テロメラーゼ活性の検出方法
【課題】ＰＣＲを必要とせず、かつ短時間でテロメラーゼ活性を測定できる方法を提供する。
【解決手段】テロメラーゼの活性を測定する方法であって、（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程、（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程を含む。
【解決手段】テロメラーゼの活性を測定する方法であって、（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程、（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はテロメラーゼの活性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の末端部分のことを指す。テロメアは幾つかのタンパク質とテロメアＤＮＡから構成されている。ヒトのテロメアＤＮＡの配列は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返し配列であり、その３’末端部分は１００塩基ほどの一本鎖ＤＮＡである。通常の体細胞では、テロメアＤＮＡは細胞分裂ごとに短くなる。その結果、細胞は分裂の限界に達する。一方で、多くのがん細胞では、テロメラーゼと呼ばれる酵素が活性化されている。テロメラーゼは、テロメアＤＮＡに結合し、テロメアＤＮＡ配列（ヒトの場合５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’）を伸長させる（以降、テロメラーゼによるテロメアＤＮＡの伸長反応のことを、単に「テロメラーゼ反応」と呼ぶ）ことができる。したがって、多くのがん細胞ではテロメアＤＮＡの短縮にともなう細胞分裂の停止が起きない。
【０００３】
テロメラーゼは、８５％以上のがん細胞において活性化されていることが知られている。したがって、テロメラーゼの活性を測定することでがんを診断できる可能性がある。現在もっともよく利用されるテロメラーゼ活性測定方法は、Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｃｏｌアッセイ法（以下、ＴＲＡＰアッセイ法）である。ＴＲＡＰアッセイ法の手順は以下のとおりである（非特許文献１）。
【０００４】
１．テロメラーゼ反応を行う
２．１の反応で得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅する
３．２で得られた増幅産物を電気泳動法などにより解析する
ＴＲＡＰアッセイ法には幾つかの課題がある。一つ目の課題は、解析結果を得るまでに長時間を要する点である。具体的には、上記のＴＲＡＰアッセイ法の手順１の工程は、通常３０分から１時間を要する。そして手順２の工程は、３時間程度を要する。そして手順３では３０分から１時間を要する。すなわちＴＲＡＰアッセイ法では、合計で４時間から５時間を要する。特に、手順２の工程が最も時間を要する。二つ目の課題は、上記のＴＲＡＰアッセイ法の手順２において、測定対象サンプル中の生体分子によってＰＣＲが阻害される場合がある点である。ＰＣＲが阻害されると、仮に手順１のテロメラーゼ反応が行われたとしても、最終的な増幅産物は得られなくなる。言い換えれば、ＰＣＲが阻害されることで正確な測定結果が得られなくなる。また三つ目の課題は、上述のとおり手順２でＰＣＲを行うことで、測定結果における定量性が乏しくなる点である。つまり、ＰＣＲを行うことで、手順１で得られたテロメラーゼ反応産物を解析可能な量まで増幅することができるが、その一方で、ＰＣＲによる増幅前のテロメラーゼ反応産物量を推定することが難しくなる。以上のとおり、ＰＣＲを用いるＴＲＡＰアッセイ法には大きな課題があるため、ＰＣＲを必要としない新規なテロメラーゼ活性測定方法の開発が求められていた。
【０００５】
また一方で、微量のＤＮＡを検出する方法として、標的ＤＮＡに相補的であり、かつその両末端に蛍光物質と消光物質が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨを反応させる方法が知られていた（非特許文献２−４）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５９４９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１１−２０１５（１９９４）
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，２４０−２４８（１９９０）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７４，７２５−７３３（２００２）
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３３，２４６−２５５（２００ ４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、テロメラーゼ活性を測定する方法として、ＴＲＡＰアッセイ法が最もよく使われている。しかしＴＲＡＰアッセイ法には幾つかの課題がある。一つ目は、結果を得るまでに、５時間もの長時間を要するという点である。したがって、より短時間に測定結果が得られる方法が求められていた。二つ目は、ＰＣＲが阻害される場合に、正確な測定結果が得られないという点である。また三つ目は、ＰＣＲを行うことにより測定結果における定量性が乏しくなるという点である。したがって、ＰＣＲを必要としない方法が求められていた。
【０００９】
以上のような背景の下、我々は鋭意検討した結果、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解反応を組み合わせてなる、新規なテロメラーゼ活性測定方法を発明するに至ったのでここに報告する。この方法は、短時間でテロメラーゼ活性を測定することができる。またこの方法はＰＣＲを必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、テロメラーゼの活性を測定する方法であって、
（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程
（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程
を含むことを特徴とする。
【００１１】
前記テロメラーゼは、ヒトのテロメラーゼであることが望ましい。
【００１２】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列は、ヒトのテロメアＤＮＡと同じ配列を含むことが望ましい。
【００１３】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列は、５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であることが望ましい。
【００１４】
前記一本鎖ＲＮＡの配列は５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’ （配列番号：５）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６）からなる群から得られる少なくとも一種であることが望ましい。
【００１５】
前記蛍光を発する官能基は前記一本鎖ＲＮＡの一方の末端部分に修飾されており、かつ、前記この蛍光を消光する官能基は前記一本鎖ＲＮＡのもう一方の末端部分に修飾されていることが望ましい。
【００１６】
前記ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程において、反応溶液中にマグネシウムイオンが含まれていることが望ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、短時間で測定結果が得られ、かつＰＣＲを必要としない、テロメラーゼ活性測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施の形態１におけるテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図
【図２】実施例１の蛍光強度結果を示すグラフ
【図３】実施例２の蛍光強度結果を示すグラフ
【図４】実施例３の蛍光強度結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図１、２を用いて説明する。
【００２０】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、本発明におけるテロメラーゼ活性測定方法の一例について図１を用いて説明する。
【００２１】
本実施の形態は、以下の手順に従って行われる。
【００２２】
手順１：反応溶液１を調製する。反応溶液１は、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ（ｄＮＴＰｓは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物を意味する。ただし、テロメアＤＮＡは、Ｃ（シトシン）を有しないので、「ｄＮＴＰｓ」にはｄＣＴＰが含まれなくても良い。なお、ｄＡＴＰとはデオキシアデノシントリホスフェート、ｄＣＴＰとはデオキシシチジントリホスフェート、ｄＧＴＰとはデオキシグアノシントリホスフェート、ｄＴＴＰとはデオキシチミジントリホスフェートである。）、そしてテロメラーゼ活性測定の対象となる生体試料を含む。テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡとは、テロメラーゼが結合することができ、かつ、その一本鎖ＤＮＡにテロメアＤＮＡを伸長させることができるＤＮＡのことを意味する。具体的には、テロメアＤＮＡが挙げられる。またＴＳプライマーと呼ばれる一本鎖ＤＮＡも、テロメラーゼの基質となることが知られている。上記反応溶液１は必要に応じて、金属塩やｐＨ緩衝能を有する化学物質などを含んでもよい。
【００２３】
手順２：上記反応溶液１は、テロメラーゼ反応が進行する条件下に置かれる。
【００２４】
手順３：手順２の処理後の上記テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡと、ＲＮａｓｅＨと、一本鎖ＲＮＡを含む反応溶液を調製する。この反応溶液を反応溶液２と呼ぶ。このとき、この一本鎖ＲＮＡの配列はテロメアＤＮＡの配列と相補的な配列を含む。またこの一本鎖ＲＮＡには、蛍光物質と、この蛍光物質からの蛍光を蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、以降、単にＦＲＥＴと呼ぶ）によって消光する消光物質が修飾されている。これら蛍光物質および消光物質が上記一本鎖ＲＮＡに修飾される位置は、両物質間でＦＲＥＴが生じる位置であればよい。
【００２５】
手順４：上記反応溶液２は、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解反応（以降、この反応を単に「ＲＮａｓｅＨ反応」と呼ぶ）が進行する条件下に置かれる。ＲＮａｓｅＨ反応にはマグネシウムイオンが必要である。したがって、反応溶液２中にはマグネシウムイオンが含まれている必要がある。マグネシウムイオンは手順４までの工程中に添加されていればよい。
【００２６】
手順５：手順４の後、上記蛍光物質に由来する蛍光強度を測定する。
【００２７】
図１に示すように、仮に上記生体試料中のテロメラーゼが活性を有していれば、手順２において、テロメラーゼによりテロメアＤＮＡが伸張される。そして手順４において、上記一本鎖ＲＮＡが伸張されたテロメアＤＮＡに結合し、この結合したＲＮＡはＲＮａｓｅＨにより分解される。このＲＮａｓｅＨ反応により、上記一本鎖ＲＮＡに修飾されている蛍光物質と消光物質の間の距離は大きくなる。その結果、蛍光物質からの蛍光強度が大きくなる。一方で、仮に生体試料中のテロメラーゼが活性を有していない、あるいは生体試料中にテロメラーゼが含まれていない場合は、手順２において、テロメラーゼ反応は生じない。その結果、手順２において、ＲＮａｓｅＨ反応も生じない。したがって、上記一本鎖ＲＮＡに修飾された蛍光物質の蛍光強度にも変化は生じない。つまり手順５で測定される蛍光強度は、上記生体試料中に含まれるテロメラーゼ活性に依存する。言いかえれば、手順５で測定される蛍光強度をもとに、上記生体試料中のテロメラーゼ活性を解析することができる。
【００２８】
本実施の形態１で示した方法では、ＰＣＲを用いることなくテロメラーゼ活性を測定することが可能である。また本実施の形態１の手順１、３、５の操作は、それぞれ５〜１０分程度しかかからない。また手順２および４についても、それぞれ少なくとも３０分かければよい。したがって、ＴＲＡＰアッセイ法より短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能である。
【００２９】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、本発明におけるテロメラーゼ活性測定方法の他の一例について説明する。
【００３０】
本実施の形態は、以下の手順に従って行われる。
【００３１】
手順１：反応溶液１を調製する。本実施の形態２における反応溶液１は、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ（実施例１と同じく、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合試薬のことを意味する。ただしｄＣＴＰは必ずしも必要ない。）、ＲＮａｓｅＨ、一本鎖ＲＮＡ、マグネシウム塩、そしてテロメラーゼ活性測定の対象となる生体試料を含む。テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡとは、テロメラーゼが結合することができ、かつ、その一本鎖ＤＮＡにテロメアＤＮＡを伸長させることができるＤＮＡのことを意味する。具体的には、テロメアＤＮＡが挙げられる。またＴＳプライマーと呼ばれる一本鎖ＤＮＡも、テロメラーゼの基質となることが知られている。また上記一本鎖ＲＮＡの配列はテロメアＤＮＡの配列と相補的な配列を含む。またこの一本鎖ＲＮＡには、蛍光物質と、この蛍光物質からの蛍光をＦＲＥＴによって消光する消光物質が修飾されている。これら蛍光物質および消光物質が上記一本鎖ＲＮＡに修飾される位置は、両物質間でＦＲＥＴが生じる位置であればよい。上記反応溶液１は必要に応じて、マグネシウム塩以外の金属塩やｐＨ緩衝能を有する化学物質などを含んでもよい。
【００３２】
手順２：上記反応溶液１は、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応が進行する条件下に置かれる。
【００３３】
手順３：手順２の後、上記蛍光物質に由来する蛍光強度を測定する。仮に上記生体試料中のテロメラーゼが活性を有していれば、手順２において、テロメラーゼによりテロメアＤＮＡが伸張される。そして手順２において、上記一本鎖ＲＮＡが、伸張されたテロメアＤＮＡに結合し、この結合したＲＮＡはＲＮａｓｅＨにより分解される。このＲＮａｓｅＨ反応により、上記一本鎖ＲＮＡに修飾されている蛍光物質と消光物質の間の距離は大きくなる。その結果、蛍光物質からの蛍光強度が大きくなる。一方で、仮に生体試料中のテロメラーゼが活性を有していない、あるいは生体試料中にテロメラーゼが含まれていない場合は、手順２において、テロメラーゼ反応は生じない。その結果、手順４において、ＲＮａｓｅＨ反応も生じない。したがって、上記一本鎖ＲＮＡに修飾された蛍光物質の蛍光強度にも変化は生じない。つまり手順３で測定される蛍光強度は、上記生体試料中に含まれるテロメラーゼ活性に依存する。言いかえれば、手順３で測定される蛍光強度をもとに、上記生体試料中のテロメラーゼ活性を解析することができる。
【００３４】
本実施の形態２で示した方法では、ＰＣＲを用いることなくテロメラーゼ活性を測定することが可能である。また本実施の形態１の手順１および３の操作は、それぞれ５〜１０分程度しかかからない。また手順２についても、少なくとも３０分かければよい。したがって、ＴＲＡＰアッセイ法より短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能である。
【００３５】
（実施例）
本実施例で用いられる一本鎖ＲＮＡは全て、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。またＤＮＡは、つくばオリゴサービス株式会社より購入したものを用いるか、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたものを用いた。またｄＮＴＰｓは、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたものを用いた。またテロメラーゼは、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたＨｅＬａ細胞より抽出して用いた。抽出方法は、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていた説明書に従った。またＲＮａｓｅＨはタカラバイオ株式会社より購入し、用いた。また蛍光強度解析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＶａｒｉｏｓｋａｎを用いて行った。
【００３６】
（実施例１）
本実施例１では、テロメラーゼ反応が行われた後に得られるテロメラーゼ反応産物として想定した一本鎖オリゴＤＮＡを設計し、購入した（以降、この一本鎖オリゴＤＮＡをＨｔｅｌｏＤＮＡ９６と呼ぶ）。ＨｔｅｌｏＤＮＡ９６の配列は５’−（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ）−３’（配列番号：７）であった。そしてＨｔｅｌｏＤＮＡ９６と、蛍光物質および消光物質が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨを反応させ、この反応に依存して蛍光強度が変化するか否かを検討した。一本鎖ＲＮＡは、５種類の異なる配列のものが検討された。これら５種類全ての一本鎖ＲＮＡの５’末端および３’末端には、それぞれＦＩＴＣ（蛍光物質）およびＤａｂｃｙｌ（消光物質）が修飾されていた。また、これら５種類の一本鎖ＲＮＡの具体的な配列は５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２、以降、このＲＮＡをＲＮＡ１と呼ぶ）５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３、以降、このＲＮＡをＲＮＡ２と呼ぶ）５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４、以降、このＲＮＡをＲＮＡ３と呼ぶ）５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：５、以降、このＲＮＡをＲＮＡ４と呼ぶ）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６、以降、このＲＮＡをＲＮＡ５と呼ぶ）であった。
【００３７】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、１μＭＨｔｅｌｏＤＮＡ９６、１００ｎＭ各種一本鎖ＲＮＡ、４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、４％グリセロール、０．００３％牛血清アルブミンを含み、全容量は１００μＬであった。次に、この反応溶液を８０℃で２分間保温した後、２℃／ｍｉｎの降温速度で２０℃まで冷やした。次に、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせるため、この反応溶液に１０Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを１μＬ添加した後、３０℃で３０分間保温した。最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれない場合についても、同様の実験が行われた。
【００３８】
結果を図２に示す。図２には各ＲＮＡを用いた場合において、反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれた場合と、含まれなかった場合の蛍光強度が比較されている。これより、いずれのＲＮＡを用いた場合も、反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれていた場合の方が、含まれていなかった場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００３９】
以上の結果は、本発明による方法によってテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【００４０】
（実施例２）
本実施例２では、まずテロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応を順に行うことで、テロメラーゼの活性を測定できるか否かについて検討した。
【００４１】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４．５ｍＭＭｇＣｌ2、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭｄＴＴＰ、５０μＭｄＧＴＰ、５０μＭｄＡＴＰ、５０μＭｄＣＴＰ、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒ、１００ｎＭＲＮＡ１、テロメラーゼを含み、全容量は１００μＬであった。ここで、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒの配列は５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であった。ＴＳ ｐｒｉｍｅｒはテロメラーゼの基質となることが知られている。また本実施例２のＲＮＡ１は、実施例１のＲＮＡ１と同じものであった。また、反応溶液中に含まれているテロメラーゼは、２５０００個のＨｅＬａ細胞から抽出されたものであった。次に、テロメラーゼ反応を行わせるために、反応溶液を３０℃で３０分間保温した。次に、テロメラーゼ反応を終了させるため、反応溶液を９０℃で１０分間保温した。次に、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせるため、反応溶液に１０Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを１μＬ添加した後、３０℃で３０分間保温した。最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液の調製の工程で、活性を有するテロメラーゼの代わりに、あらかじめ９０℃で１０分間保温処理することで失活させられたテロメラーゼが添加された場合についても、同様の実験が行われた。
【００４２】
結果を図３に示す。図３には、反応溶液中に、あらかじめ熱処理によって失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合と、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の蛍光強度が比較されている。これより、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の方が、失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００４３】
以上の結果は、本発明による方法によって、ＰＣＲを用いず、短時間にテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【００４４】
（実施例３）
本実施例３では、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応を同時に行うことで、テロメラーゼの活性を測定できるか否かについて検討した。
【００４５】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４．５ｍＭＭｇＣｌ2、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭｄＴＴＰ、５０μＭｄＧＴＰ、５０μＭｄＡＴＰ、５０μＭｄＣＴＰ、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒ、１００ｎＭＲＮＡ１、テロメラーゼ、０．１Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを含み、全容量は１００μＬであった。ここで、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒの配列は５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であった。ＴＳ ｐｒｉｍｅｒはテロメラーゼの基質となることが知られている。また本実施例３のＲＮＡ１は、実施例１および２のＲＮＡ１と同じものであった。また、反応溶液中に含まれているテロメラーゼは、２５０００個のＨｅＬａ細胞から抽出されたものであった。次に、テロメラーゼ反応およびＲＮａｓｅＨ反応を行わせるために、反応溶液を３０℃で１時間保温した。そして最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液の調製の工程で、活性を有するテロメラーゼの代わりに、あらかじめ９０℃で１０分間保温処理することで失活させられたテロメラーゼが添加された場合についても、同様の実験が行われた。
【００４６】
結果を図４に示す。図４には、反応溶液中に、あらかじめ熱処理によって失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合と、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の蛍光強度が比較されている。これより、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の方が、失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００４７】
以上の結果は、本発明による方法によって、ＰＣＲを用いず、短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、ＰＣＲを用いず、短時間でテロメラーゼ活性を測定することができる方法を提供する。
【符号の説明】
【００４９】
１ テロメラーゼの基質となるＤＮＡ
２ テロメラーゼ
３ テロメラーゼにより伸長されたＤＮＡ
４ 蛍光物質
５ テロメラーゼにより伸長されたＤＮＡと相補的に結合できる一本鎖ＲＮＡ
６ 消光物質
７ ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素
８ ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により切断されたＲＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明はテロメラーゼの活性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の末端部分のことを指す。テロメアは幾つかのタンパク質とテロメアＤＮＡから構成されている。ヒトのテロメアＤＮＡの配列は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返し配列であり、その３’末端部分は１００塩基ほどの一本鎖ＤＮＡである。通常の体細胞では、テロメアＤＮＡは細胞分裂ごとに短くなる。その結果、細胞は分裂の限界に達する。一方で、多くのがん細胞では、テロメラーゼと呼ばれる酵素が活性化されている。テロメラーゼは、テロメアＤＮＡに結合し、テロメアＤＮＡ配列（ヒトの場合５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’）を伸長させる（以降、テロメラーゼによるテロメアＤＮＡの伸長反応のことを、単に「テロメラーゼ反応」と呼ぶ）ことができる。したがって、多くのがん細胞ではテロメアＤＮＡの短縮にともなう細胞分裂の停止が起きない。
【０００３】
テロメラーゼは、８５％以上のがん細胞において活性化されていることが知られている。したがって、テロメラーゼの活性を測定することでがんを診断できる可能性がある。現在もっともよく利用されるテロメラーゼ活性測定方法は、Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｃｏｌアッセイ法（以下、ＴＲＡＰアッセイ法）である。ＴＲＡＰアッセイ法の手順は以下のとおりである（非特許文献１）。
【０００４】
１．テロメラーゼ反応を行う
２．１の反応で得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲにより増幅する
３．２で得られた増幅産物を電気泳動法などにより解析する
ＴＲＡＰアッセイ法には幾つかの課題がある。一つ目の課題は、解析結果を得るまでに長時間を要する点である。具体的には、上記のＴＲＡＰアッセイ法の手順１の工程は、通常３０分から１時間を要する。そして手順２の工程は、３時間程度を要する。そして手順３では３０分から１時間を要する。すなわちＴＲＡＰアッセイ法では、合計で４時間から５時間を要する。特に、手順２の工程が最も時間を要する。二つ目の課題は、上記のＴＲＡＰアッセイ法の手順２において、測定対象サンプル中の生体分子によってＰＣＲが阻害される場合がある点である。ＰＣＲが阻害されると、仮に手順１のテロメラーゼ反応が行われたとしても、最終的な増幅産物は得られなくなる。言い換えれば、ＰＣＲが阻害されることで正確な測定結果が得られなくなる。また三つ目の課題は、上述のとおり手順２でＰＣＲを行うことで、測定結果における定量性が乏しくなる点である。つまり、ＰＣＲを行うことで、手順１で得られたテロメラーゼ反応産物を解析可能な量まで増幅することができるが、その一方で、ＰＣＲによる増幅前のテロメラーゼ反応産物量を推定することが難しくなる。以上のとおり、ＰＣＲを用いるＴＲＡＰアッセイ法には大きな課題があるため、ＰＣＲを必要としない新規なテロメラーゼ活性測定方法の開発が求められていた。
【０００５】
また一方で、微量のＤＮＡを検出する方法として、標的ＤＮＡに相補的であり、かつその両末端に蛍光物質と消光物質が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨを反応させる方法が知られていた（非特許文献２−４）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５９４９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１１−２０１５（１９９４）
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，２４０−２４８（１９９０）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７４，７２５−７３３（２００２）
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３３，２４６−２５５（２００ ４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、テロメラーゼ活性を測定する方法として、ＴＲＡＰアッセイ法が最もよく使われている。しかしＴＲＡＰアッセイ法には幾つかの課題がある。一つ目は、結果を得るまでに、５時間もの長時間を要するという点である。したがって、より短時間に測定結果が得られる方法が求められていた。二つ目は、ＰＣＲが阻害される場合に、正確な測定結果が得られないという点である。また三つ目は、ＰＣＲを行うことにより測定結果における定量性が乏しくなるという点である。したがって、ＰＣＲを必要としない方法が求められていた。
【０００９】
以上のような背景の下、我々は鋭意検討した結果、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解反応を組み合わせてなる、新規なテロメラーゼ活性測定方法を発明するに至ったのでここに報告する。この方法は、短時間でテロメラーゼ活性を測定することができる。またこの方法はＰＣＲを必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、テロメラーゼの活性を測定する方法であって、
（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程
（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程
を含むことを特徴とする。
【００１１】
前記テロメラーゼは、ヒトのテロメラーゼであることが望ましい。
【００１２】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列は、ヒトのテロメアＤＮＡと同じ配列を含むことが望ましい。
【００１３】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列は、５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であることが望ましい。
【００１４】
前記一本鎖ＲＮＡの配列は５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’ （配列番号：５）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６）からなる群から得られる少なくとも一種であることが望ましい。
【００１５】
前記蛍光を発する官能基は前記一本鎖ＲＮＡの一方の末端部分に修飾されており、かつ、前記この蛍光を消光する官能基は前記一本鎖ＲＮＡのもう一方の末端部分に修飾されていることが望ましい。
【００１６】
前記ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程において、反応溶液中にマグネシウムイオンが含まれていることが望ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、短時間で測定結果が得られ、かつＰＣＲを必要としない、テロメラーゼ活性測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施の形態１におけるテロメラーゼ活性測定方法を説明するための図
【図２】実施例１の蛍光強度結果を示すグラフ
【図３】実施例２の蛍光強度結果を示すグラフ
【図４】実施例３の蛍光強度結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図１、２を用いて説明する。
【００２０】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、本発明におけるテロメラーゼ活性測定方法の一例について図１を用いて説明する。
【００２１】
本実施の形態は、以下の手順に従って行われる。
【００２２】
手順１：反応溶液１を調製する。反応溶液１は、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ（ｄＮＴＰｓは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物を意味する。ただし、テロメアＤＮＡは、Ｃ（シトシン）を有しないので、「ｄＮＴＰｓ」にはｄＣＴＰが含まれなくても良い。なお、ｄＡＴＰとはデオキシアデノシントリホスフェート、ｄＣＴＰとはデオキシシチジントリホスフェート、ｄＧＴＰとはデオキシグアノシントリホスフェート、ｄＴＴＰとはデオキシチミジントリホスフェートである。）、そしてテロメラーゼ活性測定の対象となる生体試料を含む。テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡとは、テロメラーゼが結合することができ、かつ、その一本鎖ＤＮＡにテロメアＤＮＡを伸長させることができるＤＮＡのことを意味する。具体的には、テロメアＤＮＡが挙げられる。またＴＳプライマーと呼ばれる一本鎖ＤＮＡも、テロメラーゼの基質となることが知られている。上記反応溶液１は必要に応じて、金属塩やｐＨ緩衝能を有する化学物質などを含んでもよい。
【００２３】
手順２：上記反応溶液１は、テロメラーゼ反応が進行する条件下に置かれる。
【００２４】
手順３：手順２の処理後の上記テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡと、ＲＮａｓｅＨと、一本鎖ＲＮＡを含む反応溶液を調製する。この反応溶液を反応溶液２と呼ぶ。このとき、この一本鎖ＲＮＡの配列はテロメアＤＮＡの配列と相補的な配列を含む。またこの一本鎖ＲＮＡには、蛍光物質と、この蛍光物質からの蛍光を蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、以降、単にＦＲＥＴと呼ぶ）によって消光する消光物質が修飾されている。これら蛍光物質および消光物質が上記一本鎖ＲＮＡに修飾される位置は、両物質間でＦＲＥＴが生じる位置であればよい。
【００２５】
手順４：上記反応溶液２は、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解反応（以降、この反応を単に「ＲＮａｓｅＨ反応」と呼ぶ）が進行する条件下に置かれる。ＲＮａｓｅＨ反応にはマグネシウムイオンが必要である。したがって、反応溶液２中にはマグネシウムイオンが含まれている必要がある。マグネシウムイオンは手順４までの工程中に添加されていればよい。
【００２６】
手順５：手順４の後、上記蛍光物質に由来する蛍光強度を測定する。
【００２７】
図１に示すように、仮に上記生体試料中のテロメラーゼが活性を有していれば、手順２において、テロメラーゼによりテロメアＤＮＡが伸張される。そして手順４において、上記一本鎖ＲＮＡが伸張されたテロメアＤＮＡに結合し、この結合したＲＮＡはＲＮａｓｅＨにより分解される。このＲＮａｓｅＨ反応により、上記一本鎖ＲＮＡに修飾されている蛍光物質と消光物質の間の距離は大きくなる。その結果、蛍光物質からの蛍光強度が大きくなる。一方で、仮に生体試料中のテロメラーゼが活性を有していない、あるいは生体試料中にテロメラーゼが含まれていない場合は、手順２において、テロメラーゼ反応は生じない。その結果、手順２において、ＲＮａｓｅＨ反応も生じない。したがって、上記一本鎖ＲＮＡに修飾された蛍光物質の蛍光強度にも変化は生じない。つまり手順５で測定される蛍光強度は、上記生体試料中に含まれるテロメラーゼ活性に依存する。言いかえれば、手順５で測定される蛍光強度をもとに、上記生体試料中のテロメラーゼ活性を解析することができる。
【００２８】
本実施の形態１で示した方法では、ＰＣＲを用いることなくテロメラーゼ活性を測定することが可能である。また本実施の形態１の手順１、３、５の操作は、それぞれ５〜１０分程度しかかからない。また手順２および４についても、それぞれ少なくとも３０分かければよい。したがって、ＴＲＡＰアッセイ法より短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能である。
【００２９】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、本発明におけるテロメラーゼ活性測定方法の他の一例について説明する。
【００３０】
本実施の形態は、以下の手順に従って行われる。
【００３１】
手順１：反応溶液１を調製する。本実施の形態２における反応溶液１は、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ（実施例１と同じく、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合試薬のことを意味する。ただしｄＣＴＰは必ずしも必要ない。）、ＲＮａｓｅＨ、一本鎖ＲＮＡ、マグネシウム塩、そしてテロメラーゼ活性測定の対象となる生体試料を含む。テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡとは、テロメラーゼが結合することができ、かつ、その一本鎖ＤＮＡにテロメアＤＮＡを伸長させることができるＤＮＡのことを意味する。具体的には、テロメアＤＮＡが挙げられる。またＴＳプライマーと呼ばれる一本鎖ＤＮＡも、テロメラーゼの基質となることが知られている。また上記一本鎖ＲＮＡの配列はテロメアＤＮＡの配列と相補的な配列を含む。またこの一本鎖ＲＮＡには、蛍光物質と、この蛍光物質からの蛍光をＦＲＥＴによって消光する消光物質が修飾されている。これら蛍光物質および消光物質が上記一本鎖ＲＮＡに修飾される位置は、両物質間でＦＲＥＴが生じる位置であればよい。上記反応溶液１は必要に応じて、マグネシウム塩以外の金属塩やｐＨ緩衝能を有する化学物質などを含んでもよい。
【００３２】
手順２：上記反応溶液１は、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応が進行する条件下に置かれる。
【００３３】
手順３：手順２の後、上記蛍光物質に由来する蛍光強度を測定する。仮に上記生体試料中のテロメラーゼが活性を有していれば、手順２において、テロメラーゼによりテロメアＤＮＡが伸張される。そして手順２において、上記一本鎖ＲＮＡが、伸張されたテロメアＤＮＡに結合し、この結合したＲＮＡはＲＮａｓｅＨにより分解される。このＲＮａｓｅＨ反応により、上記一本鎖ＲＮＡに修飾されている蛍光物質と消光物質の間の距離は大きくなる。その結果、蛍光物質からの蛍光強度が大きくなる。一方で、仮に生体試料中のテロメラーゼが活性を有していない、あるいは生体試料中にテロメラーゼが含まれていない場合は、手順２において、テロメラーゼ反応は生じない。その結果、手順４において、ＲＮａｓｅＨ反応も生じない。したがって、上記一本鎖ＲＮＡに修飾された蛍光物質の蛍光強度にも変化は生じない。つまり手順３で測定される蛍光強度は、上記生体試料中に含まれるテロメラーゼ活性に依存する。言いかえれば、手順３で測定される蛍光強度をもとに、上記生体試料中のテロメラーゼ活性を解析することができる。
【００３４】
本実施の形態２で示した方法では、ＰＣＲを用いることなくテロメラーゼ活性を測定することが可能である。また本実施の形態１の手順１および３の操作は、それぞれ５〜１０分程度しかかからない。また手順２についても、少なくとも３０分かければよい。したがって、ＴＲＡＰアッセイ法より短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能である。
【００３５】
（実施例）
本実施例で用いられる一本鎖ＲＮＡは全て、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。またＤＮＡは、つくばオリゴサービス株式会社より購入したものを用いるか、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたものを用いた。またｄＮＴＰｓは、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたものを用いた。またテロメラーゼは、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていたＨｅＬａ細胞より抽出して用いた。抽出方法は、ＴＲＡＰａｚｅ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付されていた説明書に従った。またＲＮａｓｅＨはタカラバイオ株式会社より購入し、用いた。また蛍光強度解析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＶａｒｉｏｓｋａｎを用いて行った。
【００３６】
（実施例１）
本実施例１では、テロメラーゼ反応が行われた後に得られるテロメラーゼ反応産物として想定した一本鎖オリゴＤＮＡを設計し、購入した（以降、この一本鎖オリゴＤＮＡをＨｔｅｌｏＤＮＡ９６と呼ぶ）。ＨｔｅｌｏＤＮＡ９６の配列は５’−（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ）−３’（配列番号：７）であった。そしてＨｔｅｌｏＤＮＡ９６と、蛍光物質および消光物質が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨを反応させ、この反応に依存して蛍光強度が変化するか否かを検討した。一本鎖ＲＮＡは、５種類の異なる配列のものが検討された。これら５種類全ての一本鎖ＲＮＡの５’末端および３’末端には、それぞれＦＩＴＣ（蛍光物質）およびＤａｂｃｙｌ（消光物質）が修飾されていた。また、これら５種類の一本鎖ＲＮＡの具体的な配列は５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２、以降、このＲＮＡをＲＮＡ１と呼ぶ）５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３、以降、このＲＮＡをＲＮＡ２と呼ぶ）５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４、以降、このＲＮＡをＲＮＡ３と呼ぶ）５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：５、以降、このＲＮＡをＲＮＡ４と呼ぶ）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６、以降、このＲＮＡをＲＮＡ５と呼ぶ）であった。
【００３７】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、１μＭＨｔｅｌｏＤＮＡ９６、１００ｎＭ各種一本鎖ＲＮＡ、４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、４ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、４％グリセロール、０．００３％牛血清アルブミンを含み、全容量は１００μＬであった。次に、この反応溶液を８０℃で２分間保温した後、２℃／ｍｉｎの降温速度で２０℃まで冷やした。次に、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせるため、この反応溶液に１０Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを１μＬ添加した後、３０℃で３０分間保温した。最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれない場合についても、同様の実験が行われた。
【００３８】
結果を図２に示す。図２には各ＲＮＡを用いた場合において、反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれた場合と、含まれなかった場合の蛍光強度が比較されている。これより、いずれのＲＮＡを用いた場合も、反応溶液中にＨｔｅｌｏＤＮＡ９６が含まれていた場合の方が、含まれていなかった場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００３９】
以上の結果は、本発明による方法によってテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【００４０】
（実施例２）
本実施例２では、まずテロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応を順に行うことで、テロメラーゼの活性を測定できるか否かについて検討した。
【００４１】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４．５ｍＭＭｇＣｌ2、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭｄＴＴＰ、５０μＭｄＧＴＰ、５０μＭｄＡＴＰ、５０μＭｄＣＴＰ、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒ、１００ｎＭＲＮＡ１、テロメラーゼを含み、全容量は１００μＬであった。ここで、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒの配列は５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であった。ＴＳ ｐｒｉｍｅｒはテロメラーゼの基質となることが知られている。また本実施例２のＲＮＡ１は、実施例１のＲＮＡ１と同じものであった。また、反応溶液中に含まれているテロメラーゼは、２５０００個のＨｅＬａ細胞から抽出されたものであった。次に、テロメラーゼ反応を行わせるために、反応溶液を３０℃で３０分間保温した。次に、テロメラーゼ反応を終了させるため、反応溶液を９０℃で１０分間保温した。次に、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせるため、反応溶液に１０Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを１μＬ添加した後、３０℃で３０分間保温した。最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液の調製の工程で、活性を有するテロメラーゼの代わりに、あらかじめ９０℃で１０分間保温処理することで失活させられたテロメラーゼが添加された場合についても、同様の実験が行われた。
【００４２】
結果を図３に示す。図３には、反応溶液中に、あらかじめ熱処理によって失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合と、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の蛍光強度が比較されている。これより、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の方が、失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００４３】
以上の結果は、本発明による方法によって、ＰＣＲを用いず、短時間にテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【００４４】
（実施例３）
本実施例３では、テロメラーゼ反応とＲＮａｓｅＨ反応を同時に行うことで、テロメラーゼの活性を測定できるか否かについて検討した。
【００４５】
具体的な実験手順は次のとおりであった。まず、反応溶液を調製した。この反応溶液は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４．５ｍＭＭｇＣｌ2、６３ｍＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭｄＴＴＰ、５０μＭｄＧＴＰ、５０μＭｄＡＴＰ、５０μＭｄＣＴＰ、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒ、１００ｎＭＲＮＡ１、テロメラーゼ、０．１Ｕ／μＬＲＮａｓｅＨを含み、全容量は１００μＬであった。ここで、ＴＳ ｐｒｉｍｅｒの配列は５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であった。ＴＳ ｐｒｉｍｅｒはテロメラーゼの基質となることが知られている。また本実施例３のＲＮＡ１は、実施例１および２のＲＮＡ１と同じものであった。また、反応溶液中に含まれているテロメラーゼは、２５０００個のＨｅＬａ細胞から抽出されたものであった。次に、テロメラーゼ反応およびＲＮａｓｅＨ反応を行わせるために、反応溶液を３０℃で１時間保温した。そして最後に、２５℃条件下でＦＩＴＣ由来の蛍光強度解析を行った。励起光として４８２ｎｍの光を用い、５２０ｎｍの蛍光強度を測定した。また、以上の実験の比較実験として、上記反応溶液の調製の工程で、活性を有するテロメラーゼの代わりに、あらかじめ９０℃で１０分間保温処理することで失活させられたテロメラーゼが添加された場合についても、同様の実験が行われた。
【００４６】
結果を図４に示す。図４には、反応溶液中に、あらかじめ熱処理によって失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合と、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の蛍光強度が比較されている。これより、活性を有するテロメラーゼが含まれていた場合の方が、失活させられたテロメラーゼが含まれていた場合に比べ、優位に蛍光強度が大きいことが分かる。
【００４７】
以上の結果は、本発明による方法によって、ＰＣＲを用いず、短時間でテロメラーゼ活性を測定することが可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、ＰＣＲを用いず、短時間でテロメラーゼ活性を測定することができる方法を提供する。
【符号の説明】
【００４９】
１ テロメラーゼの基質となるＤＮＡ
２ テロメラーゼ
３ テロメラーゼにより伸長されたＤＮＡ
４ 蛍光物質
５ テロメラーゼにより伸長されたＤＮＡと相補的に結合できる一本鎖ＲＮＡ
６ 消光物質
７ ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素
８ ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により切断されたＲＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼの活性を測定する方法であって、
（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程
（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記テロメラーゼが、ヒトのテロメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項３】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列が、ヒトのテロメアＤＮＡと同じ配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項４】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列が５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であることを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項５】
前記一本鎖ＲＮＡの配列が、５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：５）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６）からなる群から得られる少なくとも一種であることを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項６】
前記蛍光を発する官能基が前記一本鎖ＲＮＡの一方の末端部分に修飾されており、かつ、前記この蛍光を消光する官能基が前記一本鎖ＲＮＡのもう一方の末端部分に修飾されていることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項７】
前記ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程において、反応溶液中にマグネシウムイオンが含まれていることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項１】
テロメラーゼの活性を測定する方法であって、
（１）テロメラーゼと、テロメラーゼの基質となる一本鎖ＤＮＡを同一溶液中に置き、テロメラーゼ反応を行わせる工程
（２）前記テロメラーゼ反応に供せられた前記基質一本鎖ＤＮＡと、テロメアＤＮＡの配列と相補的に結合できる配列からなり、かつ蛍光を発する官能基とこの蛍光を消光する官能基が修飾された一本鎖ＲＮＡと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を、同一溶液中に置き、ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程
（３）前記ＲＮａｓｅＨ反応中あるいは反応後に、前記蛍光を測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記テロメラーゼが、ヒトのテロメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項３】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列が、ヒトのテロメアＤＮＡと同じ配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項４】
前記基質一本鎖ＤＮＡの配列が５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）であることを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項５】
前記一本鎖ＲＮＡの配列が、５’−ＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：２）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＣＣＵＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：４）、５’−ＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡ−３’（配列番号：５）、５’−ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ−３’（配列番号：６）からなる群から得られる少なくとも一種であることを特徴とする請求項２に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項６】
前記蛍光を発する官能基が前記一本鎖ＲＮＡの一方の末端部分に修飾されており、かつ、前記この蛍光を消光する官能基が前記一本鎖ＲＮＡのもう一方の末端部分に修飾されていることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【請求項７】
前記ＲＮａｓｅＨ反応を行わせる工程において、反応溶液中にマグネシウムイオンが含まれていることを特徴とする請求項１に記載のテロメラーゼ活性測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２０５５６８（Ｐ２０１２−２０５５６８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７５０２０（Ｐ２０１１−７５０２０）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]