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テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
説明

テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途

【課題】植物への芳香性の付与または芳香性の改変に利用できる、新たな遺伝子、より詳細には、テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途を提供する。
【解決手段】テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードする、特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド。これらのポリヌクレオチドを植物体に導入することによって、前記植物体に芳香性を付与したり、または、前記植物体の芳香性を改変する方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドに関し、さらに、これを用いた形質転換体、植物体の芳香性の改変方法および芳香性改変植物体の製造方法等の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
花において、香りは、色および形と並ぶ花の魅力の1つである。特に、野生種には、香りを有するものが多いが、品種改良の過程において、色、形、耐病性および日持ち等が優先された結果、その代償に、本来の香りが弱くなったものや、香りを失ったものも多く存在する。香りの感じ方および嗜好には、個人差があり、また、栽培による香りのバラつきも大きいことから、色や形に比べて特にその取り扱いが難しい。この理由から、これまで、色および形と比較して、芳香性品種の育種についての試みは、ほとんど報告されていない。
【0003】
しかしながら、近年、ニーズの多様化に伴って、香りに対する理解および消費が高まってきており、香りが、生花における大きな魅力の一つとして捉えられている。また、香りは、人の感性にとって、重要な役割も有している。このような状況において、色、形および日持ち性に加えて、優れた芳香性を示す園芸植物は、高い商品価値を有することが期待され、その開発が望まれている。これまでに、ツバキやスイトピー、シクラメン等に関して、交雑育種による芳香性品種の開発が行われている。この場合、通常、片親には香りの強い野生種または比較的野生種に近い品種が使用されるが、これら野生種またはこれに近い品種は、一般に、園芸種に比べて花が小さく、花色も限られている。このため、得られる交雑種では花の大きさが既存の品種よりも小さくなる傾向にあり、色のバリエーションも制限されるという問題があった。
【0004】
他方、花の香りは、多種類の香気成分の混合物であり(非特許文献1)、前記香気成分は、大きく、芳香族化合物、テルペノイド(モノテルペン等)、脂肪族化合物、含窒素化合物等に分類される。花は、例えば、含有される香気成分の違いだけなく、含有される香気成分が同じであっても、その割合によって、香りの質は大きく変化する。このように、様々な香気成分がブレンドされることで、多様な花の香りが生まれている。
【0005】
テルピネオール(terpineol)は、天然に存在するモノテルペンの一種であり、月桂樹、ローズマリー、アニス、マジョラム等、またはアキギリ属、ビャクシン属等の植物の精油、およびテレビン油の成分でもある。前記テルピネオールは、ヒドロキシ基と二重結合の位置が異なる4種類の異性体、α、β、γ、δ−テルピネオールが知られている。テルピネオールは、通常、天然ではこれらの混合物として存在し、主成分はα−テルピネオールである。前記テルピネオールは、ライラックに似た芳香を持ち、香料として使用され、例えば、化粧品、石鹸等に添加物として使用される。また、前記テルピネオールは、例えば、ホットメルト接着剤の可塑剤として使用される。また、前記テルピネオールは、防虫効果を有することも知られている。
【0006】
前記テルピネオールの生合成経路は、植物の場合、細胞質に存在するメバロン酸(MVA)経路と、プラスチドに存在するメチルエリトリトールリン酸(MEP)経路の2種類が知られている。前記メバロン酸経路では、アセチルCoAが他の2分子のアセチルCoAと反応し、還元されて生じるメバロン酸を介して、モノテルペンが合成される。具体的には、メバロン酸が脱炭酸して、イソペンテニルピロリン酸(以下、「IPP」と表す)およびジメチルアリルピロリン酸(以下、「DMAPP」と表す)となり、これら2つが、テルペノイド芳香性化合物の基本構造であるイソプレン骨格の起源となる。一方、メチルエリトリトールリン酸経路では、3−ホスホグリセルアルデヒドとピルビン酸から、脱炭酸および異性化を経て生じる2−メチル−エリトリトール−4−リン酸(MEP)を介して、IPPとDMAPPが合成される。そして、ゲラニルピロリン酸合成酵素(以下、「GPPS」と表す)の作用により、DMAPPに、一分子のIPPが付加することで、ゲラニルピロリン酸(以下、「GPP」と表す)となる。このGPPに、テルピネオール合成酵素(以下、「TES」と表す)等のモノテルペン合成酵素が作用し、テルピネオールが生成される(非特許文献2)。
【0007】
前記TES遺伝子は、これまでにいくつかの植物から取得されている。具体的には、例えば、Vitis vinifera(ブドウ)由来TES遺伝子(非特許文献3)、Magnolia grandiflora(タイサンボク)由来TES遺伝子(非特許文献4)である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Dudareva N et al., Curr. Opin. Biotechnol..181−189, 2008
【非特許文献2】Plant terpenoid synthase : Molecular biology and phylogenetic analysis,Jorg Bohlmann Gilbert Meyer−Gauen Rodney Croteau,Proc. Natl. Acad. Sci. (95)4126−4133
【非特許文献3】Identification of Vitis vinifera (−)−α−terpineol synthase by in silico screening of full length cDNA ESTs and functional characterization of recombinant terpene synthase.(2004) Diane M. Martine, Jorg Bohlmann, Phytochemistry (65)1223−1229
【非特許文献4】Biochemical and genomic characterization of terpene synthases in Magnolia grandiflora.(2008) Plant Physiol. (147)1017−1033
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
以上のように、交雑育種によると、種々の問題が生じ、優良な形質を維持したまま、芳香性の付与または改変を行うためには、遺伝子組換え技術の適用が有用と考えられる。そこで、本発明は、植物への芳香性の付与または芳香性の改変に利用できる、新たな遺伝子、より詳細には、テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明のポリヌクレオチドは、下記(a)〜(g)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
(a)配列番号1、3、5、7、9または11の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)前記(a)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)前記(a)のいずれかの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)前記(a)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)前記(e)のいずれかのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)前記(e)のいずれかのアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【0011】
本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【0012】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。
【0013】
本発明の形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする。
【0014】
本発明の加工品は、前記本発明の形質転換体、もしくは、形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品であることを特徴とする。
【0015】
本発明の芳香性の改変方法は、非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする。
【0016】
本発明の芳香性非ヒト宿主の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。
【0017】
本発明のタンパク質は、下記(A)〜(C)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
(A)配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
(C)前記(A)のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【0018】
本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりテルピネオール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、テルピネオール合成酵素を発現し、これにより香気成分であるテルピネオールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性を改変したりできるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
<ポリヌクレオチド>
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、前記(a)〜(g)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドであることを特徴とする。
【0020】
これらのポリヌクレオチドは、例えば、後述するように、フリージアより取得できる。これまで取得された、前述のVitis vinifera(ブドウ)由来TES遺伝子、Magnolia grandiflora(タイサンボク)由来TES遺伝子は、いずれも双子葉植物由来のものであり、単子葉植物由来のテルピネオール合成酵素遺伝子については、本発明により初めて明らかにされたものである。
【0021】
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードする。このため、例えば、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることで、テルピネオール合成活性を有するタンパク質を製造できる。前記タンパク質の発現は、例えば、非ヒト宿主への導入によって行ってもよいし、いわゆる無細胞タンパク質合成系において行ってもよい。また、前記ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることで、発現した前記タンパク質のテルピネオール合成活性により、テルピネオールを合成できる。前記テルピネオールは、例えば、前記発現したタンパク質を、基質を含む反応系に添加して、合成することもできるし、前記非ヒト宿主に前記ポリヌクレオチドを導入し、前記非ヒト宿主において前記タンパク質を発現させ、前記タンパク質により前記非ヒト宿主内で合成することもできる。前記非ヒト宿主内で前記テルピネオール合成を行うことによって、前記非ヒト宿主について、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。前記ポリヌクレオチドによって芳香性を改変する場合、後述するように、前記非ヒト宿主は、例えば、植物体またはその部分が好ましい。
【0022】
本発明において、以下、テルピネオール合成活性をTES活性という。本発明のポリヌクレオチドは、TES活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることから、テルピネオール合成酵素遺伝子(以下、「TES遺伝子」ともいう)と表わすこともできる。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、後述する本発明のタンパク質であり、TES活性を有することから、テルピネオール合成酵素(以下、「TES」または「TESタンパク質」ともいう)と表わすこともできる。
【0023】
前記TES活性は、基質からテルピネオールの生成を触媒する活性である。前記基質は、特に制限されず、例えば、ゲラニルピロリン酸(GPP)があげられる。
【0024】
前記TES活性により生成される前記テルピネオールは、他の酵素の働きや自動的な化学変換により、例えば、配糖体やアルデヒド体、ケトン体、エステル体等に変換できる。
【0025】
テルピネオールは、ヒドロキシ基と二重結合の位置が異なる4種類の異性体、α−テルピネオール、β−テルピネオール、γ−テルピネオール、およびδ−テルピネオールが存在する。前記テルピネオールは、ライラックに似た芳香を有している。テルピネオールは、通常、天然ではこれらの混合物として存在し、主成分はα−テルピネオールである。本発明において、前記テルピネオール合成活性は、例えば、α−テルピネオール、β−テルピネオール、γ−テルピネオール、およびδ−テルピネオールの合成活性のいずれでもよく、また、2種類以上の異性体の合成活性でもよく、好ましくは、α−テルピネオール合成活性である。
【0026】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、例えば、TES活性のみを有してもよいし、さらに、その他の触媒機能を有してもよい。
【0027】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記(a)〜(g)のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。後者の場合、例えば、センス鎖として、前記(a)〜(g)のいずれかのポリヌクレオチドと、アンチセンス鎖として、前記ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを含む。
【0028】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドから構成されるDNAでもよいし、リボヌクレオチドから構成されるRNAでもよい。後者の場合、例えば、DNAの塩基配列に対応する塩基配列、具体的には、塩基Tが塩基Uに置換された塩基配列からなるRNAがあげられる。
【0029】
前記(a)は、配列番号1、3、5、7、9または11の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。前記(a)において、配列番号1および配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア(Freesia refracta)から得られ、具体的には、品種アラジン(Freesia refracta cv. Aladdin)から得られる。配列番号1の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長cDNA配列であり、1〜234位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、235〜1785位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号1の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号2で表わされ、1〜78位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、79〜594位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド(cTP)配列として存在する。また、配列番号3の塩基配列は、配列番号1の塩基配列において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号3の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号4で表わされる。
FAfn01遺伝子(s+:シグナルペプチドのコード配列を含む)
1785bp(配列番号1)
ATGGCGTGTCTTCCATTCCACTACACGACTTACAGTCGATCACCTGCCGGAATATTGTTCCGATCGTCTCTGCCTTCTTCTCACTGTAGAGCACGCAGAAGCAGAAGCAATGAAAGTGCAAACCGCATTCGGTGTTGCAACAACACTCAAATTTCTCAGCCTTTACGGCGGACGGCGAACTATCCACCGACCATCTGGGAAAACAGCTATATTCAAGAACTCAATACTGATTATATGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAGGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGACAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn01タンパク質(s+:シグナルペプチドを含む)
594aa(配列番号2)
MACLPFHYTTYSRSPAGILFRSSLPSSHCRARRSRSNESANRIRCCNNTQISQPLRRTANYPPTIWENSYIQELNTDYMEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARDRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
FAfn01遺伝子(s−:シグナルペプチドのコード配列を含まない)
1551bp(配列番号3)
ATGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAGGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGACAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn01タンパク質(s−:シグナルペプチドを含まない)
516aa(配列番号4)
MEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARDRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
【0030】
前記(a)において、配列番号5および配列番号7の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア(Freesia refracta)から得られ、具体的には、品種アラジン(Freesia refracta cv. Aladdin)から得られる。配列番号5の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長cDNA配列であり、1〜234位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、235〜1788位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号5の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号6で表わされ、1〜78位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、79〜595位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド(cTP)配列として存在する。また、配列番号7の塩基配列は、配列番号5の塩基配列において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号7の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号8で表わされる。
FAfn16遺伝子(s+:シグナルペプチドのコード配列を含む)
1788bp(配列番号5)
ATGGCGTGTCTTCCATTCCACTACACGACTTACAGTCGATCACCTGCCGGAATATTGTTCCGATCGTCTCTGCCTTCTTCTCACTGTAGAGCACGCAGAAGCAGAAGCAATGAAAGTGCAAACCGCATTCGGTGTTGCAACAACACTCAAATTTCTCAGCCTTTACGGCGGACGGCGAACTATCCACCGACCATCTGGGAAAACAGCTATATTCAAGAACTCAATACTGATTATATGCAGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAAGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGACAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn16タンパク質(s+:シグナルペプチドを含む)
595aa(配列番号6)
MACLPFHYTTYSRSPAGILFRSSLPSSHCRARRSRSNESANRIRCCNNTQISQPLRRTANYPPTIWENSYIQELNTDYMQEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARDRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
FAfn16遺伝子(s−:シグナルペプチドのコード配列を含まない)
1554bp(配列番号7)
ATGCAGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAAGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGACAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn16タンパク質(s−:シグナルペプチドを含まない)
517aa(配列番号8)
MQEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARDRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
【0031】
前記(a)において、配列番号9および配列番号11の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、フリージア(Freesia refracta)から得られ、具体的には、品種アラジン(Freesia refracta cv. Aladdin)から得られる。配列番号9の塩基配列は、シグナルペプチドを含むタンパク質をコードする全長cDNA配列であり、1〜234位の下線領域が、シグナルペプチドのコード配列であり、235〜1788位が、成熟タンパク質の全長コード配列である。配列番号9の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号10で表わされ、1〜78位の下線領域が、シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、79〜595位が、成熟タンパク質の全長アミノ酸配列である。前記シグナルペプチドは、例えば、前記フリージアにおいては、クロロプラスト トランジット ペプチド(cTP)配列として存在する。また、配列番号11の塩基配列は、配列番号9の塩基配列において、前記シグナルペプチドのコード配列を除く、前記成熟タンパク質の全長コード配列を示す。配列番号11の塩基配列でコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号12で表わされる。
FAfn27遺伝子(s+:シグナルペプチドのコード配列を含む)
1788bp(配列番号9)
ATGGCGTGTCTTCCATTCCACTACACGACTTACAGTCGATCACCTGCCGGAATATTGTTCCGATCGTCTCTGCCTTCTTCTCACTGTAGAGCACGCAGAAGCAGAAGCAATGAAAGTGCAAACCGCATTCGGTGTTGCAACAACACTCAAATTTCTCAGCCTTTACGGCGGACGGCGAACTATCCACCGACCATCTGGGAAAACAGCTATATTCAAGAACTCAATACTGATTATATGCAGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAGGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGGCAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn27タンパク質(s+:シグナルペプチドを含む)
595aa(配列番号10)
MACLPFHYTTYSRSPAGILFRSSLPSSHCRARRSRSNESANRIRCCNNTQISQPLRRTANYPPTIWENSYIQELNTDYMQEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARGRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
FAfn27遺伝子(s−:シグナルペプチドのコード配列を含まない)
1554bp(配列番号11)
ATGCAGGAAGATGAGGAAACCATTGAAATCGGGAAGCTGAAGGAGTACGTCATGACAAGACTAATTATTAGTAACTCGGATCAAATTGAGCTCATTGATACTCTGCAACAGCTTGGGGTGGCATACCATTTTCAGGAGGAAATACAAAATATATTAGCCACCATATTTTGTTCAATAAAGAAAATAATTCCCACTATACATAATGATATTTATGCTACAGCCCTGCTCTTTAGGCTCCTTAGAGAGAAGGGTTTTCATGTCTCCACAAATATTTTCAACAACTTCAAAGAAGAGGGAGGAACTTTCAAGGCTTGCCTAAAGAATGATATTAAAGGCATGTTAAGCTTGTATGAAGCATCCTTCCTTGCTGTGGAAGGAGAGAATGAATTGGATGAAGCTAGACTCTTTGCAACCGAATGTCTGAAACATACGATGGAGAACTCGTTGTCGTTAGAGCCATCAATGAAAGAACGCATAGTTCATGCCTTGGAGCTTCCACTACATTGGAGGATGTCAAGACTACATAGCAGGTGGTTCATAGATCAATACGAGAAGGATGAAAAGATGAATCCCACATTGTTGAGATTGGCTAAGTTGGACTTCAATTTTGTGCAAACCATTTACAAAAGAGAGCTCAAGGAATTATCAAGGTGGTGGAGCAATCTGGATCTTCTTGGAGACAAACTAGGGTTTGCTAGAGGCAGGTTGGTCGAGAATTACTTGTGGACAGTTGGTTCAGCCTTCGAGCCAAAGTTCTGGCAAAGTAGAGAAGCATTGACGAAGGCCAATTGTCTAATAACAACAATAGATGACATTTATGACGTCTATGGCACCTTGGATGAACTGGTGCTATTCACTGATGTCGTCGATAGGTGGGATGTCAATGCAATCGAACAACTTCCAGATTACATGAAGACTTGCCTTTTGGCACTCTTCAACACCACTAACGATACTGCCTATAAAATTTTGAACTTGAAGGGTGTAATCATAATTCCGCAGCTAAAGAAAGTGTGGGCAGATTTGTGTAAAGCATATTTGGTAGAGGCCAAGTGGTATCACAGTGGATATATGCCAACTCTGGAGGAATATCTAGACAATGGATGGATATCAATATCAGGGCATGTGGCATTAGCTCATGCTTTTTGTACAAGTGAAGACATAACATATAGAGCACTACAATGCTACAACCAGCTCTCTCCCAATTTACTCTTCCATTCTTCTGTGATTGTTCGGCTCGTCGACGATTTGGCAACATCAACTGCGGAGCTTGAGAGAGGTGATGTTCCAAAAGCAATCCAATGCTACATGAAACAGAATAGAGTTTCAGAGGAAGTAGCTCGAGAGAAAATTAAAGAGATGATTGTCTCCACTTGGGAAAAGTTGAATGGTGATCTCATTGCTACTTCCTCTGTTGTAGAATCGTTCCAATCAGTAGCACTGAATTTTCCTAGAATGGCACAATGCATATACCAGTATGGAGATGGATATGGGGATCCAACACAAAAAACTAAGGATCAAATCGTCTCTCTTCTTATACAACCTGTTTCCCTCTAA
FAfn27タンパク質(s−:シグナルペプチドを含まない)
517aa(配列番号12)
MQEDEETIEIGKLKEYVMTRLIISNSDQIELIDTLQQLGVAYHFQEEIQNILATIFCSIKKIIPTIHNDIYATALLFRLLREKGFHVSTNIFNNFKEEGGTFKACLKNDIKGMLSLYEASFLAVEGENELDEARLFATECLKHTMENSLSLEPSMKERIVHALELPLHWRMSRLHSRWFIDQYEKDEKMNPTLLRLAKLDFNFVQTIYKRELKELSRWWSNLDLLGDKLGFARGRLVENYLWTVGSAFEPKFWQSREALTKANCLITTIDDIYDVYGTLDELVLFTDVVDRWDVNAIEQLPDYMKTCLLALFNTTNDTAYKILNLKGVIIIPQLKKVWADLCKAYLVEAKWYHSGYMPTLEEYLDNGWISISGHVALAHAFCTSEDITYRALQCYNQLSPNLLFHSSVIVRLVDDLATSTAELERGDVPKAIQCYMKQNRVSEEVAREKIKEMIVSTWEKLNGDLIATSSVVESFQSVALNFPRMAQCIYQYGDGYGDPTQKTKDQIVSLLIQPVSL
【0032】
前記(b)は、前記(a)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(b)において、「1もしくは数個」は、例えば、前記(b)のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記(a)のいずれかの塩基配列において、塩基は、例えば、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個、最も好ましくは1または2個、欠失、置換および/または付加されてもよい。
【0033】
前記(c)は、前記(a)のいずれかの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(c)において、「同一性」は、例えば、前記(c)のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上である。前記同一性は、例えば、BLAST、FAST等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる(以下、同様)。
【0034】
前記(d)は、前記(a)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(d)において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記(a)のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイ、プラークハイブリダイゼーションアッセイ等の公知の方法があげられる。ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ザンブルーク(Sambrook)ら編「モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリーマニュアル第2版(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【0035】
前記(d)において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク(Sambrook)ら編「モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリーマニュアル第2版(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」〔(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
【0036】
前記(e)は、配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(e)のポリヌクレオチドは、例えば、前記(e)のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記TES活性を有する塩基配列であればよい。前記(e)のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。具体例として、配列番号2または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記(a)における配列番号1または3の塩基配列があげられる。配列番号6または8のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記(a)における配列番号5または7の塩基配列があげられる。配列番号10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記(a)における配列番号9または11の塩基配列があげられる。
【0037】
前記(f)は、前記(e)のいずれかのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(f)において、アミノ酸に関する「1もしくは数個」は、例えば、前記(f)のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記(e)のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個、最も好ましくは1または2個、欠失、置換および/または付加されてもよい。
【0038】
前記(g)は、前記(e)のいずれかのアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記(g)において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記(g)のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上である。前記同一性は、例えば、前述のように、BLAST、FAST等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【0039】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【0040】
本発明のポリヌクレオチドの使用目的は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにコードされる本発明のTESタンパク質の製造、前記TESタンパク質を発現する形質転換体の製造、前記TESタンパク質のテルピネオール合成活性によるテルピネオールの合成等に使用できる。前記本発明のポリヌクレオチドから本発明のTESタンパク質を製造する場合、前記ポリヌクレオチドは、例えば、無細胞タンパク質合成系に使用してもよいし、前記非ヒト宿主に導入して使用してもよい。
【0041】
本発明のポリヌクレオチドの使用方法は、特に制限されず、例えば、非ヒト宿主(以下、「宿主」ともいう)に導入することが好ましい。前記非ヒト宿主に前記ポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のTESタンパク質の製造、前記本発明のTESタンパク質を発現する形質転換体の製造、本発明のTESタンパク質を発現し、テルピネオールを合成する形質転換体の製造等が可能である。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述した本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて適宜選択できる。前記宿主は、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等があげられる。
【0042】
本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体を意味し、「植物体の部分」は、前記植物個体の部分であり、例えば、器官、組織または細胞等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎(地下茎)、根、むかご等があげられる。前記茎は、例えば、球根等の鱗茎、塊茎、球茎、根茎、ライナー等があげられ、前記根は、例えば、塊根、横走根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織および/または細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織および/また細胞でもよい。
【0043】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する場合、前記非ヒト宿主は、例えば、前記植物体またはその部分が好ましい。前記植物体の種類および前記植物体の部分の種類は、特に制限されない。前記非ヒト宿主に、本発明のポリヌクレオチドを導入することによって、例えば、前記非ヒト宿主の非芳香性を芳香性に改変したり、テルピネオールに由来する芳香性をより増強したりすることができる。また、導入前の非ヒト宿主が本来有する芳香化合物とは異なる芳香化合物としてテルピネオールを合成し、異なる芳香性に改変したり、テルピネオールのさらなる合成によって、異なる芳香性に改変することが可能である。前記非ヒト宿主に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体ともいう。また、前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、芳香性改変植物体ともいう。
【0044】
芳香性の改変の対象となる植物は、特に制限されず、例えば、ナス科植物(例えば、カリブラコア、ニーレンベルギア等)、ナデシコ科植物(カーネーション、カスミソウ等)、キク科植物(キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等)、サクラソウ科植物(シクラメン等)、リンドウ科植物(トルコギキョウ、リンドウ等)、ゴマノハグサ科植物(トレニア等)、ベンケイソウ科植物(カランコエ)、ユリ科植物(チューリップ等)、ヒルガオ科植物(アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ等)、アジサイ科植物(アジサイ等)、ウリ科植物(ユウガオ等)、モクセイ科植物(レンギョウ等)等があげられる。前記芳香性改変植物は、特に制限されず、例えば、バラ、ゴマノハグサ科植物(キンギョソウ等)、ナス科植物(例えば、ペチュニア等)、バラ科植物(例えば、バラ等)、ラン科植物(ラン等)、アヤメ科植物(フリージア、アヤメ、グラジオラス等)、ユリ科植物(ユリ等)、フロウソウ科植物(ペラルゴニウム、ゼラニウム等)、ツバキ科植物(ツバキ、チャノキ等)等があげられる。好ましくは、カーネーションおよびトレニアである。
【0045】
前記本発明のポリヌクレオチドによって、前記本発明のTESタンパク質を製造する場合、前記非ヒト宿主は、特に制限されない。前記非ヒト宿主は、前述と同様であるが、中でも、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等が好ましい。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、COS細胞、CHO細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Sf9、Sf21等があげられる。前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明のTESタンパク質を製造できる。前記非ヒト宿主に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより得られる形質転換体は、前述と同様に、本発明の形質転換体である。
【0046】
前記本発明のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行える。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
【0047】
前記導入方法は、例えば、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法DEAE−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、後述するような本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【0048】
前記宿主が、植物体またはその部分の場合、前記ポリヌクレオチドの導入は、例えば、前記植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、前記組織または細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【0049】
<発現ベクター>
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを容易に前記宿主へ導入でき、また、前記宿主における前記本発明のポリヌクレオチドの発現を、容易に制御できる。
【0050】
本発明の発現ベクターの使用目的および使用方法は、特に制限されず、前述の本発明のポリヌクレオチドと同様である。
【0051】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記宿主において、前記本発明のポリヌクレオチドがコードする前記本発明のTESタンパク質を発現可能なように、前記本発明のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記宿主は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様に、例えば、植物体またはその部分、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等があげられる。
【0052】
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター(以下、「基本ベクター」ともいう)に、前記本発明のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、pBI121、pPZP202、pBINPLUSおよびpBIN19等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、pETベクター(Merck社)、pColdベクター(タカラバイオ株式会社)、PQEベクター(QIAGEN社)等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられ、また、pYES(Invitrogen社)、pESC(Stratagene社)等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。
【0053】
本発明の発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のTESタンパク質の発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列(ori)等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、シミアンウイルス−40(SV−40)、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、lacオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記本発明のTESタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて前記調節配列を配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【0054】
本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【0055】
本発明の発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行える。前記導入方法は、例えば、宿主の種類、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。
【0056】
前記導入方法は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの説明と同様であり、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法DEAE−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記宿主が植物体またはその部分の場合、例えば、中でも、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。
【0057】
前記発現ベクターの導入は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの説明と同様である。前記宿主は、例えば、前述の通りである。前記宿主が、植物またはその部分の場合、例えば、植物体およびその部分のいずれに行ってもよく、好ましくは前記植物体の部分であり、より好ましくは前記組織または前記細胞であり、さらに好ましくは細胞である。前記組織は、例えば、前記植物体から切り出した切片等があげられ、具体的には、葉、茎、根等の切片である。前記細胞は、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。本発明の発現ベクターの導入により得られる形質転換体は、後述する本発明の形質転換体であり、芳香性改変形質転換体または芳香性改変植物体ともいう。
【0058】
前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入して得られる形質転換体は、例えば、さらに、生育させてもよい。本発明において、「形質転換体」は、例えば、さらに、これらを生育させた生育体の意味も含む。例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記非ヒト宿主に導入して前記形質転換体を得た場合、前記非ヒト宿主を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた、培養細胞、組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【0059】
<形質転換体等>
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主であることを特徴とする。また、本発明の形質転換体は、前記ポリヌクレオチドを有する前記本発明の発現ベクターが導入された非ヒト宿主でもよい。以下、「本発明のポリヌクレオチドの導入」は、特に示さない限り、「本発明の発現ベクターの導入」の意味も含む。
【0060】
本発明の形質転換体は、前記本発明のポリヌクレオチドが発現可能に導入された非ヒト宿主であればよく、その他の構成は、何ら制限されない。「ポリヌクレオチドが発現可能」は、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能であるとの意味を含む。前記非ヒト宿主に対する、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記本発明の発現ベクターにおける説明を引用できる。
【0061】
本発明の形質転換体の使用方法は、特に制限されない。前記本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明のポリヌクレオチドの発現によって、前記本発明のTESタンパク質を発現可能である。このため、前記形質転換体は、本発明のTESタンパク質の製造に使用できる。前記形質転換体により製造された本発明のTESタンパク質は、テルピネオール合成活性を示すことから、前述のようにテルピネオール合成に使用できる。前記テルピネオールは、例えば、前記形質転換体から回収した前記TESタンパク質を、基質を含む反応液に添加して、合成することもできるし、前記形質転換体において、前記TESタンパク質を発現させ、前記TESタンパク質により合成することもできる。前記形質転換体内で前記テルピネオール合成を行うことによって、例えば、前記形質転換体について、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等が可能となる。このような形質転換体は、例えば、芳香性改変形質転換体ということもできる。
【0062】
前記本発明の形質転換体は、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは前記本発明の発現ベクターを導入した後、さらに生育させて得られた生育体でもよい。具体例として、前記本発明のポリヌクレオチドを、前記細胞に導入して前記形質転換体を得た場合、例えば、前記細胞を生育させて、さらに、組織、器官または個体に再生させてもよい。このようにして得られた組織、器官または個体は、本発明において、前述のように、形質転換体に含まれる。
【0063】
本発明の形質転換体は、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、TES活性を有する前記本発明のTESタンパク質が発現されていることが好ましい。また、本発明の形質転換体は、例えば、さらに生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のTESタンパク質が発現されてもよい。
【0064】
芳香性を改変する場合、前記形質転換体は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された植物体またはその部分が好ましい。前記形質転換体は、例えば、芳香性改変植物体ということもできる。前記形質転換体は、より好ましくは、前記植物体の部分であり、さらに好ましくは、組織または細胞であり、特に好ましくは細胞である。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、さらに、組織、器官または植物個体に再生することが好ましい。
【0065】
本発明の形質転換体において、前記テルピネオールが合成される部位は、特に制限されない。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記合成される部位は、例えば、花弁、花冠、花、葉、茎、根等があげられる。
【0066】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、カルス、プロトプラスト等があげられる。
【0067】
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖(vegetative propagerion)があげられ、栄養生殖(vegetative reproduction)ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
【0068】
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、例えば、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
【0069】
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体およびその部分のいずれでもよい。
【0070】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
【0071】
<非ヒト宿主の芳香性の改変方法および芳香性改変非ヒト宿主の製造方法>
本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前述のように、前記非ヒト宿主に、前記本発明のポリヌクレオチドを導入する工程を含むことを特徴とする。また、本発明の非ヒト宿主の芳香性の改変方法は、前記非ヒト宿主に、前記ポリヌクレオチドを含む前記本発明の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴としてもよい。
【0072】
本発明によれば、例えば、前記非ヒト宿主に前記本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを導入することで、前述した本発明の形質転換体が得られる。前記形質転換体は、前述のように、TES活性を有する前記本発明のタンパク質を発現することによって、テルピネオールを合成できる。このため、本発明の改変方法によれば、例えば、前記非ヒト宿主の芳香性を、未導入の場合と比較して、非芳香性から芳香性に改変、未導入よりも芳香性を増強、未導入とは異なる芳香性等に改変できる。本発明の改変方法により得られる本発明の形質転換体は、前述のように、例えば、前記芳香性改変形質転換体ということもできる。
【0073】
本発明において、前記非ヒト宿主は、特に制限されず、前述のものがあげられるが、中でも前記植物体またはその部分が好ましい。前記非ヒト宿主が、前記植物体またはその部分の場合、前記形質転換体は、前記芳香性改変植物体ということもできる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前述と同様に、植物体およびその部分のいずれに導入してもよく、好ましくは、前記植物体の部分であり、より好ましくは、組織および細胞であり、さらに好ましくは、細胞である。前記本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、何ら制限されず、前述の方法が引用できる。
【0074】
本発明の改変方法は、前記導入工程の後、さらに、前記ポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主、すなわち、前記本発明の形質転換体を生育する工程を含むことが好ましい。前記導入工程で得られる前記形質転換体が前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は個体に、前記組織は器官または個体に、前記細胞は組織、器官または個体に、再生することが好ましい。前記生育の条件は、特に制限されず、前記形質転換体の種類に応じて、適宜設定できる。前記形質転換体が、例えば、前記植物体の部分、具体的に、前記器官、前記組織または細胞の場合、この生育工程において、前記器官は植物個体に、前記組織は器官または植物個体に、前記細胞は組織、器官または植物個体に、再生することが好ましい。
【0075】
前記形質転換体は、前述のように、導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、TES活性を有する前記本発明のタンパク質が発現されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、例えば、前記生育工程において生育させることで、前記導入された前記本発明のポリヌクレオチドに基づいて、前記本発明のタンパク質が発現されてもよい。
【0076】
前記芳香性が改変する部位は、特に制限されない。前記形質転換体が植物体またはその部分の場合、例えば、植物体全体でもよいし、花弁、花冠、花、葉、茎、根等でもよい。
【0077】
次に、本発明の芳香性改変非ヒト宿主の製造方法は、前述のように、前記本発明の芳香性の改変方法により、前記非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の芳香性の改変方法を実施することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、前記本発明の芳香性の改変方法を引用できる。
【0078】
本発明において、芳香性の改変は、例えば、非芳香性から芳香性への改変、芳香性の増強、香りの改変等のいずれでもよい。
【0079】
<TESタンパク質>
本発明のタンパク質は、前述のように、下記(A)〜(C)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
(A)配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
(C)前記(A)のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
【0080】
本発明のタンパク質は、前述のように、TES活性を有するタンパク質であり、TESまたはTESタンパク質ということもできる。本発明のTESタンパク質は、特に示さない限り、前記本発明のポリヌクレオチドの説明を引用できる。本発明のTESタンパク質は、前述のようにTES活性を有していればよく、例えば、ポリペプチドでもよい。
【0081】
前記(A)において、配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前述の通りである。
【0082】
前記(B)において、「1もしくは数個」は、例えば、前記(B)のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記(A)のいずれかのアミノ酸配列において、アミノ酸は、例えば、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個、最も好ましくは1または2個、欠失、置換および/または付加されてもよい。
【0083】
前記(C)において、「同一性」は、例えば、前記(C)のアミノ酸配列からなるタンパク質が、前記TES活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、90%以上であり、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上である。前記同一性は、例えば、塩基配列の同一性と同様であり、BLAST、FAST等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる。
【0084】
本発明のTESタンパク質は、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料、ホットメルト接着剤等の可塑剤、防虫剤等として使用できるテルピネオールの合成に使用できる。
【0085】
<TESタンパク質の製造方法>
本発明のタンパク質の製造方法は、テルピネオール合成活性を有するタンパク質の製造方法であり、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするテルピネオール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする。
【0086】
本発明の製造方法は、前記本発明のポリヌクレオチドを発現させて、前記本発明のTESタンパク質を合成することが特徴であり、その他の方法および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法において、前記本発明のポリヌクレオチドの発現は、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【0087】
前記タンパク質合成工程は、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程があげられる。前記非ヒト宿主は、例えば、前述と同様であり、好ましくは、微生物、動物細胞、昆虫細胞、これらの培養細胞等である。前記非ヒト宿主への導入方法は、特に制限されず、前述の記載が引用できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより導入されてもよく、前記非ヒト宿主は、例えば、前記発現ベクターが導入された非ヒト宿主があげられる。前記培養の方法は、特に制限されず、前記非ヒト宿主の種類に応じて適宜設定できる。
【0088】
また、前記タンパク質合成工程は、前述のように、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させる工程でもよい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、前記本発明の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターを用いて、公知の方法により行うことができ、市販の試薬キットが使用できる。
【0089】
本発明の製造方法は、例えば、さらに、前記TESタンパク質を精製する工程を含んでもよい。前記TESタンパク質の精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等により行うことができる。
【0090】
<テルピネオールの製造方法>
本発明のテルピネオールの製造方法は、前記本発明のTESタンパク質を使用し、前記TESタンパク質のテルピネオール合成活性により、テルピネオールを合成するテルピネオール合成工程を含むことを特徴とする。
【0091】
本発明の製造方法は、前記本発明のTESタンパク質を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法により得られるテルピネオールは、例えば、α−テルピネオール、β−テルピネオール、γ−テルピネオール、またはδ−テルピネオールがあげられ、好ましくは、α−テルピネオールである。
【0092】
本発明の製造方法において、前記TESタンパク質は、例えば、予め製造したTESタンパク質を使用してもよいし、前記本発明のポリヌクレオチドの発現により合成してもよい。
【0093】
前者の場合、前記TESタンパク質は、例えば、本発明のTESタンパク質の製造方法により得ることができる。前記TESタンパク質は、例えば、非精製タンパク質でもよいが、精製タンパク質が好ましい。
【0094】
後者の場合、本発明の製造方法は、例えば、前記TESタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、前記テルピネオール合成工程において、前記合成したTESタンパク質を使用することが好ましい。前記タンパク質合成工程は、特に制限されず、前記本発明のTESタンパク質の製造方法によりタンパク質を合成する工程があげられる。具体的には、例えば、前記タンパク質合成工程において、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された前記非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするテルピネオール合成活性を有するタンパク質を合成することが好ましい。この際、前記非ヒト宿主において合成した前記TESタンパク質を単離して、前記テルピネオール合成工程に使用することができる。また、例えば、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質合成工程と前記テルピネオール合成工程とを行ってもよい。つまり、前記タンパク質合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記TESタンパク質を合成する工程であり、前記テルピネオール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記合成した前記TESタンパク質のテルピネオール合成活性により、テルピネオールを合成する工程でもよい。
【0095】
このようにして得られたテルピネオールは、例えば、食品、酒類、化粧品および香水等の工業製品の香料、ホットメルト接着剤等の可塑剤、防虫剤等として使用できる。
【実施例】
【0096】
[実施例1]
単子葉植物フリージア花弁から、TES遺伝子のcDNAのクローニングを行った。
【0097】
フリージア(品種アラジン)の新鮮な花弁約2〜3gから、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)により、製造業者が推奨する方法で、total RNAを取得した。前記total RNAから、ランダムプライマーを使用して、cDNAライブラリーを構築した。前記cDNAライブラリーからタンパク質を合成させ、後述する実施例2と同様の方法により、TES活性を確認した。この結果、配列番号1の塩基配列からなるTES遺伝子のcDNA(FAfn01 cDNA)、配列番号5の塩基配列からなるTES遺伝子のcDNA(FAfn16 cDNA)、および配列番号9の塩基配列からなるTES遺伝子のcDNA(FAfn27 cDNA)が取得できた。
【0098】
[実施例2]
前記3種類のフリージア由来TES遺伝子のcDNAを、それぞれ大腸菌に導入し、組換えTESタンパク質を発現させた。そして、基質としてゲラニルピロリン酸(GPP)を用いて、テルピネオール合成活性を確認した。
【0099】
(1)発現用ベクターの構築
シグナルペプチドのコード配列を含む配列番号1の塩基配列からなるFAfn01 cDNA(s+)を発現するための発現用ベクターpSPB5065を、下記の方法により構築した。前記発現ベクターは、In−Fusion Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いて構築し、組換えTESタンパク質の発現は、pET発現システム(Novagen社)を用いて行った。
【0100】
大腸菌タンパク発現ベクターpET15b(Novagen社)を、制限酵素NdeIおよびXhoIで消化後、GENECLEAN Turbo kit(フナコシ株式会社)で精製した。
【0101】
次に、配列番号1に示す前記FAfn01 cDNA(s+)のコーディング配列に対して、開始コドンの5’側にNdeI認識配列を導入し、終止コドンの3’側にXhoI認識配列を導入するため、PCRを行った。前記PCRは、下記に示す2種類のプライマーInF−pET−FAfn01−FおよびInF−pET−FAfn01−Rを含む下記組成のPCR反応液を使用した。前記PCRの条件は、98℃で10秒、65℃で15秒、72℃で1分30秒の反応を1サイクルとし、合計25サイクルとした。
(FAfn01用プライマー)
InF−pET−FAfn01−F(配列番号13)
5’-CGCGGCAGCCATATGGAAGATGAGGAAACCAT-3’
InF−pET−FAfn01−R(配列番号14)
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGAAACAGGTTGTA-3’
(PCR反応液)
pSPB5047 100pg
1x Prime STAR Max(Takara社)
プライマー 各0.2pmol/μl
総体積 20μl
【0102】
得られたPCR産物5μlに、Cloning Enhancer 2μlを加え、37℃で15分反応後、さらに80℃で15分反応させた。この反応液に、1x In−Fusion Reaction buffer(Clontech社)、In−Fusion Enzyme(Clontech社) 1μl、NdeIおよびXhoIで処理した前記pET15bベクター 100ng、Cloning Enhancer−Treated PCR Insert 2μlを混合し、総体積10μlに調整した。そして、この混合液を37℃で15分反応させた後、50℃で15分反応させ、さらに、TE40μlを添加した。この混合液のうち3μlを、Competent high DH5α(TOYOBO社)に形質転換した。
【0103】
そして、得られた4種の形質転換株よりプラスミドDNAを抽出し、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により、前記プラスミドDNAの全塩基配列を決定した。その結果、前記プラスミドDNAは、開始コドンの5’側にNdeI認識配列、終始コドンの3’側にXhoI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号1に示す前記FAfn01 cDNA(s+)のコーディング配列を有していた。このプラスミドDNAのクローンを、発現用ベクターpSPB5065とした。
【0104】
上記と同じ方法により、シグナルペプチドのコード配列を含む、配列番号5の塩基配列からなるFAfn16 cDNA(s+)、および配列番号9の塩基配列からなるFAfn27 cDNA(s+)を発現するための発現用ベクターpSPB5066(FAfn16 cDNA)およびpSPB5067(FAfn27 cDNA)を、それぞれ構築した。なお、開始コドンの5’側にNdeI認識配列を導入し、終止コドンの3’側にXhoI認識配列を導入するためのPCRにおいて、プライマーとして、両cDNAともに、下記に示す2種類のプライマーを使用した。
(FAfn16用およびFAfn27用プライマー)
InF−pET−FAfn16/27−F(配列番号15)
5’-CGCGGCAGCCATATGCAGGAAGATGAGGAAA-3’
InF−pET−FAfn16/27−R(配列番号16)
5’-AGCCGGATCCTCGAGTTAGAGGGAAACAGGTTGTA-3’
【0105】
そして、得られた各4種の形質転換株よりプラスミドDNAを抽出し、前述と同様に全塩基配列を決定した。その結果、前記プラスミドDNAは、開始コドンの5’側にNdeI認識配列、終止コドンの3’側にXhoI認識配列がそれぞれ導入された、配列番号5に示す前記FAfn16 cDNA(s+)のコーディング配列、および配列番号9に示す前記FAfn27 cDNA(s+)のコーディング配列を有していた。これらのプラスミドDNAのクローンを、発現用ベクターpSPB5066(FAfn16 cDNA)、および発現用ベクターpSPB5067(FAfn27 cDNA)とした。
【0106】
(2)組換えTESタンパク質の発現誘導
前記(1)で得られた各形質転換株を用いて、下記の方法により、各組換えTESタンパク質の発現を、それぞれ誘導した。組換えTESタンパク質の発現誘導は、Overnight Express Autoinduction System 1(Novagen社)を用いて行った。
【0107】
前記(1)の形質転換株を、OnEx Solution 1(Novagen社)40μl、OnEx Solution2(Novagen社)100μl、OnEx Solution 3(Novagen社)2μl、アンピシリン50μg/mlおよび0.05%グルコースを含むLB培地5mlにおいて、37℃で4時間振とう培養した。そして、OnEx Solution 1 2ml、OnEx Solution 2 5ml、OnEx Solution 3 100μlおよびアンピシリン50μg/mlを含むLB培地 100mlに前記培養液の全量を添加し、20℃で一晩振とう培養した。得られた培養液を遠心(5000×g、5分間、4℃)し、大腸菌を集菌した。前記菌体を、菌体1gあたり5mlの緩衝液[50mmol/L MOPSO緩衝液(pH7.0)、5mmol/L DTT、5mmol/L アスコルビン酸ナトリウム、0.1mmol/L APMSF、10%グリセロール]に懸濁した。前記懸濁液を超音波処理して前記大腸菌を破砕した後、遠心分離(15,000rpm、15分、4℃)し、得られた上清を、組換えTESタンパク質を含む粗酵素液とした。
【0108】
次に、前記粗酵素液を、Econo−Pac 10DG Desalting Columns(BIO RAD社)を用いて、緩衝液[20mmol/L MOPSO緩衝液(pH7.0)、1mmol/L DTT、0.1mmol/L APMSF、10%グリセロール]に置換後、下記の酵素反応に用いた。
【0109】
(3)TESタンパク質の活性測定
前記粗酵素液に、試薬[10μmol/L GPP、1mmol/L MgCl、0.5mmol/L MnCl、0.1mmol/L NaWO、0.05mmol/L NaF]を添加し、全量3mlの反応液を調製した。そして、この反応液を、30℃で3時間反応させた。なお、反応中、容器内の上部にヘッドスペース成分の捕集剤として、MonoTrap DCC18(ジーエルサイエンス社)を1枚吊るしておいた。前記ヘッドスペース中に揮発した生成成分を、前記捕集剤で採集した。
【0110】
次に、前記捕集剤を回収し、前記捕集剤にジクロロメタン 2mlを添加した後、超音波処理によって、揮発成分を抽出し、回収した。ジクロロメタン中に抽出された揮発成分を濃縮乾固し、さらに、ジクロロメタン 50μlに再溶解した。この溶解液を、生成成分の抽出液として、GC−MSで分析した。分析条件は、下記の通りとした。
キャピラリーカラム:HP INNOWax
(60m×0.25mm×0.25μm、Agilent社)
キャリアガス:He
温度条件:40℃で10分間保持後、5℃/minで240℃まで昇温し、最後に240℃で30分間保持
注入口温度:250℃
トランスファーライン温度:230℃
試料:スプリットレスモードで1μl注入
【0111】
その結果、保持時間37.0分に主要なピークが、それぞれの生成成分の抽出液に認められた。このピークについてのGC−MS分析結果をマスライブラリー(NISTおよびWiley)により検索した結果、α−テルピネオールのマスフラグメントと一致した。この結果から、前記各TES遺伝子(FAfn01遺伝子、FAfn16遺伝子およびFAfn27遺伝子)は、α−テルピネオール合成活性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0112】
以上のように、本発明のポリヌクレオチドによれば、遺伝子工学的手法によりテルピネオール合成酵素の発現が可能である。このため、前記本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物に導入して形質転換体を作製することで、前記形質転換体において、テルピネオール合成酵素を発現し、これにより香気成分であるテルピネオールの合成が可能となる。このため、本発明によれば、例えば、植物に芳香性を付与したり、その芳香性の改変を行うことができるため、生花等の園芸植物の栽培において、商品価値の高い園芸植物を提供できることから、極めて有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記(a)〜(g)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチド。
(a)配列番号1、3、5、7、9または11の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)前記(a)のいずれかの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)前記(a)のいずれかの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)前記(a)のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)前記(e)のいずれかのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)前記(e)のいずれかのアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項2】
前記テルピネオール合成活性が、α−テルピネオール合成活性である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項1または2記載のポリヌクレオチドからなることを特徴とするテルピネオール合成酵素遺伝子。
【請求項4】
請求項1または2記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項5】
請求項1または2記載のポリヌクレオチドまたは請求項4記載の発現ベクターが導入された非ヒト宿主であることを特徴する形質転換体。
【請求項6】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項5記載の形質転換体。
【請求項7】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項6記載の形質転換体。
【請求項8】
請求項5から7のいずれか一項に記載の形質転換体と同一の性質を有することを特徴とする、前記形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞。
【請求項9】
請求項5から8のいずれか一項に記載の形質転換体、もしくは、形質転換体の子孫、栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品。
【請求項10】
非ヒト宿主に、請求項1もしくは2記載のポリヌクレオチド、または請求項4記載の発現ベクターを導入する工程を含むことを特徴とする非ヒト宿主の芳香性の改変方法。
【請求項11】
前記非ヒト宿主が、植物体またはその部分である、請求項10記載の芳香性の改変方法。
【請求項12】
前記植物が、カーネーションまたはトレニアである、請求項11記載の芳香性の改変方法。
【請求項13】
請求項10から12のいずれか一項に記載の芳香性の改変方法により、非ヒト宿主の芳香性を改変する工程を含むことを特徴とする、芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項14】
請求項5から7のいずれか一項に記載の形質転換体を、栄養繁殖する工程を含むことを特徴とする芳香性改変非ヒト宿主の製造方法。
【請求項15】
下記(A)〜(C)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質。
(A)配列番号2、4、6、8、10または12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
(C)前記(A)のアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、テルピネオール合成活性を有するタンパク質
【請求項16】
前記テルピネオール合成活性が、α−テルピネオール合成活性である、請求項15記載のタンパク質。
【請求項17】
請求項1または2記載のポリヌクレオチドを発現させることにより、前記ポリヌクレオチドがコードするテルピネオール合成活性を有するタンパク質を合成するタンパク質合成工程を含むことを特徴とする、テルピネオール合成活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項18】
請求項15または16記載のタンパク質を使用し、前記タンパク質のテルピネオール合成活性により、テルピネオールを合成するテルピネオール合成工程を含むことを特徴とするテルピネオールの製造方法。
【請求項19】
前記テルピネオールが、α−テルピネオールである、請求項18記載の製造方法。
【請求項20】
さらに、請求項17記載のタンパク質の製造方法により、前記タンパク質を合成するタンパク質合成工程を含み、
前記テルピネオール合成工程において、前記合成したタンパク質を使用する、請求項18または19記載の製造方法。
【請求項21】
前記タンパク質合成工程が、前記ポリヌクレオチドが導入された非ヒト宿主を使用し、前記非ヒト宿主の培養により、前記非ヒト宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させ、前記ポリヌクレオチドがコードするテルピネオール合成活性を有するタンパク質を合成する工程であり、
前記テルピネオール合成工程が、前記非ヒト宿主において、前記タンパク質のテルピネオール合成活性により、テルピネオールを合成する工程である、請求項20記載の製造方法。

【公開番号】特開2013−74829(P2013−74829A)
【公開日】平成25年4月25日(2013.4.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−216252(P2011−216252)
【出願日】平成23年9月30日(2011.9.30)
【出願人】(309007911)サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Fターム(参考)】