０特異的ｓｉＲＮＡは、対照Ｃ４６５Ａ、Ｖ１１およびＶ１２細胞系に較べて抗体特異的生産性を増大した（図８）。
【００６５】
本発明はここに完全に記述され、付随する請求項の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更および修飾がそれに対して作成できることは当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、高い速度でｍＡｂを分泌する細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図２】図２は、静止増殖期の細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図３】図３は、親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルの比較を示す。
【図４】図４は、Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図５】図５は、ＦＯ親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図６】図６は、Ａｇ−６５３親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図７】図７は、ＵＰＲ遺伝子転写物レベル改変の関数としての抗体分泌速度における変化を示す。
【図８】図８は、ＣＨＯＰ−１０特異的ｓｉＲＮＡをコードしている核酸により安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞における増大された抗体分泌速度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の細胞分泌速度の変更方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、例えば抗体の大規模生産は、典型的には、培養される生産細胞系からのタンパク質の分泌に依存する。培養細胞によって生産される分泌タンパク質は、周囲の細胞培養培地から容易に回収かつ精製することができる。
【０００３】
タンパク質の細胞分泌速度は、バイオリアクターまたは他のシステムからの分泌タンパク質の生産および精製に影響を与える重要なファクターである。一般に、より高い精製タンパク質の収量は、細胞分泌速度が比較的高い場合に達成することができる。反対に、細胞分泌速度が低すぎる場合は、タンパク質精製は実行不可能であろう。
【０００４】
低分泌性細胞の問題を回避する１つのアプローチは、低分泌性細胞の集団から高分泌性のサブクローン細胞を単離することであった。典型的には、これは、高分泌性細胞系の連続希釈、スクリーニングおよび選択を限定するという数回の、かつ労力集中的なラウンドを必要とする。あるいはまた、新しい細胞系が高分泌系であろうという希望において、問題のタンパク質を生産する完全に新しい細胞系が生成される。
【０００５】
高分泌性細胞系を生成する従来の各アプローチは限界を有する。例えば、低分泌性細胞の集団からサブクローニングによって高分泌性細胞系を同定することは、集団における高分泌性細胞が相対的に希少であること、ならびにいずれかの高分泌性細胞の同定に要求される広大な量の時間と労力によって制約される。
【０００６】
さらに、問題の抗体またはタンパク質を生産する新しい細胞系の生成は、新しい細胞系が高分泌性ではない可能性、ならびに抗体産生細胞を再生し、そして高分泌性細胞を同定するために要求される多大な量の努力によって制約される。若干の例では、低下した分泌速度をもたらす細胞の小胞体（ＥＲ）内でのタンパク質のミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）により、低分泌性細胞系のみが得られることもある。
【０００７】
かくして、タンパク質の細胞分泌速度を変化させる有効な方法への要求が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の１つの態様は、細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し；そして細胞を培養する段階を含んでなる、タンパク質の細胞分泌速度の変更方法である。
【０００９】
本発明のその他の態様は、細胞において少なくとも１種のアンフォールド型（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質応答（ＵＰＲ）経路構成要素の活性を調節し；そして細胞を培養する段階を含んでなる、タンパク質の細胞分泌速度を改変することによって生成される、変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞である。
【００１０】
本発明のその他の態様は、細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し、そして細胞を培養することによって生成される、変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞を含有するトランスジェニック動物である。
【００１１】
本発明のその他の態様は、配列番号：１５または配列番号：１６において示される配列
を有する単離された核酸である。
【００１２】
限定されるものではないが、本明細書において引用される特許および特許出願を含む、すべての公表物は、完全な記述をとおして引用によって本明細書に組み入れられている。
【００１３】
本明細書で使用されるところの用語「抗体」は、広範な意味において意味され、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体および抗体フラグメントまたは変異体を含む、免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。抗体は形質細胞によって構成的に発現され、そして分泌される分泌タンパク質である。また抗体は、標準的方法、例えばハイブリドーマ生成によるか、または不死化されたＢ細胞、例えば骨髄腫細胞または他の細胞種、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞および昆虫細胞への抗体重鎖および／または軽鎖遺伝子のトランスフェクションによって、不死化された形質細胞を用いて生産することができる。
【００１４】
抗体フラグメントまたは変異体は、ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント、重鎖フラグメント、軽鎖フラグメント、および少なくとも１種の抗体ペプチド鎖の一部を含有する分子を含む。そのような部分は、抗体の可変、ヒンジもしくは定常部ペプチド鎖に対応してもよい。
【００１５】
本明細書で使用されるような用語「ミメティボディ」は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１（ｎ）−Ｐｅｐ（ｎ）−Ｆｌｅｘ（ｎ）−Ｖ２（ｎ）−ｐＨｉｎｇｅ（ｎ）−ＣＨ２（ｎ）−ＣＨ３（ｎ））（ｍ） （Ｉ）
［式中、Ｖ１は免疫グロブリン可変部のＮ末端の少なくとも１部分であり、Ｐｅｐはエピトープに結合する少なくとも１種の生物活性ペプチドであり、Ｆｌｅｘは、ミメティボディをもう一方の方向づけと結合特性をもつようにさせることによって構造的柔軟性を与えるポリペプチドであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の少なくとも１部分であり、ｐＨｉｎｇｅは免疫グロブリンヒンジ部の少なくとも１部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２定常部の少なくとも１部分であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３定常部の少なくとも１部分であり、ここでｎおよびｍは整数１〜１０であってもよい］
を有するタンパク質を意味する。ミメティボディは、構築物に存在する重鎖定常ドメインアミノ酸配列に応じて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような免疫グロブリン分子の異なるタイプの特性および機能を模倣できる。
【００１６】
本明細書で使用されるところの用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異性であり、典型的には単一な抗原決定基に対向される。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えば、マウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）のハイブリドーマ法によって作成することができる。アクセプター抗体（典型的には、ヒトのようなその他の哺乳動物種）由来の軽鎖および重鎖定常部に関連してドナー抗体（典型的には、マウス）由来の軽鎖および重鎖可変部を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示された方法によって調製されてもよい。非ヒト・ドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）由来のＣＤＲおよび場合によっては結合親和力を維持するように改変されたフレームワーク・サポート残基を有する１種以上の免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来の部分を有する、ヒト化ｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：１００２９−１００３２，（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，（１９９１）において開示された技術によって得ることができる。
【００１７】
いずれの非ヒト配列も欠く完全にヒトのｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１，（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６，（１９９７）において引用される技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製されてもよい。ヒトｍＡｂはまた、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，（２０００）およびＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４，（２００１）において引用される技術によってファージ・ディスプレイライブラリーから調製され、そして最適化されてもよい。
【００１８】
本明細書で使用されるところの用語「細胞分泌速度」は、細胞が特定のタンパク質を分泌する速度を意味する。そのような速度は、時間の変化当たりの培養培地中に存在するタンパク質の量における変化として記述されてもよく、または細胞数に標準化され、そして単位「ｐｇ／細胞／日」で表されてもよい。
【００１９】
本明細書で使用されるところの用語「短い干渉性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」は、標的遺伝子転写物の切断を媒介する核酸配列を意味する。短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖でもまたは短いヘアピン型であってもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡは、２本の個々の、逆平行の、アニールされたＲＮＡ鎖または両ＲＮＡおよびＤＮＡを含有するアニールされた核酸鎖（例えば、５’−ＴＴＴＴＵＵＵＵ−３’にアニールされた５’−ＴＴＴＴＵＵＵＵ−３’または５’−ＵＵＵＵ−３’にアニールされた５’−ＴＴＴＴ−３’）からなってもよい。短いヘアピン型のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとして有効なステム・ループ構造または他の二次構造を形成することができる単一ＲＮＡ鎖または単一ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖からなってもよい。当業者は、ｓｉＲＮＡが、他の改変体、例えばヌクレオシド類似体、バックボーン改変体、および改変ｓｉＲＮＡ核酸に標的遺伝子転写物の切断をなお媒介させる他の改変体を含んでもよいことを認識している。
【００２０】
本明細書で使用されるところの用語「低分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、アミノ酸残基または核酸残基のみからはならない２４，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量をもつ化合物を意味する。
【００２１】
本明細書で使用されるところの用語「転写制御配列」は、遺伝子の転写に必要である核酸配列または遺伝子の転写を増大または減少させる核酸配列を意味する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの用語「ＵＰＲ経路構成要素」は、ＵＰＲ経路を介するシグナル伝達を媒介するか、またはＵＰＲを活性化する、ペプチド鎖または核酸配列、例えば転写制御配列を意味する。
【００２３】
本発明は、細胞によるタンパク質の細胞分泌速度を改変するために有用な方法を提供する。本発明の方法の代表的使用は、治療、診断または研究目的に有用であるタンパク質、例えば抗体のための分泌速度の増進である。
【００２４】
細胞系における低いタンパク質分泌速度は、ＵＰＲを介して分泌過程を減速または停止する、細胞ＥＲにおけるミスフォールド（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の蓄積によって惹起できる。ＥＲ膜におけるストレス感受性タンパク質は、アンフォールド型タンパク質の過剰を検出し、そしてＵＰＲの引き金を引く。続いて、複雑なシグナル伝達カスケードを介して、シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）タンパク質Ｂｉｐおよび転写因子ＸＢＰ
−１およびＣＨＯＰが上方調節される。
【００２５】
シャペロンタンパク質はアンフォールド型タンパク質に結合し、そして正確な折り畳みを助ける。転写因子ＣＨＯＰは、一般に細胞増殖、分化および生存のネガティブレギュレーターとされる。ＣＨＯＰの上方調節は細胞周期の停止を惹起し、その結果、ＵＰＲ誘導に関与する好ましくない条件に対抗する時間を細胞に与えることが観察された。
【００２６】
転写因子ＸＢＰ−１は、形質細胞、大量の免疫グロブリンを分泌する分化したＢリンパ球を生成するために要求される。形質細胞は変化されたＵＰＲを現し、ここでは免疫グロブリン合成の前に若干のＵＰＲ遺伝子の上方調節が起きる。これらは、ＸＢＰ−１、Ｂｉｐ、Ｇｒｐ９４およびｐ５０ＡＴＦ６αを含み、そしてそれらの上方調節は形質細胞の分化と適当な分泌のために必須である。（Ｇａｓｓ，Ｊ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７，４９０４７−４９０５４（２００２））。これに対して、ＣＨＯＰはこの推移において上方調節されず、このことは異なる種類のＵＰＲを示唆している。これらの分子の上方調節は、細胞タンパク質分泌速度における増大またはアポトーシスのいずれかを惹起する有利または有害な効果を有する。参照、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１２１１−１２３３（１９９９）およびＣｕｄｎａ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１，５６−６５（２００３）。 本発明の方法では、タンパク質の細胞分泌速度は、細胞における少なくとも１個のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節し、そして細胞を培養することによって改変される。本発明の方法は、抗体のようなタンパク質の細胞分泌速度の増大または減少に備える。
【００２７】
本発明の実施態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸により細胞を安定してトラスフェクトすることによって増大される。ＵＰＲ経路構成要素は、ポリペプチドまたは核酸配列、例えば転写制御配列であってもよく、これらはＵＰＲ経路をとおしてシグナル伝達を媒介するか、またはＵＰＲを活性化する。ＵＰＲ経路構成要素の例は、Ｂｉｐ、ＸＢＰおよびＣＨＯＰならびに類似の活性を有する変異体を含む。ＵＰＲ経路構成要素の他の例は、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、シャペロン、および類似の活性を有する変異体を含む（参照、例えば、Ｃｕｄｎａ ａｎｄ Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１，５６−６５（２００２））。転写制御配列の例は、シス作用ＵＰＲ要素（ＵＰＲＥ）および種々のＵＰＲ遺伝子のプロモーター中に同定されたＥＲＳＥである。当業者は他のＵＰＲ経路構成要素および転写制御配列も認識できるであろう。ＵＰＲ経路構成要素は、配列番号：２（マウスＢｉｐ）、配列番号：４（マウスＸＢＰ−１、スプライスされた形態）、配列番号：６（マウスＸＢＰ−１、スプライスされてない形態）、配列番号：８（マウスＣＨＯＰ−１０）、配列番号：１０（ヒトＢｉｐ）、配列番号：１２（ヒトＸＢＰ−１）または配列番号：１４（ヒトＣＨＯＰ−１０）において示されるアミノ酸配列を有してもよい。ＵＰＲ経路構成要素核酸は、配列番号：１（マウスＢｉｐ ｍＲＮＡ）、配列番号：３（マウスＸＢＰ−１、スプライスされた形態 ｍＲＮＡ）、配列番号：５（マウスＸＢＰ−１、スプライスされてない形態，ｍＲＮＡ）、配列番号：７（マウスＣＨＯＰ−１０ ｍＲＮＡ）、配列番号：９（ヒトＢｉｐ ｍＲＮＡ）、配列番号：１１（ヒトＸＢＰ−１ ｍＲＮＡ）、配列番号：１３（ヒトＣＨＯＰ−１０ ｍＲＮＡ）において示される配列を有してもよい。
【００２８】
親分子に類似の活性を有するこれらの配列のバリアントもまた、本発明の方法において有用であろう。例えば、親分子に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異分子は類似の活性を有することが期待できる。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントは、フィルタリングをターンオフ（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）し、そしてすべて他のデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）セッティングを変化しないＢＲＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定することができる。ポリペプチドの種々のイソ型、ポリペプチドの優性なネガティブバージョン、またはポリペプチドの共有的に改変された形態物は、親分子のバリアントの若干の例である。
【００２９】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度はＵＰＲ経路構成要素の発現を減少させることによって減少できる。ＵＰＲ経路構成要素、例えばＢｉｐまたはＣＨＯＰのような遺伝子の発現は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子またはアンチセンス分子による細胞の によって減少できる。
【００３０】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、低分子の投与をとおしてＵＰＲ経路構成要素を調節することによって増大される。低分子の例は、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ＵＰＲ誘導剤である（Ｌｉｔｔｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６，１７０６７−１７０７１（１９９１））。そのような低分子の他の例は、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｓｉｎ）およびリポ多糖を含む。
【００３１】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、細胞を静止増殖期に置くことによって増大される。細胞は栄養利用度を制限するか、細胞の老廃物を蓄積させるか、または細胞培養培地のｐＨを変化させることによって静止増殖期に置かれてもよい。当業者はまた、静止増殖期に細胞を置く他の方法を認識できる。
【００３２】
本発明の方法において、代表的な細胞は、形質細胞、すなわち、抗体を分泌する分化したＢ細胞である。形質細胞はマウス、ヒトまたは他の動物起源から単離されてもよい。典型的には、形質細胞は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスによるウイルス感染のような標準技術か、または例えば、放射線学的もしくは化学的変異誘発のような他の方法によって不死化された。不死化される形質細胞はまたがん性であってもよく、そして鉱油またはその他の化合物を動物の腹腔内に注射することによって得られてもよい。
【００３３】
本発明の１つの態様では、不死化される融合パートナーは、「骨髄腫細胞」として当該技術分野において既知であるものである。骨髄腫は、一般に、多発性骨髄腫、骨髄がんを罹患している生物体から得られる不死化融合パートナーと脾臓細胞の融合により形成される。生物体は鳥類、魚類、爬虫類、哺乳類および他の動物であってもよい。骨髄腫細胞系の例は、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）、およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）細胞系を含み、これらはマウスから得られた。ヒトから得られる骨髄腫細胞系の例は、Ｕ２６６細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。当業者は他の骨髄腫細胞系も認識することができる。
【００３４】
本発明の１つの態様では、骨髄腫細胞はＤＮＡ分子により安定してトランスフェクトされる。安定してトランスフェクトされる骨髄腫細胞は、当業者には周知のトランスフェクション、スクリーニングおよび選択の方法によって作成されてもよい。細胞を安定してトランスフェクトするために使用されるＤＮＡは、骨髄腫細胞中に任意に組み込まれてもよく、また部位特異的方式で組み込まれてもよい。そのようなＤＮＡ配列はＵＰＲ経路構成要素をコードしていてもよい。あるいはまた、安定してトランスフェクトされた核酸配列は、挿入により不活性化してもよく、またＵＰＲ構成要素、例えばＵＰＲ遺伝子または転写制御配列を欠失してもよい。
【００３５】
本発明のその他の態様では、タンパク質の細胞分泌速度は、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸配列により細
胞を安定してトランスフェクトすることによって増大される。そのようなｓｉＲＮＡは、ＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的としてもよい。代表的なＣＨＯＰタンパク質は、配列番号：８または配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を有するものである。マウスＣＨＯＰ−１０をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸配列による安定なトランスフェクションが有用である。代表的なマウスＣＨＯＰ−１０遺伝子転写物特異的ｓｉＲＮＡは、配列番号：１５または配列番号：１６において示されるヌクレオチド配列を含有する。当業者は、ＵＰＲ遺伝子転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている他の核酸を認識できる。
【００３６】
本発明の方法において有用な他の細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、昆虫細胞および植物細胞を含む。
【００３７】
本発明のその他の態様では、非トランスジェニック動物に較べて上昇したレベルにおいてＵＰＲタンパク質を構成的または誘導的に発現するトランスジェニック動物が作成できる。トランスジェニック動物を作成する技術は当該技術分野において既知である。
【００３８】
本発明の方法では、細胞が培養される。細胞は懸濁液において、または付着培養物として培養されてもよい。細胞は、例えば、バイオリアクター、細胞バッグ（ｂａｇ）、培養プレート、フラスコおよび当業者には周知の他の容器を含む、種々の容器において培養されてもよい。細胞は化学的に定義された培地調合物を含むすべての適当な培地において培養されてもよい。細胞培養に適当な周囲条件、例えば温度および雰囲気組成は、また当業者には周知である。細胞の培養方法もまた当業者には周知である。
【００３９】
また本発明は、本発明の方法によって生成される変化した細胞分泌速度をもつ形質細胞を提供する。形質細胞は、短い干渉ＲＮＡをコードしている安定してトランスフェクトされた核酸により、ＵＰＲ経路構成要素の活性を調節することによって生成されてもよい。ｓｉＲＮＡは、ＣＨＯＰタンパク質のようなＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的としてもよい。提供される形質細胞は、例えば、Ｃ２−８またはＣ２−１８細胞のようなＳＰ２／０由来の細胞であってもよい。そのような形質細胞は精製されるべき抗体または他のポリペプチドを分泌するであろう。
【００４０】
本発明は、次に示す特定の、限定されない実施例に関連してここに記述できる。
【実施例１】
【００４１】
高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、低い速度で同一ｍＡｂを分泌する細胞系と比較されてＵＰＲ遺伝子転写物のレベルについて解析された。試験された細胞系は高分泌系Ｃ５０５Ｂ、Ｃ５０５ＣおよびＣ５０５Ｄを含んだ。試験された低分泌系はＣ５０５Ａ系およびＳＰ２／０、Ｃ５０５Ａ，Ｂ，ＣおよびＤの親の骨髄腫細胞系であった。これらの系統のすべてが、αｖ−インテグリンに対して特異的なヒトＩｇＧ１ ｍＡｂの重鎖および軽鎖をコードしているＤＮＡによりトランスフェクトされた。Ｃ５０５Ｂ、Ｃ５０５ＣおよびＣ５０５Ｄ細胞系は、ｍＡｂ分泌の高い速度に関して、連続してサブクローニング、スクリーニングおよび選択によって同定された。
【００４２】
抗体分泌速度は、細胞培養培地中に２４時間の間に分泌されたｍＡｂの量を測定し、そして生存細胞数をカウントして、「ｐｇ／生存細胞／日」の単位をもつ細胞分泌速度を生成することによって決定された。Ｃ５０５Ａ細胞系は、５〜７ｐｇ／生存細胞／日の低速度で抗体を分泌し、これは約５〜１０μｇ／ｍＬ／７日の濃度に相当する。Ｃ５０５Ｂ系は、約１５ｐｇ／生存細胞／日の速度で抗体を生産し、Ｃ５０５Ｃは、約１３ｐｇ／生存細胞／日の速度で生産し、そしてＣ５０５Ｄは、約１５ｐｇ／生存細胞／日の速度で生産
する。
【００４３】
全ｍＡｂ分泌性細胞系および親骨髄腫細胞系は、５％ＣＯ２の雰囲気中で、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸塩を含有するＩＭＤＭ培地中３７℃における懸濁液において培養された。ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌおよびキサンチン５０ｍｇ／Ｌを含有する１ＸＭＨＸ選択培地もまた培地には存在した。
【００４４】
高発現細胞系と低発現細胞系との間のＵＰＲ遺伝子転写物レベルにおける差異は、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により調査された。細胞は対数増殖期まで増殖され、そして総ＲＮＡがＲＮＥａｓｙＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲは標準の２段階反応を用いて実施された。ｃＤＮＡ合成段階は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびランダムヘキサマープライマーを用い、製造者によって特定された反応条件を用いて実施された。次いで、ＴａｑｍａｎＴＭＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が、製造者による特定されるように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７０００ＨＴまたは７９００ＨＴ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって実施された。ＲＮＡ ５，０００ｐｇが各Ｑ−ＰＣＲ反応において使用された。Ｑ−ＰＣＲのために使用されるＢｉｐ，ＣＨＯＰおよびＸＢＰ特異的プライマーおよびプローブ組み合わせ物は、Ｐｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して設計された。ｃＤＮＡレベルは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ハウスキーピング遺伝子の転写物レベルに対して標準化され、次いで、適当な親細胞系のｃＤＮＡ／ＧＡＰＤＨ転写物値に対して標準化された。ＰＣＲの初期対数期におけるデータの収集および転写物の定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ＨＴまたは７９００ＨＴ機器および関連するソフトウエアを用いて実施された。
【００４５】
結果は図１において示され、そしてＢｉｐおよびＸＢＰ−１ ＵＰＲ遺伝子転写物レベルは、低分泌性細胞におけるよりも高分泌性細胞系において約３〜４倍大きかったことを表している。ＣＨＯＰレベルにおける相違はほとんど断定されなかった。
【実施例２】
【００４６】
静止増殖期の細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルおよび抗体分泌速度
静止増殖期の細胞が、対数増殖期の細胞に比較して、ＵＰＲ遺伝子転写物レベルおよびｍＡｂ分泌速度について解析された。Ｃ１６８Ｊ細胞系は、ＳＰ２／０親骨髄腫細胞系由来のトランスフェクトーマであり、そして２５〜３０ｐｇ／細胞／日の速度でＩｇＧ１ ｍＡｂを分泌する。Ｃ５０５Ａは実施例１において既に記述されたとおりである。
【００４７】
Ｃ５０５Ａ、Ｃ１６８ＪおよびＳＰ２／０細胞系のＩｇＧ１ ｍＡｂ分泌速度は、実施例１で記述されたように、Ｔ−７５またはＴ−１５０フラスコにおいて５ｘ１０６細胞を接種、培養することによって調査された。３日後、細胞は対数増殖期にあり、そして６日目に細胞は静止増殖期にあった。総細胞数および生存細胞数が両増殖期の細胞について決定された。両増殖期の細胞からの培養培地が、標準の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってヒトＩｇＧについてアッセイされた。Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１に特異的なＱ−ＰＣＲが、先の実施例１に記述されたように、対数および静止増殖期細胞について実施された。
【００４８】
表１に示される結果は、Ｃ５０５ＡおよびＣ１６８Ｊ系がＩｇＧ１ ｍＡｂ分泌速度を増大したことを例証している（表１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】
さらに、図２に示される結果は、対数期増殖に比較して、発育停止期増殖のＣ５０５Ａ、Ｃ１６８ＪおよびＳＰ２／０において増大したＵＰＲ遺伝子転写物レベルを例証している。
【実施例３】
【００５１】
親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
ＳＰ２／０、ＮＳＯ、ＦＯおよびＡｇ６５３親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルが試験されて、高分泌性細胞系が、より高いレベルのＵＰＲ遺伝子を含有するか否か決定された。ＳＰ２／０、ＮＳＯ、ＦＯおよびＡｇ６５３細胞は、先の実施例１で記述されたように、対数増殖期まで増殖され、総ＲＮＡが５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲおよび解析もまた実施例１に記述されたように実施された。図３に示される結果は、試験された全細胞において匹敵するＢｉｐおよびＣＨＯＰ転写物レベルを示している。しかしながら、ＸＢＰ−１転写物レベルは、試験された他の細胞タイプに比較してＦＯおよびＮＳＯ細胞において上昇していた。
【実施例４】
【００５２】
高分泌性細胞系および親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベル
高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、それらの親の細胞系と比較されてＵＰＲ遺伝子転写物のレベルについて解析された。図４〜６に示される細胞系が、先の実施例１で記述されたように、対数増殖期まで増殖され、そして総ＲＮＡが５ｘ１０６細胞から単離された。Ｑ−ＰＣＲおよび解析もまた実施例１に記述されたように実施された。
【００５３】
図４〜６に示される結果は、高い速度でｍＡｂを分泌する細胞系が、それらのＳＰ２／０、ＦＯおよびＡｇ６５３親骨髄腫細胞系に較べて、より高いＵＰＲ遺伝子転写物レベルを有することを示している。これらの結果は、増大されたＵＰＲ遺伝子発現が、使用された親骨髄腫細胞系の同一性とは無関係に、増大された抗体分泌速度と共役されて、高分泌性細胞を生成することを示唆している。
【実施例５】
【００５４】
ＵＰＲ誘導後のＵＰＲタンパク質の発現
低分泌性細胞および親骨髄腫細胞系に較べて高分泌性細胞におけるＵＰＲタンパク質の発現が、薬理学的作用物タプシガルギンによるＵＰＲ誘導後に解析された。タプシガルギンは、筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプを遮断し、そしてＥＲ内腔におけるカルシウム枯渇をもたらすＡＴＰアーゼ阻害剤である。
【００５５】
細胞はタプシガルギンの１００ｎＭで処理され、そしてＸＢＰ−１およびＣＨＯＰに特異的なウエスタン・ブロットが調製された。細胞は、放射線免疫沈降（ＲＩＰＡ）溶解バ
ッファー（１ｘＰＢＳ，１％Ｎ−Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、およびＲｏｃｈｅ製プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１８３６１５３））において定められた時点で溶解され、そして清澄溶解液におけるタンパク質濃度が、標準のビシンコニニック・アシド（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｂ９６４３）を用いて定量された。ウエスタン・ブロットでは、各溶解物２０μｇが標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開され、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランに転移され、そしてＸＢＰ−１またはＣＨＯＰに特異的な抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）によりプローブされた。
【００５６】
結果（未掲示）は、高分泌性細胞におけるＵＰＲタンパク質が、低分泌性細胞および親骨髄腫細胞系に較べて高レベルで発現されることを示した。ＸＢＰ−１に特異的なウエスタン・ブロットは、ＸＢＰ−１タンパク質発現が、タプシガルギン処理された高分泌性Ｃ１６８ｊ細胞において強く誘導されることを示している。このＸＢＰ−１発現の誘導は、ＵＰＲの薬理学的誘導７時間後にもっとも明確であり、そして処置後２時間くらいの初期に見ることができる。ＣＨＯＰに特異的なウエスタン・ブロットは、ＣＨＯＰタンパク質発現が、タプシガルギン処理された高分泌性Ｃ１６８ｊ細胞において強く誘導されることを示している。ＣＨＯＰは２時間目に最初に出現し、４〜７時間に最大に発現され、そして２２時間では非常に低下される。
【実施例６】
【００５７】
ＵＰＲタンパク質発現レベルの増大
細胞は、ＢｉｐおよびＸＢＰ−１発現ベクターを用い、これらのＵＰＲタンパク質の細胞発現レベルを高めることを試みて一過性にトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）細胞が、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で付着培養物として増殖され、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび２ｍＭピルビン酸塩を含有するＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｂｅｌｃｃｏの最小必須培地（ＩＭＤＭ）培地において培養された。ＸＢＰ−１イソ型１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０２７９６３）、ＸＢＰ−１イソ型２（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ４４３１９２）またはＢｉｐをコードしているｃＤＮＡが、標準的方法を用いて一過性トランスフェクション実験のために有用なベクター中にサブクローン化された。ベクターはＣＭＶプロモーターの制御下でＺｓＧｒｅｅｎ１タンパク質を発現し、かつＣＭＶプロモーターの制御下でさらなるコーディング領域の導入のための多数のクローニング部位を有する。カナマイシン耐性遺伝子は細菌の選択のために使用された。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞が、いずれかトランスフェクトされずに残されるか、あるいは空のベクターのみ、ＸＢＰ−１イソ型１発現ベクター、ＸＢＰ−１イソ型２発現ベクターまたはＢｉｐ発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションは、製造者によって指示されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて実施された。トランスフェクション後４８時間に、細胞はＲＩＰＡ溶解バッファーにおいて溶解され、そして清澄溶解液の等しい細胞当量がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷された。次いで、ウエスタンブロットが調製され、先の実施例５に記述されたようにプローブされた。次いでブロットが除去され、アクチン特異抗体で再プローブされて各列に負荷された同じタンパク質を確認した。
【００５８】
結果（未掲示）は、ＸＢＰ−１イソ型１（「ＸＢＰ−１」を標識された列）およびＸＢＰ−１イソ型２（「Ｘ５４｝を標識された列）発現レベルが、これらのＸＢＰ−１イソ型をコードしている発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた細胞において上昇されたことを例証した。さらに、データ（未掲示）は、Ｂｉｐ発現レベルが、Ｂｉｐをコードしている発現ベクターにより一過性にトランスフェクトされた細胞において上昇され、そしてトランスフェクトされずに残されたか、または空のベクターのみでトランスフェクトされた細胞では、Ｂｉｐ発現が検出されなかったことを示した。
【実施例７】
【００５９】
抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルの影響
抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルの影響が解析された。Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１遺伝子転写物を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、Ａｍｂｉｏｎのインターネットに基づくｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を用いて設計され、そしてＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＴＸ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１１６２０）を用いて合成された。２種のｓｉＲＮＡが各標的転写物のために設計された。標準条件下で培養された３ｘ１０６Ｃ１６８Ｊ細胞が、図１０に示されるようなこれらの各二本鎖ｓｉＲＮＡの３μｇを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトされた。エレクトロポレートされた細胞は、先の実施例１に記述されたようにＩＭＤＭ培地２ｍｌに懸濁され、次いで、Ｔ−１２プレートにおいて培養された。生存細胞濃度は８日後に測定された。またＩｇＧ１ｍＡｂ濃度も、標準比濁分析技術を用いて８日後に測定された。
【００６０】
図７における結果は、抗体分泌速度が、抗体分泌速度に及ぼすＵＰＲ遺伝子転写物レベルを改変することによって調節できることを示している。ＲＮＡ転写物からＵＰＲ遺伝子Ｂｉｐ、ＣＨＯＰおよびＸＢＰ−１イソ型の発現を妨げることが可能な短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による高分泌性Ｃ１６８Ｊ細胞のトランスフェクションは、Ｃ１６８Ｊ細胞のＩｇＧ１分泌速度を減少させた。
【実施例８】
【００６１】
ＵＰＲ遺伝子転写物および発現レベルを増大することによる抗体分泌速度の増大
ＵＰＲタンパク質の過剰発現が、細胞によるｍＡｂのようなタンパク質の分泌速度を増大できる。タンパク質分泌性細胞系、例えばｍＡｂ分泌性細胞系は、Ｂｉｐ、ＣＨＯＰ、ＸＢＰ−１および他のＵＰＲ関連のタンパク質をコードしている発現ベクターによりトランスフェクトされて、これらのタンパク質の過剰発現に影響を与えられた。細胞が、単独でも、また組み合わせてもこれらの発現ベクターを用いてトランスフェクトされる。適当なタンパク質分泌速度、例えば抗体分泌速度は、標準技術を用いてトランスフェクション後２、４および６日目に決定された。トランスフェクトされた細胞におけるタンパク質分泌速度が、トランスフェクトされない対照細胞の分泌速度に比較された。タンパク質分泌速度は、１種以上のＵＰＲタンパク質を過剰発現する細胞において、より高いことが期待される。ＢｉｐまたはＸＢＰ−１の構成的な過剰発現が、最終的にこれらの細胞においてアポトーシスを誘導する事象では、これらの遺伝子が、誘導プロモーターの下流に置かれ、そして必要な場合にのみ活性化されてもよい。
【実施例９】
【００６２】
ＣＨＯＰ−１０エンコ−ディングｓｉＲＮＡにより安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞における抗体分泌速度の増大
ＣＨＯＰ−１０に特異的なｓｉＲＮＡを生産するＤＮＡ構築物によるＣ４６５Ａ骨髄腫細胞の安定なトランスフェクションは、抗体分泌速度を増大した（図８）。ＣＨＯＰ−１０遺伝子転写物を標的とする２種の異なるｓｉＲＮＡ分子が、Ａｍｂｉｏｎのインターネットに基づくｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を用いて設計された。設計されたｓｉＲＮＡ分子は短いヘアピン型であった。これらのｓｉＲＮＡをコードしている核酸（配列番号：１５および配列番号：１６）が合成され、ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏベクター（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＴＸ，）のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位中に標準法を用いてクローン化された。ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏ中への配列番号：１５において示される核酸配列のクローニングはｐＣＨＯＰ１を生成し、一方、このベクター中への配列番号：１６において示される配列のクローニングはｐＣＨＯＰ２を生成した。ｐＣＨＯＰ１、ｐＣＨＯＰ２およびｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏプラスミドＤＮＡが、次に、各々別々にエレクトロポレーションによってＣ４６５Ａ骨髄腫細胞中にトランスフェクトされた。これらのベクターを含有する安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞が、次に、１０％ＦＢＳおよびＧ４１８ ３００μｇ／ｍｌを含有するＳＦＭ８培地において５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃での培養によって選択された。また、この選択培地は、ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌおよびキサンチン５０ｍｇ／Ｌを含有する１ＸＭＨＸ選択培地を含有して、Ｃ４６５Ａ細胞による安定な抗体発現を維持した。
【００６３】
図８に示される各細胞系は、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＭＨＸおよびＧ４１８ ３００μｇ／ｍｌを含有するＳＦＭ８培地において６日間懸濁液において増殖された。生存細胞濃度および抗体タイターはこの６日間の間毎日決定された。生存細胞濃度は、標準の色素排除アッセイによってアッセイされ、そして培養培地中の抗体タイターは標準の比濁分析技術によってアッセイされた。Ｃ４６５Ａ骨髄腫細胞系はＳＰ２／０骨髄腫細胞系から得られ、ＩｇＧ１κイソ型のヒトＴＮＰ−α特異的マウスｍＡｂを安定して発現する。Ｃ２−８骨髄腫細胞系は、ｐＣＨＯＰ１により安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系である。Ｃ２−１８骨髄腫細胞系は、ｐＣＨＯＰ２により安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系である。Ｖ１１およびＶ１２細胞系は、ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ４．１−ｎｅｏのみにより安定してトランスフェクトされたＣ４６５Ａ由来の細胞系であり；両系統は独立して生成された。
【００６４】
得られたデータは、ｐＣＨＯＰ１およびｐＣＨＯＰ２によってコードされるＣＨＯＰ−１０特異的ｓｉＲＮＡは、対照Ｃ４６５Ａ、Ｖ１１およびＶ１２細胞系に較べて抗体特異的生産性を増大した（図８）。
【００６５】
本発明はここに完全に記述され、付随する請求項の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更および修飾がそれに対して作成できることは当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、高い速度でｍＡｂを分泌する細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図２】図２は、静止増殖期の細胞におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図３】図３は、親骨髄腫細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルの比較を示す。
【図４】図４は、Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図５】図５は、ＦＯ親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図６】図６は、Ａｇ−６５３親骨髄腫細胞系に比較して高分泌性細胞系におけるＵＰＲ遺伝子転写物レベルを示す。
【図７】図７は、ＵＰＲ遺伝子転写物レベル改変の関数としての抗体分泌速度における変化を示す。
【図８】図８は、ＣＨＯＰ−１０特異的ｓｉＲＮＡをコードしている核酸により安定してトランスフェクトされた骨髄腫細胞における増大された抗体分泌速度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞において少なくとも１種のアンフォールド型（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質応答（ＵＰＲ）経路構成要素の活性を調節する工程；および
ｂ）細胞を培養する工程、
を含んでなるタンパク質の細胞分泌速度の変更方法。
【請求項２】
細胞分泌速度が増大される、請求項１の方法。
【請求項３】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項２の方法。
【請求項４】
ＵＰＲ経路構成要素の核酸が、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３において示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、請求項３の方法。
【請求項５】
ＵＰＲ経路構成要素の核酸が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２または１４において示される配列を有する、請求項４の方法。
【請求項６】
ＵＰＲ経路構成要素が転写制御配列である、請求項３の方法。
【請求項７】
ＵＰＲ経路構成要素が低分子を投与することによって調節される、請求項２の方法。
【請求項８】
低分子がタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｓｉｎ）またはリポ多糖である、請求項７の方法。
【請求項９】
ＵＰＲ経路構成要素が、Ｂｉｐ、ＸＢＰ−またはＣＨＯＰである、請求項３の方法。
【請求項１０】
ＵＰＲ経路構成要素が、発育停止増殖期に細胞を置くことによって調節される、請求項２の方法。
【請求項１１】
細胞が骨髄腫細胞である、請求項１の方法。
【請求項１２】
骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳＯ、ＦＯまたはＡｇ６５３である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳＯ、ＦＯまたはＡｇ６５３のサブクローンである、請求項１１の方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体である、請求項１の方法。
【請求項１５】
細胞分泌速度が減少される、請求項１の方法。
【請求項１６】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸の転写物を標的とする短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項２の方法。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡがＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的とする、請
求項１７の方法。
【請求項１９】
ＣＨＯＰタンパク質が配列番号：８または配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
核酸配列が配列番号：１５または配列番号：１６において示される核酸配列を含有する、請求項１８の方法。
【請求項２１】
ａ）細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節する工程；およびｂ）細胞を培養する工程、
によって生成される、変更された細胞分泌速度を有する形質細胞。
【請求項２２】
ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって、ＵＰＲ経路構成要素の活性を調節することによって生成される、請求項２１の形質細胞。
【請求項２３】
ＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている、安定してトランスフェクトされた核酸を含有するＳＰ２／０由来の細胞である、請求項２２の形質細胞。
【請求項２４】
抗体を分泌する、請求項２３の形質細胞。
【請求項２５】
Ｃ２−８またはＣ２−１８細胞である、請求項２３の形質細胞。
【請求項２６】
請求項２１の形質細胞を含有する、トランスジェニック動物。
【請求項２７】
配列番号：１５において示される核酸配列を含有する単離された核酸配列。
【請求項２８】
配列番号：１６において示される核酸配列を含有する単離された核酸配列。
【請求項１】
ａ）細胞において少なくとも１種のアンフォールド型（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質応答（ＵＰＲ）経路構成要素の活性を調節する工程；および
ｂ）細胞を培養する工程、
を含んでなるタンパク質の細胞分泌速度の変更方法。
【請求項２】
細胞分泌速度が増大される、請求項１の方法。
【請求項３】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項２の方法。
【請求項４】
ＵＰＲ経路構成要素の核酸が、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３において示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、請求項３の方法。
【請求項５】
ＵＰＲ経路構成要素の核酸が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２または１４において示される配列を有する、請求項４の方法。
【請求項６】
ＵＰＲ経路構成要素が転写制御配列である、請求項３の方法。
【請求項７】
ＵＰＲ経路構成要素が低分子を投与することによって調節される、請求項２の方法。
【請求項８】
低分子がタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｓｉｎ）またはリポ多糖である、請求項７の方法。
【請求項９】
ＵＰＲ経路構成要素が、Ｂｉｐ、ＸＢＰ−またはＣＨＯＰである、請求項３の方法。
【請求項１０】
ＵＰＲ経路構成要素が、発育停止増殖期に細胞を置くことによって調節される、請求項２の方法。
【請求項１１】
細胞が骨髄腫細胞である、請求項１の方法。
【請求項１２】
骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳＯ、ＦＯまたはＡｇ６５３である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳＯ、ＦＯまたはＡｇ６５３のサブクローンである、請求項１１の方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体である、請求項１の方法。
【請求項１５】
細胞分泌速度が減少される、請求項１の方法。
【請求項１６】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸の転写物を標的とする短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＵＰＲ経路構成要素が、ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって調節される、請求項２の方法。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡがＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的とする、請
求項１７の方法。
【請求項１９】
ＣＨＯＰタンパク質が配列番号：８または配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
核酸配列が配列番号：１５または配列番号：１６において示される核酸配列を含有する、請求項１８の方法。
【請求項２１】
ａ）細胞において少なくとも１種のＵＰＲ経路構成要素の活性を調節する工程；およびｂ）細胞を培養する工程、
によって生成される、変更された細胞分泌速度を有する形質細胞。
【請求項２２】
ＵＰＲ経路構成要素をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている核酸により細胞を安定してトランスフェクトすることによって、ＵＰＲ経路構成要素の活性を調節することによって生成される、請求項２１の形質細胞。
【請求項２３】
ＣＨＯＰタンパク質をコードしている核酸配列の転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている、安定してトランスフェクトされた核酸を含有するＳＰ２／０由来の細胞である、請求項２２の形質細胞。
【請求項２４】
抗体を分泌する、請求項２３の形質細胞。
【請求項２５】
Ｃ２−８またはＣ２−１８細胞である、請求項２３の形質細胞。
【請求項２６】
請求項２１の形質細胞を含有する、トランスジェニック動物。
【請求項２７】
配列番号：１５において示される核酸配列を含有する単離された核酸配列。
【請求項２８】
配列番号：１６において示される核酸配列を含有する単離された核酸配列。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５３７７２８（Ｐ２００７−５３７７２８Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６４９２（Ｐ２００７−５０６４９２）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０６０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４３５５
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０６０５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４３５５
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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