説明

ダイオキシン類分解能力の評価方法

【課題】T−RFLP法によって示されたコンポスト内の細菌相の分析結果から、ダイオキシン類分解能力の高いコンポストに特徴的な傾向を見出し、ダイオキシン類分解能力を評価する方法を提供すること。
【解決手段】ダイオキシン類に対して分解能を有するダイオキシン類分解コンポストから抽出されたDNAのPCR産物を制限酵素で切断し、T−RFLP法により解析し、該T−RFLP法によるフラグメント数を求め、ダイオキシン分解能力と前記フラグメント数との関連によりダイオキシン類分解能を評価することを特徴とするT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法に関し、詳しくはダイオキシン類に汚染された土壌、底質、焼却灰、地下水等に対して浄化処理のために使用するダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン分解能力を迅速に評価するT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ダイオキシン類は、主に生活ごみや産業廃棄物等を焼却する過程などで発生し、環境には排ガスや排水と共に排出され、一部は降水等により土壌に浸透し吸着される。
【0003】
また、ダイオキシン類は、化学的に安定で分解されにくいため、汚染された土壌で育った植物類もダイオキシン類を取り込んでいる。
【0004】
さらに、ダイオキシン類に汚染された水が流入した河川や港湾の底にも蓄積し、そこに生息する魚介類も汚染されている。
【0005】
人間や動物がダイオキシン類に汚染されたものを摂取すると、体内に蓄積していくが、このダイオキシン類は低濃度で高い毒性を有し、発がん性、催奇性などが知られており、世界的な社会問題となっている。
【0006】
ダイオキシン類に汚染された土壌、底質、焼却灰、地下水等を浄化する方法として、いくつかの方法が提案されているが、経済性、安全性、浄化後の再利用等を考慮すると、生物学的な処理方法が有効である。
【0007】
生物処理では分解コンポストに含まれる微生物が、ダイオキシン類の持つ塩素の結合を切る(脱塩素化)することによって、ダイオキシン類を分解する。
【0008】
この方法において、重要な点は、ダイオキシン類汚染物質に添加した分解コンポストのダイオキシン類の分解能力を把握し、分解能力が高く維持されるように管理することである。
【0009】
古くは、ダイオキシン類の濃度を直接測定し、その濃度変化により分解能力の評価を行っていた。ダイオキシン類を直接測定する方法による評価は、最も確実なものではあるが、ダイオキシン類を抽出し、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(GC−MS)を用いて測定しなければならず、測定結果を得るまでに長い期間と、コストがかかってしまっていた。
【0010】
そこで、特許文献1においては、あらかじめダイオキシン類分解の精度と関連を確認した指標となる塩化化合物を添加し、その半減期から能力を測る技術が開示され、ダイオキシン分解能を測定する期間を2〜3週間程度に短縮している。
【0011】
また、特許文献2には、生物学的な処理に用いる微生物を検出するプローブを用いて、微生物群から抽出したDNAまたはRNAとハイブリダイズして、有用微生物の挙動を検出し、ダイオキシン類の分解能力を評価する技術が開示されている。
【特許文献1】特開2006−255631号公報
【特許文献2】特開2005−278433号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
指標とする特定の塩化化合物濃度の変化からダイオキシン分解能力を評価するという特許文献1の技術によって、ダイオキシン類を直接測定する場合に比べれば評価に要する期間は短縮された。しかし、依然として数週間要しており、濃度変化から分解能力を直接評価するという方法は、評価の確実性は高いが、迅速に分解能力を評価したい場合には不向きであった。
【0013】
DNAやRNAに着目した方法は、調査に要する時間が数日程度で済むという利点がある。
【0014】
また、ダイオキシン類を脱塩素化する微生物の多くは難培養性であるので、DNAやRNAなどを用いた分子生物学的な手法は、そういった微生物の挙動を調査するためには、大変有効な手段だと思われる。
【0015】
特許文献2の方法は、ダイオキシン類分解作用をもつ微生物を直接検出し、活性を測るというものである。しかし、コンポスト内の総微生物数に対して、ターゲットとする微生物の菌が占める割合は、ごくわずかであるため、検出が難しく、正確なモニタリングが困難な場合があった。
【0016】
本発明者らは、分子生物学的な手法で分解能力を測る際に、数量の少ない菌を直接モニタリングするのではなく、ダイオキシン分解能力が高いコンポストに特徴的な傾向が見られないかと、多くのコンポストについてダイオキシン類の分解能力と、T−RFLPによる分析結果との関連について、鋭意研究を重ねた結果、本発明に至った。
【0017】
そこで、本発明の課題は、T−RFLP法によって示されたコンポスト内の細菌相の分析結果から、ダイオキシン類分解能力の高いコンポストに特徴的な傾向を見出し、ダイオキシン類分解能力を評価する方法を提供することにある。
【0018】
本発明の他の課題は以下の記載によって明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【0019】
上記課題は以下の各発明によって解決される。
【0020】
(請求項1)
ダイオキシン類に対して分解能を有するダイオキシン類分解コンポストから抽出されたDNAのPCR産物を制限酵素で切断し、T−RFLP法により解析し、該T−RFLP法によるフラグメント数を求め、ダイオキシン分解能力と前記フラグメント数との関連によりダイオキシン類分解能を評価することを特徴とするT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【0021】
(請求項2)
制限酵素としてHha1を使用した場合の前記フラグメント数368base付近の検出比率によってダイオキシン分解能力を評価することを特徴とする請求項1記載のT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【0022】
(請求項3)
フラグメント数368base付近の検出比率が0.2%以上の時、ダイオキシン類分解能力が高いと評価することを特徴とする請求項1又は2記載のT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明によれば、T−RFLP法によって示されたコンポスト内の細菌相の分析結果から、ダイオキシン類分解能力の高いコンポストに特徴的な傾向を見出し、ダイオキシン類分解能力を評価する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0024】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【0025】
まず、本発明においてダイオキシン類とは、PCDD、PCDFおよびCo−PCBのダイオキシン類対策特別措置法に定められたダイオキシン類のことを指す。
【0026】
また、本発明において、評価対象となるダイオキシン類分解コンポストとは、少なくともダイオキシン類に対して分解能を有する微生物を含み、嫌気性微生物およびまたは好気性微生物からなる微生物の複合体である。ダイオキシン類に対して分解能力を有するものであれば特に制限はなく、微生物製剤であってもよい。
【0027】
ダイオキシン類分解コンポストの例としては、産業廃棄物、家畜糞、食品残渣、底質、下水汚泥などを発酵腐熟させたものが挙げられる。
【0028】
このダイオキシン類分解コンポストをダイオキシン類汚染物質に接触させると、ダイオキシン類分解コンポスト内の微生物が、ダイオキシン類汚染物質に含まれるダイオキシン類を脱塩素化し、分解処理する。
【0029】
このダイオキシン類分解コンポストを作用させる方法は、特に限定されず、ダイオキシン類汚染物質とダイオキシン類分解コンポストを分解装置内に入れて、温度、通気量、水分、pHなどを管理しながら攪拌混合するものであってもよいし、ダイオキシン類汚染物質中に注入して作用させるものであってもよいし、浄化対象が土壌などである場合はその表面に覆土して作用させるものであってもよい。
【0030】
本発明のT−RFLP法による評価法で用いるDNAの抽出には、実施例のような方法で抽出することができ、これと同様の抽出精度があれば限定されない。
【0031】
抽出したDNAは、蛍光色素で標識したプライマー27f(配列番号1)と、907r(配列番号2)を用いて、PCRを行う。PCRの増幅条件は、通常行われるプロトコルに従ってよい。
【0032】
得られたPCR産物は、濃度調整をして、制限酵素Hha1(TAKARA製)で切断した後、電気泳動し、DNAシークエンサーなどで蛍光強度を測定し、全体の検出輝度に対する368base付近のフラグメントの検出比率を求める。
【0033】
蛍光色素は、蛍光強度を測定する検出器に対応させたものとし、検出器は1baseの違いを検出できる精度を持つものであれば限定されない。
【0034】
本発明者らは、PCR産物を切断した後、電気泳動して得られたフラグメントの368base付近の検出比率と、ダイオキシン類分解能力に相関関係があり、このフラグメントの検出比率によってダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン類分解能力を評価可能であることを見出した。
【0035】
なお、この検出比率とは、全体のフラグメント検出輝度に対する、368base付近の検出輝度の割合であり、
検出比率=(368baseの検出輝度)/(全検出フラグメントの検出輝度の合計)
の計算式で求めることができる。
【0036】
図1は、後述する実施例および比較例において得られた、T−RFLP法によってダイオキシン類分解コンポストを分析し、求めた368baseの検出比率と、各ダイオキシン類分解コンポストを実際に用いてダイオキシン類汚染物質の浄化処理を行った場合に確認されたダイオキシン類の半減期との関係を示す。
【0037】
なお、この半減期とは、ダイオキシン類分解コンポストを添加する前に測定されたダイオキシン類濃度が、50%(1/2)となるまでに要する期間のことであり、この半減期が短いほど、ダイオキシン類の分解能力が高い。
【0038】
図1から、368base付近のフラグメントの検出比率と、ダイオキシン類の半減期の分布には相関関係が見られ、示された近似式で半減期を比較すると、検出比率が0%のダイオキシン類分解コンポストでは450日以上であるのに対し、0.2%では、200日程度、0.3%では100日程度である。
【0039】
本発明者らの実験に基づく評価方法によると、半減期が200日程度になるとダイオキシン分解能力が高いと判断することができるので、368base付近のフラグメントの検出比率が0.2%以上となるか否かをダイオキシン分解能力の指標とすることができる。
【0040】
この評価法を用いることによって、ダイオキシン類分解コンポストのダイオキシン類分解能力を短時間で(数日のうちに)評価することができるので、ダイオキシン類汚染物質の浄化処理をするにあたっては、ダイオキシン分解能力の高いコンポストを選択することができる。
【0041】
また、分解処理中の試料からDNAを抽出し、ダイオキシン類分解能力を評価すれば、分解処理が順調に行われているかを監視することもできる。
【0042】
評価が低く、能力が落ちていると考えられる場合には、新たに分解コンポストを添加するほか、温度やpHを調節するなどの措置を講じることでダイオキシン類分解能力を向上させるように調整することができ、ダイオキシン類を計画的に分解するための管理が容易にできるようになる。
【実施例】
【0043】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【0044】
実施例1
ダイオキシン類分解コンポストAから、Zhou et al.の方法を改変した方法でDNAを抽出した。
【0045】
まず、遠心分離して得られたダイオキシン類分解コンポストのペレットを15mL容チューブに入れ、100μLの酵母RNAを含むリン酸緩衝液(pH7.5)、1.2mLの50mM酢酸アンモニウム、800μLの0.4%スキムミルクを添加しホモジナイズした。
【0046】
これに粉末リソチーム20mgを添加し、37℃、30分振とう保温した後、300μLの20%SDSを添加し、混合して65℃で30分保温し、続いて3回の凍結融解処理を行い、上清を回収した。
【0047】
上清に500μLの7.5M酢酸アンモニウム溶液を添加し、5分間氷冷した後、遠心し、上清を回収した。これに0.8倍容のイソプロパノールを添加しよく混合して室温で2時間放置した後、遠心し、上清を除いて得られたDNA沈殿物を200μLのTE緩衝液に溶解した。
【0048】
DNA−TE溶解液に等量のPCIを加え、除タンパクし、エタノール沈殿によってDNAを回収した。
【0049】
回収したDNAをさらにRNase処理して精製した。
【0050】
蛍光物質(Texas red)で標識したプライマー27f(配列番号1)と、907r(配列番号2)を用い、PCRは、95℃ 1分、47℃ 1分、72℃ 1.5分を21サイクル行ってPCR産物を得た。
【0051】
PCR産物濃度を測定し、サンプルのPCR産物濃度が150ng/tubeとなるように調整した。
【0052】
調整したサンプルに、制限酵素Hha1(TAKARA製)を加え、37℃で2時間酵素処理を行い、97℃4分間変性処理をして氷冷し、アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を10時間行った。
【0053】
フラグメントの解析には、40baseから900base付近の範囲をフラグリス(日立製作所)を用いて行った。
【0054】
解析の結果から、全体の輝度における368baseの検出比率を算出したところ、0.31%であった。
【0055】
このダイオキシン類コンポストAと、ダイオキシン類による汚染が51ng/gである汚染土壌と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を純度99.5%の窒素ガス(酸素分圧0.5%)の、有機物負荷量を1日あたり5g(含水率80%)、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して150日処理を行なった後、ダイオキシン濃度を測定したところ、16ng/g(汚染物質の重量換算)であった(半減期は79日)。
【0056】
実施例2
ダイオキシン類分解コンポストBについて、実施例1と同様に、368baseの検出比率を求めたところ、0.2%であった。
【0057】
このダイオキシン類分解コンポストBを用いて、実施例1と同様にダイオキシン類による汚染が84ng/gであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を純度99.5%の窒素ガス(酸素分圧0.5%)の、有機物負荷量を1日あたり5g(含水率80%)、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して90日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は39ng/g(汚染物質の重量換算)であった。(半減期は86日)。
【0058】
実施例3
ダイオキシン類分解コンポストCについて、実施例1と同様に、368baseの検出比率を求めたところ、0.2%であった。
【0059】
このダイオキシン類分解コンポストCを用いて、実施例1と同様にダイオキシン類による汚染が83ng/gであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を酸素分圧10%、有機物負荷量を1日あたり50g(含水率80%)、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して90日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は58ng/g(汚染物質の重量換算)であった。(半減期は187日)。
【0060】
実施例4
ダイオキシン類分解コンポストDについて、実施例1と同様に、368baseの検出比率を求めたところ、0.2%であった。
【0061】
このダイオキシン類分解コンポストDを用いて、実施例1と同様にダイオキシン類による汚染が84ng/gであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を酸素分圧20%、有機物負荷量を1日あたり50g(含水率80%)、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して90日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は61ng/g(汚染物質の重量換算)であった。(半減期は223日)。
【0062】
比較例1
ダイオキシン類分解コンポストGについて、実施例1と同様に、368baseの検出比率を求めたところ、0.048%であった。
【0063】
このダイオキシン類分解コンポストGを用いて、実施例1と同様にダイオキシン類による汚染が72ng/gであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を酸素分圧20%、有機物負荷量を1日あたり5g(含水率80%)、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して90日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は59ng/g(汚染物質の重量換算)であった。(半減期は464日)。
【0064】
比較例2
ダイオキシン類分解コンポストHについて、実施例1と同様に、368baseの検出比率を求めたところ、0.055%であった。
【0065】
このダイオキシン類分解コンポストHを用いて、実施例1と同様にダイオキシン類による汚染が69ng/gであるダイオキシン類汚染物質と木チップとを1:1:1で混合し、容器内に入れ、容器内の温度を25℃、気相を酸素分圧20%、有機物負荷量を1日あたり油脂5.6g、1時間に5分程度撹拌を行なうように管理して90日処理したところ、ダイオキシン類の濃度は57ng/g(汚染物質の重量換算)であった。(半減期は578日)。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】368base付近のフラグメントの検出比率と、ダイオキシン類の半減期との関係を示す図。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ダイオキシン類に対して分解能を有するダイオキシン類分解コンポストから抽出されたDNAのPCR産物を制限酵素で切断し、T−RFLP法により解析し、該T−RFLP法によるフラグメント数を求め、ダイオキシン分解能力と前記フラグメント数との関連によりダイオキシン類分解能を評価することを特徴とするT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【請求項2】
制限酵素としてHha1を使用した場合の前記フラグメント数368base付近の検出比率によってダイオキシン分解能力を評価することを特徴とする請求項1記載のT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。
【請求項3】
フラグメント数368base付近の検出比率が0.2%以上の時、ダイオキシン類分解能力が高いと評価することを特徴とする請求項1又は2記載のT−RFLP法によるダイオキシン類分解コンポストによるダイオキシン類分解能力の評価方法。

【図1】
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【公開番号】特開2009−72143(P2009−72143A)
【公開日】平成21年4月9日(2009.4.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−245454(P2007−245454)
【出願日】平成19年9月21日(2007.9.21)
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)平成14年度〜平成18年度、経済産業省、生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発プロジェクト委託事業、産業技術力強化法第19条の適用を受ける特許出願
【出願人】(304027349)国立大学法人豊橋技術科学大学 (391)
【出願人】(000005902)三井造船株式会社 (1,723)
【Fターム(参考)】