チャ輪斑病に対する防除能を有する新規なグリオクラディウム属菌及びそれを用いた生物防除方法
【課題】チャ輪斑病に対して従来の化学合成農薬と同等の防除効果を有する微生物農薬及びそれを用いた生物防除方法を開発すること。
【解決手段】チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を茶樹に散布することを特徴とするチャ輪斑病の防除方法、並びに前記微生物として好適な新規微生物菌株であるグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）KGR-1（NITE P-1084）を提供する。
【解決手段】チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を茶樹に散布することを特徴とするチャ輪斑病の防除方法、並びに前記微生物として好適な新規微生物菌株であるグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）KGR-1（NITE P-1084）を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチャ輪斑病の生物防除技術に関し、詳しくは、チャ輪斑病に対する防除能を有する新規なグリオクラディウム属菌及びそれを用いた生物防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害の分野では、特定の微生物により特定の病原菌による発病が抑制される場合に、その微生物を拮抗微生物と呼んでいる。
植物病害防除を目的として販売される資材は農薬として農薬取締法により規定されており、経済的に有効な病害防除能を有する拮抗微生物は微生物農薬として開発され、登録・販売される。
【０００３】
細菌では非病原性エルビニア・カロトボーラ、バチルス・ズブチリス、シュードモナス・フルオレッセンスなど、糸状菌ではタラノマイセス・フラバス、トリコデルマ・アトロビリデなどが微生物農薬として登録、販売されてきた。
これらは主に作物としては野菜、果樹、イネが対象で、病害としては灰色かび病、うどんこ病、炭疽病、軟腐病、イネ種子伝染性病害が対象である（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
グリオクラディウム菌については土壌病原菌に対する拮抗微生物として注目され、Gliocladium catenulatumなどでの報告がある（例えば非特許文献２参照）。また、日本では（株）出光興産からグリオクラディウム菌を利用した土壌改良資材が販売されている（例えば特許文献１参照）。2005年にはグリオクラディウム・ロゼウムを用いた柑橘病害に対する生物防除法が公開されている（例えば特許文献２参照）が、グリオクラディウム・ロゼウムがチャの病害に対して防除効果を有することはこれまで知られていなかった。
【０００５】
チャ輪斑病に対する生物防除法としては、非特許文献３にチャ赤葉枯病菌が輪斑病の発生を抑制することを報告し、輪斑病の生物防除資材として有効ではないかと提言している。チャ赤葉枯病菌はその名の通り病原菌であり、病原性は弱いものの、樹体が何らかの理由で衰弱した時には被害を与えるため、実用化には至らなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−７３３０９号公報
【特許文献２】特開２００５−７３５８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】百町満朗監修、「拮抗微生物による作物病害の生物防除」、クミアイ化学工業株式会社、2003年
【非特許文献２】Mcquilken et al., Journal of phytopathology,2001,149,p.171-178
【非特許文献３】安藤・成澤、日本植物病理学会報、第55巻、p.267-274、1989年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、生物多様性を保全しながら安定した農業生産を行い、安全・安心な農産物を生産するために、環境保全型の病害防除技術の開発が求められている。微生物農薬は農家が化学合成農薬に替えて使いやすい環境保全型防除資材であり、その開発が期待されている。
微生物農薬は化学合成農薬に比べて、一般に環境負荷が低い、人畜毒性が低いおよび耐性菌の発達が少ないなどの利点があるものの、生物であるため長期保存がしにくい、製造コストが高いなどの問題点がある。特に化学合成農薬に比較して防除効果はやや低い場合が多く、防除効果を安定させるために、その使用場面も苗・種子への処理や施設栽培など限られた使用法や使用環境であることが多い。
【０００９】
チャ（Camellia sinensis）では炭疽病、輪斑病、赤焼病、褐色円星病、もち病などの病害が発生し、病原糸状菌によって引き起こされる炭疽病と輪斑病を主な防除対象とした化学合成農薬による防除体系が確立されている。
栽培面積の約７割を占める主力品種「やぶきた」が強い病害抵抗性を持たないことから、抵抗性品種の利用が有効であるが、「やぶきた」以外の抵抗性品種への転換は進んでおらず、栽培管理の一環として行われる整枝による葉や枝の物理的除去以外に化学農薬の代替えになる防除技術はほとんどない。
【００１０】
また近年、我が国における茶生産の大半を占める静岡県と鹿児島県においてストロビルリン系殺菌剤に対する耐性を獲得した輪斑病菌が発見され、基幹防除剤として使われていた同系統の農薬は使用が困難な状況になりつつある。他の登録農薬はあるものの、剤の数が少ないことから新たな防除資材の開発が求められている。
チャの病害に対して登録のある微生物農薬は存在せず、防除効果の高い微生物農薬が開発されれば、チャの環境保全型防除に有効な資材となると考えられる。
【００１１】
そこで本発明は、チャ輪斑病に対して従来の化学合成農薬と同等又はそれ以上の防除効果を有する微生物農薬及びそれを用いた生物防除方法を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、チャ輪斑病菌Pestalotiopsis longisetaに対する拮抗微生物として新規のグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）菌株KGR-1の単離に成功した。
【００１３】
チャの葉面に傷を付けてそこにチャ輪斑病菌を人工的に感染させ、続いてそこにKGR-1を接種したところ、図１に示されるように輪斑病の病斑拡大は阻止された。
また、この新菌株の胞子を摘採（収穫）後の茶樹に噴霧することにより、チャ輪斑病の発病葉数を無処理の場合の2〜20％程度に抑えることができることを明らかにした。一方、従来の化学合成農薬で処理した際の発病葉数は、無処理の場合の0〜10％となる。
【００１４】
これらの知見に基づいて、本願発明者らは、当該新菌株の菌体や培養物、代謝産物、胞子をチャ輪斑病に対する生物的防除資材として利用することを着想し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本願請求項１に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である。
本願請求項２に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を含有することを特徴とする、チャ輪斑病防除剤である。
本願請求項３に係る発明は、前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項２に記載のチャ輪斑病防除剤である。
【００１６】
本願請求項４に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは請求項２又は３に記載のチャ輪斑病防除剤を茶樹に散布することを特徴とする、チャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項５に係る発明は、前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項４に記載のチャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項６に係る発明は、前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布量が、胞子数として0.01〜5.0×10９個／ｍ２である、請求項４又は５に記載のチャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項７に係る発明は、前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布時期が、茶の摘採後９時間以内である、請求項４〜６のいずれかに記載のチャ輪斑病の防除方法である。
【発明の効果】
【００１７】
チャに登録のある農薬の中で、病害防除のための微生物農薬はないことから、本発明によって環境保全型防除体系を構築するための有効な資材が提供される。しかも、微生物農薬は化学合成農薬よりも防除効果が劣ることが多いが、本発明は化学合成農薬と同等又はそれ以上の防除効果を得ることができ、しかもチャに対して病原性を示さないため、極めて画期的な防除資材といえる。
【００１８】
また輪斑病防除では、収穫直後の茶樹に防除資材を散布することが最も有効とされているが、微生物農薬は一般に残留等の問題がないため、本発明によって収穫直後の散布による周囲の未収穫茶園へのドリフト問題を解決できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】KGR-1がチャ輪斑病の病斑進展に及ぼす影響を示す写真像図である。
【図２】実施例２におけるチャ輪斑病に対するKGR-1の圃場での防除効果を示す写真像図である。左側はKGR-1散布区、右側は無散布区での様子を示す。
【図３】実施例３におけるKGR-1の処理時期により防除価に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物（以下、「拮抗微生物」または「拮抗菌」と呼ぶこともある。）は、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属し、チャ輪斑病菌に対する防除能を有することを特色とする。
グリオクラディウム属菌は一般に土壌病原菌に対する拮抗微生物として知られていることから、土壌ではなく、茶樹の葉面に接種してチャ輪斑病に対する防除効果を発揮できるということは、全く予想外のことであった。
【００２１】
グリオクラディウム・ロゼウムは、チャ輪斑病菌に対する菌寄生菌として、チャ輪斑病の自然発病葉からprecolonized plate baiting法などにより、容易に分離することができる。precolonized plate baiting法については、以下の実施例１において詳述する。
また、分離したグリオクラディウム・ロゼウム菌株の中から、チャ輪斑病菌に対する拮抗能が高く、チャ輪斑病に対する強い防除効果を示す菌株の選抜は、例えば実施例１で記載したような輪斑病病斑長を指標とした室内検定試験によって、当業者であれば容易に行うことができる。
【００２２】
本発明に係る新規なグリオクラディウム属菌株は、上記の方法により分離されたグリオクラディウム・ロゼウム菌株KGR-1である。本菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、寄託番号はNITE P-1084である。
本発明のKGR-1菌株は、化学合成農薬とほぼ同等の高い輪斑病防除効果を有し、圃場試験においてチャ輪斑病の発病葉数を無処理の場合の2〜20％程度に抑えることができるが、チャに対しては病原性を示さない拮抗微生物である。
【００２３】
KGR-1菌株のrDNAのITS領域塩基配列の解析を行ったところ、Nectria gliocladioides（アナモルフ：Gliocladium roseum）、異名：Bionectria ochroleuca（アナモルフ：Clonostachys rosea）の塩基配列と一致した。
また、本菌株の培地上での生育はやや遅い。菌叢は初め白色綿毛状で、後に淡橙色となり、菌叢表面に多くの分生子が形成され粉状に見える。分生子の形成は、Verticillium型およびGliocladium型の分生子梗を形成する。Gliocladium型の分生子梗上のフィアライドから連鎖状に分生子が形成され、これが粉状に見える。分生子は5.0×2.9μｍの楕円形である。1ヶ月以上培養すると、橙色で直径150〜300（平均220）μｍの球形の子のう殻の集合体を形成する。集合体は直径2〜5mmで、大きさや形には幅がある。子のう胞子は２胞で約10×4μｍであり、中央がやや細くなっている。
これらの特徴などから、KGR-1菌株は上記の菌と同定された。拮抗微生物としてはグリオクラディウム属の名前が有名なので、以下、本菌株の種名はグリオクラディウム・ロゼウムと記載する。
【００２４】
KGR-1菌株の培養方法は特に限定されず、グリオクラディウム属の微生物に一般的に適用されている方法によって培養することができる。
培地としては、例えばショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地（PSA 培地）、ブドウ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地（PDA培地）、オートミール寒天培地などを使用することができる。培養温度は特に限定されないが、20〜25℃とするのが好ましい。
【００２５】
本発明のチャ輪斑病防除剤は、前記拮抗微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を有効成分として含有する。
本発明において代謝産物とは、微生物の培養中に、微生物が培地中に分泌あるいは微生物体内に蓄積する物質を指し、例えば抗生物質や酵素などのタンパク質や、炭化水素などがこれに含まれる。グリオクラディウム・ロゼウムの代謝産物として実際に報告されている例としては、ペプチド系抗生物質（Journal of applied microbiology, Vol.110, p.1177-1186, 2011）、キチナーゼ、エンドグルカナーゼ（FEMS Microbiol. Lett. Vol.285, No.1, p.101-110, 2008）などが挙げられる。
【００２６】
製剤中には拮抗微生物以外の成分が含まれていてもよい。このような拮抗微生物以外の成分としては、例えば、溶媒、担体、安定化剤、増殖補助剤、界面活性剤、分散剤などを挙げることができる。
製剤中の拮抗微生物濃度は特に限定されないが、胞子濃度として0.01〜10×10７個／mlとするのが好ましく、0.5〜1.0×10７個／mlとするのがより好ましい。
【００２７】
本発明に係るチャ輪斑病の防除方法は、前記拮抗微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記のチャ輪斑病防除剤を、茶樹の葉面に散布することを特徴とする。
散布量はチャ輪斑病を防除できる範囲内であれば特に限定されないが、通常は圃場１ｍ２当たり100〜500ml、好ましくは300〜400mlとする。また拮抗菌胞子数としては、圃場１ｍ２当たり0.01〜5.0×10９個、好ましくは1.5〜4.0×10９個となるように散布する。
【００２８】
散布時期は、従来の化学農薬による輪斑病防除法と同様に、茶の摘採（収穫）直後とするのが効果的である。具体的には摘採後９時間以内、より好ましくは６時間以内に散布すると高い防除効果が得られるが、摘採後１日以内であっても一定の効果は期待できる。
散布方法は特に限定されず、通常の農薬散布に用いるような噴霧器などで茶樹の葉面に散布すればよい。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１（KGR-1 菌株の分離）
茶園から採取したチャ輪斑病の自然発病葉からprecolonized plate baiting 法にて、チャ輪斑病に対する拮抗微生物を分離した。
すなわち、あらかじめショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天平板培地（PSA 培地、ジャガイモ200ｇの浸出液１リットルにショ糖20ｇ、寒天15ｇを添加）に培養したチャ輪斑病菌菌叢上に、採取したチャ葉の輪斑病病斑部分を5mm 大の大きさに切って、25℃で10日間静置した。病斑片に輪斑病菌に寄生する（病原菌を食べる）微生物が存在すると、培地上に生えている輪斑病菌を餌にしてその微生物が生えてくるので、輪斑病菌菌叢上に形成された拮抗微生物と思われる微生物の胞子を分離し、別のPSA培地に移植して、培養することにより複数の菌株を得た。
【００３１】
次に、上記で得られた菌株の中から、室内検定により特に輪斑病菌に対する防除効果の高い菌株を選抜した。
すなわち、上記で得られた菌株（拮抗菌株）をPSA 培地で25℃、2週間培養し、生育した菌叢の先端を径6mm のコルクボーラーで打ち抜いて含菌寒天片を得た。輪斑病菌についても同じ培地で25℃、1週間培養後に同様に含菌寒天片を得た。
【００３２】
茶園から採取した健全なチャ葉5枚（木化した枝についているやや硬化した葉、品種：「やぶきた」）を高湿度状態に保った容器に並べ、プラスのドライバーで中肋を挟んで両側の1個所ずつ計2個所付傷した。拮抗菌株の含菌寒天片を、菌叢面を葉の付傷部に密着させるようにして置き、25℃で1日静置後に除去した。続いて、輪斑病菌の含菌寒天片も同様に付傷部に置き、25 ℃で1日静置後に除去した。なお、対照として、拮抗菌株含菌寒天片の代わりにPAS培地片を置いた。
以後、葉は水を含ませたスポンジ状の資材に挿して25 ℃、照明条件下で管理して、2週間後に輪斑病の発病を調査し、拮抗菌株による防除効果を調査した。試験は3回行った。
【００３３】
防除効果は、付傷接種部から伸長した楕円形状の輪斑病病斑10 個について、長径部の長さ（病斑長）を測定して平均値を算出し、輪斑病菌のみ接種した葉での病斑長と比較して評価した。供試した拮抗菌株の中から特に高い防除効果を示した1菌株を選抜し、KGR-1と命名した。
KGR-1菌株についての室内検定試験の結果を表１に示す。KGR-1 を処理すると病斑の伸長は完全に抑制されることから、KGR-1には輪斑病に対する極めて高い防除効果があることが判明した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
実施例２（屋外における防除効果試験）
試験は独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所 金谷茶業研究拠点内の茶園（品種：「やぶきた」）で、2007年7月〜9月にかけて2回行った。
【００３６】
すなわち、KGR-1 菌株をPSA 培地で25 ℃で3〜4週間培養した後、流水をかけながら筆で菌叢の表面の気中菌糸を除去し、25 ℃、照明下に1週間置いて表面に胞子（分生子）を形成させた。この胞子を集めて水道水に懸濁させて胞子懸濁液を作り、胞子濃度をおよそ1.0 × 10７個／ ml に調整して以下の試験に用いた。
病原菌は、チャ輪斑病菌を茶葉培地（チャの葉と少しの水を入れて高圧蒸気滅菌した培地）で25 ℃、1 ヶ月間培養した。これに水道水を加えて振とうし、ガーゼでこして胞子濃度を約1.0× 10５個／ ml に調整して胞子懸濁液とし、以下の試験に用いた。
【００３７】
茶園で摘採機を用いて茎葉の先端を刈り取って摘採した後に、病原菌胞子懸濁液を散布し、さらにその3〜4時間後にKGR-1 菌株胞子懸濁液を散布した。散布量は、病原菌は約150 ml／ｍ２、KGR-1 は約330 ml／ｍ２とした。なお、農薬散布区では、KGR-1 菌株胞子懸濁液の替わりに、TPN 水和剤（商品名「ダコニール1000」、エス・ディー・エス バイオテック社製）700 倍液を200ml ／ｍ２相当量散布した。
散布から約3週間後に1区当たり1 ｍ２の病葉の数を数え、防除効果を調査した（図２）。防除効果の指標である防除価は、輪斑病菌胞子懸濁液のみを接種した区（下記表２の無散布区）と比較し、下記の計算式から算出した。
【００３８】
防除価＝１００−（（散布区の発病葉数÷無散布区の発病葉数）×１００）
【００３９】
結果を表２及び図２に示す。第1回試験では防除価約80 とやや低かったが実用上十分な防除効果を示し、第2回試験では防除価約98 という化学農薬に匹敵する高い防除効果を示した（表２）。また図２からも、病原菌のみ接種した無散布区（写真右側）に比べて、KGR-1散布区（写真左側）では病害の発生が著しく抑えられていることが分かる。
【００４０】
【表２】
試験１：輪斑病菌散布は2007年7月24日10:00 で、摘採から３時間後。
試験２：輪斑病菌散布は2007年8月30日10:00 で、摘採から１時間後。
【００４１】
実施例３（KGR-1菌株の処理時期の検討）
実施例２の防除効果試験における試験２と同様の方法で、拮抗菌の処理時期を変えて、最も防除効果の高い処理時期を調べた。試験は2008年６月〜９月にかけて2 回に分けて行い、防除効果の判定を実施例２に準じて行った。
結果を図３に示す。摘採の11 日前、1 日前、摘採当日（摘採の６時間後）、1 日後、2 日後、3 日後および7 日後に処理したが、摘採当日処理が最も高い防除効果を示した（図３）。
【００４２】
実施例４（KGR-1菌株の処理濃度の検討）
実施例２の防除効果試験における試験２と同様の方法で、拮抗菌の胞子懸濁液の濃度を変えて、防除効果を検討した。試験は2008年６月〜９月にかけて2 回に分けて行い、防除効果の判定を実施例２に準じて行った。
結果を表３に示す。胞子濃度が最も濃い1.0 × 10７個／ml（原液）で最も防除効果が高くなり、10 倍希釈すると明らかに低下した（表３）。よって、有効な防除効果を得るには0.25 〜 1.0 × 10７個／ml の胞子濃度が必要であることが判明した。
なお、チャ輪斑病菌のみを接種した無散布区におけるｍ２当たりの発病葉数は、試験１で620枚、試験２で531枚であった。
【００４３】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４４】
チャに登録のある農薬の中で、病害防除のための微生物農薬はないことから、本発明は、化学農薬を低減した環境保全型防除体系を構築するための有効な資材として利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はチャ輪斑病の生物防除技術に関し、詳しくは、チャ輪斑病に対する防除能を有する新規なグリオクラディウム属菌及びそれを用いた生物防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害の分野では、特定の微生物により特定の病原菌による発病が抑制される場合に、その微生物を拮抗微生物と呼んでいる。
植物病害防除を目的として販売される資材は農薬として農薬取締法により規定されており、経済的に有効な病害防除能を有する拮抗微生物は微生物農薬として開発され、登録・販売される。
【０００３】
細菌では非病原性エルビニア・カロトボーラ、バチルス・ズブチリス、シュードモナス・フルオレッセンスなど、糸状菌ではタラノマイセス・フラバス、トリコデルマ・アトロビリデなどが微生物農薬として登録、販売されてきた。
これらは主に作物としては野菜、果樹、イネが対象で、病害としては灰色かび病、うどんこ病、炭疽病、軟腐病、イネ種子伝染性病害が対象である（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
グリオクラディウム菌については土壌病原菌に対する拮抗微生物として注目され、Gliocladium catenulatumなどでの報告がある（例えば非特許文献２参照）。また、日本では（株）出光興産からグリオクラディウム菌を利用した土壌改良資材が販売されている（例えば特許文献１参照）。2005年にはグリオクラディウム・ロゼウムを用いた柑橘病害に対する生物防除法が公開されている（例えば特許文献２参照）が、グリオクラディウム・ロゼウムがチャの病害に対して防除効果を有することはこれまで知られていなかった。
【０００５】
チャ輪斑病に対する生物防除法としては、非特許文献３にチャ赤葉枯病菌が輪斑病の発生を抑制することを報告し、輪斑病の生物防除資材として有効ではないかと提言している。チャ赤葉枯病菌はその名の通り病原菌であり、病原性は弱いものの、樹体が何らかの理由で衰弱した時には被害を与えるため、実用化には至らなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−７３３０９号公報
【特許文献２】特開２００５−７３５８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】百町満朗監修、「拮抗微生物による作物病害の生物防除」、クミアイ化学工業株式会社、2003年
【非特許文献２】Mcquilken et al., Journal of phytopathology,2001,149,p.171-178
【非特許文献３】安藤・成澤、日本植物病理学会報、第55巻、p.267-274、1989年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、生物多様性を保全しながら安定した農業生産を行い、安全・安心な農産物を生産するために、環境保全型の病害防除技術の開発が求められている。微生物農薬は農家が化学合成農薬に替えて使いやすい環境保全型防除資材であり、その開発が期待されている。
微生物農薬は化学合成農薬に比べて、一般に環境負荷が低い、人畜毒性が低いおよび耐性菌の発達が少ないなどの利点があるものの、生物であるため長期保存がしにくい、製造コストが高いなどの問題点がある。特に化学合成農薬に比較して防除効果はやや低い場合が多く、防除効果を安定させるために、その使用場面も苗・種子への処理や施設栽培など限られた使用法や使用環境であることが多い。
【０００９】
チャ（Camellia sinensis）では炭疽病、輪斑病、赤焼病、褐色円星病、もち病などの病害が発生し、病原糸状菌によって引き起こされる炭疽病と輪斑病を主な防除対象とした化学合成農薬による防除体系が確立されている。
栽培面積の約７割を占める主力品種「やぶきた」が強い病害抵抗性を持たないことから、抵抗性品種の利用が有効であるが、「やぶきた」以外の抵抗性品種への転換は進んでおらず、栽培管理の一環として行われる整枝による葉や枝の物理的除去以外に化学農薬の代替えになる防除技術はほとんどない。
【００１０】
また近年、我が国における茶生産の大半を占める静岡県と鹿児島県においてストロビルリン系殺菌剤に対する耐性を獲得した輪斑病菌が発見され、基幹防除剤として使われていた同系統の農薬は使用が困難な状況になりつつある。他の登録農薬はあるものの、剤の数が少ないことから新たな防除資材の開発が求められている。
チャの病害に対して登録のある微生物農薬は存在せず、防除効果の高い微生物農薬が開発されれば、チャの環境保全型防除に有効な資材となると考えられる。
【００１１】
そこで本発明は、チャ輪斑病に対して従来の化学合成農薬と同等又はそれ以上の防除効果を有する微生物農薬及びそれを用いた生物防除方法を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、チャ輪斑病菌Pestalotiopsis longisetaに対する拮抗微生物として新規のグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）菌株KGR-1の単離に成功した。
【００１３】
チャの葉面に傷を付けてそこにチャ輪斑病菌を人工的に感染させ、続いてそこにKGR-1を接種したところ、図１に示されるように輪斑病の病斑拡大は阻止された。
また、この新菌株の胞子を摘採（収穫）後の茶樹に噴霧することにより、チャ輪斑病の発病葉数を無処理の場合の2〜20％程度に抑えることができることを明らかにした。一方、従来の化学合成農薬で処理した際の発病葉数は、無処理の場合の0〜10％となる。
【００１４】
これらの知見に基づいて、本願発明者らは、当該新菌株の菌体や培養物、代謝産物、胞子をチャ輪斑病に対する生物的防除資材として利用することを着想し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本願請求項１に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である。
本願請求項２に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を含有することを特徴とする、チャ輪斑病防除剤である。
本願請求項３に係る発明は、前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項２に記載のチャ輪斑病防除剤である。
【００１６】
本願請求項４に係る発明は、チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは請求項２又は３に記載のチャ輪斑病防除剤を茶樹に散布することを特徴とする、チャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項５に係る発明は、前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項４に記載のチャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項６に係る発明は、前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布量が、胞子数として0.01〜5.0×10９個／ｍ２である、請求項４又は５に記載のチャ輪斑病の防除方法である。
本願請求項７に係る発明は、前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布時期が、茶の摘採後９時間以内である、請求項４〜６のいずれかに記載のチャ輪斑病の防除方法である。
【発明の効果】
【００１７】
チャに登録のある農薬の中で、病害防除のための微生物農薬はないことから、本発明によって環境保全型防除体系を構築するための有効な資材が提供される。しかも、微生物農薬は化学合成農薬よりも防除効果が劣ることが多いが、本発明は化学合成農薬と同等又はそれ以上の防除効果を得ることができ、しかもチャに対して病原性を示さないため、極めて画期的な防除資材といえる。
【００１８】
また輪斑病防除では、収穫直後の茶樹に防除資材を散布することが最も有効とされているが、微生物農薬は一般に残留等の問題がないため、本発明によって収穫直後の散布による周囲の未収穫茶園へのドリフト問題を解決できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】KGR-1がチャ輪斑病の病斑進展に及ぼす影響を示す写真像図である。
【図２】実施例２におけるチャ輪斑病に対するKGR-1の圃場での防除効果を示す写真像図である。左側はKGR-1散布区、右側は無散布区での様子を示す。
【図３】実施例３におけるKGR-1の処理時期により防除価に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物（以下、「拮抗微生物」または「拮抗菌」と呼ぶこともある。）は、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属し、チャ輪斑病菌に対する防除能を有することを特色とする。
グリオクラディウム属菌は一般に土壌病原菌に対する拮抗微生物として知られていることから、土壌ではなく、茶樹の葉面に接種してチャ輪斑病に対する防除効果を発揮できるということは、全く予想外のことであった。
【００２１】
グリオクラディウム・ロゼウムは、チャ輪斑病菌に対する菌寄生菌として、チャ輪斑病の自然発病葉からprecolonized plate baiting法などにより、容易に分離することができる。precolonized plate baiting法については、以下の実施例１において詳述する。
また、分離したグリオクラディウム・ロゼウム菌株の中から、チャ輪斑病菌に対する拮抗能が高く、チャ輪斑病に対する強い防除効果を示す菌株の選抜は、例えば実施例１で記載したような輪斑病病斑長を指標とした室内検定試験によって、当業者であれば容易に行うことができる。
【００２２】
本発明に係る新規なグリオクラディウム属菌株は、上記の方法により分離されたグリオクラディウム・ロゼウム菌株KGR-1である。本菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、寄託番号はNITE P-1084である。
本発明のKGR-1菌株は、化学合成農薬とほぼ同等の高い輪斑病防除効果を有し、圃場試験においてチャ輪斑病の発病葉数を無処理の場合の2〜20％程度に抑えることができるが、チャに対しては病原性を示さない拮抗微生物である。
【００２３】
KGR-1菌株のrDNAのITS領域塩基配列の解析を行ったところ、Nectria gliocladioides（アナモルフ：Gliocladium roseum）、異名：Bionectria ochroleuca（アナモルフ：Clonostachys rosea）の塩基配列と一致した。
また、本菌株の培地上での生育はやや遅い。菌叢は初め白色綿毛状で、後に淡橙色となり、菌叢表面に多くの分生子が形成され粉状に見える。分生子の形成は、Verticillium型およびGliocladium型の分生子梗を形成する。Gliocladium型の分生子梗上のフィアライドから連鎖状に分生子が形成され、これが粉状に見える。分生子は5.0×2.9μｍの楕円形である。1ヶ月以上培養すると、橙色で直径150〜300（平均220）μｍの球形の子のう殻の集合体を形成する。集合体は直径2〜5mmで、大きさや形には幅がある。子のう胞子は２胞で約10×4μｍであり、中央がやや細くなっている。
これらの特徴などから、KGR-1菌株は上記の菌と同定された。拮抗微生物としてはグリオクラディウム属の名前が有名なので、以下、本菌株の種名はグリオクラディウム・ロゼウムと記載する。
【００２４】
KGR-1菌株の培養方法は特に限定されず、グリオクラディウム属の微生物に一般的に適用されている方法によって培養することができる。
培地としては、例えばショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地（PSA 培地）、ブドウ糖加用ジャガイモ煎汁寒天培地（PDA培地）、オートミール寒天培地などを使用することができる。培養温度は特に限定されないが、20〜25℃とするのが好ましい。
【００２５】
本発明のチャ輪斑病防除剤は、前記拮抗微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を有効成分として含有する。
本発明において代謝産物とは、微生物の培養中に、微生物が培地中に分泌あるいは微生物体内に蓄積する物質を指し、例えば抗生物質や酵素などのタンパク質や、炭化水素などがこれに含まれる。グリオクラディウム・ロゼウムの代謝産物として実際に報告されている例としては、ペプチド系抗生物質（Journal of applied microbiology, Vol.110, p.1177-1186, 2011）、キチナーゼ、エンドグルカナーゼ（FEMS Microbiol. Lett. Vol.285, No.1, p.101-110, 2008）などが挙げられる。
【００２６】
製剤中には拮抗微生物以外の成分が含まれていてもよい。このような拮抗微生物以外の成分としては、例えば、溶媒、担体、安定化剤、増殖補助剤、界面活性剤、分散剤などを挙げることができる。
製剤中の拮抗微生物濃度は特に限定されないが、胞子濃度として0.01〜10×10７個／mlとするのが好ましく、0.5〜1.0×10７個／mlとするのがより好ましい。
【００２７】
本発明に係るチャ輪斑病の防除方法は、前記拮抗微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記のチャ輪斑病防除剤を、茶樹の葉面に散布することを特徴とする。
散布量はチャ輪斑病を防除できる範囲内であれば特に限定されないが、通常は圃場１ｍ２当たり100〜500ml、好ましくは300〜400mlとする。また拮抗菌胞子数としては、圃場１ｍ２当たり0.01〜5.0×10９個、好ましくは1.5〜4.0×10９個となるように散布する。
【００２８】
散布時期は、従来の化学農薬による輪斑病防除法と同様に、茶の摘採（収穫）直後とするのが効果的である。具体的には摘採後９時間以内、より好ましくは６時間以内に散布すると高い防除効果が得られるが、摘採後１日以内であっても一定の効果は期待できる。
散布方法は特に限定されず、通常の農薬散布に用いるような噴霧器などで茶樹の葉面に散布すればよい。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１（KGR-1 菌株の分離）
茶園から採取したチャ輪斑病の自然発病葉からprecolonized plate baiting 法にて、チャ輪斑病に対する拮抗微生物を分離した。
すなわち、あらかじめショ糖加用ジャガイモ煎汁寒天平板培地（PSA 培地、ジャガイモ200ｇの浸出液１リットルにショ糖20ｇ、寒天15ｇを添加）に培養したチャ輪斑病菌菌叢上に、採取したチャ葉の輪斑病病斑部分を5mm 大の大きさに切って、25℃で10日間静置した。病斑片に輪斑病菌に寄生する（病原菌を食べる）微生物が存在すると、培地上に生えている輪斑病菌を餌にしてその微生物が生えてくるので、輪斑病菌菌叢上に形成された拮抗微生物と思われる微生物の胞子を分離し、別のPSA培地に移植して、培養することにより複数の菌株を得た。
【００３１】
次に、上記で得られた菌株の中から、室内検定により特に輪斑病菌に対する防除効果の高い菌株を選抜した。
すなわち、上記で得られた菌株（拮抗菌株）をPSA 培地で25℃、2週間培養し、生育した菌叢の先端を径6mm のコルクボーラーで打ち抜いて含菌寒天片を得た。輪斑病菌についても同じ培地で25℃、1週間培養後に同様に含菌寒天片を得た。
【００３２】
茶園から採取した健全なチャ葉5枚（木化した枝についているやや硬化した葉、品種：「やぶきた」）を高湿度状態に保った容器に並べ、プラスのドライバーで中肋を挟んで両側の1個所ずつ計2個所付傷した。拮抗菌株の含菌寒天片を、菌叢面を葉の付傷部に密着させるようにして置き、25℃で1日静置後に除去した。続いて、輪斑病菌の含菌寒天片も同様に付傷部に置き、25 ℃で1日静置後に除去した。なお、対照として、拮抗菌株含菌寒天片の代わりにPAS培地片を置いた。
以後、葉は水を含ませたスポンジ状の資材に挿して25 ℃、照明条件下で管理して、2週間後に輪斑病の発病を調査し、拮抗菌株による防除効果を調査した。試験は3回行った。
【００３３】
防除効果は、付傷接種部から伸長した楕円形状の輪斑病病斑10 個について、長径部の長さ（病斑長）を測定して平均値を算出し、輪斑病菌のみ接種した葉での病斑長と比較して評価した。供試した拮抗菌株の中から特に高い防除効果を示した1菌株を選抜し、KGR-1と命名した。
KGR-1菌株についての室内検定試験の結果を表１に示す。KGR-1 を処理すると病斑の伸長は完全に抑制されることから、KGR-1には輪斑病に対する極めて高い防除効果があることが判明した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
実施例２（屋外における防除効果試験）
試験は独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所 金谷茶業研究拠点内の茶園（品種：「やぶきた」）で、2007年7月〜9月にかけて2回行った。
【００３６】
すなわち、KGR-1 菌株をPSA 培地で25 ℃で3〜4週間培養した後、流水をかけながら筆で菌叢の表面の気中菌糸を除去し、25 ℃、照明下に1週間置いて表面に胞子（分生子）を形成させた。この胞子を集めて水道水に懸濁させて胞子懸濁液を作り、胞子濃度をおよそ1.0 × 10７個／ ml に調整して以下の試験に用いた。
病原菌は、チャ輪斑病菌を茶葉培地（チャの葉と少しの水を入れて高圧蒸気滅菌した培地）で25 ℃、1 ヶ月間培養した。これに水道水を加えて振とうし、ガーゼでこして胞子濃度を約1.0× 10５個／ ml に調整して胞子懸濁液とし、以下の試験に用いた。
【００３７】
茶園で摘採機を用いて茎葉の先端を刈り取って摘採した後に、病原菌胞子懸濁液を散布し、さらにその3〜4時間後にKGR-1 菌株胞子懸濁液を散布した。散布量は、病原菌は約150 ml／ｍ２、KGR-1 は約330 ml／ｍ２とした。なお、農薬散布区では、KGR-1 菌株胞子懸濁液の替わりに、TPN 水和剤（商品名「ダコニール1000」、エス・ディー・エス バイオテック社製）700 倍液を200ml ／ｍ２相当量散布した。
散布から約3週間後に1区当たり1 ｍ２の病葉の数を数え、防除効果を調査した（図２）。防除効果の指標である防除価は、輪斑病菌胞子懸濁液のみを接種した区（下記表２の無散布区）と比較し、下記の計算式から算出した。
【００３８】
防除価＝１００−（（散布区の発病葉数÷無散布区の発病葉数）×１００）
【００３９】
結果を表２及び図２に示す。第1回試験では防除価約80 とやや低かったが実用上十分な防除効果を示し、第2回試験では防除価約98 という化学農薬に匹敵する高い防除効果を示した（表２）。また図２からも、病原菌のみ接種した無散布区（写真右側）に比べて、KGR-1散布区（写真左側）では病害の発生が著しく抑えられていることが分かる。
【００４０】
【表２】
試験１：輪斑病菌散布は2007年7月24日10:00 で、摘採から３時間後。
試験２：輪斑病菌散布は2007年8月30日10:00 で、摘採から１時間後。
【００４１】
実施例３（KGR-1菌株の処理時期の検討）
実施例２の防除効果試験における試験２と同様の方法で、拮抗菌の処理時期を変えて、最も防除効果の高い処理時期を調べた。試験は2008年６月〜９月にかけて2 回に分けて行い、防除効果の判定を実施例２に準じて行った。
結果を図３に示す。摘採の11 日前、1 日前、摘採当日（摘採の６時間後）、1 日後、2 日後、3 日後および7 日後に処理したが、摘採当日処理が最も高い防除効果を示した（図３）。
【００４２】
実施例４（KGR-1菌株の処理濃度の検討）
実施例２の防除効果試験における試験２と同様の方法で、拮抗菌の胞子懸濁液の濃度を変えて、防除効果を検討した。試験は2008年６月〜９月にかけて2 回に分けて行い、防除効果の判定を実施例２に準じて行った。
結果を表３に示す。胞子濃度が最も濃い1.0 × 10７個／ml（原液）で最も防除効果が高くなり、10 倍希釈すると明らかに低下した（表３）。よって、有効な防除効果を得るには0.25 〜 1.0 × 10７個／ml の胞子濃度が必要であることが判明した。
なお、チャ輪斑病菌のみを接種した無散布区におけるｍ２当たりの発病葉数は、試験１で620枚、試験２で531枚であった。
【００４３】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４４】
チャに登録のある農薬の中で、病害防除のための微生物農薬はないことから、本発明は、化学農薬を低減した環境保全型防除体系を構築するための有効な資材として利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）。
【請求項２】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を含有することを特徴とする、チャ輪斑病防除剤。
【請求項３】
前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項２に記載のチャ輪斑病防除剤。
【請求項４】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは請求項２又は３に記載のチャ輪斑病防除剤を茶樹に散布することを特徴とする、チャ輪斑病の防除方法。
【請求項５】
前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項４に記載のチャ輪斑病の防除方法。
【請求項６】
前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布量が、胞子数として0.01〜5.0×10９個／ｍ２である、請求項４又は５に記載のチャ輪斑病の防除方法。
【請求項７】
前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布時期が、茶の摘採後９時間以内である、請求項４〜６のいずれかに記載のチャ輪斑病の防除方法。
【請求項１】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）。
【請求項２】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上を含有することを特徴とする、チャ輪斑病防除剤。
【請求項３】
前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項２に記載のチャ輪斑病防除剤。
【請求項４】
チャ輪斑病菌に対する防除能を有する、グリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは請求項２又は３に記載のチャ輪斑病防除剤を茶樹に散布することを特徴とする、チャ輪斑病の防除方法。
【請求項５】
前記微生物がグリオクラディウム・ロゼウム（Gliocladium roseum）に属する新規な微生物菌株KGR-1（NITE P-1084）である、請求項４に記載のチャ輪斑病の防除方法。
【請求項６】
前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布量が、胞子数として0.01〜5.0×10９個／ｍ２である、請求項４又は５に記載のチャ輪斑病の防除方法。
【請求項７】
前記微生物の菌体、培養物、代謝産物及び胞子からなる群より選ばれた一種以上、あるいは前記チャ輪斑病防除剤の散布時期が、茶の摘採後９時間以内である、請求項４〜６のいずれかに記載のチャ輪斑病の防除方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２３９４３５（Ｐ２０１２−２３９４３５Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１３７１７（Ｐ２０１１−１１３７１７）
【出願日】平成２３年５月２０日（２０１１．５．２０）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２０日（２０１１．５．２０）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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