チロシン脱リン酸化酵素のペプチド基質およびチロシン脱リン酸化酵素の阻害作用を有するペプチド
【課題】本発明は、チロシンの脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の新規基質を提供すること、そして当該基質を用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、ＳＨＰ２の新規阻害剤を提供することを課題とする
【解決手段】チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子のリン酸化チロシンを含む部分ペプチドが、ＳＨＰ２の酵素学的反応において基質として作用し得る。当該リン酸化チロシンを含むペプチドを用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法による。また、Ｅｐｈファミリー分子のチロシンを含む部分ペプチドにおいて、チロシンをリン酸以外のもので修飾したペプチドが、ＳＨＰ２酵素活性の阻害作用を有することによる。
【解決手段】チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子のリン酸化チロシンを含む部分ペプチドが、ＳＨＰ２の酵素学的反応において基質として作用し得る。当該リン酸化チロシンを含むペプチドを用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法による。また、Ｅｐｈファミリー分子のチロシンを含む部分ペプチドにおいて、チロシンをリン酸以外のもので修飾したペプチドが、ＳＨＰ２酵素活性の阻害作用を有することによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなるチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質、当該ペプチド基質を用いたＳＨＰ２酵素活性測定方法、当該基質を用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法、およびこれらの方法に用いるためのキットに関する。また本発明は、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド、当該ペプチドを有効成分とするチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤、当該ペプチドを有効成分とする医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸化セリン、スレオニンまたはチロシンの脱リン酸化酵素は、一般に情報伝達を抑制する機能を有しているが、このうちチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２（protein tyrosine phsophatase non-receptor type 11：PTPN11）は情報伝達を促進させるユニークな機能が知られている。
【０００３】
ＳＨＰ２は、種々の疾患に関連していることが予想されている。ヘリコバクターピロリ菌による細胞増殖時の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｓの活性化と癌化にＳＨＰ２が重要な役割を担っていると予想されている（非特許文献１，２）。また、先天性心疾患を有するヌーナン症候群の原因としてＳＨＰ２の変異（優勢変異により脱リン酸化酵素活性が増加する変異）が同定されている（非特許文献３，４）。
【０００４】
いずれの病態においてもＳＨＰ２の生体内基質が同定されておらず、病態解明が進まない状況である。ＳＨＰ２が何らかの機構を介してＲａｓを活性化すると考えられているが、ＳＨＰ２がいかにしてＲａｓの活性化を起こすのかは明らかにされていない。ＳＨＰ２の基質候補として、細胞接着班キナーゼ（focal adhesin kinase, ＦＡＫ）、Sprouty（Ｒａｓ−ＭＡＰＫ（Mitogen-activated protein kinase）の抑制分子）あるいは血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体）が挙げられてきたが（非特許文献５，６，７）、いずれもＳＨＰ２のＲａｓ−ＭＡＰＫの活性化を論理的に十分説明できるものでない。また、ＳＨＰ２の酵素活性測定の基質としては、Ｓｒｃペプチドが用いられている（特許文献１）。ＳＨＰ２生体内基質が判明すれば、ＳＨＰ２機能を阻害する薬剤等の同定が可能となるため、ＳＨＰ２基質の解明は重要な課題である。
【０００５】
チロシンキナーゼ受容体であるＥｐｈは、細胞膜表面に存在するｅｐｈｒｉｎのレセプターおよびリガンドとして機能する。Ｅｐｈファミリー分子は、結合するｅｐｈｒｉｎリガンドへの親和性に基づいて定義され、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：Ａ１〜Ａ８、Ａ１０、Ｂ群：Ｂ１〜Ｂ４、Ｂ６）。Ｅｐｈは、軸索経路の探索、接着融合や集合（神経管閉鎖、血管新生など）といった胚発生上の重要なプロセス調節に寄与していることが知られている。また、一部の癌発生、種々の炎症性疾患との関係も指摘されている。
【０００６】
ＥｐｈＡのエピトープペプチドが、免疫応答の増強に用いられ得ることが開示されている（特許文献２）。また、ＥｐｈＢ２のペプチドが炎症細胞の化学遊走調節剤として用いられ、血管形成に関連することが開示されている（特許文献３）。また、Ｅｐｈの部分ペプチドが、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素ＰＴＰＲＯの基質となることが報告されている（非特許文献８）。
【特許文献１】特開２００６−１５８２４７
【特許文献２】特表２００７−５２７２２５
【特許文献３】特表２００８−５１４６１８
【非特許文献１】Hatakeyama, M. (2004) Nat.Rev.Cancer 4, 688-694
【非特許文献２】Mohi, M. G. and Neel, B. G. (2007) Curr.Opin.Genet.Dev. 17, 23-30
【非特許文献３】Maheshwari, M., Belmont, J., Fernbach, S., Ho, T., Molinari, L., Yakub, I., Yu, F., Combes, A., Towbin, J., Craigen, W. J., and Gibbs, R. (2002) Hum.Mutat. 20, 298-304
【非特許文献４】Nakamura, T., Colberlt, M., Krenz M., Molkentin, J. D., Hahn, H. S., Dorn, G. W., and Robbins, J.(2007) J. Clin. Invest 117, 2123-2132
【非特許文献５】Hanafusa, H., Torii, S., Yasunaga, T., and Nishida, E. (2002) Nat.Cell Biol. 4, 850-858
【非特許文献６】Tsutsumi, R., Takahashi, A., Azuma, T., Higashi, H., and Hatakeyama, M. (2006) Mol.Cell Biol. 26, 261-276
【非特許文献７】Nakata S, Fujita N, Kitagawa Y, Okamoto R, Ogita H, Takai Y., (2007) J Biol Chem. 282(52), 37815-25
【非特許文献８】Shintani T, Ihara M, Sakuta H, Takahashi H, Watakabe I, Noda M., (2006) Nat Neurosci. 9(6), 761-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、チロシンの脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の新規基質を提供すること、当該基質を用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、ＳＨＰ２の新規阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ね、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子のリン酸化チロシンを含む部分ペプチドが、ＳＨＰ２の酵素学的反応において基質として作用すること、当該リン酸化チロシンを含むペプチドを用いてＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法を行い得ることを見出し、本発明を完成した。また、Ｅｐｈファミリー分子のチロシンを含む部分ペプチドにおいて、チロシンをリン酸以外のもので修飾することにより、当該ペプチドがＳＨＰ２の阻害剤として作用することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
２．下記の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
３．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤。
４．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の作用増強により誘発または促進される疾患の治療または予防剤。
５．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、医薬組成物。
６．一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
７．下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、
Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
８．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料と、前項６または７に記載のペプチド基質とを接触させることを含む、ＳＨＰ２酵素活性の測定方法。
９．前項６または７に記載のペプチド基質および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を測定するためのキット。
１０．被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；
前記画分と、前項６または７に記載のペプチド基質とを接触させて、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
測定された酵素活性の値を基準値と比較する工程；
を含む、被験者由来の検体についてのＳＨＰ２酵素活性の検査方法。
１１．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２と、前項６または７に記載のペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、変化した場合に当該被検物質を選択する工程；
を含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法。
１２．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２、前項６または７に記載のペプチド基質、および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチド基質により、ＳＨＰ２酵素活性を特異的に測定することが可能となった。また、本発明のペプチド基質を用いたスクリーニング方法により、ＳＨＰ２酵素活性の促進剤もしくは阻害剤を選択することができる。
また、チロシンがリン酸以外のもので修飾された本発明のペプチド（以下、「修飾ペプチド」とも称する）により、ＳＨＰ２酵素活性を有効に阻害することが可能となり、ＳＨＰ２酵素活性が増強されることに起因して誘発または促進される疾患の病態が緩和されるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２は、Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼにおいて同定された約１００アミノ酸からなる保存領域Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２ドメイン）を２つと、触媒作用を有する脱リン酸化酵素ドメインを有する。これらの２つのＳＨ２ドメインは、ＳＨＰ２脱リン酸化酵素の制御において、異なる機能を有している。アミノ末端側のＳＨ２ドメインは制御および補充ドメインとして働き、脱リン酸化酵素ドメインと相互作用することにより自己阻害効果を生み出す。すなわち、アミノ末端側のＳＨ２ドメインが脱リン酸化酵素ドメインと相互作用することにより、ＳＨＰ２は不活性型となる。カルボキシル末端側のＳＨ２ドメインはシグナルの変換に必要な分子間相互作用のために、他のタンパク質を補充する作用を有する。
【００１２】
野生型のＳＨＰ２は、アミノ末端ＳＨ２ドメインが脱リン酸化酵素ドメインと相互作用しており、折畳まれた状態であり、不活性型で存在する。かかるアミノ末端のＳＨ２ドメインが、血小板由来増殖因子受容体（platelet-derived growth factor receptor：ＰＤＧＦＲ）、インスリン受容体基質（Insulin receptor substrate：ＩＲＳ）、繊維芽細胞増殖因子受容体基質（fibroblast growth factor receptor substrate：ＦＲＳ）、Ｇａｂ蛋白などに結合することにより、折畳み構造が解消され、活性型になる。ＳＨＰ２の恒常的活性化型の変異体（例えば、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（配列番号１１））は、折り畳まれずに存在すると考えられ、アミノ末端側のＳＨ２ドメインに、何らかのタンパク質が結合しなくても、高い酵素活性を示すと考えられている。
【００１３】
チロシンキナーゼ受容体であるＥｐｈファミリー分子は、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：Ａ１〜Ａ８、Ｂ群：Ｂ１〜Ｂ４、Ｂ６）。ＥｐｈＡ１はGenBank Accession番号NP_005223.3に示されており、ＥｐｈＡ２はGenBank Accession番号NP_004422.2、ＥｐｈＡ３はGenBank Accession番号NP_005224.2、ＥｐｈＡ４はGenBank Accession番号NP_004429.1、ＥｐｈＡ５はGenBank Accession番号NP_004430.3、ＥｐｈＡ６はGenBank Accession番号NP_001073917.2、ＥｐｈＡ７はGenBank Accession番号NP_004431.1、ＥｐｈＡ８はGenBank Accession番号NP_065387.1、ＥｐｈＢ１はGenBank Accession番号NP_004432.1、ＥｐｈＢ２はGenBank Accession番号NP_004433.2、ＥｐｈＢ３はGenBank Accession番号NP_004434.2、ＥｐｈＢ４はGenBank Accession番号NP_004435.3、ＥｐｈＢ５は、GenBank Accession番号NP_001004387.1、ＥｐｈＢ６は、GenBank Accession番号NP_004436.1に示されている。
【００１４】
Ｅｐｈファミリー分子に保存されている細胞膜近傍の２つのリン酸化チロシン（ＥｐｈＡ２における５８８番目と、５９４番目のリン酸化チロシン）をそれぞれ含むペプチドについて、ＳＨＰ２の基質となり得るかどうかについて解析を行ったところ、カルボキシ末端側の５９４番目のリン酸化チロシンを含むペプチドがＳＨＰ２の基質となることが判明した。
【００１５】
（ＳＨＰ２酵素のペプチド基質）
ＥｐｈＡ２における５９４番目のリン酸化チロシンを含むペプチドが、ＳＨＰ２の基質として酵素学的反応に使用可能である。かかるペプチドは、一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくは、一般式（ＩＩ）：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドである。
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の５８９〜５９８番目に相当するものであり、一般式（Ｉ）のアミノ酸配列は、Ｅｐｈ２のアミノ酸配列の５９４〜５９７番目に相当する。一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のチロシン（Ｔｙｒ）はＥｐｈＡ２のアミノ酸配列において５９４番目に相当する。また、当該チロシンはリン酸化されていることが必要である。ペプチドのアミノ末端にはアミノ保護基が付加されていてもよい。なお、一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ１のアミノ酸配列の６００〜６０９番目に相当し、ＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＡ５のアミノ酸配列の６２９〜６３８番目、ＥｐｈＡ６のアミノ酸配列の７０１〜７１０番目、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＡ８のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ１のアミノ酸配列の５９５〜６０４番目、ＥｐｈＢ２のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＢ３のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の５９１〜６００番目、ＥｐｈＢ６のアミノ酸配列の６３１〜６４０番目に相当する。
【００１６】
本発明のペプチド基質は、４個〜３０個、好ましくは６個〜２５個、さらに好ましくは、８個〜１２個のアミノ酸からなる。
【００１７】
好ましくは、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ４はヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はスレオニンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００１８】
さらに好ましくは、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｘ１はバリンであり、Ｘ２はアスパラギン酸であり、Ｘ３はプロリンであり、Ｘ４はヒスチジンであり、Ｘ５はスレオニンであり、Ｘ６はアスパラギン酸であり、Ｘ７はアスパラギンである。
【００１９】
本発明のペプチド基質は、自体公知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法の何れによって行ってもよく、即ち、ペプチドを構成しうる部分ペプチド鎖もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合には保護基を脱離させることにより目的のペプチドを製造することができる。
例えば、ペプチド基質はＦｍｏｃ固相合成法により、連続フロー方式の自動合成機を用いて化学合成することができる。アミノ酸は、側鎖が保護基により保護された誘導体を使用し、固相担体上でペプチド鎖の伸長を行う。酸性条件下にて、脱保護・切り出しを行い、粗ペプチドを回収する。
【００２０】
このようにして得られたペプチドは、通常の精製方法、例えば溶媒抽出；蒸留；カラムクロマトグラフィー；液体クロマトグラフィー；再結晶等を組み合わせて単離精製することができる。
例えば、逆相ＨＰＬＣを用いて、粗ペプチドの分離・精製を行うことができる。逆相カラムは、ＯＤＳカラム（スペルコ社製：Ｃ１８）を使用して、移動相は水／アセトニトリル系（ＴＦＡ添加、０．１％）を使用することができる。精製を行ったペプチドは、凍結乾燥して保存することができる（白色粉末、もしくはオイル状）。なお、逆相ＨＰＬＣにて純度を測定可能であり、ＴＯＦ−ＭＡＳＳにて分子量測定が可能であり、電子天秤により重量測定して、品質管理が可能である。
また、上記方法で得られたペプチドが遊離体である場合には公知の方法によって適当な塩に変換可能であり、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体に変換することも可能である。
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などに合成を委託してペプチドを得ることも可能である。
【００２１】
（ＳＨＰ２酵素活性の測定方法）
上記ペプチド基質と、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料とを接触させることにより、ＳＨＰ２酵素活性を測定することが可能である。
【００２２】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料とは、ＳＨＰ２を含む可能性があればいかなる試料でもよく、例えば、ヒトの血液や体液から調製した画分や、遺伝子組換え技術などで作製したタンパク質を回収した溶液などを含む。
反応バッファーは適宜使用可能であるが、反応バッファーのｐＨは６．５〜８．５であることが好ましく、７〜８であることがさらに好ましい。反応バッファーとして、例えば、最終濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＤＴＴを含む溶液を用いることができる。所望により、反応バッファーには、その他の成分、例えばＳＨＰ２のアミノ末端側のＳＨ２ドメインに結合するタンパク質からなるＳＨＰ２の活性化剤を混合することも可能である。かかる活性化剤としては、ＩＲＳｐＹ１１７２（ＩＲＳ−１の１１７２番目のチロシンがリン酸化されたもの）などが挙げられる。ＩＲＳｐＹ１１７２は、Pluskeyら(J Biol Chem. 1995 Feb 17;270(7):2897-900：「IRS-1 pY1172」)に記載の方法により調製することができる。
【００２３】
当該試料とペプチド基質を、前記反応バッファー中で所定の時間、反応させる。反応条件は適宜決定することができるが、室温で、１５分〜１時間反応させればよい。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸を自体公知の方法により測定する。例えば、遊離リン酸を測定する方法にはモリブデン法や、マラカイトグリーン（例えば、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ（ＢＩＯＭＯＬ社製））を使用する方法がある。マラカイトグリーンを使用した場合は、波長６２０ｎｍの吸収を測定すればよい。試料についての測定値を、標準（酵素活性が判明している試料）についての測定値と比較することにより、試料中の酵素活性を算出することができる。
【００２４】
また、ペプチド基質を含む試薬が本発明の範囲に包含される。さらに、本発明のペプチド基質と、反応バッファー等の必要な試薬を含むものを、ＳＨＰ２酵素活性測定用キットとして提供することもできる。キット中、ペプチド基質とバッファーは別個の容器に入った状態で提供されてもよいし、２以上の試薬を混合した状態で提供されてもよい。
【００２５】
（ＳＨＰ２酵素活性の検査方法）
上記ＳＨＰ２酵素活性の測定方法を用いて、被験者の生体内でのＳＨＰ２酵素活性を予測し、疾患との関連性を評価することが可能である。
かかるＳＨＰ２酵素活性の検査方法には、被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；前記画分とペプチド基質とを接触させ、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；前記測定結果を基準値と比較する工程；が含まれる。
【００２６】
検体とは、哺乳類等から採取され、例えば、血液、血清、糞便、尿、精液、喀痰、唾液、鼻汁、脳脊髄液、涙等の各種体液、又は、脳、結腸、尿生殖器、肺、腎臓、造血組織、乳房、胸腺、精巣、 卵巣、子宮組織等の各種組織、あるいはこれらに含まれる細胞群が挙げられる。検体からＳＨＰ２を含むと予測される画分を調製し、これを本発明の検査方法に使用する。当該画分の調製方法は、自体公知の方法を使用すればよい。
【００２７】
前記画分とペプチド基質とを接触させＳＨＰ２酵素活性を測定し、前記測定結果を基準値と比較することにより、被験者生体内でのＳＨＰ２の酵素活性の状態を予測することができる。基準値とは、ＳＨＰ２酵素活性と疾患とを関連付ける値であり、検体の採取された被験者が疾患と関連があるかないかを判断するために使用される数値もしくは数値範囲である。例えば、基準値とは、ＳＨＰ２の酵素活性に関連する疾患を有さない健常者におけるＳＨＰ２酵素活性レベルの数値範囲であり、予め設定されていてもよい。
【００２８】
（ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法）
ＳＨＰ２ペプチド基質を用いて、ＳＨＰ２の酵素活性を変動させる物質をスクリーニングすることが可能である。具体的には、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２とペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、被検物質の有無によりＳＨＰ２酵素活性が変化した場合に当該被検物質を選択する工程；を含む方法である。
ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質とは、ＳＨＰ２酵素活性を促進もしくは阻害する作用を有する物質である。被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性より低下した場合は、当該被検物質を阻害剤として選択することができる。逆に、被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性より上昇した場合は、当該被検物質を促進剤として選択することができる。
【００２９】
本スクリーニング方法において、ＳＨＰ２は野生型ＳＨＰ２、変異型ＳＨＰ２を適宜用いることが可能である。ＳＨＰ２は、自体公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することが可能である。ヒトＳＨＰ２の塩基配列はGenBankのAccession No.NM_002834（アミノ酸配列は、GenBankのAccession No.NP_002825）に示されている。また、市販のＳＨＰ２を使用することも可能である（例えば、SignalChem社：PTPN11 (SHP2), Active：カタログNo.P38-21G、exalpha社：Recombinant SHP-2 (224.529)/PTPN11 Active Enzyme：カタログNo.X1663E）。変異型ＳＨＰ２は、後述する実施例２に記載のものを使用することができる。
【００３０】
さらに本発明は、スクリーニング方法に用いるためのスクリーニングキットにも関する。当該キットには、ペプチド基質、ＳＨＰ２タンパク質、反応バッファー等の試薬を含み、これらの試薬は別個の容器に入って提供されてもよいし、２以上の試薬を適宜混合した状態で提供されてもよい。
【００３１】
本スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて選択される物質はＳＨＰ２の酵素活性を変動させる物質であり、ＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患の治療剤もしくは予防剤として使用することができる。かかる疾患の例として、胃癌、ヌーナン症候群、肥満関連疾患、白血病、レパード症候群などが挙げられる。本スクリーニング方法またはスクリーニングキットにより選択され得る物質として、以下に記載するＳＨＰ２酵素活性の阻害作用を有する修飾ペプチドが例示される。
【００３２】
（修飾ペプチド）
ＥｐｈＡ２における５９４番目のチロシンを含み、当該チロシンの水酸基がリン酸以外の基により修飾されているＥｐｈの部分ペプチド（以下、「修飾ペプチド」とも称する）が、ＳＨＰ２の阻害剤として作用する。かかるペプチドは、一般式（Ｉ）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくは、一般式（ＩＩ）：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドである。
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００３３】
また、当該ペプチドにおいて、チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されていることが必要である；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
好ましくは、チロシンの水酸基は、スルホ基もしくはバナジン酸基により修飾されており、さらに好ましくは、スルホ基により修飾されている。
【００３４】
一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の５８９〜５９８番目に相当するものであり、一般式（Ｉ）のアミノ酸配列は、Ｅｐｈ２のアミノ酸配列の５９４〜５９７番目に相当する。一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のチロシン（Ｔｙｒ）はＥｐｈＡ２のアミノ酸配列において５９４番目に相当する。また、当該チロシンはリン酸化されていることが必要である。ペプチドのアミノ末端にはアミノ保護基が付加されていてもよい。なお、一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ１のアミノ酸配列の６００〜６０９番目に相当し、ＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＡ５のアミノ酸配列の６２９〜６３８番目、ＥｐｈＡ６のアミノ酸配列の７０１〜７１０番目、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＡ８のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ１のアミノ酸配列の５９５〜６０４番目、ＥｐｈＢ２のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＢ３のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の５９１〜６００番目、ＥｐｈＢ６のアミノ酸配列の６３１〜６４０番目に相当する。
【００３５】
本発明の修飾ペプチドは、４個〜３０個、好ましくは６個〜２５個、さらに好ましくは、８個〜１２個のアミノ酸からなる。
【００３６】
好ましくは、一般式Ｉにおいて、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ４はヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はスレオニンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００３７】
さらに好ましくは、一般式Ｉにおいて、Ｘ１はバリンであり、Ｘ２はアスパラギン酸であり、Ｘ３はプロリンであり、Ｘ４はヒスチジンであり、Ｘ５はスレオニンであり、Ｘ６はアスパラギン酸であり、Ｘ７はアスパラギンである。
【００３８】
本発明の修飾ペプチドは、自体公知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法の何れによって行ってもよく、即ち、ペプチドを構成しうる部分ペプチド鎖もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合には保護基を脱離させることにより目的のペプチドを製造することができる。
例えば、本発明の修飾ペプチドはＦｍｏｃ固相合成法により、連続フロー方式の自動合成機を用いて化学合成することができる。アミノ酸は、側鎖が保護基により保護された誘導体を使用し、固相担体上でペプチド鎖の伸長を行う。酸性条件下にて、脱保護・切り出しを行い、粗ペプチドを回収する。
【００３９】
このようにして得られたペプチドは、通常の精製方法、例えば溶媒抽出；蒸留；カラムクロマトグラフィー；液体クロマトグラフィー；再結晶等を組み合わせて単離精製することができる。
例えば、逆相ＨＰＬＣを用いて、粗ペプチドの分離・精製を行うことができる。逆相カラムは、ＯＤＳカラム（スペルコ社製：Ｃ１８）を使用して、移動相は水／アセトニトリル系（ＴＦＡ添加、０．１％）を使用することができる。精製を行ったペプチドは、凍結乾燥して、保存することができる（白色粉末、もしくはオイル状）。なお、逆相ＨＰＬＣにて純度を測定可能であり、ＴＯＦ−ＭＡＳＳにて分子量測定が可能であり、電子天秤により重量測定して、品質管理が可能である。
また、上記方法で得られたペプチドが遊離体である場合には公知の方法によって適当な塩に変換可能であり、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体に変換することも可能である。
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などに合成を委託してペプチドを得ることも可能である。
【００４０】
本発明の修飾ペプチドまたはその塩は、ＳＨＰ２阻害剤として作用する。本発明の修飾ペプチドまたはその塩は、ＳＨＰ２の酵素活性が増強することにより誘発または促進される疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。当該疾患として、胃癌もしくはヌーナン症候群、白血病などが挙げられる。
【００４１】
本発明の修飾ペプチドまたはその塩を医薬組成物として用いる場合には、通常、それ自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。
また、本発明の修飾ペプチドは、ヒト用医薬としての使用は勿論、他の哺乳動物用医薬としても使用可能である。投与量は疾患の種類及び程度、投与するペプチド並びに投与経路、患者の年齢、性別、体重等により変わりうるが、注射剤の形での投与の場合、通常、成人１日当たり、約０．１〜３０ｍｇを投与するのが好ましい。また、本発明のペプチドは上記各種対象疾患の予防、治療の為に単独で投与する以外に、該疾患の予防、治療に有用な別の薬剤と併用することもできる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１）ペプチド基質の調製
ペプチド基質の候補であるＪＸ１およびＪＸ２（それぞれＹ（Ｔｙｒ）がリン酸化されている）を、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社に委託して合成し、作製した。本ペプチドを１ｍＭの濃度になるように水に溶かし、−８０℃に保存した。
ＪＸ１：ＰＬＫＴＹＶＤＰＨＴ（配列番号３）
ＪＸ２：ＶＤＰＨＴＹＥＤＰＮ（配列番号４）
【００４４】
（実施例２）ＳＨＰ２酵素の調製
ＭｙｃタグをＣ末端に付加した下記（ａ）〜（ｅ）の各種ＳＨＰ２酵素を発現するプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたトランスフェクションによりＭＤＣＫ細胞に導入した。４０時間培養後に細胞を溶解し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−セファロースおよび抗ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降法により各種ＳＨＰ２を調製した。酵素は４℃にて保存した。
（ａ）ＳＨＰ２ Ｔ４６８Ｍ（配列番号５）：レパード症候群の患者で検出される変異体。酵素活性が低い。
（ｂ）ＳＨＰ２ Ｃ／Ｓ（Ｃ４５９Ｓ）（配列番号７）：不活性型。酵素活性なし。基質との複合体形成能有り。ただし（ｃ）ＳＨＰ２ ＤＭより複合体形成能は弱い。
（ｃ）ＳＨＰ２ ＤＭ（２箇所の置換がある。Ｄ４２５Ａ／Ｃ４５９Ｓ）（配列番号９）：不活性型。酵素活性なし。基質との複合体形成能有り。
（ｄ）ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（配列番号１１）：活性化型の変異体。高い酵素活性を示す。白血病の患者で検出される。
（ｅ）ＳＨＰ２ ｗｔ（配列番号１３）：野生型。
【００４５】
（実施例３）酵素活性の測定
９６ウェルプレート１ウェルあたり１０μｌの基質（最終濃度０．２５ｍＭ）、２０μｌの反応バッファー（最終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＤＴＴ）および１０μｌの酵素（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温にて３０分間、反応させる。その後マラカイトグリーンを等量加え、遊離したリン酸とマラカイトグリーンの反応によって生じる波長６２０ｎｍの吸収をプレートリーダーにて測定した。基質としてＪＸ１またはＪＸ２、酵素として野生型ＳＨＰ２を使用した。ＩＲＳｐＹ１１７２（ＩＲＳ−１の１１７２番目のチロシンがリン酸化されたもの）を、野生型酵素の活性化剤として使用した。
【００４６】
その結果を図１に示す。ＪＸ２がＳＨＰ２の特異的な基質となることが判明した。
【００４７】
（実施例４）酵素活性の測定
実施例３と同様の方法により、基質としてＪＸ２を用い、酵素として（ａ）〜（ｅ）のＳＨＰ２を用いて、ＩＲＳｐＹ１１７２の存在下、もしくは非存在下で酵素活性を測定した。
【００４８】
その結果を図２に示す。ＳＨＰ２の野生型およびＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（高い酵素活性を示す）では酵素活性が認められた。一方、不活性型の変異型（ＳＨＰ２ Ｔ４６８Ｍ、ＳＨＰ２ Ｃ／Ｓ、ＳＨＰ２ ＤＭ）では酵素活性が認められなかった。
【００４９】
（実施例５）修飾ペプチドの調製
ＪＸ２−Ｓペプチド（Ｙ（Ｔｙｒ）にスルホ基が付加されている）を、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社に委託して合成し、作製した。本ペプチドを１ｍＭの濃度になるように水に溶かし、−８０℃に保存した。
ＪＸ２−Ｓ：ＶＤＰＨＴＹＥＤＰＮ（配列番号１５）
【００５０】
（実施例６）酵素活性の測定
ＳＨＰ２Ｄ６１ＹとＪＸ２−Ｓ（０，３０，１００，３００μＭ）とＴＢＳを混合して、１０分間、室温でインキュベートした。その後、基質としてＪＸ２（２００μＭ）を添加して、３０分間、室温でインキュベートした。その後、等量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭを添加して１０分間、室温でインキュベートし、波長６２０ｎｍの吸収を測定した。
【００５１】
その結果を、図３に示す。ＪＸ２−Ｓペプチドの量が増加するにつれて、酵素活性が阻害された。
【００５２】
（実施例７）ゼブラフィッシュにおける実験
Jopling Cらの方法（PLoS Genet. 2007 Dec;3(12):e225）に従って、ゼブラフィッシュの受精卵にヒトＳＨＰ２ ｍＲＮＡ変異体（ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡ）（配列番号２５）をマイクロインジェクションし、個体発生過程における心臓の形態変化を観察した。また、ＪＸ２−Ｓペプチドを、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡの注入と同時に受精卵に注入した。
なお、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇは、ヌーナン症候群で検出される弱い活性化型である。
【００５３】
その結果、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡのみを注入した場合は、ゼブラフィッシュに心臓の異常、目が小さいなどの病態が発症していたが、ＪＸ２−Ｓペプチドの投与によりこれらの病態が抑えられることがわかった。
なお、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（強い活性化型）のｍＲＮＡを注入した場合は、心臓が形成される前に胚発生が異常を示し、ゼブラフィッシュ全体が正常な形態ではなくなった（データは示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
上記説明したとおり、本発明のＥｐｈの部分ペプチドからなるペプチド基質は、ＳＨＰ２酵素の特異的に作用する。かかる基質をＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患についての簡便な検査方法、ＳＨＰ２酵素活性の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法に用いることが可能である。スクリーニング方法により得られたＳＨＰ２阻害剤もしくは促進剤は、ＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患の予防剤もしくは治療剤として使用され得、有用である。また、本発明の修飾ペプチドは、生体内でＳＨＰ２酵素の活性を阻害して、ＳＨＰ２酵素活性の上昇により発症すると考えられる症状を抑制する。かかる修飾ペプチドは、ＳＨＰ２酵素活性の上昇により発症する病態の治療剤として使用することが期待され、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ペプチド基質のＳＨＰ２酵素に対する特異性に関する結果を示す。（実施例３）
【図２】ペプチド基質の機能を確認した結果を示す。（実施例４）
【図３】修飾ペプチドのＳＨＰ２阻害作用を確認した結果を示す。（実施例６）
【図４】修飾ペプチドのゼブラフィッシュ生体内での作用を確認した結果を示す。（実施例７）
【図５】Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列についてのアライメントを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなるチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質、当該ペプチド基質を用いたＳＨＰ２酵素活性測定方法、当該基質を用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法、およびこれらの方法に用いるためのキットに関する。また本発明は、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド、当該ペプチドを有効成分とするチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤、当該ペプチドを有効成分とする医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸化セリン、スレオニンまたはチロシンの脱リン酸化酵素は、一般に情報伝達を抑制する機能を有しているが、このうちチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２（protein tyrosine phsophatase non-receptor type 11：PTPN11）は情報伝達を促進させるユニークな機能が知られている。
【０００３】
ＳＨＰ２は、種々の疾患に関連していることが予想されている。ヘリコバクターピロリ菌による細胞増殖時の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｓの活性化と癌化にＳＨＰ２が重要な役割を担っていると予想されている（非特許文献１，２）。また、先天性心疾患を有するヌーナン症候群の原因としてＳＨＰ２の変異（優勢変異により脱リン酸化酵素活性が増加する変異）が同定されている（非特許文献３，４）。
【０００４】
いずれの病態においてもＳＨＰ２の生体内基質が同定されておらず、病態解明が進まない状況である。ＳＨＰ２が何らかの機構を介してＲａｓを活性化すると考えられているが、ＳＨＰ２がいかにしてＲａｓの活性化を起こすのかは明らかにされていない。ＳＨＰ２の基質候補として、細胞接着班キナーゼ（focal adhesin kinase, ＦＡＫ）、Sprouty（Ｒａｓ−ＭＡＰＫ（Mitogen-activated protein kinase）の抑制分子）あるいは血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ受容体）が挙げられてきたが（非特許文献５，６，７）、いずれもＳＨＰ２のＲａｓ−ＭＡＰＫの活性化を論理的に十分説明できるものでない。また、ＳＨＰ２の酵素活性測定の基質としては、Ｓｒｃペプチドが用いられている（特許文献１）。ＳＨＰ２生体内基質が判明すれば、ＳＨＰ２機能を阻害する薬剤等の同定が可能となるため、ＳＨＰ２基質の解明は重要な課題である。
【０００５】
チロシンキナーゼ受容体であるＥｐｈは、細胞膜表面に存在するｅｐｈｒｉｎのレセプターおよびリガンドとして機能する。Ｅｐｈファミリー分子は、結合するｅｐｈｒｉｎリガンドへの親和性に基づいて定義され、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：Ａ１〜Ａ８、Ａ１０、Ｂ群：Ｂ１〜Ｂ４、Ｂ６）。Ｅｐｈは、軸索経路の探索、接着融合や集合（神経管閉鎖、血管新生など）といった胚発生上の重要なプロセス調節に寄与していることが知られている。また、一部の癌発生、種々の炎症性疾患との関係も指摘されている。
【０００６】
ＥｐｈＡのエピトープペプチドが、免疫応答の増強に用いられ得ることが開示されている（特許文献２）。また、ＥｐｈＢ２のペプチドが炎症細胞の化学遊走調節剤として用いられ、血管形成に関連することが開示されている（特許文献３）。また、Ｅｐｈの部分ペプチドが、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素ＰＴＰＲＯの基質となることが報告されている（非特許文献８）。
【特許文献１】特開２００６−１５８２４７
【特許文献２】特表２００７−５２７２２５
【特許文献３】特表２００８−５１４６１８
【非特許文献１】Hatakeyama, M. (2004) Nat.Rev.Cancer 4, 688-694
【非特許文献２】Mohi, M. G. and Neel, B. G. (2007) Curr.Opin.Genet.Dev. 17, 23-30
【非特許文献３】Maheshwari, M., Belmont, J., Fernbach, S., Ho, T., Molinari, L., Yakub, I., Yu, F., Combes, A., Towbin, J., Craigen, W. J., and Gibbs, R. (2002) Hum.Mutat. 20, 298-304
【非特許文献４】Nakamura, T., Colberlt, M., Krenz M., Molkentin, J. D., Hahn, H. S., Dorn, G. W., and Robbins, J.(2007) J. Clin. Invest 117, 2123-2132
【非特許文献５】Hanafusa, H., Torii, S., Yasunaga, T., and Nishida, E. (2002) Nat.Cell Biol. 4, 850-858
【非特許文献６】Tsutsumi, R., Takahashi, A., Azuma, T., Higashi, H., and Hatakeyama, M. (2006) Mol.Cell Biol. 26, 261-276
【非特許文献７】Nakata S, Fujita N, Kitagawa Y, Okamoto R, Ogita H, Takai Y., (2007) J Biol Chem. 282(52), 37815-25
【非特許文献８】Shintani T, Ihara M, Sakuta H, Takahashi H, Watakabe I, Noda M., (2006) Nat Neurosci. 9(6), 761-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、チロシンの脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の新規基質を提供すること、当該基質を用いたＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、ＳＨＰ２の新規阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ね、チロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子のリン酸化チロシンを含む部分ペプチドが、ＳＨＰ２の酵素学的反応において基質として作用すること、当該リン酸化チロシンを含むペプチドを用いてＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法を行い得ることを見出し、本発明を完成した。また、Ｅｐｈファミリー分子のチロシンを含む部分ペプチドにおいて、チロシンをリン酸以外のもので修飾することにより、当該ペプチドがＳＨＰ２の阻害剤として作用することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
２．下記の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
３．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤。
４．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の作用増強により誘発または促進される疾患の治療または予防剤。
５．前項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、医薬組成物。
６．一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
７．下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、
Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
８．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料と、前項６または７に記載のペプチド基質とを接触させることを含む、ＳＨＰ２酵素活性の測定方法。
９．前項６または７に記載のペプチド基質および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を測定するためのキット。
１０．被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；
前記画分と、前項６または７に記載のペプチド基質とを接触させて、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
測定された酵素活性の値を基準値と比較する工程；
を含む、被験者由来の検体についてのＳＨＰ２酵素活性の検査方法。
１１．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２と、前項６または７に記載のペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、変化した場合に当該被検物質を選択する工程；
を含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法。
１２．チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２、前項６または７に記載のペプチド基質、および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチド基質により、ＳＨＰ２酵素活性を特異的に測定することが可能となった。また、本発明のペプチド基質を用いたスクリーニング方法により、ＳＨＰ２酵素活性の促進剤もしくは阻害剤を選択することができる。
また、チロシンがリン酸以外のもので修飾された本発明のペプチド（以下、「修飾ペプチド」とも称する）により、ＳＨＰ２酵素活性を有効に阻害することが可能となり、ＳＨＰ２酵素活性が増強されることに起因して誘発または促進される疾患の病態が緩和されるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２は、Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼにおいて同定された約１００アミノ酸からなる保存領域Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２ドメイン）を２つと、触媒作用を有する脱リン酸化酵素ドメインを有する。これらの２つのＳＨ２ドメインは、ＳＨＰ２脱リン酸化酵素の制御において、異なる機能を有している。アミノ末端側のＳＨ２ドメインは制御および補充ドメインとして働き、脱リン酸化酵素ドメインと相互作用することにより自己阻害効果を生み出す。すなわち、アミノ末端側のＳＨ２ドメインが脱リン酸化酵素ドメインと相互作用することにより、ＳＨＰ２は不活性型となる。カルボキシル末端側のＳＨ２ドメインはシグナルの変換に必要な分子間相互作用のために、他のタンパク質を補充する作用を有する。
【００１２】
野生型のＳＨＰ２は、アミノ末端ＳＨ２ドメインが脱リン酸化酵素ドメインと相互作用しており、折畳まれた状態であり、不活性型で存在する。かかるアミノ末端のＳＨ２ドメインが、血小板由来増殖因子受容体（platelet-derived growth factor receptor：ＰＤＧＦＲ）、インスリン受容体基質（Insulin receptor substrate：ＩＲＳ）、繊維芽細胞増殖因子受容体基質（fibroblast growth factor receptor substrate：ＦＲＳ）、Ｇａｂ蛋白などに結合することにより、折畳み構造が解消され、活性型になる。ＳＨＰ２の恒常的活性化型の変異体（例えば、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（配列番号１１））は、折り畳まれずに存在すると考えられ、アミノ末端側のＳＨ２ドメインに、何らかのタンパク質が結合しなくても、高い酵素活性を示すと考えられている。
【００１３】
チロシンキナーゼ受容体であるＥｐｈファミリー分子は、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：Ａ１〜Ａ８、Ｂ群：Ｂ１〜Ｂ４、Ｂ６）。ＥｐｈＡ１はGenBank Accession番号NP_005223.3に示されており、ＥｐｈＡ２はGenBank Accession番号NP_004422.2、ＥｐｈＡ３はGenBank Accession番号NP_005224.2、ＥｐｈＡ４はGenBank Accession番号NP_004429.1、ＥｐｈＡ５はGenBank Accession番号NP_004430.3、ＥｐｈＡ６はGenBank Accession番号NP_001073917.2、ＥｐｈＡ７はGenBank Accession番号NP_004431.1、ＥｐｈＡ８はGenBank Accession番号NP_065387.1、ＥｐｈＢ１はGenBank Accession番号NP_004432.1、ＥｐｈＢ２はGenBank Accession番号NP_004433.2、ＥｐｈＢ３はGenBank Accession番号NP_004434.2、ＥｐｈＢ４はGenBank Accession番号NP_004435.3、ＥｐｈＢ５は、GenBank Accession番号NP_001004387.1、ＥｐｈＢ６は、GenBank Accession番号NP_004436.1に示されている。
【００１４】
Ｅｐｈファミリー分子に保存されている細胞膜近傍の２つのリン酸化チロシン（ＥｐｈＡ２における５８８番目と、５９４番目のリン酸化チロシン）をそれぞれ含むペプチドについて、ＳＨＰ２の基質となり得るかどうかについて解析を行ったところ、カルボキシ末端側の５９４番目のリン酸化チロシンを含むペプチドがＳＨＰ２の基質となることが判明した。
【００１５】
（ＳＨＰ２酵素のペプチド基質）
ＥｐｈＡ２における５９４番目のリン酸化チロシンを含むペプチドが、ＳＨＰ２の基質として酵素学的反応に使用可能である。かかるペプチドは、一般式（Ｉ）：Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくは、一般式（ＩＩ）：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドである。
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の５８９〜５９８番目に相当するものであり、一般式（Ｉ）のアミノ酸配列は、Ｅｐｈ２のアミノ酸配列の５９４〜５９７番目に相当する。一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のチロシン（Ｔｙｒ）はＥｐｈＡ２のアミノ酸配列において５９４番目に相当する。また、当該チロシンはリン酸化されていることが必要である。ペプチドのアミノ末端にはアミノ保護基が付加されていてもよい。なお、一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ１のアミノ酸配列の６００〜６０９番目に相当し、ＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＡ５のアミノ酸配列の６２９〜６３８番目、ＥｐｈＡ６のアミノ酸配列の７０１〜７１０番目、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＡ８のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ１のアミノ酸配列の５９５〜６０４番目、ＥｐｈＢ２のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＢ３のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の５９１〜６００番目、ＥｐｈＢ６のアミノ酸配列の６３１〜６４０番目に相当する。
【００１６】
本発明のペプチド基質は、４個〜３０個、好ましくは６個〜２５個、さらに好ましくは、８個〜１２個のアミノ酸からなる。
【００１７】
好ましくは、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ４はヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はスレオニンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００１８】
さらに好ましくは、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｘ１はバリンであり、Ｘ２はアスパラギン酸であり、Ｘ３はプロリンであり、Ｘ４はヒスチジンであり、Ｘ５はスレオニンであり、Ｘ６はアスパラギン酸であり、Ｘ７はアスパラギンである。
【００１９】
本発明のペプチド基質は、自体公知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法の何れによって行ってもよく、即ち、ペプチドを構成しうる部分ペプチド鎖もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合には保護基を脱離させることにより目的のペプチドを製造することができる。
例えば、ペプチド基質はＦｍｏｃ固相合成法により、連続フロー方式の自動合成機を用いて化学合成することができる。アミノ酸は、側鎖が保護基により保護された誘導体を使用し、固相担体上でペプチド鎖の伸長を行う。酸性条件下にて、脱保護・切り出しを行い、粗ペプチドを回収する。
【００２０】
このようにして得られたペプチドは、通常の精製方法、例えば溶媒抽出；蒸留；カラムクロマトグラフィー；液体クロマトグラフィー；再結晶等を組み合わせて単離精製することができる。
例えば、逆相ＨＰＬＣを用いて、粗ペプチドの分離・精製を行うことができる。逆相カラムは、ＯＤＳカラム（スペルコ社製：Ｃ１８）を使用して、移動相は水／アセトニトリル系（ＴＦＡ添加、０．１％）を使用することができる。精製を行ったペプチドは、凍結乾燥して保存することができる（白色粉末、もしくはオイル状）。なお、逆相ＨＰＬＣにて純度を測定可能であり、ＴＯＦ−ＭＡＳＳにて分子量測定が可能であり、電子天秤により重量測定して、品質管理が可能である。
また、上記方法で得られたペプチドが遊離体である場合には公知の方法によって適当な塩に変換可能であり、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体に変換することも可能である。
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などに合成を委託してペプチドを得ることも可能である。
【００２１】
（ＳＨＰ２酵素活性の測定方法）
上記ペプチド基質と、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料とを接触させることにより、ＳＨＰ２酵素活性を測定することが可能である。
【００２２】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料とは、ＳＨＰ２を含む可能性があればいかなる試料でもよく、例えば、ヒトの血液や体液から調製した画分や、遺伝子組換え技術などで作製したタンパク質を回収した溶液などを含む。
反応バッファーは適宜使用可能であるが、反応バッファーのｐＨは６．５〜８．５であることが好ましく、７〜８であることがさらに好ましい。反応バッファーとして、例えば、最終濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＤＴＴを含む溶液を用いることができる。所望により、反応バッファーには、その他の成分、例えばＳＨＰ２のアミノ末端側のＳＨ２ドメインに結合するタンパク質からなるＳＨＰ２の活性化剤を混合することも可能である。かかる活性化剤としては、ＩＲＳｐＹ１１７２（ＩＲＳ−１の１１７２番目のチロシンがリン酸化されたもの）などが挙げられる。ＩＲＳｐＹ１１７２は、Pluskeyら(J Biol Chem. 1995 Feb 17;270(7):2897-900：「IRS-1 pY1172」)に記載の方法により調製することができる。
【００２３】
当該試料とペプチド基質を、前記反応バッファー中で所定の時間、反応させる。反応条件は適宜決定することができるが、室温で、１５分〜１時間反応させればよい。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸を自体公知の方法により測定する。例えば、遊離リン酸を測定する方法にはモリブデン法や、マラカイトグリーン（例えば、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ（ＢＩＯＭＯＬ社製））を使用する方法がある。マラカイトグリーンを使用した場合は、波長６２０ｎｍの吸収を測定すればよい。試料についての測定値を、標準（酵素活性が判明している試料）についての測定値と比較することにより、試料中の酵素活性を算出することができる。
【００２４】
また、ペプチド基質を含む試薬が本発明の範囲に包含される。さらに、本発明のペプチド基質と、反応バッファー等の必要な試薬を含むものを、ＳＨＰ２酵素活性測定用キットとして提供することもできる。キット中、ペプチド基質とバッファーは別個の容器に入った状態で提供されてもよいし、２以上の試薬を混合した状態で提供されてもよい。
【００２５】
（ＳＨＰ２酵素活性の検査方法）
上記ＳＨＰ２酵素活性の測定方法を用いて、被験者の生体内でのＳＨＰ２酵素活性を予測し、疾患との関連性を評価することが可能である。
かかるＳＨＰ２酵素活性の検査方法には、被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；前記画分とペプチド基質とを接触させ、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；前記測定結果を基準値と比較する工程；が含まれる。
【００２６】
検体とは、哺乳類等から採取され、例えば、血液、血清、糞便、尿、精液、喀痰、唾液、鼻汁、脳脊髄液、涙等の各種体液、又は、脳、結腸、尿生殖器、肺、腎臓、造血組織、乳房、胸腺、精巣、 卵巣、子宮組織等の各種組織、あるいはこれらに含まれる細胞群が挙げられる。検体からＳＨＰ２を含むと予測される画分を調製し、これを本発明の検査方法に使用する。当該画分の調製方法は、自体公知の方法を使用すればよい。
【００２７】
前記画分とペプチド基質とを接触させＳＨＰ２酵素活性を測定し、前記測定結果を基準値と比較することにより、被験者生体内でのＳＨＰ２の酵素活性の状態を予測することができる。基準値とは、ＳＨＰ２酵素活性と疾患とを関連付ける値であり、検体の採取された被験者が疾患と関連があるかないかを判断するために使用される数値もしくは数値範囲である。例えば、基準値とは、ＳＨＰ２の酵素活性に関連する疾患を有さない健常者におけるＳＨＰ２酵素活性レベルの数値範囲であり、予め設定されていてもよい。
【００２８】
（ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法）
ＳＨＰ２ペプチド基質を用いて、ＳＨＰ２の酵素活性を変動させる物質をスクリーニングすることが可能である。具体的には、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２とペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、被検物質の有無によりＳＨＰ２酵素活性が変化した場合に当該被検物質を選択する工程；を含む方法である。
ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質とは、ＳＨＰ２酵素活性を促進もしくは阻害する作用を有する物質である。被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性より低下した場合は、当該被検物質を阻害剤として選択することができる。逆に、被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性より上昇した場合は、当該被検物質を促進剤として選択することができる。
【００２９】
本スクリーニング方法において、ＳＨＰ２は野生型ＳＨＰ２、変異型ＳＨＰ２を適宜用いることが可能である。ＳＨＰ２は、自体公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することが可能である。ヒトＳＨＰ２の塩基配列はGenBankのAccession No.NM_002834（アミノ酸配列は、GenBankのAccession No.NP_002825）に示されている。また、市販のＳＨＰ２を使用することも可能である（例えば、SignalChem社：PTPN11 (SHP2), Active：カタログNo.P38-21G、exalpha社：Recombinant SHP-2 (224.529)/PTPN11 Active Enzyme：カタログNo.X1663E）。変異型ＳＨＰ２は、後述する実施例２に記載のものを使用することができる。
【００３０】
さらに本発明は、スクリーニング方法に用いるためのスクリーニングキットにも関する。当該キットには、ペプチド基質、ＳＨＰ２タンパク質、反応バッファー等の試薬を含み、これらの試薬は別個の容器に入って提供されてもよいし、２以上の試薬を適宜混合した状態で提供されてもよい。
【００３１】
本スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて選択される物質はＳＨＰ２の酵素活性を変動させる物質であり、ＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患の治療剤もしくは予防剤として使用することができる。かかる疾患の例として、胃癌、ヌーナン症候群、肥満関連疾患、白血病、レパード症候群などが挙げられる。本スクリーニング方法またはスクリーニングキットにより選択され得る物質として、以下に記載するＳＨＰ２酵素活性の阻害作用を有する修飾ペプチドが例示される。
【００３２】
（修飾ペプチド）
ＥｐｈＡ２における５９４番目のチロシンを含み、当該チロシンの水酸基がリン酸以外の基により修飾されているＥｐｈの部分ペプチド（以下、「修飾ペプチド」とも称する）が、ＳＨＰ２の阻害剤として作用する。かかるペプチドは、一般式（Ｉ）Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくは、一般式（ＩＩ）：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列を含むペプチドである。
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００３３】
また、当該ペプチドにおいて、チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されていることが必要である；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
好ましくは、チロシンの水酸基は、スルホ基もしくはバナジン酸基により修飾されており、さらに好ましくは、スルホ基により修飾されている。
【００３４】
一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列の５８９〜５９８番目に相当するものであり、一般式（Ｉ）のアミノ酸配列は、Ｅｐｈ２のアミノ酸配列の５９４〜５９７番目に相当する。一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のチロシン（Ｔｙｒ）はＥｐｈＡ２のアミノ酸配列において５９４番目に相当する。また、当該チロシンはリン酸化されていることが必要である。ペプチドのアミノ末端にはアミノ保護基が付加されていてもよい。なお、一般式（ＩＩ）のアミノ酸配列は、ＥｐｈＡ１のアミノ酸配列の６００〜６０９番目に相当し、ＥｐｈＡ３およびＥｐｈＡ４のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＡ５のアミノ酸配列の６２９〜６３８番目、ＥｐｈＡ６のアミノ酸配列の７０１〜７１０番目、ＥｐｈＡ７およびＥｐｈＡ８のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ１のアミノ酸配列の５９５〜６０４番目、ＥｐｈＢ２のアミノ酸配列の５９７〜６０６番目、ＥｐｈＢ３のアミノ酸配列の６０９〜６１８番目、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の５９１〜６００番目、ＥｐｈＢ６のアミノ酸配列の６３１〜６４０番目に相当する。
【００３５】
本発明の修飾ペプチドは、４個〜３０個、好ましくは６個〜２５個、さらに好ましくは、８個〜１２個のアミノ酸からなる。
【００３６】
好ましくは、一般式Ｉにおいて、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ４はヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はスレオニンであるアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基である。
【００３７】
さらに好ましくは、一般式Ｉにおいて、Ｘ１はバリンであり、Ｘ２はアスパラギン酸であり、Ｘ３はプロリンであり、Ｘ４はヒスチジンであり、Ｘ５はスレオニンであり、Ｘ６はアスパラギン酸であり、Ｘ７はアスパラギンである。
【００３８】
本発明の修飾ペプチドは、自体公知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法の何れによって行ってもよく、即ち、ペプチドを構成しうる部分ペプチド鎖もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合には保護基を脱離させることにより目的のペプチドを製造することができる。
例えば、本発明の修飾ペプチドはＦｍｏｃ固相合成法により、連続フロー方式の自動合成機を用いて化学合成することができる。アミノ酸は、側鎖が保護基により保護された誘導体を使用し、固相担体上でペプチド鎖の伸長を行う。酸性条件下にて、脱保護・切り出しを行い、粗ペプチドを回収する。
【００３９】
このようにして得られたペプチドは、通常の精製方法、例えば溶媒抽出；蒸留；カラムクロマトグラフィー；液体クロマトグラフィー；再結晶等を組み合わせて単離精製することができる。
例えば、逆相ＨＰＬＣを用いて、粗ペプチドの分離・精製を行うことができる。逆相カラムは、ＯＤＳカラム（スペルコ社製：Ｃ１８）を使用して、移動相は水／アセトニトリル系（ＴＦＡ添加、０．１％）を使用することができる。精製を行ったペプチドは、凍結乾燥して、保存することができる（白色粉末、もしくはオイル状）。なお、逆相ＨＰＬＣにて純度を測定可能であり、ＴＯＦ−ＭＡＳＳにて分子量測定が可能であり、電子天秤により重量測定して、品質管理が可能である。
また、上記方法で得られたペプチドが遊離体である場合には公知の方法によって適当な塩に変換可能であり、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体に変換することも可能である。
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社などに合成を委託してペプチドを得ることも可能である。
【００４０】
本発明の修飾ペプチドまたはその塩は、ＳＨＰ２阻害剤として作用する。本発明の修飾ペプチドまたはその塩は、ＳＨＰ２の酵素活性が増強することにより誘発または促進される疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。当該疾患として、胃癌もしくはヌーナン症候群、白血病などが挙げられる。
【００４１】
本発明の修飾ペプチドまたはその塩を医薬組成物として用いる場合には、通常、それ自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコールのようなアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアゼテートゼラチン、ラクトース、デンプン等のような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ワセリン等と混合して錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤等の形態により経口又は非経口的に投与することができる。
また、本発明の修飾ペプチドは、ヒト用医薬としての使用は勿論、他の哺乳動物用医薬としても使用可能である。投与量は疾患の種類及び程度、投与するペプチド並びに投与経路、患者の年齢、性別、体重等により変わりうるが、注射剤の形での投与の場合、通常、成人１日当たり、約０．１〜３０ｍｇを投与するのが好ましい。また、本発明のペプチドは上記各種対象疾患の予防、治療の為に単独で投与する以外に、該疾患の予防、治療に有用な別の薬剤と併用することもできる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
（実施例１）ペプチド基質の調製
ペプチド基質の候補であるＪＸ１およびＪＸ２（それぞれＹ（Ｔｙｒ）がリン酸化されている）を、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社に委託して合成し、作製した。本ペプチドを１ｍＭの濃度になるように水に溶かし、−８０℃に保存した。
ＪＸ１：ＰＬＫＴＹＶＤＰＨＴ（配列番号３）
ＪＸ２：ＶＤＰＨＴＹＥＤＰＮ（配列番号４）
【００４４】
（実施例２）ＳＨＰ２酵素の調製
ＭｙｃタグをＣ末端に付加した下記（ａ）〜（ｅ）の各種ＳＨＰ２酵素を発現するプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたトランスフェクションによりＭＤＣＫ細胞に導入した。４０時間培養後に細胞を溶解し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−セファロースおよび抗ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降法により各種ＳＨＰ２を調製した。酵素は４℃にて保存した。
（ａ）ＳＨＰ２ Ｔ４６８Ｍ（配列番号５）：レパード症候群の患者で検出される変異体。酵素活性が低い。
（ｂ）ＳＨＰ２ Ｃ／Ｓ（Ｃ４５９Ｓ）（配列番号７）：不活性型。酵素活性なし。基質との複合体形成能有り。ただし（ｃ）ＳＨＰ２ ＤＭより複合体形成能は弱い。
（ｃ）ＳＨＰ２ ＤＭ（２箇所の置換がある。Ｄ４２５Ａ／Ｃ４５９Ｓ）（配列番号９）：不活性型。酵素活性なし。基質との複合体形成能有り。
（ｄ）ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（配列番号１１）：活性化型の変異体。高い酵素活性を示す。白血病の患者で検出される。
（ｅ）ＳＨＰ２ ｗｔ（配列番号１３）：野生型。
【００４５】
（実施例３）酵素活性の測定
９６ウェルプレート１ウェルあたり１０μｌの基質（最終濃度０．２５ｍＭ）、２０μｌの反応バッファー（最終濃度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＤＴＴ）および１０μｌの酵素（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温にて３０分間、反応させる。その後マラカイトグリーンを等量加え、遊離したリン酸とマラカイトグリーンの反応によって生じる波長６２０ｎｍの吸収をプレートリーダーにて測定した。基質としてＪＸ１またはＪＸ２、酵素として野生型ＳＨＰ２を使用した。ＩＲＳｐＹ１１７２（ＩＲＳ−１の１１７２番目のチロシンがリン酸化されたもの）を、野生型酵素の活性化剤として使用した。
【００４６】
その結果を図１に示す。ＪＸ２がＳＨＰ２の特異的な基質となることが判明した。
【００４７】
（実施例４）酵素活性の測定
実施例３と同様の方法により、基質としてＪＸ２を用い、酵素として（ａ）〜（ｅ）のＳＨＰ２を用いて、ＩＲＳｐＹ１１７２の存在下、もしくは非存在下で酵素活性を測定した。
【００４８】
その結果を図２に示す。ＳＨＰ２の野生型およびＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（高い酵素活性を示す）では酵素活性が認められた。一方、不活性型の変異型（ＳＨＰ２ Ｔ４６８Ｍ、ＳＨＰ２ Ｃ／Ｓ、ＳＨＰ２ ＤＭ）では酵素活性が認められなかった。
【００４９】
（実施例５）修飾ペプチドの調製
ＪＸ２−Ｓペプチド（Ｙ（Ｔｙｒ）にスルホ基が付加されている）を、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社に委託して合成し、作製した。本ペプチドを１ｍＭの濃度になるように水に溶かし、−８０℃に保存した。
ＪＸ２−Ｓ：ＶＤＰＨＴＹＥＤＰＮ（配列番号１５）
【００５０】
（実施例６）酵素活性の測定
ＳＨＰ２Ｄ６１ＹとＪＸ２−Ｓ（０，３０，１００，３００μＭ）とＴＢＳを混合して、１０分間、室温でインキュベートした。その後、基質としてＪＸ２（２００μＭ）を添加して、３０分間、室温でインキュベートした。その後、等量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭを添加して１０分間、室温でインキュベートし、波長６２０ｎｍの吸収を測定した。
【００５１】
その結果を、図３に示す。ＪＸ２−Ｓペプチドの量が増加するにつれて、酵素活性が阻害された。
【００５２】
（実施例７）ゼブラフィッシュにおける実験
Jopling Cらの方法（PLoS Genet. 2007 Dec;3(12):e225）に従って、ゼブラフィッシュの受精卵にヒトＳＨＰ２ ｍＲＮＡ変異体（ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡ）（配列番号２５）をマイクロインジェクションし、個体発生過程における心臓の形態変化を観察した。また、ＪＸ２−Ｓペプチドを、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡの注入と同時に受精卵に注入した。
なお、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇは、ヌーナン症候群で検出される弱い活性化型である。
【００５３】
その結果、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｇ ｍＲＮＡのみを注入した場合は、ゼブラフィッシュに心臓の異常、目が小さいなどの病態が発症していたが、ＪＸ２−Ｓペプチドの投与によりこれらの病態が抑えられることがわかった。
なお、ＳＨＰ２ Ｄ６１Ｙ（強い活性化型）のｍＲＮＡを注入した場合は、心臓が形成される前に胚発生が異常を示し、ゼブラフィッシュ全体が正常な形態ではなくなった（データは示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
上記説明したとおり、本発明のＥｐｈの部分ペプチドからなるペプチド基質は、ＳＨＰ２酵素の特異的に作用する。かかる基質をＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患についての簡便な検査方法、ＳＨＰ２酵素活性の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法に用いることが可能である。スクリーニング方法により得られたＳＨＰ２阻害剤もしくは促進剤は、ＳＨＰ２酵素活性に関連する疾患の予防剤もしくは治療剤として使用され得、有用である。また、本発明の修飾ペプチドは、生体内でＳＨＰ２酵素の活性を阻害して、ＳＨＰ２酵素活性の上昇により発症すると考えられる症状を抑制する。かかる修飾ペプチドは、ＳＨＰ２酵素活性の上昇により発症する病態の治療剤として使用することが期待され、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ペプチド基質のＳＨＰ２酵素に対する特異性に関する結果を示す。（実施例３）
【図２】ペプチド基質の機能を確認した結果を示す。（実施例４）
【図３】修飾ペプチドのＳＨＰ２阻害作用を確認した結果を示す。（実施例６）
【図４】修飾ペプチドのゼブラフィッシュ生体内での作用を確認した結果を示す。（実施例７）
【図５】Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列についてのアライメントを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ） Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
【請求項２】
下記の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
一般式（ＩＩ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の作用増強により誘発または促進される疾患の治療または予防剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項６】
一般式（Ｉ） Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
【請求項７】
下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
一般式（ＩＩ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、
Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
【請求項８】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを接触させることを含む、ＳＨＰ２酵素活性の測定方法。
【請求項９】
請求項６または７に記載のペプチド基質および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を測定するためのキット。
【請求項１０】
被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；
前記画分と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを接触させて、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
測定された酵素活性の値を基準値と比較する工程；
を含む、被験者由来の検体についてのＳＨＰ２酵素活性の検査方法。
【請求項１１】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、変化した場合に当該被検物質を選択する工程；
を含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２、請求項６または７に記載のペプチド基質、および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニングキット。
【請求項１】
一般式（Ｉ） Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
【請求項２】
下記の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩：
一般式（ＩＩ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基が以下の群より選択されるいずれか１の置換基により、修飾されている；スルホ基、バナジン酸基、炭酸基、ハロゲニド基、亜燐酸基、クロム酸基、シュウ酸基、酢酸基、硝酸基、ヘキサン酸基、セバシン酸基、モリブデン酸基、タングステン酸基、シアノ基、ハロゲン原子、カルバモイル基、メルカプト基、炭素数１〜６個のアルキルチオ基、炭素数１〜６個のアルカンスルフィニル基、炭素数１〜６個のアルカンスルホニル基、複素環基、炭素数３〜８個のシクロアルキル基、アミノ基、アミノアリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、アミジノ基、グアニジノ基、カルボキシル基、または、テトラゾリル基、あるいは、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていない炭素数１〜６個のアルキル基、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換された、もしくは置換されていないアリール基、または、上記の何れかに記載の置換基もしくは水酸基で置換されたアラルキル基。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２の作用増強により誘発または促進される疾患の治療または予防剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のペプチドまたはその塩を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項６】
一般式（Ｉ） Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
式中、Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
【請求項７】
下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むチロシンキナーゼ受容体Ｅｐｈファミリー分子の部分ペプチドからなる、チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２のペプチド基質：
一般式（ＩＩ） Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５―Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｘ６―Ｐｒｏ―Ｘ７（配列番号２）
式中、
Ｘ１はバリン、イソロイシン、アラニンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ２はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ３はプロリンまたはロイシンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ４はグルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
Ｘ５はアラニンまたはスレオニンのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ６はアスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかのアミノ酸残基であり、
Ｘ７はアラニン、アスパラギン、スレオニン、セリン、グリシン、システインから選択されるいずれか１のアミノ酸残基であり、
チロシン（Ｔｙｒ）がリン酸化されている。
【請求項８】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含み得る試料と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを接触させることを含む、ＳＨＰ２酵素活性の測定方法。
【請求項９】
請求項６または７に記載のペプチド基質および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を測定するためのキット。
【請求項１０】
被験者由来の検体からチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２を含む画分を調製する工程；
前記画分と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを接触させて、ＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
測定された酵素活性の値を基準値と比較する工程；
を含む、被験者由来の検体についてのＳＨＰ２酵素活性の検査方法。
【請求項１１】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２と、請求項６または７に記載のペプチド基質とを、被検物質の存在下で接触させてＳＨＰ２酵素活性を測定する工程；
被検物質の存在下でのＳＨＰ２酵素活性が、前記被検物質の非存在下でのＳＨＰ２酵素活性と比較して、変化した場合に当該被検物質を選択する工程；
を含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
チロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ２、請求項６または７に記載のペプチド基質、および反応バッファーを含む、ＳＨＰ２酵素活性を変動させる物質のスクリーニングキット。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−４３０２６（Ｐ２０１０−４３０２６Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０８３７４（Ｐ２００８−２０８３７４）
【出願日】平成２０年８月１３日（２００８．８．１３）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１３日（２００８．８．１３）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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