デオキシリボ核酸における塩基置換の一斉検出
【課題】 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）を簡便，迅速，安価に検出できる一斉分析法を提供する．
【解決手段】 ＤＮＡ上にある多数のＳＮＰを増幅するために，対応するアリル特異的プライマーを合成し，多数のプライマーを含む反応液を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検査する方法．
【解決手段】 ＤＮＡ上にある多数のＳＮＰを増幅するために，対応するアリル特異的プライマーを合成し，多数のプライマーを含む反応液を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検査する方法．
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）にある多数の塩基置換部位を一斉に検出するための検査手法に関するものである．
【背景技術】
【０００２】
遺伝子上の一塩基置換多型（ＳＮＰ）は個人の遺伝的特徴を決定づける主要因として重要であり，この塩基置換を検出するための様々な検査方法が開発されている．
【０００３】
遺伝子上のＳＮＰを，鎖長や蛍光標識物質が異なることによって識別できる多数のアリル特異的プライマーを混合してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い反応液中に残った未反応のアリル特異的プライマーを電気泳動によって識別することで，対応する塩基置換の有無を検査するマルチプレックスＳＮＰ検査法は既に利用されている．
【０００４】
プライマー伸長反応とマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を組み合わせて，ファインマッピング，連鎖解析，および遺伝的検査を目的としてＳＮＰを検杳する手法は，ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムとして既に利用されている．
【特許文献１】特許第３０５７５５３号公報
【非特許文献１】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マルチプレックスＳＮＰ検査法は，検査するＳＮＰ部位が多くなるに従って，必要となるアリル特異的プライマーの数が増加するが，蛍光標識プライマーは高価なため，検査コストが高くなるという問題点がある．
【０００６】
また，プライマーの鎖長の違いを電気泳動によって識別するには，最低１〜３塩基差が必要であり，プライマーの塩基配列の違いによって泳動速度が変化するため，実際に泳動することなしに識別可能かどうか推測することは困難である．
【０００７】
一方，プライマー伸長反応は，事前にＰＣＲ増幅（ＰｒｅＰＣＲ）した産物から未反応のデオキシリボ核酸（ｄＮＴＰｓ）やＰＣＲプライマー，１本鎖ＤＮＡ
め操作が煩雑で，時間と手間がかかるという問題点がある．
【０００８】
また，プライマー伸長反応前のマルチプレックスＰｒｅＰＣＲで，目的とするＳＮＰを含む全ての部位において等量の増幅産物が得られるように調節することは困難であり，非特異的に増幅した二本鎖ＤＮＡ内にＳＮＰ検出用のＭａｓｓＥ
なるという問題点がある．
【０００９】
さらに，プライマー伸長反応では，通常のＰＣＲに必要なｄＮＴＰｓ以外にジデオキシリボ核酸（ｄｄＮＴＰｓ）とアルカリフォスファターゼ，ＳＮＰ検出用
う問題点がある．
【００１０】
したがって，本発明の課題は，一回のＰＣＲでＤＮＡ上の多数のＳＮＰを簡便，迅速，安価に検出できる一斉分析法を提供することである．
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は，ＤＮＡ上にある多数のＳＮＰを増幅するためにアリル特異的プライマーを合成し，ＰＣＲを行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検出することを特徴とする検査方法である．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば，一回のＰＣＲで多数のＳＮＰを同時に検査することが可能で，必要となるアリル特異的プライマーは蛍光標識する必要がない．ＴＯＦ−ＭＳの分子量測定精度の高さから，同鎖長のプライマーでも塩基組成の違いから識別可能となるので，必ずしも鎖長が異なるように設計する必要がなく，より多くのＳＮＰ部位を安価に検査することができる．
【００１３】
また，プライマーの設計に特別な知識は必要なく，ＰｒｅＰＣＲや酵素処理などの工程もなく非常に簡便であり，分子量を計算することでピークの出現位置を推定することができるためアリル特異的プライマーの同定が容易である．
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによってイオン化可能な分子量範囲は数千〜数万なので，１０〜３００オリゴヌクレオチドの範囲で分子量の異なる多数のプライマーを同時に検査でき，数百〜数千ＳＮＰの一斉分析が可能になる．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下，本発明を実施するための最良の形態について説明する．
【００１６】
目的に応じたＳＮＰを選び出し，前後の塩基配列から対立する塩基置換部位を３’末端に持つアリル特異的プライマーと共通するリバースプライマーを設計する．多数のＳＮＰについて設計したプライマーの分子量を計算し，分子量が近接する場合は５’末端に非相補的オリゴヌクレオチドを加えて各プライマーが容易に識別できるように修正を加える．
【００１７】
合成したプライマーミックス，ｄＮＴＰｓ，ポリメラーゼなどを含むＰＣＲ反応液に鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲ増幅を行う．この時，増幅産物の分子量が未反応のプライマーとオーバーラップしないように注意する．
【００１８】
対照試料を含めた試料について，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる分析を行い，陰性対照のピークと試料のピークを比較し，減少の認められたピークからＰＣＲに使用されたプライマーを同定する．
【００１９】
リバースプライマーと，対立するアリル特異的プライマーの一方もしくは両方に減少が認められれば，対応する塩基置換の存在が認められ，リバースプライマーとアリル特異的プライマーの両方に減少が認められなければ，ＰＣＲ阻害，鋳型ＤＮＡの不足，予期しない塩基置換によるアニーリング不全が起こったものと判断する．
【実施例】
【００２０】
ヒト第６染色体上にあるＡＢＯ式血液型遺伝子座のエクソン６にあるグアニンの挿入・欠損（塩基番号２６１），エクソン７にあるシトシンとアデニンのトランスバージョン変異（塩基番号７９６）に対応した４つのアリル特異的プライマーと２つのリバースプライマーを合成した．
【００２１】
ＡＢＯ式血液型既知の血液からＤＮＡを抽出し，合成したプライマーミックスを含むＰＣＲ反応液と混合し，サーマルサイクラーでＰＣＲを行った．
【００２２】
ＰＣＲ後の液を脱塩し，プレート上でマトリックスと混合して乾燥したものについて，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる分析を行った．
【００２３】
陰性対照と比較すると，特定のプライマーに相当する分子量ピークの減少が認められ，ＰＣＲに使用されたプライマーが同定できた．
【００２４】
同定されたプライマーから対応する塩基置換の有無を特定し，ＡＢＯ式血液型遺伝子型判定を行ったところ，既知の血液型と完全に一致した．
【技術分野】
【０００１】
この発明は，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）にある多数の塩基置換部位を一斉に検出するための検査手法に関するものである．
【背景技術】
【０００２】
遺伝子上の一塩基置換多型（ＳＮＰ）は個人の遺伝的特徴を決定づける主要因として重要であり，この塩基置換を検出するための様々な検査方法が開発されている．
【０００３】
遺伝子上のＳＮＰを，鎖長や蛍光標識物質が異なることによって識別できる多数のアリル特異的プライマーを混合してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い反応液中に残った未反応のアリル特異的プライマーを電気泳動によって識別することで，対応する塩基置換の有無を検査するマルチプレックスＳＮＰ検査法は既に利用されている．
【０００４】
プライマー伸長反応とマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を組み合わせて，ファインマッピング，連鎖解析，および遺伝的検査を目的としてＳＮＰを検杳する手法は，ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムとして既に利用されている．
【特許文献１】特許第３０５７５５３号公報
【非特許文献１】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マルチプレックスＳＮＰ検査法は，検査するＳＮＰ部位が多くなるに従って，必要となるアリル特異的プライマーの数が増加するが，蛍光標識プライマーは高価なため，検査コストが高くなるという問題点がある．
【０００６】
また，プライマーの鎖長の違いを電気泳動によって識別するには，最低１〜３塩基差が必要であり，プライマーの塩基配列の違いによって泳動速度が変化するため，実際に泳動することなしに識別可能かどうか推測することは困難である．
【０００７】
一方，プライマー伸長反応は，事前にＰＣＲ増幅（ＰｒｅＰＣＲ）した産物から未反応のデオキシリボ核酸（ｄＮＴＰｓ）やＰＣＲプライマー，１本鎖ＤＮＡ
め操作が煩雑で，時間と手間がかかるという問題点がある．
【０００８】
また，プライマー伸長反応前のマルチプレックスＰｒｅＰＣＲで，目的とするＳＮＰを含む全ての部位において等量の増幅産物が得られるように調節することは困難であり，非特異的に増幅した二本鎖ＤＮＡ内にＳＮＰ検出用のＭａｓｓＥ
なるという問題点がある．
【０００９】
さらに，プライマー伸長反応では，通常のＰＣＲに必要なｄＮＴＰｓ以外にジデオキシリボ核酸（ｄｄＮＴＰｓ）とアルカリフォスファターゼ，ＳＮＰ検出用
う問題点がある．
【００１０】
したがって，本発明の課題は，一回のＰＣＲでＤＮＡ上の多数のＳＮＰを簡便，迅速，安価に検出できる一斉分析法を提供することである．
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は，ＤＮＡ上にある多数のＳＮＰを増幅するためにアリル特異的プライマーを合成し，ＰＣＲを行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検出することを特徴とする検査方法である．
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば，一回のＰＣＲで多数のＳＮＰを同時に検査することが可能で，必要となるアリル特異的プライマーは蛍光標識する必要がない．ＴＯＦ−ＭＳの分子量測定精度の高さから，同鎖長のプライマーでも塩基組成の違いから識別可能となるので，必ずしも鎖長が異なるように設計する必要がなく，より多くのＳＮＰ部位を安価に検査することができる．
【００１３】
また，プライマーの設計に特別な知識は必要なく，ＰｒｅＰＣＲや酵素処理などの工程もなく非常に簡便であり，分子量を計算することでピークの出現位置を推定することができるためアリル特異的プライマーの同定が容易である．
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによってイオン化可能な分子量範囲は数千〜数万なので，１０〜３００オリゴヌクレオチドの範囲で分子量の異なる多数のプライマーを同時に検査でき，数百〜数千ＳＮＰの一斉分析が可能になる．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下，本発明を実施するための最良の形態について説明する．
【００１６】
目的に応じたＳＮＰを選び出し，前後の塩基配列から対立する塩基置換部位を３’末端に持つアリル特異的プライマーと共通するリバースプライマーを設計する．多数のＳＮＰについて設計したプライマーの分子量を計算し，分子量が近接する場合は５’末端に非相補的オリゴヌクレオチドを加えて各プライマーが容易に識別できるように修正を加える．
【００１７】
合成したプライマーミックス，ｄＮＴＰｓ，ポリメラーゼなどを含むＰＣＲ反応液に鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲ増幅を行う．この時，増幅産物の分子量が未反応のプライマーとオーバーラップしないように注意する．
【００１８】
対照試料を含めた試料について，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる分析を行い，陰性対照のピークと試料のピークを比較し，減少の認められたピークからＰＣＲに使用されたプライマーを同定する．
【００１９】
リバースプライマーと，対立するアリル特異的プライマーの一方もしくは両方に減少が認められれば，対応する塩基置換の存在が認められ，リバースプライマーとアリル特異的プライマーの両方に減少が認められなければ，ＰＣＲ阻害，鋳型ＤＮＡの不足，予期しない塩基置換によるアニーリング不全が起こったものと判断する．
【実施例】
【００２０】
ヒト第６染色体上にあるＡＢＯ式血液型遺伝子座のエクソン６にあるグアニンの挿入・欠損（塩基番号２６１），エクソン７にあるシトシンとアデニンのトランスバージョン変異（塩基番号７９６）に対応した４つのアリル特異的プライマーと２つのリバースプライマーを合成した．
【００２１】
ＡＢＯ式血液型既知の血液からＤＮＡを抽出し，合成したプライマーミックスを含むＰＣＲ反応液と混合し，サーマルサイクラーでＰＣＲを行った．
【００２２】
ＰＣＲ後の液を脱塩し，プレート上でマトリックスと混合して乾燥したものについて，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる分析を行った．
【００２３】
陰性対照と比較すると，特定のプライマーに相当する分子量ピークの減少が認められ，ＰＣＲに使用されたプライマーが同定できた．
【００２４】
同定されたプライマーから対応する塩基置換の有無を特定し，ＡＢＯ式血液型遺伝子型判定を行ったところ，既知の血液型と完全に一致した．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上にある多数の一塩基置換多型（ＳＮＰ）を増幅するためにアリル特異的プライマーを合成し，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検査する方法．
【請求項１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上にある多数の一塩基置換多型（ＳＮＰ）を増幅するためにアリル特異的プライマーを合成し，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に，反応液中に残存しているアリル特異的プライマーの量をマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって分析し，反応前の量と比較することで，反応に利用されたアリル特異的プライマーを同定し，対応する塩基置換の有無を一斉に検査する方法．
【公開番号】特開２０１０−２４６５１５（Ｐ２０１０−２４６５１５Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１５９５１（Ｐ２００９−１１５９５１）
【出願日】平成２１年４月１５日（２００９．４．１５）
【出願人】（５９６０７７７７６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１５日（２００９．４．１５）
【出願人】（５９６０７７７７６）
【Ｆターム（参考）】
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