ダサチニブの耐性の判別とその克服方法
【課題】ダサチニブに対して治療抵抗性を示すＣＭＬ患者および今後が新たな治療抵抗性が生ずるＣＭＬ患者に提供する、より優れたＣＭＬの治療方法の確立。
【解決手段】フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサニチブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供する。
【解決手段】フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサニチブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサチニブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
白血病とは血液中に異常な白血球が無制限に増加する疾患であり、血液の悪性腫瘍である。白血病は、病気の進行する速度により急性と慢性、異常な白血球の種類により骨髄性（顆粒球系）とリンパ性に分類することができる。この白血病患者、特に慢性骨髄性白血病（以下「ＣＭＬ」と称することもある）患者のほとんどはフィラデルフィア染色体（以下「Ｐｈ」と称することもある）と呼ばれる染色体異常を有する。このフィラデルフィア染色体は、途中で切れた２２番染色体と結合した９番染色体断片から構成され、この遺伝子から生成されるＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質によりチロシンキナーゼ活性が上昇して慢性骨髄性白血病における細胞の無限増殖が引き起こされると考えられている。
【０００３】
選択的なＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））の登場は、ＣＭＬの治療に大きな変化をもたらし、欧米を中心として行われたインターフェロンアルファとの大規模比較試験の結果から、第一選択薬として位置付けられるに至った。メシル酸イマチニブは、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞特異的に増殖を阻害する。
【０００４】
しかし、慢性骨髄性白血病の急性期の患者あるいはＰｈ陽性急性リンパ性白血病患者では、ほとんどの例で短期間のうちにメシル酸イマチニブに対する治療抵抗性が出現するという問題点が指摘されている。その原因としては、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の突然変異によりＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の構造に変化を来し、メシル酸イマチニブが結合できなくなるためと考えられている（非特許文献１）。他にもＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の増幅、遺伝子増幅を伴わないタンパク質の増加、多剤耐性タンパク質の発現といった耐性機序が解明されてきている（非特許文献２〜６）。
【０００５】
このようにメシル酸イマチニブに対する治療抵抗性の発現には、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の変異によるイマチニブ結合部位の変化が原因と考えられ、また癌遺伝子ＳＲＣの作り出す産物と酷似するタンパクの総称であるＳＲＣファミリーキナーゼの活性化などの複数の薬剤耐性機序が原因と考えられている。従って、こうした薬剤耐性を克服した更に効果的なＣＭＬに対する治療薬が医療上必要とされている。
【０００６】
こうした中で、ダサチニブ（dasatinib、ＢＭＳ−３５４８２５）は、以下の構造を有し、メシル酸イマチニブと異なる部位に結合してＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼに阻害作用を示し、さらにＳＲＣチロシンキナーゼの阻害作用も有することから、Ｐｈ陽性のＣＭＬに対する有用性が期待できると考え、世界的に開発が進められている（特許文献１）。
【化１】
【特許文献１】米国特許公報第６，５９６，７４６Ｂ１号
【非特許文献１】陣内逸郎 ４．慢性骨髄性白血病に対するイマチニブ療法 血液フロンティア 2004；14：43-49
【非特許文献２】Druker BJ et al., N Engl J Med 2001; 344: 1038-1042.
【非特許文献３】O'Brien SG et al., N Engl J Med 2003; 348: 994-1004.
【非特許文献４】Mahon FX et al., Blood 2000; 96: 1070-1079.
【非特許文献５】Weisberg E et al., Blood 2000; 95: 3498-3505.
【非特許文献６】le Coutre P et al., Blood 2000; 95: 1758-1766.
【非特許文献７】CANCER CELL; JULY 2005, p 5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、メシル酸イマチニブの場合と同様に、ダサチニブに対して治療抵抗性を示すＣＭＬ患者の出現が懸念されており、また今後更に新たな治療抵抗性が生ずることも考えられ、更により優れたＣＭＬの治療方法を確立することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ダサチニブ耐性ＣＭＬ患者のＰｈ染色体陽性細胞中にアポトーシス関連バイオマーカーがアップレギュレートされていることを見出した。
かかる知見に基づき、上記の課題を解決するため、本発明は、以下の工程
（１）フィラデルフィア染色体陽性の（慢性）骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、及び
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者のダサチニブによる治療に対する適応性を判定する方法を提供する。
ここで採取された生体試料としては、例えば血液、骨髄液などが挙げられる。
ここでコントロールとは、Ｐｈ陽性細胞であってダサチニブ非耐性のもの、Ｐｈ陰性細胞等のいずれでもよい。Ｐｈ陰性の対応細胞の起源は、Ｐｈ陰性であればどのような人でも良く、例えばＰｈ陰性白血病患者や健常人が含まれる。Ｐｈ陽性骨髄性白血病患者であって、ダサチニブ投与前の白血病細胞が望ましい。
ここでアポトーシス関連バイオマーカーとは、例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せなどが挙げられる。
そしてそのバイオマーカーの量を測定する工程としては、例えばイムノブロッティング法があり、具体的には以下の実施例にその例が挙げられている。
またここでアポトーシス関連バイオマーカーの測定をコントロールにおける測定値と比較して判断する基準としては、例えば、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下ならダサチニブ治療に適応すると判断し、また３．０倍以上、好ましくは５．０倍以上なら、非適応と判断することができる。
【０００９】
また、本発明は、以下の工程
（１）ダサチニブにより治療中のフィラデルフィア染色体陽性の（慢性）骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者におけるダサチニブに対する耐性の発現を判定する方法を提供する。
ここで採取された生体試料としては、例えば血液、骨髄液などが挙げられる。
ここでコントロールとは、Ｐｈ陽性細胞であってダサチニブ非耐性のもの、Ｐｈ陰性細胞等のいずれでもよい。Ｐｈ陰性の対応細胞の起源は、Ｐｈ陰性であればどのような人でも良く、例えばＰｈ陰性白血病患者や健常人が含まれる。Ｐｈ陽性骨髄性白血病患者であって、ダサチニブ投与前の白血病細胞が望ましい。
ここでアポトーシス関連バイオマーカーとは、例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せなどが挙げられる。
そしてそのバイオマーカーの量を測定する工程としては、例えばイムノブロッティング法があり、具体的には以下の実施例にその例が挙げられている。
またここでアポトーシス関連バイオマーカーの測定をコントロールにおける測定値と比較して判断する基準としては、例えば、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下ならダサチニブ治療に適応すると判断し、また３．０倍以上、好ましくは５．０倍以上なら、非適応と判断することができる。
【００１０】
更に、本発明は、ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞をダサチニブ及び候補薬物を含有する培地で培養し、該細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が培養前に比較して培養後で低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいて、ダサチニブとの併用薬物を選択する方法を提供する。
ここで、ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞は、例えば、ダサチニブで加療中の骨髄性白血病患者由来のフィラデルフィア染色体陽性細胞、またはＢＣＲ−ＡＢＬをトランスフェクトされたダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞が挙げられる。
【００１１】
また、本発明は、以下の工程
（１）ヒト以外の哺乳動物にダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性骨髄性白血病を誘発し、
（２）該動物から単離した白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定し、
（３）ダサチニブと候補薬物とを該動物に投与して飼育した後白血病細胞中のアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が上記（２）の測定値に比較して低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいてダサチニブとの併用薬物を選択する方法を提供する。
上記で示したダサチニブとの併用薬物を選択する方法においては、ダサチニブと候補薬物の存在下での培養または飼育前の測定値が培養または飼育後の測定値と比較して判断する基準としては、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下なら該候補薬物がダサチニブとの併用薬物として有用であると判断する。
その他各用語は、上記の各方法での定義と同義である。
または候補薬物とダサチニブの両者を含有する培地、ダサチニブのみを含有する培地で、フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞を並行して培養し、双方の培地中のバイオマーカーを測定し、候補薬物を含有する培地中のバイオマーカー値の減少又はアポトーシスを観察することによっても判定できる。
また、モデル動物を用いてインビボで行うこともできる
更に本発明では、上記の方法で得られた併用薬物を、同時または順次に投与して、ダサチニブとの併用治療に用いる医薬組成物を提供する。
該併用薬物としては、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼの阻害剤を挙げることができるが、これらに限定されない。一例としてＡＢＴ−７３７が挙げられる。
ここで用いるＡＢＴ−７３７とは、以下のような構造を有し、Ｂｃｌ−２の阻害剤として様々な癌に効果が期待できる化合物である（非特許文献７）。
【化２】
【００１２】
また、本発明は、上記の各種方法を行うためのキットであって、
（１）ダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞
（２）培養装置
（３）バイオマーカーの抗体
（４）正常値を示す対照表
を含むキットを提供する。
さらに上記キットに使用説明書を含むキットも提供する。
ここで各用語は、上記の各方法での定義と同義である。
【００１３】
また、本発明は、上記の各種方法およびキットに有用な、ダサチニブ耐性を発症している急性リンパ性白血病患者または慢性骨髄性白血病患者由来または株化細胞を起源とするダサチニブ耐性細胞株を提供する。該ダサチニブ耐性細胞株の調製方法としては、例えば以下の実施例の記載が挙げられる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサチニブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明（スクリーニング方法）の対象とする疾患としては、フィラデルフィア染色体を有する患者が発症する白血病、具体的には、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病が挙げられる。
また、本発明はヒトの疾患に適用される他、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物にも適用される。
以下、本発明を実施するにあたり、具体的に説明する。
なお、本発明の耐性株化細胞の作製に用いることができる株化細胞としては、ＴＦ−１、またはＫ５６２などが挙げられる。
白血病に効果が期待できるか否かの検討に一般的に用いられる２種類のヒト白血病株化細胞のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４３）およびＢＤＲ−ＡＢＬ遺伝子をトランスフェクトしたＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２００３。以下、ＴＦ１ ＢＣＲＡＢＬ細胞と称する）を、イマチニブまたはダサチニブを漸増的に増加させながら培養することによりイマチニブ耐性またはダサチニブ耐性を発現した細胞株が提供される。具体的には、Ｋ５６２細胞およびＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞をイマチニブ０.１μＭ存在下、またはダサチニブ０.５ｎＭ存在下で２週間培養し、次いでイマチニブまたはダサチニブの濃度を漸増させた。最終的に、イマチニブ耐性Ｋ５６２細胞およびイマチニブ耐性ＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞はイマチニブ１０μＭ存在下で増殖することができた。また、ダサチニブ耐性Ｋ５６２細胞およびダサチニブ耐性ＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞はダサチニブ１０ｎＭ存在下で増殖することができた。これらの耐性細胞株をＰＣＲにより分析して、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインに点変異が生じておらず、耐性発現がＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼの変異に由来するものではないことを確認した。この株はダサチニブ耐性を発現する白血病患者の治療に用い得る化合物（ダサチニブとの併用化合物を含む）を開発する際に、一次スクリーニングの道具として利用することができる。
また、これら細胞を分析すると、ダサチニブ耐性を発現している細胞ではＢｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼの発現がアップレギュレートされていることが確認された。この知見をもとに、本発明者らはイマチニブ耐性を発現した白血病患者、または発現する可能性のある患者をＢｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼをバイオマーカーとして用いて判別して、不要な薬剤投与を省きうることを見出した。また、ダサチニブ耐性患者とイマチニブ耐性患者とではＬｙｎキナーゼの発現に差異があるので、いずれの薬剤が有効または無効であるかも判別することができる。
さらに、これらの細胞は、これら化合物に対する耐性を耐性細胞から消失させうる化合物のスクリーニングに使用することもできる。本発明において本発明者らはダサチニブとＡＢＴ−７３７と併用すると細胞の生存率が減少し、アポトーシスが増加することを見出した。
【００１６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ダサチニブ耐性細胞株の作製
ダサチニブ耐性細胞株を以下の手順により作製した。本実施例では耐性株の親株として、Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を用いた。Ｋ５６２細胞はヒト白血病細胞株であり、文献（Nakajima et al., Mol Cancer Ther., 2, 219-224）の記載に従い、ＴＦ−１細胞にｐ２１０ ＢＣＲ−ＡＢＬ (Ｂ２Ａ２) ｃＤＮＡを有するｐＧＤ２１０ベクターをトランスフェクトしてＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を作製した。これら細胞株を培養する基本培地には１０％ウシ胎仔血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)を補充したＲＰＭＩ１６４０(Life Technology, Inc.)を用いた。
Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞をイマチニブ（Novartis Inc. Basel, Switzerland製）０.１μＭまたはダサニチブ（Bristol-Myers Squibb, New York, NY製）０.５ｎＭと共に２週間培養し、次いでイマチニブまたはダサチニブの濃度を段階的に増加させることにより、イマチニブまたはダサチニブ耐性株を作製した。ダサチニブについては、０．５ｎｍｏｌから開始し、各濃度で２週間培養し、生存している細胞に対し、１．２５倍から２倍に濃度を段階的に上げ、ＴＦ−１については、２０ｎｍｏｌまで、Ｋ−５６２については２００ｎｍｏｌまで上げ、生存している細胞を耐性と定義した。同様にイマチニブについても０．５μｍｏｌから開始し、１０μｍｏｌで生存している細胞を耐性と定義した。細胞の薬剤耐性は、ＦＩＴＣ結合型ＡＰＯ２.７モノクローナル抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにかけることによりアポトーシス細胞の数を測定して決定した（図１Ａ、１Ｂ）。最終的に、それぞれ、イマチニブ１０μＭ存在下、およびダサチニブ２０ｎＭ（Ｋ５６２の場合）または２００ｎＭ（ＴＦ−１の場合）存在下で増殖し得る細胞を作製することができた。
なお、これら耐性株のＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン配列をＰＣＲ分析により確認すると点変異は生じていなかった。従って、これら細胞に生じた耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質をコードする配列を保持したままで耐性を獲得している。
以下、イマチニブ耐性のＫ５６２細胞をＫ５６２−ＩＭＲ細胞、ＴＦ−１細胞をＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＩＭＲ細胞、ならびにダサチニブ耐性のＫ５６２細胞をＫ５６２−ＢＭＳＲ細胞、ＴＦ−１細胞をＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞と称する。
【実施例２】
【００１８】
バイオマーカーによるダサチニブ耐性の判別
上記耐性細胞を用いて、イマチニブ耐性またはダサチニブ耐性の細胞を用いて、転写レベルが変化している遺伝子を同定した。この実験データは、３回の独立したマイクロアレイハイブリダイゼーションから遺伝子発現データをイムノブロッティングすることにより得た。実験に用いたＡＢＬ抗体(24-11)、ＳＨＰ-２抗体 (C-18)、Ｂｃｌ−２抗体(C-2)およびＭｃｌ−１抗体(S-19)は、Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)から購入した。Ｌｙｎ抗体、リン酸化Ｌｙｎ抗体 (Tyr507)、Ｂｃｌ−ＸＬ抗体、カスパーゼ−３抗体、開列型カスパーゼ−３抗体、ＰＡＲＰ抗体、および開裂型ＰＡＲＰ (Asp214)はCell Signaling technology (Beverly, MA)から入手した。
我々は遺伝子発現変化の信頼限界として、１.５倍をカットオフ値として用いた。イムノブロッティングは文献（Tauchi et al., J Biol Chem, 269, 15381-15387）の記載に従い行った。
耐性細胞を、それぞれ、イマチニブ１０μＭ存在下、およびダサチニブ２０ｎＭ（Ｋ５６２の場合）または２００ｎＭ（ＴＦ−１の場合）存在下で培養し、イムノブロッティングを行うと、いずれも親細胞と比較してＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の発現が増加していた（図２Ａ）。ＳＨＰ−２は発現量がイマチニブあるいはダサチニブ耐性の有無により変化しないので、各レーンにアプライしたタンパク質量が一定であることを示している。さらに、ダサチニブ耐性株においてＬｙｎキナーゼのリン酸化が顕著に増加しており、Ｌｙｎ発現レベルも増加していた（図２Ｂ）。他方、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２および生存率の発現は顕著な変化は観察されなかったが、Ｂｃｌ−ＸＬの発現が増加していた（図２Ｂ）。これらの結果より、ダサチニブ耐性表現型の獲得は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質、ＬｙｎキナーゼおよびＢｃｌ−ＸＬの顕著な増加と関連している。
【実施例３】
【００１９】
薬物の併用によるダサチニブ耐性の克服
従来、Ｌｙｎ活性型ＣＭＬ細胞におけるＢcl-2発現の増加がイマチニブ抵抗性の表現型の原因であることが示されており(Dai Y, Rahmani M, Corey SJ, Dent P, Grant S. (2004) J Biol Chem., 279, 34227-34239)、本発明者らはBcl-2をアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてダウンレギュレートすることによりBCR-ABL発現細胞をイマチニブに対して感受性にし得ることを見出していた（T. Tauchi et al., Clinical Cancer Research Vol. 9, 2003, 4267-4273）。そこで、我々は、BCR-ABL形質転換細胞におけるBcl-2ファミリータンパク質のインヒビターであるABT-737の活性を調べ、さらには、ダサチニブとの併用によるダサチニブ耐性克服の可能性について試験した。
１）ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞をＡＢＴ−７３７（Abbott Laboratories, Abott Park, IL製)およびイマチニブまたはダサチニブと共に７２時間培養した後、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を測定した。ＡＢＴ−７３７を単独で適用した場合は細胞に対する毒性は最小限であるが、イマチニブと併用すると劇的にアポトーシス細胞数が増加した（図３Ａ、３Ｂ）。ダサチニブをＡＢＴ−７３７と併用すると、アポトーシス細胞は５ｎＭより高濃度のダサチニブ濃度の場合と同レベルにまで達した（図３Ｃ、Ｄ）。この実験条件をイムノブロッティングで分析すると、１μＭ ＡＢＴ−７３７および１００ｎＭダサチニブを併用すると、Ｋ５６２細胞内でカスパーゼ−３とＰＡＲＰの切断物が増加していた（図３Ｅ）。カスパーゼ３の開裂による活性化は、アポトーシスの過程において主要な役割を果たしており、特にカスパーゼ３は細胞死の最終段階で作用しＰＲＡＰを開裂し、細胞死に至らしめるとともに、カスパーゼ２、６、８、１０を活性化し、更にフィードバックにより上流のカスパーゼ９を増量させる。これら知見を合わせて考慮すると、ＡＢＴ−７３７は、その細胞毒性が最小となるような濃度でイマチニブまたはダサチニブのいずれかと併用して、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞におけるアポトーシスを効率よく誘発することができる。
２）Ｂｃｌ−ＸＬがダサチニブ耐性ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞におけるＡＢＬキナーゼインヒビター反応の調節における役割を機能的に調べるために、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を異なる濃度のＡＢＴ−７３７およびイマチニブまたはダサチニブと共に７２時間培養し、アポトーシスについて試験した。ダサチニブ１００ｎＭまたはイマチニブ１０ｎＭを用いて処理すると毒性は最小限に抑えられるが、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞にアポトーシスを誘発することはできなかった。しかし、ＡＢＴ−７３７、およびイマチニブまたはダサチニブを同時に用いて処理すると、アポトーシス細胞の数は顕著に上昇した（図４Ａ、４Ｂ）。これらの結果は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害がＬｙｎキナーゼ活性化エレメントによるダサチニブ耐性を克服する原因である可能性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明により、ダサチニブに対して治療抵抗性を示すＣＭＬ患者に、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、およびそのような患者の処置に有用なダサニチブ併用組成物が提供され、また
その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞も提供され、ＣＭＬ患者に対して適切な処置をすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】１Ａは、イマチニブまたはダサチニブの添加によりアポトーシスを生じたＴＦ−１細胞、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＩＭＲ細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞の数を示すグラフである。
【図１Ｂ】１Ｂは、イマチニブまたはダサチニブの添加によりアポトーシスを生じたＫ５６２、Ｋ５６２−ＩＭＲ、Ｋ５６２−ＢＭＳＲ細胞の数を示すグラフである。
【図２Ａ】２Ａは記載の細胞株由来の細胞溶解物を、ＡＢＬモノクローナル抗体（上段）およびＳＨＰ−２抗体（下段）でイムノブロットした結果を示す。
【図２Ｂ】２Ｂは記載の細胞株から作製した細胞溶解物を抗Ｌｙｎ抗体（上段パネル）、抗リン酸化Ｌｙｎ抗体（中段）または抗Ｂｃｌ−ＸＬ抗体（下段）でイムノブロットした結果を示す。
【図３Ａ】イマチニブまたはダサチニブとＡＢＴ−７３７との併用による、Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞におけるアポトーシスの誘導およびカスパーゼ活性化を示す。３Ａは、Ｋ５６２細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｂ】３Ｂは、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｃ】３Ｃは、Ｋ５６２細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｄ】３Ｄは、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｅ】３Ｅは、ＡＢＴ−７３７１μＭおよびダサチニブ１００ｎＭと共にＫ５６２細胞を培養した後の、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの開裂のイムノブロットによる評価を示す。
【図４Ａ】ＡＢＴ−７３７によりＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞のＡＢＬキナーゼインヒビター耐性が克服されることを示すグラフである。４ＡはＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図４Ｂ】４ＢはＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサチニブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
白血病とは血液中に異常な白血球が無制限に増加する疾患であり、血液の悪性腫瘍である。白血病は、病気の進行する速度により急性と慢性、異常な白血球の種類により骨髄性（顆粒球系）とリンパ性に分類することができる。この白血病患者、特に慢性骨髄性白血病（以下「ＣＭＬ」と称することもある）患者のほとんどはフィラデルフィア染色体（以下「Ｐｈ」と称することもある）と呼ばれる染色体異常を有する。このフィラデルフィア染色体は、途中で切れた２２番染色体と結合した９番染色体断片から構成され、この遺伝子から生成されるＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質によりチロシンキナーゼ活性が上昇して慢性骨髄性白血病における細胞の無限増殖が引き起こされると考えられている。
【０００３】
選択的なＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））の登場は、ＣＭＬの治療に大きな変化をもたらし、欧米を中心として行われたインターフェロンアルファとの大規模比較試験の結果から、第一選択薬として位置付けられるに至った。メシル酸イマチニブは、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞特異的に増殖を阻害する。
【０００４】
しかし、慢性骨髄性白血病の急性期の患者あるいはＰｈ陽性急性リンパ性白血病患者では、ほとんどの例で短期間のうちにメシル酸イマチニブに対する治療抵抗性が出現するという問題点が指摘されている。その原因としては、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の突然変異によりＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の構造に変化を来し、メシル酸イマチニブが結合できなくなるためと考えられている（非特許文献１）。他にもＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の増幅、遺伝子増幅を伴わないタンパク質の増加、多剤耐性タンパク質の発現といった耐性機序が解明されてきている（非特許文献２〜６）。
【０００５】
このようにメシル酸イマチニブに対する治療抵抗性の発現には、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の変異によるイマチニブ結合部位の変化が原因と考えられ、また癌遺伝子ＳＲＣの作り出す産物と酷似するタンパクの総称であるＳＲＣファミリーキナーゼの活性化などの複数の薬剤耐性機序が原因と考えられている。従って、こうした薬剤耐性を克服した更に効果的なＣＭＬに対する治療薬が医療上必要とされている。
【０００６】
こうした中で、ダサチニブ（dasatinib、ＢＭＳ−３５４８２５）は、以下の構造を有し、メシル酸イマチニブと異なる部位に結合してＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼに阻害作用を示し、さらにＳＲＣチロシンキナーゼの阻害作用も有することから、Ｐｈ陽性のＣＭＬに対する有用性が期待できると考え、世界的に開発が進められている（特許文献１）。
【化１】
【特許文献１】米国特許公報第６，５９６，７４６Ｂ１号
【非特許文献１】陣内逸郎 ４．慢性骨髄性白血病に対するイマチニブ療法 血液フロンティア 2004；14：43-49
【非特許文献２】Druker BJ et al., N Engl J Med 2001; 344: 1038-1042.
【非特許文献３】O'Brien SG et al., N Engl J Med 2003; 348: 994-1004.
【非特許文献４】Mahon FX et al., Blood 2000; 96: 1070-1079.
【非特許文献５】Weisberg E et al., Blood 2000; 95: 3498-3505.
【非特許文献６】le Coutre P et al., Blood 2000; 95: 1758-1766.
【非特許文献７】CANCER CELL; JULY 2005, p 5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、メシル酸イマチニブの場合と同様に、ダサチニブに対して治療抵抗性を示すＣＭＬ患者の出現が懸念されており、また今後更に新たな治療抵抗性が生ずることも考えられ、更により優れたＣＭＬの治療方法を確立することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ダサチニブ耐性ＣＭＬ患者のＰｈ染色体陽性細胞中にアポトーシス関連バイオマーカーがアップレギュレートされていることを見出した。
かかる知見に基づき、上記の課題を解決するため、本発明は、以下の工程
（１）フィラデルフィア染色体陽性の（慢性）骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、及び
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者のダサチニブによる治療に対する適応性を判定する方法を提供する。
ここで採取された生体試料としては、例えば血液、骨髄液などが挙げられる。
ここでコントロールとは、Ｐｈ陽性細胞であってダサチニブ非耐性のもの、Ｐｈ陰性細胞等のいずれでもよい。Ｐｈ陰性の対応細胞の起源は、Ｐｈ陰性であればどのような人でも良く、例えばＰｈ陰性白血病患者や健常人が含まれる。Ｐｈ陽性骨髄性白血病患者であって、ダサチニブ投与前の白血病細胞が望ましい。
ここでアポトーシス関連バイオマーカーとは、例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せなどが挙げられる。
そしてそのバイオマーカーの量を測定する工程としては、例えばイムノブロッティング法があり、具体的には以下の実施例にその例が挙げられている。
またここでアポトーシス関連バイオマーカーの測定をコントロールにおける測定値と比較して判断する基準としては、例えば、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下ならダサチニブ治療に適応すると判断し、また３．０倍以上、好ましくは５．０倍以上なら、非適応と判断することができる。
【０００９】
また、本発明は、以下の工程
（１）ダサチニブにより治療中のフィラデルフィア染色体陽性の（慢性）骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者におけるダサチニブに対する耐性の発現を判定する方法を提供する。
ここで採取された生体試料としては、例えば血液、骨髄液などが挙げられる。
ここでコントロールとは、Ｐｈ陽性細胞であってダサチニブ非耐性のもの、Ｐｈ陰性細胞等のいずれでもよい。Ｐｈ陰性の対応細胞の起源は、Ｐｈ陰性であればどのような人でも良く、例えばＰｈ陰性白血病患者や健常人が含まれる。Ｐｈ陽性骨髄性白血病患者であって、ダサチニブ投与前の白血病細胞が望ましい。
ここでアポトーシス関連バイオマーカーとは、例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せなどが挙げられる。
そしてそのバイオマーカーの量を測定する工程としては、例えばイムノブロッティング法があり、具体的には以下の実施例にその例が挙げられている。
またここでアポトーシス関連バイオマーカーの測定をコントロールにおける測定値と比較して判断する基準としては、例えば、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下ならダサチニブ治療に適応すると判断し、また３．０倍以上、好ましくは５．０倍以上なら、非適応と判断することができる。
【００１０】
更に、本発明は、ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞をダサチニブ及び候補薬物を含有する培地で培養し、該細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が培養前に比較して培養後で低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいて、ダサチニブとの併用薬物を選択する方法を提供する。
ここで、ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞は、例えば、ダサチニブで加療中の骨髄性白血病患者由来のフィラデルフィア染色体陽性細胞、またはＢＣＲ−ＡＢＬをトランスフェクトされたダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞が挙げられる。
【００１１】
また、本発明は、以下の工程
（１）ヒト以外の哺乳動物にダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性骨髄性白血病を誘発し、
（２）該動物から単離した白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定し、
（３）ダサチニブと候補薬物とを該動物に投与して飼育した後白血病細胞中のアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が上記（２）の測定値に比較して低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいてダサチニブとの併用薬物を選択する方法を提供する。
上記で示したダサチニブとの併用薬物を選択する方法においては、ダサチニブと候補薬物の存在下での培養または飼育前の測定値が培養または飼育後の測定値と比較して判断する基準としては、２．０倍以下、好ましくは１．５倍以下なら該候補薬物がダサチニブとの併用薬物として有用であると判断する。
その他各用語は、上記の各方法での定義と同義である。
または候補薬物とダサチニブの両者を含有する培地、ダサチニブのみを含有する培地で、フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞を並行して培養し、双方の培地中のバイオマーカーを測定し、候補薬物を含有する培地中のバイオマーカー値の減少又はアポトーシスを観察することによっても判定できる。
また、モデル動物を用いてインビボで行うこともできる
更に本発明では、上記の方法で得られた併用薬物を、同時または順次に投与して、ダサチニブとの併用治療に用いる医薬組成物を提供する。
該併用薬物としては、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼの阻害剤を挙げることができるが、これらに限定されない。一例としてＡＢＴ−７３７が挙げられる。
ここで用いるＡＢＴ−７３７とは、以下のような構造を有し、Ｂｃｌ−２の阻害剤として様々な癌に効果が期待できる化合物である（非特許文献７）。
【化２】
【００１２】
また、本発明は、上記の各種方法を行うためのキットであって、
（１）ダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞
（２）培養装置
（３）バイオマーカーの抗体
（４）正常値を示す対照表
を含むキットを提供する。
さらに上記キットに使用説明書を含むキットも提供する。
ここで各用語は、上記の各方法での定義と同義である。
【００１３】
また、本発明は、上記の各種方法およびキットに有用な、ダサチニブ耐性を発症している急性リンパ性白血病患者または慢性骨髄性白血病患者由来または株化細胞を起源とするダサチニブ耐性細胞株を提供する。該ダサチニブ耐性細胞株の調製方法としては、例えば以下の実施例の記載が挙げられる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、そのような患者の処置に有用なダサチニブ併用組成物、その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明（スクリーニング方法）の対象とする疾患としては、フィラデルフィア染色体を有する患者が発症する白血病、具体的には、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病が挙げられる。
また、本発明はヒトの疾患に適用される他、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物にも適用される。
以下、本発明を実施するにあたり、具体的に説明する。
なお、本発明の耐性株化細胞の作製に用いることができる株化細胞としては、ＴＦ−１、またはＫ５６２などが挙げられる。
白血病に効果が期待できるか否かの検討に一般的に用いられる２種類のヒト白血病株化細胞のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４３）およびＢＤＲ−ＡＢＬ遺伝子をトランスフェクトしたＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２００３。以下、ＴＦ１ ＢＣＲＡＢＬ細胞と称する）を、イマチニブまたはダサチニブを漸増的に増加させながら培養することによりイマチニブ耐性またはダサチニブ耐性を発現した細胞株が提供される。具体的には、Ｋ５６２細胞およびＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞をイマチニブ０.１μＭ存在下、またはダサチニブ０.５ｎＭ存在下で２週間培養し、次いでイマチニブまたはダサチニブの濃度を漸増させた。最終的に、イマチニブ耐性Ｋ５６２細胞およびイマチニブ耐性ＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞はイマチニブ１０μＭ存在下で増殖することができた。また、ダサチニブ耐性Ｋ５６２細胞およびダサチニブ耐性ＴＦ１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞はダサチニブ１０ｎＭ存在下で増殖することができた。これらの耐性細胞株をＰＣＲにより分析して、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインに点変異が生じておらず、耐性発現がＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼの変異に由来するものではないことを確認した。この株はダサチニブ耐性を発現する白血病患者の治療に用い得る化合物（ダサチニブとの併用化合物を含む）を開発する際に、一次スクリーニングの道具として利用することができる。
また、これら細胞を分析すると、ダサチニブ耐性を発現している細胞ではＢｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼの発現がアップレギュレートされていることが確認された。この知見をもとに、本発明者らはイマチニブ耐性を発現した白血病患者、または発現する可能性のある患者をＢｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、およびＬｙｎキナーゼをバイオマーカーとして用いて判別して、不要な薬剤投与を省きうることを見出した。また、ダサチニブ耐性患者とイマチニブ耐性患者とではＬｙｎキナーゼの発現に差異があるので、いずれの薬剤が有効または無効であるかも判別することができる。
さらに、これらの細胞は、これら化合物に対する耐性を耐性細胞から消失させうる化合物のスクリーニングに使用することもできる。本発明において本発明者らはダサチニブとＡＢＴ−７３７と併用すると細胞の生存率が減少し、アポトーシスが増加することを見出した。
【００１６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ダサチニブ耐性細胞株の作製
ダサチニブ耐性細胞株を以下の手順により作製した。本実施例では耐性株の親株として、Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を用いた。Ｋ５６２細胞はヒト白血病細胞株であり、文献（Nakajima et al., Mol Cancer Ther., 2, 219-224）の記載に従い、ＴＦ−１細胞にｐ２１０ ＢＣＲ−ＡＢＬ (Ｂ２Ａ２) ｃＤＮＡを有するｐＧＤ２１０ベクターをトランスフェクトしてＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を作製した。これら細胞株を培養する基本培地には１０％ウシ胎仔血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)を補充したＲＰＭＩ１６４０(Life Technology, Inc.)を用いた。
Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞をイマチニブ（Novartis Inc. Basel, Switzerland製）０.１μＭまたはダサニチブ（Bristol-Myers Squibb, New York, NY製）０.５ｎＭと共に２週間培養し、次いでイマチニブまたはダサチニブの濃度を段階的に増加させることにより、イマチニブまたはダサチニブ耐性株を作製した。ダサチニブについては、０．５ｎｍｏｌから開始し、各濃度で２週間培養し、生存している細胞に対し、１．２５倍から２倍に濃度を段階的に上げ、ＴＦ−１については、２０ｎｍｏｌまで、Ｋ−５６２については２００ｎｍｏｌまで上げ、生存している細胞を耐性と定義した。同様にイマチニブについても０．５μｍｏｌから開始し、１０μｍｏｌで生存している細胞を耐性と定義した。細胞の薬剤耐性は、ＦＩＴＣ結合型ＡＰＯ２.７モノクローナル抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにかけることによりアポトーシス細胞の数を測定して決定した（図１Ａ、１Ｂ）。最終的に、それぞれ、イマチニブ１０μＭ存在下、およびダサチニブ２０ｎＭ（Ｋ５６２の場合）または２００ｎＭ（ＴＦ−１の場合）存在下で増殖し得る細胞を作製することができた。
なお、これら耐性株のＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン配列をＰＣＲ分析により確認すると点変異は生じていなかった。従って、これら細胞に生じた耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質をコードする配列を保持したままで耐性を獲得している。
以下、イマチニブ耐性のＫ５６２細胞をＫ５６２−ＩＭＲ細胞、ＴＦ−１細胞をＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＩＭＲ細胞、ならびにダサチニブ耐性のＫ５６２細胞をＫ５６２−ＢＭＳＲ細胞、ＴＦ−１細胞をＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞と称する。
【実施例２】
【００１８】
バイオマーカーによるダサチニブ耐性の判別
上記耐性細胞を用いて、イマチニブ耐性またはダサチニブ耐性の細胞を用いて、転写レベルが変化している遺伝子を同定した。この実験データは、３回の独立したマイクロアレイハイブリダイゼーションから遺伝子発現データをイムノブロッティングすることにより得た。実験に用いたＡＢＬ抗体(24-11)、ＳＨＰ-２抗体 (C-18)、Ｂｃｌ−２抗体(C-2)およびＭｃｌ−１抗体(S-19)は、Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)から購入した。Ｌｙｎ抗体、リン酸化Ｌｙｎ抗体 (Tyr507)、Ｂｃｌ−ＸＬ抗体、カスパーゼ−３抗体、開列型カスパーゼ−３抗体、ＰＡＲＰ抗体、および開裂型ＰＡＲＰ (Asp214)はCell Signaling technology (Beverly, MA)から入手した。
我々は遺伝子発現変化の信頼限界として、１.５倍をカットオフ値として用いた。イムノブロッティングは文献（Tauchi et al., J Biol Chem, 269, 15381-15387）の記載に従い行った。
耐性細胞を、それぞれ、イマチニブ１０μＭ存在下、およびダサチニブ２０ｎＭ（Ｋ５６２の場合）または２００ｎＭ（ＴＦ−１の場合）存在下で培養し、イムノブロッティングを行うと、いずれも親細胞と比較してＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の発現が増加していた（図２Ａ）。ＳＨＰ−２は発現量がイマチニブあるいはダサチニブ耐性の有無により変化しないので、各レーンにアプライしたタンパク質量が一定であることを示している。さらに、ダサチニブ耐性株においてＬｙｎキナーゼのリン酸化が顕著に増加しており、Ｌｙｎ発現レベルも増加していた（図２Ｂ）。他方、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２および生存率の発現は顕著な変化は観察されなかったが、Ｂｃｌ−ＸＬの発現が増加していた（図２Ｂ）。これらの結果より、ダサチニブ耐性表現型の獲得は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質、ＬｙｎキナーゼおよびＢｃｌ−ＸＬの顕著な増加と関連している。
【実施例３】
【００１９】
薬物の併用によるダサチニブ耐性の克服
従来、Ｌｙｎ活性型ＣＭＬ細胞におけるＢcl-2発現の増加がイマチニブ抵抗性の表現型の原因であることが示されており(Dai Y, Rahmani M, Corey SJ, Dent P, Grant S. (2004) J Biol Chem., 279, 34227-34239)、本発明者らはBcl-2をアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてダウンレギュレートすることによりBCR-ABL発現細胞をイマチニブに対して感受性にし得ることを見出していた（T. Tauchi et al., Clinical Cancer Research Vol. 9, 2003, 4267-4273）。そこで、我々は、BCR-ABL形質転換細胞におけるBcl-2ファミリータンパク質のインヒビターであるABT-737の活性を調べ、さらには、ダサチニブとの併用によるダサチニブ耐性克服の可能性について試験した。
１）ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞をＡＢＴ−７３７（Abbott Laboratories, Abott Park, IL製)およびイマチニブまたはダサチニブと共に７２時間培養した後、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を測定した。ＡＢＴ−７３７を単独で適用した場合は細胞に対する毒性は最小限であるが、イマチニブと併用すると劇的にアポトーシス細胞数が増加した（図３Ａ、３Ｂ）。ダサチニブをＡＢＴ−７３７と併用すると、アポトーシス細胞は５ｎＭより高濃度のダサチニブ濃度の場合と同レベルにまで達した（図３Ｃ、Ｄ）。この実験条件をイムノブロッティングで分析すると、１μＭ ＡＢＴ−７３７および１００ｎＭダサチニブを併用すると、Ｋ５６２細胞内でカスパーゼ−３とＰＡＲＰの切断物が増加していた（図３Ｅ）。カスパーゼ３の開裂による活性化は、アポトーシスの過程において主要な役割を果たしており、特にカスパーゼ３は細胞死の最終段階で作用しＰＲＡＰを開裂し、細胞死に至らしめるとともに、カスパーゼ２、６、８、１０を活性化し、更にフィードバックにより上流のカスパーゼ９を増量させる。これら知見を合わせて考慮すると、ＡＢＴ−７３７は、その細胞毒性が最小となるような濃度でイマチニブまたはダサチニブのいずれかと併用して、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞におけるアポトーシスを効率よく誘発することができる。
２）Ｂｃｌ−ＸＬがダサチニブ耐性ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換細胞におけるＡＢＬキナーゼインヒビター反応の調節における役割を機能的に調べるために、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を異なる濃度のＡＢＴ−７３７およびイマチニブまたはダサチニブと共に７２時間培養し、アポトーシスについて試験した。ダサチニブ１００ｎＭまたはイマチニブ１０ｎＭを用いて処理すると毒性は最小限に抑えられるが、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞にアポトーシスを誘発することはできなかった。しかし、ＡＢＴ−７３７、およびイマチニブまたはダサチニブを同時に用いて処理すると、アポトーシス細胞の数は顕著に上昇した（図４Ａ、４Ｂ）。これらの結果は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害がＬｙｎキナーゼ活性化エレメントによるダサチニブ耐性を克服する原因である可能性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明により、ダサチニブに対して治療抵抗性を示すＣＭＬ患者に、フィラデルフィア染色体として知られる遺伝子異常を有する白血病患者にダサチニブが有効かどうかを判定する方法、およびそのような患者の処置に有用なダサニチブ併用組成物が提供され、また
その組成物に用いられる薬剤のスクリーニング方法およびその方法に有用な細胞も提供され、ＣＭＬ患者に対して適切な処置をすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】１Ａは、イマチニブまたはダサチニブの添加によりアポトーシスを生じたＴＦ−１細胞、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＩＭＲ細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞の数を示すグラフである。
【図１Ｂ】１Ｂは、イマチニブまたはダサチニブの添加によりアポトーシスを生じたＫ５６２、Ｋ５６２−ＩＭＲ、Ｋ５６２−ＢＭＳＲ細胞の数を示すグラフである。
【図２Ａ】２Ａは記載の細胞株由来の細胞溶解物を、ＡＢＬモノクローナル抗体（上段）およびＳＨＰ−２抗体（下段）でイムノブロットした結果を示す。
【図２Ｂ】２Ｂは記載の細胞株から作製した細胞溶解物を抗Ｌｙｎ抗体（上段パネル）、抗リン酸化Ｌｙｎ抗体（中段）または抗Ｂｃｌ−ＸＬ抗体（下段）でイムノブロットした結果を示す。
【図３Ａ】イマチニブまたはダサチニブとＡＢＴ−７３７との併用による、Ｋ５６２細胞およびＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞におけるアポトーシスの誘導およびカスパーゼ活性化を示す。３Ａは、Ｋ５６２細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｂ】３Ｂは、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｃ】３Ｃは、Ｋ５６２細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｄ】３Ｄは、ＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３Ｅ】３Ｅは、ＡＢＴ−７３７１μＭおよびダサチニブ１００ｎＭと共にＫ５６２細胞を培養した後の、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの開裂のイムノブロットによる評価を示す。
【図４Ａ】ＡＢＴ−７３７によりＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞のＡＢＬキナーゼインヒビター耐性が克服されることを示すグラフである。４ＡはＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のイマチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【図４Ｂ】４ＢはＴＦ−１ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＢＭＳＲ細胞を、記載濃度のダサチニブおよびＡＢＴ−７３７と共に培養した場合のＡＰＯ２．７で測定したアポトーシス細胞の割合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程
（１）フィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、及び
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者のダサチニブによる治療に対する適応性を判定する方法。
【請求項２】
コントロールが、健常人又、フィラデルフィア染色体陰性患者、ダサチニブで治療されていないフィラデルフィア染色体陽性患者由来の対応する細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（２）の測定値が（３）の測定値の１．５倍以下であれば、該患者に対するダサチニブによる治療が適すると判定する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下の工程
（１）ダサチニブにより治療中のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者におけるダサチニブに対する耐性の発現を判定する方法。
【請求項６】
コントロールが、健常人又、フィラデルフィア染色体陰性患者、ダサチニブで治療されていないフィラデルフィア染色体陽性患者由来の対応する細胞である、５の方法。
【請求項７】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
（２）の測定値が（３）の測定値の１．５倍以下であれば、該患者がダサチニブ耐性を発現していると判定する請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞をダサチニブ及び候補薬物を含有する培地で培養し、該細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が培養前に比較して培養後で低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいて、ダサチニブとの併用薬物を選択する方法。
【請求項１０】
ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞が、ダサチニブで加療中の骨髄性白血病患者由来のフィラデルフィア染色体陽性細胞、またはＢＣＲ−ＡＢＬをトランスフェクトされたダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞である、９記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程
（１）ヒト以外の哺乳動物にダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性骨髄性白血病を誘発し、
（２）該動物から単離した白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定し、
（３）ダサチニブと候補薬物とを該動物に投与して飼育した後白血病細胞中のアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が上記（２）の測定値に比較して低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいてダサチニブとの併用薬物を選択する方法。
【請求項１２】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ダサチニブと候補薬物の存在下での培養または飼育前の測定値が培養または飼育後の測定値の１．５倍以上であれば、該候補薬物がダサチニブとの併用薬物として有用であると判定する、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかで得られた併用薬物を、同時または順次に投与して、ダサチニブとの併用治療に用いる医薬組成物。
【請求項１５】
該併用薬物がＡＢＴ−７３７である請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、
（１）ダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞
（２）培養装置
（３）バイオマーカーの抗体
（４）正常値を示す対照表
を含むキット。
【請求項１７】
さらに使用説明書を含む、請求項１６のキット。
【請求項１８】
ダサチニブ耐性を発症している急性リンパ性白血病患者または慢性骨髄性白血病患者由来または株化細胞を起源とするダサチニブ耐性細胞株。
【請求項１】
以下の工程
（１）フィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、及び
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者のダサチニブによる治療に対する適応性を判定する方法。
【請求項２】
コントロールが、健常人又、フィラデルフィア染色体陰性患者、ダサチニブで治療されていないフィラデルフィア染色体陽性患者由来の対応する細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（２）の測定値が（３）の測定値の１．５倍以下であれば、該患者に対するダサチニブによる治療が適すると判定する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下の工程
（１）ダサチニブにより治療中のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病患者からフィラデルフィア染色体陽性の白血病細胞を含む生体試料を採取する工程、
（２）試料中の上記白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定する工程、
（３）上記（２）の測定値をコントロールにおける測定値と比較し、高いか否かを判断する工程、
を含む、患者におけるダサチニブに対する耐性の発現を判定する方法。
【請求項６】
コントロールが、健常人又、フィラデルフィア染色体陰性患者、ダサチニブで治療されていないフィラデルフィア染色体陽性患者由来の対応する細胞である、５の方法。
【請求項７】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
（２）の測定値が（３）の測定値の１．５倍以下であれば、該患者がダサチニブ耐性を発現していると判定する請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞をダサチニブ及び候補薬物を含有する培地で培養し、該細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が培養前に比較して培養後で低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいて、ダサチニブとの併用薬物を選択する方法。
【請求項１０】
ダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性の骨髄性白血病細胞が、ダサチニブで加療中の骨髄性白血病患者由来のフィラデルフィア染色体陽性細胞、またはＢＣＲ−ＡＢＬをトランスフェクトされたダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞である、９記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程
（１）ヒト以外の哺乳動物にダサチニブ耐性のフィラデルフィア染色体陽性骨髄性白血病を誘発し、
（２）該動物から単離した白血病細胞におけるアポトーシス関連バイオマーカーを測定し、
（３）ダサチニブと候補薬物とを該動物に投与して飼育した後白血病細胞中のアポトーシス関連バイオマーカーの測定値が上記（２）の測定値に比較して低いかまたはアポトーシスが誘導されたかに基づいてダサチニブとの併用薬物を選択する方法。
【請求項１２】
アポトーシス関連バイオマーカーが、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１またはＬｙｎキナーゼまたはそれらの組合せである、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ダサチニブと候補薬物の存在下での培養または飼育前の測定値が培養または飼育後の測定値の１．５倍以上であれば、該候補薬物がダサチニブとの併用薬物として有用であると判定する、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかで得られた併用薬物を、同時または順次に投与して、ダサチニブとの併用治療に用いる医薬組成物。
【請求項１５】
該併用薬物がＡＢＴ−７３７である請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、
（１）ダサチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性白血病細胞
（２）培養装置
（３）バイオマーカーの抗体
（４）正常値を示す対照表
を含むキット。
【請求項１７】
さらに使用説明書を含む、請求項１６のキット。
【請求項１８】
ダサチニブ耐性を発症している急性リンパ性白血病患者または慢性骨髄性白血病患者由来または株化細胞を起源とするダサチニブ耐性細胞株。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公開番号】特開２００７−１５９４１６（Ｐ２００７−１５９４１６Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５６１４３（Ｐ２００５−３５６１４３）
【出願日】平成１７年１２月９日（２００５．１２．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年９月１８日 日本血液学会・日本臨床血液学会主催の「第６７回日本血液学会総会・第４７回日本臨床血液学会総会 合同総会」において文書をもって発表
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月９日（２００５．１２．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年９月１８日 日本血液学会・日本臨床血液学会主催の「第６７回日本血液学会総会・第４７回日本臨床血液学会総会 合同総会」において文書をもって発表
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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