チオール基標識方法、チオール基標識用試薬及びサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法
【課題】アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする、短時間で簡便に、目的物質のチオール基を、チオール基に結合する標識物質で、特異的に標識する方法及び試薬、並びにチオール基標識方法及び試薬を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法を提供する。
【解決手段】Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの存在下で、目的物質と５−ヨードアセトアミドフルオレセインとを反応させるチオール基標識方法。更にサイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程を含むチオール基標識方法。及びサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法。
【解決手段】Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの存在下で、目的物質と５−ヨードアセトアミドフルオレセインとを反応させるチオール基標識方法。更にサイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程を含むチオール基標識方法。及びサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール基に結合する標識物質を用いた、目的物質を標識するための方法及び試薬に関する。さらに本発明は、チオール基に結合する標識物質を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ペプチド又は核酸等の生体分子の解析や検出等において、チオール基に結合する標識物質を用いて、目的とする生体分子のチオール基を標識することが、生物学や分子生物学等の分野で多用されている。
【０００３】
例えば、システインが有するチオール基やシステインにより形成されるジスルフィドは、タンパク質の立体構造やタンパク質の酵素活性に、大きく影響していることが知られている。そのため、チオール基やジスルフィドの位置を同定することは、タンパク質の構造又は活性を解析するときに重要である。例えば、チオール基に結合する標識物質を用いてタンパク質のチオール基を標識することで、タンパク質におけるチオール基の位置を同定する方法が知られている。
【０００４】
また、チオール基に結合する標識物質を用いて、サイクリン依存性キナーゼ（以下ＣＤＫという）の活性を測定する方法が知られている（特許文献１）。この測定方法では、まず、ＣＤＫ及びアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下ＡＴＰ−γＳという）を用いて、ＣＤＫの基質にチオール基を導入する。次に、基質に導入されたチオール基を、チオール基に結合する標識物質で標識する。そして、チオール基に結合する標識物質で標識された基質を測定することで、ＣＤＫの活性測定を行っている。
【０００５】
ここで、チオール基に結合する標識物質で、標識対象である目的物質を標識する場合、一般的に、過剰量の標識物質で目的物質と反応させる。この際、チオール基に結合する標識物質が、目的物質のアミノ基に、非特異的に結合してしまう場合がある。そのため、上記のタンパク質におけるチオール基の位置の同定やＣＤＫ活性測定を正確に行えない場合がある。
【０００６】
なお、白金化合物を用いて、目的物質のチオール基を特異的に標識する方法が知られている。この方法では、まずアニオンと目的物質のアミノ基とを結合させた後、白金化合物を用いて目的物質のチオール基を標識している。ここで、目的物質のアミノ基にはアニオンが結合しているため、白金化合物は目的物質のアミノ基には結合しない。そのため、目的物質のチオール基を、白金化合物で特異的に標識することができる。
【０００７】
しかしながら、特許文献２の方法は、アニオンと目的物質のアミノ基とを結合させる工程を行った後、目的物質のチオール基を白金化合物で標識する工程を行う必要がある。そのため、工程ごとに、試料の前処理や試薬のｐＨ調製といった操作が必要となる。結果として、作業が繁雑となり、時間を要するという問題があった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３３５９９７号公報
【特許文献２】特表２００４−５３０８８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、短時間で簡便に、目的物質のチオール基を、チオール基に結合する標識物質で、特異的に標識する方法及び試薬を提供することを目的とする。
さらに本発明は、上記のチオール基標識方法及び試薬を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする、チオール基標識方法；
（２）前記目的物質がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ、又はペプチド核酸である、（１）に記載のチオール基標識方法；
（３）前記保護物質がアミノ基と共有結合するための官能基を有する（１）又は（２）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（４）アミノ基と共有結合する官能基が、スクシンイミド又はイソチオシアネートである、（３）に記載のチオール基標識方法；
（５）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１）〜（４）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（６）前記標識物質が、チオール基と共有結合するための官能基を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（７）チオール基と共有結合する官能基が、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンである、（６）に記載のチオール基標識方法；
（８）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１）〜（７）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（９）チオール基に結合する標識物質が、蛍光標識物質又は酵素標識物質である、（１）〜（８）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（１０）前記反応がｐＨ６．５〜８．５で行われる、（１）〜（９）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（１１）チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする、チオール基標識用試薬；
（１２）前記溶液のｐＨが６．５〜８．５である、（１１）に記載のチオール基標識用試薬；
（１３）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１１）又は（１２）のいずれかに記載のチオール基標識用試薬；
（１４）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載のチオール基標識用試薬；
（１５）試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１６）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１５）に記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１７）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１５）又は（１６）のいずれかに記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１８）反応工程が、ｐＨ６．５〜８．５で行われる、（１５）〜（１７）のいずれかに記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、短時間で簡便に、目的物質のチオール基を、チオール基に結合する標識物質で、特異的に標識する方法及び試薬が提供される。
さらに本発明によると、上記のチオール基標識方法及び試薬を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態である、チオール基標識方法は、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする。
【００１３】
本実施形態において目的物質とは、チオール基に結合する標識物質による標識の対象となる物質であれば特に限定されない。具体的には、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ又はペプチド核酸などが挙げられる。この中で好ましくはタンパク質である。目的物質がチオール基を有さない場合には、目的物質にチオール基を導入することにより、標識物質と目的物質との結合が可能になる。例えば、目的物質がチオール基を有さないタンパク質である場合、このタンパク質を基質とするキナーゼとアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下ＡＴＰγＳとする）とを用いてこのタンパク質にチオール基を導入することができる。
【００１４】
本実施形態において、アミノ基に結合する保護物質は、チオール基に結合する標識物質と目的物質のチオール基との結合を阻害せず、チオール基に結合する標識物質と目的物質のアミノ基との結合を防ぐ物質であればよい。好ましくはアミノ基と共有結合するための官能基を有している保護物質である。アミノ基と共有結合する官能基としては、スクシンイミド、イソチオシアネートなどが挙げられる。好ましくはスクシンイミド基である。具体的な保護物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルやフェニルイソチオシアネートなどが挙げられる。
【００１５】
本実施形態において、チオール基に結合する標識物質は、目的物質のチオール基と結合し、目的物質を検出できるものであれば良い。好ましくはチオール基と共有結合するための官能基を有している標識物質である。チオール基と共有結合する官能基としては、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンなどが挙げられる。好ましくは、アルキルハライド基である。
【００１６】
また、チオール基に結合する標識物質は、蛍光標識物質であっても酵素標識物質であってもよい。蛍光標識物質に用いられる蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミンなどが挙げられる。そのうち、フルオレセインが好ましい。具体的な蛍光標識物質としては、ヨードアセチル−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（６−ＩＡＦ）、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、エオシン−５−マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミド、１−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（ＰＭＩＡ アミド）、１−ピレンメチルヨードアセテート（ＰＭＩＡ エステル）、ローダミンレッドＣ２マレンイミドなどが挙げられる。このうち、５−ヨードアセトアミドフルオレセインが好ましい。
標識物質として蛍光標識物質を用いる場合、まず目的物質と蛍光標識物質とを結合させる。次に蛍光物質を特定の波長で励起させて、蛍光を検出する。例えば蛍光物質がフルオレセインの場合、フルオレセインに４８８ｎｍの波長を照射して励起させ、蛍光画像解析装置で検出する。これにより、目的物質を検出することができる。
【００１７】
酵素標識物質に用いられる酵素としては、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼなどが挙げられる。そのうち、ペルオキシダーゼが好ましい。
標識物質として酵素標識物質を用いる場合、まず目的物質と酵素標識物質とを結合させる。次に酵素標識物質で標識された目的物質に、酵素との反応によって発光が生じるような試薬を加える。次に試薬と酵素とを反応させて、発光を生じさせ検出する。これにより、目的物質を検出することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、試薬としてはＥＣＬ−プラス（アマシャム・バイオサイエンス社）が挙げられる。なお、試薬は使用する酵素に合わせて適宜選択することができる。
【００１８】
本実施形態の、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質との反応では、標識物質が目的物質のチオール基に結合する反応を阻害せず、標識物質とアミノ基との意図しない結合反応よりも保護物質が十分に目的物質のアミノ基に結合できるｐＨである必要がある。また、目的物質が生体物質である場合、生体物質の構造変化等を防ぐためには、ｐＨは中性付近が好ましい。特に目的物質がタンパク質である場合、実験内容により、ｐＨによるタンパク質の変性を防ぐ必要がある。そのため、標識物質及び保護物質と目的物質との反応は、中性付近で行われる必要がある。より具体的には、ｐＨは６．５〜８．５で反応させることが好ましい。さらに好ましくはｐＨ７．０〜７．５である。上記ｐＨの範囲で反応が行われる標識物質としては、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、テトラメチルローダミンヨードアセトアミド、テキサスレッドマレイミドなどが挙げられる。また上記ｐＨの範囲で反応が行われる保護物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、イソチオシアネートなどが挙げられる。
この反応では前記ｐＨの範囲で緩衝能を有する緩衝液を用いることができる。具体的にはトリス緩衝液やモルフォリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液などが挙げられる。またこの緩衝液には、タンパク質分解酵素阻害剤を添加してもよい。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。
【００１９】
さらにこの反応は、通常１０分〜２時間でチオール基標識反応を行うことができる。この反応で用いられる標識物質及び保護物質の量は、目的物質の量に応じて添加する。例えば目的物質としてヒストンＨ１タンパク質、標識物質として５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、保護物質としてＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いる場合、目的物質のタンパク質１当量に対して、標識物質は５０〜５００当量、保護物質は１００〜２０００当量が添加される。
そしてこの反応は、遊離のチオール、例えばβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−アセチルシステインなどが添加されて停止される。
【００２０】
本発明の一実施形態である、チオール基標識用試薬は、チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする。
【００２１】
本実施形態のチオール基標識試薬のｐＨとしては、前述と同様のｐＨでよい。またこの溶液には、前述の緩衝液を用いることができる。この緩衝液にも同様にタンパク質分解酵素阻害剤を添加することができる。
【００２２】
本発明の一実施形態である、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法は、試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む。
【００２３】
本実施形態で用いられる試料は、生体細胞からサイクリン依存性キナーゼの活性を測定するために調製された試料であることが好ましい。生体細胞は、組織サンプル（バイオプシーサンプルや外科切除サンプル等）のようなヒトを含む動物由来の細胞を用いるのが好ましい。
サイクリン依存性キナーゼ（以下ＣＤＫという）は、細胞質中に存在しており、核内のサイクリンと結合する。そして、サイクリン依存性キナーゼとサイクリンとの複合体（以下、活性型ＣＤＫという）を形成し、活性化状態となる。よって活性測定の対象となるＣＤＫは細胞の内部に含まれている。このため測定するための試料を調製するときには、細胞膜及び核膜を破壊し、ＣＤＫを試料中に遊離させた状態で存在させることが好ましい。つまりＣＤＫと基質タンパク質との反応を行う前に、生体細胞に対して可溶化処理を行うことが好ましい。
【００２４】
可溶化処理は、生体細胞に可溶化処理用の緩衝液（以下細胞可溶化液とする）を添加して行うことが好ましい。この緩衝液は前述と同様のものを用いることができる。細胞可溶化液には、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤や脱リン酸化酵素阻害剤などを含有させることができる。具体的な可溶化処理の方法としては、細胞可溶化液を細胞に添加し、ワーリングブレンダーによる粉砕処理、シリンジによる吸引排出処理又は超音波処理を行う。これにより、生体細胞に対して可溶化処理を行うことができる。
【００２５】
界面活性剤は、細胞膜及び核膜を破壊して細胞内物質を取り出すために用いられる。ただし、活性型ＣＤＫを分解させない程度の界面活性を有するものが用いられる。例えば、ノニデットＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸又はＣＨＡＰＳなどが挙げられる。界面活性剤濃度は、１ｗ／ｖ％以下が好ましい。
【００２６】
タンパク質分解酵素阻害剤は、破壊された細胞膜や核膜などの細胞内物質が混在するとき、タンパク質であるＣＤＫやサイクリン分子が破壊されるのを防ぐために用いられる。例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡのようなメタロプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシンのようなセリンプロテアーゼ阻害剤又はヨードアセトアミド、Ｅ−６４のようなシステインプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。また、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）のようなそれらタンパク質分解酵素阻害剤を予め混合した市販品も挙げられる。
【００２７】
脱リン酸化酵素阻害剤は、細胞に含まれる脱リン酸化酵素が、測定対象の酵素の活性を低下させることを防ぐ目的で用いられる。例えば、セリン／スレオニン脱リン酸化酵素阻害剤（フッ化ナトリウムなど）、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤（オルトバナジン酸ナトリウムなど）などが挙げられる。溶解緩衝液にはこれらの脱リン酸化酵素阻害剤を単独又は混合して用いることができる。
【００２８】
本実施形態のＣＤＫとは、具体的には、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７及びＣＤＫ８等が例示される。
【００２９】
可溶化処理を行った細胞から測定目的の活性型ＣＤＫを抽出する方法として、例えば免疫沈降法がある。免疫沈降法では、目的の各種ＣＤＫ１〜８のいずれか一つに特異性を有する抗ＣＤＫ抗体が用いられる。
【００３０】
より詳細には、所定量のタンパク質を含む細胞可溶化液に、測定目的の活性型ＣＤＫに対応する抗ＣＤＫ抗体と、その抗ＣＤＫ抗体を捕捉するための材料としてプロテインＡ、プロテインＧまたは抗ウサギＩｇＧ抗体をコートしたセファロースビーズとの懸濁液を０〜１０℃で１〜２時間反応させる。これらビーズは不溶性なので、ビーズに結合した抗ＣＤＫ抗体とＣＤＫの複合体は不溶性となり沈降する。このビーズを回収することで測定目的の活性型ＣＤＫを抽出することができる。
【００３１】
本実施形態で用いられる基質タンパク質は、活性測定の対象となる酵素の基質となるものであれば特に限定されない。例えば、活性測定の対象となる酵素がＣＤＫ１又はＣＤＫ２である場合、基質タンパク質としては、ヒストンＨ１又は網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下Ｒｂとする）を用いることが好ましい。また、酵素がＣＤＫ４又はＣＤＫ６である場合は、基質タンパク質としてＲｂを用いることが好ましい。この基質タンパク質は、硫黄原子を含まないアミノ酸（システイン及びメチオニン以外のアミノ酸）から構成されるタンパク質が好ましい。Ｒｂのようなシステイン残基を含むタンパク質は、システイン残基をアラニンなどの硫黄原子を含まないアミノ酸に置換して用いることが好ましい。基質中のシステイン又はメチオニン残基を、硫黄原子を含まないアミノ酸に置換する方法としては、ＰＣＲ法や部分点突然変異法などの公知の方法を用いて行うことができる。
【００３２】
本実施形態においてＣＤＫの基質タンパク質にチオール基を導入する工程は、活性型ＣＤＫの存在下で、ＣＤＫの基質タンパク質とＡＴＰ−γＳとを反応させることにより行われる。通常、活性型ＣＤＫの存在下では、以下の（化１）に示すように、ＡＴＰ由来のモノリン酸基が、基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基に導入される。本実施形態では、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ−γＳを用いている。よって、活性型ＣＤＫの存在下で、基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にＡＴＰ−γＳ由来のチオリン酸基が導入される。これにより、基質タンパク質にチオール基を導入することができる。
【００３３】
【化１】
【００３４】
本実施形態の保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、標識物質とを反応させる際の反応は、前述のｐＨと同様でよい。またこの反応において、前述の緩衝液を用いることができる。この緩衝液にも同様にタンパク質分解酵素阻害剤などを添加することができる。
さらにこの反応は、１０分〜２時間でチオール基標識反応を行うことができる。この反応で用いられる標識物質及び保護物質の量は、前述と同様の量を添加すればよい。またこの反応は遊離のチオールを添加することで停止される。
【００３５】
標識された基質タンパク質を検出する方法としては、蛍光標識物質からの蛍光を検出する方法や、酵素との反応により生成した蛍光物質からの蛍光を検出する方法が挙げられる。具体的な方法については前述に記載の方法と同様である。これにより、目的物質である基質タンパク質を検出することができる。
【００３６】
本実施形態の活性の測定は、蛍光標識物質又は反応によって生成した蛍光物質の量を測定し、予め作製した検量線にあてはめて、活性型ＣＤＫの活性値が算出される。
予め作製する検量線は、チオール基を導入した既知量の基質タンパク質を用いて作製するのが好ましい。また蛍光標識物質又は酵素との反応に対する挙動が、チオール基を導入した基質タンパク質と同様であることが知られているビオチン化アクチン等が代わりに用いられてもよい。その際、活性型ＣＤＫの活性値はビオチン化アクチン等の量から換算される必要がある。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、チオール基標識方法及び試薬を用いたサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法について説明する。
【００３８】
実施例(チオール基標識方法を用いたＣＤＫ２の活性測定)
〔活性測定用試料の調製〕
５０ｍL遠沈管に、細胞数が１×１０８から１×１０９であるＫ５６２（白血病由来の培養細胞）を加えた。ここに細胞可溶化液（０．１ｗ／ｖ％ＮＰ−４０（界面活性剤ノニデットＰ−４０）、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を含む）を、２×１０７個の細胞数に対し１ｍＬの割合で加えた。
次に、ピペッティングにより細胞を可溶化し、２ｍＬのエッペンドルフチューブに２ｍＬずつ分注した。これらのチューブを遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、５分間）にかけ、上清を回収し、これを測定用試料とした。
なお、この測定用試料中に含まれる全タンパク質量をＤＣタンパク質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で測定した。
【００３９】
〔測定試料中のＣＤＫ２の捕捉〕
９６穴フィルタープレートの親水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社）の各ウェルに、免疫沈降用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％ＮＰ−４０及び５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）を７０μＬ加えた。
ここに抗ＣＤＫ２抗体を８μｇとプロテインＡをコートした５０ｖ／ｖ％セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社）を３０μＬ加えた。これにより、セファロースビーズと抗ＣＤＫ２抗体とを結合させた。
次に、測定用試料を、ウェル内の全タンパク質の濃度が２３μｇ／１５０μＬとなるように調節して、ウェル内に加えた。そして前記プレートを４℃で２時間振盪した。これにより、測定試料中のＣＤＫ２と、抗ＣＤＫ２抗体とを反応させた。
反応後、ウェル内のビーズを、ビーズ洗浄液Ａ（１ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０及び５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で二回洗浄した。次にビーズ洗浄液Ｂ（３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で一回洗浄した。そしてビーズ洗浄液Ｃ（５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で一回洗浄した。
【００４０】
〔チオール基の導入〕
ウェル内のビーズに、ＣＤＫの基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（カルビオケム社）、２ｍＭ ＡＴＰ−γＳ（カルビオケム社）、５４ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を加えた。基質溶液は、ウェルに収容した混合液の総量が５０μＬとなるように調節して加えた。これを３７℃で３０分間振盪してキナーゼ反応を行い、ヒストンＨ１にチオール基を導入した。キナーゼ反応後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を回収した。
【００４１】
〔蛍光標識試薬の調製〕
蛍光標識試薬Ａ及びＢを調製した。蛍光標識試薬Ａは、２８７ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、１．０３ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオロセイン（以下５−ＩＡＦという）、４．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４．３％ＤＭＳＯを含む溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの濃度がそれぞれ１、１０、４０ｍＭとなるように添加したものである。
蛍光標識試薬Ｂは、２８７ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮaＯＨ（ｐＨ７．４）、１．０３ｍＭ ５−ＩＡＦ、４．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４．３％ＤＭＳＯを含む溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの濃度がそれぞれ１、１０ｍＭとなるように添加したものである。
【００４２】
なお、バックグラウンド測定用として、抗ＣＤＫ２抗体の代わりに、ウサギＩｇＧ抗体を用いて同様の操作を行った。これにより、セファロースビーズとウサギＩｇＧ抗体とを結合させた。
【００４３】
〔蛍光標識反応〕
チオール基を導入したヒストンＨ１を含む、上記回収した上清に、蛍光標識試薬Ａ又はＢを加え、遮光条件下で２５℃、２０分間振盪した。これにより、ヒストンＨ１に導入されたチオール基の硫黄原子に、５−ＩＡＦを結合させた。標識反応後、５−ＩＡＦとチオール基との結合反応を停止するために、Ｎ−アセチルシステインを加えた。
次に、反応停止後の試料を４８μＬ（５−ＩＡＦが結合した基質タンパク質１．７６μｇを含む）採取した。ここにトリス緩衝生理食塩水（２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を１８０μＬ加えて希釈した。
希釈したサンプル２００μＬを、９６穴フィルタープレートの疎水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）の各ウェルにブロッティングした。
このメンブレンを２００μＬのメンブレン洗浄液（２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）で２回洗浄した。洗浄後、メンブレンの各ウェルにバックグラウンド低減用のブロッキング溶液（４ｗ／ｖ％ ＢＳＡ、２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を加えた。
その後、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅＦ−２００（テカン社製）を用いて、フィルタープレートの蛍光強度を測定した。蛍光強度は蛍光カウント値（単位はＣＮＴ）として表される。
【００４４】
比較例
比較例では、蛍光標識試薬Ａ又はＢにおいて、Ｎ−スクシンイミジルエステルを加えない試薬を用いた以外は実施例と同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００４５】
結果
実施例及び比較例において測定された蛍光強度のグラフを図１（蛍光標識試薬Ａ）及び図２(蛍光標識試薬Ｂ)に示す。バックグラウンド値は、ＩｇＧ抗体を用いて測定した蛍光強度である。ＣＤＫ２活性値は、抗ＣＤＫ２抗体を用いて測定した蛍光強度からバックグラウンド値を差し引いた値である。またＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）は、ＣＤＫ２活性値をバックグラウンド値で除した値である。
なおグラフは、比較例で測定された蛍光強度の蛍光カウント値を１００％としたときの相対値で示す。
【００４６】
図１及び図２より、蛍光標識試薬Ａ及びＢのいずれにおいても、ＮＨＳを加えたとき（実施例）は、ＮＨＳを加えなかったとき（比較例）よりも、バックグラウンドが低減していることを確認できた。またＮＨＳを加えたときでも、ＣＤＫ２の活性値が低下することはなかった。
そして、ＮＨＳを加えたときはＮＨＳを加えなかったときよりも、Ｓ／Ｎ比が向上していることが確認できた。
以上より、実施例の方法によって、従来よりも特異的にチオール基を標識でき、正確にチオール基が導入されたヒストンＨ１タンパク質を定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例及び比較例においてトリス緩衝液を用いて測定された蛍光強度のグラフである。
【図２】実施例及び比較例においてＭＯＰＳ緩衝液を用いて測定された蛍光強度のグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール基に結合する標識物質を用いた、目的物質を標識するための方法及び試薬に関する。さらに本発明は、チオール基に結合する標識物質を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ペプチド又は核酸等の生体分子の解析や検出等において、チオール基に結合する標識物質を用いて、目的とする生体分子のチオール基を標識することが、生物学や分子生物学等の分野で多用されている。
【０００３】
例えば、システインが有するチオール基やシステインにより形成されるジスルフィドは、タンパク質の立体構造やタンパク質の酵素活性に、大きく影響していることが知られている。そのため、チオール基やジスルフィドの位置を同定することは、タンパク質の構造又は活性を解析するときに重要である。例えば、チオール基に結合する標識物質を用いてタンパク質のチオール基を標識することで、タンパク質におけるチオール基の位置を同定する方法が知られている。
【０００４】
また、チオール基に結合する標識物質を用いて、サイクリン依存性キナーゼ（以下ＣＤＫという）の活性を測定する方法が知られている（特許文献１）。この測定方法では、まず、ＣＤＫ及びアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下ＡＴＰ−γＳという）を用いて、ＣＤＫの基質にチオール基を導入する。次に、基質に導入されたチオール基を、チオール基に結合する標識物質で標識する。そして、チオール基に結合する標識物質で標識された基質を測定することで、ＣＤＫの活性測定を行っている。
【０００５】
ここで、チオール基に結合する標識物質で、標識対象である目的物質を標識する場合、一般的に、過剰量の標識物質で目的物質と反応させる。この際、チオール基に結合する標識物質が、目的物質のアミノ基に、非特異的に結合してしまう場合がある。そのため、上記のタンパク質におけるチオール基の位置の同定やＣＤＫ活性測定を正確に行えない場合がある。
【０００６】
なお、白金化合物を用いて、目的物質のチオール基を特異的に標識する方法が知られている。この方法では、まずアニオンと目的物質のアミノ基とを結合させた後、白金化合物を用いて目的物質のチオール基を標識している。ここで、目的物質のアミノ基にはアニオンが結合しているため、白金化合物は目的物質のアミノ基には結合しない。そのため、目的物質のチオール基を、白金化合物で特異的に標識することができる。
【０００７】
しかしながら、特許文献２の方法は、アニオンと目的物質のアミノ基とを結合させる工程を行った後、目的物質のチオール基を白金化合物で標識する工程を行う必要がある。そのため、工程ごとに、試料の前処理や試薬のｐＨ調製といった操作が必要となる。結果として、作業が繁雑となり、時間を要するという問題があった。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−３３５９９７号公報
【特許文献２】特表２００４−５３０８８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、短時間で簡便に、目的物質のチオール基を、チオール基に結合する標識物質で、特異的に標識する方法及び試薬を提供することを目的とする。
さらに本発明は、上記のチオール基標識方法及び試薬を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする、チオール基標識方法；
（２）前記目的物質がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ、又はペプチド核酸である、（１）に記載のチオール基標識方法；
（３）前記保護物質がアミノ基と共有結合するための官能基を有する（１）又は（２）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（４）アミノ基と共有結合する官能基が、スクシンイミド又はイソチオシアネートである、（３）に記載のチオール基標識方法；
（５）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１）〜（４）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（６）前記標識物質が、チオール基と共有結合するための官能基を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（７）チオール基と共有結合する官能基が、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンである、（６）に記載のチオール基標識方法；
（８）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１）〜（７）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（９）チオール基に結合する標識物質が、蛍光標識物質又は酵素標識物質である、（１）〜（８）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（１０）前記反応がｐＨ６．５〜８．５で行われる、（１）〜（９）のいずれかに記載のチオール基標識方法；
（１１）チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする、チオール基標識用試薬；
（１２）前記溶液のｐＨが６．５〜８．５である、（１１）に記載のチオール基標識用試薬；
（１３）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１１）又は（１２）のいずれかに記載のチオール基標識用試薬；
（１４）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載のチオール基標識用試薬；
（１５）試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１６）前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、（１５）に記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１７）前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、（１５）又は（１６）のいずれかに記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
（１８）反応工程が、ｐＨ６．５〜８．５で行われる、（１５）〜（１７）のいずれかに記載のサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法；
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、短時間で簡便に、目的物質のチオール基を、チオール基に結合する標識物質で、特異的に標識する方法及び試薬が提供される。
さらに本発明によると、上記のチオール基標識方法及び試薬を用いた、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態である、チオール基標識方法は、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする。
【００１３】
本実施形態において目的物質とは、チオール基に結合する標識物質による標識の対象となる物質であれば特に限定されない。具体的には、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ又はペプチド核酸などが挙げられる。この中で好ましくはタンパク質である。目的物質がチオール基を有さない場合には、目的物質にチオール基を導入することにより、標識物質と目的物質との結合が可能になる。例えば、目的物質がチオール基を有さないタンパク質である場合、このタンパク質を基質とするキナーゼとアデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下ＡＴＰγＳとする）とを用いてこのタンパク質にチオール基を導入することができる。
【００１４】
本実施形態において、アミノ基に結合する保護物質は、チオール基に結合する標識物質と目的物質のチオール基との結合を阻害せず、チオール基に結合する標識物質と目的物質のアミノ基との結合を防ぐ物質であればよい。好ましくはアミノ基と共有結合するための官能基を有している保護物質である。アミノ基と共有結合する官能基としては、スクシンイミド、イソチオシアネートなどが挙げられる。好ましくはスクシンイミド基である。具体的な保護物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルやフェニルイソチオシアネートなどが挙げられる。
【００１５】
本実施形態において、チオール基に結合する標識物質は、目的物質のチオール基と結合し、目的物質を検出できるものであれば良い。好ましくはチオール基と共有結合するための官能基を有している標識物質である。チオール基と共有結合する官能基としては、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンなどが挙げられる。好ましくは、アルキルハライド基である。
【００１６】
また、チオール基に結合する標識物質は、蛍光標識物質であっても酵素標識物質であってもよい。蛍光標識物質に用いられる蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミンなどが挙げられる。そのうち、フルオレセインが好ましい。具体的な蛍光標識物質としては、ヨードアセチル−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（６−ＩＡＦ）、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、エオシン−５−マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミド、１−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（ＰＭＩＡ アミド）、１−ピレンメチルヨードアセテート（ＰＭＩＡ エステル）、ローダミンレッドＣ２マレンイミドなどが挙げられる。このうち、５−ヨードアセトアミドフルオレセインが好ましい。
標識物質として蛍光標識物質を用いる場合、まず目的物質と蛍光標識物質とを結合させる。次に蛍光物質を特定の波長で励起させて、蛍光を検出する。例えば蛍光物質がフルオレセインの場合、フルオレセインに４８８ｎｍの波長を照射して励起させ、蛍光画像解析装置で検出する。これにより、目的物質を検出することができる。
【００１７】
酵素標識物質に用いられる酵素としては、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼなどが挙げられる。そのうち、ペルオキシダーゼが好ましい。
標識物質として酵素標識物質を用いる場合、まず目的物質と酵素標識物質とを結合させる。次に酵素標識物質で標識された目的物質に、酵素との反応によって発光が生じるような試薬を加える。次に試薬と酵素とを反応させて、発光を生じさせ検出する。これにより、目的物質を検出することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、試薬としてはＥＣＬ−プラス（アマシャム・バイオサイエンス社）が挙げられる。なお、試薬は使用する酵素に合わせて適宜選択することができる。
【００１８】
本実施形態の、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質との反応では、標識物質が目的物質のチオール基に結合する反応を阻害せず、標識物質とアミノ基との意図しない結合反応よりも保護物質が十分に目的物質のアミノ基に結合できるｐＨである必要がある。また、目的物質が生体物質である場合、生体物質の構造変化等を防ぐためには、ｐＨは中性付近が好ましい。特に目的物質がタンパク質である場合、実験内容により、ｐＨによるタンパク質の変性を防ぐ必要がある。そのため、標識物質及び保護物質と目的物質との反応は、中性付近で行われる必要がある。より具体的には、ｐＨは６．５〜８．５で反応させることが好ましい。さらに好ましくはｐＨ７．０〜７．５である。上記ｐＨの範囲で反応が行われる標識物質としては、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、テトラメチルローダミンヨードアセトアミド、テキサスレッドマレイミドなどが挙げられる。また上記ｐＨの範囲で反応が行われる保護物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、イソチオシアネートなどが挙げられる。
この反応では前記ｐＨの範囲で緩衝能を有する緩衝液を用いることができる。具体的にはトリス緩衝液やモルフォリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液などが挙げられる。またこの緩衝液には、タンパク質分解酵素阻害剤を添加してもよい。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。
【００１９】
さらにこの反応は、通常１０分〜２時間でチオール基標識反応を行うことができる。この反応で用いられる標識物質及び保護物質の量は、目的物質の量に応じて添加する。例えば目的物質としてヒストンＨ１タンパク質、標識物質として５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、保護物質としてＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用いる場合、目的物質のタンパク質１当量に対して、標識物質は５０〜５００当量、保護物質は１００〜２０００当量が添加される。
そしてこの反応は、遊離のチオール、例えばβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−アセチルシステインなどが添加されて停止される。
【００２０】
本発明の一実施形態である、チオール基標識用試薬は、チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする。
【００２１】
本実施形態のチオール基標識試薬のｐＨとしては、前述と同様のｐＨでよい。またこの溶液には、前述の緩衝液を用いることができる。この緩衝液にも同様にタンパク質分解酵素阻害剤を添加することができる。
【００２２】
本発明の一実施形態である、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法は、試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む。
【００２３】
本実施形態で用いられる試料は、生体細胞からサイクリン依存性キナーゼの活性を測定するために調製された試料であることが好ましい。生体細胞は、組織サンプル（バイオプシーサンプルや外科切除サンプル等）のようなヒトを含む動物由来の細胞を用いるのが好ましい。
サイクリン依存性キナーゼ（以下ＣＤＫという）は、細胞質中に存在しており、核内のサイクリンと結合する。そして、サイクリン依存性キナーゼとサイクリンとの複合体（以下、活性型ＣＤＫという）を形成し、活性化状態となる。よって活性測定の対象となるＣＤＫは細胞の内部に含まれている。このため測定するための試料を調製するときには、細胞膜及び核膜を破壊し、ＣＤＫを試料中に遊離させた状態で存在させることが好ましい。つまりＣＤＫと基質タンパク質との反応を行う前に、生体細胞に対して可溶化処理を行うことが好ましい。
【００２４】
可溶化処理は、生体細胞に可溶化処理用の緩衝液（以下細胞可溶化液とする）を添加して行うことが好ましい。この緩衝液は前述と同様のものを用いることができる。細胞可溶化液には、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤や脱リン酸化酵素阻害剤などを含有させることができる。具体的な可溶化処理の方法としては、細胞可溶化液を細胞に添加し、ワーリングブレンダーによる粉砕処理、シリンジによる吸引排出処理又は超音波処理を行う。これにより、生体細胞に対して可溶化処理を行うことができる。
【００２５】
界面活性剤は、細胞膜及び核膜を破壊して細胞内物質を取り出すために用いられる。ただし、活性型ＣＤＫを分解させない程度の界面活性を有するものが用いられる。例えば、ノニデットＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸又はＣＨＡＰＳなどが挙げられる。界面活性剤濃度は、１ｗ／ｖ％以下が好ましい。
【００２６】
タンパク質分解酵素阻害剤は、破壊された細胞膜や核膜などの細胞内物質が混在するとき、タンパク質であるＣＤＫやサイクリン分子が破壊されるのを防ぐために用いられる。例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡのようなメタロプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシンのようなセリンプロテアーゼ阻害剤又はヨードアセトアミド、Ｅ−６４のようなシステインプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。また、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）のようなそれらタンパク質分解酵素阻害剤を予め混合した市販品も挙げられる。
【００２７】
脱リン酸化酵素阻害剤は、細胞に含まれる脱リン酸化酵素が、測定対象の酵素の活性を低下させることを防ぐ目的で用いられる。例えば、セリン／スレオニン脱リン酸化酵素阻害剤（フッ化ナトリウムなど）、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤（オルトバナジン酸ナトリウムなど）などが挙げられる。溶解緩衝液にはこれらの脱リン酸化酵素阻害剤を単独又は混合して用いることができる。
【００２８】
本実施形態のＣＤＫとは、具体的には、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７及びＣＤＫ８等が例示される。
【００２９】
可溶化処理を行った細胞から測定目的の活性型ＣＤＫを抽出する方法として、例えば免疫沈降法がある。免疫沈降法では、目的の各種ＣＤＫ１〜８のいずれか一つに特異性を有する抗ＣＤＫ抗体が用いられる。
【００３０】
より詳細には、所定量のタンパク質を含む細胞可溶化液に、測定目的の活性型ＣＤＫに対応する抗ＣＤＫ抗体と、その抗ＣＤＫ抗体を捕捉するための材料としてプロテインＡ、プロテインＧまたは抗ウサギＩｇＧ抗体をコートしたセファロースビーズとの懸濁液を０〜１０℃で１〜２時間反応させる。これらビーズは不溶性なので、ビーズに結合した抗ＣＤＫ抗体とＣＤＫの複合体は不溶性となり沈降する。このビーズを回収することで測定目的の活性型ＣＤＫを抽出することができる。
【００３１】
本実施形態で用いられる基質タンパク質は、活性測定の対象となる酵素の基質となるものであれば特に限定されない。例えば、活性測定の対象となる酵素がＣＤＫ１又はＣＤＫ２である場合、基質タンパク質としては、ヒストンＨ１又は網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下Ｒｂとする）を用いることが好ましい。また、酵素がＣＤＫ４又はＣＤＫ６である場合は、基質タンパク質としてＲｂを用いることが好ましい。この基質タンパク質は、硫黄原子を含まないアミノ酸（システイン及びメチオニン以外のアミノ酸）から構成されるタンパク質が好ましい。Ｒｂのようなシステイン残基を含むタンパク質は、システイン残基をアラニンなどの硫黄原子を含まないアミノ酸に置換して用いることが好ましい。基質中のシステイン又はメチオニン残基を、硫黄原子を含まないアミノ酸に置換する方法としては、ＰＣＲ法や部分点突然変異法などの公知の方法を用いて行うことができる。
【００３２】
本実施形態においてＣＤＫの基質タンパク質にチオール基を導入する工程は、活性型ＣＤＫの存在下で、ＣＤＫの基質タンパク質とＡＴＰ−γＳとを反応させることにより行われる。通常、活性型ＣＤＫの存在下では、以下の（化１）に示すように、ＡＴＰ由来のモノリン酸基が、基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基に導入される。本実施形態では、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ−γＳを用いている。よって、活性型ＣＤＫの存在下で、基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にＡＴＰ−γＳ由来のチオリン酸基が導入される。これにより、基質タンパク質にチオール基を導入することができる。
【００３３】
【化１】
【００３４】
本実施形態の保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、標識物質とを反応させる際の反応は、前述のｐＨと同様でよい。またこの反応において、前述の緩衝液を用いることができる。この緩衝液にも同様にタンパク質分解酵素阻害剤などを添加することができる。
さらにこの反応は、１０分〜２時間でチオール基標識反応を行うことができる。この反応で用いられる標識物質及び保護物質の量は、前述と同様の量を添加すればよい。またこの反応は遊離のチオールを添加することで停止される。
【００３５】
標識された基質タンパク質を検出する方法としては、蛍光標識物質からの蛍光を検出する方法や、酵素との反応により生成した蛍光物質からの蛍光を検出する方法が挙げられる。具体的な方法については前述に記載の方法と同様である。これにより、目的物質である基質タンパク質を検出することができる。
【００３６】
本実施形態の活性の測定は、蛍光標識物質又は反応によって生成した蛍光物質の量を測定し、予め作製した検量線にあてはめて、活性型ＣＤＫの活性値が算出される。
予め作製する検量線は、チオール基を導入した既知量の基質タンパク質を用いて作製するのが好ましい。また蛍光標識物質又は酵素との反応に対する挙動が、チオール基を導入した基質タンパク質と同様であることが知られているビオチン化アクチン等が代わりに用いられてもよい。その際、活性型ＣＤＫの活性値はビオチン化アクチン等の量から換算される必要がある。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、チオール基標識方法及び試薬を用いたサイクリン依存性キナーゼの活性測定方法について説明する。
【００３８】
実施例(チオール基標識方法を用いたＣＤＫ２の活性測定)
〔活性測定用試料の調製〕
５０ｍL遠沈管に、細胞数が１×１０８から１×１０９であるＫ５６２（白血病由来の培養細胞）を加えた。ここに細胞可溶化液（０．１ｗ／ｖ％ＮＰ−４０（界面活性剤ノニデットＰ−４０）、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を含む）を、２×１０７個の細胞数に対し１ｍＬの割合で加えた。
次に、ピペッティングにより細胞を可溶化し、２ｍＬのエッペンドルフチューブに２ｍＬずつ分注した。これらのチューブを遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、５分間）にかけ、上清を回収し、これを測定用試料とした。
なお、この測定用試料中に含まれる全タンパク質量をＤＣタンパク質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で測定した。
【００３９】
〔測定試料中のＣＤＫ２の捕捉〕
９６穴フィルタープレートの親水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社）の各ウェルに、免疫沈降用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％ＮＰ−４０及び５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）を７０μＬ加えた。
ここに抗ＣＤＫ２抗体を８μｇとプロテインＡをコートした５０ｖ／ｖ％セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社）を３０μＬ加えた。これにより、セファロースビーズと抗ＣＤＫ２抗体とを結合させた。
次に、測定用試料を、ウェル内の全タンパク質の濃度が２３μｇ／１５０μＬとなるように調節して、ウェル内に加えた。そして前記プレートを４℃で２時間振盪した。これにより、測定試料中のＣＤＫ２と、抗ＣＤＫ２抗体とを反応させた。
反応後、ウェル内のビーズを、ビーズ洗浄液Ａ（１ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０及び５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で二回洗浄した。次にビーズ洗浄液Ｂ（３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で一回洗浄した。そしてビーズ洗浄液Ｃ（５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を含む）で一回洗浄した。
【００４０】
〔チオール基の導入〕
ウェル内のビーズに、ＣＤＫの基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（カルビオケム社）、２ｍＭ ＡＴＰ−γＳ（カルビオケム社）、５４ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を加えた。基質溶液は、ウェルに収容した混合液の総量が５０μＬとなるように調節して加えた。これを３７℃で３０分間振盪してキナーゼ反応を行い、ヒストンＨ１にチオール基を導入した。キナーゼ反応後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を回収した。
【００４１】
〔蛍光標識試薬の調製〕
蛍光標識試薬Ａ及びＢを調製した。蛍光標識試薬Ａは、２８７ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、１．０３ｍＭ ５−ヨードアセトアミドフルオロセイン（以下５−ＩＡＦという）、４．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４．３％ＤＭＳＯを含む溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの濃度がそれぞれ１、１０、４０ｍＭとなるように添加したものである。
蛍光標識試薬Ｂは、２８７ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮaＯＨ（ｐＨ７．４）、１．０３ｍＭ ５−ＩＡＦ、４．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４．３％ＤＭＳＯを含む溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの濃度がそれぞれ１、１０ｍＭとなるように添加したものである。
【００４２】
なお、バックグラウンド測定用として、抗ＣＤＫ２抗体の代わりに、ウサギＩｇＧ抗体を用いて同様の操作を行った。これにより、セファロースビーズとウサギＩｇＧ抗体とを結合させた。
【００４３】
〔蛍光標識反応〕
チオール基を導入したヒストンＨ１を含む、上記回収した上清に、蛍光標識試薬Ａ又はＢを加え、遮光条件下で２５℃、２０分間振盪した。これにより、ヒストンＨ１に導入されたチオール基の硫黄原子に、５−ＩＡＦを結合させた。標識反応後、５−ＩＡＦとチオール基との結合反応を停止するために、Ｎ−アセチルシステインを加えた。
次に、反応停止後の試料を４８μＬ（５−ＩＡＦが結合した基質タンパク質１．７６μｇを含む）採取した。ここにトリス緩衝生理食塩水（２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を１８０μＬ加えて希釈した。
希釈したサンプル２００μＬを、９６穴フィルタープレートの疎水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）の各ウェルにブロッティングした。
このメンブレンを２００μＬのメンブレン洗浄液（２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）で２回洗浄した。洗浄後、メンブレンの各ウェルにバックグラウンド低減用のブロッキング溶液（４ｗ／ｖ％ ＢＳＡ、２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を加えた。
その後、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅＦ−２００（テカン社製）を用いて、フィルタープレートの蛍光強度を測定した。蛍光強度は蛍光カウント値（単位はＣＮＴ）として表される。
【００４４】
比較例
比較例では、蛍光標識試薬Ａ又はＢにおいて、Ｎ−スクシンイミジルエステルを加えない試薬を用いた以外は実施例と同様にして蛍光強度の測定を行った。
【００４５】
結果
実施例及び比較例において測定された蛍光強度のグラフを図１（蛍光標識試薬Ａ）及び図２(蛍光標識試薬Ｂ)に示す。バックグラウンド値は、ＩｇＧ抗体を用いて測定した蛍光強度である。ＣＤＫ２活性値は、抗ＣＤＫ２抗体を用いて測定した蛍光強度からバックグラウンド値を差し引いた値である。またＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）は、ＣＤＫ２活性値をバックグラウンド値で除した値である。
なおグラフは、比較例で測定された蛍光強度の蛍光カウント値を１００％としたときの相対値で示す。
【００４６】
図１及び図２より、蛍光標識試薬Ａ及びＢのいずれにおいても、ＮＨＳを加えたとき（実施例）は、ＮＨＳを加えなかったとき（比較例）よりも、バックグラウンドが低減していることを確認できた。またＮＨＳを加えたときでも、ＣＤＫ２の活性値が低下することはなかった。
そして、ＮＨＳを加えたときはＮＨＳを加えなかったときよりも、Ｓ／Ｎ比が向上していることが確認できた。
以上より、実施例の方法によって、従来よりも特異的にチオール基を標識でき、正確にチオール基が導入されたヒストンＨ１タンパク質を定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例及び比較例においてトリス緩衝液を用いて測定された蛍光強度のグラフである。
【図２】実施例及び比較例においてＭＯＰＳ緩衝液を用いて測定された蛍光強度のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする、チオール基標識方法。
【請求項２】
前記目的物質がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ、又はペプチド核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記保護物質がアミノ基と共有結合するための官能基を有する請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
アミノ基と共有結合する官能基が、スクシンイミド又はイソチオシアネートである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、チオール基と共有結合するための官能基を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
チオール基と共有結合する官能基が、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
チオール基に結合する標識物質が、蛍光標識物質又は酵素標識物質である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記反応がｐＨ６．５〜８．５で行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、
アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする、チオール基標識用試薬。
【請求項１２】
前記溶液のｐＨが６．５〜８．５である、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１１又は１２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、
アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、
標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、
検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法。
【請求項１６】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１５又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
反応工程が、ｐＨ６．５〜８．５で行われる、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
アミノ基に結合する保護物質の存在下で、目的物質とチオール基に結合する標識物質とを反応させることを特徴とする、チオール基標識方法。
【請求項２】
前記目的物質がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、Ｓオリゴ、又はペプチド核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記保護物質がアミノ基と共有結合するための官能基を有する請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
アミノ基と共有結合する官能基が、スクシンイミド又はイソチオシアネートである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、チオール基と共有結合するための官能基を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
チオール基と共有結合する官能基が、アルキルハライド、アリールハライド、マレイミド又はアジリジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
チオール基に結合する標識物質が、蛍光標識物質又は酵素標識物質である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記反応がｐＨ６．５〜８．５で行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
チオール基に結合する標識物質で目的物質を標識する試薬であって、
アミノ基に結合する保護物質と、チオール基に結合する標識物質とを含有する溶液を含むことを特徴とする、チオール基標識用試薬。
【請求項１２】
前記溶液のｐＨが６．５〜８．５である、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１１又は１２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の試薬。
【請求項１５】
試料中のサイクリン依存性キナーゼの酵素活性により、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を用いて、サイクリン依存性キナーゼの基質タンパク質にチオール基を導入する工程と、
アミノ基に結合する保護物質の存在下で、チオール基が導入された基質タンパク質と、チオール基に結合する標識物質とを反応させる工程と、
標識物質で標識された基質タンパク質を検出する工程と、
検出工程で得られた検出結果に基づいて、サイクリン依存性キナーゼの活性を測定する工程とを含む、サイクリン依存性キナーゼの活性測定方法。
【請求項１６】
前記保護物質が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識物質が、５−ヨードアセトアミドフルオレセインである、請求項１５又は１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
反応工程が、ｐＨ６．５〜８．５で行われる、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−５１２８９（Ｐ２０１０−５１２８９Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２２６２４（Ｐ２００８−２２２６２４）
【出願日】平成２０年８月２９日（２００８．８．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２９日（２００８．８．２９）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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