タンパク質輸送の選択的薬理学的阻害、および関連した、ヒト疾患を治療する方法
本発明の好ましい態様は、特定の内在ＥＲおよびゴルジタンパク質を選択的に薬理学的にダウンレギュレーションすることによる細胞内タンパク質輸送経路の阻害に関し、より詳しくは、これらの細胞内タンパク質輸送経路に依存する様々な疾患状態を治療する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の好ましい態様は、特定の内在ＥＲおよびゴルジタンパク質を選択的に薬理学的にダウンレギュレーションすることによる細胞内タンパク質輸送経路の阻害に関し、より詳しくは、これらの細胞内タンパク質輸送経路に依存する様々な疾患状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１８９８年、Ｃａｍｉｌｌｉｏ Ｇｏｌｇｉは、今では彼の名が付いている新規な細胞内網目構造について記述した（Ｇｏｌｇｉ、１８９８年）。ゴルジ複合体は、細胞内タンパク質をプロセシング、輸送、および選別する上で顕著な機能を有する精巧な細胞小器官である（Ｇｏｎａｔａｓ、１９９４年；Ｍｅｌｌｍａｎ、１９９５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年に総説がある）。構造上は、ゴルジ複合体は、殆どの哺乳動物細胞の核周囲領域に局在し、膜結合した槽の積み重ね、ならびに機能的に異なるトランスゴルジ網（「ＴＧＮ」）、中間ゴルジ網およびシスゴルジ網（「ＣＧＮ」、例えば図１を参照のこと）を特徴とする。ゴルジ複合体の選別機能はＴＧＮおよびＣＧＮで行われ、一方、プロセシング機能はシス、中間、およびトランス区画で行われることが提案されている（Ｍｅｌｌｍａｎ、Ｓｉｍｏｎｓ、１９９２年）。新しく合成されたタンパク質の細胞内輸送には、小胞体（「ＥＲ」）から輸送小胞を経由してゴルジ複合体のシス、中間、およびトランス区画まで、場合によっては原形質膜までの管理された移動が必要である（Ｂａｎｆｉｅｌｄら、１９９４年；Ｆａｒｑｕｈａｒ、Ｐａｌａｄｅ、１９８１年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９８９年；Ｍｅｌｌｍａｎ、１９９５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年；Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９２年）。
【０００３】
コートマータンパク質のＣＯＰＩ被覆小胞は、現在、介在する槽を通過するこの順行性輸送を媒介すると考えられている（Ｒｏｔｈｍａｎ、１９９４年；Ｓｃｈｅｋｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９６年）。ゴルジ複合体を通過するタンパク質輸送は、供与膜から出芽した小胞により媒介され、受容膜を標的にしてそれと融合する（Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９２年）。輸送小胞はＴＧＮに向かって移動することが知られており、コートタンパク質複合体（コートマータンパク質、例えばβ−ＣＯＰ、（Ｂａｎｆｉｅｌｄら、１９９４年；Ｂａｒｌｏｗｅら、１９９４年；Ｄｕｄｅｎら、１９９１年；Ｏｒｃｉら、１９９７年；Ｐｅｌｈａｍ、１９９４年；Ｓｅａｍａｎ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９４年；Ｓｅｒａｆｉｎｉら、１９９１年；Ｗａｔｅｒｓら、１９９１年）を参照のこと）を経由してＣＧＮへ「逆」方向に移動することも仮定されている。小胞輸送についてのこれらの経路は、タンパク質輸送の他に、膜構造を再生するために重要であると考えられている。細胞内微小管が重要な構成要素であることは知られているが、小胞輸送を制御するシグナルはよく理解されていない（Ｋｒｅｉｓ、１９９０年；Ｍｉｚｕｎｏ、Ｓｉｎｇｅｒ、１９９４年）。ある種の役割を果たすと考えられているゴルジ複合体のその他のタンパク質には、アダプチン類（Ｐｅａｒｓｅ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９０年）、ＧＴＰ結合（すなわち「Ｒａｂ」）タンパク質類（Ｊｅｎａら、１９９４年；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９４年；Ｎｕｏｆｆｅｒら、１９９４年；Ｏｋａ、Ｎａｋａｎｏ、１９９４年；Ｐｆｅｆｆｅｒ、１９９４年）、ＡＤＰリボシル化因子類（ＡＲＦ）（Ｓｔｅａｒｎｓら、１９９０年）、および内在酵素類（Ｆａｒｑｕｈａｒ、１９８５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年に総説がある）などのタンパク質のファミリーがある。タンパク質および膜輸送器官の別個の領域についての、様々なＥＲおよびゴルジタンパク質の提案されている関係を図示した図２６も参照されたい。
【０００４】
最近、抗腫瘍活性があると報告されたため、ゴルジ装置撹乱物質、特にブレフェルジンＡに大きな関心が寄せられている。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）は、最初、抗真菌性、細胞毒性、および制癌性の抗生物質であると記述された（Ｈａｅｒｒｉら、１９６３年、Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．５９巻、５７２６ｈ）。ブレフェルジンＡは、また、抗ウイルス性を有するとも報告された（Ｔａｍｕｒａら、１９６８年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２１巻、１６１〜１６６頁）。近年、ブレフェルジンＡは、タンパク質輸送阻害物質として広く研究されている。ブレフェルジンＡは、ゴルジ装置を可逆的に撹乱し、それによって細胞質を通過するタンパク質輸送に影響を及ぼすことができると考えられている（Ｄｏｍｅｓら、１９８９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９巻、６１〜７２頁、１９８９年；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１２巻、５６７〜５７７頁）。今では、ブレフェルジンＡはゴルジからＥＲへの逆行性の膜輸送を引き起こすことが知られている（Ｄｉｎｔｅｒら、１９９８年、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９巻、５７１〜５９０頁）。現在は、ブレフェルジンＡは、タンパク質輸送の理解をより深めるために、でき上がったタンパク質のプロセシングおよび選別を妨害するためのツールとして研究者らに使用されている。ブレフェルジンＡは、試験した細胞の多くでＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を広く妨害するので、毒性に大きな懸念があり、治療薬としては開発されてこなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＥＲおよび／またはゴルジタンパク質と、アレルギー、癌、ウイルス感染などの様々な疾患状態で引き起こされる特異的タンパク質輸送過程を調整する機序とを解明し、そのような機序を選択的に標的とする薬理学的阻害物質を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の好ましい実施形態に従って、疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための方法が開示される。この方法は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に関連する少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖を阻害することを含む。この方法の好ましい変形例では、少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される。より好ましくは、少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質はＧＳ２８である。
【０００７】
本方法の好ましい実施形態においては、前記組成物が、次からなる群より選択される化合物を含む。
【０００８】
【化１】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【０００９】
【化２】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。）
【００１０】
【化３】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。）
【００１１】
【化４】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。）
【００１２】
【化５】
（式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。）
【００１３】
【化６】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【００１４】
【化７】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。）
【００１５】
【化８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。）
【００１６】
【化９】
（式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。）
【００１７】
【化１０】
【００１８】
【化１１】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【００１９】
【化１２】
【００２０】
【化１３】
【００２１】
【化１４】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【００２２】
【化１５】
【００２３】
【化１６】
（式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。）
【００２４】
【化１７】
【００２５】
【化１８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。）
【００２６】
本方法のより好ましい実施形態においては、前記組成物が化合物ＡＶＰ ８９３を含む。
【００２７】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法の変形例では、組成物は次の化合物を含み、その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される。
【００２８】
【化１９】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【００２９】
真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法の他の変形例では、組成物は次の化合物を含み、その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される。
【００３０】
【化２０】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【００３１】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＥＲとゴルジとの間のサイトカイン依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連するサイトカイン反応を阻害することを含む、疾患状態に関連するサイトカイン反応を選択的に阻害する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＥＲとゴルジとの間のウイルス性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってウイルス複製を阻害することを含む、ウイルス複製を選択的に阻害する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってＢ細胞のＩｇＥ分泌を減らすことを含む、アレルギー反応に関連するＢ細胞のＩｇＥ分泌を選択的に減らす方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＧＳ２８の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってＧＳ２８−介在タンパク質輸送を減らすことを含む、ＧＳ２８−介在タンパク質輸送を減らす方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、真核細胞に対する外的な作用の効果を変化させる方法であって、前記外的な作用がＧＳ２８−介在タンパク質輸送に依存しており、細胞中のＧＳ２８の発現を変えるのに十分な量の組成物を投与し、それによって外的な作用を変化させることを含む方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３６】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＧＳ２８の発現を減らすのに十分な量の組成物を投与し、それによって子孫ウイルス粒子（ビリオン）の集合を減らし、それによってウイルス感染を治療することを含む、ウイルス感染を治療する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、少なくとも１種のＥＲ−ゴルジタンパク質の発現を阻害するのに十分な量の薬剤を投与することを含み、前記少なくとも１種のＥＲ−ゴルジタンパク質は癌細胞の増殖に必要なものである、癌を治療する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
アレルギー疾患を治療するための新規な治療薬を開発する努力は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＥ反応を抑制するリード化合物の同定に結びついた。追加の一連の化合物は、その後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩｇＥ反応を抑制する活性度に基づいて合成された。これらの一連の化合物は、その合成経路および生物活性も、発行された米国特許第６，２７１，３９０号、第６，４５１，８２９号、第６，３６９，０９１号、第６，３０３，６４５号および第６，７５９，４２５号、ならびに係属中の米国特許出願第０９／９８３，０５４号、第１０／１０３，２５８号、第１０／６６１，１３９号、第１０／６６１，２９６号および第１０／８２１，６６７号、ならびに係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５９８５およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０６９８１に詳述されている。これらの出願は全て、それへの参照により全てそのまま本明細書に組み込まれる。これらの化合物は、ＩｇＥの抑制に加えて、サイトカイン生産／放出の阻害、細胞表面受容体の発現の抑制、細胞増殖の阻害を含む他の生物学的効果を有することが見出された。この一連のものに含まれたリード化合物のうちの幾つかはＡＶＰ ８９３、ＡＶＰ １３３５８およびＡＶＰ ２５７５２であり、それらは全て、上記の生物学的効果を共有しているが、一方で、多くの他の類似体の活性が、１つ以上のこれらの作用を基礎として、規定されてきた。
【００３９】
その化合物は、目標に基づいたアッセイを基礎として同定されず、むしろ細胞の活動に基づいて同定されていた。従って、最近まで作用機構は謎であった。これらの化合物の活性プロフィールは非常に変わっていて、それらの共有する作用機構が新規であることを示唆している。これらの薬剤は、７０を超えるキナーゼおよび他の酵素の活性に影響を及ぼさない。さらに、９５０を超えるタンパク質の発現に対する薬物活性のスクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの僅かひと握りの調整されたタンパク質を明らかにした。これらの結果、およびこの後に続く研究は、本明細書に記載された特許出願の基礎を形成する。
【００４０】
ＩｇＥの発現、サイトカインの誘出、膜受容体の発現および細胞増殖に対する抑制的な作用を共通に有する幾つかの別個のシリーズの化合物が記載される。これらのシリーズは次の化合物を含む。
【００４１】
【化２１】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。
【００４２】
【化２２】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。
【００４３】
【化２３】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。
【００４４】
【化２４】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。
【００４５】
【化２５】
式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。
【００４６】
【化２６】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。
【００４７】
【化２７】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。
【００４８】
【化２８】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００４９】
【化２９】
式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。
【００５０】
【化３０】
【００５１】
【化３１】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。
【００５２】
【化３２】
【００５３】
【化３３】
【００５４】
【化３４】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。
【００５５】
【化３５】
【００５６】
【化３６】
式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。
【００５７】
【化３７】
【００５８】
【化３８】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。
【００５９】
本発明の好ましい態様に従って、一般式（１）〜（４２）の例となる多数の具体的な化合物が合成され、試験された。いくつかの好ましい化合物を以下の表１に列挙する。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
最近、これらの化合物の多様な作用を関連付けるために、これらの化合物の作用機序が研究された。これらの研究は、細胞内タンパク質輸送（図１）がｉｎ ｖｉｔｒｏで薬物処理の影響を受けるという事実を明らかにした。この新規な作用機序は、ヒト疾患の治療に利用されている薬物による既知の機序とは異なる。さらに、細胞過程の分子メカニズムの精査に用いられている化学薬品のほんのひと握りだけが、細胞内タンパク質輸送を阻害することが知られている。本明細書に記載の化合物は、全ての初代細胞および多くの腫瘍細胞株において、小胞体（ＥＲ）とゴルジとの間の細胞タンパク質の移動を担う特定のタンパク質の発現に影響を及ぼす。さらに、細胞内タンパク質移動を追跡することを意図した研究では、これらの化合物が、モネンシンやブレフェルジンＡなど他の既知の阻害物質が利用するものとは異なる機序によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質のＥＲ−ゴルジ間移動を阻止することが示されている。この記載された活性は、ＡＶＰ化合物の既知の多様な作用を説明し、その他の活性、特にウイルス増殖の阻害をうまく予言している。
【００６５】
アッセイ
好ましい一つの実施形態においては、本発明は、アレルギーおよび／または喘息、あるいはＩｇＥが病原となる全ての疾患の治療に有用な、小分子のＩｇＥ（合成および／または放出）阻害物質を対象とする。本明細書に開示される特定の化合物は、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイの両方においてＩｇＥ濃度を抑制する能力によって同定されたものである。臨床治療計画の開発および最適化は、以下に記載するｅｘ ｖｉｖｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを参照することにより、当業者はモニターすることができる。
【００６６】
ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ
この系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原のプライミングで始まり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの二次抗体反応を測定する。以下のものを含むパラメータの範囲について基本プロトコルを記録し、最適化した：プライミングのための抗原の用量およびプライミング後のタイムスパン、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する細胞の数、ｉｎ ｖｉｔｒｏで二次ＩｇＥ（および他のＩｇの）反応を引き出すための抗原の濃度、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最適なＩｇＥ反応を可能にするウシ胎仔血清（ＦＢＳ）バッチ、プライミングしたＣＤ４＋Ｔ細胞およびハプテン特異的Ｂ細胞の重要性、およびＩｇＥについてのＥＬＩＳＡアッセイの特異性（ＭａｒｃｅｌｌｅｔｔｉおよびＫａｔｚ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１３５巻、第４７１〜４８９頁（１９９１年）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６７】
本プロジェクトのために利用した実際のプロトコルは、よりハイスループットの分析に適合させた。ＢＡＬＢ／ｃＢｙｊマウスは、ミョウバン４ｍｇに吸着させたＤＮＰ−ＫＬＨ１０μｇの腹腔内投与で免疫化し、１５日後に屠殺した。脾臓を切り取り、組織グラインダーで均質化し、２度洗浄し、ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、および２−メルカプトエタノール０．０００５％を加えたＤＭＥＭ中に保存した。脾臓細胞培養はＤＮＰ−ＫＬＨ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で確立させた（９６ウェルプレート４個１組で２００万〜３００万細胞／ｍｌ、０．２ｍｌ／ウェル）。抗原を含む脾臓細胞培養物に試験化合物（２μｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ）を加え、１０％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で８日間培養した。
【００６８】
８日後に培養上清を集め、ＭａｒｃｅｌｌｅｔｔｉおよびＫａｔｚ（上記）が記載した特異的アイソタイプ選択性ＥＬＩＳＡアッセイを変更したものによってＩｇを測定した。ハイスループットを促進するために、このアッセイを変更した。ＤＮＰ−ＫＬＨを一晩中コーティングすることによってＥＬＩＳＡプレートを調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、各培養上清のアリコートは希釈し（ＢＳＡ、アジ化ナトリウム、およびＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：４）、ＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃の加湿容器内で終夜培養した。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＥ（ｂ−ＧＡＭＥ）、ＡＰ−ストレプトアビジン、および基質で連続して培養した後、ＩｇＥ濃度を定量した。
【００６９】
培養上清を２００倍に希釈し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ｂ−ＧＡＭＧ１）をｂ−ＧＡＭＥの代わりに用いたことを除き、同様にして、抗原特異的ＩｇＧ１を測定した。培養上清を１：２０で希釈し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ｂ−ＧＡＭＧ２ａ）で培養した後、ＤＮＰ−ＫＬＨでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＩｇＧ２ａを測定した。各アイソタイプの定量は、検量線との比較によって決定した。全抗体の検出レベルは約２００〜４００ｐｇ／ｍｌであり、ＩｇＥ用ＥＬＩＳＡ中の他のどんなＩｇアイソタイプとの交差反応性も０．００１％未満であった。
【００７０】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ（上記）において活性であることが判明した化合物は、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇＥ反応を抑制する活性について試験した。キャリヤーで免疫化する前に低線量の放射線照射を受けたマウスは、７日後に抗原感作に対して高いＩｇＥ反応を示した。抗原感作の直前および直後に試験化合物を投与することによって、その薬物のＩｇＥ反応抑制能力を測定した。血清中のＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの濃度を比較した。
【００７１】
雌のＢＡＬＢ／ｃＢｙｊマウスに、毎日の光サイクル開始後、２５０ラドで７時間照射した。２時間後に、ミョウバン４ｍｇ中のＫＬＨ２μｇの腹腔内投与でマウスを免疫化した。６日後に、２日から７日連続して薬物注射を１日１回または２回のどちらかすることを開始した。典型的には、腹腔内注射および強制経口投与を、１０％エタノールおよび０．２５％メチルセルロースを含む生理食塩水の懸濁液（１５０μｌ／注射）として施した。各治療グループは、５〜６匹のマウスから構成した。薬物投与２日目、朝の薬物注射の直後に、ミョウバン４ｍｇ中のＤＮＰ−ＫＬＨ２μｇを腹腔内投与した。ＤＮＰ−ＫＬＨ攻撃後、マウスを７〜２１日間飼育した。
【００７２】
抗原特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ抗体をＥＬＩＳＡによって測定した。眼窩周囲出血を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を生理食塩水で５倍に希釈し、再度遠心分離した。各血液の抗体濃度は４種の希釈液（３通り）のＥＬＩＳＡによって測定し、検量線：抗ＤＮＰ ＩｇＥ（１：１００〜１：８００）、抗ＤＮＰ ＩｇＧ２ａ（１：１００〜１：８００）、および抗ＤＮＰ ＩｇＧ１（１：１６００〜１：１２８００）と比較した。
【００７３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物作用の測定
最初にｅｘ ｖｉｖｏでのＩｇＥ反応プロトコルにおけるＩｇＥ遮断活性（図２）に基づいて、これらの一連の化合物を同定し、このアッセイにおけるそれらの活性に基づいて、全ての類似体の生物学的活性を特徴づけた。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおける活性は、標準的な手順を用いて、ヒトＰＢＬのＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体で刺激したＩｇＥに対するＢ細胞の反応（図３）、およびマウスの脾臓Ｂ細胞の反応（図示せず）のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで確認した。Ｔ細胞に対する薬物の作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの様々な刺激に対するＴ細胞のサイトカイン反応を試験することにより示した。いくつかの代替の刺激に対するサイトカインおよびケモカイン構造の反応を、マウス脾臓およびヒトＰＢＬからのＴ細胞で試験した。刺激により少なくとも１０倍高められたサイトカインのデータを図４および図５に示す。マウスの脾臓からＴ細胞を分離し、刺激物＋／−ＡＶＰ１３３５８の存在下で１６時間培養した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを用いて、上清のサイトカインを定量した。サイトカインは全て少なくとも２００ｐｇ／ｍｌのレベルに達し、バックグラウンドよりも１０倍高かった（図４）。ドナーのＰＢＬからＴ細胞を分離し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）およびＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）＋／−ＡＶＰ１３３５８の存在下で１６〜３６時間培養した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを用いて、上清のサイトカインを定量した（図５）。サイトカインは全て少なくとも２００ｐｇ／ｍｌのレベルに達し、このレベルはバックグラウンドよりも少なくとも１０倍高かった。ＡＶＰ１３３５８は、アレルギーの発症に重要なもの、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を含めて多数のサイトカインのレベルを強力に抑制した。これらの化合物について発見された活性の第３のグループは、膜受容体の発現の抑制である。上記のＣＤ２３（Ｂ細胞ＩｇＥ受容体、図６）およびＩＬ−４受容体（図示せず）の発現を刺激する同様の手法を用いると、ＡＶＰ１３３５８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスＢ細胞およびヒトの単核細胞上のこれらの受容体の誘導を強力に遮断した。これらの化合物について発見された第４の活性は、細胞増殖の阻害であった。この作用は、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＬＰＳ、ＣｏｎＡ、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの様々な刺激物に対する初代細胞の増殖で最初に注目された。マウス脾臓細胞およびヒトＰＢＬの増殖に及ぼす薬物の影響をそれぞれ図７および図８に示す。これらの一連の化合物はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞増殖に対する増殖抑制作用を有することが示された（図９）。ＡＶＰ化合物は、６０−細胞スクリーニングパネルで試験するためにＮＣＩに付託した。図９に示したデータは、腫瘍細胞株の２日培養物からの全タンパク質の測定を表す。全タンパク質は、以下の概要の増殖実験の多くで採用されているＳＲＢアッセイによって評価した。
【００７４】
スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイプロトコル（ＮＣＩプロトコルに適合）
典型的なスクリーニング実験のために、個々の細胞株の倍加時間に応じて、５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの範囲のプレーティング密度で、細胞を１００μｌ、９６ウェルマイクロタイタープレートに植え付ける。細胞を植え付けた後、実験用の薬物を添加する前に、マイクロタイタープレートを３７℃、細胞株および培地に応じて５％または１０％ＣＯ２、空気９５％、相対湿度１００％で２４時間培養した。２４時間後、薬物添加時の各細胞株の細胞数の測定値を表すために、各細胞株のプレート２枚をｉｎ ｓｉｔｕでＴＣＡで固定した。薬物添加後、プレートを３７℃、ＣＯ２５％／１０％、空気９５％、相対湿度１００％で更に４８時間培養する。接着細胞については、冷ＴＣＡを添加してアッセイを終了させる。５０％（ｗ／ｖ）冷ＴＣＡ５０μｌを穏やかに加えて（最終濃度、ＴＣＡ１０％）ｉｎ ｓｉｔｕで細胞を固定し、４℃で６０分間培養する。上清を捨て、プレートを水道水で５回洗浄して、空気乾燥する。０．４％（ｗ／ｖ）スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）の１％酢酸溶液（１００μｌ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間培養する。染色後、１％酢酸で５回洗浄して結合していない染料を取り除き、プレートを空気乾燥する。その後、結合した染剤を１０ｍＭトリズマベース（trizma base）で可溶化して、自動プレートリーダーで波長５１５ｎｍの吸光度を読みとる。懸濁細胞についても、８０％ＴＣＡ５０μｌを穏やかに加えて（最終濃度、ＴＣＡ１６％）ウェルの底に沈殿した細胞を固定することでアッセイを終了させることを除いて方法論は同じである。７つの吸光度測定値［０時間、対照の増殖、および５つの濃度レベルの薬物の存在下での試験増殖］を用いて、薬物の各濃度レベルで増殖パーセントを計算した。
【００７５】
国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＣＩ）で行われた試験により、構造、および化合物が活性を示す細胞のプロファイルの両方において、この化合物が新規であることが明らかになった。
【００７６】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性によるｉｎ ｖｉｔｒｏ作用の確認
いくつかの化合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された結果をも反映してもいるヒト疾患のｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験された。マウスにおいて、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）モデルおよび気道過敏症（ＡＨＲ）モデルの２つのアレルギー性喘息のモデルを試験した。両方のモデルとも、ニワトリのオバルブミン（ＯＶＡ）に対する「アレルギー性」反応を引き起こす同様のプロトコルで開始した。ＢＡＬモデルでは、噴霧されたＯＶＡに応じた、細胞およびサイトカインの肺への浸潤を測定した。薬物を投与すると、標準プロトコル（図１０）おいても、他の同様のモデルにおいても、好酸球およびリンパ球の浸潤が抑制される。サイトカインおよびＩｇＥの増加が認められた場合は、薬物はこれらの反応も抑制した（図示せず）。メタコリン攻撃に対する気道過敏症反応も薬物によって阻害された（図１１）。最後に、マウスのＢ細胞のＣＤ２３発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物での長期にわたる（連続して３日以上）治療によって抑制された（図示せず）。
【００７７】
多くのｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍モデルで、活性について、化合物を試験した。Ｂ１６黒色腫細胞を同質遺伝子的（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスに皮下接種すると、急速な腫瘍増殖が起こった。腫瘍細胞を接種したマウスを薬物（ＡＶＰ２５７５２）で治療すると、賦形剤で治療したマウスに比べて、腫瘍増殖速度が著しく減少した（図１２）。異種移植片モデルにおいてヒト黒色腫細胞をＮｕ／Ｎｕマウスに接種すると、同様であるが、より劇的な結果が得られた（図１３）。Ｎｕ／Ｎｕマウス２５匹にＨｓｔ２９４ｔ腫瘍細胞８００万個を皮下注射で接種した。１２日後にマウスを２つのグループに分け、毎日ＡＶＰ８９３（１０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日）または賦形剤の腹腔内投与で治療した。
【００７８】
このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された様々な反応に対するＡＶＰ薬物の作用は、ｉｎ ｖｉｖｏでも注目される。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果が無傷な動物に引き継がれ得るという信頼レベルを与えるだけではなく、これらの薬剤が、これらの作用が有益であるヒト疾患を治療する上で有用であるかもしれないことをも示している。
【００７９】
生物学的活性のスクリーニング
これらの化合物が細胞レベルおよび分子レベルでどのように作用しているかを理解するために、いくつかの薬物活性のスクリーニングを開始した。最初の２つのスクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのある結合事象に対する薬物の活性および様々な酵素の活性を試験するために計画された（図１４および図１５）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの生化学的アッセイの結果（Ｙ軸上に示す）を図１４に示す。Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｉｎｃ．が行ったキナーゼアッセイのパネルの結果を図１５に示す。Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｉｎｃ．が行ったスクリーニングプロトコルの一部として、６０のキナーゼアッセイにおいて、ＡＶＰ１３３５８（１μＭ）を活性について試験した。しかしながら、上記の薬理学的活性についてＩＣ５０をはるかに超えて、１μｇ／ｍｌより低い濃度では薬物活性は観察されなかった。
【００８０】
第２シリーズの実験では、９５０を超えるタンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏのウェスタンブロット法（３重で）で試験した。この方法は以下に詳しく述べる。このスクリーニングにはＢ１６腫瘍細胞を選択し、薬物により変性され得るタンパク質の数を最適化するために、１６時間のＡＶＰ８９３の処理が選択された。６種のタンパク質のみが、薬物処理した細胞由来の溶解物中で常に、著しく変性されることが見出された（図１６）。Ｂ１６−Ｆ１０細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＡＶＢ８９３の存在下または非存在下で１６時間培養した。試料を回収し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから提供された指示書に従って溶解物を調製した。試料をドライアイス上に置き、９５０のタンパク質の発現を分析するために同所に付託した。これらの中で、ＧＳ２８およびニカストリンのみが、Ｂ１６および他の細胞株において一貫した変化をすることが見出された。両方のタンパク質は細胞では全く異なる機能を有しており、科学文献では（見たところ）関連付けられていないが、下記のように、それぞれのタンパク質で見られた変化について合理的な説明がある。
【００８１】
ウェスタンブロットおよび試料調製
真空排気により（接着細胞の場合）、または室温で５〜７分間の低速の遠心分離により（懸濁細胞の場合）、培地を除去した。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで遠心し、細胞ペレットを氷中に保存した。細胞２．０×１０７個あたり氷冷溶解バッファー３００μｌを加え、プロテアーゼ阻害剤を新たに加えた。細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、氷上で少なくとも３０分間培養し、培養中に数回ボルテックスミキサーにかけた。細胞溶解物を４℃で、２〜５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した。上清を新しい遠沈管に移し、ペレットを捨てた。試料のアリコートを等容量の２Ｘ試料バッファー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅからの「ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット」を用いて決定した。
【００８２】
電気泳動と転写
タンパク質試料（試料バッファー中）を１〜３分間煮沸し、氷上に置いた。同量のタンパク質をＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に注入した。電気泳動が完了した後、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製エレクトロブロッティング装置を用いて、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移した。その時、電圧は２〜３時間２５に設定した。室温で少なくとも３０分間、または４℃で一晩、膜を５％の乳汁（ＰＢＳ中、０．１〜２０％）で培養して、非特異的結合をブロックした。ブロックした膜を、５％乳汁で希釈した一次抗体（表２を参照）とともに、室温で１時間培養した。最適の抗体の希釈倍率は、会社、タンパク質の量に依存する。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製の一次抗体には、通常、１：１０００の希釈倍率が用いられる。膜は、ＰＢＳ、０．１％で５分間３〜４回洗浄した。膜を、５％乳汁で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに、室温で３０〜６０分間培養した。我々は通常、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製の二次抗体には、１:４０００の希釈倍率を用いた。膜は、ＰＢＳ、０．１％で３〜４回、各１５分間ずつ洗浄した。検出溶液ＡおよびＢを４０：１の比で混合し、膜上にピペットで移し、室温で５分間培養した。暗所で１枚のハイパーフィルムＥＣＬを膜上に置き、１分間曝露し、または相応に調節した。
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
細胞輸送タンパク質の発現
ＧＳ２８は、ゴルジおよび中間区画（ＩＣ、ＥＲとゴルジとの間に位置する）における小胞のドッキングおよび融合に関与するｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質である。したがって、ＧＳ２８は、ＥＲとゴルジとの間の、およびゴルジ槽内の（小胞を介した）タンパク質の移動両方に密接に関係している。ニカストリンは、引き続き核内に移動して転写因子として働く多くのタンパク質の膜内における切断を担うγ−セクレターゼ複合体の一部である。これらのタンパク質の中には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ノッチタンパク質、ｅｒｂＢ４、Ｅ−カドヘリンなどが含まれる。Ｂ１６細胞を薬物処理すると、ニカストリンの成熟が阻害され、完全にグリコシル化された活性部分を犠牲にして、未成熟で部分的にグリコシル化された形態のニカストリンが蓄積することになる。ニカストリンは普通、ＥＲを通過し、ＥＲで部分的にグリコシル化され、次いでゴルジに行き、ゴルジでグリコシル化およびシアル酸付加が完了する。このように、ニカストリンは実質的に積み荷タンパク質として働いており、その変化は細胞中をどのように移動するかを反映している。ニカストリンの成熟を抑制することにより、ＡＶＰ８９３処理は、おそらくはそのＧＳ２８に対する作用を介して、ＥＲからゴルジへのニカストリンの輸送を妨げると思われる。
【００８６】
ＡＶＰ８９３の推定されるタンパク質輸送作用をさらに試験するために、この経路における他のタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｂ１６および他の細胞株で試験した。ＡＶＰ８９３の細胞タンパク質に対する作用はＢ１６細胞で確認され、経時変化を含むように拡張された（図１７）。Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を集密度２０％でＴ７５フラスコに接種し、一晩培養した。いくつかのフラスコにＡＶＰ８９３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、化合物の添加後いくつかの時点で、１つのフラスコの細胞を回収した。溶解物を調製し、電気泳動により分離し、一般的なウェスタンブロットプロトコルで、上記のような抗体でプローブした。薬物のＧＳ２８およびニカストリンに対する作用は互いに類似しており、薬物の培養が長くなるほど次第に強くなった。ＡＶＰ８９３で２日間培養すると、ＧＳ２８は完全に消滅した。他の細胞株もＧＳ２８およびニカストリンの発現について試験し、量的な差は明らかであったが、薬物に対して同様に反応することが見出された。ＡＶＰ８９３に同様に反応することが見出された腫瘍細胞株には、ＣＡＫＩ、ＳＦ２９５、ＰＣ３、ＭＯＬＴ４、Ｎｅｕｒｏ２ａ、およびＲＢＬが含まれる（図１８、図１９、および図２０）。図１８に示した実験では、ＬＯＸ、ＣＡＫＩ、および３Ｔ３細胞株を図１７について記載したように処理した。図１９に示した結果では、ＳＦ２９５、ＰＣ３、ＭＯＬＴ−４、およびＮｅｕｒｏ２ａ細胞を図１７について記載したように処理した。図２０に示した結果では、ＬＯＸ、３Ｔ３、およびＲＢＬ細胞株を図１７について記載したように様々な濃度のＡＶＰ８９３で処理した。ＬＯＸ細胞に対する作用はあまり明白ではなかった。正常の繊維芽細胞株である３Ｔ３は、ＧＳ２８および成熟ニカストリンのレベルがＡＶＰ８９３曝露によって実質的に除去されたほどに、薬物に対してより大きい反応を示した。対照（control）として用いられるＥＲ内在タンパク質であるカルネキシンのレベルは、薬物処理した細胞では変化しなかった。ＡＶＰ８９３の濃度／３Ｔ３細胞についての反応評価は、ＧＳ２８および成熟ニカストリン発現についてのＩＣ５０が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間であり（図２０）、３Ｔ３細胞の増殖をＡＶＰ８９３が阻害するＩＣ５０と一致することを示唆している。
【００８７】
ＡＶＰ８９３はまた、様々な刺激物で刺激されたマウスの脾臓細胞のＧＳ２８の発現を抑制する（図２１）。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を刺激物＋／−ＡＶＰ８９３（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で２０時間培養し、回収して、図１７に記載したように調製した。刺激の条件には、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）に抗ＣＤ４０抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えたもの、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）にイオノマイシン（１００ｎＭ）を加えたもの、またはＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）が含まれる。３Ｔ３繊維芽細胞と同様に、脾臓細胞のＧＳ２８の発現は薬物により排除されたが、一方で、カルネキシンの発現は最小限の影響しか受けなかった。図２２は、マウス脾臓細胞による、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体刺激を受けたＩｇＥ生産または増殖の阻害について異なる効力を有する３つの化合物の作用を比較するものである。この実験は、増殖抑制効力が高い（ＡＶＰ８９３、５ｎＭ）、中程度（ＡＶＰ２６２９７、５０ｎＭ）、低い（ＡＶＰ２５６３０、５００ｎＭ）様々なＡＶＰ化合物を試験して比較したことを除いて、図２１について記載したように行った。ＡＶＰ８９３は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌで試験し、ＡＶＰ２６２９７は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌで試験し、ＡＶＰ２５６３０は１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌで試験した。各化合物について、ＧＳ２８および成熟ニカストリン両方に対する作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に対する作用に匹敵しており、細胞およびタンパク質のレベルではこれらの作用が関連付けられることが示唆された。
【００８８】
いくつかの試料はタンパク質キナーゼＣ活性剤であるＰＭＡでも処理したことを除いて、マウス脾臓細胞で行ったのと同様の実験をヒトＰＢＬで繰り返した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物でＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体にＰＭＡを添加しても、ヒトＰＢＬの増殖またはそのＩｇＥ反応は影響を受けることはないが、その両尺度を阻害するためのＡＶＰ８９３の効力が高められる（図２３）。ＰＢＬを準備し、刺激物＋／−ＡＶＰ８９３の存在下で４日間培養した後、３Ｈ−チミジンでパルス標識して回収した。刺激の条件は、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体、またはＰＭＡとＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体の組合せのいずれかであった。これらの培養物について、以下の濃度のヒト特異的試薬を用いた：ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＣＤ４０抗体（３００ｎｇ／ｍｌ）。同様に、ＰＭＡをＰＢＬに添加しても、ＧＳ２８のレベルは上昇しないが、ＧＳ２８発現を阻害するためのＡＶＰ８９３の効力は高まる（図２４）。ＰＢＬ培養は、細胞は４８時間後に回収し、ウェスタンブロット用に溶解物を調製した（図１７のように）ことを除いて、図２３について記載したように行った。これらの結果は、ＡＶＰ８９３の細胞の作用と一次（非形質転換）細胞のＧＳ２８の発現との間に関連があることの追加の証拠を提供している。
【００８９】
ＡＶＰ８９３がＧＳ２８タンパク質の発現を低減させる具体的な様式は未だ知られていないが、薬物添加後３〜１６時間に試験するとＡＶＰ８９３はＧＳ２８ ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさなかったため、転写は関与していないと思われる（図２５）。ヒト軟膜はＳａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋより購入した。軟膜は、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃプロトコルに従って、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用い、赤血球を取り去った。次いで、リンパ球（２０００万個）を、７５ｃｍ２フラスコ中で、ｃＤＭＥＭ（＋／−刺激物およびＡＶＰ８９３）中で４時間または２４時間培養した。細胞を回収し、本質的にＭａｎｉａｔｉｓが記載したように、グアニジン／フェノール溶液中で再形成した。水層を除去して、グアニジン溶液で洗浄し、最後に７０％エタノールで洗浄した。分光光度計によりＲＮＡ純度を確認した。ＲＴ−ＰＣＲ一段階プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ＲＴ−ＰＣＲ（３６サイクル）を実施した。他の細胞源から得られたｍＲＮＡ試料を試験したところ、同様の結果が得られた（図示せず）。
【００９０】
プライマー
ＧＳ２８ ５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＧ−３’,５’−ＣＣＴＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧ−３’
ＡＣＴＩＮ ５’−ＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’５’−ＴＧＧＣＣＴＴＡＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧ−３’
ＧＳ２８は、細胞を通る小胞の移動を担う相互に作用するタンパク質の複雑な経路の一員にすぎない。小胞のドッキングおよび融合に関与するＳＮＡＲＥタンパク質に加えて、Ｒａｂｓとして知られる小型のＲａｓ様ＧＴＰａｓｅのグループが、それらの相互作用を可能にするこれらのタンパク質の多くの活性化を担っている。ＥＲ−ゴルジ間タンパク質輸送において顕著な役割を果たすことが知られているＲａｂタンパク質には、Ｒａｂ１ａ、Ｒａｂ１ｂ、およびＲａｂ６が含まれる（図２６）。Ｒａｂ１タンパク質は両者ともＣＯＰＩＩタンパク質被覆小胞がＥＲからゴルジへ移動するのを助け、一方、Ｒａｂ６は小胞がＥＲに戻る逆行移動に関与している。ＧＳ２８に対する作用と一致して、ＡＶＰ８９３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３Ｔ３およびＰＭＡ／イオノマイシン刺激脾臓細胞におけるＲａｂ６の発現も抑制した（図２７）。図１７について記載したように、３Ｔ３繊維芽細胞およびＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をＡＶＰ８９３と共に一晩培養して回収した。脾臓細胞は、図２１について記載したように、ＰＭＡ／イオノマイシンの存在下および非存在下で培養した。Ｒａｂ１の反応は細胞によって異なり、Ｒａｂ１ｂは脾臓細胞では薬物によって抑制されたが、３Ｔ３細胞では影響を受けず、一方、Ｒａｂ１ａは３Ｔ３細胞では薬物に対して穏やかな反応を示した（図２７および図２８）。
【００９１】
様々な他の輸送タンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３の作用も試験したが、いくつかの推定されるＧＳ２８の相互作用の相手（ＶＡＭＰ１、Ｇｓ１５、Ｙｋｔ６）、ならびに様々な係留（tethering）タンパク質およびＧＴＰａｓｅを含む他のタンパク質はどれも、量的に変化されなかったと思われる（図２６）。これらのタンパク質の殆どは、ＥＲ−ゴルジ領域の外で機能するが、多くのものの所在は明らかにされていない。
【００９２】
ＡＶＰ８９３は、マンノシダーゼＩＩ（図３０）およびＧＰＰ１３０（データは示さず）と同じく、図２９に示すように、ＧＳ２８およびＧＳ１５などのゴルジ内在タンパク質の量的な発現に、時間に依存した形で影響を及ぼすことが見出された。３Ｔ３細胞のＧＳ１５の染色は、約２〜４時間曝露すると始まるが、ＡＶＰ８９３によって大幅に低減するのに対して、ＧＳ２８のレベルは８時間曝露後に減少し始め、ついには２０時間の薬物培養後に著しく減少したレベルになる。ゴルジ構造タンパク質であるＧＭ−１３０はＡＶＰ８９３の影響を受けなかったと思われる（データは示さず）。同様に、非ゴルジ内在タンパク質であるＲａｂ６は、図３１に示したように、いくつかの細胞型では影響を受けなかったと思われる。
【００９３】
これらの結果は、ＡＶＰ８９３が、ゴルジ内在タンパク質であるＧＳ１５、ＧＳ２８、ＧＰＰ１３０、およびマンノシダーゼＩＩの発現に差別的に作用し、ゴルジ構造タンパク質であるＧＭ−１３０にはさほど影響せず、Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｂ６に対しては殆ど作用しないことを実証している。さらに、これらの作用は、ある種の作用は早い時点で見られたが、ＡＶＰ８９３と共に一晩（１６〜２０時間）培養した後に最も顕著である。これらの結論はウェスタンブロット分析（図２９）および免疫細胞化学的研究（図３０〜３１）から導き出された。より詳しくは、炭水化物のプロセシングに関与するゴルジ内在酵素であるマンノシダーゼＩＩは、ＡＶＰ８９３投与の１時間後にゴルジ中で減少し始めることが示され（図３０）、４時間後には識別できる量の酵素が殆ど〜全く残らず、１８時間後には確実に全く残らなかった。これとは対照的に、図３１に示したように、１８時間後でも、ＧＴＰａｓｅ Ｒａｂ６の染色は低減せず、ＡＶＰ８９３の存在によって大きく変わることはなかった。
【００９４】
したがって、ＡＶＰ８９３は、ゴルジ内在タンパク質に差別的に影響を及ぼすが、一方で、非内在タンパク質（例えばＲａｂ６）またはＧＭ−１３０などの構造タンパク質には影響を及ぼさずにいる（データは示さず）と結論付けることができる。さらに、マンノシダーゼＩＩのデータは、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ８９３の作用の経時変化のさらに別の例であり、それでは、発現レベルはゆっくりと低減し、ついには薬物培養の１６〜２０時間後に激しく低減したレベルになる。
【００９５】
ＡＶＰ８９３で処理した後の超微細構造レベルのゴルジの構造および形態を試験するために、実験を行った。処理していないＭＯＬＴ４細胞、およびＡＶＰ８９３（２００ｎｇ／ｍＬ）で２時間または１８時間処理したＭＯＬＴ４細胞を電子顕微鏡で分析したところ、ＡＶＰ８９３がゴルジの構造を崩壊させることが実証された（図３２）。ＡＶＰ８９３で２時間処理した時、および１８時間処理した後（データは示さず）には、ゴルジ槽は見られなかった。この結果は、ＡＶＰ８９３を１時間、４時間、および１８時間適用したＶｅｒｏ細胞でも再現され、後の２つの曝露では槽構造が崩壊した（データは示さず）。したがって、ＡＶＰ８９３は処理後数時間以内にゴルジ槽の構造を撹乱すると結論を下す。
【００９６】
細胞内タンパク質移動
この領域内での輸送タンパク質に対する選択的阻害により、ＥＲ−ゴルジを通るタンパク質移動に対するある作用が示唆される。この可能性を直接試験するために、細胞を薬物と共に、および薬物なしで１６〜２０時間培養し、回収し、溶解し、様々な濃度のイオジキサノール含有画分（２．５〜３０％）のグラジエント上に重層した。グラジエントを５６Ｋｘｇで２〜１８時間遠心分離し、回収して、ウェスタンブロットにより内在タンパク質について試験した。画分は、カルネキシン（ＥＲ特異的マーカー）、γ−アダプチン（ゴルジ）、およびＲａｂ５ａ（小胞）に特異的な抗体でプローブした。図３３〜３６はそれぞれ、小胞体（ＥＲ）の場合はカルネキシン、ゴルジ（Ｇ）の場合はγ−アダプチン、および小胞／エンドソーム（Ｖ）の場合はＲａｂ５ａであるマーカータンパク質の存在と比較した、各画分に存在する様々なタンパク質のレベルを示す。図３４および図３５はそれぞれ、また、密度勾配遠心分離の前に得られたＲａｂ６およびＲａｂ１Ｂの非分画のレベルを示す。これら３つのマーカータンパク質の発現において、対照と薬物処理した細胞との間に差は見られなかった。
【００９７】
Ｂ１６Ｆ１／Ｂ１６Ｆ１０密度勾配プロトコル
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、薬物を適用する１日前に１７５ｃｍ２のフラスコに接種した。翌日、培養物に、新たに調製した培地＋／−薬物を当てた。１６時間後、冷却したＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで細胞を洗浄し、その後、氷冷したホモジナイズ用バッファー：ＫＣｌ １３０ｍＭ、ＮａＣｌ ２５ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４ ２５ｍＭに、バッファー５ｍＬ当たりプロテアーゼ阻害剤１５μｌを加えたものの中に回収した。フラスコ１本当たりバッファー１ｍＬを使用し、細胞は破片にして１４ｍＬ培養用丸底試験管に入れ、氷上に保存した。次いで、回収した細胞を組織用ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１０／３５）でホモジナイズし、２ｍＬ遠沈管に移して、４℃、８分間、１０００ｒｐｍで遠心した。上清を集め、予めホモジナイズ用バッファーと共に調製し、冷却しておいた３０％〜２．５％のイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）のグラジエント上に置いた。１６×１００ｍｍの超遠心分離用試験管を用い、ＡＨ−６２７ローター付Ｓｏｒｖａｌ ＯＴＤ５０Ｂ 超遠心分離機で、試料を２７，０００ｒｐｍで１時間遠心した。グラジエント上部から試料１ｍＬを注意深く取り、その後、ウェスタンブロット分析のために２Ｘ試料用バッファーで希釈した（１レーン当たり１６μｌ注入）。注意：このプロトコルを通して、試料はできる限り氷上に保った。
【００９８】
ＡＶＰ８９３で処理した細胞ははるかに少ないＧＳ２８しか発現しなかったが、その分配に著しい変化はなかった（図３３）。ニカストリンははるかに広く分配され、薬物処理した細胞からの溶解物の画分全てにおいて部分的にグリコシル化された形態で主に発現された（対照の細胞に対して）。Ｒａｂ１ｂおよびＲａｂ６の発現も試験した。その結果を図３４および図３５にそれぞれ示す。どちらのタンパク質も（ＧＳ２８とは対照的に）未画分溶解物中では量的に減少しなかったが、Ｒａｂ１ｂとＲａｂ６両方ともゴルジ区画ではなく、ＥＲ中に保持されていた。Ｒａｂ１ａについても、同様の結果が示された（図示せず）。Ｒａｂ６も小胞中に局在すると思われ、ＥＲ（逆行）またはゴルジ（順行）どちらかとの小胞の融合はＡＶＰ８９３により阻害される可能性が示唆された。ゴルジ後方区画中に主に配置されるＳＮＡＲＥタンパク質であるＳＮＡＰ２３は、同様にＥＲへ移動した（図３６）。しかしながら、この場合、ＳＮＡＰ２３はＥＲで積み荷タンパク質として発現され、ＥＲからゴルジへ周辺の区画を通過して移動する。
【００９９】
ブレフェルジンＡとの比較
タンパク質の細胞内輸送に影響を及ぼすことが知られている少数の化合物の中で、最も研究されている２つはモネンシンとブレフェルジンＡである。モネンシンは、ＡＶＰ化合物について注目される幾つかの作用（例えばサイトカインの阻害）を共有するナトリウムイオン透過担体である。しかしながら、モネンシンはゴルジ後方区画中で作用するので、その活性において質的な不一致があり、この化合物が違ったふうに作用することを明らかに実証している。しかしながら、ブレフェルジンＡはＥＲからゴルジへのタンパク質の移動を遮断し、サイトカイン生産／放出および腫瘍細胞増殖を含むＡＶＰ８９３で見られる作用の多くを共有する。ブレフェルジンＡの機序はかなり良く描出されており、ゴルジからＥＲへの逆行ＣＯＰＩＩ小胞の出芽の活性化を担うＧＴＰａｓｅであるＡｒｆ１上でのＧＤＰ−ＧＴＰ変換の阻害によるゴルジの崩壊を伴っている。しかしながら、Ａｒｆ１は主としてＥＲ−ゴルジ領域に位置するが、他の区画中にも見られ、ＥＲ−ゴルジ領域よりも広い作用を有すると思われる。
【０１００】
ブレフェルジンＡは、６０細胞のスクリーニングにおいての腫瘍細胞増殖の阻害について、ＮＣＩにより試験された。ＮＣＩの６０細胞スクリーニングは、実質的に図９について記載したように行われた。ブレフェルジンＡについてのＮＣＩのデータベースから入手可能なデータを、より最近のＡＶＰ８９３のデータと比較した。ブレフェルジンＡに関して得られた結果とＡＶＰ８９３のデータとの比較から、ブレフェルジンＡは１０〜１００ｎＭの濃度で実質的に全ての細胞の増殖を阻害するが、ＡＶＰ８９３は試験した細胞株に応じて効力にかなりの変動を示した（＜１０ｎＭ〜＞１０μＭ）ことが示される（図３７）。ＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかの存在下でいくつかの腫瘍細胞株を約７２時間培養し、その後、図９について記載したように、全タンパク質（ＳＲＢ）を測定することによって増殖反応を評価した。社内で行った一対一の比較の結果も、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのブレフェルジンＡおよびＡＶＰ８９３に対する細胞の相対的な増殖反応が実質的に変動したことも示している（表３）。
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
表３に略述した細胞株で、タンパク質の発現に対する化合物の作用のさらなる比較を行った。図３８に示すように、ＡＶＰ８９３は、２つの「感受性の」細胞株で、増殖に対する活性と殆ど匹敵する濃度で、ＧＳ２８（および成熟ニカストリン）の発現を阻害した。ＭＯＬＴ−４、Ｈｓ２９４Ｔ、およびＨ４６０細胞をＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかと共に一晩培養し、回収して、図１７について記載したようにウェスタンブロット用に調製した。ＡＶＰ８９３は、耐性系のＨ−４６０では、ＧＳ２８またはニカストリンへの影響がなかった。対照的に、ブレフェルジンＡは、高濃度で、少々の低減（ＭＯＬＴ４、Ｈｓ５７８Ｔ）から発現の大きな増大（Ｈ−４６０）までの範囲で、ＧＳ２８への可変の影響を有していた。さらに、ＧＳ２８に見られた変化は、これらの細胞株における増殖について、ブレフェルジンＡのＩＣ５０に匹敵しなかった。ニカストリンへの影響は最小であった。
【０１０３】
これらの結果は、ブレフェルジンＡとＡＶＰ８９３とは、タンパク質輸送を阻害するために、異なる機序で作用することを明白に示している。ＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかで処理した細胞に由来する溶解物の密度勾配遠心分離を比較した最初の結果は、２つの化合物が同様の方法でＲａｂ６の分配を変えることを示している（図３９）。３Ｔ３細胞を培養し、回収して、図３３に記載した手順と同様の密度勾配遠心分離のために調製した。これは、ＡＶＰ８９３がＥＲ−ゴルジ間のタンパク質の移動を阻害するように作用しているという考えを支持している。ＡＶＰ化合物は、試験した全ての非形質転換細胞でＧＳ２８を抑制するが、全ての腫瘍細胞がこのように反応するわけではない（図４０）。１μｇ／ｍｌのＡＶＰ８９３で１８〜２０時間処理した６つの細胞株に由来する溶解物をニカストリンおよびＧＳ２８の発現について比較した。ウェスタンブロットのために、各レーンに同量の全タンパク質を注入した。腫瘍細胞は様々な遺伝子改変を受け、それ自身で、増殖能力を増加するために、正常のタンパク質輸送を回避することがある。したがって、ＡＶＰ８９３（またはブレフェルジンＡ）の特異的な標的は同定されていないが、ＥＲ−ゴルジを通るタンパク質輸送を阻害することがその機序として提案されている。
【０１０４】
ゴルジに影響を及ぼすことが知られている薬理剤に比べて、ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質に対して特異な活性を有することを示すために、さらなる研究を行った。ＡＶＰ８９３の活性と、既知の薬剤であるモネンシン、ブレフェルジンＡ、およびラパマイシンの活性とのこの比較は、ＡＶＰ８９３が独特の方法でゴルジ内在タンパク質に影響を及ぼすことを実証する助けとなる。組合せ処理では、第１の薬剤を添加して１時間後に、第２の薬剤を添加し、その後１８時間培養する。薬剤の用量は以下のとおりである：ＡＶＰ８９３、２００ｎｇ／ｍｌ；ブレフェルジンＡ、１０ｍｇ／ｍｌ；モネンシン、１０ｍｇ／ｍｌ、ラパマイシン１０ｎＭ。図４１に示すように、ＡＶＰ８９３は、他の３つの薬剤よりも著しくＧＳ２８およびＧＳ１５の発現を低減させ、そのＧＰＰ１３０に対する作用（より低い、推定上、未成熟形態の糖タンパク質の発現をもたらす）は、モネンシンとのみ匹敵した。加えて、ブレフェルジンＡおよびモネンシンは、８９３と組み合わせると、その活性が優勢となるが、ブレフェルジンＡまたはモネンシンにのみ誘発される発現の「表現型」を示す。８９３をラパマイシンと組み合わせた時にのみ、８９３のタンパク質の発現の「表現型」が起こる。したがって、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ８９３の活性は独特であり、既知の薬剤であるモネンシン、ブレフェルジンＡ、ラパマイシンとは異なる。
【０１０５】
他の既知の薬理剤であるブレフェルジンＡと比較して独特なＡＶＰ８９３の活性を決定するために、タンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３およびブレフェルジンＡの用量増加の効果を複数の細胞株で比較した。ＡＶＰ８９３は、３つの異なる細胞株にわたってブレフェルジンＡとは異なる方法でゴルジ内在タンパク質ＧＳ２８に影響を及ぼすことが示された（図４２）。ＡＶＰ８９３処理の有効範囲は、ブレフェルジンＡのそれに近くはなかった。さらに、Ｒａｂ６の発現はＡＶＰ８９３によって大きな影響を受けないことが再び示されたが、対して、ブレフェルジンＡは細胞の種類に応じて、その発現に対する影響が様々であった。結論として、ＡＶＰ８９３の独特な活性は、複数の細胞株にわたって存在した。
【０１０６】
ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質（例えば、マンノシダーゼＩＩ）に対して独特の活性を有することの更なる証拠は、ウェスタンブロット分析の代わりに、薬物曝露の時間を短くし、免疫細胞化学試験を用いて見出された（図４３）。この実験は、ブレフェルジンＡおよびノコドゾール（Nocodozole）で１時間処理すると、マンノシダーゼＩＩの標準の染色パターンが撹乱されることを示した。三日月形のゴルジの標識は、ブレフェルジンＡの場合は完全に消散し、あるいはノコドゾールの場合は広がって無数の小さな点状の破片となった。しかしながら、この実験では、ＡＶＰ８９３に１時間曝露しても明白な作用はなく、確かにマンノシダーゼＩＩの局在または発現レベルにはいかなる混乱もなかった。結論として、図４３に示した結果は、ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質に対して独特の方法で作用することの更なる証拠を提供する。
【０１０７】
タンパク質輸送の阻害により予想される他の生物学的作用
ＥＲからゴルジへの輸送の阻害を実証することにより、観察されるＡＶＰ化合物の作用の明確な説明が与えられる。古典的なＥＲ−ゴルジ経路は、ＩｇＥ、多くの膜受容体、および多くのサイトカインを含む殆どの細胞内タンパク質の好ましい輸送／成熟経路である。後者の一つの例外はＩＬ−１であり、これは「非古典的な」分泌経路によってＥＲ−ゴルジを回避する。ＡＶＰ１３３５８は殆どのサイトカインの分泌を阻害するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１のレベルに影響を及ぼさない。
【０１０８】
提案された細胞内タンパク質輸送に関するＡＶＰ化合物の機序によって、これらの化合物が共有する可能性のある他の作用および非作用に関して、ある種の予測もできるようになる。例えば、モネンシンなどのポストゴルジ活性の化合物に予想されるように、ＥＲとゴルジとの間の小胞の融合または出芽の阻害はエキソサイトーシスに影響を及ぼすことはない。ＡＶＰ８９３は、エキソサイトーシスに関与するタンパク質、特にＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ２３（非神経細胞）、およびＳＮＡＰ２５（神経細胞）の発現に及ぼす影響は最小である。したがって、この化合物は、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞のノルエピネフリンの放出またはドーパミンの再取込みに影響を及ぼさない（図示せず）。さらに、ＡＶＰ８９３の類似体であるＡＶＰ１３３５８は、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはＩｇＥ−抗原複合体で誘発したとき、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞の脱顆粒を阻害しない（図示せず）。
【０１０９】
ＥＲとゴルジとの間の正常な小胞の移動を遮断することで起こり得る重要な結果は、ウイルスタンパク質の成熟および細胞内伝播の阻害である。殆どのウイルスは、そのタンパク質の同化および最終的には感染性について、古典的なＥＲからゴルジへの経路に依存している。ブレフェルジンＡは、ＥＲ−ゴルジにウイルスタンパク質の蓄積を引き起こす。ＡＶＰ８９３のウイルス伝播を阻害する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−２を感染させ、薬物濃度の増加の効果を観察することによって試験した（図４４）。Ｖｅｒｏ細胞（１００万個／ｍｌ）を一晩培養し、ＡＶＰ８９３を添加して約１時間後に生きている２型ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２、ＡＴＣＣ）約１５０ＰＦＵを接種した。４８時間後に培地を取り除き、細胞を生理食塩水で洗浄して、生物学的プラーク染色で２０分間染色した。水１ｍｌを加え、液体を除去した後、ＰＦＵを計数してウイルスを定量した。ＡＶＰ８９３は、試験した全ての濃度で、プラークの形成を抑制し、３００ｎｇ／ｍｌで完全にブロックされた。さらに、急勾配の濃度−反応曲線から、ウイルスよりもむしろ、宿主細胞に作用する薬物に予想されるような、非競合的阻害であることが示唆される。
【０１１０】
ウイルス感染の広がりに対するＡＶＰ８９３の作用をさらに調べた。ＡＶＰ８９３（３００ｎｇ／ｍｌ）を適用して１６時間後に、ウイルスを接種した。図４５に示した時点は、ウイルス接種後の時間を表している。ＡＶＰ８９３はゴルジ内在タンパク質の発現および局在化に対して作用することを実証したので、次の一連の実験は、そのライフサイクルでゴルジを利用するウイルスであるＨＳＶに対するＡＶＰ８９３の作用を試験した。図４５に示した免疫細胞化学的研究に加えて、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、ならびにそのライフサイクルでゴルジを使用する他の系統のウイルスについて、広範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏのプラークアッセイを行った（表２を参照）。
【０１１１】
ウイルス粒子（ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｅをラベルして図４５に視覚化した）がＡＶＰ８９３の存在下で最初の感染部位を越えて広がるかどうかかを測定した。ＨＳＶ−２に感染した培養物をＡＶＰ８９３で処理した。その結果は、最初の感染部位を越えて、周囲の細胞にラベルは殆ど〜全く見られなかったことを実証している。ｇＢ、ｇＤ、およびカプシドタンパク質ＩＣＰ５を含む他のＨＳＶタンパク質も試験し、同様の結果を得た（データは示さず）。結論として、ＡＶＰ８９３はＨＳＶ−２ウイルス粒子の広まりを妨げた（または、少なくとも感染性粒子の広まりを妨げる）。さらに、ＡＶＰ８９３は、培養物の初期感染を阻止したのではなく、ウイルスのその後の広まりのみを阻止したと思われた。これらの結果は、ＡＶＰ８９３が、ゴルジ内在タンパク質に対する作用を通して、ＨＳＶ−２がするように、そのライフサイクルでゴルジを利用するウイルス粒子の広まりを阻害しているかもしれないという概念実証を与える。
【０１１２】
ＨＳＶタンパク質の発現に影響を及ぼす他に、ＡＶＰ８９３は、他のウイルスの系統に対する抗ウイルス活性を発揮することが実証された。ゴルジを利用すると思われる系統からの代表的なウイルスを試験した。表４に示すように、多くの他のウイルス系統の広まりは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＶＰ８９３により阻止された。さらに、モルモットの局所的ＨＳＶモデルは、ＡＶＰ８９３はｉｎ ｖｉｖｏでウイルスの活性を阻害するかもしれないことを示している（データは示さず）。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
細胞内タンパク質輸送の阻害
記載された本発明の好ましい態様は、少なくとも１７の構造クラスの化合物を含む（表５）。これらのシリーズの全てを代表する化合物は、ＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を阻害するのと同様の濃度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩｇＥ反応および細胞増殖を阻害する。後者は、非形質転換細胞でＧＳ２８の発現が阻害されることにより証明される（図４５）。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
本発明の好ましい態様は、アレルギー、細胞増殖およびウイルス複製を含む、多くの生物学的プロセスに影響を与えるタンパク質輸送を選択的に変調する新規な機序に関する。さらに特には、本発明の態様は、この機序を調整し、それによって生物学的プロセスを変調する化合物の同定およびキャラクタリゼーションに関する。本明細書に記載したように、ゴルジと中間区画（ＩＣ、ＥＲとゴルジとの間に位置する）での小胞のドッキングおよび融合に関与するｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質であるＧＳ２８、および、核内に移動して転写因子として動作するタンパク質の膜内切断に関係するニカストリンの両方が、広範囲の生物学的活性を示す化合物の影響を受けることが見出された。さらに、これらの化合物で処理すると、ニカストリンの成熟が妨げられ、完全にグリコシル化された活性部分を犠牲にして、未成熟で部分的にグリコシル化された形態のニカストリンが蓄積することが明らかになった。ニカストリンは普通、ＥＲを通過し、ＥＲで部分的にグリコシル化され、次いでゴルジに行き、ゴルジでグリコシル化およびシアル酸付加が完了する。したがって、ニカストリンの状態の変化は、ニカストリンが細胞中を移動することから、細胞内区画と関係があるように思われる。これらの化合物は、ニカストリンの成熟を抑制することにより、ＥＲからゴルジへのニカストリンの輸送を防止している可能性がある。ニカストリンの輸送が防止されるのは、薬物の存在下でＧＳ２８の発現が低減されることによる可能性がある。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態の上記の記載は、本発明の範囲を限定しようとするものではない。実際、Ｊｕｎｇら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０００年、２１巻、３３６９〜３３７７頁）は、ＥＲおよびゴルジ装置に関連する内在タンパク質は１５７種ある（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース、表１）ことを指摘している。Ｔａｙｌｏｒら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９７年、１８巻、６４３〜６５４頁）は、ラット肝細胞のゴルジの１７３種のタンパク質を報告した。したがって、ＧＳ１５、ＧＳ２８、ニカストリンおよびＲａｂ（本明細書では、ＡＶＰ化合物によって抑制されることが示されている）の他にも、上記のものと同一のまたは重複する経路を介して、疾患状態（とりわけ、アレルギー、癌、ウイルス感染）においてタンパク質輸送に影響を及ぼす、他のＥＲ／ゴルジタンパク質のターゲットは多数ある可能性がある。したがって、本発明者らは、増殖的な（またはウイルス複製的な）細胞の反応に必要なタンパク質輸送を選択的に調整するための一つの好ましい手段として、例えばＧＳ２８レベルの薬理的抑制を明らかにしたが、ＧＳ２８と協調して作用する、またはＧＳ２８の作用を補い、あるいは高める、他のＥＲ／ゴルジ関連タンパク質を変調することは、増殖／複製の障害を治療するための他の好ましい手段を示す可能性がある（図４６および図４７に概略図の形で示したように）。あるいは、病的な輸送反応の抑制を高めるような、他のＥＲ／ゴルジタンパク質を標的とする他の薬剤との併用療法は、本発明の範囲内の他の実施形態を表すものである。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態の興味深い態様は、重複するタンパク質輸送経路、およびそれに関与するタンパク質が、疾患状態（例えば、形質転換された、感染した、など）に関係する細胞に関連する「悪い」輸送を選択的に抑制するにもかかわらず、正常な（または「良い」）タンパク質輸送のニーズを成し遂げることを細胞ができるように作動することである。したがって、本発明者らは、本明細書に開示された選択的薬理療法を用いると、（ブレフェルジンＡを用いる治療レジメンとは対照的に）毒性を最小限にできることを見出した。
【０１２３】
当業者であれば、ごく普通の実験だけを使用して、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの同等物を理解し、または確認できるであろう。そのような同等物は次の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、細胞内タンパク質輸送を説明する概略図である。
【図２】図２は、ｅｘ ｖｉｖｏでの抗原に対するＩｇＥ反応を示す。
【図３】図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＰＢＬのＩＬ−４＋αＣＤ４０ Ａｂに対するＩｇＥ反応を示す。
【図４】図４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスの脾臓Ｔ細胞のサイトカイン反応を示す。
【図５】図５は、ヒトＰＢＬのＴ細胞のサイトカイン反応を示す。
【図６】図６は、ヒトの単核細胞のＣＤ２３を示す。
【図７】図７は、ＡＶＰ ８９３に対する脾臓細胞増殖反応を示す。
【図８】図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激物および薬物に応じたヒトＰＢＬの増殖を示す。
【図９】図９は、ＮＣＩ ６０−細胞パネルを示す。
【図１０】図１０は、ＢＡＬプロトコル＃１の概略図であり、ＢＡＬ洗浄の細胞を例証する。
【図１１】図１１は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＨＲ反応を示す。
【図１２】図１２は、Ｂ１６−Ｆ１マウス黒色腫腫瘍増殖に及ぼすＡＶＰ ２５７５２の影響を示す。
【図１３】図１３は、ＨＳ２９４ｔヒト黒色腫腫瘍増殖に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図１４】図１４は、様々な生化学的アッセイについてＡＶＰ １３３５８の用量反応を示す。
【図１５】図１５は、ＡＶＰ １３３５８のキナーゼスクリーニングである。
【図１６】図１６は、タンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響のパワーブロット結果を示す。
【図１７】図１７は、Ｂ１６細胞のＡＶＰ ８９３の作用の経時変化を示す。
【図１８】図１８は、１６時間での様々な細胞のニカストリンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図１９】図１９は、一晩での様々な細胞のニカストリン、カルネキシンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図２０】図２０は、一晩での様々な細胞のニカストリン、ｎ−グリシン、カルネキシンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図２１】図２１は、ＡＶＰ ８９３による、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の刺激されたタンパク質の発現の阻害を示す。
【図２２】図２２は、様々な化合物による、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激されたニカストリンおよびＧＳ２８の発現の用量反応的な阻害を示す。
【図２３】図２３は、ＩＬ−４／αＣＤ４０ Ａｂに対するＰＢＬ増殖反応のＡＶＰ ８９３阻害に及ぼすＰＭＡの影響を示す。
【図２４】図２４は、ＰＭＡ存在下およびＰＭＡ不存在下での４８時間後のＩＬ−４／αＣＤ４０ Ａｂに誘発されたタンパク質の発現のダウンレギュレーションするＡＶＰ ８９３の選択的用量反応を示す。
【図２５】図２５は、ヒトＰＢＬのＡＶＰ ８９３に対するＧＳ２８ ｍＲＮＡの反応を示す。
【図２６】図２６は、様々なＥＲおよびゴルジタンパク質のタンパク質輸送経路との関りを示す概略図である。
【図２７】図２７は、ＡＶＰ ８９３による、１８〜２０時間培養のＲａｂの発現の用量反応的な阻害を示す。
【図２８】図２８は、３Ｔ３細胞のＧＳ２８とＲａｂ１ａタンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響の比較を示す。
【図２９】図２９は、ゴルジ内在タンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３０】図３０は、マンノシダーゼIIの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３１】図３１は、Ｖｅｒｏ細胞のＲａｂ１Ｂの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３２】図３２は、ＭＯＬＴ４細胞のゴルジ形態に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３３】図３３は、Ｂ１６細胞のタンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３４】図３４は、Ｂ１６細胞のＲａｂ６分布を示す。
【図３５】図３５は、Ｂ１６細胞のＲａｂ１Ｂ分布を示す。
【図３６】図３６は、Ｂ１６細胞のＡＶＰ ８９３に対するＳＮＡＰ２３の反応を示す。
【図３７】図３７は、ＡＶＰ ８９３とブレフェルジンＡでのＮＣＩ結果を示す。
【図３８】図３８は、ＧＳ２８およびニカストリンの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３およびブレフェルジンＡの影響を示す。
【図３９】図３９は、３Ｔ３細胞のブレフェルジンＡおよびＡＶＰ ８９３に対するＲａｂ６の反応を示す。
【図４０】図４０は、６細胞株のＧＳ２８とニカストリンの量的比較を示す。
【図４１】図４１は、３Ｔ３細胞の公知の薬理剤と比べた、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ ８９３の特異な作用を示す。
【図４２】図４２は、ＧＳ２８、カルネキシンおよびＲａｂ６の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３およびブレフェルジンＡの特異な影響を示す。
【図４３】図４３は、マンノシダーゼIIの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３、ブレフェルジンＡおよびノコドゾール（Nocodozole）の特異な影響を示す。
【図４４】図４４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶｅｒｏ細胞のＨＳＶ−２増殖に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図４５】図４５は、ＨＳＶ−２に感染したＶｅｒｏ細胞のｇＥ発現に対するＡＶＰ ８９３の作用を示す。
【図４６】図４６は、解明されたＡＶＰ化合物の作用機構を示す概略図である。
【図４７】図４７は、ＡＶＰ ８９３によるＧＳ２８タンパク質の発現の選択的阻害の多様な効果を示す概略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明の好ましい態様は、特定の内在ＥＲおよびゴルジタンパク質を選択的に薬理学的にダウンレギュレーションすることによる細胞内タンパク質輸送経路の阻害に関し、より詳しくは、これらの細胞内タンパク質輸送経路に依存する様々な疾患状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１８９８年、Ｃａｍｉｌｌｉｏ Ｇｏｌｇｉは、今では彼の名が付いている新規な細胞内網目構造について記述した（Ｇｏｌｇｉ、１８９８年）。ゴルジ複合体は、細胞内タンパク質をプロセシング、輸送、および選別する上で顕著な機能を有する精巧な細胞小器官である（Ｇｏｎａｔａｓ、１９９４年；Ｍｅｌｌｍａｎ、１９９５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年に総説がある）。構造上は、ゴルジ複合体は、殆どの哺乳動物細胞の核周囲領域に局在し、膜結合した槽の積み重ね、ならびに機能的に異なるトランスゴルジ網（「ＴＧＮ」）、中間ゴルジ網およびシスゴルジ網（「ＣＧＮ」、例えば図１を参照のこと）を特徴とする。ゴルジ複合体の選別機能はＴＧＮおよびＣＧＮで行われ、一方、プロセシング機能はシス、中間、およびトランス区画で行われることが提案されている（Ｍｅｌｌｍａｎ、Ｓｉｍｏｎｓ、１９９２年）。新しく合成されたタンパク質の細胞内輸送には、小胞体（「ＥＲ」）から輸送小胞を経由してゴルジ複合体のシス、中間、およびトランス区画まで、場合によっては原形質膜までの管理された移動が必要である（Ｂａｎｆｉｅｌｄら、１９９４年；Ｆａｒｑｕｈａｒ、Ｐａｌａｄｅ、１９８１年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９８９年；Ｍｅｌｌｍａｎ、１９９５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年；Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９２年）。
【０００３】
コートマータンパク質のＣＯＰＩ被覆小胞は、現在、介在する槽を通過するこの順行性輸送を媒介すると考えられている（Ｒｏｔｈｍａｎ、１９９４年；Ｓｃｈｅｋｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９６年）。ゴルジ複合体を通過するタンパク質輸送は、供与膜から出芽した小胞により媒介され、受容膜を標的にしてそれと融合する（Ｒｏｔｈｍａｎ、Ｏｒｃｉ、１９９２年）。輸送小胞はＴＧＮに向かって移動することが知られており、コートタンパク質複合体（コートマータンパク質、例えばβ−ＣＯＰ、（Ｂａｎｆｉｅｌｄら、１９９４年；Ｂａｒｌｏｗｅら、１９９４年；Ｄｕｄｅｎら、１９９１年；Ｏｒｃｉら、１９９７年；Ｐｅｌｈａｍ、１９９４年；Ｓｅａｍａｎ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９４年；Ｓｅｒａｆｉｎｉら、１９９１年；Ｗａｔｅｒｓら、１９９１年）を参照のこと）を経由してＣＧＮへ「逆」方向に移動することも仮定されている。小胞輸送についてのこれらの経路は、タンパク質輸送の他に、膜構造を再生するために重要であると考えられている。細胞内微小管が重要な構成要素であることは知られているが、小胞輸送を制御するシグナルはよく理解されていない（Ｋｒｅｉｓ、１９９０年；Ｍｉｚｕｎｏ、Ｓｉｎｇｅｒ、１９９４年）。ある種の役割を果たすと考えられているゴルジ複合体のその他のタンパク質には、アダプチン類（Ｐｅａｒｓｅ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９０年）、ＧＴＰ結合（すなわち「Ｒａｂ」）タンパク質類（Ｊｅｎａら、１９９４年；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９４年；Ｎｕｏｆｆｅｒら、１９９４年；Ｏｋａ、Ｎａｋａｎｏ、１９９４年；Ｐｆｅｆｆｅｒ、１９９４年）、ＡＤＰリボシル化因子類（ＡＲＦ）（Ｓｔｅａｒｎｓら、１９９０年）、および内在酵素類（Ｆａｒｑｕｈａｒ、１９８５年；Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｗａｒｒｅｎ、１９９４年に総説がある）などのタンパク質のファミリーがある。タンパク質および膜輸送器官の別個の領域についての、様々なＥＲおよびゴルジタンパク質の提案されている関係を図示した図２６も参照されたい。
【０００４】
最近、抗腫瘍活性があると報告されたため、ゴルジ装置撹乱物質、特にブレフェルジンＡに大きな関心が寄せられている。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）は、最初、抗真菌性、細胞毒性、および制癌性の抗生物質であると記述された（Ｈａｅｒｒｉら、１９６３年、Ｃｈｅｍ．Ａｂｓ．５９巻、５７２６ｈ）。ブレフェルジンＡは、また、抗ウイルス性を有するとも報告された（Ｔａｍｕｒａら、１９６８年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２１巻、１６１〜１６６頁）。近年、ブレフェルジンＡは、タンパク質輸送阻害物質として広く研究されている。ブレフェルジンＡは、ゴルジ装置を可逆的に撹乱し、それによって細胞質を通過するタンパク質輸送に影響を及ぼすことができると考えられている（Ｄｏｍｅｓら、１９８９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９巻、６１〜７２頁、１９８９年；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１２巻、５６７〜５７７頁）。今では、ブレフェルジンＡはゴルジからＥＲへの逆行性の膜輸送を引き起こすことが知られている（Ｄｉｎｔｅｒら、１９９８年、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９巻、５７１〜５９０頁）。現在は、ブレフェルジンＡは、タンパク質輸送の理解をより深めるために、でき上がったタンパク質のプロセシングおよび選別を妨害するためのツールとして研究者らに使用されている。ブレフェルジンＡは、試験した細胞の多くでＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を広く妨害するので、毒性に大きな懸念があり、治療薬としては開発されてこなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＥＲおよび／またはゴルジタンパク質と、アレルギー、癌、ウイルス感染などの様々な疾患状態で引き起こされる特異的タンパク質輸送過程を調整する機序とを解明し、そのような機序を選択的に標的とする薬理学的阻害物質を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の好ましい実施形態に従って、疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための方法が開示される。この方法は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に関連する少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖を阻害することを含む。この方法の好ましい変形例では、少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される。より好ましくは、少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質はＧＳ２８である。
【０００７】
本方法の好ましい実施形態においては、前記組成物が、次からなる群より選択される化合物を含む。
【０００８】
【化１】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【０００９】
【化２】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。）
【００１０】
【化３】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。）
【００１１】
【化４】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。）
【００１２】
【化５】
（式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。）
【００１３】
【化６】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【００１４】
【化７】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。）
【００１５】
【化８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。）
【００１６】
【化９】
（式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。）
【００１７】
【化１０】
【００１８】
【化１１】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【００１９】
【化１２】
【００２０】
【化１３】
【００２１】
【化１４】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【００２２】
【化１５】
【００２３】
【化１６】
（式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。）
【００２４】
【化１７】
【００２５】
【化１８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。）
【００２６】
本方法のより好ましい実施形態においては、前記組成物が化合物ＡＶＰ ８９３を含む。
【００２７】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法の変形例では、組成物は次の化合物を含み、その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される。
【００２８】
【化１９】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【００２９】
真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法の他の変形例では、組成物は次の化合物を含み、その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される。
【００３０】
【化２０】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【００３１】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＥＲとゴルジとの間のサイトカイン依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連するサイトカイン反応を阻害することを含む、疾患状態に関連するサイトカイン反応を選択的に阻害する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＥＲとゴルジとの間のウイルス性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってウイルス複製を阻害することを含む、ウイルス複製を選択的に阻害する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってＢ細胞のＩｇＥ分泌を減らすことを含む、アレルギー反応に関連するＢ細胞のＩｇＥ分泌を選択的に減らす方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＧＳ２８の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによってＧＳ２８−介在タンパク質輸送を減らすことを含む、ＧＳ２８−介在タンパク質輸送を減らす方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、真核細胞に対する外的な作用の効果を変化させる方法であって、前記外的な作用がＧＳ２８−介在タンパク質輸送に依存しており、細胞中のＧＳ２８の発現を変えるのに十分な量の組成物を投与し、それによって外的な作用を変化させることを含む方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３６】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、ＧＳ２８の発現を減らすのに十分な量の組成物を投与し、それによって子孫ウイルス粒子（ビリオン）の集合を減らし、それによってウイルス感染を治療することを含む、ウイルス感染を治療する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態に従って、少なくとも１種のＥＲ−ゴルジタンパク質の発現を阻害するのに十分な量の薬剤を投与することを含み、前記少なくとも１種のＥＲ−ゴルジタンパク質は癌細胞の増殖に必要なものである、癌を治療する方法が開示される。好ましい変形例では、組成物が化合物（１）〜（４２）からなる群より選択される化合物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
アレルギー疾患を治療するための新規な治療薬を開発する努力は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＥ反応を抑制するリード化合物の同定に結びついた。追加の一連の化合物は、その後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩｇＥ反応を抑制する活性度に基づいて合成された。これらの一連の化合物は、その合成経路および生物活性も、発行された米国特許第６，２７１，３９０号、第６，４５１，８２９号、第６，３６９，０９１号、第６，３０３，６４５号および第６，７５９，４２５号、ならびに係属中の米国特許出願第０９／９８３，０５４号、第１０／１０３，２５８号、第１０／６６１，１３９号、第１０／６６１，２９６号および第１０／８２１，６６７号、ならびに係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５９８５およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０６９８１に詳述されている。これらの出願は全て、それへの参照により全てそのまま本明細書に組み込まれる。これらの化合物は、ＩｇＥの抑制に加えて、サイトカイン生産／放出の阻害、細胞表面受容体の発現の抑制、細胞増殖の阻害を含む他の生物学的効果を有することが見出された。この一連のものに含まれたリード化合物のうちの幾つかはＡＶＰ ８９３、ＡＶＰ １３３５８およびＡＶＰ ２５７５２であり、それらは全て、上記の生物学的効果を共有しているが、一方で、多くの他の類似体の活性が、１つ以上のこれらの作用を基礎として、規定されてきた。
【００３９】
その化合物は、目標に基づいたアッセイを基礎として同定されず、むしろ細胞の活動に基づいて同定されていた。従って、最近まで作用機構は謎であった。これらの化合物の活性プロフィールは非常に変わっていて、それらの共有する作用機構が新規であることを示唆している。これらの薬剤は、７０を超えるキナーゼおよび他の酵素の活性に影響を及ぼさない。さらに、９５０を超えるタンパク質の発現に対する薬物活性のスクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの僅かひと握りの調整されたタンパク質を明らかにした。これらの結果、およびこの後に続く研究は、本明細書に記載された特許出願の基礎を形成する。
【００４０】
ＩｇＥの発現、サイトカインの誘出、膜受容体の発現および細胞増殖に対する抑制的な作用を共通に有する幾つかの別個のシリーズの化合物が記載される。これらのシリーズは次の化合物を含む。
【００４１】
【化２１】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。
【００４２】
【化２２】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。
【００４３】
【化２３】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。
【００４４】
【化２４】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。
【００４５】
【化２５】
式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。
【００４６】
【化２６】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。
【００４７】
【化２７】
式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。
【００４８】
【化２８】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００４９】
【化２９】
式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。
【００５０】
【化３０】
【００５１】
【化３１】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。
【００５２】
【化３２】
【００５３】
【化３３】
【００５４】
【化３４】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。
【００５５】
【化３５】
【００５６】
【化３６】
式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。
【００５７】
【化３７】
【００５８】
【化３８】
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。
【００５９】
本発明の好ましい態様に従って、一般式（１）〜（４２）の例となる多数の具体的な化合物が合成され、試験された。いくつかの好ましい化合物を以下の表１に列挙する。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
最近、これらの化合物の多様な作用を関連付けるために、これらの化合物の作用機序が研究された。これらの研究は、細胞内タンパク質輸送（図１）がｉｎ ｖｉｔｒｏで薬物処理の影響を受けるという事実を明らかにした。この新規な作用機序は、ヒト疾患の治療に利用されている薬物による既知の機序とは異なる。さらに、細胞過程の分子メカニズムの精査に用いられている化学薬品のほんのひと握りだけが、細胞内タンパク質輸送を阻害することが知られている。本明細書に記載の化合物は、全ての初代細胞および多くの腫瘍細胞株において、小胞体（ＥＲ）とゴルジとの間の細胞タンパク質の移動を担う特定のタンパク質の発現に影響を及ぼす。さらに、細胞内タンパク質移動を追跡することを意図した研究では、これらの化合物が、モネンシンやブレフェルジンＡなど他の既知の阻害物質が利用するものとは異なる機序によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質のＥＲ−ゴルジ間移動を阻止することが示されている。この記載された活性は、ＡＶＰ化合物の既知の多様な作用を説明し、その他の活性、特にウイルス増殖の阻害をうまく予言している。
【００６５】
アッセイ
好ましい一つの実施形態においては、本発明は、アレルギーおよび／または喘息、あるいはＩｇＥが病原となる全ての疾患の治療に有用な、小分子のＩｇＥ（合成および／または放出）阻害物質を対象とする。本明細書に開示される特定の化合物は、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイの両方においてＩｇＥ濃度を抑制する能力によって同定されたものである。臨床治療計画の開発および最適化は、以下に記載するｅｘ ｖｉｖｏアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを参照することにより、当業者はモニターすることができる。
【００６６】
ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ
この系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原のプライミングで始まり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの二次抗体反応を測定する。以下のものを含むパラメータの範囲について基本プロトコルを記録し、最適化した：プライミングのための抗原の用量およびプライミング後のタイムスパン、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する細胞の数、ｉｎ ｖｉｔｒｏで二次ＩｇＥ（および他のＩｇの）反応を引き出すための抗原の濃度、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最適なＩｇＥ反応を可能にするウシ胎仔血清（ＦＢＳ）バッチ、プライミングしたＣＤ４＋Ｔ細胞およびハプテン特異的Ｂ細胞の重要性、およびＩｇＥについてのＥＬＩＳＡアッセイの特異性（ＭａｒｃｅｌｌｅｔｔｉおよびＫａｔｚ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１３５巻、第４７１〜４８９頁（１９９１年）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６７】
本プロジェクトのために利用した実際のプロトコルは、よりハイスループットの分析に適合させた。ＢＡＬＢ／ｃＢｙｊマウスは、ミョウバン４ｍｇに吸着させたＤＮＰ−ＫＬＨ１０μｇの腹腔内投与で免疫化し、１５日後に屠殺した。脾臓を切り取り、組織グラインダーで均質化し、２度洗浄し、ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、および２−メルカプトエタノール０．０００５％を加えたＤＭＥＭ中に保存した。脾臓細胞培養はＤＮＰ−ＫＬＨ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で確立させた（９６ウェルプレート４個１組で２００万〜３００万細胞／ｍｌ、０．２ｍｌ／ウェル）。抗原を含む脾臓細胞培養物に試験化合物（２μｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ）を加え、１０％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で８日間培養した。
【００６８】
８日後に培養上清を集め、ＭａｒｃｅｌｌｅｔｔｉおよびＫａｔｚ（上記）が記載した特異的アイソタイプ選択性ＥＬＩＳＡアッセイを変更したものによってＩｇを測定した。ハイスループットを促進するために、このアッセイを変更した。ＤＮＰ−ＫＬＨを一晩中コーティングすることによってＥＬＩＳＡプレートを調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、各培養上清のアリコートは希釈し（ＢＳＡ、アジ化ナトリウム、およびＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：４）、ＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃の加湿容器内で終夜培養した。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＥ（ｂ−ＧＡＭＥ）、ＡＰ−ストレプトアビジン、および基質で連続して培養した後、ＩｇＥ濃度を定量した。
【００６９】
培養上清を２００倍に希釈し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ｂ−ＧＡＭＧ１）をｂ−ＧＡＭＥの代わりに用いたことを除き、同様にして、抗原特異的ＩｇＧ１を測定した。培養上清を１：２０で希釈し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ｂ−ＧＡＭＧ２ａ）で培養した後、ＤＮＰ−ＫＬＨでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＩｇＧ２ａを測定した。各アイソタイプの定量は、検量線との比較によって決定した。全抗体の検出レベルは約２００〜４００ｐｇ／ｍｌであり、ＩｇＥ用ＥＬＩＳＡ中の他のどんなＩｇアイソタイプとの交差反応性も０．００１％未満であった。
【００７０】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ（上記）において活性であることが判明した化合物は、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇＥ反応を抑制する活性について試験した。キャリヤーで免疫化する前に低線量の放射線照射を受けたマウスは、７日後に抗原感作に対して高いＩｇＥ反応を示した。抗原感作の直前および直後に試験化合物を投与することによって、その薬物のＩｇＥ反応抑制能力を測定した。血清中のＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの濃度を比較した。
【００７１】
雌のＢＡＬＢ／ｃＢｙｊマウスに、毎日の光サイクル開始後、２５０ラドで７時間照射した。２時間後に、ミョウバン４ｍｇ中のＫＬＨ２μｇの腹腔内投与でマウスを免疫化した。６日後に、２日から７日連続して薬物注射を１日１回または２回のどちらかすることを開始した。典型的には、腹腔内注射および強制経口投与を、１０％エタノールおよび０．２５％メチルセルロースを含む生理食塩水の懸濁液（１５０μｌ／注射）として施した。各治療グループは、５〜６匹のマウスから構成した。薬物投与２日目、朝の薬物注射の直後に、ミョウバン４ｍｇ中のＤＮＰ−ＫＬＨ２μｇを腹腔内投与した。ＤＮＰ−ＫＬＨ攻撃後、マウスを７〜２１日間飼育した。
【００７２】
抗原特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ抗体をＥＬＩＳＡによって測定した。眼窩周囲出血を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を生理食塩水で５倍に希釈し、再度遠心分離した。各血液の抗体濃度は４種の希釈液（３通り）のＥＬＩＳＡによって測定し、検量線：抗ＤＮＰ ＩｇＥ（１：１００〜１：８００）、抗ＤＮＰ ＩｇＧ２ａ（１：１００〜１：８００）、および抗ＤＮＰ ＩｇＧ１（１：１６００〜１：１２８００）と比較した。
【００７３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物作用の測定
最初にｅｘ ｖｉｖｏでのＩｇＥ反応プロトコルにおけるＩｇＥ遮断活性（図２）に基づいて、これらの一連の化合物を同定し、このアッセイにおけるそれらの活性に基づいて、全ての類似体の生物学的活性を特徴づけた。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおける活性は、標準的な手順を用いて、ヒトＰＢＬのＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体で刺激したＩｇＥに対するＢ細胞の反応（図３）、およびマウスの脾臓Ｂ細胞の反応（図示せず）のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで確認した。Ｔ細胞に対する薬物の作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの様々な刺激に対するＴ細胞のサイトカイン反応を試験することにより示した。いくつかの代替の刺激に対するサイトカインおよびケモカイン構造の反応を、マウス脾臓およびヒトＰＢＬからのＴ細胞で試験した。刺激により少なくとも１０倍高められたサイトカインのデータを図４および図５に示す。マウスの脾臓からＴ細胞を分離し、刺激物＋／−ＡＶＰ１３３５８の存在下で１６時間培養した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを用いて、上清のサイトカインを定量した。サイトカインは全て少なくとも２００ｐｇ／ｍｌのレベルに達し、バックグラウンドよりも１０倍高かった（図４）。ドナーのＰＢＬからＴ細胞を分離し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）およびＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）＋／−ＡＶＰ１３３５８の存在下で１６〜３６時間培養した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを用いて、上清のサイトカインを定量した（図５）。サイトカインは全て少なくとも２００ｐｇ／ｍｌのレベルに達し、このレベルはバックグラウンドよりも少なくとも１０倍高かった。ＡＶＰ１３３５８は、アレルギーの発症に重要なもの、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を含めて多数のサイトカインのレベルを強力に抑制した。これらの化合物について発見された活性の第３のグループは、膜受容体の発現の抑制である。上記のＣＤ２３（Ｂ細胞ＩｇＥ受容体、図６）およびＩＬ−４受容体（図示せず）の発現を刺激する同様の手法を用いると、ＡＶＰ１３３５８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスＢ細胞およびヒトの単核細胞上のこれらの受容体の誘導を強力に遮断した。これらの化合物について発見された第４の活性は、細胞増殖の阻害であった。この作用は、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体、ＰＭＡ／イオノマイシン、ＬＰＳ、ＣｏｎＡ、または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの様々な刺激物に対する初代細胞の増殖で最初に注目された。マウス脾臓細胞およびヒトＰＢＬの増殖に及ぼす薬物の影響をそれぞれ図７および図８に示す。これらの一連の化合物はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞増殖に対する増殖抑制作用を有することが示された（図９）。ＡＶＰ化合物は、６０−細胞スクリーニングパネルで試験するためにＮＣＩに付託した。図９に示したデータは、腫瘍細胞株の２日培養物からの全タンパク質の測定を表す。全タンパク質は、以下の概要の増殖実験の多くで採用されているＳＲＢアッセイによって評価した。
【００７４】
スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイプロトコル（ＮＣＩプロトコルに適合）
典型的なスクリーニング実験のために、個々の細胞株の倍加時間に応じて、５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの範囲のプレーティング密度で、細胞を１００μｌ、９６ウェルマイクロタイタープレートに植え付ける。細胞を植え付けた後、実験用の薬物を添加する前に、マイクロタイタープレートを３７℃、細胞株および培地に応じて５％または１０％ＣＯ２、空気９５％、相対湿度１００％で２４時間培養した。２４時間後、薬物添加時の各細胞株の細胞数の測定値を表すために、各細胞株のプレート２枚をｉｎ ｓｉｔｕでＴＣＡで固定した。薬物添加後、プレートを３７℃、ＣＯ２５％／１０％、空気９５％、相対湿度１００％で更に４８時間培養する。接着細胞については、冷ＴＣＡを添加してアッセイを終了させる。５０％（ｗ／ｖ）冷ＴＣＡ５０μｌを穏やかに加えて（最終濃度、ＴＣＡ１０％）ｉｎ ｓｉｔｕで細胞を固定し、４℃で６０分間培養する。上清を捨て、プレートを水道水で５回洗浄して、空気乾燥する。０．４％（ｗ／ｖ）スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）の１％酢酸溶液（１００μｌ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間培養する。染色後、１％酢酸で５回洗浄して結合していない染料を取り除き、プレートを空気乾燥する。その後、結合した染剤を１０ｍＭトリズマベース（trizma base）で可溶化して、自動プレートリーダーで波長５１５ｎｍの吸光度を読みとる。懸濁細胞についても、８０％ＴＣＡ５０μｌを穏やかに加えて（最終濃度、ＴＣＡ１６％）ウェルの底に沈殿した細胞を固定することでアッセイを終了させることを除いて方法論は同じである。７つの吸光度測定値［０時間、対照の増殖、および５つの濃度レベルの薬物の存在下での試験増殖］を用いて、薬物の各濃度レベルで増殖パーセントを計算した。
【００７５】
国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＣＩ）で行われた試験により、構造、および化合物が活性を示す細胞のプロファイルの両方において、この化合物が新規であることが明らかになった。
【００７６】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性によるｉｎ ｖｉｔｒｏ作用の確認
いくつかの化合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された結果をも反映してもいるヒト疾患のｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験された。マウスにおいて、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）モデルおよび気道過敏症（ＡＨＲ）モデルの２つのアレルギー性喘息のモデルを試験した。両方のモデルとも、ニワトリのオバルブミン（ＯＶＡ）に対する「アレルギー性」反応を引き起こす同様のプロトコルで開始した。ＢＡＬモデルでは、噴霧されたＯＶＡに応じた、細胞およびサイトカインの肺への浸潤を測定した。薬物を投与すると、標準プロトコル（図１０）おいても、他の同様のモデルにおいても、好酸球およびリンパ球の浸潤が抑制される。サイトカインおよびＩｇＥの増加が認められた場合は、薬物はこれらの反応も抑制した（図示せず）。メタコリン攻撃に対する気道過敏症反応も薬物によって阻害された（図１１）。最後に、マウスのＢ細胞のＣＤ２３発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物での長期にわたる（連続して３日以上）治療によって抑制された（図示せず）。
【００７７】
多くのｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍モデルで、活性について、化合物を試験した。Ｂ１６黒色腫細胞を同質遺伝子的（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスに皮下接種すると、急速な腫瘍増殖が起こった。腫瘍細胞を接種したマウスを薬物（ＡＶＰ２５７５２）で治療すると、賦形剤で治療したマウスに比べて、腫瘍増殖速度が著しく減少した（図１２）。異種移植片モデルにおいてヒト黒色腫細胞をＮｕ／Ｎｕマウスに接種すると、同様であるが、より劇的な結果が得られた（図１３）。Ｎｕ／Ｎｕマウス２５匹にＨｓｔ２９４ｔ腫瘍細胞８００万個を皮下注射で接種した。１２日後にマウスを２つのグループに分け、毎日ＡＶＰ８９３（１０〜４０ｍｇ／ｋｇ／日）または賦形剤の腹腔内投与で治療した。
【００７８】
このように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された様々な反応に対するＡＶＰ薬物の作用は、ｉｎ ｖｉｖｏでも注目される。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果が無傷な動物に引き継がれ得るという信頼レベルを与えるだけではなく、これらの薬剤が、これらの作用が有益であるヒト疾患を治療する上で有用であるかもしれないことをも示している。
【００７９】
生物学的活性のスクリーニング
これらの化合物が細胞レベルおよび分子レベルでどのように作用しているかを理解するために、いくつかの薬物活性のスクリーニングを開始した。最初の２つのスクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのある結合事象に対する薬物の活性および様々な酵素の活性を試験するために計画された（図１４および図１５）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの生化学的アッセイの結果（Ｙ軸上に示す）を図１４に示す。Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｉｎｃ．が行ったキナーゼアッセイのパネルの結果を図１５に示す。Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｉｎｃ．が行ったスクリーニングプロトコルの一部として、６０のキナーゼアッセイにおいて、ＡＶＰ１３３５８（１μＭ）を活性について試験した。しかしながら、上記の薬理学的活性についてＩＣ５０をはるかに超えて、１μｇ／ｍｌより低い濃度では薬物活性は観察されなかった。
【００８０】
第２シリーズの実験では、９５０を超えるタンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏのウェスタンブロット法（３重で）で試験した。この方法は以下に詳しく述べる。このスクリーニングにはＢ１６腫瘍細胞を選択し、薬物により変性され得るタンパク質の数を最適化するために、１６時間のＡＶＰ８９３の処理が選択された。６種のタンパク質のみが、薬物処理した細胞由来の溶解物中で常に、著しく変性されることが見出された（図１６）。Ｂ１６−Ｆ１０細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＡＶＢ８９３の存在下または非存在下で１６時間培養した。試料を回収し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから提供された指示書に従って溶解物を調製した。試料をドライアイス上に置き、９５０のタンパク質の発現を分析するために同所に付託した。これらの中で、ＧＳ２８およびニカストリンのみが、Ｂ１６および他の細胞株において一貫した変化をすることが見出された。両方のタンパク質は細胞では全く異なる機能を有しており、科学文献では（見たところ）関連付けられていないが、下記のように、それぞれのタンパク質で見られた変化について合理的な説明がある。
【００８１】
ウェスタンブロットおよび試料調製
真空排気により（接着細胞の場合）、または室温で５〜７分間の低速の遠心分離により（懸濁細胞の場合）、培地を除去した。細胞はＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで遠心し、細胞ペレットを氷中に保存した。細胞２．０×１０７個あたり氷冷溶解バッファー３００μｌを加え、プロテアーゼ阻害剤を新たに加えた。細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、氷上で少なくとも３０分間培養し、培養中に数回ボルテックスミキサーにかけた。細胞溶解物を４℃で、２〜５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した。上清を新しい遠沈管に移し、ペレットを捨てた。試料のアリコートを等容量の２Ｘ試料バッファー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅからの「ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット」を用いて決定した。
【００８２】
電気泳動と転写
タンパク質試料（試料バッファー中）を１〜３分間煮沸し、氷上に置いた。同量のタンパク質をＮｕＰａｇｅゲル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に注入した。電気泳動が完了した後、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ製エレクトロブロッティング装置を用いて、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移した。その時、電圧は２〜３時間２５に設定した。室温で少なくとも３０分間、または４℃で一晩、膜を５％の乳汁（ＰＢＳ中、０．１〜２０％）で培養して、非特異的結合をブロックした。ブロックした膜を、５％乳汁で希釈した一次抗体（表２を参照）とともに、室温で１時間培養した。最適の抗体の希釈倍率は、会社、タンパク質の量に依存する。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製の一次抗体には、通常、１：１０００の希釈倍率が用いられる。膜は、ＰＢＳ、０．１％で５分間３〜４回洗浄した。膜を、５％乳汁で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに、室温で３０〜６０分間培養した。我々は通常、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製の二次抗体には、１:４０００の希釈倍率を用いた。膜は、ＰＢＳ、０．１％で３〜４回、各１５分間ずつ洗浄した。検出溶液ＡおよびＢを４０：１の比で混合し、膜上にピペットで移し、室温で５分間培養した。暗所で１枚のハイパーフィルムＥＣＬを膜上に置き、１分間曝露し、または相応に調節した。
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
細胞輸送タンパク質の発現
ＧＳ２８は、ゴルジおよび中間区画（ＩＣ、ＥＲとゴルジとの間に位置する）における小胞のドッキングおよび融合に関与するｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質である。したがって、ＧＳ２８は、ＥＲとゴルジとの間の、およびゴルジ槽内の（小胞を介した）タンパク質の移動両方に密接に関係している。ニカストリンは、引き続き核内に移動して転写因子として働く多くのタンパク質の膜内における切断を担うγ−セクレターゼ複合体の一部である。これらのタンパク質の中には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ノッチタンパク質、ｅｒｂＢ４、Ｅ−カドヘリンなどが含まれる。Ｂ１６細胞を薬物処理すると、ニカストリンの成熟が阻害され、完全にグリコシル化された活性部分を犠牲にして、未成熟で部分的にグリコシル化された形態のニカストリンが蓄積することになる。ニカストリンは普通、ＥＲを通過し、ＥＲで部分的にグリコシル化され、次いでゴルジに行き、ゴルジでグリコシル化およびシアル酸付加が完了する。このように、ニカストリンは実質的に積み荷タンパク質として働いており、その変化は細胞中をどのように移動するかを反映している。ニカストリンの成熟を抑制することにより、ＡＶＰ８９３処理は、おそらくはそのＧＳ２８に対する作用を介して、ＥＲからゴルジへのニカストリンの輸送を妨げると思われる。
【００８６】
ＡＶＰ８９３の推定されるタンパク質輸送作用をさらに試験するために、この経路における他のタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｂ１６および他の細胞株で試験した。ＡＶＰ８９３の細胞タンパク質に対する作用はＢ１６細胞で確認され、経時変化を含むように拡張された（図１７）。Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を集密度２０％でＴ７５フラスコに接種し、一晩培養した。いくつかのフラスコにＡＶＰ８９３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、化合物の添加後いくつかの時点で、１つのフラスコの細胞を回収した。溶解物を調製し、電気泳動により分離し、一般的なウェスタンブロットプロトコルで、上記のような抗体でプローブした。薬物のＧＳ２８およびニカストリンに対する作用は互いに類似しており、薬物の培養が長くなるほど次第に強くなった。ＡＶＰ８９３で２日間培養すると、ＧＳ２８は完全に消滅した。他の細胞株もＧＳ２８およびニカストリンの発現について試験し、量的な差は明らかであったが、薬物に対して同様に反応することが見出された。ＡＶＰ８９３に同様に反応することが見出された腫瘍細胞株には、ＣＡＫＩ、ＳＦ２９５、ＰＣ３、ＭＯＬＴ４、Ｎｅｕｒｏ２ａ、およびＲＢＬが含まれる（図１８、図１９、および図２０）。図１８に示した実験では、ＬＯＸ、ＣＡＫＩ、および３Ｔ３細胞株を図１７について記載したように処理した。図１９に示した結果では、ＳＦ２９５、ＰＣ３、ＭＯＬＴ−４、およびＮｅｕｒｏ２ａ細胞を図１７について記載したように処理した。図２０に示した結果では、ＬＯＸ、３Ｔ３、およびＲＢＬ細胞株を図１７について記載したように様々な濃度のＡＶＰ８９３で処理した。ＬＯＸ細胞に対する作用はあまり明白ではなかった。正常の繊維芽細胞株である３Ｔ３は、ＧＳ２８および成熟ニカストリンのレベルがＡＶＰ８９３曝露によって実質的に除去されたほどに、薬物に対してより大きい反応を示した。対照（control）として用いられるＥＲ内在タンパク質であるカルネキシンのレベルは、薬物処理した細胞では変化しなかった。ＡＶＰ８９３の濃度／３Ｔ３細胞についての反応評価は、ＧＳ２８および成熟ニカストリン発現についてのＩＣ５０が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間であり（図２０）、３Ｔ３細胞の増殖をＡＶＰ８９３が阻害するＩＣ５０と一致することを示唆している。
【００８７】
ＡＶＰ８９３はまた、様々な刺激物で刺激されたマウスの脾臓細胞のＧＳ２８の発現を抑制する（図２１）。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を刺激物＋／−ＡＶＰ８９３（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で２０時間培養し、回収して、図１７に記載したように調製した。刺激の条件には、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）に抗ＣＤ４０抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えたもの、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）にイオノマイシン（１００ｎＭ）を加えたもの、またはＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）が含まれる。３Ｔ３繊維芽細胞と同様に、脾臓細胞のＧＳ２８の発現は薬物により排除されたが、一方で、カルネキシンの発現は最小限の影響しか受けなかった。図２２は、マウス脾臓細胞による、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体刺激を受けたＩｇＥ生産または増殖の阻害について異なる効力を有する３つの化合物の作用を比較するものである。この実験は、増殖抑制効力が高い（ＡＶＰ８９３、５ｎＭ）、中程度（ＡＶＰ２６２９７、５０ｎＭ）、低い（ＡＶＰ２５６３０、５００ｎＭ）様々なＡＶＰ化合物を試験して比較したことを除いて、図２１について記載したように行った。ＡＶＰ８９３は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌで試験し、ＡＶＰ２６２９７は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌで試験し、ＡＶＰ２５６３０は１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌで試験した。各化合物について、ＧＳ２８および成熟ニカストリン両方に対する作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に対する作用に匹敵しており、細胞およびタンパク質のレベルではこれらの作用が関連付けられることが示唆された。
【００８８】
いくつかの試料はタンパク質キナーゼＣ活性剤であるＰＭＡでも処理したことを除いて、マウス脾臓細胞で行ったのと同様の実験をヒトＰＢＬで繰り返した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物でＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体にＰＭＡを添加しても、ヒトＰＢＬの増殖またはそのＩｇＥ反応は影響を受けることはないが、その両尺度を阻害するためのＡＶＰ８９３の効力が高められる（図２３）。ＰＢＬを準備し、刺激物＋／−ＡＶＰ８９３の存在下で４日間培養した後、３Ｈ−チミジンでパルス標識して回収した。刺激の条件は、ＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体、またはＰＭＡとＩＬ−４／抗ＣＤ４０抗体の組合せのいずれかであった。これらの培養物について、以下の濃度のヒト特異的試薬を用いた：ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＣＤ４０抗体（３００ｎｇ／ｍｌ）。同様に、ＰＭＡをＰＢＬに添加しても、ＧＳ２８のレベルは上昇しないが、ＧＳ２８発現を阻害するためのＡＶＰ８９３の効力は高まる（図２４）。ＰＢＬ培養は、細胞は４８時間後に回収し、ウェスタンブロット用に溶解物を調製した（図１７のように）ことを除いて、図２３について記載したように行った。これらの結果は、ＡＶＰ８９３の細胞の作用と一次（非形質転換）細胞のＧＳ２８の発現との間に関連があることの追加の証拠を提供している。
【００８９】
ＡＶＰ８９３がＧＳ２８タンパク質の発現を低減させる具体的な様式は未だ知られていないが、薬物添加後３〜１６時間に試験するとＡＶＰ８９３はＧＳ２８ ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさなかったため、転写は関与していないと思われる（図２５）。ヒト軟膜はＳａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋより購入した。軟膜は、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃプロトコルに従って、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用い、赤血球を取り去った。次いで、リンパ球（２０００万個）を、７５ｃｍ２フラスコ中で、ｃＤＭＥＭ（＋／−刺激物およびＡＶＰ８９３）中で４時間または２４時間培養した。細胞を回収し、本質的にＭａｎｉａｔｉｓが記載したように、グアニジン／フェノール溶液中で再形成した。水層を除去して、グアニジン溶液で洗浄し、最後に７０％エタノールで洗浄した。分光光度計によりＲＮＡ純度を確認した。ＲＴ−ＰＣＲ一段階プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ＲＴ−ＰＣＲ（３６サイクル）を実施した。他の細胞源から得られたｍＲＮＡ試料を試験したところ、同様の結果が得られた（図示せず）。
【００９０】
プライマー
ＧＳ２８ ５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＧ−３’,５’−ＣＣＴＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧ−３’
ＡＣＴＩＮ ５’−ＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’５’−ＴＧＧＣＣＴＴＡＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧ−３’
ＧＳ２８は、細胞を通る小胞の移動を担う相互に作用するタンパク質の複雑な経路の一員にすぎない。小胞のドッキングおよび融合に関与するＳＮＡＲＥタンパク質に加えて、Ｒａｂｓとして知られる小型のＲａｓ様ＧＴＰａｓｅのグループが、それらの相互作用を可能にするこれらのタンパク質の多くの活性化を担っている。ＥＲ−ゴルジ間タンパク質輸送において顕著な役割を果たすことが知られているＲａｂタンパク質には、Ｒａｂ１ａ、Ｒａｂ１ｂ、およびＲａｂ６が含まれる（図２６）。Ｒａｂ１タンパク質は両者ともＣＯＰＩＩタンパク質被覆小胞がＥＲからゴルジへ移動するのを助け、一方、Ｒａｂ６は小胞がＥＲに戻る逆行移動に関与している。ＧＳ２８に対する作用と一致して、ＡＶＰ８９３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３Ｔ３およびＰＭＡ／イオノマイシン刺激脾臓細胞におけるＲａｂ６の発現も抑制した（図２７）。図１７について記載したように、３Ｔ３繊維芽細胞およびＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞をＡＶＰ８９３と共に一晩培養して回収した。脾臓細胞は、図２１について記載したように、ＰＭＡ／イオノマイシンの存在下および非存在下で培養した。Ｒａｂ１の反応は細胞によって異なり、Ｒａｂ１ｂは脾臓細胞では薬物によって抑制されたが、３Ｔ３細胞では影響を受けず、一方、Ｒａｂ１ａは３Ｔ３細胞では薬物に対して穏やかな反応を示した（図２７および図２８）。
【００９１】
様々な他の輸送タンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３の作用も試験したが、いくつかの推定されるＧＳ２８の相互作用の相手（ＶＡＭＰ１、Ｇｓ１５、Ｙｋｔ６）、ならびに様々な係留（tethering）タンパク質およびＧＴＰａｓｅを含む他のタンパク質はどれも、量的に変化されなかったと思われる（図２６）。これらのタンパク質の殆どは、ＥＲ−ゴルジ領域の外で機能するが、多くのものの所在は明らかにされていない。
【００９２】
ＡＶＰ８９３は、マンノシダーゼＩＩ（図３０）およびＧＰＰ１３０（データは示さず）と同じく、図２９に示すように、ＧＳ２８およびＧＳ１５などのゴルジ内在タンパク質の量的な発現に、時間に依存した形で影響を及ぼすことが見出された。３Ｔ３細胞のＧＳ１５の染色は、約２〜４時間曝露すると始まるが、ＡＶＰ８９３によって大幅に低減するのに対して、ＧＳ２８のレベルは８時間曝露後に減少し始め、ついには２０時間の薬物培養後に著しく減少したレベルになる。ゴルジ構造タンパク質であるＧＭ−１３０はＡＶＰ８９３の影響を受けなかったと思われる（データは示さず）。同様に、非ゴルジ内在タンパク質であるＲａｂ６は、図３１に示したように、いくつかの細胞型では影響を受けなかったと思われる。
【００９３】
これらの結果は、ＡＶＰ８９３が、ゴルジ内在タンパク質であるＧＳ１５、ＧＳ２８、ＧＰＰ１３０、およびマンノシダーゼＩＩの発現に差別的に作用し、ゴルジ構造タンパク質であるＧＭ−１３０にはさほど影響せず、Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｂ６に対しては殆ど作用しないことを実証している。さらに、これらの作用は、ある種の作用は早い時点で見られたが、ＡＶＰ８９３と共に一晩（１６〜２０時間）培養した後に最も顕著である。これらの結論はウェスタンブロット分析（図２９）および免疫細胞化学的研究（図３０〜３１）から導き出された。より詳しくは、炭水化物のプロセシングに関与するゴルジ内在酵素であるマンノシダーゼＩＩは、ＡＶＰ８９３投与の１時間後にゴルジ中で減少し始めることが示され（図３０）、４時間後には識別できる量の酵素が殆ど〜全く残らず、１８時間後には確実に全く残らなかった。これとは対照的に、図３１に示したように、１８時間後でも、ＧＴＰａｓｅ Ｒａｂ６の染色は低減せず、ＡＶＰ８９３の存在によって大きく変わることはなかった。
【００９４】
したがって、ＡＶＰ８９３は、ゴルジ内在タンパク質に差別的に影響を及ぼすが、一方で、非内在タンパク質（例えばＲａｂ６）またはＧＭ−１３０などの構造タンパク質には影響を及ぼさずにいる（データは示さず）と結論付けることができる。さらに、マンノシダーゼＩＩのデータは、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ８９３の作用の経時変化のさらに別の例であり、それでは、発現レベルはゆっくりと低減し、ついには薬物培養の１６〜２０時間後に激しく低減したレベルになる。
【００９５】
ＡＶＰ８９３で処理した後の超微細構造レベルのゴルジの構造および形態を試験するために、実験を行った。処理していないＭＯＬＴ４細胞、およびＡＶＰ８９３（２００ｎｇ／ｍＬ）で２時間または１８時間処理したＭＯＬＴ４細胞を電子顕微鏡で分析したところ、ＡＶＰ８９３がゴルジの構造を崩壊させることが実証された（図３２）。ＡＶＰ８９３で２時間処理した時、および１８時間処理した後（データは示さず）には、ゴルジ槽は見られなかった。この結果は、ＡＶＰ８９３を１時間、４時間、および１８時間適用したＶｅｒｏ細胞でも再現され、後の２つの曝露では槽構造が崩壊した（データは示さず）。したがって、ＡＶＰ８９３は処理後数時間以内にゴルジ槽の構造を撹乱すると結論を下す。
【００９６】
細胞内タンパク質移動
この領域内での輸送タンパク質に対する選択的阻害により、ＥＲ−ゴルジを通るタンパク質移動に対するある作用が示唆される。この可能性を直接試験するために、細胞を薬物と共に、および薬物なしで１６〜２０時間培養し、回収し、溶解し、様々な濃度のイオジキサノール含有画分（２．５〜３０％）のグラジエント上に重層した。グラジエントを５６Ｋｘｇで２〜１８時間遠心分離し、回収して、ウェスタンブロットにより内在タンパク質について試験した。画分は、カルネキシン（ＥＲ特異的マーカー）、γ−アダプチン（ゴルジ）、およびＲａｂ５ａ（小胞）に特異的な抗体でプローブした。図３３〜３６はそれぞれ、小胞体（ＥＲ）の場合はカルネキシン、ゴルジ（Ｇ）の場合はγ−アダプチン、および小胞／エンドソーム（Ｖ）の場合はＲａｂ５ａであるマーカータンパク質の存在と比較した、各画分に存在する様々なタンパク質のレベルを示す。図３４および図３５はそれぞれ、また、密度勾配遠心分離の前に得られたＲａｂ６およびＲａｂ１Ｂの非分画のレベルを示す。これら３つのマーカータンパク質の発現において、対照と薬物処理した細胞との間に差は見られなかった。
【００９７】
Ｂ１６Ｆ１／Ｂ１６Ｆ１０密度勾配プロトコル
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、薬物を適用する１日前に１７５ｃｍ２のフラスコに接種した。翌日、培養物に、新たに調製した培地＋／−薬物を当てた。１６時間後、冷却したＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで細胞を洗浄し、その後、氷冷したホモジナイズ用バッファー：ＫＣｌ １３０ｍＭ、ＮａＣｌ ２５ｍＭ、ＥＧＴＡ １ｍＭ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４ ２５ｍＭに、バッファー５ｍＬ当たりプロテアーゼ阻害剤１５μｌを加えたものの中に回収した。フラスコ１本当たりバッファー１ｍＬを使用し、細胞は破片にして１４ｍＬ培養用丸底試験管に入れ、氷上に保存した。次いで、回収した細胞を組織用ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１０／３５）でホモジナイズし、２ｍＬ遠沈管に移して、４℃、８分間、１０００ｒｐｍで遠心した。上清を集め、予めホモジナイズ用バッファーと共に調製し、冷却しておいた３０％〜２．５％のイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）のグラジエント上に置いた。１６×１００ｍｍの超遠心分離用試験管を用い、ＡＨ−６２７ローター付Ｓｏｒｖａｌ ＯＴＤ５０Ｂ 超遠心分離機で、試料を２７，０００ｒｐｍで１時間遠心した。グラジエント上部から試料１ｍＬを注意深く取り、その後、ウェスタンブロット分析のために２Ｘ試料用バッファーで希釈した（１レーン当たり１６μｌ注入）。注意：このプロトコルを通して、試料はできる限り氷上に保った。
【００９８】
ＡＶＰ８９３で処理した細胞ははるかに少ないＧＳ２８しか発現しなかったが、その分配に著しい変化はなかった（図３３）。ニカストリンははるかに広く分配され、薬物処理した細胞からの溶解物の画分全てにおいて部分的にグリコシル化された形態で主に発現された（対照の細胞に対して）。Ｒａｂ１ｂおよびＲａｂ６の発現も試験した。その結果を図３４および図３５にそれぞれ示す。どちらのタンパク質も（ＧＳ２８とは対照的に）未画分溶解物中では量的に減少しなかったが、Ｒａｂ１ｂとＲａｂ６両方ともゴルジ区画ではなく、ＥＲ中に保持されていた。Ｒａｂ１ａについても、同様の結果が示された（図示せず）。Ｒａｂ６も小胞中に局在すると思われ、ＥＲ（逆行）またはゴルジ（順行）どちらかとの小胞の融合はＡＶＰ８９３により阻害される可能性が示唆された。ゴルジ後方区画中に主に配置されるＳＮＡＲＥタンパク質であるＳＮＡＰ２３は、同様にＥＲへ移動した（図３６）。しかしながら、この場合、ＳＮＡＰ２３はＥＲで積み荷タンパク質として発現され、ＥＲからゴルジへ周辺の区画を通過して移動する。
【００９９】
ブレフェルジンＡとの比較
タンパク質の細胞内輸送に影響を及ぼすことが知られている少数の化合物の中で、最も研究されている２つはモネンシンとブレフェルジンＡである。モネンシンは、ＡＶＰ化合物について注目される幾つかの作用（例えばサイトカインの阻害）を共有するナトリウムイオン透過担体である。しかしながら、モネンシンはゴルジ後方区画中で作用するので、その活性において質的な不一致があり、この化合物が違ったふうに作用することを明らかに実証している。しかしながら、ブレフェルジンＡはＥＲからゴルジへのタンパク質の移動を遮断し、サイトカイン生産／放出および腫瘍細胞増殖を含むＡＶＰ８９３で見られる作用の多くを共有する。ブレフェルジンＡの機序はかなり良く描出されており、ゴルジからＥＲへの逆行ＣＯＰＩＩ小胞の出芽の活性化を担うＧＴＰａｓｅであるＡｒｆ１上でのＧＤＰ−ＧＴＰ変換の阻害によるゴルジの崩壊を伴っている。しかしながら、Ａｒｆ１は主としてＥＲ−ゴルジ領域に位置するが、他の区画中にも見られ、ＥＲ−ゴルジ領域よりも広い作用を有すると思われる。
【０１００】
ブレフェルジンＡは、６０細胞のスクリーニングにおいての腫瘍細胞増殖の阻害について、ＮＣＩにより試験された。ＮＣＩの６０細胞スクリーニングは、実質的に図９について記載したように行われた。ブレフェルジンＡについてのＮＣＩのデータベースから入手可能なデータを、より最近のＡＶＰ８９３のデータと比較した。ブレフェルジンＡに関して得られた結果とＡＶＰ８９３のデータとの比較から、ブレフェルジンＡは１０〜１００ｎＭの濃度で実質的に全ての細胞の増殖を阻害するが、ＡＶＰ８９３は試験した細胞株に応じて効力にかなりの変動を示した（＜１０ｎＭ〜＞１０μＭ）ことが示される（図３７）。ＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかの存在下でいくつかの腫瘍細胞株を約７２時間培養し、その後、図９について記載したように、全タンパク質（ＳＲＢ）を測定することによって増殖反応を評価した。社内で行った一対一の比較の結果も、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのブレフェルジンＡおよびＡＶＰ８９３に対する細胞の相対的な増殖反応が実質的に変動したことも示している（表３）。
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
表３に略述した細胞株で、タンパク質の発現に対する化合物の作用のさらなる比較を行った。図３８に示すように、ＡＶＰ８９３は、２つの「感受性の」細胞株で、増殖に対する活性と殆ど匹敵する濃度で、ＧＳ２８（および成熟ニカストリン）の発現を阻害した。ＭＯＬＴ−４、Ｈｓ２９４Ｔ、およびＨ４６０細胞をＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかと共に一晩培養し、回収して、図１７について記載したようにウェスタンブロット用に調製した。ＡＶＰ８９３は、耐性系のＨ−４６０では、ＧＳ２８またはニカストリンへの影響がなかった。対照的に、ブレフェルジンＡは、高濃度で、少々の低減（ＭＯＬＴ４、Ｈｓ５７８Ｔ）から発現の大きな増大（Ｈ−４６０）までの範囲で、ＧＳ２８への可変の影響を有していた。さらに、ＧＳ２８に見られた変化は、これらの細胞株における増殖について、ブレフェルジンＡのＩＣ５０に匹敵しなかった。ニカストリンへの影響は最小であった。
【０１０３】
これらの結果は、ブレフェルジンＡとＡＶＰ８９３とは、タンパク質輸送を阻害するために、異なる機序で作用することを明白に示している。ＡＶＰ８９３またはブレフェルジンＡのいずれかで処理した細胞に由来する溶解物の密度勾配遠心分離を比較した最初の結果は、２つの化合物が同様の方法でＲａｂ６の分配を変えることを示している（図３９）。３Ｔ３細胞を培養し、回収して、図３３に記載した手順と同様の密度勾配遠心分離のために調製した。これは、ＡＶＰ８９３がＥＲ−ゴルジ間のタンパク質の移動を阻害するように作用しているという考えを支持している。ＡＶＰ化合物は、試験した全ての非形質転換細胞でＧＳ２８を抑制するが、全ての腫瘍細胞がこのように反応するわけではない（図４０）。１μｇ／ｍｌのＡＶＰ８９３で１８〜２０時間処理した６つの細胞株に由来する溶解物をニカストリンおよびＧＳ２８の発現について比較した。ウェスタンブロットのために、各レーンに同量の全タンパク質を注入した。腫瘍細胞は様々な遺伝子改変を受け、それ自身で、増殖能力を増加するために、正常のタンパク質輸送を回避することがある。したがって、ＡＶＰ８９３（またはブレフェルジンＡ）の特異的な標的は同定されていないが、ＥＲ−ゴルジを通るタンパク質輸送を阻害することがその機序として提案されている。
【０１０４】
ゴルジに影響を及ぼすことが知られている薬理剤に比べて、ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質に対して特異な活性を有することを示すために、さらなる研究を行った。ＡＶＰ８９３の活性と、既知の薬剤であるモネンシン、ブレフェルジンＡ、およびラパマイシンの活性とのこの比較は、ＡＶＰ８９３が独特の方法でゴルジ内在タンパク質に影響を及ぼすことを実証する助けとなる。組合せ処理では、第１の薬剤を添加して１時間後に、第２の薬剤を添加し、その後１８時間培養する。薬剤の用量は以下のとおりである：ＡＶＰ８９３、２００ｎｇ／ｍｌ；ブレフェルジンＡ、１０ｍｇ／ｍｌ；モネンシン、１０ｍｇ／ｍｌ、ラパマイシン１０ｎＭ。図４１に示すように、ＡＶＰ８９３は、他の３つの薬剤よりも著しくＧＳ２８およびＧＳ１５の発現を低減させ、そのＧＰＰ１３０に対する作用（より低い、推定上、未成熟形態の糖タンパク質の発現をもたらす）は、モネンシンとのみ匹敵した。加えて、ブレフェルジンＡおよびモネンシンは、８９３と組み合わせると、その活性が優勢となるが、ブレフェルジンＡまたはモネンシンにのみ誘発される発現の「表現型」を示す。８９３をラパマイシンと組み合わせた時にのみ、８９３のタンパク質の発現の「表現型」が起こる。したがって、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ８９３の活性は独特であり、既知の薬剤であるモネンシン、ブレフェルジンＡ、ラパマイシンとは異なる。
【０１０５】
他の既知の薬理剤であるブレフェルジンＡと比較して独特なＡＶＰ８９３の活性を決定するために、タンパク質の発現に対するＡＶＰ８９３およびブレフェルジンＡの用量増加の効果を複数の細胞株で比較した。ＡＶＰ８９３は、３つの異なる細胞株にわたってブレフェルジンＡとは異なる方法でゴルジ内在タンパク質ＧＳ２８に影響を及ぼすことが示された（図４２）。ＡＶＰ８９３処理の有効範囲は、ブレフェルジンＡのそれに近くはなかった。さらに、Ｒａｂ６の発現はＡＶＰ８９３によって大きな影響を受けないことが再び示されたが、対して、ブレフェルジンＡは細胞の種類に応じて、その発現に対する影響が様々であった。結論として、ＡＶＰ８９３の独特な活性は、複数の細胞株にわたって存在した。
【０１０６】
ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質（例えば、マンノシダーゼＩＩ）に対して独特の活性を有することの更なる証拠は、ウェスタンブロット分析の代わりに、薬物曝露の時間を短くし、免疫細胞化学試験を用いて見出された（図４３）。この実験は、ブレフェルジンＡおよびノコドゾール（Nocodozole）で１時間処理すると、マンノシダーゼＩＩの標準の染色パターンが撹乱されることを示した。三日月形のゴルジの標識は、ブレフェルジンＡの場合は完全に消散し、あるいはノコドゾールの場合は広がって無数の小さな点状の破片となった。しかしながら、この実験では、ＡＶＰ８９３に１時間曝露しても明白な作用はなく、確かにマンノシダーゼＩＩの局在または発現レベルにはいかなる混乱もなかった。結論として、図４３に示した結果は、ＡＶＰ８９３がゴルジ内在タンパク質に対して独特の方法で作用することの更なる証拠を提供する。
【０１０７】
タンパク質輸送の阻害により予想される他の生物学的作用
ＥＲからゴルジへの輸送の阻害を実証することにより、観察されるＡＶＰ化合物の作用の明確な説明が与えられる。古典的なＥＲ−ゴルジ経路は、ＩｇＥ、多くの膜受容体、および多くのサイトカインを含む殆どの細胞内タンパク質の好ましい輸送／成熟経路である。後者の一つの例外はＩＬ−１であり、これは「非古典的な」分泌経路によってＥＲ−ゴルジを回避する。ＡＶＰ１３３５８は殆どのサイトカインの分泌を阻害するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１のレベルに影響を及ぼさない。
【０１０８】
提案された細胞内タンパク質輸送に関するＡＶＰ化合物の機序によって、これらの化合物が共有する可能性のある他の作用および非作用に関して、ある種の予測もできるようになる。例えば、モネンシンなどのポストゴルジ活性の化合物に予想されるように、ＥＲとゴルジとの間の小胞の融合または出芽の阻害はエキソサイトーシスに影響を及ぼすことはない。ＡＶＰ８９３は、エキソサイトーシスに関与するタンパク質、特にＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ２３（非神経細胞）、およびＳＮＡＰ２５（神経細胞）の発現に及ぼす影響は最小である。したがって、この化合物は、ＰＣ１２褐色細胞腫細胞のノルエピネフリンの放出またはドーパミンの再取込みに影響を及ぼさない（図示せず）。さらに、ＡＶＰ８９３の類似体であるＡＶＰ１３３５８は、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはＩｇＥ−抗原複合体で誘発したとき、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞の脱顆粒を阻害しない（図示せず）。
【０１０９】
ＥＲとゴルジとの間の正常な小胞の移動を遮断することで起こり得る重要な結果は、ウイルスタンパク質の成熟および細胞内伝播の阻害である。殆どのウイルスは、そのタンパク質の同化および最終的には感染性について、古典的なＥＲからゴルジへの経路に依存している。ブレフェルジンＡは、ＥＲ−ゴルジにウイルスタンパク質の蓄積を引き起こす。ＡＶＰ８９３のウイルス伝播を阻害する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−２を感染させ、薬物濃度の増加の効果を観察することによって試験した（図４４）。Ｖｅｒｏ細胞（１００万個／ｍｌ）を一晩培養し、ＡＶＰ８９３を添加して約１時間後に生きている２型ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２、ＡＴＣＣ）約１５０ＰＦＵを接種した。４８時間後に培地を取り除き、細胞を生理食塩水で洗浄して、生物学的プラーク染色で２０分間染色した。水１ｍｌを加え、液体を除去した後、ＰＦＵを計数してウイルスを定量した。ＡＶＰ８９３は、試験した全ての濃度で、プラークの形成を抑制し、３００ｎｇ／ｍｌで完全にブロックされた。さらに、急勾配の濃度−反応曲線から、ウイルスよりもむしろ、宿主細胞に作用する薬物に予想されるような、非競合的阻害であることが示唆される。
【０１１０】
ウイルス感染の広がりに対するＡＶＰ８９３の作用をさらに調べた。ＡＶＰ８９３（３００ｎｇ／ｍｌ）を適用して１６時間後に、ウイルスを接種した。図４５に示した時点は、ウイルス接種後の時間を表している。ＡＶＰ８９３はゴルジ内在タンパク質の発現および局在化に対して作用することを実証したので、次の一連の実験は、そのライフサイクルでゴルジを利用するウイルスであるＨＳＶに対するＡＶＰ８９３の作用を試験した。図４５に示した免疫細胞化学的研究に加えて、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、ならびにそのライフサイクルでゴルジを使用する他の系統のウイルスについて、広範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏのプラークアッセイを行った（表２を参照）。
【０１１１】
ウイルス粒子（ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｅをラベルして図４５に視覚化した）がＡＶＰ８９３の存在下で最初の感染部位を越えて広がるかどうかかを測定した。ＨＳＶ−２に感染した培養物をＡＶＰ８９３で処理した。その結果は、最初の感染部位を越えて、周囲の細胞にラベルは殆ど〜全く見られなかったことを実証している。ｇＢ、ｇＤ、およびカプシドタンパク質ＩＣＰ５を含む他のＨＳＶタンパク質も試験し、同様の結果を得た（データは示さず）。結論として、ＡＶＰ８９３はＨＳＶ−２ウイルス粒子の広まりを妨げた（または、少なくとも感染性粒子の広まりを妨げる）。さらに、ＡＶＰ８９３は、培養物の初期感染を阻止したのではなく、ウイルスのその後の広まりのみを阻止したと思われた。これらの結果は、ＡＶＰ８９３が、ゴルジ内在タンパク質に対する作用を通して、ＨＳＶ−２がするように、そのライフサイクルでゴルジを利用するウイルス粒子の広まりを阻害しているかもしれないという概念実証を与える。
【０１１２】
ＨＳＶタンパク質の発現に影響を及ぼす他に、ＡＶＰ８９３は、他のウイルスの系統に対する抗ウイルス活性を発揮することが実証された。ゴルジを利用すると思われる系統からの代表的なウイルスを試験した。表４に示すように、多くの他のウイルス系統の広まりは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＶＰ８９３により阻止された。さらに、モルモットの局所的ＨＳＶモデルは、ＡＶＰ８９３はｉｎ ｖｉｖｏでウイルスの活性を阻害するかもしれないことを示している（データは示さず）。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
細胞内タンパク質輸送の阻害
記載された本発明の好ましい態様は、少なくとも１７の構造クラスの化合物を含む（表５）。これらのシリーズの全てを代表する化合物は、ＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を阻害するのと同様の濃度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩｇＥ反応および細胞増殖を阻害する。後者は、非形質転換細胞でＧＳ２８の発現が阻害されることにより証明される（図４５）。
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
本発明の好ましい態様は、アレルギー、細胞増殖およびウイルス複製を含む、多くの生物学的プロセスに影響を与えるタンパク質輸送を選択的に変調する新規な機序に関する。さらに特には、本発明の態様は、この機序を調整し、それによって生物学的プロセスを変調する化合物の同定およびキャラクタリゼーションに関する。本明細書に記載したように、ゴルジと中間区画（ＩＣ、ＥＲとゴルジとの間に位置する）での小胞のドッキングおよび融合に関与するｔ−ＳＮＡＲＥタンパク質であるＧＳ２８、および、核内に移動して転写因子として動作するタンパク質の膜内切断に関係するニカストリンの両方が、広範囲の生物学的活性を示す化合物の影響を受けることが見出された。さらに、これらの化合物で処理すると、ニカストリンの成熟が妨げられ、完全にグリコシル化された活性部分を犠牲にして、未成熟で部分的にグリコシル化された形態のニカストリンが蓄積することが明らかになった。ニカストリンは普通、ＥＲを通過し、ＥＲで部分的にグリコシル化され、次いでゴルジに行き、ゴルジでグリコシル化およびシアル酸付加が完了する。したがって、ニカストリンの状態の変化は、ニカストリンが細胞中を移動することから、細胞内区画と関係があるように思われる。これらの化合物は、ニカストリンの成熟を抑制することにより、ＥＲからゴルジへのニカストリンの輸送を防止している可能性がある。ニカストリンの輸送が防止されるのは、薬物の存在下でＧＳ２８の発現が低減されることによる可能性がある。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態の上記の記載は、本発明の範囲を限定しようとするものではない。実際、Ｊｕｎｇら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０００年、２１巻、３３６９〜３３７７頁）は、ＥＲおよびゴルジ装置に関連する内在タンパク質は１５７種ある（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース、表１）ことを指摘している。Ｔａｙｌｏｒら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９７年、１８巻、６４３〜６５４頁）は、ラット肝細胞のゴルジの１７３種のタンパク質を報告した。したがって、ＧＳ１５、ＧＳ２８、ニカストリンおよびＲａｂ（本明細書では、ＡＶＰ化合物によって抑制されることが示されている）の他にも、上記のものと同一のまたは重複する経路を介して、疾患状態（とりわけ、アレルギー、癌、ウイルス感染）においてタンパク質輸送に影響を及ぼす、他のＥＲ／ゴルジタンパク質のターゲットは多数ある可能性がある。したがって、本発明者らは、増殖的な（またはウイルス複製的な）細胞の反応に必要なタンパク質輸送を選択的に調整するための一つの好ましい手段として、例えばＧＳ２８レベルの薬理的抑制を明らかにしたが、ＧＳ２８と協調して作用する、またはＧＳ２８の作用を補い、あるいは高める、他のＥＲ／ゴルジ関連タンパク質を変調することは、増殖／複製の障害を治療するための他の好ましい手段を示す可能性がある（図４６および図４７に概略図の形で示したように）。あるいは、病的な輸送反応の抑制を高めるような、他のＥＲ／ゴルジタンパク質を標的とする他の薬剤との併用療法は、本発明の範囲内の他の実施形態を表すものである。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態の興味深い態様は、重複するタンパク質輸送経路、およびそれに関与するタンパク質が、疾患状態（例えば、形質転換された、感染した、など）に関係する細胞に関連する「悪い」輸送を選択的に抑制するにもかかわらず、正常な（または「良い」）タンパク質輸送のニーズを成し遂げることを細胞ができるように作動することである。したがって、本発明者らは、本明細書に開示された選択的薬理療法を用いると、（ブレフェルジンＡを用いる治療レジメンとは対照的に）毒性を最小限にできることを見出した。
【０１２３】
当業者であれば、ごく普通の実験だけを使用して、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの同等物を理解し、または確認できるであろう。そのような同等物は次の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、細胞内タンパク質輸送を説明する概略図である。
【図２】図２は、ｅｘ ｖｉｖｏでの抗原に対するＩｇＥ反応を示す。
【図３】図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＰＢＬのＩＬ−４＋αＣＤ４０ Ａｂに対するＩｇＥ反応を示す。
【図４】図４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスの脾臓Ｔ細胞のサイトカイン反応を示す。
【図５】図５は、ヒトＰＢＬのＴ細胞のサイトカイン反応を示す。
【図６】図６は、ヒトの単核細胞のＣＤ２３を示す。
【図７】図７は、ＡＶＰ ８９３に対する脾臓細胞増殖反応を示す。
【図８】図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激物および薬物に応じたヒトＰＢＬの増殖を示す。
【図９】図９は、ＮＣＩ ６０−細胞パネルを示す。
【図１０】図１０は、ＢＡＬプロトコル＃１の概略図であり、ＢＡＬ洗浄の細胞を例証する。
【図１１】図１１は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＨＲ反応を示す。
【図１２】図１２は、Ｂ１６−Ｆ１マウス黒色腫腫瘍増殖に及ぼすＡＶＰ ２５７５２の影響を示す。
【図１３】図１３は、ＨＳ２９４ｔヒト黒色腫腫瘍増殖に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図１４】図１４は、様々な生化学的アッセイについてＡＶＰ １３３５８の用量反応を示す。
【図１５】図１５は、ＡＶＰ １３３５８のキナーゼスクリーニングである。
【図１６】図１６は、タンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響のパワーブロット結果を示す。
【図１７】図１７は、Ｂ１６細胞のＡＶＰ ８９３の作用の経時変化を示す。
【図１８】図１８は、１６時間での様々な細胞のニカストリンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図１９】図１９は、一晩での様々な細胞のニカストリン、カルネキシンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図２０】図２０は、一晩での様々な細胞のニカストリン、ｎ−グリシン、カルネキシンおよびＧＳ２８の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図２１】図２１は、ＡＶＰ ８９３による、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の刺激されたタンパク質の発現の阻害を示す。
【図２２】図２２は、様々な化合物による、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞の、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激されたニカストリンおよびＧＳ２８の発現の用量反応的な阻害を示す。
【図２３】図２３は、ＩＬ−４／αＣＤ４０ Ａｂに対するＰＢＬ増殖反応のＡＶＰ ８９３阻害に及ぼすＰＭＡの影響を示す。
【図２４】図２４は、ＰＭＡ存在下およびＰＭＡ不存在下での４８時間後のＩＬ−４／αＣＤ４０ Ａｂに誘発されたタンパク質の発現のダウンレギュレーションするＡＶＰ ８９３の選択的用量反応を示す。
【図２５】図２５は、ヒトＰＢＬのＡＶＰ ８９３に対するＧＳ２８ ｍＲＮＡの反応を示す。
【図２６】図２６は、様々なＥＲおよびゴルジタンパク質のタンパク質輸送経路との関りを示す概略図である。
【図２７】図２７は、ＡＶＰ ８９３による、１８〜２０時間培養のＲａｂの発現の用量反応的な阻害を示す。
【図２８】図２８は、３Ｔ３細胞のＧＳ２８とＲａｂ１ａタンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響の比較を示す。
【図２９】図２９は、ゴルジ内在タンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３０】図３０は、マンノシダーゼIIの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３１】図３１は、Ｖｅｒｏ細胞のＲａｂ１Ｂの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３２】図３２は、ＭＯＬＴ４細胞のゴルジ形態に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３３】図３３は、Ｂ１６細胞のタンパク質の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図３４】図３４は、Ｂ１６細胞のＲａｂ６分布を示す。
【図３５】図３５は、Ｂ１６細胞のＲａｂ１Ｂ分布を示す。
【図３６】図３６は、Ｂ１６細胞のＡＶＰ ８９３に対するＳＮＡＰ２３の反応を示す。
【図３７】図３７は、ＡＶＰ ８９３とブレフェルジンＡでのＮＣＩ結果を示す。
【図３８】図３８は、ＧＳ２８およびニカストリンの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３およびブレフェルジンＡの影響を示す。
【図３９】図３９は、３Ｔ３細胞のブレフェルジンＡおよびＡＶＰ ８９３に対するＲａｂ６の反応を示す。
【図４０】図４０は、６細胞株のＧＳ２８とニカストリンの量的比較を示す。
【図４１】図４１は、３Ｔ３細胞の公知の薬理剤と比べた、ゴルジ内在タンパク質に対するＡＶＰ ８９３の特異な作用を示す。
【図４２】図４２は、ＧＳ２８、カルネキシンおよびＲａｂ６の発現に及ぼすＡＶＰ ８９３およびブレフェルジンＡの特異な影響を示す。
【図４３】図４３は、マンノシダーゼIIの発現に及ぼすＡＶＰ ８９３、ブレフェルジンＡおよびノコドゾール（Nocodozole）の特異な影響を示す。
【図４４】図４４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶｅｒｏ細胞のＨＳＶ−２増殖に及ぼすＡＶＰ ８９３の影響を示す。
【図４５】図４５は、ＨＳＶ−２に感染したＶｅｒｏ細胞のｇＥ発現に対するＡＶＰ ８９３の作用を示す。
【図４６】図４６は、解明されたＡＶＰ化合物の作用機構を示す概略図である。
【図４７】図４７は、ＡＶＰ ８９３によるＧＳ２８タンパク質の発現の選択的阻害の多様な効果を示す概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する薬物候補を同定するためのスクリーニング方法であって、
真核細胞を薬物候補と接触させること、および
増殖依存性タンパク質輸送に関連する、ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を決定することを含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質がＧＳ２８である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に関連する少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖を阻害することを含む、疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質がＧＳ２８である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用。
【化１】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【化２】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。）
【化３】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。）
【化４】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。）
【化５】
（式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。）
【化６】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【化７】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。）
【化８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。）
【化９】
（式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。）
【化１０】
【化１１】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【化１２】
【化１３】
【化１４】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【化１５】
【化１６】
（式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。）
【化１７】
【化１８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。）
【請求項８】
前記組成物がＡＶＰ ８９３を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用であって、
その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される使用。
【化１９】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【請求項１０】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用であって、
その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される使用。
【化２０】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【請求項１１】
疾患状態に関連するサイトカイン反応を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【請求項１２】
ウイルス複製を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【請求項１３】
アレルギー反応に関連するＢ細胞のＩｇＥ分泌を選択的に減らすための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【請求項１】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する薬物候補を同定するためのスクリーニング方法であって、
真核細胞を薬物候補と接触させること、および
増殖依存性タンパク質輸送に関連する、ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を決定することを含むスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＲ／ゴルジ内在タンパク質がＧＳ２８である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に関連する少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分な量の組成物を投与し、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖を阻害することを含む、疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害する方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質が、ＧＳ１５，ＧＳ２８，ニカストリンおよびＲａｂからなる群より選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質がＧＳ２８である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用。
【化１】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【化２】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヒドロキシ，ハロゲン，ＮＯ２，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＨ２，ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４およびＣＮからなる群より選択され；
Ｚは、Ｏ，Ｓ，ＮＨおよびＮ−Ｒ’からなる群より選択され；さらに、Ｒ’は、Ｈ，アルキル，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，アルキル，ハロゲン，アルコキシ，ＣＦ３およびＯＣＦ３からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アミノアルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，アルコキシアルキル，シクロアルキル，オキサシクロアルキルおよびチオシクロアルキルからなる群より選択される。）
【化３】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルからなる群より選択され、前記置換基はヘテロ環でなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニルおよび置換アダマンチルの置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５およびＣＯＯＨからなる群より選択される。）
【化４】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は両方がメチル基であることはなく；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アシル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ５，ＣＯＯＨ，ＣＯＣＦ３およびヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２または前記置換基の少なくとも１つはヘテロ環である。）
【化５】
（式中、
Ｘは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２ＣＨ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｙは、モノ，ジ，トリおよびテトラ置換Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，ベンゾ，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＰｈ，ＣＯＯＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＮＨＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒ１は、アルキル，置換アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチル，一個以上のヘテロ原子を含むヘテロ環，および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
前記置換アルキル，置換シクロアルキル，置換シクロプロピル，置換シクロブチル，置換シクロペンチル，置換シクロヘキシル，置換シクロヘプチル，置換ビシクロアルケニル，置換アダマンチルおよび置換ヘテロ環の置換基は、アルキル，アリール，ＣＦ３，ＣＨ３，ＯＣＨ３，ＯＨ，ＣＮ，ＣＯＯＲ，ＣＯＯＨおよびヘテロ環からなる群より選択される。）
【化６】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択され、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基である。）
【化７】
（式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，ハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲおよびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３，アミノアルキルおよびジアルキルアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，ヘテロアリール，チオフェン，ピリジル，チアゾリル，イソオキサゾリル，オキサゾリル，ピリミジニル，置換アリール，置換ヘテロアリール，置換チオフェン，置換ピリジル，置換チアゾリル，置換イソオキサゾリル，置換オキサゾリル，シクロアリール，シクロヘテロアリール，キノリニル，イソキノリニル，置換シクロアリール，置換シクロヘテロアリール，置換キノリニル，置換イソキノリニル，多重環シクロアリール，多重環シクロヘテロアリール，ベンジル，ヘテロアリール−メチル，置換ベンジル，置換ヘテロアリール−メチルアルキル，ジアルキルアミノアルキル，シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含むシクロアルキル，置換シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，１−３個のヘテロ原子を含む多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，１−３個のヘテロ原子を含む縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，ピロール，ピペリジン，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，置換ピロール，置換ピペリジン，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチルおよび置換アダマンチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
Ｒ１およびＲ２は両方がフェニル基であることはない。）
【化８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，置換多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリールおよびＣＯＲ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，置換多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；Ｒ’はハロアルキルでなく；
Ｒ１，Ｒ２およびＲ’の置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，カルボニル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＯＣＯＲ’，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン類，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＯＲ’’，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つはＨではない。）
【化９】
（式中、
ＸおよびＹは異なっていても、同一であってもよく、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルキル，アルコキシ，アリール，置換アリール，ヒドロキシ，アミノ，アルキルアミノ，シクロアルキル，モルホリン，チオモルホリン，ニトロ，シアノ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＣＯＲ１，ＣＯＯＲ１，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ１およびＮＨＣＯＲ１からなる群より選択され；
ｎは、１〜３の整数であり；
ｍは、１〜４の整数であり；
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２Ｐｈ，ＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−），ＣＯＣＨ３，ＣＯＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，アルケニル，置換アルケニル，アルキニル，置換アルキニル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロアルケニル，置換シクロアルケニル，ポリシクロアルキル，置換ポリシクロアルキル，ポリシクロアルケニル，置換ポリシクロアルケニル，アリールアルキル，置換アリールアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，アリールシクロアルキル，置換アリールシクロアルキル，ヘテロアリールシクロアルキル，置換ヘテロアリールシクロアルキル，ヘテロ環，置換ヘテロ環，ヘテロ原子および置換ヘテロ原子からなる群より選択される。）
【化１０】
【化１１】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【化１２】
【化１３】
【化１４】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、前記Ｃ１−Ｃ８アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択される。）
【化１５】
【化１６】
（式中、
Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｖ，Ｘ，ＹおよびＺは、それぞれ独立に、炭素および窒素から選択され、ただしＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇの少なくとも１つは窒素であり；
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換フェニル，置換ナフチルおよび置換ヘテロアリールは、１−３個の置換基を含み、前記置換基は、Ｈ，ハロゲン類，ポリハロゲン類，アルコキシ基，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択される。）
【化１７】
【化１８】
（式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１−Ｃ５アルキル，ベンジル，ｐ−フルオロベンジルおよびジ−アルキルアミノアルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ５アルキルは、直鎖，分枝または環状アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３，ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＣＯＯＲ’’，ＣＨＯおよびＣＯＲ’’からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族基，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロ環および置換ヘテロ環からなる群より選択され、前記ヘテロ環および前記置換ヘテロ環は１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
前記置換基は、Ｈ，ハロゲン，アルコキシ，置換アルコキシ，アルキル，置換アルキル，ジアルキルアミノアルキル，ヒドロキシアルキル，ＯＨ，ＯＣＨ３，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ’，ＣＯＲ’，ＣＮ，ＣＦ３，ＯＣＦ３，ＮＯ２，ＮＲ’Ｒ’，ＮＨＣＯＲ’およびＣＯＮＲ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ’は、Ｈ，アルキル，置換アルキル，Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，置換Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル，多環式脂肪族類，フェニル，置換フェニル，ナフチル，置換ナフチル，ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールからなる群より選択され、前記ヘテロアリールおよび前記置換ヘテロアリールは１−３個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、それぞれ独立に、窒素，酸素および硫黄からなる群より選択され；
Ｒ’’は、Ｃ１−Ｃ９アルキルからなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ９アルキルは、直鎖アルキル，分枝アルキルおよび環状アルキルからなる群より選択される。）
【請求項８】
前記組成物がＡＶＰ ８９３を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用であって、
その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される使用。
【化１９】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【請求項１０】
疾患状態に関連する真核細胞の増殖を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、下記の群から選択される化合物の使用であって、
その量は、ＥＲとゴルジとの間の増殖依存性タンパク質輸送に伴う少なくとも１種のＥＲ／ゴルジ内在タンパク質の発現を抑制するのに十分なものであり、それによって疾患状態に関連する真核細胞の増殖が阻害される使用。
【化２０】
（式中、
Ｒは、Ｈ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ３Ｈ７，Ｃ４Ｈ９，ＣＨ２ＰｈおよびＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｆ（ｐ−）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ，アリール，置換アリール，シクロアリール，置換シクロアリール，多重環シクロアリール，ベンジル，置換ベンジル，アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，多重環シクロアルキル，縮合環脂肪族，シクロプロピル，置換シクロプロピル，シクロブチル，置換シクロブチル，シクロペンチル，置換シクロペンチル，シクロヘキシル，置換シクロヘキシル，シクロヘプチル，置換シクロヘプチル，ビシクロヘプチル，ビシクロオクチル，ビシクロノニル，置換ビシクロアルケニル，アダマンチル，置換アダマンチルなどからなる群より選択される。）
【請求項１１】
疾患状態に関連するサイトカイン反応を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【請求項１２】
ウイルス複製を選択的に阻害するための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【請求項１３】
アレルギー反応に関連するＢ細胞のＩｇＥ分泌を選択的に減らすための薬剤を調製するための、請求項７〜１０に記載の化合物のいずれかの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２３】
【図２６】
【図３７】
【図４４】
【図４７】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４５】
【図４６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２３】
【図２６】
【図３７】
【図４４】
【図４７】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４５】
【図４６】
【公表番号】特表２００７−５０１６１８（Ｐ２００７−５０１６１８Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２８１０（Ｐ２００６−５２２８１０）
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９５０
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５００５３９０３３）アバニール・ファーマシューティカルズ (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９５０
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５００５３９０３３）アバニール・ファーマシューティカルズ (15)
【Ｆターム（参考）】
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