ダイズに対するＤ−アミノ酸選択
本発明は、D-アラニンおよび/またはD-セリン選択に基づくダイズ(Glycine max)の形質転換のための改善された方法および手段に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製するための方法:
a. ダイズ細胞または組織に、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を導入するステップ、および
b. 約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体を含む選択培地上で、少なくとも5日間の期間、ステップ(a)のダイズ細胞または組織をインキュベートするステップ、および
c. ステップ(b)のダイズ細胞または組織を再生培地に移し、該DNA構築物を含むダイズ植物を再生および選択するステップ。
【請求項２】
ダイズにおいて活性なプロモーターが双子葉植物種由来のユビキチンプロモーターもしくはアクチン2プロモーター、またはp-ScBVもしくはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターである、請求項１に記載のいずれかの方法。
【請求項３】
植物ユビキチンプロモーターが、であり、共培養後に選択圧が適用される場合、それは以下のステップのうち1以上を含む、請求項２に記載の方法:
a. シュート誘導時に選択を行なわない最初のステップ、
b. シュート誘導期の間に選択を行うステップ、
c. シュート伸長期を通じて選択を行うステップ。
【請求項４】
ダイズにおいて活性なプロモーターが以下からなる群から選択される、請求項２または３に記載の方法:
(a) 配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(b) 配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、
(c) 配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(d) 配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列。
【請求項５】
以下のステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法:
(a) ダイズ実生の初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を提供するステップ、および
(b) トランスジェニックT-DNAを含むリゾビウム科細菌と腋生分裂組織を共培養するステップであって、該トランスジェニックT-DNAが、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を含む、ステップ、
(c) 以下のものを含むシュート誘導および選択培地上に、共培養した腋生分裂組織を移すステップ:
(i) 腋生分裂組織からde novoシュート誘導を誘導するために好適な濃度の少なくとも1種の植物成長因子、および
(ii) 約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体、および
(iii) 場合により、リゾビウム科細菌の増殖を阻害するために好適な1種以上の抗生物質、
および該共培養した腋生分裂組織を、少なくとも5日間の期間、前記培地上で、そこからシュートが誘導されて発達するまで培養し、かつ該シュートを単離するステップ、および
(d) 単離したシュートを発根培地に移し、該シュートを該発根培地上で、該シュートが根を形成するまで培養し、さらにそのように誘導された小植物体を成熟植物に再生させるステップであって、該成熟植物がそのゲノムに挿入された該トランスジェニックT-DNAを含む、ステップ。
【請求項６】
D-セリンを代謝できる酵素が、以下からなる群:
(i) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼ、
(ii) 表Iに示されるD-セリンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行うか、
または、D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を、以下からなる群から選択される形式で提供する、請求項５または６に記載の方法:
(i) 実質的に実生全体によって提供される実生の腋生分裂組織、および
(ii) 初生葉またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結合したままであるように解剖することによって提供される葉の腋生分裂組織、および
(iii) 増殖させた腋生分裂組織。
【請求項８】
ステップ(b)および/または(c)の培地が以下のものを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法:
(a) 約1μM〜約10μM 6-ベンジルアミノプリンの濃度と等価な濃度のサイトカイニンおよび/または
(b) 約0.1μM〜約2μMの範囲のジベレリン酸(GA3)、およびまたは
(c) 少なくとも1種のチオール化合物。
【請求項９】
サイトカイニンが1μM〜10μMの濃度のカイネチンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素が、D-セリンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.18)、D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)、およびD-アラニントランスアミナーゼ(EC 2.6.1.21)からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
D-セリンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 配列番号２によってコードされるE.coli D-セリンアンモニアリアーゼ、および
(ii) 配列番号２によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii) 配列番号１に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 配列番号４または６によってコードされるRhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii) 配列番号４または６によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii) 配列番号３または５に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(i) 約3〜約30 mM D-アラニンを使用すること、
(ii) 約30〜50mM D-セリンを使用すること、および/または
(iii) 約1〜10mM D-セリンを30mM以下のD-アラニンと組み合わせて、好ましくはおよそ5〜7mM D-セリン、例えば7.5mM、および10mM〜20mM D-アラニンを使用すること
によって、脱分化条件下で約3〜4週間にわたり選択を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
dsda遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-セリン。
【請求項１５】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-アラニン。
【請求項１６】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば5〜7日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加え、かつ5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-セリンおよび2mM〜7mM、例えば5 mM D-アラニン。
【請求項１７】
DNA構築物の導入をリゾビウム科細菌媒介形質転換によって媒介する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
リゾビウム科細菌が、安全化されたAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アグロバクテリウム株が、安全化されたAgrobacterium rhizogenes K599株である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含む、ダイズ細胞または植物を作製する方法:
(i) 以下のものを含む第１DNA構築物でダイズ細胞を形質転換するステップ:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アミノ酸オキシダーゼ酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物であって、第１発現カセットには該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している、第１発現構築物、および
(b) 農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセットであって、第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない、第２発現カセット、および
(ii) 植物毒性濃度のD-アラニン、D-セリンまたはその誘導体からなる群から選択される第１化合物で、ステップ(i)の形質転換されたダイズ植物細胞を処理し、該D-アミノ酸オキシダーゼの発現によって該第１化合物に対する耐性を該形質転換植物細胞に付与する該第１DNA構築物をゲノム中に含む植物細胞を選択するステップ、および
(iii) 該形質転換植物細胞のゲノムからの該第１発現カセットの欠失を誘導し、該第１発現カセットを依然として含む植物細胞に対して有毒な濃度のD-イソロイシン、D-バリンおよびその誘導体からなる群から選択される第２化合物で該植物細胞を処理し、それによって、該第２発現カセットを含むが該第１発現カセットを欠いている植物細胞を選択するステップ。
【請求項２１】
(a) プロモーターが請求項２〜４のいずれか１項と同様に規定され、および/または
(b) D-アミノ酸オキシダーゼが請求項１１と同様に規定される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
以下のもの:
(a) ダイズユビキチンプロモーター; 双子葉植物種由来のアクチン2プロモーターおよびp-ScBVまたはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、およびそれに機能しうるように連結されている
(b) D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、かつ、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２３】
以下のもの:
(a) 以下からなる群から選択されるプロモーター:
(i) 配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(ii) 配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、および
(iii) 配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、および
(iv) 配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
ならびに
(b) 表1に記載のD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ダイズ植物または細胞において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含むDNA構築物であって、該プロモーターが該酵素をコードする配列に対して異種性であるDNA構築物を含む、ダイズ植物または細胞。
【請求項２５】
請求項DNA １８〜２０のいずれか１項に記載の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ植物または細胞。
【請求項２６】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のダイズ植物の部分または種子。
【請求項２７】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現構築物を含む第１構築物で形質転換するステップ、および
(b) D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない第２選択マーカー遺伝子を含む第２構築物で形質転換するステップ。
【請求項２８】
第２マーカー遺伝子が、ホスフィノトリシン、ジカンバ、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン-型の除草剤または抗生物質からなる群から選択される少なくとも1つの化合物に対する耐性を付与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
以下を含むダイズ植物:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む第１発現構築物、および
(b) D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物。
【請求項３０】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物で形質転換し、D-セリンで選択するステップ、および
(b) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物で形質転換し、D-アラニンで選択するステップ。
【請求項３１】
以下を含むダイズ植物:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物、および
(b) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物。
【請求項３２】
以下のステップ:
a. 実生を殺菌するステップ;
b. 3〜10日間、好ましくは5〜8日間、例えば7日間、明所で、実生を育てるステップ;
c. 単葉身の葉を有する上胚軸を子葉の長さまたはそれ以上にまで育てるステップ;
d. 上胚軸を0.5cm〜4cmの範囲; 例えば0.7cm以上、1.0cm以上、または2cm以下まで育てるステップ;
e. 頂端分裂組織を含むすべてのあらかじめ形成された葉を取り出すステップ;
f. 数回の切断により第１セットの葉に位置する節を傷つけるステップ;
g. 傷つけられた節を液体培地中で0.1〜1時間、例えば0.5時間にわたり、アグロバクテリウム混合物と共培養するステップ;
h. 固体共培養培地上で暗所で3〜5日間、節をアグロバクテリウムと共培養するステップ;
i. 外植片を、選択のため、18時間 明/6時間 暗のサイクル条件下、70〜100μE/m2sに、上胚軸の上の第１の節で腋生分裂組織が成長するまで置くステップ;
j. 形質転換前で共培養の2週間後までに形成されたシュートを取り出し、場合により、この期間中に外植片を切断して、より小さい切片にするステップ;
k. 共培養の2〜4週間後に外植片をシュート原基伸長培地に移し、シュートが伸長するまで、死滅組織を除去した後に選択物質を含む新鮮培地に2〜3週間毎に外植片を移すステップ;
l. 外植片からシュート3cm以上を取り出し、根が形成され始めるまで1週間にわたり、発根誘導培地に入れるステップ;
m. 発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、発根したシュートを温室に移すステップ
のうちの1以上、例えばすべてのステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項の方法。
【請求項３３】
トランスジェニックダイズ植物細胞、トランスジェニックダイズ植物組織、トランスジェニックダイズ植物器官またはトランスジェニックダイズ植物体またはその部分の選択、再生、育成、培養または維持のための組成物であって、トランスジェニックダイズ植物細胞、ダイズ植物組織、ダイズ植物器官またはダイズ植物体またはその部分の選択を可能にするD-アラニン、D-セリン、またはその誘導体の有効量、およびトランスジェニックダイズ生物、トランスジェニックダイズ細胞、トランスジェニック細胞培養物、トランスジェニックダイズ植物体および/またはその部分を含む、組成物。
【請求項３４】
第１セットの葉に位置する節に由来する1個以上の胚形成カルス、およびおよそ5〜10mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む細胞培養物。
【請求項３５】
ダイズ標的組織および、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を含む選択培地。
【請求項１】
以下のステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製するための方法:
a. ダイズ細胞または組織に、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を導入するステップ、および
b. 約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体を含む選択培地上で、少なくとも5日間の期間、ステップ(a)のダイズ細胞または組織をインキュベートするステップ、および
c. ステップ(b)のダイズ細胞または組織を再生培地に移し、該DNA構築物を含むダイズ植物を再生および選択するステップ。
【請求項２】
ダイズにおいて活性なプロモーターが双子葉植物種由来のユビキチンプロモーターもしくはアクチン2プロモーター、またはp-ScBVもしくはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターである、請求項１に記載のいずれかの方法。
【請求項３】
植物ユビキチンプロモーターが、であり、共培養後に選択圧が適用される場合、それは以下のステップのうち1以上を含む、請求項２に記載の方法:
a. シュート誘導時に選択を行なわない最初のステップ、
b. シュート誘導期の間に選択を行うステップ、
c. シュート伸長期を通じて選択を行うステップ。
【請求項４】
ダイズにおいて活性なプロモーターが以下からなる群から選択される、請求項２または３に記載の方法:
(a) 配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(b) 配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、
(c) 配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
(d) 配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列。
【請求項５】
以下のステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法:
(a) ダイズ実生の初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を提供するステップ、および
(b) トランスジェニックT-DNAを含むリゾビウム科細菌と腋生分裂組織を共培養するステップであって、該トランスジェニックT-DNAが、該ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物を含むDNA構築物を含む、ステップ、
(c) 以下のものを含むシュート誘導および選択培地上に、共培養した腋生分裂組織を移すステップ:
(i) 腋生分裂組織からde novoシュート誘導を誘導するために好適な濃度の少なくとも1種の植物成長因子、および
(ii) 約3 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンおよび/またはその誘導体、および
(iii) 場合により、リゾビウム科細菌の増殖を阻害するために好適な1種以上の抗生物質、
および該共培養した腋生分裂組織を、少なくとも5日間の期間、前記培地上で、そこからシュートが誘導されて発達するまで培養し、かつ該シュートを単離するステップ、および
(d) 単離したシュートを発根培地に移し、該シュートを該発根培地上で、該シュートが根を形成するまで培養し、さらにそのように誘導された小植物体を成熟植物に再生させるステップであって、該成熟植物がそのゲノムに挿入された該トランスジェニックT-DNAを含む、ステップ。
【請求項６】
D-セリンを代謝できる酵素が、以下からなる群:
(i) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼ、
(ii) 表Iに示されるD-セリンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv) 表1に示されるD-セリンアンモニアリアーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行うか、
または、D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、
(iii) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼの核酸配列に対して少なくとも80％のコード化核酸配列における同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iv) 表1に示されるD-アミノ酸オキシダーゼをコードする配列の相補体にハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、3 mM〜100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
初生葉節またはより高次の葉節の腋生分裂組織を、以下からなる群から選択される形式で提供する、請求項５または６に記載の方法:
(i) 実質的に実生全体によって提供される実生の腋生分裂組織、および
(ii) 初生葉またはより高次の葉を、腋生分裂組織が葉の葉柄に結合したままであるように解剖することによって提供される葉の腋生分裂組織、および
(iii) 増殖させた腋生分裂組織。
【請求項８】
ステップ(b)および/または(c)の培地が以下のものを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法:
(a) 約1μM〜約10μM 6-ベンジルアミノプリンの濃度と等価な濃度のサイトカイニンおよび/または
(b) 約0.1μM〜約2μMの範囲のジベレリン酸(GA3)、およびまたは
(c) 少なくとも1種のチオール化合物。
【請求項９】
サイトカイニンが1μM〜10μMの濃度のカイネチンである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
D-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素が、D-セリンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.18)、D-アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.3)、およびD-アラニントランスアミナーゼ(EC 2.6.1.21)からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
D-セリンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 配列番号２によってコードされるE.coli D-セリンアンモニアリアーゼ、および
(ii) 配列番号２によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii) 配列番号１に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの濃度のD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
D-セリンおよびD-アラニンを代謝できる酵素が以下からなる群:
(i) 配列番号４または６によってコードされるRhodotorula gracilis D-アミノ酸オキシダーゼ、および
(ii) 配列番号４または６によってコードされる配列に対して少なくとも60％の同一性および同じ酵素活性を有する酵素、および
(iii) 配列番号３または５に記載の配列の相補体に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズ可能な核酸配列によってコードされる酵素、
から選択され、かつ、約0.5 mM〜約100 mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む培地上で選択を行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(i) 約3〜約30 mM D-アラニンを使用すること、
(ii) 約30〜50mM D-セリンを使用すること、および/または
(iii) 約1〜10mM D-セリンを30mM以下のD-アラニンと組み合わせて、好ましくはおよそ5〜7mM D-セリン、例えば7.5mM、および10mM〜20mM D-アラニンを使用すること
によって、脱分化条件下で約3〜4週間にわたり選択を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
dsda遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-セリン。
【請求項１５】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導で5〜10日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM D-アラニン。
【請求項１６】
dao1遺伝子を用いる形質転換後の選択が以下のステップを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法:
a. 選択を伴わないシュート誘導での5〜10日間、例えば5〜7日間、
b. 5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-アラニンを加え、かつ5mM〜10mM、例えば7.5 mM D-セリンを加えたシュート誘導培地上で2〜4週間、例えば3週間、
c. シュート伸長期を通じて2mM〜7mM、例えば5 mM D-セリンおよび2mM〜7mM、例えば5 mM D-アラニン。
【請求項１７】
DNA構築物の導入をリゾビウム科細菌媒介形質転換によって媒介する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
リゾビウム科細菌が、安全化されたAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
アグロバクテリウム株が、安全化されたAgrobacterium rhizogenes K599株である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップを含む、ダイズ細胞または植物を作製する方法:
(i) 以下のものを含む第１DNA構築物でダイズ細胞を形質転換するステップ:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アミノ酸オキシダーゼ酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの第１発現構築物であって、第１発現カセットには該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする配列に隣接している、第１発現構築物、および
(b) 農学的に有益な形質を該植物に付与するために好適な少なくとも1つの第２発現カセットであって、第２発現カセットは該第１発現カセットの特異的欠失を可能にする該配列間に位置しない、第２発現カセット、および
(ii) 植物毒性濃度のD-アラニン、D-セリンまたはその誘導体からなる群から選択される第１化合物で、ステップ(i)の形質転換されたダイズ植物細胞を処理し、該D-アミノ酸オキシダーゼの発現によって該第１化合物に対する耐性を該形質転換植物細胞に付与する該第１DNA構築物をゲノム中に含む植物細胞を選択するステップ、および
(iii) 該形質転換植物細胞のゲノムからの該第１発現カセットの欠失を誘導し、該第１発現カセットを依然として含む植物細胞に対して有毒な濃度のD-イソロイシン、D-バリンおよびその誘導体からなる群から選択される第２化合物で該植物細胞を処理し、それによって、該第２発現カセットを含むが該第１発現カセットを欠いている植物細胞を選択するステップ。
【請求項２１】
(a) プロモーターが請求項２〜４のいずれか１項と同様に規定され、および/または
(b) D-アミノ酸オキシダーゼが請求項１１と同様に規定される、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
以下のもの:
(a) ダイズユビキチンプロモーター; 双子葉植物種由来のアクチン2プロモーターおよびp-ScBVまたはp-ScBV-iSuc UDPプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、およびそれに機能しうるように連結されている
(b) D-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、かつ、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２３】
以下のもの:
(a) 以下からなる群から選択されるプロモーター:
(i) 配列番号７または８に記載の配列を含む配列、および
(ii) 配列番号７または８に記載の配列の少なくとも50個連続した塩基対の断片を少なくとも1つ含み、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列、および
(iii) 配列番号７または８に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有し、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、および
(iv) 配列番号７または８に記載の配列に対して、30％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDS中で37℃でのハイブリダイゼーション、および2X SSC中で50℃での洗浄に等価なまたは等しい条件下でハイブリダイズし、かつダイズにおいてプロモーター活性を有する配列を含む配列、
ならびに
(b) 表1に記載のD-アラニンおよび/またはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列、
を含み、該プロモーターは該核酸配列に対して異種性である、異種ヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ダイズ植物または細胞において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含むDNA構築物であって、該プロモーターが該酵素をコードする配列に対して異種性であるDNA構築物を含む、ダイズ植物または細胞。
【請求項２５】
請求項DNA １８〜２０のいずれか１項に記載の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ植物または細胞。
【請求項２６】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のダイズ植物の部分または種子。
【請求項２７】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現構築物を含む第１構築物で形質転換するステップ、および
(b) D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない第２選択マーカー遺伝子を含む第２構築物で形質転換するステップ。
【請求項２８】
第２マーカー遺伝子が、ホスフィノトリシン、ジカンバ、グリフォセート、スルホニル尿素-およびイミダゾリノン-型の除草剤または抗生物質からなる群から選択される少なくとも1つの化合物に対する耐性を付与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
以下を含むダイズ植物:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されているD-アラニンまたはD-セリンを代謝できる酵素をコードする核酸配列を含む第１発現構築物、および
(b) D-アラニンまたはD-セリンに対する耐性を付与しない選択マーカー遺伝子に関する第２発現構築物。
【請求項３０】
以下のステップを含む、少なくとも2つのDNA構築物をダイズ植物へと連続して形質転換するための方法:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物で形質転換し、D-セリンで選択するステップ、および
(b) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物で形質転換し、D-アラニンで選択するステップ。
【請求項３１】
以下を含むダイズ植物:
(a) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dsdA酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第１構築物、および
(b) ダイズ植物において活性なプロモーターおよびそれに機能しうるように連結されている、dao酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む第２構築物。
【請求項３２】
以下のステップ:
a. 実生を殺菌するステップ;
b. 3〜10日間、好ましくは5〜8日間、例えば7日間、明所で、実生を育てるステップ;
c. 単葉身の葉を有する上胚軸を子葉の長さまたはそれ以上にまで育てるステップ;
d. 上胚軸を0.5cm〜4cmの範囲; 例えば0.7cm以上、1.0cm以上、または2cm以下まで育てるステップ;
e. 頂端分裂組織を含むすべてのあらかじめ形成された葉を取り出すステップ;
f. 数回の切断により第１セットの葉に位置する節を傷つけるステップ;
g. 傷つけられた節を液体培地中で0.1〜1時間、例えば0.5時間にわたり、アグロバクテリウム混合物と共培養するステップ;
h. 固体共培養培地上で暗所で3〜5日間、節をアグロバクテリウムと共培養するステップ;
i. 外植片を、選択のため、18時間 明/6時間 暗のサイクル条件下、70〜100μE/m2sに、上胚軸の上の第１の節で腋生分裂組織が成長するまで置くステップ;
j. 形質転換前で共培養の2週間後までに形成されたシュートを取り出し、場合により、この期間中に外植片を切断して、より小さい切片にするステップ;
k. 共培養の2〜4週間後に外植片をシュート原基伸長培地に移し、シュートが伸長するまで、死滅組織を除去した後に選択物質を含む新鮮培地に2〜3週間毎に外植片を移すステップ;
l. 外植片からシュート3cm以上を取り出し、根が形成され始めるまで1週間にわたり、発根誘導培地に入れるステップ;
m. 発根したシュートを土壌に移し、育成チャンバー中で2〜3週間ハードニング処理した後に、発根したシュートを温室に移すステップ
のうちの1以上、例えばすべてのステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項の方法。
【請求項３３】
トランスジェニックダイズ植物細胞、トランスジェニックダイズ植物組織、トランスジェニックダイズ植物器官またはトランスジェニックダイズ植物体またはその部分の選択、再生、育成、培養または維持のための組成物であって、トランスジェニックダイズ植物細胞、ダイズ植物組織、ダイズ植物器官またはダイズ植物体またはその部分の選択を可能にするD-アラニン、D-セリン、またはその誘導体の有効量、およびトランスジェニックダイズ生物、トランスジェニックダイズ細胞、トランスジェニック細胞培養物、トランスジェニックダイズ植物体および/またはその部分を含む、組成物。
【請求項３４】
第１セットの葉に位置する節に由来する1個以上の胚形成カルス、およびおよそ5〜10mMの総濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンを含む細胞培養物。
【請求項３５】
ダイズ標的組織および、植物毒性濃度のD-アラニンおよび/またはD-セリンまたはその誘導体を含む選択培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２９８６３（Ｐ２００９−５２９８６３Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８８３２（Ｐ２００８−５５８８３２）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２５１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０７５１６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０１３８３７５０）ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２５１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０７５１６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０１３８３７５０）ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー (17)
【Ｆターム（参考）】
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