デコリン遺伝子を含む遺伝子伝達システム及びこれを含む薬剤学的抗腫瘍組成物
本発明は、デコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を追加的に含み、前記デコリンは、前記目的ヌクレオチド配列の細胞内運搬効率を増加させる作用をすることを特徴とする遺伝子伝達システム、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む組み換えアデノウイルス、これを含む抗腫瘍薬剤学的組成物、及び細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾患または状態の治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子伝達システム及び組み換えアデノウイルスに関するものであって、より詳細には、デコリン遺伝子を含む遺伝子伝達システム、組み換えアデノウイルス、前記組み換えアデノウイルスを含む抗腫瘍薬剤学的組成物、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物、及び細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患の治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス(Adenovirus, Ad)を利用した初期の遺伝子治療は、アデノウイルスの複製に必須的なＥ１遺伝子の代わりに、治療用遺伝子を挿入して製造した複製不能アデノウイルスを主に利用したが、これらのアデノウイルスは、感染された細胞とその周辺でのみ制限的に抗腫瘍効果を誘導して、臨床的な実用性の面で多い制約があった(Vile RG, Russell SJ, Lemoine NR., Gene Ther, 2000, 7(1):2-8)。これを克服するための一つの方案として、癌細胞でのみ選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＯＮＹＸ−０１５(Ad変異体、dl1520)をMcCormick研究陣が最初に開発した(Bischoff JR, et al., Science, 1996, 274(5286):373-376; Heise C, et al., Nat Med, 1997, 3(6):639-645)。ＯＮＹＸ−０１５は、Ｅ１Ｂ ５５ ｋＤａ遺伝子が部分的に欠損されたアデノウイルスであって、ｐ５３が機能的に非活性化された細胞でのみ増殖が可能である。即ち、正常細胞では、ＯＮＹＸ−０１５アデノウイルスがｐ５３を非活性化することができないため、ウイルスの増殖が抑えられ、細胞殺傷を誘導することができない反面、ｐ５３の機能が抑えられている癌細胞では、ウイルスの増殖が活発に起こり、究極的に癌細胞だけを選択的に殺傷するようになる(Chang F, Syrjanen S, Syrjanen K., J Clin Oncol, 1995, 13(4):1009-1022)。
【０００３】
最近、頭頸部癌を対象に進行された臨床II/III期の試験結果、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの優れた治療効果が報告された(Kirn D, Hermiston T, McCormick F., Nat Med, 1998, 4(12):1341-1342; Nemunaitis J, et al., Cancer Res, 2000, 60(22):6359-6366; Ganly I, et al., Clin Cancer Res, 2000, 6(3): 798-806)。しかしながら、前記アデノウイルスの投与により、頭頸部腫瘍の成長が部分的に抑制されたものの、完全に消滅されたわけではなく、一定期間が過ぎた後には、腫瘍の成長がさらに速やかに進行された。このような結果は、局所的に腫瘍内投与されたアデノウイルスが一部周辺にのみ拡散されて、腫瘍組織全体に広がらなかったため、抗腫瘍効果が制限的に誘導され、ウイルスに感染されなかった腫瘍細胞が再び速やかに成長したからであると考えられる。最近の研究報告によると、ヌードマウスに形成された人体腫瘍内に投与されたアデノウイルスは、ウイルスの投与後１００日が経った場合も、腫瘍内で複製が起こり、腫瘍組織から生きているウイルスが抽出されたが、腫瘍の成長を完全に抑制することはできなかった。以後の研究結果によると、このような低い抗腫瘍効果は、腫瘍組織内に存在する結締組織(connective tissue)と細胞外基質(extracellular matrix)により、ウイルスの拡散が制限的に起こったからであると明かされた。また、アデノウイルスを腫瘍内に投与すると、初期には、生来の(innate)免疫反応により、アデノウイルスが血流から速やかに除去されたが、ウイルス投与後約４８週には、アデノウイルスが再び血流から検出されて、これは、腫瘍内で複製されたアデノウイルスが血流に放出されてきたものと推論された。このような一連の結果をまとめてみると、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスは、癌細胞内で活発に複製が起こるが、癌細胞間に存在する細胞外基質及び結締組織などのような物理的障壁により、周辺癌細胞に活発に広がることができず、これらのアデノウイルスによる抗腫瘍効果が制限的に誘導されると考えられる。
【０００４】
したがって、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを癌治療に効率的に利用するためには、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスが強力な細胞殺傷能を誘導することができなければならなく、投与されたアデノウイルスが腫瘍組織全体によく拡散されて、周辺癌細胞を効率的に感染できなければならない。
【０００５】
最近、ウイルス性遺伝子伝達体の制限された組織内拡散問題と、これによる低い遺伝子伝達効率を克服するために、いくつかの方案が研究されている。N. Kuriyama研究陣は、コラーゲンとその他の細胞外基質を分解できるコラゲナーゼ/ディスパーゼ(collagenase/dispase)、またはトリプシンのような蛋白質分解酵素(protease)を、アデノウイルスを投与する前に処理することにより、アデノウイルスの遺伝子伝達効率を大きく向上した(Kuriyama N, et al., Hum Gene Ther, 2000, 11(16):2219-2230)。また、同じ概念で、L. Maillard研究陣は、動脈の主要構成成分であるエラスチンを分解できるエラスターゼをラビットのお尻(iliac)動脈に処理することにより、アデノウイルスによる遺伝子伝達効率を約２倍ほど向上させることができた(Maillard, L., et al., Gene Ther, 1998, 5(8):1023-1030)。その他にも、細胞外基質を分解できるヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)を利用して、ラットの筋肉におけるアデノ随伴ウイルスによる遺伝子伝達効率を約２〜３倍程度向上できることが報告された(Favre D, et al., Gene Ther, 2000, 7(16):1417-1420)。このような一連の研究を通じて、細胞外基質の構成成分の合成を阻害するかまたが分解を促進して、細胞外基質の構成成分を減少させると、組織内におけるウイルス拡散を増大することができて、その結果、遺伝子伝達効率を向上させることができると期待される。また、皮膚の結合組織の異常増殖により引き起こされるケロイド(keloid)のような線維症疾患においても、細胞外基質の合成を阻害することにより、線維症疾患の生成を抑制し、治療効果を誘導することができると考えられる。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用は、括弧内に表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、遺伝子伝達システムの伝達効率、特に、組織内における遺伝子伝達システムの浸透性(あるいは拡散性)を増加させるために鋭意研究した結果、デコリンが遺伝子伝達効率を大きく改善でき、前記デコリンを発現する組み換えアデノウイルスが組織浸透性及び抗腫瘍効果に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、デコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含む新規遺伝子伝達システムを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、伝達効率の改善された遺伝子伝達方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能が改善された組み換えアデノウイルスを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、上述の組み換えアデノウイルスを含む薬剤学的抗腫瘍組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、上述の薬剤学的抗腫瘍組成物を利用した癌の治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患の治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一様態によると、本発明は、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列及びデコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、前記目的ヌクレオチド配列の細胞内運搬効率を増加させる作用をすることを特徴とする遺伝子伝達システムを提供する。
【００１７】
本発明者らは、遺伝子伝達システムの伝達効率、特に、組織内における遺伝子伝達システムの浸透性(あるいは、拡散性)を増加させるために鋭意研究した。このような研究の方向は、細胞外基質(ECM)の構成成分の合成を阻害するかまたは分解を促進し、細胞外基質の構成成分を減少させれば、組織内における遺伝子伝達システムの拡散を増大させることができるという仮説に基づいたものである。結局、本発明者らは、デコリンが遺伝子伝達効率を大きく改善できるという驚くべき事実を見出した。
【００１８】
本明細書において、用語“デコリン”は、実施例に示されたデコリンだけではなく、本発明で目標とする遺伝子伝達効率を増加させることのできるデコリンのあらゆる擬似体(homologues)を含む。
【００１９】
本発明において、遺伝子伝達効率を改善するデコリン(decorin：DCN)は、SLRP(small leucine rich proteoglycan)部類に属するタンパク質であって、10〜12個のロイシンリッチリピート(leucine rich repeat)から構成されており、コア部位は、アーチ(arch)状になっており、細胞外基質に存在する数種の成長因子またはデコリン受容体と結合が容易な構造に形成されている(Krusius T, Ruoslahti E., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(20):7683-7687; Day AA, et al., Biochem J, 1987, 248(3):801-805; Fisher LW, Termine JD, Young MF., J Biol Chem, 1989, 264(8):4571-4576)。デコリンは、腫瘍成長因子(TGF)−βの活性を抑制することにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質の構成(matrix assembly)に関与して、腫瘍細胞の成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に天然拮抗剤(antagonist)として作用すると知られている(Iozzo RV., Crit Rev Biochem Mol Biol, 1997, 32(2):141-174; Isaka Y, et al., Nat Med, 1996, 2(4):418-423)。また、デコリンは、成長因子や金属イオンのような細胞外基質の構成成分と反応し、MMP-1(matrix metalloproteinase-1)とMMP-2などの発現を促進して、細胞外基質を分解させる(Yamaguchi Y, Mann DM, Ruoslahti E., Nature, 1990, 346(6281):281-284; Vogel KG, Paulsson M, Heinegard D., Biochem J, 1984, 223(3):587-597; Danielson KG, et al., J Cell Biol, 1997, 136(3):729-743)。
【００２０】
本発明の遺伝子伝達システムにおいて、デコリンが遺伝子伝達効率を増加させるメカニズムの一つは、デコリンが、MMP2及びMMP9などのような数種のMMP発現を促進することにより、細胞を囲んでいる細胞外基質成分の大部分を占めているコラーゲンを分解し、 結締組織、ひいては基底膜までも破壊して、細胞外基質の分解を誘導することができるためであると判断されて、このようなメカニズムは、下記の実施例により検証される。
【００２１】
したがって、上述のデコリンの作用を参照すると、本発明の遺伝子伝達システムは、細胞外基質により連結された細胞からなる組織内の細胞において、その長所が顕著に現れる。特に、結締組織により堅固に囲まれている腫瘍組織に、本発明の遺伝子伝達システムが適用されると、従来のいかなる遺伝子伝達体よりも改善された伝達効率を示す。
【００２２】
本発明の遺伝子伝達システムを製造するために、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、適した発現コンストラクト(expression construct)内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、デコリン遺伝子は、プロモーターに作動的に結合されることが好ましい。本明細書において、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節するようになる。本発明において、デコリン遺伝子に結合されたプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、デコリン遺伝子の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ(Cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Kプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、誘導性(inducible)プロモーター、癌細胞特異的プロモーター(例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター)及び組織特異的プロモーター(例えば、アルブミンプロモーター)を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターまたは癌細胞特異的プロモーターである。癌細胞特異的プロモーターを利用する場合、TERTプロモーターまたはE2Fプロモーターを利用することが好ましい。TERT(telomere reverse transcriptase)プロモーターとして野生型ヒトhTERT(human telomere reverse transcriptase)プロモーターまたは本発明者らにより開発されたm-hTERTを利用できる(see WO 2004/076668)。m-hTERTは、2個のc-Myc結合部位及び5個のSp1結合部位を含むヒトテロメア逆転写酵素プロモーターに、さらに一つ以上(好ましくは1個)のc-Myc結合部位及び一つ以上(好ましくは5個)のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたプロモーターである。m-hTERTの具体的なヌクレオチド配列は、WO 2004/076668に開示されている。E2Fプロモーターは、細胞周期に関与するプロモーターである(Johnson, D.G., Mol. Carcinog. 27: 151-157(2000); Ngwenya, S., and Safe, S., Endocrinology 144:1675-1685; Cam, H., and Dynlacht, D., Cancer Cell 3:311-316(2003))。
【００２３】
好ましくは、本発明に利用される発現コンストラクトは、ポリアデニル化配列を含む(例えば、牛成長ホルモンターミネーター及びＳＶ４０由来ポリアデニル化配列)。
【００２４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に利用されるデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、“プロモーター−デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列−ポリアデニル化配列(Pol A)”の構造を有する。
【００２５】
本発明の遺伝子伝達システムにおいて、細胞内に運搬しようとする目的のヌクレオチド配列も、上述のデコリン遺伝子の発現コンストラクトと同一な方法により発現コンストラクトを構築することができる。
【００２６】
本発明で細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、いかなるヌクレオチド配列でも可能であって、例えば、癌細胞の死滅を誘導して、究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子として、腫瘍抑制遺伝子、免疫調節遺伝子[例えば、サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、及び共刺激因子(Costimulatory factor:B7.1とB7.2のようなT細胞活性に必要な補助分子)]、抗原性遺伝子、自殺遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子、及び抗−新生血管生成遺伝子が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
自殺遺伝子は、細胞が外部因子により殺傷され易くなるように誘導する物質を発現するか、細胞に毒性条件を誘発する核酸配列である。このような自殺遺伝子としてよく知られているものは、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子である(米国特許第5,631,236号及び第5,601,818号)。ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル(gancyclovir)の投与により選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドを暗号化する遺伝子を意味する。腫瘍抑制遺伝子は、哺乳動物において自然発生遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は、腫瘍発生に必須前提とされている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＶＨＬ、ｐ５３、Ｒｂ、ＭＭＡＣ−１、ＭＭＳＣ−２、網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al. Nature, 329:642(1987))、大腸腺腫症遺伝子蛋白質(adenomatous polyposis coli protein;米国特許第5,783,666号)、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998))、欠損された血漿腫瘍(DCC)遺伝子、ＭＴＳ１、ＣＤＫ４、ＶＨＬ、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６、及びｐ２１を含む腫瘍抑制遺伝子のＩＮＫ４系列の一員及びこれの治療学的に有効な断片(例えば、p56Rb、p94Rbなど)が含まれる。当業者なら、前記例示した遺伝子に限定されず、その他に知られたあらゆる抗腫瘍遺伝子が本発明に使用できるということが分かるだろう。
【００２８】
本明細書において、用語“抗原性遺伝子(antigenic gene)”は、ターゲット細胞内で発現されて、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)及びＰＳＡ(prostate specific antigen)、ＡＦＰ(α-feto protein)、ｐ５３(WO 94/02167)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。
【００２９】
本明細書において、用語“細胞毒性遺伝子(Cytotoxic gene)”は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列が含まれる。
【００３０】
本明細書において、用語“細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)”は、細胞内で発現されて、細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合蛋白質遺伝子、シクリン−従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、p16、p15、p18及びp19)、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox, GAX)遺伝子(WO 97/16459及びWO 96/30385)などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、各種疾患を治療するに有用に使用できる種々の治療遺伝子も、本発明のシステムにより運搬される。例えば、サイトカイン(例えば、インターフェロン−α、−β、−δ、−γ)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-5、IL-18、IL-19、IL-20及びIL-23)、及びコロニー刺激因子(例えば、GM-CSF及びG-CSF)を暗号化する遺伝子、ケモカイングループ(単球走化性蛋白質１(MCP-1)、単球走化性蛋白質2(MCP-2)、単球走化性蛋白質3(MCP-3)、単球走化性蛋白質4(MCP-4)、マクロファージ炎症性蛋白質１α(MIP-1α)、マクロファージ炎症性蛋白質１β(MIP-1β)、マクロファージ炎症性蛋白質１γ(MIP-1γ)、マクロファージ炎症性蛋白質３α(MIP-3α)、マクロファージ炎症性蛋白質３β(MIP-3β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症性蛋白質４(MIP-4)、マクロファージ炎症性蛋白質５(MIP-5)、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−イプシロン(p500)、胸腺活性化調節されるケモカイン(TARC)、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒト蛋白質ＨＣＣ−１/ＮＣＣ−２、ヒト蛋白質ＨＣＣ−３、マウス蛋白質Ｃ１０など)が含まれる。また、組織プラスミノゲン活性化剤(tPA)またはウロキナーゼを発現する遺伝子及び持続的な血栓効果を提供して、高コレステロール血症を予防するＬＡＬ生成遺伝子が含まれる。また、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びＡＩＤＳのようなウイルス、悪性または炎症疾患を治療するための数種のポリヌクレオチドが知られている。
【００３２】
本明細書において、用語“親−細胞死滅遺伝子(Pro-apoptotic gene)”は、発現されて、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ(Ａｄ２及びＡｄ５由来)またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ(Ａｄ由来)、アデノウイルスＥ４遺伝子、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれる。
【００３３】
本発明の明細書において、用語“抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)”は、発現されて、抗−新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管生成因子には、アンジオスタチン、Ｔｉｅ ２(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子(VEGF)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００３４】
上述の目的のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬのようなＤＮＡ配列データバンクから入手できる。
【００３５】
本発明の遺伝子伝達システムは、多様な形態に製作することができるが、これは、(i)ネーキッド(naked)組み換えＤＮＡ分子、(ii)プラスミド、(iii)ウイルスベクター、及び(iv)前記ネーキッド組み換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはネオソームの形態に製作することができる。
【００３６】
デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、通常的な遺伝子治療に利用される全ての遺伝子伝達システムに適用できて、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997))、アデノ−関連ウイルス(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、レトロウイルス(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、レンチウイルス(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999))、単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))、ワクシニアウイルス(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999))、リポソーム(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002)、またはネオソームに適用できる。最も好ましくは、本発明の遺伝子伝達システムは、デコリンエンコーディングヌクレオチド配列をアデノウイルスに適用して製造される。
【００３７】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲のターゲット細胞、及び優れた感染性から、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ(inverted terminal repeat)を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的なシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域(E1A及びE1B)は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節する蛋白質をコーディングする。Ｅ２領域(E2A及びE2B)は、ウイルスＤＮＡ複製に関与する蛋白質をコーディングする。
【００３８】
現在開発されたアデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域の欠如された複製不能アデノウイルスがよく利用されている。一方、Ｅ３領域は、通常的なアデノウイルスベクターから除去され、外来遺伝子が挿入される座を提供する(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); ・ Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989))。したがって、本発明のデコリン遺伝子は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失されたＥ３領域に挿入される。一方、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失されたＥ１領域に挿入される。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語、“欠失”は、該当配列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。
【００３９】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムは、“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列”と“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”とが連結された構造を有して、前記“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域、好ましくは、欠失されたＥ１領域に挿入されたものであり、前記“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域、好ましくは、欠失されたＥ３領域に挿入されたものである。また、“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列−ＩＲＥＳ−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”のように、目的ヌクレオチドとデコリン遺伝子がＩＲＥＳ(internal ribosome entry site)により連結されたバイシストロン(bicistronic)発現システムによっても発現可能である。
【００４０】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987))。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加的に結合させることもできる。
【００４１】
アデノウイルスは、４２個の相異なる血清型及びＡ〜Ｆのサブグループを有する。この中で、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ２及びタイプ５が、本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ２及びタイプ５に対する生化学的及び遺伝的情報は、よく知られている。
【００４２】
アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同一な方式により複製されて、そのため、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子治療が非常に安全であると判断される。
【００４３】
ii．レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させて、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染できる細胞のスペクトルが広いため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。
【００４４】
レトロウイルスベクターを構築するために、デコリン遺伝子及び運搬しようする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入されて、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ(long terminal repeat)とΨ配列は含まないパッケージング細胞株を構築する(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983))。デコリン遺伝子、運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、ＬＴＲ及びΨ配列を含む組み換えプラスミドを前記細胞株に移入すると、Ψ配列は、組み換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にして、この転写体は、ウイルスにパッケージングされて、ウイルスは、培地に排出される(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988))。組み換えレトロウイルスを含有する培地を収集して濃縮し、遺伝子伝達システムに利用する。
【００４５】
２世帯レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。Kasaharaら(Science, 266:1373-1376(1994))は、モロニーマウス白血病ウイルス(moloney-murine leukemia virus)の変異体を製造して、ここで、ＥＰＯ(erythropoietin)配列をエンベロープ部位に挿入して、新しい結合特性を有するキメリック蛋白質(Chimeric proteins)を生産した。本発明の遺伝子伝達システムも、このような２世帯レトロウイルスベクターの構築戦略により製造することができる。
【００４６】
iii．ＡＡＶベクター
アデノ関連ウイルス(AAV)は、非分裂細胞を感染させることができて、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているため、本発明の遺伝子伝達システムに適している。ＡＡＶベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００４７】
遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究は、LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)、及びFlotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)に開示されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療剤として臨床Ｉを施している。
【００４８】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、二つのＡＡＶ末端リピートが両側に位置されている目的の遺伝子配列(デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列)を含むプラスミド(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988);及びSamulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989))及び末端リピートのない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))を同時形質転換させて製造される。
【００４９】
iv．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムとして利用することができる。ワクシニアウイルス(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986)及びCoupar et al., Gene, 68:1-10(1988))、レンチウイルス(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999))、または単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))由来のベクターも、デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬できる運搬システムとして利用することができる。
【００５０】
v．リポソーム
リポソームは、水上に分散されたリン脂質により自然に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームにより成功的に細胞内に運搬した例は、Nicolau及びSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982)、及びNicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)に開示されている。一方、リポソームを利用した動物細胞の形質転換に最もよく利用される試薬としては、Lipofectamine(Gibco BRL)がある。デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着またはプラズマ細胞膜との融合などのメカニズムを通じて細胞と相互作用し、細胞内にデコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を運搬する。
【００５１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明の遺伝子伝達システムを、細胞を含むバイオサンプルに接触させる段階を含む遺伝子伝達方法を提供する。
【００５２】
本発明において、遺伝子伝達システムがウイルスベクターに基づいて製作された場合は、前記接触させる段階は、当業界に公知されたウイルス感染方法により行われる。ウイルスベクターを利用した宿主細胞の感染は、上述の引用文献に記載されている。
【００５３】
本発明において、遺伝子伝達システムがネーキッド(naked)組み換えＤＮＡ分子またはプラスミドの場合は、微細注入法(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980);及びHarlandとWeintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985))、カルシウムフォスフェート沈殿法(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973);及びChenとOkayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987))、電気穿孔法(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982);及びTur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986))、リポソーム−媒介形質感染法(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau及びSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982);及びNicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987))、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985))、及び遺伝子ボンバードメント(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))方法により、遺伝子を細胞内に移入させることができる。
【００５４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、アデノウイルスのＩＴＲ(inverted terminal repeat)ヌクレオチド配列及びデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させる作用をすることを特徴とする組み換えアデノウイルスを提供する。
【００５５】
本発明の組み換えアデノウイルスは、従来の組み換えアデノウイルスにデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を追加的に結合させ、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させて、アデノウイルスによる癌治療効能を大きく増加させる。
【００５６】
アデノウイルスゲノムの小さい部分だけがｃｉｓで必要であると知られているため(Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981))、アデノウイルスは、大量の外来ＤＮＡ分子を運搬できる能力があり、これは特に、２９３のような特定細胞株を利用する場合にそうである。このような側面で、本発明の組み換えアデノウイルスにおいて、デコリン遺伝子以外の他のアデノウイルスの配列は、少なくともＩＴＲ配列を含む。
【００５７】
デコリン遺伝子は、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ３領域に挿入される。一方、他の外来ヌクレオチド配列(例えば、サイトカイン、免疫−共刺激因子、自殺遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子)も追加的にアデノウイルスに含ませることができて、これは、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)に挿入される(参照：図1a及び1b)。本発明の他の変形例によると、デコリン遺伝子は、Ｅ４領域に挿入できる。
【００５８】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加的に結合させることもできる。
【００５９】
本発明の好ましい具現例において、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子、またはＥ１Ｂ １９ｋＤａ/Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子を有して、好ましくは、非活性化されたＥ１Ｂ １９ｋＤａ及びＥ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子を有する。本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語“非活性化”は、その遺伝子の転写及び/または解読が正常的になされず、その遺伝子によりコーディングされる正常的な蛋白質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変異(置換、付加、部分的欠失、または全体的欠失)が発生され、活性のＥ１Ｂ １９ｋＤａ蛋白質を生成できない遺伝子である。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子が欠如された場合は、細胞アポトーシス能を増加させることができて、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子が欠如された場合は、腫瘍細胞特異性を有するようにする(参照：大韓民国特許出願第2002−23760号)。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組み換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有するようになる。本発明のより好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ １９及び/またはＥ１Ｂ ５５遺伝子及び活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明の最も好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ １９及び/またはＥ１Ｂ ５５遺伝子が欠失されて、活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入される。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ遺伝子及び変異された活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン遺伝子は、欠失されたＥ３領域に挿入されているものである。ここで、変異された活性のＥ１Ａ遺伝子は、Ｒｂ(retinoblastoma蛋白質)結合部位をコーディングするヌクレオチド配列中で、４５番目Ｇｌｕ残基がＧｌｙに置換された変異及び１２１〜１２７番目アミノ酸配列が全体的にＧｌｙに置換された変異を有する。腫瘍細胞では、ｐ５３蛋白質の変異だけではなく、Ｒｂの突然変異あるいはＲｂ関連信号メカニズムが相当部分損傷されているため、Ｒｂとの結合能が消失されたアデノウイルスは、正常細胞では、Ｒｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、Ｒｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を選択的に殺傷することができる。したがって、上述のＲｂ結合部位における変異を含む本発明の組み換えアデノウイルスは、癌細胞特異性が非常に大きく増大される。
【００６２】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、“ＩＴＲ−Ｅ１Ａ−ΔＥ１Ｂ−プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”構造を有して、前記“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ３領域に挿入されたものである。
【００６３】
本発明の最も好ましい実施例によると、本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスは、図１ｂの遺伝子地図を有する。
【００６４】
本発明の組み換えアデノウイルスにおいて、従来の抗腫瘍アデノウイルスの局所的腫瘍浸透力が大きく改善されて、細胞アポトーシス能も大きく改善される。このような効果は、本発明で利用されたデコリンが細胞外基質を効果的に分解して、細胞アポトーシス能を増加させるためであり、最終的に本発明の組み換えアデノウイルスは、大きく改善された腫瘍細胞殺傷能を示す。
【００６５】
大部分の腫瘍組織は、癌細胞が単純に群集されているのではなく、血管と正常組織とが絡まっている。特に、癌組織内に存在する結締組織は、硬くて、且つ癌細胞の外部周囲に硬い細胞外基質が形成されているため、ウイルスはもちろん抗癌治療剤が腫瘍に円滑に浸透できず、抗腫瘍効果を十分発揮できない場合が多い。このような問題点は、デコリン遺伝子を含む本発明の組み換えアデノウイルスを利用した場合、成功的に克服される。
【００６６】
下記の実施例で証明されたように、デコリンの挿入されたアデノウイルスは、腫瘍球の表面だけではなく、腫瘍球の奥まで活発に拡散される。生体内の癌組織においても、デコリンを発現する本発明のアデノウイルスは、投与部位(injection site, needle track)からさらに遠く且つさらに広く広がっていく。デコリンの発現による遺伝子伝達効率の増加は、肉眼でも容易に確認できるほど、約２〜１０倍以上に大きく差があって、既存になされた数々の研究によるコラゲナーゼ/ディスパーゼ、またはトリプシンのような蛋白質分解酵素の前処理、エラスチンを分解できるエラスターゼ、または細胞外基質を分解できるヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)による約２〜３倍の遺伝子伝達効率の増大に比べ、著しく優れた遺伝子伝達効率を示す。
【００６７】
そして、このようなデコリンの著しい組織内ウイルス拡散増進効果は、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスにも適用されて、その結果、抗腫瘍効果を大きく増大させる結果を誘導する。このような抗腫瘍効果の改善は、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(複製可能組み換えアデノウイルス)だけではなく、複製不能組み換えアデノウイルスでも現れる。一方、デコリンによる組み換えアデノウイルスの細胞アポトーシス能の格段の改善は、全く予期できなかった効果である。
【００６８】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)上述の本発明の組み換えアデノウイルスの治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的抗腫瘍組成物を提供する。
【００６９】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明の薬剤学的抗腫瘍組成物を動物に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物に有効成分として含まれる組み換えアデノウイルスは、上述の本発明の組み換えアデノウイルスと同一なものであるため、組み換えアデノウイルスに対する詳細な説明は、本発明の薬剤学的組成物にも同様に適用される。したがって、本明細書の不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００７１】
組み換えアデノウイルスを利用した効果的な抗腫瘍効果を誘導するためには、速い速度で成長する癌細胞に比べ、より速いウイルスの増殖と隣接細胞への拡散を通じて、効果的な細胞殺傷効果を誘発することができなければならない。また、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療が成功的になされるためには、高い治療効果と共に、安全性を高めるための方案が開発されなければならない。本発明で開発されたデコリン遺伝子を含む組み換えアデノウイルスは、ウイルス組織内拡散増大と細胞アポトーシス促進を通じて抗腫瘍効果が著しく増大されて、癌細胞特異的に細胞殺傷能を示す。これは、結果的に癌治療に必要なウイルス投与量を減少させることができ、ウイルスによる生体内毒性と免疫反応を大きく減らすことができる。
【００７２】
本発明の組成物に含まれる組み換えアデノウイルスは、上述のように、多様な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病または疾患、例えば、脳癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、結腸癌、及び子宮頸部癌などの治療に利用できる。本明細書において、“治療”は、(i)腫瘍細胞形成の予防；(ii)腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病または疾患の抑制；及び(iii)腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病または疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語“治療学的有効量”は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００７３】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００７４】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができて、脳癌、皮膚癌、頭頸部癌及び乳房癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００７５】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０5〜１×１０15ＰＦＵ/ｍｌの組み換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０10ＰＦＵを二日に一回、２週間注射する。
【００７６】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法または放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチニウム(transplatinum)、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む、本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ−線照射及びγ−線照射などである。
【００７８】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)薬物の組織浸透性を改善するためのデコリンタンパク質、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物を提供する。
【００７９】
本発明で利用されるデコリンタンパク質は、天然ソース(natural source)から分離されたデコリンタンパク質及び組み換え技術で得られたデコリンタンパク質を含み、細胞外基質分解活性を有する範囲内で、前記タンパク質の断片も含む。
【００８０】
本発明の組成物は、薬物が投与される前または薬物と同時に投与することができる。また、本発明の組成物は、薬物を追加的に含むことができる。本発明の薬剤学的組成物は、薬物が適用される生体組織の細胞外基質を分解することにより、薬物の組織浸透性を大きく改善し、薬物の薬理学的効果を増加させる。
【００８１】
本発明の薬剤学的組成物において、薬剤学的に許容される担体、投与方法及び製剤化方法などは、上述の抗腫瘍薬剤学的組成物の内容が適用される。特に、本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましいが、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または組織内直接投与(例えば、頭頸部癌または乳房癌腫塊内への直接投与)を利用して投与することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ/ｋｇである。
【００８２】
本発明の組成物により組織浸透性が改善される前記薬物は、化学薬物及びバイオ薬物(biodrug)を含み、好ましくは、細胞外基質により組織浸透性が問題となる薬物、例えば、上述の癌に対する化学療法剤である。
【００８３】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムまたはデコリンタンパク質の治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む細胞外基質の過度なる蓄積(accumulation)に係る疾患または状態の治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００８４】
本発明の薬剤学的組成物は、生体組織の細胞外基質を効果的に分解して、細胞外基質の過度なる蓄積または沈着(deposition)が関与する疾病または疾患を治療することができる。本明細書における表現“細胞外基質の過度なる蓄積”は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカンのような細胞外基質成分が、組織または器官機能を損傷し、終局的に線維症疾患を招来する程度に沈着されたことを意味する。
【００８５】
本発明の薬剤学的組成物が適用される、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾患または状態は、線維症状態と関連したものであって、斑痕、肝硬変症、肺線維症、糸球体腎炎、成人または急性呼吸困難症、肝線維症、腎線維症、後心筋梗塞線維症、 嚢胞性線維症、線維症癌、静脈閉塞症、または腎間質線維症を含むが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の薬剤学的組成物が適用される斑痕(scar)は、傷、火傷、または手術により生じた斑痕及びケロイドのような過度な斑痕である。
【００８７】
本発明の薬剤学的組成物において、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムは、上述した本発明の遺伝子伝達システムにより説明される。一方、本発明の薬剤学的組成物で利用されるデコリンタンパク質は、天然ソース(natural source)から分離されたデコリンタンパク質及び組み換え技術により得られたデコリンタンパク質を含み、細胞外基質分解活性を有する範囲内で、前記タンパク質の断片も含む。
【００８８】
本発明の薬剤学的組成物において、薬剤学的に許容される担体、投与方法及び製剤化方法などは、上述の抗腫瘍薬剤学的組成物の内容が適用される。特に、本発明の薬剤学的組成物が斑痕の治療のために利用される場合は、経皮投与が最も適しており、軟膏、ゲル、クリーム、液体、スプレー、パッチ、またはローションの剤形で製造することが最も好ましい。一般に、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ/ｋｇである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００９０】
［実験材料及び実験方法］
１．対象細胞株及び細胞の培養
本発明の実験に使用された細胞株は、人体脳癌細胞株(U343及びU87MG)、子宮頸部癌細胞株(C33A)、肝癌細胞株(Hep3B)、肺癌細胞株(A549)とマウス黒色腫(B16BL6)のような癌細胞株、人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90及びWI38)及びアデノウイルス初期発現遺伝子であるＥ１部位が宿主遺伝体内に内在されている２９３細胞株である。Ｂ１６ＢＬ６を除いた全ての細胞株は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)から購入し、Ｂ１６ＢＬ６マウス黒色腫細胞株は、大韓民国のヨンセ大学校(Yonsei University)のボクヨンソク教授チームから提供してもらった。
【００９１】
Ｂ１６ＢＬ６細胞株を除いた全ての細胞株は、１０％の牛胎児血清(Gibco BRL, Grand Island, NY)の含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)を培養液とし、抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)を添加して、５％ＣＯ2の存在下、３７℃恒温培養器で培養した。Ｂ１６ＢＬ６細胞株は、１０％の牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ １６４０(Gibco BRL)を使用して、５％ＣＯ2の存在下、３７℃恒温培養器で培養した。
【００９２】
２．実験動物
生体内抗腫瘍実験は、６〜８週齢の雄ヌードマウス(BALB/c-nu)とC57BL/6 マウスをCharles River Korea(Seoul, Korea)で購入して行った。動物飼育室の温度は、２２±２℃、湿度は、５５〜６０％に維持して、明暗循環が１２時間単位で調節されるようにし、放射線照射で滅菌した固形飼料(Orient, Seoul, Korea)と滅菌された給水を自由に摂取するようにした。
【００９３】
３．デコリンを発現するアデノウイルスの製作、生産及び力価算出
(1)複製不能アデノウイルスの製作
ＬａｃＺ遺伝子を標識遺伝子として発現し且つデコリン遺伝子を発現する、Ｅ１とＥ３遺伝子の消失された複製不能アデノウイルスを製作した。まずｖｍｄｌ３２４ＢｓｔＢ(Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-270(2000))ベクターの消失されたＥ１部位に標識遺伝子のＬａｃＺ遺伝子を挿入し、ｐｄｌ−ＬａｃＺウイルスベクターを製作した。このために、まず、ＬａｃＺを発現するｐｃＤＮＡ−ｈｙｇｒｏ−ＬａｃＺ(Invitrogen, Carlsbad, CA,米国) プラスミドからＣＭＶプロモーター、ＬａｃＺ、及びｐｏｌＡ部位をＨｉｎｄIIIとＮａｅＩとで処理し分離した後、これをＥ１アデノウイルスシャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ａに挿入し、ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ/ＣＭＶ−ＬａｃＺシャトルベクターを製作した。製作されたｐΔＥ１ｓｐ１Ａ/ＣＭＶ−ＬａｃＺシャトルベクターをＸｍｎＩ制限酵素で切断した後、ＢｓｔＢＩ制限酵素により一本鎖となったアデノウイルスｖｍｄｌ３２４ＢｓｔＢと共に大腸菌ＢＪ５１８３(S.B. Verca, University of Fribourgh, Switzerland)で同時形質転換させて、遺伝子相同組み換えを誘導し、ｐｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを製作した。
【００９４】
デコリン遺伝子を発現するアデノウイルスを製作するために、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にデコリン遺伝子(DCNG) (D.G. Seidler, University Hospital of Munster, ドイツ)を挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＧ(野生型cDNA形態のデコリン)を製造した。次に、前記野生型デコリンコアタンパク質の６番目ロイシンリッチリピート部位内にあるＥ１８０アミノ酸をＥ１８０Ｑで点突然変異させて、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを製造した後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＱ発現ベクターを製造した。そして、デコリンコアタンパク質のＥ１８０アミノ酸をＥ１８０Ｋで点突然変異させて、コラーゲンとの結合能が消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを製造し、これをｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＫ発現ベクターを製造した。次に、前記発現ベクターのそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａIで処理し、１ｋｂ ＤＮＡ切片を得た後、ｐＣＡ１４ベクター(Microbix, Ontario, Canada)に挿入させて、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＧ、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＱ及びｐＣＡ１４−ＤＣＮＫベクターを製作した。
【００９５】
製作されたｐＣＡ１４−ＤＣＮＧ、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＱ及びｐＣＡ１４−ＤＣＮＫベクターのそれぞれを制限酵素ＢｇｌIIで処理し、デコリンをＣＭＶプロモーターにより発現できるＣＭＡ−ＤＣＮ−ｐｏｌＡ発現カセットを切り出して、これをアデノウイルスＥ３シャトルベクターであるｐＳＰ７２ΔＥ３に挿入して、アデノウイルスＥ３シャトルベクター(pSP72ΔE3-DCNG, pSP72ΔE3-DCNQ及びpSP72ΔE3-DCNK)を製作した。
【００９６】
前記製作されたアデノウイルスＥ３シャトルベクターを制限酵素ＰｖｕＩまたはＸｍｎＩでそれぞれ処理し線形化した後、ＳｐｅＩを処理して線形化されたＰｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルストータルベクターと共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時形質転換させて、遺伝子相同組み換え(homologous recombination)を誘導し、ＬａｃＺ遺伝子とデコリンとを同時に発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫアデノウイルスをそれぞれ製作した(図１ａ)。
【００９７】
(2)腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの製作
デコリン遺伝子を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを製作した。具体的には、上記で製作したアデノウイルスＥ３シャトルベクターｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＧ、ｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＱ及びｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＫのそれぞれを制限酵素ＰｖｕＩまたはＸｍｎＩでそれぞれ処理して線形化させた後、制限酵素ＳｐｅＩを処理して線形化されたｐＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルストータルベクター(E1B 19kDa遺伝子とE1B 55kDa遺伝子とが共に消失された腫瘍特異的殺傷アデノウイルス)と共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時形質転換させて、アデノウイルスベクターＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫをそれぞれ製作した(図１ａ及び図１ｂ)。相同性組み換えされたアデノウイルスベクターを制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理し、相同性組み換え有無を確認した。相同性組み換えが確認されたプラスミドは、ＰａｃＩ制限酵素で切断した後、２９３細胞株に形質転換して、アデノウイルスを生産した(図１ａ及び図１ｂ)。
【００９８】
これらのアデノウイルスを２９３細胞株で増殖させた後、限界希釈法(limiting dilution)またはプラーク分析(plaque assay)を行って、ウイルスの力価を決定し(Hitt, M. et al., Construction and propagation of human adenovirus vectors. Cel biology: a laboratory handbook. New York: Academic Press Inc, 479-490(1994))、ＣｓＣｌ濃度勾配で濃縮して分離した。
【００９９】
４．デコリンの発現様相の調査
本発明で製作したアデノウイルスにより誘導されるデコリンの発現様相を調べるために、デコリン遺伝子が挿入された腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)及び対照群としてＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを、それぞれ３ＭＯＩで人体肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂに感染させた。感染４８時間後、細胞から培地を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルにあるタンパク質をＰＶＤＦメンブレインに電気−伝達させた後、デコリン(D.G. Seidler, University Hospital of Munster、ドイツ)及びβ−アクチン(Sigma, St. Louis, MO, USA)を特異的に認知する抗体を一次抗体で結合させて、ＨＲＰ(horse radish peroxidase)が結合された二次抗体(sc-2004; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)をさらに結合させた後、ＥＣＬ検出キット(sc-2004; Santa Cruz Biotech)を利用して、デコリンタンパク質の発現様相を究明した。
【０１００】
５．遺伝子伝達効率の比較検証
ＬａｃＺを発現する複製不能アデノウイルスの遺伝子伝達効率を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, IMR90及びWI38)とを２４−ウェルプレートに分株した後、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫウイルスを０．１〜１００ＭＯＩ(multiplicity of infection)でそれぞれ感染させた。ウイルス感染二日後、Ｘ−Ｇａｌ試薬(PBS containing 1mg/ml, 5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN)6及び2mM MgCl2)で３７℃で６時間反応し、Ｘ−Ｇａｌ染色することにより、デコリン遺伝子の発現によるＬａｃＺ遺伝子の伝達効率を確認した。
【０１０１】
６．アデノウイルスの腫瘍球内組織浸透性の検証
約６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、及びA549)をそれぞれ１×１０7個皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースでコーティングされた培養器で、５％牛胎児血清と抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシンとが含有されたＤＭＥＭを添加して培養した。培養液は、一週間に約１〜２回入れ替えて、１週間以上腫瘍球を培養した。アデノウイルスを感染させる前に、約２ｍｍ径の腫瘍球を０．７５％アガロースのコーティングされた４８ウェルプレートに移した後、５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ１５０μｌを添加して、１×１０6、１×１０7、及び１×１０8ＰＦＵ(plaque-forming unit)のアデノウイルスをそれぞれ添加した。アデノウイルスを添加した後三日頃に培地を除去して、腫瘍球を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。立体顕微鏡(Olympus optical Co., LTD, Tokyo, Japan)を利用して、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球の表面を観察した後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(Sakura Finetec, Torrance, CA)で凍結薄片した後、１０μｍ厚に切断して、ゼラチンのコーティングされたスライドガラス上に付着し光学顕微鏡で観察して、アデノウイルスの腫瘍球内への浸透程度を確認した。また、腫瘍球内のＸ−ｇａｌ染色された部分の比率は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム(Meta imaging series, Version 6.1, Universal imaging corporation TM, Downingtown, PA)を利用して算出した。
【０１０２】
７．アデノウイルスの生体内癌組織浸透性の検証
約６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に数種の人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A及びHep3B)を皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧをそれぞれ５×１０7〜５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に５回投与した。A549 xenograft modelの場合は、Ａ５４９細胞株を皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫをそれぞれ５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に５回投与した。ウイルス投与後３日頃に腫瘍を摘出して、４％パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に入れ、４℃で４〜８時間固定させた後、３０％スクロース溶液で１２時間程度脱水させた。脱水された組織をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、上述の腫瘍球内組織浸透性の検証実験と同様な方法により、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
【０１０３】
８．細胞病変効果(cytopathic effect, CPE)の分析
デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの癌細胞殺傷能を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90及びWI38)を４８−ウェルプレートに分株して、２４時間後、Ａｄ−ΔＥ１、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫなどのアデノウイルスを０．１〜１００ＭＯＩでそれぞれ処理した。一実験で処理された数種のウイルスの中でいずれか一つのウイルスが、最も低い力価で細胞をほとんどアポトーシスさせた時点で、全ての培地を除去し、０．５％クリスタルバイオレット( in 50%メタノール)で細胞を固定させて染色した後、残存した細胞を分析した。
【０１０４】
９．プラーク形成分析
デコリン発現によるプラークの大きさの変化を観察するために、６ウェルプレートに３×１０5個のＨｅｐ３Ｂ細胞株を分株して、翌日アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを１×１０-4ＰＦＵの力価で処理した。ウイルス感染後約４時間頃に、３７℃の２×ＤＭＥＭ(１０％牛胎児血清と抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシン含み)と４２℃の１．４％UltraPureTMアガロース(Invitrogen, Carsbad, CA)とを１：１で混合したアガロース−ＤＭＥＭ溶液を、感染された細胞株上に添加した後培養した。培養後、約４〜１６日頃に、プレートに形成されたプラークの大きさを確認し、アガロースオーバーレイ(overlay)上に１０％トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid)を１ｍｌ入れて３０分間放置した後、アガロースオーバーレイを除去し、０．５％クリスタルバイオレット(in 50%メタノール)で固定させて染色し、形成されたプラークの個数を算出した。
【０１０５】
１０．フローサイトメトリー分析による細胞アポトーシス観察
デコリンの発現により誘導される細胞アポトーシスを確認するために、人体腫瘍細胞株のＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９を２５Ｔ培養器にそれぞれ分株した後、２４時間頃にそれぞれのアデノウイルスを０．５〜５０ＭＯＩでそれぞれ感染させた。陽性対照群としては、細胞アポトーシスを誘導する物質であるカンプトテシン(camptothecin)−１１(CPT)を０．１〜１μｍ処理して、陰性対照群としては、ＰＢＳを処理した。４８時間、７２時間、そして９６時間後に感染された細胞を回収し、７０％エタノールで４℃で２４時間以上固定させた。固定が終わった後、ＰＩ(propidium iodide, 50μg/μl)とＲＮａｓｅ(ribonuclease)とが混合された溶液５００μｌを入れて、４℃で１５分間反応させた後、フローサイトメトリー分析(FACS analysis)を行った。
【０１０６】
また、デコリンの発現により誘導される初期細胞アポトーシスを検証するために、上記のような方法により、数種の人体腫瘍細胞株をそれぞれのアデノウイルスでそれぞれ感染させた後、細胞を回収し、ＡｐｏＡｌｅｒｔ Ｖ−ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)細胞アポトーシス検出キット(CLONTECH, Polo Alto, CA)を利用し、製造会社が提示した方法にしたがって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ/ＰＩ二重染色(double staining)して、フローサイトメトリー分析を行った。
【０１０７】
１１．ＴＵＮＥＬ分析
数種の人体腫瘍細胞株Ｕ３４３(5x104)、Ｕ８７ＭＧ(5x104)、Ｃ３３Ａ(5x105)、Ｈｅｐ３Ｂ(4x105)、及びＡ５４９(5x104)をそれぞれ２-ウェルチャンバースライドに分株して、アデノウイルスを０．２〜２０ＭＯＩで感染させた後、２４時間と４８時間頃に培地を除去して、ＡｐｏｐＴａｇキット(intergen, Purchase, NY)を用いて、製造会社が提示した方法にしたがってＴＵＮＥＬ(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling)分析を行った。発色有無を確認するために、ペロキシダーゼと結合されたアビジンを使用して、ＤＡＢ(3,3' diaminobenzine; Dako, Carpinteria, CA)と反応させた後、細胞が褐色に変わるのが肉眼で確認されたら、０．５％メチルグリーンで１０分間染色して、顕微鏡で観察した。顕微鏡上で四ヶ所以上の部位をランダムに選定して、全体細胞の中で染色された細胞の比率を算出した。
【０１０８】
１２．生体内抗腫瘍効果と生存率の検証
ヌードマウスに形成された人体癌腫塊の成長に、デコリンを発現するアデノウイルスが及ぼす影響を検証した。具体的には、生後６〜８週のヌードマウス(Charles River Japan Inc.)の腹壁に、皮下に１×１０7個の人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、Hep3B、及びA549)をそれぞれ１００μｌのＨＢＳＳ(Hanks' balanced salt solution, Gibco BRL)に浮遊して皮下注射した。腫瘍が約５０〜８０ｍｍ3程度に成長した時、１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ二日間隔で３回腫瘍に直接注射した後、腫瘍の成長と生存率を観察した。陰性対照群としては、ＰＢＳを注射した。腫瘍の容積は、バーニヤキャリパスを利用して腫瘍の長軸と短軸を測定した後、次の数学式で算出した。
腫瘍の容積＝(短軸ｍｍ)2×長軸ｍｍ×０．５２３
【０１０９】
１３．デコリンを発現する複製可能アデノウイルス投与による腫瘍組織の変化観察
ヌードマウスの腹壁に形成されたＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、またはＡ５４９腫瘍が約５０〜８０ｍｍ3程度に成長した時、１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出してパラフィンブロックを製作した。陰性対照群としては、ＰＢＳを注射した。製作されたパラフィンブロックを３μｍ厚のスライドに切断した後、これを、キシレン、１００％、９５％、８０％、及び７０％エタノール溶液に順に浸してパラフィンを除去(deparafinization)した後、ヘマトキシリンとエオシン(H & E)で染色した。生体内結締組織の構成成分であるコラーゲンの分布を観察するためには、３μｍ厚のパラフィンブロックスライドをボウイン(bouin)、ヘマトキシリン及びMasson'sトリクロム(biebrich's scarlet acid fuchsin)でそれぞれ染色して観察した。前記染色試薬は、ＤＡＫＯ ＡＲＫ(Dako, Carpinteria, CA)から購入した。また、同一部位のパラフィンブロックを利用して、アデノウイルスのヘキソン(hexon)部位を検出できる免疫組織化学分析(immunohistochemistry, IHC)を行った。上記のような方法によりスライドのパラフィンを除去した後、アデノウイルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体(MAB 8052 chemicon, Temecula, CA)を一次抗体として、そして、ヤギａｎｔｉ−ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ(Sata Cruz Biotechnology)を二次抗体として反応させて、ＤＡＢを添加し発色させて観察した。
【０１１０】
腫瘍内の細胞アポトーシスも、同一な部位のパラフィンブロックスライドを利用して観察した。ＡｐｏｐＴａｇキットを利用して、製造会社が提示した方法にしたがってＴＵＮＥＬ分析を行い、ペロキシダーゼと結合されたアビジンを使用してＤＡＢと反応させた後、細胞が褐色に変わるのが肉眼で確認されたら、０．５％メチルグリーンで１０分間染色し、顕微鏡で観察した。
【０１１１】
１４．ザイモグラフィ(Zymograpy)を利用したＭＭＰ発現様相究明
ＭＭＰ活性変化を観察するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)を７５Ｔ培養器に分株して、２４時間後にＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ１〜１００ＭＯＩで添加し、４８時間培養した。その後、牛胎児血清の含まれていないＤＭＥＭに入れ替えて、２４時間培養した後、培地を回収して濃縮し、濃縮された培地のタンパク質濃度は、タンパク質分析キット(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を利用して定量した後、同量のタンパク質をゼラチン−基質ゲルに電気泳動した。電気泳動した後、ゲルを３７℃で１８時間ゼラチン溶解(gelatinolysis)反応が起こるようにした後、クマシーブルーで染色して、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を観察した。また、各実験は、３回以上行って、QuntityOne2.1プログラム(BIO-Rad Laboratories, Hercules, CA)を利用して、バンド厚を比較検証した。
【０１１２】
１５．Spontaneous癌転移モデルを利用したデコリン発現による癌転移能(metastatic potential)変化の検証
デコリンの高発現による癌転移能(metastatic potential)の変化を調べるために、まず、Ｂ１６ＢＬ６細胞(2×105/マウス)を６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ/６マウス(Charles River Korea, Seoul, Korea)の後ろ右足パッドに皮下投与して、一次腫瘍(primary tumor)を形成した。一次腫瘍の大きさが約１００〜２００ｍｍ程度になった時、ＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧをそれぞれ二日間隔で腫瘍内に３回投与した。最後の投与後、５日頃にマウスの右足首以下を切断し一次腫瘍を除去した後、２０日頃にマウスを全部犠牲させて、肺に転移された腫塊の重量を測定した。
【０１１３】
１６．乳房癌患者から採取した腫瘍組織を利用した、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透性の検証
乳房癌患者から腫瘍組織及びその周辺の正常組織を採取した後、約１〜２ｍｍ径の切片にして、２４−ウェルプレート培養器で、５％牛胎児血清と１０μＭ/Ｌインシュリンと１μＭ/Ｌヒドロコルチゾン(hydrocortisone)を含むＩＭＤＭ(Isocove's Modified Dulbecco's Medium)を添加して、４時間培養した。乳房癌組織が入っている培養器に１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ添加し、５％ＣＯ2、３７℃恒温器で５日間培養した。培養後、培地を除去して、乳房癌組織を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を行い、立体顕微鏡(Olympus optical Co., LTD, Tokyo, Japan)を利用して、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球の表面を観察した。
【０１１４】
１７．一次ケロイド細胞における、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率の検証
ケロイド(Keloid)患者の組織から採取した一次ケロイド細胞株(2継代培養)を２４−ウェルプレートに分株して、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを０．１〜５０ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、５％ＣＯ2、３７℃恒温器で培養した。ウイルス感染後、４８時間頃にＸ−ｇａｌ染色を行って、アデノウイルスの遺伝子伝達効率を観察した。
【０１１５】
１８．ケロイド細胞球を利用したスフェロイド(spheroid)モデルを利用した組織浸透性の検証
ケロイド患者の組織から採取した継代培養２世代の一次ケロイド細胞(１×１０5個)を１５ｍｌファルコン(falcon)チューブに入れて、５００ｇで５分間遠心分離し、スフェロイド(spheroid)を作った後、これを２４−ウェルプレートに入れて３７℃培養器で５日間培養した。その後、ケロイドスフェロイドを０．７５％アガロースコーティングされた４８−ウェルプレートに移した後、１５０μｌのＤＭＥＭ培地(５％の牛胎児血清含有)を添加して、１×１０7ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス感染後３日頃に培地を除去して、ケロイドスフェロイドを固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を行い、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球を立体顕微鏡を利用して表面を観察した。
【０１１６】
１９．ケロイド患者から採取した組織を利用した組織浸透性の検証
ケロイド患者の組織から採取したケロイド組織を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースコーティングされた培養器で、５％牛胎児血清の含有されたＤＭＥＭと抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシンとを添加して培養した。培養液は、一週間に約１〜２回入れ替えて、１週間以上ケロイド組織を培養した。アデノウイルスを感染させる前に、約２ｍｍ程度の直径を有するケロイド組織を、０．７５％アガロースでコーティングされた４８−ウェルプレートに移した後、１５０μｌのＤＭＥＭ培地(５％の牛胎児血清)を添加して、１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス感染後３日頃に培地を除去して、ケロイド組織を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。Ｘ−ｇａｌ染色されたケロイド組織を、立体顕微鏡を利用して表面を観察した後、アデノウイルスのケロイド組織内浸透程度を確認するために、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、１０μｍ厚に切断して、ゼラチンのコーティングされたスライド上に付着し、光学顕微鏡で観察した。
【０１１７】
［実験結果］
１．デコリンを発現するアデノウイルスの製作及びデコリンの発現様相の究明
デコリン遺伝子の発現による組織内浸透力の変化を可視的に観察するために、標識遺伝子としてＬａｃＺ遺伝子を発現する複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫを製作した。また、アデノウイルスの組織内拡散及び浸透力を向上させるために、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを製作した(図１ａ及び１ｂ)。 複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺは、Ｅ１部位が欠失されて、欠失されたＥ１部位に挿入されたＣＭＶプロモーターの調節下でＬａｃＺ遺伝子を発現する；腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂは、正常的なＥ１Ａ遺伝子は含んでいるが、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ及びＥ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子が欠失されている。複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫと腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫは、ＣＭＶプロモーターの調節下でＥ３部位に挿入されたデコリン遺伝子を発現する。デコリン遺伝子の点突然変異ＤＣＮＫ及びＤＣＮＱは、タイプＩコラーゲンフィブリルとデコリンとの結合に非常に重要な作用をする部位を置換したものである。
【０１１８】
製作されたアデノウイルスにより発現されるデコリンの発現様相を検証するために、人体肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂに腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを３ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、細胞から培地を回収し、ウェスタンブロッテングを行った。その結果、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの陰性対照群であるＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスで感染された細胞では、デコリンの発現を観察することができなかった反面、 ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫアデノウイルスで感染された細胞の全てでは、デコリンの発現を観察することができた(図２)。
【０１１９】
２．遺伝子伝達効率の比較検証
デコリンを発現して、ＬａｃＺを発現する複製不能アデノウイルスの遺伝子伝達効率を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, IMR90及びWI38)にｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫウイルスを０．１〜１００ＭＯＩでそれぞれ感染させて、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色法を行って、ＬａｃＺの発現様相を比較観察した。その結果、本発明で使用された全ての癌細胞株において、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ感染によるＬａｃＺ発現程度が、対照群であるｄｌ−ＬａｃＺに比べ増加し、デコリンの発現により遺伝子伝達効率が大いに増加することを確認した。ところが、高力価の複製不能ウイルスを処理した場合は、細胞が死滅されることを観察することができて、特に、Ｃ３３Ａ細胞株を１０ＭＯＩ以上のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧウイルスで感染させた場合は、全ての細胞が完全に死滅され、デコリンが高発現する時に細胞を死滅することができることが分かった(図３ａ及び３ｂ)。しかしながら、コラーゲンフィブリルとデコリンとの結合に非常に重要な作用をする部位を置換したＤＣＮＫ及びＤＣＮＱ点突然変異がデコリン遺伝子を発現する場合は、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱの遺伝子伝達効率が、対照群ウイルスｄｌ−ＬａｃＺに比べ若干増加した反面、コラーゲンとの結合能が完全に消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫの遺伝子伝達効率は、ｄｌ−ＬａｃＺの遺伝子伝達効率とほぼ等しいことを観察した。こうような結果から、野生型デコリンの発現により、遺伝子伝達効率が増加することが分かった。これに比べ、正常細胞では、デコリンの発現によるＬａｃＺ遺伝子の伝達効率が大いに増加されなかったが、このような結果は、デコリンの癌細胞特異性を意味する。
【０１２０】
３．腫瘍球を利用したアデノウイルスの生体外癌組織浸透性の検証
アデノウイルスの腫瘍球内への遺伝子伝達効率と組織拡散及び浸透性を調べるために、数種の人体腫瘍細胞株をヌードマウスに皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3になった時、腫瘍を摘出した。摘出された腫瘍組織を１〜２ｍｍ程度の直径になるように細かく切って培養液に入れた後、１×１０6、１×１０7及び１×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ培地に添加して、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を施した。腫瘍球を光学顕微鏡で観察した結果、１×１０6ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱアデノウイルスを投与した場合に比べ、同力価のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した腫瘍球の表面にＸ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察することができ、１×１０7ＰＦＵ以上のアデノウイルスを培地に添加した場合は、全ての腫瘍球の表面全体がＸ−ｇａｌで濃く染色されていることを観察した(図４)。また、アデノウイルスの腫瘍球内への浸透程度をより綿密に観察するために、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球を凍結薄片して観察した。その結果、１×１０6、１×１０7及び１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱを投与した癌組織の場合、ＬａｃＺの発現程度が微弱であり、ウイルスが腫瘍球表面に留まっている反面、同力価のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した癌組織におけるＬａｃＺ発現度がｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱの場合より著しく高くて、アデノウイルスが腫瘍球表面に局限されず、腫瘍球の内側部位へウイルスが広がっていくことを確認することができた(図４)。また、本実施例でも、上述の遺伝子伝達効率の比較検証の実施例と同様に、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びコラーゲンとの結合能が完全に消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫの組織浸透力が、コラーゲンとの結合力が完全な野生型ＤＣＮＧを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧに比べ、大いに弱化されて、弱化された程度は、コラーゲンとの結合力と反比例することが分かった。このような実験結果を通じて、野生型デコリンを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透力が、腫瘍球内において、対照群ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱに比べ、大いに増加されたことが分かった。
【０１２１】
４．ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの生体内癌組織浸透性の検証
生体外腫瘍球を利用した実験結果を通じて確認したｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの増加された組織浸透力を、異種移植(xenograft)生体モデルを利用して検証してみた。ヌードマウスの腹壁に形成されたＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ及びＨｅｐ３Ｂ腫瘍に、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスのそれぞれを１×１０8〜５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に直接注射した後、三日頃に腫瘍を摘出して凍結薄片した後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。その結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した腫瘍組織の場合は、ＬａｃＺの発現程度が微弱であり、染色部位がウイルスの投与された組織付近に限定されている反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織のＬａｃＺ発現度は、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ著しく高く、Ｘ−ｇａｌで染色された部位がウイルスの投与された部位に局限されず、広い部位に広がっていることが確認できた(図５)。特に、Ｕ８７ＭＧ及びＣ３３Ａ異種移植の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した時、腫瘍組織全体でＬａｃＺが発現されて、濃いブルーに染色されたことを確認することができた。また、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱアデノウイルスを投与したＡ５４９腫瘍の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織の場合のＬａｃＺ発現程度及び発現された腫瘍部位が、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱを投与した場合に比べ、大いに増大したことを確認することができた。このような実験結果を通じて、生体内でも、腫瘍球を利用した実験と同様に、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの組織内拡散及び浸透性が、デコリンを発現しない対照群アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺに比べ、大いに増加したことが分かった。
【０１２２】
また、ＧＦＰ(green fluorescence protein)を発現するアデノウイルスであるｄｌ−ＧＦＰとｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれヌードマウスの腹壁に形成されたＣ３３Ａ腫瘍に５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に直接注射した後、三日頃に腫瘍を摘出して凍結薄片した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、ｄｌ−ＧＦＰを腫瘍内投与した腫瘍組織の場合は、ＧＦＰの発現がウイルス投与時に形成されるneedle trackの周辺に沿って制限的に発現された反面、ｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮアデノウイルスを腫瘍内投与した腫瘍組織の場合は、ウイルスが投与された部位に局限されず、広い部位に拡散されて強く発現されることを確認することができた(図１９ａ)。
【０１２３】
５．デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能の検証
先行の実験から既に確認されたコラーゲンとの結合能を有したデコリンの発現によるアデノウイルスの組織内拡散の増加により、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能が増加されるかどうかを調べるために、ＣＰＥ分析を行った。陰性対照群として複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ、実験群として腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫアデノウイルスを、それぞれ０．１〜１００ＭＯＩで人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、Hep3B、及びA549)と人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90, WI38)をそれぞれ感染させた後、細胞の殺傷程度を比較観察した。図６から分かるように、陰性対照群のｄｌ−ＬａｃＺで感染された種々の癌細胞では、ウイルスの増殖による細胞殺傷効果が観察されなかったが、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧで感染された場合は、デコリンを発現しない対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂに比べ、約１０〜２０倍程度高い癌細胞殺傷効果が観察された。即ち、Ｈｅｐ３ＢとＵ８７ＭＧ細胞株では、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスがＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ約２０倍程度高い癌細胞殺傷効果を誘導し、Ｕ３４３、Ｃ３３Ａ、及びＡ５４９細胞株では、約１０倍程度高い癌細胞殺傷効果を誘導した。このような実験結果から、デコリンの発現がアデノウイルスの複製能に否定的な影響を及ぼさないばかりか、却ってデコリンの発現により癌細胞特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能が増加されることが分かった。また、先行の実施例等と同様に、コラーゲンとの結合能が弱化または消失されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫの癌細胞殺傷能がＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ著しく低くて、その低い程度は、コラーゲンとの結合能と反比例することを確認することができた。しかしながら、正常細胞の場合は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスの細胞殺傷効果が対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂに比べ増加しなかった。したがって、このような結果から、ＤＣＮＧの発現による細胞殺傷能増大効果が癌細胞では誘導されたが、正常細胞では誘導されず、癌細胞特異的であることを確認することができた。
【０１２４】
６．デコリン発現によるプラーク(plaque)形成の比較
デコリンの発現が細胞殺傷と周辺細胞へのウイルス拡散に及ぼす影響を可視化するために、アデノウイルスの増殖と周辺細胞への拡散によるプラークの形成をアガロースの含有された固体培地で比較検証した。Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫアデノウイルスをそれぞれＨｅｐ３Ｂ細胞株に感染させて、プラーク形成の進行速度を観察した。図７ａ及び７ｂから分かるように、対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫ、またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱに感染された場合に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧで感染されたＨｅｐ３Ｂ細胞株でプラークの形成が速く進行されて、形成されたプラークの大きさも増加したことを観察することができた。即ち、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した場合は、ウイルス感染後１３〜１６日が経ってからプラークの形成を肉眼で確認することができたのに比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを感染させた場合は、ウイルス感染後４日頃から、プラークが形成されたことを確認することができた。また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫのプラーク形成速度がＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ大いに減少したが、その減少された程度は、コラーゲンとの結合能と反比例することを観察した。このような結果は、デコリンとの結合能を有したデコリンを発現するアデノウイルスの増加された細胞殺傷能と、隣接した細胞へのウイルス拡散によりプラークの形成が速く進行されて、また形成されたプラークの大きさが増加したことを意味する。
【０１２５】
７．デコリンを発現するアデノウイルスによる細胞アポトーシスの誘導
デコリンの発現様相及びこれによる遺伝子伝達効率の変化を調べるために進行された実験(実験結果2)で、高力価の複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧで細胞を感染させた場合、細胞が死滅されて細胞培養プレートの底から離れていくことが観察されたため、デコリンにより細胞殺傷が誘導されるかどうかをより綿密に調べた。これのために、まず、細胞アポトーシスが誘導されるとＤＮＡが無作為的に切片化されて現れるｓｕｂＧ1細胞群の増加率を、ＰＩ染色後フローサイトメトリー分析を行って測定した。種々の人体腫瘍細胞株を腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫでそれぞれ感染させて、４８〜９６時間後に細胞を回収してｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した。細胞アポトーシスを誘導する陽性対照群としては、細胞アポトーシス誘導化学物質であるＣＰＴを使用した。対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂにより感染されたＡ５４９細胞の場合、ｓｕｂＧ1細胞群が約３．１１％であるのに対し、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより感染された場合は、ｓｕｂＧ1細胞群が約２６．５２％に大きく増加した。このようなＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルス感染によるｓｕｂＧ1細胞群の増加は、他の種類の細胞株(U343、U87MG、C33A、及びHep3B)でも観察された(図８ａ、表１)。また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染によるｓｕｂＧ1細胞群の増加は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ減少したが、その減少程度は、コラーゲンとの結合能が低いほどさらに大きいことを、先行の実施例等の結果と同様に、確認することができた。
【０１２６】
そして、複製不能アデノウイルスであるｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧでそれぞれ感染させて４８〜９６時間後に細胞を回収してｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した。腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによるｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した上記結果と同様に、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを感染させた場合より、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合にｓｕｂＧ1細胞群が大きく増加することを観察することができた(図８ｂ、表２)。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
また、細胞アポトーシスに及ぼすデコリンの影響をさらに綿密に観察するために、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによる細胞アポトーシスの進行程度をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで二重染色して確認した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣは、細胞アポトーシス初期に細胞膜外に流出されてきたフォスファチジルセリン(phosphatidylserine: PS)を検出することができる反面、ＰＩは、細胞死後期に細胞膜の破壊によりＰＩが細胞内に入って、核内にあるクロマチン(chromatin)と結合することにより、細胞壊死(necrosis)の特徴を確認することができる。したがって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ-/ＰＩ-は、健康な細胞を意味して、 Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-は、初期細胞アポトーシスが起こった細胞、そしてＰＩ+細胞は、細胞壊死が起こった細胞を意味する。細胞アポトーシスを誘導する陽性対照群として利用されたＣＰＴを処理したＵ３４３細胞株の場合、約３２．１５％(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-)の細胞が細胞アポトーシスに進行されて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより感染された場合は、それぞれ２４．１５％及び４４．８５％の細胞で細胞アポトーシスが誘導されて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスによる細胞アポトーシス頻度がＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ大きく増加したことを観察した(図９ａ)。その他にも、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９細胞株でも、対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ、デコリンを発現するアデノウイルスにより遥かに高い頻度で細胞アポトーシスが誘導されることを確認することができた。また、細胞死を総括的に測定できる細胞アポトーシス及び細胞壊死頻度を全部合わせた場合(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-＋ＰＩ+)でも、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスにより誘導された細胞死頻度がＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ著しく増加した。以上のような結果から、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの対照群Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスにより感染された場合より、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスに感染された場合に細胞アポトーシスが著しく高い頻度で進行され、結果的に細胞死が増加することを確認することができた。そして、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染により誘導される細胞アポトーシス頻度が、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより誘導される細胞アポトーシス頻度に比べ減少したが、その減少程度は、コラーゲンとの結合能が低いほどさらに大きいことを確認することができた。
【０１３０】
また、デコリンを発現する複製不能アデノウイルスによる細胞アポトーシス誘導を調べるために、Ｕ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ５４９細胞に、ＰＢＳ、ＣＰＴ、ｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを処理した後、細胞アポトーシス進行程度をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで二重染色して確認した。図９ｂから分かるように、ＣＰＴを処理したＵ３４３細胞株の場合、約１９．４１％(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-)の細胞が初期細胞アポトーシスに進行されて、ｄｌ−ＬａｃＺにより感染された場合は、３．９３％の細胞だけが細胞アポトーシスに進行され、ＰＢＳのみを処理した陰性対照群と同様に非常に低い比率の細胞のみが細胞アポトーシスに進行された。その反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧにより感染されたＵ３４３細胞株の場合は、約１３．１８％の細胞が細胞アポトーシスに進行され、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ複製不能アデノウイルスによる細胞アポトーシス頻度が、対照群複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺに比べ、大きく増加したことを観察した。この他にも、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ及びＡ５４９細胞株においても、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスに比べ、デコリンを発現する複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧにより遥かに高い頻度で細胞アポトーシスが誘導されることを確認することができた。このような結果がら、コラーゲンとの結合能を有したデコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスだけではなく、複製不能アデノウイルスにより感染された場合も、細胞アポトーシス誘導が著しく増加され得ることを確認することができた。
【０１３１】
初期細胞内アポトーシスの特徴であるＤＮＡ切片化を確認できるまた他の分析方法のＴＵＮＥＬ分析も行った。図１０ａと表３から分かるように、陽性対照群として使用されたＣＰＴを処理した全ての細胞株の場合は、ほとんどの細胞が濃い褐色に染色され、細胞アポトーシスが活発に進行されていることを確認した。Ｕ３４３細胞株をＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスで感染させた場合、約３２．５±１２．５％の細胞が褐色に淡く染色された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合は、約６９．７±５．４０％の細胞が濃い褐色に染色され、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスが遥かに高い頻度で細胞アポトーシスを誘導することが分かった(表３)。このようなデコリン発現による細胞アポトーシス頻度の増加現象は、他の細胞株(U87MG, C33A, Hep3B及びA549)でもほぼ等しい傾向で観察されて、また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染により誘導されるＤＮＡ切片化頻度が、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより誘導されるＤＮＡ切片化頻度に比べ大いに減少し、その減少程度がコラーゲンとの結合能に反比例することを観察した。本実施例で確認されたコラーゲンとの結合能に比例したデコリンの作用は、先行の実施例等において、全て同様な結果として検証されたため、以後進行された実施例では、コラーゲンとの結合能の最も高い野生型デコリンを発現するアデノウイルスのみを利用して進行した。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
また、複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧでそれぞれ感染させて、４８〜９６時間後に細胞を回収し、ＴＵＮＥＬ分析を行った。腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによる細胞アポトーシス進行程度を観察した上記の結果と同様に、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを感染させた場合より、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合、遥かに高い頻度で細胞アポトーシスを誘導することを観察することができた(図１０ｂ及び表３)。
【０１３４】
８．デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果の検証
野性型デコリンを発現するＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、種々の人体腫瘍細胞株をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍に１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスのそれぞれを、陰性対照群のＰＢＳと共に二日間隔で３回腫瘍内投与した後、腫瘍の成長を観察した。人体脳腫瘍Ｕ８７ＭＧの場合、ＰＢＳを投与された時は、ウイルス投与後１９日頃に腫瘍の大きさが約１０８９．２２ｍｍ3で、腫瘍が急激に成長した反面、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１ＢまたはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与された時は、それぞれ１１５．７０ｍｍ3及び１１．８７ｍｍ3で、腫瘍の成長が顕著に遅延されることを観察することができた(図１１ａ)。即ち、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与された腫瘍の方が、ＰＢＳを投与された場合に比べ、明らかな抗腫瘍効果を示した。
【０１３５】
また、ウイルスの投与後２５日頃には、ＰＢＳを投与した９匹のマウスが全部死んでしまい、それ以上腫瘍の成長を測定することができなかった反面(図１１ｂ)、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した後３３日頃には、腫瘍の大きさがそれぞれ３９９．６８ｍｍ3及び２３．３８ｍｍ3であって、デコリンを発現するアデノウイルスによる抗腫瘍効果が、対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ、さらに優れており且つさらに長く持続されることを確認した。特に、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した場合、ウイルス投与後１９日頃に７匹のマウスの中で４匹から、そして４１日頃には６匹から、腫瘍が完全になくなって、６０日が経っても腫瘍の再成長は観察されなかった(図１１ｂ)。このようなＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧの卓越な抗腫瘍効果が他の人体腫瘍モデルでも適用できるかを調べるために、Ｕ３４３、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９異種移植(xenograft)で、前記の方法と同一な方法により抗腫瘍効果を検証した。図１１ａから分かるように、陰性対照群のＰＢＳを投与した群に比べ、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与した群で明らかな抗腫瘍効果が観察されて、デコリンを発現するＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与された場合、腫瘍の大きさが、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与された場合に比べ著しく減少し、デコリン発現による明らかな抗腫瘍効果を観察することができた。
【０１３６】
また、デコリンを発現するアデノウイルスを腫瘍に投与時、マウスの生存率を比較した。Ｃ３３Ａ異種移植モデルにおいてＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与時(C33Aに対しては1×108 PFU投与、U343, U87MG, Hep3B及びA549に対しては5×108 PFU投与)、８０日経過後、１００％のマウスが生存した反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与した場合、同じ期間にただ５０％のマウスのみが生存した(マウスの死；腫瘍大きさ＞C33Aに対して2000mm3)ことが分かった(図１１ｂ)。Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧの生存率増加は、他のＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｈｅｐ３Ｂ及びＡ５４９異種移植モデルでも同様な結果を示した。このような結果を通じて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧウイルスが、生体モデルにおいて、優れた抗腫瘍効果及び生存率増大効果を示すことが分かった。
【０１３７】
９．デコリンを発現する複製可能アデノウイルス投与による腫瘍の変化観察
数種の癌細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)をヌードマウスの腹壁皮下に接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを陰性対照群のＰＢＳと共に３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出してヘマトキシリンとエオシンでＨ＆Ｅ染色し、組織の状態を検証した。図１２ａ〜１２ｅから分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した腫瘍の場合は、腫塊の中心部位から自然に発生する細胞壊死と、ウイルスが投与された腫塊の縁の局所的部位でのみ細胞壊死が進行された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した腫瘍の場合は、腫塊の中心部位だけではなく、ウイルスが投与された腫瘍の縁まで、さらに広い部位で細胞壊死が非常に活発に進行されることを確認した。また、腫瘍組織内における癌細胞特異的殺傷アデノウイルスの複製様相を検証するために、アデノウイルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体を利用して、ＩＨＣを行った。図１２ａ〜１２ｅから分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与した場合に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍の場合に腫瘍のさらに広い部位からアデノウイルスを検出することができて、細胞アポトーシスを確認できるＴＵＮＥＬ分析を行った場合も、アデノウイルスが検出された部位と同じ部位で細胞アポトーシスが活発に進行されることを確認することができた。以上の結果をまとめてみると、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスが投与された腫塊部位でウイルスの複製が活発に起こって且つさらに広い部位に広がっていくことができ、その結果、細胞アポトーシス及び細胞壊死が非常に活発に且つ広範囲で誘導されることが分かった。
【０１３８】
１０．マッソン・トリクローム(Masson's trichrome)染色を利用した腫瘍内コラーゲン分布の検証
人体脳癌細胞株Ｕ３４３をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出しマッソン・トリクロームで染色して、青色に染色される細胞外基質の主成分のコラーゲンの分布を観察した。その結果、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与したＵ３４３腫瘍の場合は、腫瘍内部において、青色染色が腫瘍細胞の間で多く観察された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した場合は、腫瘍内部では青色がほとんど観察されず、腫瘍の周囲を囲んでいる正常組織でのみコラーゲンカプセルのような形態を観察することができた(図１３のＡパネル)。このような結果から、癌細胞特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧによるデコリンの発現が癌細胞特異的に誘導されて、癌組織内部のコラーゲンの発現のみを阻害し、周辺の正常組織のコラーゲンの発現様相には、影響を及ぼさないことが分かった。
【０１３９】
そして、人体脳癌細胞株のＵ８７ＭＧをヌードマウスに接種した後、形成されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを腫瘍内注射した後、マッソン・トリクロームで染色した場合は、対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した場合と同様に、コラーゲンの発現が非常に低くて、青色に染色された部位がほとんど観察されなかった(図１３のＢパネル)。このような結果から、腫瘍組織内のコラーゲン発現が低い場合は、デコリンの高発現により、コラーゲンの発現様相が変化されないことが分かった。
【０１４０】
１１．ザイモグラフィ(Zymograpy)を利用したＭＭＰ発現様相の究明
デコリンの発現による細胞外基質の減少が、ＭＭＰ発現により誘導されるものであるかを確認するために、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性をザイモグラフィにより検証した(図１４)。数種の細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)を様々な力価のアデノウイルス(Ad-ΔE1B及びAd-ΔE1B-DCNG)で感染させて、培地を回収し、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を観察した結果、ＰＢＳ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ対照群に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスにより感染された場合に、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性が大きく増加した。このようなＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性増加現象は、実験に使用された５種類の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)でほぼ等しく観察された。前記結果から、デコリンの発現により、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性が増加されたことが分かった。
【０１４１】
１２．Spontaneous癌転移モデルを利用した、デコリン発現による癌転移能(metastatic potential)の変化検証
デコリンは、細胞外基質の構成成分と反応し、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−２などの発現を促進して細胞外基質を分解すると知られており、ＭＭＰ−２の場合は、本研究の実験結果１１でも確認された。したがって、デコリンの高発現による癌転移能(metastatic potential)の変化を、spontaneous癌転移モデルを利用して調べてみた。まず、Ｂ１６ＢＬ６細胞をＣ５７ＢＬ/６マウスの右後ろ足の裏に皮下投与した後、腫瘍の大きさが約１００〜２００ｍｍ程度に成長した時、ＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを二日間隔で３回腫瘍内投与した。最後の投与後５日頃にマウスの右足首以下を切断して、一次腫瘍を除去した後、２０日頃にマウスを全部犠牲させて、肺に転移された腫塊の重量を測定した。図１５から分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与されたマウスの肺に転移された腫塊の平均重量は、それぞれ２００±１４０ｍｇ及び１３０±１６０ｍｇであって、ＰＢＳを投与された対照群マウスの肺に転移された腫塊の平均重量の２５０±１４０ｍｇに比べ、著しく低いことが確認できた。さらに、ＰＢＳを投与された６匹のマウスの全部から肺転移が酷く起こったのに対し、Ａｄ−ΔＥ１ＢまたはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与された６匹のマウスの場合は、それぞれ１匹と２匹のマウスで癌転移が完全に抑制されたことを観察した。このような結果から、デコリンの発現により、対照群ウイルスに比べ、癌転移がさらに活発に抑制されることが確認できた。
【０１４２】
１３．乳房癌患者から採取した腫瘍組織を利用した、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透性の検証
先行の各種実験結果から確認された、デコリンを発現するアデノウイルスの向上された遺伝子伝達効率及び組織浸透性が、一次人体腫瘍組織でも確認できるかどうかを調べるために、実際の乳房癌患者から採取した癌組織及びその周辺の正常組織を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースでコーティングされた培養器で培養した後、１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ添加した。ウイルス添加後、約５日後にＸ−ｇａｌ染色を行った結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＬａｃＺを感染させた場合に比べ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを感染させた場合の癌組織表面にＸ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察することができた(図１６)。これとは対照的に、正常組織の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを添加した全ての一次正常組織において、Ｘ−ｇａｌ染色がほとんど起こらなかった。
【０１４３】
また、ＧＦＰを発現するアデノウイルスのｄｌ−ＧＦＰとｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ乳房癌患者から摘出した乳房癌組織球(<1cm3)を、１２−ウェルプレートに腫瘍組織球を入れて、インシュリン(10μmol)とヒドロコルチゾン(1μmol)とを含有した５％ＩＭＤＭ培地を添加した後、１×１０7ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス添加後、５日頃に蛍光顕微鏡で腫瘍球を観察した結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＧＦＰを培地内に投与した場合は、腫瘍球の表面でのみ制限的にＧＦＰの発現が観察された反面、デコリンを発現するアデノウイルスのｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮが投与された培地で培養された腫瘍球の場合は、腫瘍球の大部分の組織からＧＦＰが強く発現されることを観察することができた(図１９ｂ)。
【０１４４】
１４．一次ケロイド細胞における、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率の検証
ケロイドは、細胞外基質の過度なる形成により現れる疾患であって、デコリンの細胞外基質分解能を利用してケロイド疾患を治療できるかどうかを調べるために、まず、ケロイド患者の組織から採取した一次ケロイド細胞株に、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを０．１〜５０ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、二日後にＸ−ｇａｌ染色を施して観察した結果、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ感染によるＬａｃＺ発現程度が、対照群のｄｌ−ＬａｃＺに比べ増加し、デコリンの発現により、ケロイド細胞への遺伝子伝達効率が大きく増加することを確認した(図１７)。
【０１４５】
１５．ケロイドスフェロイドモデルを利用した遺伝子伝達効率の検証
デコリン発現によるアデノウイルスのケロイド組織における遺伝子伝達の増加を調べるために、ケロイド患者の組織から採取した継代培養２世代の一次ケロイド細胞を利用して製作されたケロイドスフェロイドを、１×１０7ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスでそれぞれ感染させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施して組織表面を光学顕微鏡で観察した。その結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ、野生型デコリンを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与したケロイドスフェロイドの表面にＸ−ｇａｌが非常に濃く染色されることを観察した(図１８のパネルＡ)。
【０１４６】
１６．ケロイド患者から採取した組織を利用した組織浸透性の検証
ケロイド細胞から構成されたケロイドスフェロイドを利用した先行の実施例を通じて確認したｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの増加された遺伝子伝達効率が、実際のケロイド患者から採取したケロイド組織でも現れるのかを調べるために、ケロイド患者の組織から採取したケロイド組織を１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスでそれぞれ感染させて、Ｘ−ｇａｌ染色を施した後、まず、ケロイド組織の表面を観察した。その結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与したケロイド組織の場合は、ＬａｃＺの発現程度が非常に微弱である反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与したケロイド組織の表面は、Ｘ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察した(図１８のパネルＢ)。また、アデノウイルスのケロイド組織内浸透程度を確認するために、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、光学顕微鏡で観察した結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与したケロイド組織の場合は、表面と同様に、ケロイド組織の内部もほとんど染色されなかった反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織のＬａｃＺ発現度は、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ著しく高く、Ｘ−ｇａｌで染色された部位が、ウイルスの投与された部位に局限されず、広い部位に広がっていることを確認することができた(図１８のパネルＢ)。このような結果から、細胞外基質の分解を誘導できるデコリンを発現するアデノウイルスを利用する場合、ケロイド組織における遺伝子伝達効率が著しく増大されるだけではなく、細胞外基質の分解により、ケロイド疾患治療剤として利用することができることを確認した。
【０１４７】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１ａ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ, dl-LacZ-DCNG, dl-LacZ-DCNQ及びdl-LacZ-DCNK)と腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)のベクターマップである。ITRは、inverted terminal repeat配列、Ψは、パッケージシグナル配列、LacZは、lac Z配列、IXは蛋白質IX遺伝子、CMVは、CMVプロモーター、そして、Pol Aは、ポリA配列を示す。DCNGは、野生型デコリン遺伝子、DCNQは、野生型デコリンコア蛋白質の６番目ロイシンリッチリピート部位内にあるE180アミノ酸をE180Qで点突然変異させた変異遺伝子、そしてDCNKは、野生型デコリンコア蛋白質のE180アミノ酸をE180Kで点突然変異させた変異遺伝子を示す。
【図１ｂ】本発明の具体的な一実施例に該当する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGのより具体的なベクターマップである。
【図２】本発明のデコリン発現腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた腫瘍細胞株Hep3Bがデコリンを発現することを確認したウェスタンブロット分析結果である。
【図３ａ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(図3a)及び人体正常細胞株(図3b)におけるデコリン遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図３ｂ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(図3a)及び人体正常細胞株(図3b)におけるデコリン遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図４】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を生体外(in vitro)感染させた腫瘍球(U343, U87MG, C33A及びA549)へのウイルス浸透性を検証したX-gal染色写真である。左側パネルは、X-gal染色された腫瘍球の光学顕微鏡写真(倍率:38×)であり、右側パネルは、X-gal染色された腫瘍球の凍結薄片光学顕微鏡写真(倍率: 40×)である。
【図５】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)を生体内(in vivo)感染させた腫瘍球(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)へのウイルス浸透性を検証したLacZ染色写真である。
【図６】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)及び人体正常細胞株(CBHEL, IMR90, MRC5及びW138)における癌細胞特異的殺傷能を検証した細胞病変効果(cytopathic effect, CPE)分析結果である。
【図７ａ】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株HeP3Bにおけるプラーク形成程度を示したプレート写真(図7a)及びこれのプラーク数を概数してプラーク形成速度を示したグラフ(図7b)である。
【図７ｂ】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株HeP3Bにおけるプラーク形成程度を示したプレート写真(図7a)及びこれのプラーク数を概数してプラーク形成速度を示したグラフ(図7b)である。
【図８ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したPI染色後のフローサイトメトリー分析結果である。図８ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図８ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、フローサイトメトリー分析結果にある数字は、subG1細胞群の比率を示す。
【図８ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したPI染色後のフローサイトメトリー分析結果である。図８ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図８ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、フローサイトメトリー分析結果にある数字は、subG1細胞群の比率を示す。
【図９ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシスと細胞壊死の程度を同時に確認したAnnexin V-PI染色及びフローサイトメトリー分析結果である。図９ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図９ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、各フローサイトメトリー分析結果において、Annexin V+/PI-の比率は、太いイタリック体で右側下に表示した。横座標は、Annexin V数値であり、縦座標は、PI数値である。
【図９ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシスと細胞壊死の程度を同時に確認したAnnexin V-PI染色及びフローサイトメトリー分析結果である。図９ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図９ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、各フローサイトメトリー分析結果において、Annexin V+/PI-の比率は、太いイタリック体で右側下に表示した。横座標は、Annexin V数値であり、縦座標は、PI数値である。
【図１０ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したTUNEL分析結果である。１０ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図１０ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、DNA鎖の分節化は、褐色で染色されている。
【図１０ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したTUNEL分析結果である。１０ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図１０ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、DNA鎖の分節化は、褐色で染色されている。
【図１１ａ】腫瘍(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)が誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによる腫瘍の大きさ変化を示したグラフ(図11a)及びマウスの生存率を示したグラフ(図11b)である。
【図１１ｂ】腫瘍(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)が誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによる腫瘍の大きさ変化を示したグラフ(図11a)及びマウスの生存率を示したグラフ(図11b)である。
【図１２ａ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるU343腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｂ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるU87MG腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｃ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるC33A腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｄ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるHep3B腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｅ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるA549腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１３】腫瘍U343(パネルA)及びU87MG(パネルB)が誘導されたマウスに感染させた腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG)による腫瘍の細胞外組織にあるコラーゲン分布を確認したMasson's trichrome染色結果である。
【図１４】人体腫瘍細胞U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549に感染させた腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1BまたはAd-ΔE1B-DCNGによるMMP発現様相を確認したゼラチンザイモグラフィ電気泳動結果を数値化したグラフである。
【図１５】B16BL6 Spontaneous癌転移モデルを利用して、癌転移に対するデコリン発現の影響を検証した結果(上パネル)及び肺転移された腫塊の重量を数値化したグラフ(下パネル)である。
【図１６】乳房癌患者から採取した腫瘍組織及びその周辺の正常組織にデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)を投与した後の遺伝子伝達効率及び組織浸透性をX-gal染色で確認した写真である。
【図１７】デコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)を処理した一次ケロイド細胞における遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図１８】ケロイドスフェロイド(spheroid)モデルを利用して、デコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)の遺伝子伝達効率を検証したケロイド細胞球のX-gal染色写真(Aパネル)及びケロイド組織を利用してデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)の組織浸透性を検証したX-gal染色写真(Bパネル)である。
【図１９ａ】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-GFPとdl-GFP-DCNG)を生体内(in vivo)感染させた腫瘍球(C33A)内へのウイルス浸透性を検証した蛍光顕微鏡写真である(x10)。
【図１９ｂ】乳房癌患者から採取した腫瘍組織にdl-GFPまたはdl-GFP-DCNGを投与した後の遺伝子伝達効率及び組織浸透性を確認した蛍光顕微鏡写真である(x 40)。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子伝達システム及び組み換えアデノウイルスに関するものであって、より詳細には、デコリン遺伝子を含む遺伝子伝達システム、組み換えアデノウイルス、前記組み換えアデノウイルスを含む抗腫瘍薬剤学的組成物、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物、及び細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患の治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス(Adenovirus, Ad)を利用した初期の遺伝子治療は、アデノウイルスの複製に必須的なＥ１遺伝子の代わりに、治療用遺伝子を挿入して製造した複製不能アデノウイルスを主に利用したが、これらのアデノウイルスは、感染された細胞とその周辺でのみ制限的に抗腫瘍効果を誘導して、臨床的な実用性の面で多い制約があった(Vile RG, Russell SJ, Lemoine NR., Gene Ther, 2000, 7(1):2-8)。これを克服するための一つの方案として、癌細胞でのみ選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＯＮＹＸ−０１５(Ad変異体、dl1520)をMcCormick研究陣が最初に開発した(Bischoff JR, et al., Science, 1996, 274(5286):373-376; Heise C, et al., Nat Med, 1997, 3(6):639-645)。ＯＮＹＸ−０１５は、Ｅ１Ｂ ５５ ｋＤａ遺伝子が部分的に欠損されたアデノウイルスであって、ｐ５３が機能的に非活性化された細胞でのみ増殖が可能である。即ち、正常細胞では、ＯＮＹＸ−０１５アデノウイルスがｐ５３を非活性化することができないため、ウイルスの増殖が抑えられ、細胞殺傷を誘導することができない反面、ｐ５３の機能が抑えられている癌細胞では、ウイルスの増殖が活発に起こり、究極的に癌細胞だけを選択的に殺傷するようになる(Chang F, Syrjanen S, Syrjanen K., J Clin Oncol, 1995, 13(4):1009-1022)。
【０００３】
最近、頭頸部癌を対象に進行された臨床II/III期の試験結果、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの優れた治療効果が報告された(Kirn D, Hermiston T, McCormick F., Nat Med, 1998, 4(12):1341-1342; Nemunaitis J, et al., Cancer Res, 2000, 60(22):6359-6366; Ganly I, et al., Clin Cancer Res, 2000, 6(3): 798-806)。しかしながら、前記アデノウイルスの投与により、頭頸部腫瘍の成長が部分的に抑制されたものの、完全に消滅されたわけではなく、一定期間が過ぎた後には、腫瘍の成長がさらに速やかに進行された。このような結果は、局所的に腫瘍内投与されたアデノウイルスが一部周辺にのみ拡散されて、腫瘍組織全体に広がらなかったため、抗腫瘍効果が制限的に誘導され、ウイルスに感染されなかった腫瘍細胞が再び速やかに成長したからであると考えられる。最近の研究報告によると、ヌードマウスに形成された人体腫瘍内に投与されたアデノウイルスは、ウイルスの投与後１００日が経った場合も、腫瘍内で複製が起こり、腫瘍組織から生きているウイルスが抽出されたが、腫瘍の成長を完全に抑制することはできなかった。以後の研究結果によると、このような低い抗腫瘍効果は、腫瘍組織内に存在する結締組織(connective tissue)と細胞外基質(extracellular matrix)により、ウイルスの拡散が制限的に起こったからであると明かされた。また、アデノウイルスを腫瘍内に投与すると、初期には、生来の(innate)免疫反応により、アデノウイルスが血流から速やかに除去されたが、ウイルス投与後約４８週には、アデノウイルスが再び血流から検出されて、これは、腫瘍内で複製されたアデノウイルスが血流に放出されてきたものと推論された。このような一連の結果をまとめてみると、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスは、癌細胞内で活発に複製が起こるが、癌細胞間に存在する細胞外基質及び結締組織などのような物理的障壁により、周辺癌細胞に活発に広がることができず、これらのアデノウイルスによる抗腫瘍効果が制限的に誘導されると考えられる。
【０００４】
したがって、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを癌治療に効率的に利用するためには、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスが強力な細胞殺傷能を誘導することができなければならなく、投与されたアデノウイルスが腫瘍組織全体によく拡散されて、周辺癌細胞を効率的に感染できなければならない。
【０００５】
最近、ウイルス性遺伝子伝達体の制限された組織内拡散問題と、これによる低い遺伝子伝達効率を克服するために、いくつかの方案が研究されている。N. Kuriyama研究陣は、コラーゲンとその他の細胞外基質を分解できるコラゲナーゼ/ディスパーゼ(collagenase/dispase)、またはトリプシンのような蛋白質分解酵素(protease)を、アデノウイルスを投与する前に処理することにより、アデノウイルスの遺伝子伝達効率を大きく向上した(Kuriyama N, et al., Hum Gene Ther, 2000, 11(16):2219-2230)。また、同じ概念で、L. Maillard研究陣は、動脈の主要構成成分であるエラスチンを分解できるエラスターゼをラビットのお尻(iliac)動脈に処理することにより、アデノウイルスによる遺伝子伝達効率を約２倍ほど向上させることができた(Maillard, L., et al., Gene Ther, 1998, 5(8):1023-1030)。その他にも、細胞外基質を分解できるヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)を利用して、ラットの筋肉におけるアデノ随伴ウイルスによる遺伝子伝達効率を約２〜３倍程度向上できることが報告された(Favre D, et al., Gene Ther, 2000, 7(16):1417-1420)。このような一連の研究を通じて、細胞外基質の構成成分の合成を阻害するかまたが分解を促進して、細胞外基質の構成成分を減少させると、組織内におけるウイルス拡散を増大することができて、その結果、遺伝子伝達効率を向上させることができると期待される。また、皮膚の結合組織の異常増殖により引き起こされるケロイド(keloid)のような線維症疾患においても、細胞外基質の合成を阻害することにより、線維症疾患の生成を抑制し、治療効果を誘導することができると考えられる。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用は、括弧内に表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、遺伝子伝達システムの伝達効率、特に、組織内における遺伝子伝達システムの浸透性(あるいは拡散性)を増加させるために鋭意研究した結果、デコリンが遺伝子伝達効率を大きく改善でき、前記デコリンを発現する組み換えアデノウイルスが組織浸透性及び抗腫瘍効果に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、デコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含む新規遺伝子伝達システムを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、伝達効率の改善された遺伝子伝達方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能が改善された組み換えアデノウイルスを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、上述の組み換えアデノウイルスを含む薬剤学的抗腫瘍組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、上述の薬剤学的抗腫瘍組成物を利用した癌の治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患の治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一様態によると、本発明は、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列及びデコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、前記目的ヌクレオチド配列の細胞内運搬効率を増加させる作用をすることを特徴とする遺伝子伝達システムを提供する。
【００１７】
本発明者らは、遺伝子伝達システムの伝達効率、特に、組織内における遺伝子伝達システムの浸透性(あるいは、拡散性)を増加させるために鋭意研究した。このような研究の方向は、細胞外基質(ECM)の構成成分の合成を阻害するかまたは分解を促進し、細胞外基質の構成成分を減少させれば、組織内における遺伝子伝達システムの拡散を増大させることができるという仮説に基づいたものである。結局、本発明者らは、デコリンが遺伝子伝達効率を大きく改善できるという驚くべき事実を見出した。
【００１８】
本明細書において、用語“デコリン”は、実施例に示されたデコリンだけではなく、本発明で目標とする遺伝子伝達効率を増加させることのできるデコリンのあらゆる擬似体(homologues)を含む。
【００１９】
本発明において、遺伝子伝達効率を改善するデコリン(decorin：DCN)は、SLRP(small leucine rich proteoglycan)部類に属するタンパク質であって、10〜12個のロイシンリッチリピート(leucine rich repeat)から構成されており、コア部位は、アーチ(arch)状になっており、細胞外基質に存在する数種の成長因子またはデコリン受容体と結合が容易な構造に形成されている(Krusius T, Ruoslahti E., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(20):7683-7687; Day AA, et al., Biochem J, 1987, 248(3):801-805; Fisher LW, Termine JD, Young MF., J Biol Chem, 1989, 264(8):4571-4576)。デコリンは、腫瘍成長因子(TGF)−βの活性を抑制することにより、コラーゲンの繊維化を防ぎ、細胞外基質の構成(matrix assembly)に関与して、腫瘍細胞の成長を抑制し、腫瘍の形成と成長に天然拮抗剤(antagonist)として作用すると知られている(Iozzo RV., Crit Rev Biochem Mol Biol, 1997, 32(2):141-174; Isaka Y, et al., Nat Med, 1996, 2(4):418-423)。また、デコリンは、成長因子や金属イオンのような細胞外基質の構成成分と反応し、MMP-1(matrix metalloproteinase-1)とMMP-2などの発現を促進して、細胞外基質を分解させる(Yamaguchi Y, Mann DM, Ruoslahti E., Nature, 1990, 346(6281):281-284; Vogel KG, Paulsson M, Heinegard D., Biochem J, 1984, 223(3):587-597; Danielson KG, et al., J Cell Biol, 1997, 136(3):729-743)。
【００２０】
本発明の遺伝子伝達システムにおいて、デコリンが遺伝子伝達効率を増加させるメカニズムの一つは、デコリンが、MMP2及びMMP9などのような数種のMMP発現を促進することにより、細胞を囲んでいる細胞外基質成分の大部分を占めているコラーゲンを分解し、 結締組織、ひいては基底膜までも破壊して、細胞外基質の分解を誘導することができるためであると判断されて、このようなメカニズムは、下記の実施例により検証される。
【００２１】
したがって、上述のデコリンの作用を参照すると、本発明の遺伝子伝達システムは、細胞外基質により連結された細胞からなる組織内の細胞において、その長所が顕著に現れる。特に、結締組織により堅固に囲まれている腫瘍組織に、本発明の遺伝子伝達システムが適用されると、従来のいかなる遺伝子伝達体よりも改善された伝達効率を示す。
【００２２】
本発明の遺伝子伝達システムを製造するために、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、適した発現コンストラクト(expression construct)内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、デコリン遺伝子は、プロモーターに作動的に結合されることが好ましい。本明細書において、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節するようになる。本発明において、デコリン遺伝子に結合されたプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で作動し、デコリン遺伝子の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ(Cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Kプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、誘導性(inducible)プロモーター、癌細胞特異的プロモーター(例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター)及び組織特異的プロモーター(例えば、アルブミンプロモーター)を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターまたは癌細胞特異的プロモーターである。癌細胞特異的プロモーターを利用する場合、TERTプロモーターまたはE2Fプロモーターを利用することが好ましい。TERT(telomere reverse transcriptase)プロモーターとして野生型ヒトhTERT(human telomere reverse transcriptase)プロモーターまたは本発明者らにより開発されたm-hTERTを利用できる(see WO 2004/076668)。m-hTERTは、2個のc-Myc結合部位及び5個のSp1結合部位を含むヒトテロメア逆転写酵素プロモーターに、さらに一つ以上(好ましくは1個)のc-Myc結合部位及び一つ以上(好ましくは5個)のSp1結合部位を含む核酸配列が連結されたプロモーターである。m-hTERTの具体的なヌクレオチド配列は、WO 2004/076668に開示されている。E2Fプロモーターは、細胞周期に関与するプロモーターである(Johnson, D.G., Mol. Carcinog. 27: 151-157(2000); Ngwenya, S., and Safe, S., Endocrinology 144:1675-1685; Cam, H., and Dynlacht, D., Cancer Cell 3:311-316(2003))。
【００２３】
好ましくは、本発明に利用される発現コンストラクトは、ポリアデニル化配列を含む(例えば、牛成長ホルモンターミネーター及びＳＶ４０由来ポリアデニル化配列)。
【００２４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に利用されるデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、“プロモーター−デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列−ポリアデニル化配列(Pol A)”の構造を有する。
【００２５】
本発明の遺伝子伝達システムにおいて、細胞内に運搬しようとする目的のヌクレオチド配列も、上述のデコリン遺伝子の発現コンストラクトと同一な方法により発現コンストラクトを構築することができる。
【００２６】
本発明で細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、いかなるヌクレオチド配列でも可能であって、例えば、癌細胞の死滅を誘導して、究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子として、腫瘍抑制遺伝子、免疫調節遺伝子[例えば、サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、及び共刺激因子(Costimulatory factor:B7.1とB7.2のようなT細胞活性に必要な補助分子)]、抗原性遺伝子、自殺遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子、及び抗−新生血管生成遺伝子が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
自殺遺伝子は、細胞が外部因子により殺傷され易くなるように誘導する物質を発現するか、細胞に毒性条件を誘発する核酸配列である。このような自殺遺伝子としてよく知られているものは、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子である(米国特許第5,631,236号及び第5,601,818号)。ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル(gancyclovir)の投与により選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドを暗号化する遺伝子を意味する。腫瘍抑制遺伝子は、哺乳動物において自然発生遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は、腫瘍発生に必須前提とされている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＶＨＬ、ｐ５３、Ｒｂ、ＭＭＡＣ−１、ＭＭＳＣ−２、網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al. Nature, 329:642(1987))、大腸腺腫症遺伝子蛋白質(adenomatous polyposis coli protein;米国特許第5,783,666号)、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998))、欠損された血漿腫瘍(DCC)遺伝子、ＭＴＳ１、ＣＤＫ４、ＶＨＬ、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６、及びｐ２１を含む腫瘍抑制遺伝子のＩＮＫ４系列の一員及びこれの治療学的に有効な断片(例えば、p56Rb、p94Rbなど)が含まれる。当業者なら、前記例示した遺伝子に限定されず、その他に知られたあらゆる抗腫瘍遺伝子が本発明に使用できるということが分かるだろう。
【００２８】
本明細書において、用語“抗原性遺伝子(antigenic gene)”は、ターゲット細胞内で発現されて、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)及びＰＳＡ(prostate specific antigen)、ＡＦＰ(α-feto protein)、ｐ５３(WO 94/02167)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするために、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。
【００２９】
本明細書において、用語“細胞毒性遺伝子(Cytotoxic gene)”は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列が含まれる。
【００３０】
本明細書において、用語“細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)”は、細胞内で発現されて、細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合蛋白質遺伝子、シクリン−従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、p16、p15、p18及びp19)、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox, GAX)遺伝子(WO 97/16459及びWO 96/30385)などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、各種疾患を治療するに有用に使用できる種々の治療遺伝子も、本発明のシステムにより運搬される。例えば、サイトカイン(例えば、インターフェロン−α、−β、−δ、−γ)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-5、IL-18、IL-19、IL-20及びIL-23)、及びコロニー刺激因子(例えば、GM-CSF及びG-CSF)を暗号化する遺伝子、ケモカイングループ(単球走化性蛋白質１(MCP-1)、単球走化性蛋白質2(MCP-2)、単球走化性蛋白質3(MCP-3)、単球走化性蛋白質4(MCP-4)、マクロファージ炎症性蛋白質１α(MIP-1α)、マクロファージ炎症性蛋白質１β(MIP-1β)、マクロファージ炎症性蛋白質１γ(MIP-1γ)、マクロファージ炎症性蛋白質３α(MIP-3α)、マクロファージ炎症性蛋白質３β(MIP-3β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症性蛋白質４(MIP-4)、マクロファージ炎症性蛋白質５(MIP-5)、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−イプシロン(p500)、胸腺活性化調節されるケモカイン(TARC)、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒト蛋白質ＨＣＣ−１/ＮＣＣ−２、ヒト蛋白質ＨＣＣ−３、マウス蛋白質Ｃ１０など)が含まれる。また、組織プラスミノゲン活性化剤(tPA)またはウロキナーゼを発現する遺伝子及び持続的な血栓効果を提供して、高コレステロール血症を予防するＬＡＬ生成遺伝子が含まれる。また、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びＡＩＤＳのようなウイルス、悪性または炎症疾患を治療するための数種のポリヌクレオチドが知られている。
【００３２】
本明細書において、用語“親−細胞死滅遺伝子(Pro-apoptotic gene)”は、発現されて、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ(Ａｄ２及びＡｄ５由来)またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ(Ａｄ由来)、アデノウイルスＥ４遺伝子、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれる。
【００３３】
本発明の明細書において、用語“抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)”は、発現されて、抗−新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管生成因子には、アンジオスタチン、Ｔｉｅ ２(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子(VEGF)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００３４】
上述の目的のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬのようなＤＮＡ配列データバンクから入手できる。
【００３５】
本発明の遺伝子伝達システムは、多様な形態に製作することができるが、これは、(i)ネーキッド(naked)組み換えＤＮＡ分子、(ii)プラスミド、(iii)ウイルスベクター、及び(iv)前記ネーキッド組み換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはネオソームの形態に製作することができる。
【００３６】
デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、通常的な遺伝子治療に利用される全ての遺伝子伝達システムに適用できて、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997))、アデノ−関連ウイルス(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、レトロウイルス(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、レンチウイルス(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999))、単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))、ワクシニアウイルス(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999))、リポソーム(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002)、またはネオソームに適用できる。最も好ましくは、本発明の遺伝子伝達システムは、デコリンエンコーディングヌクレオチド配列をアデノウイルスに適用して製造される。
【００３７】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲のターゲット細胞、及び優れた感染性から、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐのＩＴＲ(inverted terminal repeat)を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的なシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域(E1A及びE1B)は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節する蛋白質をコーディングする。Ｅ２領域(E2A及びE2B)は、ウイルスＤＮＡ複製に関与する蛋白質をコーディングする。
【００３８】
現在開発されたアデノウイルスベクターの中で、Ｅ１領域の欠如された複製不能アデノウイルスがよく利用されている。一方、Ｅ３領域は、通常的なアデノウイルスベクターから除去され、外来遺伝子が挿入される座を提供する(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); ・ Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989))。したがって、本発明のデコリン遺伝子は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失されたＥ３領域に挿入される。一方、細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、欠失されたＥ１領域に挿入される。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語、“欠失”は、該当配列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。
【００３９】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムは、“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列”と“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”とが連結された構造を有して、前記“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域、好ましくは、欠失されたＥ１領域に挿入されたものであり、前記“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域、好ましくは、欠失されたＥ３領域に挿入されたものである。また、“プロモーター−目的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列−ＩＲＥＳ−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”のように、目的ヌクレオチドとデコリン遺伝子がＩＲＥＳ(internal ribosome entry site)により連結されたバイシストロン(bicistronic)発現システムによっても発現可能である。
【００４０】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987))。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加的に結合させることもできる。
【００４１】
アデノウイルスは、４２個の相異なる血清型及びＡ〜Ｆのサブグループを有する。この中で、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ２及びタイプ５が、本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ２及びタイプ５に対する生化学的及び遺伝的情報は、よく知られている。
【００４２】
アデノウイルスにより運搬される外来遺伝子は、エピソームと同一な方式により複製されて、そのため、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを利用した遺伝子治療が非常に安全であると判断される。
【００４３】
ii．レトロウイルス
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させて、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染できる細胞のスペクトルが広いため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。
【００４４】
レトロウイルスベクターを構築するために、デコリン遺伝子及び運搬しようする目的ヌクレオチド配列は、レトロウイルスの配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入されて、複製不能のウイルスを生産する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ(long terminal repeat)とΨ配列は含まないパッケージング細胞株を構築する(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983))。デコリン遺伝子、運搬しようとする目的ヌクレオチド配列、ＬＴＲ及びΨ配列を含む組み換えプラスミドを前記細胞株に移入すると、Ψ配列は、組み換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にして、この転写体は、ウイルスにパッケージングされて、ウイルスは、培地に排出される(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988))。組み換えレトロウイルスを含有する培地を収集して濃縮し、遺伝子伝達システムに利用する。
【００４５】
２世帯レトロウイルスベクターを利用した遺伝子伝達が発表された。Kasaharaら(Science, 266:1373-1376(1994))は、モロニーマウス白血病ウイルス(moloney-murine leukemia virus)の変異体を製造して、ここで、ＥＰＯ(erythropoietin)配列をエンベロープ部位に挿入して、新しい結合特性を有するキメリック蛋白質(Chimeric proteins)を生産した。本発明の遺伝子伝達システムも、このような２世帯レトロウイルスベクターの構築戦略により製造することができる。
【００４６】
iii．ＡＡＶベクター
アデノ関連ウイルス(AAV)は、非分裂細胞を感染させることができて、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているため、本発明の遺伝子伝達システムに適している。ＡＡＶベクターの製造及び用途に対する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【００４７】
遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究は、LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)、及びFlotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)に開示されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療剤として臨床Ｉを施している。
【００４８】
典型的に、ＡＡＶウイルスは、二つのＡＡＶ末端リピートが両側に位置されている目的の遺伝子配列(デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列)を含むプラスミド(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988);及びSamulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989))及び末端リピートのない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))を同時形質転換させて製造される。
【００４９】
iv．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムとして利用することができる。ワクシニアウイルス(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986)及びCoupar et al., Gene, 68:1-10(1988))、レンチウイルス(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999))、または単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))由来のベクターも、デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬できる運搬システムとして利用することができる。
【００５０】
v．リポソーム
リポソームは、水上に分散されたリン脂質により自然に形成される。外来ＤＮＡ分子をリポソームにより成功的に細胞内に運搬した例は、Nicolau及びSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982)、及びNicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)に開示されている。一方、リポソームを利用した動物細胞の形質転換に最もよく利用される試薬としては、Lipofectamine(Gibco BRL)がある。デコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着またはプラズマ細胞膜との融合などのメカニズムを通じて細胞と相互作用し、細胞内にデコリン遺伝子及び運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を運搬する。
【００５１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明の遺伝子伝達システムを、細胞を含むバイオサンプルに接触させる段階を含む遺伝子伝達方法を提供する。
【００５２】
本発明において、遺伝子伝達システムがウイルスベクターに基づいて製作された場合は、前記接触させる段階は、当業界に公知されたウイルス感染方法により行われる。ウイルスベクターを利用した宿主細胞の感染は、上述の引用文献に記載されている。
【００５３】
本発明において、遺伝子伝達システムがネーキッド(naked)組み換えＤＮＡ分子またはプラスミドの場合は、微細注入法(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980);及びHarlandとWeintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985))、カルシウムフォスフェート沈殿法(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973);及びChenとOkayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987))、電気穿孔法(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982);及びTur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986))、リポソーム−媒介形質感染法(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau及びSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982);及びNicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987))、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985))、及び遺伝子ボンバードメント(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))方法により、遺伝子を細胞内に移入させることができる。
【００５４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、アデノウイルスのＩＴＲ(inverted terminal repeat)ヌクレオチド配列及びデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させる作用をすることを特徴とする組み換えアデノウイルスを提供する。
【００５５】
本発明の組み換えアデノウイルスは、従来の組み換えアデノウイルスにデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を追加的に結合させ、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させて、アデノウイルスによる癌治療効能を大きく増加させる。
【００５６】
アデノウイルスゲノムの小さい部分だけがｃｉｓで必要であると知られているため(Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981))、アデノウイルスは、大量の外来ＤＮＡ分子を運搬できる能力があり、これは特に、２９３のような特定細胞株を利用する場合にそうである。このような側面で、本発明の組み換えアデノウイルスにおいて、デコリン遺伝子以外の他のアデノウイルスの配列は、少なくともＩＴＲ配列を含む。
【００５７】
デコリン遺伝子は、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)、またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ３領域に挿入される。一方、他の外来ヌクレオチド配列(例えば、サイトカイン、免疫−共刺激因子、自殺遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子)も追加的にアデノウイルスに含ませることができて、これは、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ１領域(E1A領域及び/またはE1B領域、好ましくは、E1B領域)に挿入される(参照：図1a及び1b)。本発明の他の変形例によると、デコリン遺伝子は、Ｅ４領域に挿入できる。
【００５８】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスのゲノムに追加的に結合させることもできる。
【００５９】
本発明の好ましい具現例において、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子、またはＥ１Ｂ １９ｋＤａ/Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子を有して、好ましくは、非活性化されたＥ１Ｂ １９ｋＤａ及びＥ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子を有する。本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語“非活性化”は、その遺伝子の転写及び/または解読が正常的になされず、その遺伝子によりコーディングされる正常的な蛋白質の機能が現れないことを意味する。例えば、非活性化Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変異(置換、付加、部分的欠失、または全体的欠失)が発生され、活性のＥ１Ｂ １９ｋＤａ蛋白質を生成できない遺伝子である。Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ遺伝子が欠如された場合は、細胞アポトーシス能を増加させることができて、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子が欠如された場合は、腫瘍細胞特異性を有するようにする(参照：大韓民国特許出願第2002−23760号)。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組み換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有するようになる。本発明のより好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ １９及び/またはＥ１Ｂ ５５遺伝子及び活性のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明の最も好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ １９及び/またはＥ１Ｂ ５５遺伝子が欠失されて、活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入される。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ遺伝子及び変異された活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、デコリン遺伝子は、欠失されたＥ３領域に挿入されているものである。ここで、変異された活性のＥ１Ａ遺伝子は、Ｒｂ(retinoblastoma蛋白質)結合部位をコーディングするヌクレオチド配列中で、４５番目Ｇｌｕ残基がＧｌｙに置換された変異及び１２１〜１２７番目アミノ酸配列が全体的にＧｌｙに置換された変異を有する。腫瘍細胞では、ｐ５３蛋白質の変異だけではなく、Ｒｂの突然変異あるいはＲｂ関連信号メカニズムが相当部分損傷されているため、Ｒｂとの結合能が消失されたアデノウイルスは、正常細胞では、Ｒｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、Ｒｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を選択的に殺傷することができる。したがって、上述のＲｂ結合部位における変異を含む本発明の組み換えアデノウイルスは、癌細胞特異性が非常に大きく増大される。
【００６２】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明の組み換えアデノウイルスは、“ＩＴＲ−Ｅ１Ａ−ΔＥ１Ｂ−プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”構造を有して、前記“プロモーター−デコリン遺伝子−ポリＡ配列”は、欠失されたＥ３領域に挿入されたものである。
【００６３】
本発明の最も好ましい実施例によると、本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスは、図１ｂの遺伝子地図を有する。
【００６４】
本発明の組み換えアデノウイルスにおいて、従来の抗腫瘍アデノウイルスの局所的腫瘍浸透力が大きく改善されて、細胞アポトーシス能も大きく改善される。このような効果は、本発明で利用されたデコリンが細胞外基質を効果的に分解して、細胞アポトーシス能を増加させるためであり、最終的に本発明の組み換えアデノウイルスは、大きく改善された腫瘍細胞殺傷能を示す。
【００６５】
大部分の腫瘍組織は、癌細胞が単純に群集されているのではなく、血管と正常組織とが絡まっている。特に、癌組織内に存在する結締組織は、硬くて、且つ癌細胞の外部周囲に硬い細胞外基質が形成されているため、ウイルスはもちろん抗癌治療剤が腫瘍に円滑に浸透できず、抗腫瘍効果を十分発揮できない場合が多い。このような問題点は、デコリン遺伝子を含む本発明の組み換えアデノウイルスを利用した場合、成功的に克服される。
【００６６】
下記の実施例で証明されたように、デコリンの挿入されたアデノウイルスは、腫瘍球の表面だけではなく、腫瘍球の奥まで活発に拡散される。生体内の癌組織においても、デコリンを発現する本発明のアデノウイルスは、投与部位(injection site, needle track)からさらに遠く且つさらに広く広がっていく。デコリンの発現による遺伝子伝達効率の増加は、肉眼でも容易に確認できるほど、約２〜１０倍以上に大きく差があって、既存になされた数々の研究によるコラゲナーゼ/ディスパーゼ、またはトリプシンのような蛋白質分解酵素の前処理、エラスチンを分解できるエラスターゼ、または細胞外基質を分解できるヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)による約２〜３倍の遺伝子伝達効率の増大に比べ、著しく優れた遺伝子伝達効率を示す。
【００６７】
そして、このようなデコリンの著しい組織内ウイルス拡散増進効果は、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスにも適用されて、その結果、抗腫瘍効果を大きく増大させる結果を誘導する。このような抗腫瘍効果の改善は、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(複製可能組み換えアデノウイルス)だけではなく、複製不能組み換えアデノウイルスでも現れる。一方、デコリンによる組み換えアデノウイルスの細胞アポトーシス能の格段の改善は、全く予期できなかった効果である。
【００６８】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)上述の本発明の組み換えアデノウイルスの治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的抗腫瘍組成物を提供する。
【００６９】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明の薬剤学的抗腫瘍組成物を動物に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物に有効成分として含まれる組み換えアデノウイルスは、上述の本発明の組み換えアデノウイルスと同一なものであるため、組み換えアデノウイルスに対する詳細な説明は、本発明の薬剤学的組成物にも同様に適用される。したがって、本明細書の不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００７１】
組み換えアデノウイルスを利用した効果的な抗腫瘍効果を誘導するためには、速い速度で成長する癌細胞に比べ、より速いウイルスの増殖と隣接細胞への拡散を通じて、効果的な細胞殺傷効果を誘発することができなければならない。また、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療が成功的になされるためには、高い治療効果と共に、安全性を高めるための方案が開発されなければならない。本発明で開発されたデコリン遺伝子を含む組み換えアデノウイルスは、ウイルス組織内拡散増大と細胞アポトーシス促進を通じて抗腫瘍効果が著しく増大されて、癌細胞特異的に細胞殺傷能を示す。これは、結果的に癌治療に必要なウイルス投与量を減少させることができ、ウイルスによる生体内毒性と免疫反応を大きく減らすことができる。
【００７２】
本発明の組成物に含まれる組み換えアデノウイルスは、上述のように、多様な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病または疾患、例えば、脳癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、結腸癌、及び子宮頸部癌などの治療に利用できる。本明細書において、“治療”は、(i)腫瘍細胞形成の予防；(ii)腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病または疾患の抑制；及び(iii)腫瘍細胞の除去による、腫瘍に係る疾病または疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語“治療学的有効量”は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００７３】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００７４】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができて、脳癌、皮膚癌、頭頸部癌及び乳房癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００７５】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０5〜１×１０15ＰＦＵ/ｍｌの組み換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０10ＰＦＵを二日に一回、２週間注射する。
【００７６】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法または放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチニウム(transplatinum)、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む、本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ−線照射及びγ−線照射などである。
【００７８】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)薬物の組織浸透性を改善するためのデコリンタンパク質、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物を提供する。
【００７９】
本発明で利用されるデコリンタンパク質は、天然ソース(natural source)から分離されたデコリンタンパク質及び組み換え技術で得られたデコリンタンパク質を含み、細胞外基質分解活性を有する範囲内で、前記タンパク質の断片も含む。
【００８０】
本発明の組成物は、薬物が投与される前または薬物と同時に投与することができる。また、本発明の組成物は、薬物を追加的に含むことができる。本発明の薬剤学的組成物は、薬物が適用される生体組織の細胞外基質を分解することにより、薬物の組織浸透性を大きく改善し、薬物の薬理学的効果を増加させる。
【００８１】
本発明の薬剤学的組成物において、薬剤学的に許容される担体、投与方法及び製剤化方法などは、上述の抗腫瘍薬剤学的組成物の内容が適用される。特に、本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましいが、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または組織内直接投与(例えば、頭頸部癌または乳房癌腫塊内への直接投与)を利用して投与することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ/ｋｇである。
【００８２】
本発明の組成物により組織浸透性が改善される前記薬物は、化学薬物及びバイオ薬物(biodrug)を含み、好ましくは、細胞外基質により組織浸透性が問題となる薬物、例えば、上述の癌に対する化学療法剤である。
【００８３】
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムまたはデコリンタンパク質の治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む細胞外基質の過度なる蓄積(accumulation)に係る疾患または状態の治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００８４】
本発明の薬剤学的組成物は、生体組織の細胞外基質を効果的に分解して、細胞外基質の過度なる蓄積または沈着(deposition)が関与する疾病または疾患を治療することができる。本明細書における表現“細胞外基質の過度なる蓄積”は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカンのような細胞外基質成分が、組織または器官機能を損傷し、終局的に線維症疾患を招来する程度に沈着されたことを意味する。
【００８５】
本発明の薬剤学的組成物が適用される、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾患または状態は、線維症状態と関連したものであって、斑痕、肝硬変症、肺線維症、糸球体腎炎、成人または急性呼吸困難症、肝線維症、腎線維症、後心筋梗塞線維症、 嚢胞性線維症、線維症癌、静脈閉塞症、または腎間質線維症を含むが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の薬剤学的組成物が適用される斑痕(scar)は、傷、火傷、または手術により生じた斑痕及びケロイドのような過度な斑痕である。
【００８７】
本発明の薬剤学的組成物において、デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムは、上述した本発明の遺伝子伝達システムにより説明される。一方、本発明の薬剤学的組成物で利用されるデコリンタンパク質は、天然ソース(natural source)から分離されたデコリンタンパク質及び組み換え技術により得られたデコリンタンパク質を含み、細胞外基質分解活性を有する範囲内で、前記タンパク質の断片も含む。
【００８８】
本発明の薬剤学的組成物において、薬剤学的に許容される担体、投与方法及び製剤化方法などは、上述の抗腫瘍薬剤学的組成物の内容が適用される。特に、本発明の薬剤学的組成物が斑痕の治療のために利用される場合は、経皮投与が最も適しており、軟膏、ゲル、クリーム、液体、スプレー、パッチ、またはローションの剤形で製造することが最も好ましい。一般に、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ/ｋｇである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００９０】
［実験材料及び実験方法］
１．対象細胞株及び細胞の培養
本発明の実験に使用された細胞株は、人体脳癌細胞株(U343及びU87MG)、子宮頸部癌細胞株(C33A)、肝癌細胞株(Hep3B)、肺癌細胞株(A549)とマウス黒色腫(B16BL6)のような癌細胞株、人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90及びWI38)及びアデノウイルス初期発現遺伝子であるＥ１部位が宿主遺伝体内に内在されている２９３細胞株である。Ｂ１６ＢＬ６を除いた全ての細胞株は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)から購入し、Ｂ１６ＢＬ６マウス黒色腫細胞株は、大韓民国のヨンセ大学校(Yonsei University)のボクヨンソク教授チームから提供してもらった。
【００９１】
Ｂ１６ＢＬ６細胞株を除いた全ての細胞株は、１０％の牛胎児血清(Gibco BRL, Grand Island, NY)の含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco BRL)を培養液とし、抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)を添加して、５％ＣＯ2の存在下、３７℃恒温培養器で培養した。Ｂ１６ＢＬ６細胞株は、１０％の牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ １６４０(Gibco BRL)を使用して、５％ＣＯ2の存在下、３７℃恒温培養器で培養した。
【００９２】
２．実験動物
生体内抗腫瘍実験は、６〜８週齢の雄ヌードマウス(BALB/c-nu)とC57BL/6 マウスをCharles River Korea(Seoul, Korea)で購入して行った。動物飼育室の温度は、２２±２℃、湿度は、５５〜６０％に維持して、明暗循環が１２時間単位で調節されるようにし、放射線照射で滅菌した固形飼料(Orient, Seoul, Korea)と滅菌された給水を自由に摂取するようにした。
【００９３】
３．デコリンを発現するアデノウイルスの製作、生産及び力価算出
(1)複製不能アデノウイルスの製作
ＬａｃＺ遺伝子を標識遺伝子として発現し且つデコリン遺伝子を発現する、Ｅ１とＥ３遺伝子の消失された複製不能アデノウイルスを製作した。まずｖｍｄｌ３２４ＢｓｔＢ(Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-270(2000))ベクターの消失されたＥ１部位に標識遺伝子のＬａｃＺ遺伝子を挿入し、ｐｄｌ−ＬａｃＺウイルスベクターを製作した。このために、まず、ＬａｃＺを発現するｐｃＤＮＡ−ｈｙｇｒｏ−ＬａｃＺ(Invitrogen, Carlsbad, CA,米国) プラスミドからＣＭＶプロモーター、ＬａｃＺ、及びｐｏｌＡ部位をＨｉｎｄIIIとＮａｅＩとで処理し分離した後、これをＥ１アデノウイルスシャトルベクターであるｐΔＥ１ｓｐ１Ａに挿入し、ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ/ＣＭＶ−ＬａｃＺシャトルベクターを製作した。製作されたｐΔＥ１ｓｐ１Ａ/ＣＭＶ−ＬａｃＺシャトルベクターをＸｍｎＩ制限酵素で切断した後、ＢｓｔＢＩ制限酵素により一本鎖となったアデノウイルスｖｍｄｌ３２４ＢｓｔＢと共に大腸菌ＢＪ５１８３(S.B. Verca, University of Fribourgh, Switzerland)で同時形質転換させて、遺伝子相同組み換えを誘導し、ｐｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを製作した。
【００９４】
デコリン遺伝子を発現するアデノウイルスを製作するために、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にデコリン遺伝子(DCNG) (D.G. Seidler, University Hospital of Munster, ドイツ)を挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＧ(野生型cDNA形態のデコリン)を製造した。次に、前記野生型デコリンコアタンパク質の６番目ロイシンリッチリピート部位内にあるＥ１８０アミノ酸をＥ１８０Ｑで点突然変異させて、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを製造した後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＱ発現ベクターを製造した。そして、デコリンコアタンパク質のＥ１８０アミノ酸をＥ１８０Ｋで点突然変異させて、コラーゲンとの結合能が消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを製造し、これをｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＣＮＫ発現ベクターを製造した。次に、前記発現ベクターのそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａIで処理し、１ｋｂ ＤＮＡ切片を得た後、ｐＣＡ１４ベクター(Microbix, Ontario, Canada)に挿入させて、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＧ、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＱ及びｐＣＡ１４−ＤＣＮＫベクターを製作した。
【００９５】
製作されたｐＣＡ１４−ＤＣＮＧ、ｐＣＡ１４−ＤＣＮＱ及びｐＣＡ１４−ＤＣＮＫベクターのそれぞれを制限酵素ＢｇｌIIで処理し、デコリンをＣＭＶプロモーターにより発現できるＣＭＡ−ＤＣＮ−ｐｏｌＡ発現カセットを切り出して、これをアデノウイルスＥ３シャトルベクターであるｐＳＰ７２ΔＥ３に挿入して、アデノウイルスＥ３シャトルベクター(pSP72ΔE3-DCNG, pSP72ΔE3-DCNQ及びpSP72ΔE3-DCNK)を製作した。
【００９６】
前記製作されたアデノウイルスＥ３シャトルベクターを制限酵素ＰｖｕＩまたはＸｍｎＩでそれぞれ処理し線形化した後、ＳｐｅＩを処理して線形化されたＰｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルストータルベクターと共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時形質転換させて、遺伝子相同組み換え(homologous recombination)を誘導し、ＬａｃＺ遺伝子とデコリンとを同時に発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫアデノウイルスをそれぞれ製作した(図１ａ)。
【００９７】
(2)腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの製作
デコリン遺伝子を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを製作した。具体的には、上記で製作したアデノウイルスＥ３シャトルベクターｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＧ、ｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＱ及びｐＳＰ７２ΔＥ３−ＤＣＮＫのそれぞれを制限酵素ＰｖｕＩまたはＸｍｎＩでそれぞれ処理して線形化させた後、制限酵素ＳｐｅＩを処理して線形化されたｐＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルストータルベクター(E1B 19kDa遺伝子とE1B 55kDa遺伝子とが共に消失された腫瘍特異的殺傷アデノウイルス)と共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時形質転換させて、アデノウイルスベクターＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫをそれぞれ製作した(図１ａ及び図１ｂ)。相同性組み換えされたアデノウイルスベクターを制限酵素ＨｉｎｄIIIで処理し、相同性組み換え有無を確認した。相同性組み換えが確認されたプラスミドは、ＰａｃＩ制限酵素で切断した後、２９３細胞株に形質転換して、アデノウイルスを生産した(図１ａ及び図１ｂ)。
【００９８】
これらのアデノウイルスを２９３細胞株で増殖させた後、限界希釈法(limiting dilution)またはプラーク分析(plaque assay)を行って、ウイルスの力価を決定し(Hitt, M. et al., Construction and propagation of human adenovirus vectors. Cel biology: a laboratory handbook. New York: Academic Press Inc, 479-490(1994))、ＣｓＣｌ濃度勾配で濃縮して分離した。
【００９９】
４．デコリンの発現様相の調査
本発明で製作したアデノウイルスにより誘導されるデコリンの発現様相を調べるために、デコリン遺伝子が挿入された腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)及び対照群としてＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを、それぞれ３ＭＯＩで人体肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂに感染させた。感染４８時間後、細胞から培地を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルにあるタンパク質をＰＶＤＦメンブレインに電気−伝達させた後、デコリン(D.G. Seidler, University Hospital of Munster、ドイツ)及びβ−アクチン(Sigma, St. Louis, MO, USA)を特異的に認知する抗体を一次抗体で結合させて、ＨＲＰ(horse radish peroxidase)が結合された二次抗体(sc-2004; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)をさらに結合させた後、ＥＣＬ検出キット(sc-2004; Santa Cruz Biotech)を利用して、デコリンタンパク質の発現様相を究明した。
【０１００】
５．遺伝子伝達効率の比較検証
ＬａｃＺを発現する複製不能アデノウイルスの遺伝子伝達効率を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, IMR90及びWI38)とを２４−ウェルプレートに分株した後、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫウイルスを０．１〜１００ＭＯＩ(multiplicity of infection)でそれぞれ感染させた。ウイルス感染二日後、Ｘ−Ｇａｌ試薬(PBS containing 1mg/ml, 5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN)6及び2mM MgCl2)で３７℃で６時間反応し、Ｘ−Ｇａｌ染色することにより、デコリン遺伝子の発現によるＬａｃＺ遺伝子の伝達効率を確認した。
【０１０１】
６．アデノウイルスの腫瘍球内組織浸透性の検証
約６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、及びA549)をそれぞれ１×１０7個皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースでコーティングされた培養器で、５％牛胎児血清と抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシンとが含有されたＤＭＥＭを添加して培養した。培養液は、一週間に約１〜２回入れ替えて、１週間以上腫瘍球を培養した。アデノウイルスを感染させる前に、約２ｍｍ径の腫瘍球を０．７５％アガロースのコーティングされた４８ウェルプレートに移した後、５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ１５０μｌを添加して、１×１０6、１×１０7、及び１×１０8ＰＦＵ(plaque-forming unit)のアデノウイルスをそれぞれ添加した。アデノウイルスを添加した後三日頃に培地を除去して、腫瘍球を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。立体顕微鏡(Olympus optical Co., LTD, Tokyo, Japan)を利用して、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球の表面を観察した後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(Sakura Finetec, Torrance, CA)で凍結薄片した後、１０μｍ厚に切断して、ゼラチンのコーティングされたスライドガラス上に付着し光学顕微鏡で観察して、アデノウイルスの腫瘍球内への浸透程度を確認した。また、腫瘍球内のＸ−ｇａｌ染色された部分の比率は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム(Meta imaging series, Version 6.1, Universal imaging corporation TM, Downingtown, PA)を利用して算出した。
【０１０２】
７．アデノウイルスの生体内癌組織浸透性の検証
約６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に数種の人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A及びHep3B)を皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧをそれぞれ５×１０7〜５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に５回投与した。A549 xenograft modelの場合は、Ａ５４９細胞株を皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3程度になった時、アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫをそれぞれ５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に５回投与した。ウイルス投与後３日頃に腫瘍を摘出して、４％パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に入れ、４℃で４〜８時間固定させた後、３０％スクロース溶液で１２時間程度脱水させた。脱水された組織をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、上述の腫瘍球内組織浸透性の検証実験と同様な方法により、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
【０１０３】
８．細胞病変効果(cytopathic effect, CPE)の分析
デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの癌細胞殺傷能を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90及びWI38)を４８−ウェルプレートに分株して、２４時間後、Ａｄ−ΔＥ１、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫなどのアデノウイルスを０．１〜１００ＭＯＩでそれぞれ処理した。一実験で処理された数種のウイルスの中でいずれか一つのウイルスが、最も低い力価で細胞をほとんどアポトーシスさせた時点で、全ての培地を除去し、０．５％クリスタルバイオレット( in 50%メタノール)で細胞を固定させて染色した後、残存した細胞を分析した。
【０１０４】
９．プラーク形成分析
デコリン発現によるプラークの大きさの変化を観察するために、６ウェルプレートに３×１０5個のＨｅｐ３Ｂ細胞株を分株して、翌日アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを１×１０-4ＰＦＵの力価で処理した。ウイルス感染後約４時間頃に、３７℃の２×ＤＭＥＭ(１０％牛胎児血清と抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシン含み)と４２℃の１．４％UltraPureTMアガロース(Invitrogen, Carsbad, CA)とを１：１で混合したアガロース−ＤＭＥＭ溶液を、感染された細胞株上に添加した後培養した。培養後、約４〜１６日頃に、プレートに形成されたプラークの大きさを確認し、アガロースオーバーレイ(overlay)上に１０％トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid)を１ｍｌ入れて３０分間放置した後、アガロースオーバーレイを除去し、０．５％クリスタルバイオレット(in 50%メタノール)で固定させて染色し、形成されたプラークの個数を算出した。
【０１０５】
１０．フローサイトメトリー分析による細胞アポトーシス観察
デコリンの発現により誘導される細胞アポトーシスを確認するために、人体腫瘍細胞株のＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９を２５Ｔ培養器にそれぞれ分株した後、２４時間頃にそれぞれのアデノウイルスを０．５〜５０ＭＯＩでそれぞれ感染させた。陽性対照群としては、細胞アポトーシスを誘導する物質であるカンプトテシン(camptothecin)−１１(CPT)を０．１〜１μｍ処理して、陰性対照群としては、ＰＢＳを処理した。４８時間、７２時間、そして９６時間後に感染された細胞を回収し、７０％エタノールで４℃で２４時間以上固定させた。固定が終わった後、ＰＩ(propidium iodide, 50μg/μl)とＲＮａｓｅ(ribonuclease)とが混合された溶液５００μｌを入れて、４℃で１５分間反応させた後、フローサイトメトリー分析(FACS analysis)を行った。
【０１０６】
また、デコリンの発現により誘導される初期細胞アポトーシスを検証するために、上記のような方法により、数種の人体腫瘍細胞株をそれぞれのアデノウイルスでそれぞれ感染させた後、細胞を回収し、ＡｐｏＡｌｅｒｔ Ｖ−ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)細胞アポトーシス検出キット(CLONTECH, Polo Alto, CA)を利用し、製造会社が提示した方法にしたがって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ/ＰＩ二重染色(double staining)して、フローサイトメトリー分析を行った。
【０１０７】
１１．ＴＵＮＥＬ分析
数種の人体腫瘍細胞株Ｕ３４３(5x104)、Ｕ８７ＭＧ(5x104)、Ｃ３３Ａ(5x105)、Ｈｅｐ３Ｂ(4x105)、及びＡ５４９(5x104)をそれぞれ２-ウェルチャンバースライドに分株して、アデノウイルスを０．２〜２０ＭＯＩで感染させた後、２４時間と４８時間頃に培地を除去して、ＡｐｏｐＴａｇキット(intergen, Purchase, NY)を用いて、製造会社が提示した方法にしたがってＴＵＮＥＬ(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling)分析を行った。発色有無を確認するために、ペロキシダーゼと結合されたアビジンを使用して、ＤＡＢ(3,3' diaminobenzine; Dako, Carpinteria, CA)と反応させた後、細胞が褐色に変わるのが肉眼で確認されたら、０．５％メチルグリーンで１０分間染色して、顕微鏡で観察した。顕微鏡上で四ヶ所以上の部位をランダムに選定して、全体細胞の中で染色された細胞の比率を算出した。
【０１０８】
１２．生体内抗腫瘍効果と生存率の検証
ヌードマウスに形成された人体癌腫塊の成長に、デコリンを発現するアデノウイルスが及ぼす影響を検証した。具体的には、生後６〜８週のヌードマウス(Charles River Japan Inc.)の腹壁に、皮下に１×１０7個の人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、Hep3B、及びA549)をそれぞれ１００μｌのＨＢＳＳ(Hanks' balanced salt solution, Gibco BRL)に浮遊して皮下注射した。腫瘍が約５０〜８０ｍｍ3程度に成長した時、１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ二日間隔で３回腫瘍に直接注射した後、腫瘍の成長と生存率を観察した。陰性対照群としては、ＰＢＳを注射した。腫瘍の容積は、バーニヤキャリパスを利用して腫瘍の長軸と短軸を測定した後、次の数学式で算出した。
腫瘍の容積＝(短軸ｍｍ)2×長軸ｍｍ×０．５２３
【０１０９】
１３．デコリンを発現する複製可能アデノウイルス投与による腫瘍組織の変化観察
ヌードマウスの腹壁に形成されたＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、またはＡ５４９腫瘍が約５０〜８０ｍｍ3程度に成長した時、１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出してパラフィンブロックを製作した。陰性対照群としては、ＰＢＳを注射した。製作されたパラフィンブロックを３μｍ厚のスライドに切断した後、これを、キシレン、１００％、９５％、８０％、及び７０％エタノール溶液に順に浸してパラフィンを除去(deparafinization)した後、ヘマトキシリンとエオシン(H & E)で染色した。生体内結締組織の構成成分であるコラーゲンの分布を観察するためには、３μｍ厚のパラフィンブロックスライドをボウイン(bouin)、ヘマトキシリン及びMasson'sトリクロム(biebrich's scarlet acid fuchsin)でそれぞれ染色して観察した。前記染色試薬は、ＤＡＫＯ ＡＲＫ(Dako, Carpinteria, CA)から購入した。また、同一部位のパラフィンブロックを利用して、アデノウイルスのヘキソン(hexon)部位を検出できる免疫組織化学分析(immunohistochemistry, IHC)を行った。上記のような方法によりスライドのパラフィンを除去した後、アデノウイルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体(MAB 8052 chemicon, Temecula, CA)を一次抗体として、そして、ヤギａｎｔｉ−ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ(Sata Cruz Biotechnology)を二次抗体として反応させて、ＤＡＢを添加し発色させて観察した。
【０１１０】
腫瘍内の細胞アポトーシスも、同一な部位のパラフィンブロックスライドを利用して観察した。ＡｐｏｐＴａｇキットを利用して、製造会社が提示した方法にしたがってＴＵＮＥＬ分析を行い、ペロキシダーゼと結合されたアビジンを使用してＤＡＢと反応させた後、細胞が褐色に変わるのが肉眼で確認されたら、０．５％メチルグリーンで１０分間染色し、顕微鏡で観察した。
【０１１１】
１４．ザイモグラフィ(Zymograpy)を利用したＭＭＰ発現様相究明
ＭＭＰ活性変化を観察するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)を７５Ｔ培養器に分株して、２４時間後にＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ１〜１００ＭＯＩで添加し、４８時間培養した。その後、牛胎児血清の含まれていないＤＭＥＭに入れ替えて、２４時間培養した後、培地を回収して濃縮し、濃縮された培地のタンパク質濃度は、タンパク質分析キット(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を利用して定量した後、同量のタンパク質をゼラチン−基質ゲルに電気泳動した。電気泳動した後、ゲルを３７℃で１８時間ゼラチン溶解(gelatinolysis)反応が起こるようにした後、クマシーブルーで染色して、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を観察した。また、各実験は、３回以上行って、QuntityOne2.1プログラム(BIO-Rad Laboratories, Hercules, CA)を利用して、バンド厚を比較検証した。
【０１１２】
１５．Spontaneous癌転移モデルを利用したデコリン発現による癌転移能(metastatic potential)変化の検証
デコリンの高発現による癌転移能(metastatic potential)の変化を調べるために、まず、Ｂ１６ＢＬ６細胞(2×105/マウス)を６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ/６マウス(Charles River Korea, Seoul, Korea)の後ろ右足パッドに皮下投与して、一次腫瘍(primary tumor)を形成した。一次腫瘍の大きさが約１００〜２００ｍｍ程度になった時、ＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧをそれぞれ二日間隔で腫瘍内に３回投与した。最後の投与後、５日頃にマウスの右足首以下を切断し一次腫瘍を除去した後、２０日頃にマウスを全部犠牲させて、肺に転移された腫塊の重量を測定した。
【０１１３】
１６．乳房癌患者から採取した腫瘍組織を利用した、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透性の検証
乳房癌患者から腫瘍組織及びその周辺の正常組織を採取した後、約１〜２ｍｍ径の切片にして、２４−ウェルプレート培養器で、５％牛胎児血清と１０μＭ/Ｌインシュリンと１μＭ/Ｌヒドロコルチゾン(hydrocortisone)を含むＩＭＤＭ(Isocove's Modified Dulbecco's Medium)を添加して、４時間培養した。乳房癌組織が入っている培養器に１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ添加し、５％ＣＯ2、３７℃恒温器で５日間培養した。培養後、培地を除去して、乳房癌組織を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を行い、立体顕微鏡(Olympus optical Co., LTD, Tokyo, Japan)を利用して、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球の表面を観察した。
【０１１４】
１７．一次ケロイド細胞における、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率の検証
ケロイド(Keloid)患者の組織から採取した一次ケロイド細胞株(2継代培養)を２４−ウェルプレートに分株して、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを０．１〜５０ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、５％ＣＯ2、３７℃恒温器で培養した。ウイルス感染後、４８時間頃にＸ−ｇａｌ染色を行って、アデノウイルスの遺伝子伝達効率を観察した。
【０１１５】
１８．ケロイド細胞球を利用したスフェロイド(spheroid)モデルを利用した組織浸透性の検証
ケロイド患者の組織から採取した継代培養２世代の一次ケロイド細胞(１×１０5個)を１５ｍｌファルコン(falcon)チューブに入れて、５００ｇで５分間遠心分離し、スフェロイド(spheroid)を作った後、これを２４−ウェルプレートに入れて３７℃培養器で５日間培養した。その後、ケロイドスフェロイドを０．７５％アガロースコーティングされた４８−ウェルプレートに移した後、１５０μｌのＤＭＥＭ培地(５％の牛胎児血清含有)を添加して、１×１０7ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス感染後３日頃に培地を除去して、ケロイドスフェロイドを固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を行い、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球を立体顕微鏡を利用して表面を観察した。
【０１１６】
１９．ケロイド患者から採取した組織を利用した組織浸透性の検証
ケロイド患者の組織から採取したケロイド組織を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースコーティングされた培養器で、５％牛胎児血清の含有されたＤＭＥＭと抗生剤ペニシリン/ストレプトマイシンとを添加して培養した。培養液は、一週間に約１〜２回入れ替えて、１週間以上ケロイド組織を培養した。アデノウイルスを感染させる前に、約２ｍｍ程度の直径を有するケロイド組織を、０．７５％アガロースでコーティングされた４８−ウェルプレートに移した後、１５０μｌのＤＭＥＭ培地(５％の牛胎児血清)を添加して、１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス感染後３日頃に培地を除去して、ケロイド組織を固定溶液に入れて固定させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。Ｘ−ｇａｌ染色されたケロイド組織を、立体顕微鏡を利用して表面を観察した後、アデノウイルスのケロイド組織内浸透程度を確認するために、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、１０μｍ厚に切断して、ゼラチンのコーティングされたスライド上に付着し、光学顕微鏡で観察した。
【０１１７】
［実験結果］
１．デコリンを発現するアデノウイルスの製作及びデコリンの発現様相の究明
デコリン遺伝子の発現による組織内浸透力の変化を可視的に観察するために、標識遺伝子としてＬａｃＺ遺伝子を発現する複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫを製作した。また、アデノウイルスの組織内拡散及び浸透力を向上させるために、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを製作した(図１ａ及び１ｂ)。 複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺは、Ｅ１部位が欠失されて、欠失されたＥ１部位に挿入されたＣＭＶプロモーターの調節下でＬａｃＺ遺伝子を発現する；腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂは、正常的なＥ１Ａ遺伝子は含んでいるが、Ｅ１Ｂ １９ｋＤａ及びＥ１Ｂ ５５ｋＤａ遺伝子が欠失されている。複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫと腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫは、ＣＭＶプロモーターの調節下でＥ３部位に挿入されたデコリン遺伝子を発現する。デコリン遺伝子の点突然変異ＤＣＮＫ及びＤＣＮＱは、タイプＩコラーゲンフィブリルとデコリンとの結合に非常に重要な作用をする部位を置換したものである。
【０１１８】
製作されたアデノウイルスにより発現されるデコリンの発現様相を検証するために、人体肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂに腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫを３ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、細胞から培地を回収し、ウェスタンブロッテングを行った。その結果、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの陰性対照群であるＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスで感染された細胞では、デコリンの発現を観察することができなかった反面、 ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫアデノウイルスで感染された細胞の全てでは、デコリンの発現を観察することができた(図２)。
【０１１９】
２．遺伝子伝達効率の比較検証
デコリンを発現して、ＬａｃＺを発現する複製不能アデノウイルスの遺伝子伝達効率を検証するために、数種の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)と、人体正常細胞株(CBHEL, IMR90及びWI38)にｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫウイルスを０．１〜１００ＭＯＩでそれぞれ感染させて、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色法を行って、ＬａｃＺの発現様相を比較観察した。その結果、本発明で使用された全ての癌細胞株において、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ感染によるＬａｃＺ発現程度が、対照群であるｄｌ−ＬａｃＺに比べ増加し、デコリンの発現により遺伝子伝達効率が大いに増加することを確認した。ところが、高力価の複製不能ウイルスを処理した場合は、細胞が死滅されることを観察することができて、特に、Ｃ３３Ａ細胞株を１０ＭＯＩ以上のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧウイルスで感染させた場合は、全ての細胞が完全に死滅され、デコリンが高発現する時に細胞を死滅することができることが分かった(図３ａ及び３ｂ)。しかしながら、コラーゲンフィブリルとデコリンとの結合に非常に重要な作用をする部位を置換したＤＣＮＫ及びＤＣＮＱ点突然変異がデコリン遺伝子を発現する場合は、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱの遺伝子伝達効率が、対照群ウイルスｄｌ−ＬａｃＺに比べ若干増加した反面、コラーゲンとの結合能が完全に消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫの遺伝子伝達効率は、ｄｌ−ＬａｃＺの遺伝子伝達効率とほぼ等しいことを観察した。こうような結果から、野生型デコリンの発現により、遺伝子伝達効率が増加することが分かった。これに比べ、正常細胞では、デコリンの発現によるＬａｃＺ遺伝子の伝達効率が大いに増加されなかったが、このような結果は、デコリンの癌細胞特異性を意味する。
【０１２０】
３．腫瘍球を利用したアデノウイルスの生体外癌組織浸透性の検証
アデノウイルスの腫瘍球内への遺伝子伝達効率と組織拡散及び浸透性を調べるために、数種の人体腫瘍細胞株をヌードマウスに皮下注射した後、腫瘍の大きさが約１５０〜２００ｍｍ3になった時、腫瘍を摘出した。摘出された腫瘍組織を１〜２ｍｍ程度の直径になるように細かく切って培養液に入れた後、１×１０6、１×１０7及び１×１０8ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ培地に添加して、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を施した。腫瘍球を光学顕微鏡で観察した結果、１×１０6ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱアデノウイルスを投与した場合に比べ、同力価のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した腫瘍球の表面にＸ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察することができ、１×１０7ＰＦＵ以上のアデノウイルスを培地に添加した場合は、全ての腫瘍球の表面全体がＸ−ｇａｌで濃く染色されていることを観察した(図４)。また、アデノウイルスの腫瘍球内への浸透程度をより綿密に観察するために、Ｘ−ｇａｌ染色された腫瘍球を凍結薄片して観察した。その結果、１×１０6、１×１０7及び１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱを投与した癌組織の場合、ＬａｃＺの発現程度が微弱であり、ウイルスが腫瘍球表面に留まっている反面、同力価のｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した癌組織におけるＬａｃＺ発現度がｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱの場合より著しく高くて、アデノウイルスが腫瘍球表面に局限されず、腫瘍球の内側部位へウイルスが広がっていくことを確認することができた(図４)。また、本実施例でも、上述の遺伝子伝達効率の比較検証の実施例と同様に、コラーゲンとの結合力が野生型に比べ弱化されたデコリン変異体ＤＣＮＱを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱ及びコラーゲンとの結合能が完全に消失されたデコリン変異体ＤＣＮＫを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫの組織浸透力が、コラーゲンとの結合力が完全な野生型ＤＣＮＧを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧに比べ、大いに弱化されて、弱化された程度は、コラーゲンとの結合力と反比例することが分かった。このような実験結果を通じて、野生型デコリンを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透力が、腫瘍球内において、対照群ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱに比べ、大いに増加されたことが分かった。
【０１２１】
４．ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの生体内癌組織浸透性の検証
生体外腫瘍球を利用した実験結果を通じて確認したｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの増加された組織浸透力を、異種移植(xenograft)生体モデルを利用して検証してみた。ヌードマウスの腹壁に形成されたＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ及びＨｅｐ３Ｂ腫瘍に、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスのそれぞれを１×１０8〜５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に直接注射した後、三日頃に腫瘍を摘出して凍結薄片した後、Ｘ−ｇａｌ染色を施した。その結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した腫瘍組織の場合は、ＬａｃＺの発現程度が微弱であり、染色部位がウイルスの投与された組織付近に限定されている反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織のＬａｃＺ発現度は、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ著しく高く、Ｘ−ｇａｌで染色された部位がウイルスの投与された部位に局限されず、広い部位に広がっていることが確認できた(図５)。特に、Ｕ８７ＭＧ及びＣ３３Ａ異種移植の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した時、腫瘍組織全体でＬａｃＺが発現されて、濃いブルーに染色されたことを確認することができた。また、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱアデノウイルスを投与したＡ５４９腫瘍の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織の場合のＬａｃＺ発現程度及び発現された腫瘍部位が、ｄｌ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＫ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＱを投与した場合に比べ、大いに増大したことを確認することができた。このような実験結果を通じて、生体内でも、腫瘍球を利用した実験と同様に、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの組織内拡散及び浸透性が、デコリンを発現しない対照群アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺに比べ、大いに増加したことが分かった。
【０１２２】
また、ＧＦＰ(green fluorescence protein)を発現するアデノウイルスであるｄｌ−ＧＦＰとｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれヌードマウスの腹壁に形成されたＣ３３Ａ腫瘍に５×１０8ＰＦＵの力価で腫瘍内に直接注射した後、三日頃に腫瘍を摘出して凍結薄片した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、ｄｌ−ＧＦＰを腫瘍内投与した腫瘍組織の場合は、ＧＦＰの発現がウイルス投与時に形成されるneedle trackの周辺に沿って制限的に発現された反面、ｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮアデノウイルスを腫瘍内投与した腫瘍組織の場合は、ウイルスが投与された部位に局限されず、広い部位に拡散されて強く発現されることを確認することができた(図１９ａ)。
【０１２３】
５．デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能の検証
先行の実験から既に確認されたコラーゲンとの結合能を有したデコリンの発現によるアデノウイルスの組織内拡散の増加により、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能が増加されるかどうかを調べるために、ＣＰＥ分析を行った。陰性対照群として複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ、実験群として腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫアデノウイルスを、それぞれ０．１〜１００ＭＯＩで人体腫瘍細胞株(U343、U87MG、C33A、Hep3B、及びA549)と人体正常細胞株(CBHEL, MRC5, IMR90, WI38)をそれぞれ感染させた後、細胞の殺傷程度を比較観察した。図６から分かるように、陰性対照群のｄｌ−ＬａｃＺで感染された種々の癌細胞では、ウイルスの増殖による細胞殺傷効果が観察されなかったが、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧで感染された場合は、デコリンを発現しない対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂに比べ、約１０〜２０倍程度高い癌細胞殺傷効果が観察された。即ち、Ｈｅｐ３ＢとＵ８７ＭＧ細胞株では、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスがＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ約２０倍程度高い癌細胞殺傷効果を誘導し、Ｕ３４３、Ｃ３３Ａ、及びＡ５４９細胞株では、約１０倍程度高い癌細胞殺傷効果を誘導した。このような実験結果から、デコリンの発現がアデノウイルスの複製能に否定的な影響を及ぼさないばかりか、却ってデコリンの発現により癌細胞特異的殺傷アデノウイルスの細胞殺傷能が増加されることが分かった。また、先行の実施例等と同様に、コラーゲンとの結合能が弱化または消失されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫの癌細胞殺傷能がＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ著しく低くて、その低い程度は、コラーゲンとの結合能と反比例することを確認することができた。しかしながら、正常細胞の場合は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスの細胞殺傷効果が対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂに比べ増加しなかった。したがって、このような結果から、ＤＣＮＧの発現による細胞殺傷能増大効果が癌細胞では誘導されたが、正常細胞では誘導されず、癌細胞特異的であることを確認することができた。
【０１２４】
６．デコリン発現によるプラーク(plaque)形成の比較
デコリンの発現が細胞殺傷と周辺細胞へのウイルス拡散に及ぼす影響を可視化するために、アデノウイルスの増殖と周辺細胞への拡散によるプラークの形成をアガロースの含有された固体培地で比較検証した。Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫアデノウイルスをそれぞれＨｅｐ３Ｂ細胞株に感染させて、プラーク形成の進行速度を観察した。図７ａ及び７ｂから分かるように、対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫ、またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱに感染された場合に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧで感染されたＨｅｐ３Ｂ細胞株でプラークの形成が速く進行されて、形成されたプラークの大きさも増加したことを観察することができた。即ち、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した場合は、ウイルス感染後１３〜１６日が経ってからプラークの形成を肉眼で確認することができたのに比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを感染させた場合は、ウイルス感染後４日頃から、プラークが形成されたことを確認することができた。また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫのプラーク形成速度がＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ大いに減少したが、その減少された程度は、コラーゲンとの結合能と反比例することを観察した。このような結果は、デコリンとの結合能を有したデコリンを発現するアデノウイルスの増加された細胞殺傷能と、隣接した細胞へのウイルス拡散によりプラークの形成が速く進行されて、また形成されたプラークの大きさが増加したことを意味する。
【０１２５】
７．デコリンを発現するアデノウイルスによる細胞アポトーシスの誘導
デコリンの発現様相及びこれによる遺伝子伝達効率の変化を調べるために進行された実験(実験結果2)で、高力価の複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧで細胞を感染させた場合、細胞が死滅されて細胞培養プレートの底から離れていくことが観察されたため、デコリンにより細胞殺傷が誘導されるかどうかをより綿密に調べた。これのために、まず、細胞アポトーシスが誘導されるとＤＮＡが無作為的に切片化されて現れるｓｕｂＧ1細胞群の増加率を、ＰＩ染色後フローサイトメトリー分析を行って測定した。種々の人体腫瘍細胞株を腫瘍特異的殺傷アデノウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫでそれぞれ感染させて、４８〜９６時間後に細胞を回収してｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した。細胞アポトーシスを誘導する陽性対照群としては、細胞アポトーシス誘導化学物質であるＣＰＴを使用した。対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂにより感染されたＡ５４９細胞の場合、ｓｕｂＧ1細胞群が約３．１１％であるのに対し、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより感染された場合は、ｓｕｂＧ1細胞群が約２６．５２％に大きく増加した。このようなＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルス感染によるｓｕｂＧ1細胞群の増加は、他の種類の細胞株(U343、U87MG、C33A、及びHep3B)でも観察された(図８ａ、表１)。また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染によるｓｕｂＧ1細胞群の増加は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧに比べ減少したが、その減少程度は、コラーゲンとの結合能が低いほどさらに大きいことを、先行の実施例等の結果と同様に、確認することができた。
【０１２６】
そして、複製不能アデノウイルスであるｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧでそれぞれ感染させて４８〜９６時間後に細胞を回収してｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した。腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによるｓｕｂＧ1細胞群の増加を観察した上記結果と同様に、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを感染させた場合より、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合にｓｕｂＧ1細胞群が大きく増加することを観察することができた(図８ｂ、表２)。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
また、細胞アポトーシスに及ぼすデコリンの影響をさらに綿密に観察するために、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによる細胞アポトーシスの進行程度をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで二重染色して確認した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣは、細胞アポトーシス初期に細胞膜外に流出されてきたフォスファチジルセリン(phosphatidylserine: PS)を検出することができる反面、ＰＩは、細胞死後期に細胞膜の破壊によりＰＩが細胞内に入って、核内にあるクロマチン(chromatin)と結合することにより、細胞壊死(necrosis)の特徴を確認することができる。したがって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ-/ＰＩ-は、健康な細胞を意味して、 Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-は、初期細胞アポトーシスが起こった細胞、そしてＰＩ+細胞は、細胞壊死が起こった細胞を意味する。細胞アポトーシスを誘導する陽性対照群として利用されたＣＰＴを処理したＵ３４３細胞株の場合、約３２．１５％(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-)の細胞が細胞アポトーシスに進行されて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより感染された場合は、それぞれ２４．１５％及び４４．８５％の細胞で細胞アポトーシスが誘導されて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスによる細胞アポトーシス頻度がＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ大きく増加したことを観察した(図９ａ)。その他にも、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９細胞株でも、対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ、デコリンを発現するアデノウイルスにより遥かに高い頻度で細胞アポトーシスが誘導されることを確認することができた。また、細胞死を総括的に測定できる細胞アポトーシス及び細胞壊死頻度を全部合わせた場合(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-＋ＰＩ+)でも、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスにより誘導された細胞死頻度がＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ著しく増加した。以上のような結果から、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの対照群Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスにより感染された場合より、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスに感染された場合に細胞アポトーシスが著しく高い頻度で進行され、結果的に細胞死が増加することを確認することができた。そして、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染により誘導される細胞アポトーシス頻度が、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより誘導される細胞アポトーシス頻度に比べ減少したが、その減少程度は、コラーゲンとの結合能が低いほどさらに大きいことを確認することができた。
【０１３０】
また、デコリンを発現する複製不能アデノウイルスによる細胞アポトーシス誘導を調べるために、Ｕ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ５４９細胞に、ＰＢＳ、ＣＰＴ、ｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを処理した後、細胞アポトーシス進行程度をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩで二重染色して確認した。図９ｂから分かるように、ＣＰＴを処理したＵ３４３細胞株の場合、約１９．４１％(Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ+/ＰＩ-)の細胞が初期細胞アポトーシスに進行されて、ｄｌ−ＬａｃＺにより感染された場合は、３．９３％の細胞だけが細胞アポトーシスに進行され、ＰＢＳのみを処理した陰性対照群と同様に非常に低い比率の細胞のみが細胞アポトーシスに進行された。その反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧにより感染されたＵ３４３細胞株の場合は、約１３．１８％の細胞が細胞アポトーシスに進行され、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ複製不能アデノウイルスによる細胞アポトーシス頻度が、対照群複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺに比べ、大きく増加したことを観察した。この他にも、Ｕ８７ＭＧ、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ及びＡ５４９細胞株においても、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスに比べ、デコリンを発現する複製不能アデノウイルスのｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧにより遥かに高い頻度で細胞アポトーシスが誘導されることを確認することができた。このような結果がら、コラーゲンとの結合能を有したデコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスだけではなく、複製不能アデノウイルスにより感染された場合も、細胞アポトーシス誘導が著しく増加され得ることを確認することができた。
【０１３１】
初期細胞内アポトーシスの特徴であるＤＮＡ切片化を確認できるまた他の分析方法のＴＵＮＥＬ分析も行った。図１０ａと表３から分かるように、陽性対照群として使用されたＣＰＴを処理した全ての細胞株の場合は、ほとんどの細胞が濃い褐色に染色され、細胞アポトーシスが活発に進行されていることを確認した。Ｕ３４３細胞株をＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスで感染させた場合、約３２．５±１２．５％の細胞が褐色に淡く染色された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合は、約６９．７±５．４０％の細胞が濃い褐色に染色され、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスが遥かに高い頻度で細胞アポトーシスを誘導することが分かった(表３)。このようなデコリン発現による細胞アポトーシス頻度の増加現象は、他の細胞株(U87MG, C33A, Hep3B及びA549)でもほぼ等しい傾向で観察されて、また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＱ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＫウイルス感染により誘導されるＤＮＡ切片化頻度が、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧにより誘導されるＤＮＡ切片化頻度に比べ大いに減少し、その減少程度がコラーゲンとの結合能に反比例することを観察した。本実施例で確認されたコラーゲンとの結合能に比例したデコリンの作用は、先行の実施例等において、全て同様な結果として検証されたため、以後進行された実施例では、コラーゲンとの結合能の最も高い野生型デコリンを発現するアデノウイルスのみを利用して進行した。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
また、複製不能アデノウイルスｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧでそれぞれ感染させて、４８〜９６時間後に細胞を回収し、ＴＵＮＥＬ分析を行った。腫瘍特異的殺傷アデノウイルスによる細胞アポトーシス進行程度を観察した上記の結果と同様に、対照群のｄｌ−ＬａｃＺアデノウイルスを感染させた場合より、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスで感染させた場合、遥かに高い頻度で細胞アポトーシスを誘導することを観察することができた(図１０ｂ及び表３)。
【０１３４】
８．デコリンを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果の検証
野性型デコリンを発現するＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、種々の人体腫瘍細胞株をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍に１×１０8〜５×１０8ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスのそれぞれを、陰性対照群のＰＢＳと共に二日間隔で３回腫瘍内投与した後、腫瘍の成長を観察した。人体脳腫瘍Ｕ８７ＭＧの場合、ＰＢＳを投与された時は、ウイルス投与後１９日頃に腫瘍の大きさが約１０８９．２２ｍｍ3で、腫瘍が急激に成長した反面、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１ＢまたはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与された時は、それぞれ１１５．７０ｍｍ3及び１１．８７ｍｍ3で、腫瘍の成長が顕著に遅延されることを観察することができた(図１１ａ)。即ち、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与された腫瘍の方が、ＰＢＳを投与された場合に比べ、明らかな抗腫瘍効果を示した。
【０１３５】
また、ウイルスの投与後２５日頃には、ＰＢＳを投与した９匹のマウスが全部死んでしまい、それ以上腫瘍の成長を測定することができなかった反面(図１１ｂ)、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した後３３日頃には、腫瘍の大きさがそれぞれ３９９．６８ｍｍ3及び２３．３８ｍｍ3であって、デコリンを発現するアデノウイルスによる抗腫瘍効果が、対照群のＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスに比べ、さらに優れており且つさらに長く持続されることを確認した。特に、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した場合、ウイルス投与後１９日頃に７匹のマウスの中で４匹から、そして４１日頃には６匹から、腫瘍が完全になくなって、６０日が経っても腫瘍の再成長は観察されなかった(図１１ｂ)。このようなＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧの卓越な抗腫瘍効果が他の人体腫瘍モデルでも適用できるかを調べるために、Ｕ３４３、Ｃ３３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＡ５４９異種移植(xenograft)で、前記の方法と同一な方法により抗腫瘍効果を検証した。図１１ａから分かるように、陰性対照群のＰＢＳを投与した群に比べ、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与した群で明らかな抗腫瘍効果が観察されて、デコリンを発現するＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与された場合、腫瘍の大きさが、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与された場合に比べ著しく減少し、デコリン発現による明らかな抗腫瘍効果を観察することができた。
【０１３６】
また、デコリンを発現するアデノウイルスを腫瘍に投与時、マウスの生存率を比較した。Ｃ３３Ａ異種移植モデルにおいてＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与時(C33Aに対しては1×108 PFU投与、U343, U87MG, Hep3B及びA549に対しては5×108 PFU投与)、８０日経過後、１００％のマウスが生存した反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与した場合、同じ期間にただ５０％のマウスのみが生存した(マウスの死；腫瘍大きさ＞C33Aに対して2000mm3)ことが分かった(図１１ｂ)。Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧの生存率増加は、他のＵ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｈｅｐ３Ｂ及びＡ５４９異種移植モデルでも同様な結果を示した。このような結果を通じて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧウイルスが、生体モデルにおいて、優れた抗腫瘍効果及び生存率増大効果を示すことが分かった。
【０１３７】
９．デコリンを発現する複製可能アデノウイルス投与による腫瘍の変化観察
数種の癌細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)をヌードマウスの腹壁皮下に接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを陰性対照群のＰＢＳと共に３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出してヘマトキシリンとエオシンでＨ＆Ｅ染色し、組織の状態を検証した。図１２ａ〜１２ｅから分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した腫瘍の場合は、腫塊の中心部位から自然に発生する細胞壊死と、ウイルスが投与された腫塊の縁の局所的部位でのみ細胞壊死が進行された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した腫瘍の場合は、腫塊の中心部位だけではなく、ウイルスが投与された腫瘍の縁まで、さらに広い部位で細胞壊死が非常に活発に進行されることを確認した。また、腫瘍組織内における癌細胞特異的殺傷アデノウイルスの複製様相を検証するために、アデノウイルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体を利用して、ＩＨＣを行った。図１２ａ〜１２ｅから分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂを投与した場合に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍の場合に腫瘍のさらに広い部位からアデノウイルスを検出することができて、細胞アポトーシスを確認できるＴＵＮＥＬ分析を行った場合も、アデノウイルスが検出された部位と同じ部位で細胞アポトーシスが活発に進行されることを確認することができた。以上の結果をまとめてみると、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスが投与された腫塊部位でウイルスの複製が活発に起こって且つさらに広い部位に広がっていくことができ、その結果、細胞アポトーシス及び細胞壊死が非常に活発に且つ広範囲で誘導されることが分かった。
【０１３８】
１０．マッソン・トリクローム(Masson's trichrome)染色を利用した腫瘍内コラーゲン分布の検証
人体脳癌細胞株Ｕ３４３をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを３回腫瘍内注射した後、三日後に腫瘍組織を摘出しマッソン・トリクロームで染色して、青色に染色される細胞外基質の主成分のコラーゲンの分布を観察した。その結果、Ａｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与したＵ３４３腫瘍の場合は、腫瘍内部において、青色染色が腫瘍細胞の間で多く観察された反面、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与した場合は、腫瘍内部では青色がほとんど観察されず、腫瘍の周囲を囲んでいる正常組織でのみコラーゲンカプセルのような形態を観察することができた(図１３のＡパネル)。このような結果から、癌細胞特異的殺傷アデノウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧによるデコリンの発現が癌細胞特異的に誘導されて、癌組織内部のコラーゲンの発現のみを阻害し、周辺の正常組織のコラーゲンの発現様相には、影響を及ぼさないことが分かった。
【０１３９】
そして、人体脳癌細胞株のＵ８７ＭＧをヌードマウスに接種した後、形成されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスを腫瘍内注射した後、マッソン・トリクロームで染色した場合は、対照群ウイルスのＡｄ−ΔＥ１Ｂアデノウイルスを投与した場合と同様に、コラーゲンの発現が非常に低くて、青色に染色された部位がほとんど観察されなかった(図１３のＢパネル)。このような結果から、腫瘍組織内のコラーゲン発現が低い場合は、デコリンの高発現により、コラーゲンの発現様相が変化されないことが分かった。
【０１４０】
１１．ザイモグラフィ(Zymograpy)を利用したＭＭＰ発現様相の究明
デコリンの発現による細胞外基質の減少が、ＭＭＰ発現により誘導されるものであるかを確認するために、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性をザイモグラフィにより検証した(図１４)。数種の細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)を様々な力価のアデノウイルス(Ad-ΔE1B及びAd-ΔE1B-DCNG)で感染させて、培地を回収し、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を観察した結果、ＰＢＳ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ対照群に比べ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧアデノウイルスにより感染された場合に、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性が大きく増加した。このようなＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性増加現象は、実験に使用された５種類の人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)でほぼ等しく観察された。前記結果から、デコリンの発現により、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性が増加されたことが分かった。
【０１４１】
１２．Spontaneous癌転移モデルを利用した、デコリン発現による癌転移能(metastatic potential)の変化検証
デコリンは、細胞外基質の構成成分と反応し、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−２などの発現を促進して細胞外基質を分解すると知られており、ＭＭＰ−２の場合は、本研究の実験結果１１でも確認された。したがって、デコリンの高発現による癌転移能(metastatic potential)の変化を、spontaneous癌転移モデルを利用して調べてみた。まず、Ｂ１６ＢＬ６細胞をＣ５７ＢＬ/６マウスの右後ろ足の裏に皮下投与した後、腫瘍の大きさが約１００〜２００ｍｍ程度に成長した時、ＰＢＳ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ、及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを二日間隔で３回腫瘍内投与した。最後の投与後５日頃にマウスの右足首以下を切断して、一次腫瘍を除去した後、２０日頃にマウスを全部犠牲させて、肺に転移された腫塊の重量を測定した。図１５から分かるように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与されたマウスの肺に転移された腫塊の平均重量は、それぞれ２００±１４０ｍｇ及び１３０±１６０ｍｇであって、ＰＢＳを投与された対照群マウスの肺に転移された腫塊の平均重量の２５０±１４０ｍｇに比べ、著しく低いことが確認できた。さらに、ＰＢＳを投与された６匹のマウスの全部から肺転移が酷く起こったのに対し、Ａｄ−ΔＥ１ＢまたはＡｄ−ΔＥ１Ｂ−ＤＣＮＧを投与された６匹のマウスの場合は、それぞれ１匹と２匹のマウスで癌転移が完全に抑制されたことを観察した。このような結果から、デコリンの発現により、対照群ウイルスに比べ、癌転移がさらに活発に抑制されることが確認できた。
【０１４２】
１３．乳房癌患者から採取した腫瘍組織を利用した、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率及び組織浸透性の検証
先行の各種実験結果から確認された、デコリンを発現するアデノウイルスの向上された遺伝子伝達効率及び組織浸透性が、一次人体腫瘍組織でも確認できるかどうかを調べるために、実際の乳房癌患者から採取した癌組織及びその周辺の正常組織を約１〜２ｍｍ径の切片にして、０．７５％アガロースでコーティングされた培養器で培養した後、１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ添加した。ウイルス添加後、約５日後にＸ−ｇａｌ染色を行った結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＬａｃＺを感染させた場合に比べ、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを感染させた場合の癌組織表面にＸ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察することができた(図１６)。これとは対照的に、正常組織の場合は、ｄｌ−ＬａｃＺまたはｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを添加した全ての一次正常組織において、Ｘ−ｇａｌ染色がほとんど起こらなかった。
【０１４３】
また、ＧＦＰを発現するアデノウイルスのｄｌ−ＧＦＰとｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮＧアデノウイルスをそれぞれ乳房癌患者から摘出した乳房癌組織球(<1cm3)を、１２−ウェルプレートに腫瘍組織球を入れて、インシュリン(10μmol)とヒドロコルチゾン(1μmol)とを含有した５％ＩＭＤＭ培地を添加した後、１×１０7ＰＦＵのアデノウイルスをそれぞれ培地に添加した。ウイルス添加後、５日頃に蛍光顕微鏡で腫瘍球を観察した結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＧＦＰを培地内に投与した場合は、腫瘍球の表面でのみ制限的にＧＦＰの発現が観察された反面、デコリンを発現するアデノウイルスのｄｌ−ＧＦＰ−ＤＣＮが投与された培地で培養された腫瘍球の場合は、腫瘍球の大部分の組織からＧＦＰが強く発現されることを観察することができた(図１９ｂ)。
【０１４４】
１４．一次ケロイド細胞における、デコリンを発現するアデノウイルスの遺伝子伝達効率の検証
ケロイドは、細胞外基質の過度なる形成により現れる疾患であって、デコリンの細胞外基質分解能を利用してケロイド疾患を治療できるかどうかを調べるために、まず、ケロイド患者の組織から採取した一次ケロイド細胞株に、ｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを０．１〜５０ＭＯＩの力価でそれぞれ感染させて、二日後にＸ−ｇａｌ染色を施して観察した結果、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧ感染によるＬａｃＺ発現程度が、対照群のｄｌ−ＬａｃＺに比べ増加し、デコリンの発現により、ケロイド細胞への遺伝子伝達効率が大きく増加することを確認した(図１７)。
【０１４５】
１５．ケロイドスフェロイドモデルを利用した遺伝子伝達効率の検証
デコリン発現によるアデノウイルスのケロイド組織における遺伝子伝達の増加を調べるために、ケロイド患者の組織から採取した継代培養２世代の一次ケロイド細胞を利用して製作されたケロイドスフェロイドを、１×１０7ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスでそれぞれ感染させた後、Ｘ−ｇａｌ染色を施して組織表面を光学顕微鏡で観察した。その結果、対照群ウイルスのｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ、野生型デコリンを発現するｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスを投与したケロイドスフェロイドの表面にＸ−ｇａｌが非常に濃く染色されることを観察した(図１８のパネルＡ)。
【０１４６】
１６．ケロイド患者から採取した組織を利用した組織浸透性の検証
ケロイド細胞から構成されたケロイドスフェロイドを利用した先行の実施例を通じて確認したｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスの増加された遺伝子伝達効率が、実際のケロイド患者から採取したケロイド組織でも現れるのかを調べるために、ケロイド患者の組織から採取したケロイド組織を１×１０8ＰＦＵのｄｌ−ＬａｃＺ及びｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧアデノウイルスでそれぞれ感染させて、Ｘ−ｇａｌ染色を施した後、まず、ケロイド組織の表面を観察した。その結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与したケロイド組織の場合は、ＬａｃＺの発現程度が非常に微弱である反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与したケロイド組織の表面は、Ｘ−ｇａｌが濃く染色されたことを観察した(図１８のパネルＢ)。また、アデノウイルスのケロイド組織内浸透程度を確認するために、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドで凍結薄片した後、光学顕微鏡で観察した結果、ｄｌ−ＬａｃＺを投与したケロイド組織の場合は、表面と同様に、ケロイド組織の内部もほとんど染色されなかった反面、ｄｌ−ＬａｃＺ−ＤＣＮＧを投与した腫瘍組織のＬａｃＺ発現度は、ｄｌ−ＬａｃＺを投与した場合に比べ著しく高く、Ｘ−ｇａｌで染色された部位が、ウイルスの投与された部位に局限されず、広い部位に広がっていることを確認することができた(図１８のパネルＢ)。このような結果から、細胞外基質の分解を誘導できるデコリンを発現するアデノウイルスを利用する場合、ケロイド組織における遺伝子伝達効率が著しく増大されるだけではなく、細胞外基質の分解により、ケロイド疾患治療剤として利用することができることを確認した。
【０１４７】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１ａ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ, dl-LacZ-DCNG, dl-LacZ-DCNQ及びdl-LacZ-DCNK)と腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)のベクターマップである。ITRは、inverted terminal repeat配列、Ψは、パッケージシグナル配列、LacZは、lac Z配列、IXは蛋白質IX遺伝子、CMVは、CMVプロモーター、そして、Pol Aは、ポリA配列を示す。DCNGは、野生型デコリン遺伝子、DCNQは、野生型デコリンコア蛋白質の６番目ロイシンリッチリピート部位内にあるE180アミノ酸をE180Qで点突然変異させた変異遺伝子、そしてDCNKは、野生型デコリンコア蛋白質のE180アミノ酸をE180Kで点突然変異させた変異遺伝子を示す。
【図１ｂ】本発明の具体的な一実施例に該当する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGのより具体的なベクターマップである。
【図２】本発明のデコリン発現腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた腫瘍細胞株Hep3Bがデコリンを発現することを確認したウェスタンブロット分析結果である。
【図３ａ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(図3a)及び人体正常細胞株(図3b)におけるデコリン遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図３ｂ】本発明のデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(図3a)及び人体正常細胞株(図3b)におけるデコリン遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図４】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG, dl-lacZ-DCNQ及びdl-lacZ-DCNK)を生体外(in vitro)感染させた腫瘍球(U343, U87MG, C33A及びA549)へのウイルス浸透性を検証したX-gal染色写真である。左側パネルは、X-gal染色された腫瘍球の光学顕微鏡写真(倍率:38×)であり、右側パネルは、X-gal染色された腫瘍球の凍結薄片光学顕微鏡写真(倍率: 40×)である。
【図５】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)を生体内(in vivo)感染させた腫瘍球(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)へのウイルス浸透性を検証したLacZ染色写真である。
【図６】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)及び人体正常細胞株(CBHEL, IMR90, MRC5及びW138)における癌細胞特異的殺傷能を検証した細胞病変効果(cytopathic effect, CPE)分析結果である。
【図７ａ】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株HeP3Bにおけるプラーク形成程度を示したプレート写真(図7a)及びこれのプラーク数を概数してプラーク形成速度を示したグラフ(図7b)である。
【図７ｂ】本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)を感染させた人体腫瘍細胞株HeP3Bにおけるプラーク形成程度を示したプレート写真(図7a)及びこれのプラーク数を概数してプラーク形成速度を示したグラフ(図7b)である。
【図８ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したPI染色後のフローサイトメトリー分析結果である。図８ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図８ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、フローサイトメトリー分析結果にある数字は、subG1細胞群の比率を示す。
【図８ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したPI染色後のフローサイトメトリー分析結果である。図８ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図８ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、フローサイトメトリー分析結果にある数字は、subG1細胞群の比率を示す。
【図９ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシスと細胞壊死の程度を同時に確認したAnnexin V-PI染色及びフローサイトメトリー分析結果である。図９ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図９ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、各フローサイトメトリー分析結果において、Annexin V+/PI-の比率は、太いイタリック体で右側下に表示した。横座標は、Annexin V数値であり、縦座標は、PI数値である。
【図９ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシスと細胞壊死の程度を同時に確認したAnnexin V-PI染色及びフローサイトメトリー分析結果である。図９ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図９ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、各フローサイトメトリー分析結果において、Annexin V+/PI-の比率は、太いイタリック体で右側下に表示した。横座標は、Annexin V数値であり、縦座標は、PI数値である。
【図１０ａ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したTUNEL分析結果である。１０ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図１０ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、DNA鎖の分節化は、褐色で染色されている。
【図１０ｂ】本発明のアデノウイルスを感染させた人体腫瘍細胞株(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)における細胞アポトーシス程度を確認したTUNEL分析結果である。１０ａは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG, Ad-ΔE1B-DCNQ及びAd-ΔE1B-DCNK)であり、図１０ｂは、複製不能アデノウイルス(dl-lacZ, dl-lacZ-DCNG)の結果であって、DNA鎖の分節化は、褐色で染色されている。
【図１１ａ】腫瘍(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)が誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによる腫瘍の大きさ変化を示したグラフ(図11a)及びマウスの生存率を示したグラフ(図11b)である。
【図１１ｂ】腫瘍(U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549)が誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによる腫瘍の大きさ変化を示したグラフ(図11a)及びマウスの生存率を示したグラフ(図11b)である。
【図１２ａ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるU343腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｂ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるU87MG腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｃ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるC33A腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｄ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるHep3B腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１２ｅ】腫瘍C33Aが誘導されたマウスに感染させた本発明の腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1B-DCNGによるA549腫瘍の変化を観察したH＆E染色結果、IHC (immunohistochemical)染色結果及び細胞アポトーシスされた細胞をTUNEL分析した結果である。
【図１３】腫瘍U343(パネルA)及びU87MG(パネルB)が誘導されたマウスに感染させた腫瘍特異的殺傷アデノウイルス(Ad-ΔE1B, Ad-ΔE1B-DCNG)による腫瘍の細胞外組織にあるコラーゲン分布を確認したMasson's trichrome染色結果である。
【図１４】人体腫瘍細胞U343, U87MG, C33A, Hep3B及びA549に感染させた腫瘍特異的殺傷アデノウイルスAd-ΔE1BまたはAd-ΔE1B-DCNGによるMMP発現様相を確認したゼラチンザイモグラフィ電気泳動結果を数値化したグラフである。
【図１５】B16BL6 Spontaneous癌転移モデルを利用して、癌転移に対するデコリン発現の影響を検証した結果(上パネル)及び肺転移された腫塊の重量を数値化したグラフ(下パネル)である。
【図１６】乳房癌患者から採取した腫瘍組織及びその周辺の正常組織にデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)を投与した後の遺伝子伝達効率及び組織浸透性をX-gal染色で確認した写真である。
【図１７】デコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)を処理した一次ケロイド細胞における遺伝子伝達効率を検証したX-gal染色写真である。
【図１８】ケロイドスフェロイド(spheroid)モデルを利用して、デコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)の遺伝子伝達効率を検証したケロイド細胞球のX-gal染色写真(Aパネル)及びケロイド組織を利用してデコリン発現複製不能アデノウイルス(dl-LacZ-DCNG)の組織浸透性を検証したX-gal染色写真(Bパネル)である。
【図１９ａ】本発明の複製不能アデノウイルス(dl-GFPとdl-GFP-DCNG)を生体内(in vivo)感染させた腫瘍球(C33A)内へのウイルス浸透性を検証した蛍光顕微鏡写真である(x10)。
【図１９ｂ】乳房癌患者から採取した腫瘍組織にdl-GFPまたはdl-GFP-DCNGを投与した後の遺伝子伝達効率及び組織浸透性を確認した蛍光顕微鏡写真である(x 40)。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列及びデコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、前記目的ヌクレオチド配列の細胞内運搬効率を増加させる作用をすることを特徴とする遺伝子伝達システム。
【請求項２】
前記細胞は、細胞外基質により連結された細胞からなる組織内の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項３】
前記組織は、腫瘍組織であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項４】
前記遺伝子伝達システムは、プラスミド、組み換えアデノウイルス、アデノ−関連ウイルス(Adeno-associated viruses: AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、リポソーム、またはネオソーム(neosome)であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項５】
前記遺伝子伝達システムは、組み換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項６】
前記組み換えアデノウイルスは、Ｅ３領域が欠失されたものであって、前記デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、Ｅ３領域の位置に挿入されたことを特徴とする請求項５に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の遺伝子伝達システムを、細胞を含むバイオサンプル(biosample)に接触させる段階を含むことを特徴とする遺伝子伝達方法。
【請求項８】
アデノウイルスのＩＴＲ(inverted terminal repeat)ヌクレオチド配列及びデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させる作用をすることを特徴とする組み換えアデノウイルス。
【請求項９】
前記組み換えアデノウイルスは、Ｅ３遺伝子領域が欠失されたものであって、前記デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、前記Ｅ３遺伝子領域の位置に挿入されたことを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５遺伝子、またはＥ１Ｂ遺伝子/Ｅ１Ｂ ５５遺伝子を有することを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１】
前記組み換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含むことを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２】
(a)請求項８〜１１のいずれか一つの項に記載の組み換えアデノウイルスの治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする薬剤学的抗腫瘍組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の薬剤学的組成物を動物に投与する段階を含むことを特徴とする癌の治療方法。
【請求項１４】
(a)薬物の組織浸透性を改善するためのデコリンタンパク質、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物。
【請求項１５】
(a)デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムまたはデコリンタンパク質の治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾患または状態の治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患は、斑痕、肝硬変症、肺線維症、糸球体腎炎、成人または急性呼吸困難症、肝線維症、腎線維症、後心筋梗塞線維症、 嚢胞性線維症、線維症癌、静脈閉塞症、または腎間質線維症であることを特徴とする請求項１５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１】
細胞内に運搬しようとする目的ヌクレオチド配列及びデコリン(decorin)−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、前記目的ヌクレオチド配列の細胞内運搬効率を増加させる作用をすることを特徴とする遺伝子伝達システム。
【請求項２】
前記細胞は、細胞外基質により連結された細胞からなる組織内の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項３】
前記組織は、腫瘍組織であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項４】
前記遺伝子伝達システムは、プラスミド、組み換えアデノウイルス、アデノ−関連ウイルス(Adeno-associated viruses: AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、リポソーム、またはネオソーム(neosome)であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項５】
前記遺伝子伝達システムは、組み換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項６】
前記組み換えアデノウイルスは、Ｅ３領域が欠失されたものであって、前記デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、Ｅ３領域の位置に挿入されたことを特徴とする請求項５に記載の遺伝子伝達システム。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の遺伝子伝達システムを、細胞を含むバイオサンプル(biosample)に接触させる段階を含むことを特徴とする遺伝子伝達方法。
【請求項８】
アデノウイルスのＩＴＲ(inverted terminal repeat)ヌクレオチド配列及びデコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含み、前記デコリンは、アデノウイルスの腫瘍組織浸透能及び腫瘍細胞アポトーシス能を増大させる作用をすることを特徴とする組み換えアデノウイルス。
【請求項９】
前記組み換えアデノウイルスは、Ｅ３遺伝子領域が欠失されたものであって、前記デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列は、前記Ｅ３遺伝子領域の位置に挿入されたことを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記組み換えアデノウイルスは、非活性化されたＥ１Ｂ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５遺伝子、またはＥ１Ｂ遺伝子/Ｅ１Ｂ ５５遺伝子を有することを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１】
前記組み換えアデノウイルスは、活性のＥ１Ａ遺伝子を含むことを特徴とする請求項８に記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２】
(a)請求項８〜１１のいずれか一つの項に記載の組み換えアデノウイルスの治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする薬剤学的抗腫瘍組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の薬剤学的組成物を動物に投与する段階を含むことを特徴とする癌の治療方法。
【請求項１４】
(a)薬物の組織浸透性を改善するためのデコリンタンパク質、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む、改善された組織浸透性を有する薬剤学的組成物。
【請求項１５】
(a)デコリン−エンコーディングヌクレオチド配列を含む遺伝子伝達システムまたはデコリンタンパク質の治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む、細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾患または状態の治療用薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記細胞外基質の過度なる蓄積に係る疾病または疾患は、斑痕、肝硬変症、肺線維症、糸球体腎炎、成人または急性呼吸困難症、肝線維症、腎線維症、後心筋梗塞線維症、 嚢胞性線維症、線維症癌、静脈閉塞症、または腎間質線維症であることを特徴とする請求項１５に記載の薬剤学的組成物。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ】
【図１９ｂ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ】
【図１９ｂ】
【公表番号】特表２００８−５３１０１０（Ｐ２００８−５３１０１０Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６９７７（Ｐ２００７−５５６９７７）
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／０００６５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９１０４５
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８３１９３）インダストリー−ユニバーシティ コオペレーション ファウンデーション ヨンセイ ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＹ−ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＹＯＮＳＥＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（３０８００６３３５）
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＮ，Ｃｈａｏｅ−Ｏｋ
【出願人】（３０８００６３４６）
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＭ，Ｊｏｏ−Ｈｙｕｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２４日（２００６．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／０００６５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９１０４５
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８３１９３）インダストリー−ユニバーシティ コオペレーション ファウンデーション ヨンセイ ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＹ−ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＹＯＮＳＥＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（３０８００６３３５）
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＮ，Ｃｈａｏｅ−Ｏｋ
【出願人】（３０８００６３４６）
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＭ，Ｊｏｏ−Ｈｙｕｎ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]