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トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその検出のための方法
説明

トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその検出のための方法

【課題】植物分子生物学の分野に関し、植物に昆虫抵抗性を付与するDNA構築物、昆虫抵抗性トウモロコシ植物DAS−59122−7、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物DAS−59122−7のDNAの存在を検出するアッセイを提供する。
【解決手段】トウモロコシ植物DAS−59122−7のDNA植物発現構築物。DAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキット、プライマー。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
本発明の実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、本発明の実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するDNA構築物に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ植物DAS−59122−7に関し、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物DAS−59122−7のDNAの存在を検出するアッセイに関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ(Zea mays)植物DAS−59122−7(トウモロコシ系統DAS−59122−7またはトウモロコシイベントDAS−59122−7とも呼ばれる)に関し、さらにトウモロコシ植物DAS−59122−7のDNA植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物DAS−59122−7およびその後代における導入遺伝子/隣接挿入領域の検出に関する。
【0003】
トウモロコシは、重要な作物であり、世界の多くの地域における主要な食料源である。化学農薬などの保護対策の使用にかかわらず、害虫によって引き起こされる被害は、世界のトウモロコシ収穫高の損失の主要な要因である。このような事情に鑑みて、虫害を制御し、従来の化学農薬の必要性を減少させるために、トウモロコシなどの作物に昆虫抵抗性を付与するための遺伝子組み換えが行われてきた。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の1つの群は、Bacillus thuringiensis(B.t.)由来のδ−エンドトキシンである。δ−エンドトキシンは、綿、ジャガイモ、米、ヒマワリ、およびトウモロコシなどの作物中でうまく発現して、害虫に対して優れた制御をもたらすことが証明されている。(特許文献1、非特許文献1〜4、Bing JWら(2000)Efficacy of Cry1F Transgenic Maize,14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop,Fort Collins,CO)。
【0004】
植物における外来遺伝子の発現は、植物ゲノム中の位置によって(おそらくクロマチン構造(例えば、ヘテロクロマチン)に起因するか、または組込部位に近い転写調節因子(例えば、エンハンサー)の近接性に起因して)影響を受けることが知られている(非特許文献5)。同時に、ゲノムの異なる位置での導入遺伝子の存在は、植物の全体的な表現型に異なる方法で影響を及ぼす。このような理由で、導入された目的の遺伝子の最適な発現を特徴とするイベントを同定するために、多数のイベントのスクリーニングをすることがしばしば必要である。例えば、イベント間で、導入された遺伝子の発現レベルに幅広いバリエーションが存在し得ることが、植物および他の生物において観察されている。また、空間的または時間的な発現パターン(これは、導入された遺伝子構築物中に存在する転写調節因子から予期されるパターンに一致しない場合がある)の差異(例えば、種々の植物組織中の導入遺伝子の相対的発現における差異)も存在し得る。このため、数百から数千もの異なるイベントを作製し、これらのイベントを、商業目的のために望ましい導入遺伝子発現のレベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベントは、導入遺伝子を他の遺伝的背景に、従来の育種方法を用いた有性異系交配(sexual outcrossing)によって遺伝子移入するのに有用である。このような交配の後代は、もとの形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持している。このストラテジーは、局所的な生育条件に十分適応した多数の変種において信頼性の高い遺伝子発現を保証するために用いられる。
【0005】
特定のイベントの存在を検出可能であることは、有性交配の後代が目的の導入遺伝子を含んでいるか否かを決定するために有利である。また、特定のイベントを検出する方法は、例えば、組換え作物に由来する食品の市販前承認および表示を要する規定を遵守するために役立つか、あるいは、環境モニタリング、圃場での作物の性質のモニタリング、または収穫作物に由来する製品のモニタリングに用いるために、ならびに規制条項または契約条項の対象になる団体の遵守を保証するのに用いるために役立つ。
【0006】
当該分野で公知の任意の核酸検出方法(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または核酸プローブを用いるDNAハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない)によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などのような、頻繁に用いられる遺伝因子に焦点を当てる。なぜなら、多くのDNA構築物にとって、コード領域は交換可能であるためである。その結果、このような方法は、挿入された異種DNAに隣接する隣接DNAのDNA配列が既知でなければ、異なるイベント(特に、同じDNA構築物または非常に類似した構築物を用いて作製されたイベント)を区別するのに有用ではない場合がある。例えば、イベント特異的PCRアッセイは、選良イベントGAT−ZM1の検出について、特許文献2に記載される。従って、イベントDAS−59122−7の同定のための簡単かつ判別可能な方法を有することが所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第01/13731号パンフレット
【特許文献2】米国特許第6,395,485号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Perlak,FJら,Bio/Technology,1990年,第8巻,p.939−943
【非特許文献2】Perlak,FJ.ら,Plant Mol.Biol.,1993年,第22巻,p.313−321
【非特許文献3】Fujimoto H.ら,Bio/Technology,1993年,第11巻,p.1151−1155
【非特許文献4】Tuら,Nature Biotechnology,2000年,第18巻,p.1101−1104
【非特許文献5】Weisingら,1988年,Ann.Rev.Genet,第22巻,p.421−477
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
(発明の要旨)
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性の単子葉植物作物を作製および選択する方法に関する。より具体的には、植物細胞および植物中で発現されると昆虫に対する抵抗性を付与する、DNA構築物を提供する。本発明の1つの局面によれば、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能なDNA構築物が提供され、このDNA構築物は、植物細胞および植物中で発現されると、これらの植物細胞および植物に対して昆虫抵抗性を付与する。このDNA構築物は、PHI17662Aと称されるDNA分子から構成され、3つの導入遺伝子発現カセットを含む。第一の発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry34Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,127,180号、同第6,624,145号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン(Ubi−1)遺伝子のプロモーター、5’側非翻訳エキソン、および第1イントロンを含むDNA分子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689、ならびにChristensenおよびQuail(1996)Transgenic Res.5:213−218)を含む。DNA構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry35Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,083,499号、同第6,548,291号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするDNA分子(Hertigら(1991)Plant Mol.Biol.16:171−174)を含む。DNA構築物の第3の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーターを含むDNA分子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59を参照)に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子をコードするDNA分子(Wohlleben W.ら(1988)Gene
70:25−37)に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターのDNA分子(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を含む。このDNA構築物を含む植物も提供される。
【0010】
本発明の別の実施形態によれば、DAS−59122−7と称される新規のトウモロコシ植物を同定するための組成物および方法が提供され、これらの方法は、DAS−59122−7の5’および/または3’隣接配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。PCR反応に用いられるとトランスジェニックイベントDAS−59122−7に特有のアンプリコンを生成するプライマー配列を含む、DNA分子が提供される。これらの分子は、以下:
5’−GTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC−3’(配列番号1);
5’−CGTGCAAGCGCTCAATTCGCCCTATAGTG−3’(配列番号2);
5’−AATTGAGCGCTTGCACGTTT−3’(配列番号3);
5’−AACAACAAGACCGGCCACACCCTC−3’(配列番号4);
5’−GAGGTGGTCTGGATGGTGTAGGTCA−3’(配列番号5);
5’−TACAACCTCAAGTGGTTCCTCTTCCCGA−3’(配列番号6);
5’−GAGGTCTGGATCTGCATGATGCGGA−3’(配列番号7);
5’−AACCCTTAGTATGTATTTGTATT−3’(配列番号8);
5’−CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAG−3’(配列番号9);5’−TTTTGCAAAGCGAACGATTCAGATG−3’(配列番号10);5’−GCGGGACAAGCCGTTTTACGTTT−3’(配列番号11);
5’−GACGGGTGATTTATTTGATCTGCAC−3’(配列番号12);5’−CATCTGAATCGTTCGCTTTGCAAAA−3’(配列番号13);5’−CTACGTTCCAATGGAGCTCGACTGTC−3’(配列番号14);
5’−GGTCAAGTGGACACTTGGTCACTCA−3’(配列番号15);5’−GAGTGAAGAGATAAGCAAGTCAAAG−3’(配列番号16);5’−CATGTATACGTAAGTTTGGTGCTGG−3’(配列番号17);5’−AATCCACAAGATTGGAGCAAACGAC−3’(配列番号18)
5’−CGTATTACAATCGTACGCAATTCAG−3’(配列番号36);
5’−GGATAAACAAACGGGACCATAGAAG−3’(配列番号37)
およびこれらの相補体からなる群より選択され得る。これらの分子を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の実施形態である。さらに、これらのプライマー配列を利用する、DAS−59122−7イベントの同定のためのキットが提供される。
【0011】
本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のDAS−59122−7の特異的同定方法を開発するのに用いられ得る、本明細書中に記載されるDAS−59122−7の特異的な隣接配列に関する。より詳細には、本発明は、DAS−59122−7の5’および/または3’隣接領域(それぞれ、配列番号19(5’隣接領域)および配列番号20(3’隣接領域))に関し、これらの領域は、特異的プライマーおよびプローブの開発に用いられ得る。本発明のさらなる実施形態は、このよう特異的プライマーまたはプローブの使用に基づく、生物学的サンプル中のDAS−59122−7の存在についての同定方法に関する。
【0012】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のトウモロコシイベントDAS−59122−7に相当するDNAの存在を検出する方法が提供される。このような方法は、以下の工程を包含する:(a)DNAを含むサンプルと、DNAプライマーセット(このDNAプライマーセットは、トウモロコシイベントDAS−59122−7から抽出されたゲノムDNAと共に核酸増幅反応に用いると、トウモロコシイベントDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成する)とを接触させる工程;(b)核酸増幅反応を行うことによって、アンプリコンを生成する工程;および(c)アンプリコンを検出する工程。
【0013】
新規の導入遺伝子/隣接挿入領域(配列番号21(5’隣接領域+1000内部領域)および配列番号22(3’隣接領域+1000内部領域))を含み、かつ、配列番号21および配列番号22に相同または相補的なDNA分子は、本発明の実施形態である。
【0014】
新規導入遺伝子/隣接挿入領域を含むDNA配列(配列番号21)は、本発明の実施形態である。トウモロコシ植物DAS−59122−7に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号21のトウモロコシ植物DAS−59122−7由来のトウモロコシゲノム配列および/または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、DNA配列が挙げられる。
【0015】
さらに、新規導入遺伝子/隣接挿入領域を含むDNA配列(配列番号22)が提供される。トウモロコシ植物DAS−59122−7に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号22のトウモロコシ植物DAS−59122−7由来のトウモロコシゲノム配列および/または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、DNA配列が挙げられる。
【0016】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号21のDNA配列の少なくとも11個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むDNA配列またはその相補体、および配列番号21の類似の長さの5’隣接トウモロコシDNA配列またはその相補体が、DNA増幅方法におけるDNAプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントDAS−59122−7に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号21に相同または相補的なDNAプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【0017】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号22のDNA配列の少なくとも11個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むDNA配列またはその相補体、および配列番号22の類似の長さの3’隣接トウモロコシDNA配列またはその相補体が、DNA増幅方法におけるDNAプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントDAS−59122−7に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号22に相同または相補的なDNAプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【0018】
より具体的には、DNAプライマーセットを含む1対のDNA分子であって、配列番号18またはその相補体および配列番号1またはその相補体;配列番号2またはその相補体および配列番号17またはその相補体;配列番号10またはその相補体および配列番号9またはその相補体;配列番号8またはその相補体および配列番号17またはその相補体;ならびに配列番号36またはその相補体および配列番号37またはその相補体と同定される1対のDNA分子は、本発明の実施形態である。
【0019】
本発明のさらなる実施形態としては、配列番号18および配列番号1のDNA分子を含むアンプリコン;配列番号2および配列番号17のDNA分子を含むアンプリコン;配列番号10および配列番号9のDNA分子を含むアンプリコン;配列番号8および配列番号17のDNA分子を含むアンプリコン;ならびに配列番号36および配列番号37のDNA分子を含むアンプリコンが挙げられる。
【0020】
本発明のさらなる実施形態としては、イベントDAS−59122−7を検出するかまたは特徴付けるのに有用な、以下のプライマーが挙げられる:配列番号11またはその相補体;配列番号5またはその相補体;配列番号4またはその相補体;配列番号7またはその相補体;配列番号6またはその相補体;配列番号3またはその相補体;配列番号18またはその相補体;配列番号14またはその相補体;配列番号13またはその相補体;配列番号15またはその相補体;配列番号17またはその相補体;配列番号16またはその相補体;および配列番号12またはその相補体。さらなる実施形態としては、上記のプライマーのいずれかを組み合わせることによって生成されるアンプリコンも挙げられる。
【0021】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のDAS−59122−7イベントに対応するDNA分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程を包含する:(a)トウモロコシ植物から抽出されたDNAを含むサンプルと、DNAプローブ(トウモロコシイベントDAS−59122−7から抽出されたDNAと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物DNAとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない分子)を接触させる工程;(b)このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに(c)DNAへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。より具体的には、サンプル中のDAS−59122−7イベントに対応するDNA分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程からなる:(a)トウモロコシ植物から抽出されたDNAを含むサンプルと、DAS−59122−7イベントに特有の配列(例えば、結合配列)からなるDNAプローブ分子(このDNAプローブ分子は、トウモロコシイベントDAS−59122−7から抽出されたDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物DNAとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない)を接触させる工程;(b)このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに(c)DNAへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。
【0022】
さらに、配列番号23内のDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するキットおよび方法が提供される。
【0023】
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される、DAS−59122−7の少なくとも1つの結合配列ならびにその相補体を含む、DNA分子が提供され;この結合配列は、ゲノム中に挿入される異種DNAと、この挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞由来のDNA(すなわち、隣接DNA)との結合部をつなぎ、DAS−59122−7イベントに特徴的である。
【0024】
本発明の別の実施形態によれば、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法であって、以下の工程を包含する:(a)昆虫に対する抵抗性を付与する本発明の発現カセットを含む、第一の親トウモロコシ系統と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ系統とを有性交配させることによって、複数の後代植物を作製する工程;および(b)昆虫抵抗性の後代植物を選択する工程。このような方法は、必要に応じて、この後代植物を第二の親トウモロコシ系統に戻し交雑して、昆虫抵抗性の純粋種トウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【0025】
本発明のさらなる実施形態は、トウモロコシ細胞をDNA構築物PHI17662A(配列番号24)で形質転換する工程、この形質転換したトウモロコシ細胞を、トウモロコシ植物へと成長させる工程、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を選択する工程、およびこのトウモロコシ植物を、繁殖性のトウモロコシ植物へとさらに成長させる工程を包含する、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する方法を提供する。繁殖性のトウモロコシ植物は、適合性のトウモロコシ品種と自家受粉または交配して、昆虫抵抗性後代を作製し得る。
【0026】
本発明の別の実施形態は、さらに、生物学的サンプル中のトウモロコシイベントDAS−59122−7を同定するためのDNA検出キットに関する。このキットは、PCR同定プロトコルに用いられる、DAS−59122−7の5’または3’隣接領域を特異的に認識する第一のプライマー、およびDAS−59122−7の外来DNA内かまたは隣接DNA内の配列を特異的に認識する第二のプライマーを含む。本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントDAS−59122−7の特異的領域と80%〜100%の間の配列同一性を有する配列に相当するか、またはこの配列に相補的な配列を有する、特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントDAS−59122−7の5’または3’隣接領域の一部を含む特異的領域に相当する。
【0027】
本発明の実施形態に含まれる方法およびキットは、限定されないが、以下のような異なる目的に用いられ得る:植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品(生鮮品もしくは加工品)などの製品中のイベントDAS−59122−7を同定するために;さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料とを分離する目的で、トランスジェニック植物材料を同定するのに用いられ得る;さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トウモロコシイベントDAS−59122−7を含む植物材料の質を決定するのに用いられ得る。これらのキットはまた、検出方法の実行に必要な試薬および材料も含み得る。
【0028】
本発明のさらなる実施形態は、DAS−59122−7トウモロコシ植物またはその一部(トウモロコシ植物DAS−59122−7およびこれに由来する後代の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核、および卵子の核が挙げられるが、これらに限定されない)に関する。DNAプライマー分子が特異的アンプリコン生成物を提供する、トウモロコシ植物および種子のDAS−59122−7は、本発明の実施形態である。
【0029】
本発明の前述のおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面から、より明らかになる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
単離されたDNA分子であって、以下:
a)配列番号19に示されるヌクレオチド配列;
b)配列番号20に示されるヌクレオチド配列;
c)配列番号23に示されるヌクレオチド配列;
d)配列番号21に示されるヌクレオチド配列;および
e)配列番号22に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子。
(項目2)
DAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットであって、該キットが、配列番号19内または配列番号20内の配列を認識する、少なくとも1つの第一のプライマーを含む、キット。
(項目3)
項目2に記載のキットであって、以下:
a)配列番号24の配列;および
b)配列番号20の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、少なくとも1つの第二のプライマーをさらに含む、キット。
(項目4)
上記第一のプライマーが、以下:
a)配列番号19の配列;および
b)配列番号20の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、項目2に記載のキット。
(項目5)
上記少なくとも第一および第二のプライマーがそれぞれ、以下:
a)配列番号18および配列番号1の配列;
b)配列番号10および配列番号9の配列;
c)配列番号2および配列番号17の配列;
d)配列番号8および配列番号17の配列;ならびに
e)配列番号36および配列番号37の配列
からなる群より選択される1対の配列を含む、項目3に記載のキット。
(項目6)
トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその後代の結合部DNAに特異的なDNA検出キットであって、以下:
a)配列番号21に示されるヌクレオチド配列;および
b)配列番号22に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択される配列に相同または相補的な、DNA検出方法において機能するために十分な長さの連続するDNAポリヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を含む、DNA検出キット。
(項目7)
生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキットであって、該キットが、以下:
a)配列番号19および配列番号24の配列;ならびに
b)配列番号20および配列番号24の配列
からなる群より選択される配列にハイブリダイズし、該配列と連続する配列を含む、特異的プローブを含む、キット。
(項目8)
トウモロコシイベントDAS−59122−7およびその後代に特異的なDNAプライマーまたはプローブとして機能する、配列番号21または配列番号22に相同または相補的な十分な長さの連続するヌクレオチドの少なくとも1つのDNA分子を含む、DNA検出キット。
(項目9)
第一、第二、および第三の発現カセットを含むDNA構築物であって、
該第一の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(a)トウモロコシユビキチンプロモーター;
(b)トウモロコシユビキチン遺伝子の5’側非翻訳エキソン;
(c)トウモロコシユビキチン第1イントロン;
(d)Cry34Ab1をコードするDNA分子;および
(e)PinII転写ターミネーター
を含み;
該第二の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(i)コムギペルオキシダーゼプロモーター;
(ii)Cry35Ab1をコードするDNA分子;および
(iii)PinII転写ターミネーター
を含み;そして
該第三の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下:
(1)CaMV 35Sプロモーター;
(2)patをコードするDNA分子;および
(3)(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーター
を含む、DNA構築物。
(項目10)
項目9に記載のDNA構築物を含む植物。
(項目11)
上記植物が、トウモロコシ植物である、項目10に記載の植物。
(項目12)
生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するための方法であって、配列番号19または配列番号20内の配列を特異的に認識するプローブまたは第一のプライマーを用いて、DAS−59122−7特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
(項目13)
少なくとも2つのプライマーであって、上記第一のプライマーが、配列番号19または配列番号20内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号20または配列番号24内の配列を認識する、プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、上記生物学的サンプル中に存在する核酸からDNAフラグメントを増幅する工程をさらに包含する、項目12に記載の方法。
(項目14)
上記第一のプライマーが、配列番号19内の配列を認識し、そして上記第二のプライマーが、配列番号24内の配列を認識する、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記第一のプライマーが、配列番号20内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号20内の配列を認識する、項目13に記載の方法。
(項目16)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号18および配列番号1の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号10および配列番号9の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目18)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号2および配列番号17の配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目19)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号8および配列番号17の配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号36および配列番号37の配列を含む、項目14に記載の方法。
(項目21)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約555bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目16に記載の方法。
(項目22)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約313bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目17に記載の方法。
(項目23)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約547bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目18に記載の方法。
(項目24)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約754bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目19に記載の方法。
(項目25)
DAS−59122−7 PCR同定プロトコルを用いて、約104bpのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目20に記載の方法。
(項目26)
生物学的サンプル中のトウモロコシイベントDAS−59122−7またはその後代の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該生物学的サンプルからDNAサンプルを抽出する工程;
(b)以下:
i)配列番号18および配列番号1の配列;
ii)配列番号10および配列番号9の配列;
iii)配列番号2および配列番号17の配列;ならびに
iv)配列番号8および配列番号17の配列
からなる群より選択される、1対のDNAプライマー分子を提供する工程;
(c)DNA増幅反応条件を提供する工程;
(d)該DNA増幅反応を行って、DNAアンプリコン分子を生成する工程;ならびに
(e)該DNA増幅反応における該DNAアンプリコン分子の検出が、トウモロコシイベントDAS−59122−7の存在を示す、該DNAアンプリコン分子を検出する工程を包含する、方法。
(項目27)
項目26に記載の方法によって生成されるアンプリコンのいずれか1つを含む、単離されたDNA分子。
(項目28)
サンプル中のDAS−59122−7イベントに対応するDNAの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)トウモロコシDNAを含む該サンプルと、ポリヌクレオチドプローブであって、該ポリヌクレオチドプローブは、トウモロコシイベントDAS−59122−7由来のDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、非DAS−59122−7トウモロコシ植物DNAとは該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに
(c)該DNAへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ハイブリダイゼーションの検出が、DAS−59122−7イベントの存在を示す、工程
を包含する、方法。
(項目29)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、単離されたDNAヌクレオチドプライマー配列。
(項目30)
配列番号1、2、8、9、10、17および18からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、項目29に記載の単離されたDNAヌクレオチドプライマー配列。
(項目31)
第一のDNA分子および第二のDNA分子を含む、1対のDNA分子であって、該DNA分子が、DAS−59122−7トウモロコシ植物またはその後代から抽出されるDNAに特徴的なDNAプライマーまたはプローブとして機能するために、以下:
a)配列番号21に示される配列またはその相補体;および
b)配列番号22に示される配列またはその相補体
からなる群より選択される配列の、十分な長さの連続するヌクレオチドのDNA分子。
(項目32)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される配列ならびにその相補体を含む結合配列を含む、単離されたDNA分子。
(項目33)
種子サンプル中の配列番号19もしくは配列番号20内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、DAS−59122−7特異的領域の検出を包含する、種子純度を確認する方法。
(項目34)
イベントDAS−59122−7の存在について種子をスクリーニングする方法であって、種子ロットのサンプル中の配列番号19または配列番号20内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、DAS−59122−7特異的領域の検出を包含する、方法。
(項目35)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するDNAが、植物ゲノムの一部を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部。
(項目36)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するDNAが、植物ゲノムの一部を形成する、項目35に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の子孫植物。
(項目37)
項目35または36に記載の植物の種子。
(項目38)
項目35または36に記載の植物と交配させる工程、ならびに、配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列ならびにその相補体について分析することにより後代を選択する工程を包含する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法。
(項目39)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離されたDNA配列。
(項目40)
各々が少なくとも10個のヌクレオチドを含み、かつ、DNA増幅手順において一緒に用いられた場合にイベントDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成する、1対の単離されたDNA配列。
(項目41)
各々の配列が、以下:
a)配列番号21の配列;および
b)配列番号22の配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列の中から選択される、項目40に記載の1対の単離されたDNA配列。
(項目42)
トウモロコシ組織中のDAS−59122−7イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)プライマー対の各々が、配列番号21または配列番号22由来の少なくとも10個のヌクレオチドを含み、該プライマー対の各メンバーが、上記DAS−59122−7イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、プライマー対を選択する工程;
(b)該トウモロコシ組織のサンプルを該プライマー対と接触させる工程;
(c)DNA増幅を行い、そしてアンプリコンについて分析する工程
を包含する、方法。
(項目43)
上記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37またはその相補体からなる群より選択される、項目42に記載の方法。
(項目44)
トウモロコシ組織中のDAS−59122−7イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該トウモロコシ組織のサンプルを、配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される1つ以上のDNA配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる工程;
(b)該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程;ならびに
(c)該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程
を包含する、方法。
(項目45)
配列番号32、33、34、および35からなる群より選択される1つ以上のDNA配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブを含む、DNA検出キット。
(項目46)
プライマー対の各々が、配列番号21および配列番号22の中から少なくとも10個のヌクレオチドを含む、プライマー対を含むDNA検出キットであって、該プライマー対の各々が、上記DAS−59122−7イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、DNA検出キット。
(項目47)
上記プライマー対が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、36および37ならびにその相補体からなる群より選択される、項目46に記載のDNA検出キット。
(項目48)
配列番号23内のDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するためのキット。
(項目49)
配列番号23内のDAS−59122−7特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のDAS−59122−7を同定するための方法。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1−1】図1は、トランスジェニック挿入物PHI17662A、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すDNA配列(配列番号23)である。5’境界領域および3’境界領域(それぞれ、bp1〜bp2593およびbp9937〜bp11922)に下線を引いている。形質転換プラスミドPHP17662との比較に基づく2つのヌクレオチドの相違(bp6526およびbp6562)は、太字および下線で記載される。
【図1−2】図1は、トランスジェニック挿入物PHI17662A、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すDNA配列(配列番号23)である。5’境界領域および3’境界領域(それぞれ、bp1〜bp2593およびbp9937〜bp11922)に下線を引いている。形質転換プラスミドPHP17662との比較に基づく2つのヌクレオチドの相違(bp6526およびbp6562)は、太字および下線で記載される。
【図1−3】図1は、トランスジェニック挿入物PHI17662A、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すDNA配列(配列番号23)である。5’境界領域および3’境界領域(それぞれ、bp1〜bp2593およびbp9937〜bp11922)に下線を引いている。形質転換プラスミドPHP17662との比較に基づく2つのヌクレオチドの相違(bp6526およびbp6562)は、太字および下線で記載される。
【図1−4】図1は、トランスジェニック挿入物PHI17662A、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すDNA配列(配列番号23)である。5’境界領域および3’境界領域(それぞれ、bp1〜bp2593およびbp9937〜bp11922)に下線を引いている。形質転換プラスミドPHP17662との比較に基づく2つのヌクレオチドの相違(bp6526およびbp6562)は、太字および下線で記載される。
【図2】図2は、B.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の3つの別個の部分に分かれている;トウモロコシゲノムDNAを含む5’境界領域、インタクトなT−DNA挿入物、およびトウモロコシゲノムDNAを含む3’境界領域。挿入物の概略図の下の2つの矢印は、5’および3’ゲノムウォーキングフラグメントに由来する配列の始点および終点を示している。挿入物の概略図の下の他のボックスは、イベントDAS−59122−7のゲノムDNAから増幅され、インタクトなT−DNA挿入物ならびに5’および3’挿入物/境界結合領域にわたって配列決定された、PCRフラグメントを表す。
【図3】図3は、B.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の3つの別個の部分に分かれている;トウモロコシゲノムDNAを含む5’境界領域、インタクトなT−DNA挿入物、およびトウモロコシゲノムDNAを含む3’境界領域。挿入物の概略図の下のボックスは、ゲノム境界領域に位置するか、またはイベントDAS−59122−7由来のゲノムDNAから増幅されたトウモロコシゲノムDNAを含むT−DNA挿入物の5’および3’結合領域を横断して位置する、PCRフラグメントを表す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
(詳細な説明)
以下の定義および方法は、本発明をよりよく規定し、かつ、本発明の実施において当業者を導くために提供される。他に断らない限り、用語は、関連分野の当業者によって慣例的用法に従って理解されるべきである。分子生物学の共通語の定義は、Riegerら,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,第5版,Springer−Verlag;New York,1991;およびLewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994にも見出され得る。米国特許法施行規則1.822に示されるようなDNA塩基に関する命名法が用いられる。
【0032】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」とは、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。
【0033】
本明細書中で使用される場合、用語「トウモロコシ(corn)」とは、Zea maysまたはトウモロコシ(maize)を意味し、野生種トウモロコシを含む、トウモロコシと交配され得るすべての植物品種を含む。
【0034】
本明細書中で使用される場合、用語「DAS−59122−7特異的」とは、植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品(生鮮品もしくは加工品)などの製品中のイベントDAS−59122−7を差別的に同定するのに適したヌクレオチド配列をいう。
【0035】
本明細書中で使用される場合、用語「昆虫抵抗性」および「害虫に影響を与える」とは、任意の発育段階で、昆虫の摂食、成長、および/または行動に変化を生じさせることをいい、この変化としては以下が挙げられるが、これらに限定されない:昆虫の殺虫;成長の遅延;生殖能力の抑制;摂食の阻害;など。
【0036】
本明細書中で使用される場合、用語「殺虫活性」および「殺虫力」は、多数のパラメータによって測定され得る、生物または物質(例えば、タンパク質など)の活性をいうために同義的に用いられ、これらのパラメータとしては、この生物または物質を餌として常食した後、および/あるいはこの生物または物質に適当な時間曝露した後の、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避性、ならびに害虫の他の行動変化および物理的変化が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「殺虫性タンパク質」は、それ自体で、または他のタンパク質と組み合わせて、殺虫活性を示すタンパク質である。
【0037】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「コードする」または「コードされる」は、特定の核酸に関連して使用される場合には、この核酸が、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を誘導するのに必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされている情報は、コドンの使用により特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列(例えば、イントロン)を含んでいてもよく、このような介在性の非翻訳配列を欠いていてもよい(例えば、cDNAのように)。
【0038】
「遺伝子」とは、コード配列の前の調節配列(5’非コード配列)およびコード配列の後の調節配列(3’非コード配列)を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをいう。「天然型遺伝子」とは、遺伝子自体の調節配列とともに天然に見出されるような遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されることのない調節配列およびコード配列を含む、天然型遺伝子ではない任意の遺伝子をいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または、同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置に存在する天然型遺伝子をいう。「外来」とは、所定の位置には通常見出されない材料をいう。従って、「外来DNA」は、組換えDNAと、新たに導入され再配列された植物DNAの両方を含み得る。「外来」遺伝子とは、宿主生物中で通常見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子をいう。外来遺伝子は、非天然型の生物中に挿入された天然型遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。組換DNAが挿入された、植物ゲノム中の部位は、「挿入部位」または「標的部位」と呼ばれ得る。
【0039】
本明細書中で使用される場合、「挿入DNA」とは、植物材料を形質転換するのに用いられる発現カセット内の異種DNAをいい、一方、「隣接DNA」は、植物などの生物中に天然に存在するゲノムDNAか、元の挿入DNA分子(例えば、形質転換事象に関与するフラグメント)にとって外来性の、形質転換プロセスによって導入された外来(異種)DNAのいずれかで存在し得る。「隣接領域」または「隣接配列」とは、本明細書中で使用される場合、元の外来挿入DNA分子のすぐ上流に隣接して、または、元の外来挿入DNA分子のすぐ下流に隣接して位置する、少なくとも20塩基対、好ましくは少なくとも50塩基対、そして最大5000塩基対までの配列をいう。外来DNAのランダムな組み込みを引き起こす形質転換手順により、各形質転換体に特徴的かつ特有の異なる隣接領域を含む形質転換体が生じる。組換えDNAが従来の交配によって植物に導入される場合、その隣接領域は、一般に変化しない。形質転換体はまた、1つの異種挿入DNAとゲノムDNAの断片間に、または2つのゲノムDNAの断片間に、または2つの異種DNAの断片間に、特有の結合部を含む。「結合部」は、2つの特定のDNAフラグメントが結合する点である。例えば、結合部は、挿入DNAが隣接DNAと結合するところに存在する。2つのDNAフラグメントが、天然の生物において見出される様式を改変した様式で結合する、形質転換生物にも、結合点が存在する。「結合部DNA」とは、結合点を含むDNAをいう。
【0040】
本明細書中で使用される場合、核酸に関する「異種」は、外来種が起源であるか、あるいは同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、組成および/または遺伝子座がその天然型から実質的に改変されている核酸である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結するプロモーターは、このヌクレオチド配列が由来する種とは異なる種に由来し得るか、あるいは同じ種に由来する場合は、プロモーターは、天然にはこのヌクレオチド配列に作動可能に連結して見出されない。異種タンパク質は、外来種が起源であってもよく、または同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、その本来の型から実質的に改変されている。
【0041】
「調節配列」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、コード配列内、またはコード配列の下流(3’非コード配列)に位置するヌクレオチド配列をいい、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【0042】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性RNAの発現を制御し得るヌクレオチド配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して3’側に位置する。プロモーター配列は、近位の上流因子およびより遠位の上流因子からなり、後者のより遠位の上流因子は、しばしばエンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るヌクレオチド配列であり、かつ、プロモーターの内在的な因子であっても、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種因子であってもよい。プロモーターは、その全体が天然型遺伝子に由来してもよく、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子で構成されていてもよく、さらには合成ヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターは、異なる組織型または細胞型において、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を行わせ得ることが、当業者に理解される。核酸フラグメントを、ほとんどの細胞型においてほとんどいつでも発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な、種々の型の新しいプロモーターは、常に発見され続けており、多数の例が、OkamuroおよびGoldbergによる編集物(1989)Biochemistry of Plants 15:1−82に見出され得る。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さの核酸フラグメントが同じプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【0043】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するヌクレオチド配列をいう。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたmRNAに存在する。翻訳リーダー配列は、mRNAの一次転写物のプロセシング、mRNA安定性および/または翻訳効率を含む、多数のパラメータに影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は、記載されている(TurnerおよびFoster(1995)Mol.Biotechnol.3:225−236)。
【0044】
「3’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列をいい、ポリアデニル化認識配列、およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸部分(polyadenylic acid tract)の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる3’非コード配列の使用は、Ingelbrechtら(1989)Plant Cell 1:671−680に例示される。
【0045】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード配列によって決定される特定の順序で配列される、アミノ酸の鎖である。
【0046】
DNA構築物は、1つ以上の発現カセットを提供する、連結されたDNA分子の集合体である。DNA構築物は、細菌細胞中で自己複製することが可能であり、かつ、機能的な遺伝因子(すなわち、中でも、プロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、3’終結領域)を提供するDNA分子を導入するのに有用な、種々のエンドヌクレアーゼ酵素の制限部位を含むプラスミドであってもよく;あるいは、DNA構築物は、DNA分子の直鎖状の集合体(例えば、発現カセット)であってもよい。DNA構築物中に含まれる発現カセットは、メッセンジャーRNAの転写をもたらすのに必要な遺伝因子を含む。発現カセットは、原核細胞または真核細胞中で発現されるように設計され得る。本発明の実施形態の発現カセットは、植物細胞中で発現されるように設計される。
【0047】
本発明の実施形態のDNA分子は、目的の生物における発現のための発現カセット中に提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された5’および3’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していることを意味し、そして2つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には、これらの核酸配列が隣接し、かつ同じリーディングフレーム中に存在することを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーター配列と第二の配列の間の機能的結合を指すことが意図され、このプロモーター配列が、第二の配列に相当するDNA配列の転写を開始させ、かつ媒介する。このカセットは、生物に同時形質転換される少なくとも1つのさらなる遺伝子をさらに含み得る。あるいは、さらなる遺伝子(単数または複数)が、複数の発現カセットまたは複数のDNA構築物上に提供され得る。
【0048】
発現カセットは、5’から3’の転写方向に、以下を含む:宿主としての役割を果たす生物において機能的な、転写および翻訳開始領域、コード領域、ならびに転写および翻訳終結領域。転写開始領域(すなわち、プロモーター)は、宿主生物にとって天然または類似であっても、あるいは外来または異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列であっても、あるいは合成配列であってもよい。発現カセットは、発現カセット構築物中に5’リーダー配列をさらに含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を促進するように作用し得る。
【0049】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック(transgenic)」は、その遺伝子型が、異種核酸の存在によって改変された、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位、または植物(最初にそのように改変されたこれらのトランスジェニック、およびこの最初のトランスジェニックからの有性交配または無性増殖によって作製されたものを含む)を含むと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック」は、従来の植物育種方法によるか、または天然に存在するイベント(例えば、ランダムな交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異)による、ゲノム(染色体のまたは染色体外の)の改変を含まない。
【0050】
トランスジェニック「イベント」は、目的の導入遺伝子を含む核酸発現カセット、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入によって生じる植物個体群の再分化、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる特定の植物の選択を含む、異種DNA構築物(単数または複数)を用いた植物細胞の形質転換によって作製される。イベントは、導入遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」はまた、形質転換体と異種DNAを含む別の変種との間の有性異系交配によって作製された後代をいう。反復親への戻し交配が繰り返された後でさえ、形質転換親由来の挿入DNAおよび隣接DNAは、同じ染色体位置で交配の後代に存在する。用語「イベント」はまた、挿入DNAおよびこの挿入DNAに直接隣接した隣接配列を含む、もとの形質転換体由来のDNAをいい、この隣接配列は、挿入DNAを含む親株(例えば、もとの形質転換体および自家受粉により生じる後代)と挿入DNAを含まない親株との有性交配の結果として、目的の導入遺伝子を含む挿入DNAを受け取る後代に移入されることが予期される。
【0051】
昆虫抵抗性DAS−59122−7トウモロコシ植物は、以下の工程によって育種され得る:昆虫抵抗性を付与する本発明の実施形態の発現カセットを用いた形質転換によって誘導された、トランスジェニックDAS−59122−7トウモロコシ植物およびその後代から成長したトウモロコシ植物からなる第一の親トウモロコシ植物と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ植物との第一の有性交配によって、複数の第一の後代植物を作製する工程;次いで、昆虫に対して抵抗性を示す第一の後代植物を選択する工程;およびこの第一の後代植物を自家受粉させることによって、複数の第二の後代植物を作製する工程;次いで、この第二の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択する工程。これらの工程は、第一の昆虫抵抗性後代植物または第二の昆虫抵抗性後代植物を、第二の親トウモロコシ植物または第3の親トウモロコシ植物に戻し交雑することにより、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【0052】
本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、全植物体、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、およびそれらの後代への言及を含む。予め本発明のDNA分子で形質転換されており、従って少なくとも部分的にトランスジェニック細胞からなる、トランスジェニック植物またはそれらの後代を起源とする、例えば植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、ならびに花、茎、果実、葉、および根を含む、本発明の範囲内にあると理解されるトランスジェニック植物の部位もまた、本発明の実施形態である。
【0053】
本明細書中で使用される場合、用語「植物細胞」は、限定されないが、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。本発明の方法に用いられ得る植物のクラスは、一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む、形質転換技術を受け入れ可能な高等植物のクラスと同程度に広い。
【0054】
「形質転換」とは、遺伝学的に安定した遺伝を生じる、宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物という。植物の形質転換方法の例としては、Agrobacterium媒介性の形質転換(De Blaereら(1987)Meth.Enzymol.143:277)および粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術(Kleinら(1987)Nature(London)327:70−73;米国特許第4,945,050号、本明細書中に参考として援用される)が挙げられる。さらなる形質転換方法は、以下に開示される。
【0055】
このように、本発明の単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能な、組換え構築物(典型的には、DNA構築物)中に組み込まれ得る。このような構築物は、ポリペプチドのコード配列を所定の宿主細胞内で転写および翻訳することが可能な複製系および配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定なトランスフェクションに適した、またはトランスジェニック植物の構築に適した多数のベクターは、例えば、Pouwelsら(1985;補遺、1987)Cloning Vectors:A Laboratory Manual,WeissbachおよびWeissbach(1989)Methods for Plant Molecular Biology,(Academic Press,New York);ならびにFlevinら(1990)Plant Molecular Biology Manual,(Kluwer Academic Publishers)に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、5’および3’調節配列の転写制御下に1つ以上のクローン化植物遺伝子ならびに優性選択マーカーを含む。このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域(例えば、誘導性もしくは構成的発現、環境的にもしくは発生的に調節された発現、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域)、転写開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位、および/またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【0056】
2つの異なるトランスジェニック植物を交配して、2つの独立的に分離している付加された外来遺伝子を含む子孫を作製することも可能であることも、理解されるべきである。適切な後代の自家受粉により、両方の付加された外来遺伝子のホモ接合体である植物を作製し得る。親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配もまた、栄養体生殖と同様に企図される。種々の形質および作物に一般に用いられる他の育種方法の記載は、いくつかの参考文献の1つに見出され得る(例えば、Fehr、Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcos J.編,American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987))。
【0057】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子(例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素)が付着された単離核酸である。このようなプローブは、標的核酸鎖(本発明の場合には、トウモロコシイベントDAS−59122−7由来のDNAを含むサンプルに由来するか、またはトウモロコシ植物に由来する、トウモロコシイベントDAS−59122−7由来の単離DNA鎖)に相補的である。本発明に従うプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のみならず、ポリアミド、および標的DNA配列に特異的に結合してこの標的DNA配列の存在を検出するのに用いられ得る、他のプローブ材料も含む。
【0058】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的DNA鎖にアニールされて、プライマーと標的DNA鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)によって標的DNA鎖に沿って伸長される、単離核酸である。本発明のプライマー対とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用をいう。「PCR」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のDNAセグメントの増幅に用いられる技術である(米国特許第4,683,195号および同第4,800,159号を参照のこと;これらは本明細書中に参考として援用される)。
【0059】
プローブおよびプライマーは、操作者によって決定されたハイブリダイゼーション条件または反応条件において、標的DNA配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択された検出方法に役立つのに十分な長さの任意の長さであってもよい。一般に、11ヌクレオチド以上、18ヌクレオチド以上、および22ヌクレオチド以上の長さが用いられる。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズする。標的DNA配列と異なり、かつ標的DNA配列にハイブリダイズする能力を保持しているプローブが、従来の方法によって設計され得るが、本発明の実施形態に従うプローブおよびプライマーは、標的配列と隣接するヌクレオチドの完全なDNA配列類似性を有し得る。プローブは、プライマーとして用いられ得るが、一般に、標的DNAまたはRNAに結合するように設計されており、増幅プロセスでは用いられない。
【0060】
特異的プライマーは、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7を同定するための「特異的プローブ」として用いられ得るアンプリコンを生成するために、組込みフラグメントを増幅するのに用いられ得る。プローブが、生物学的サンプルの核酸と、プローブのサンプルへの結合を可能にする条件下でハイブリダイズされる場合、この結合は検出され得るので、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7の存在を示すことが可能になる。このような結合プローブの同定は、当該分野で記載されている。本発明の実施形態において、特異的プローブは、最適条件下でイベントの5’または3’隣接領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、そしてまた、この領域と隣接する外来DNAの一部を含む配列である。特異的プローブは、イベントの特定の領域に対して、少なくとも80%の、80〜85%の間の、85〜90%の間の、90〜95%の間の、および95〜100%の間の同一性(または相補性)を有する配列を含み得る。
【0061】
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1−3巻,Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1989(以下、「Sambrookら、1989」);Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York,1992(定期更新)(以下、「Ausubelら、1992」);およびInnisら、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990に記載される。PCRプライマー対は、例えば、Vector NTIバージョン6(Informax Inc.,Bethesda MD);PrimerSelect(DNASTAR Inc.,Madison,WI);およびPrimer(バージョン0.5(著作権),1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)のPCRプライマー分析ツールのような、その目的を意図したコンピュータープログラムを用いて、既知の配列から得られ得る。さらに、この配列が視覚的にスキャンされ得、そしてプライマーが当業者に公知のガイドラインを用いて手動で同定される。
【0062】
本明細書中で使用される場合、「キット」とは、本発明の方法の実施形態(より詳細には、生物学的サンプル中のイベントDAS−59122−7の同定)を実行するための試薬一式をいう。本発明のキットが用いられ得、その構成要素は、品質管理(例えば、種子ロットの純度)の目的、植物材料あるいは植物材料を含むかまたは植物材料に由来する材料(例えば、限定されないが、食品または飼料製品)中のイベントDAS−59122−7を検出する目的のために、特別に調整され得る。本明細書中で使用される場合、「植物材料」とは、植物から得られるか、または植物に由来する材料をいう。
【0063】
本明細書中に開示される隣接DNA配列および挿入配列に基づくプライマーならびにプローブは、従来の方法によって(例えば、このような配列をリクローニングし、かつ配列決定することによって)、開示された配列を確認するために(そして必要な場合には、補正するために)用いられ得る。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的DNA配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法が、サンプル中のトランスジェニックイベント由来のDNAの存在を同定するのに用いられ得る。核酸分子またはそのフラグメントは、ある特定の状況下で、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る。本明細書中で使用される場合、2つの核酸分子は、これらの2つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成し得る場合、互いに特異的にハイブリダイズし得るといわれる。
【0064】
核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書中で使用される場合、分子は、これらの分子の1つのすべてのヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すといわれる。2つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「最低限に相補的」であるといわれる。同様に、これらの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「相補的」であるといわれる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら(1989)およびHaymesら(Nucleic Acid Hybridization,a Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.(1985))によって記載されており、従って、完全な相補性からの逸脱は、このような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げることのない限り、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、用いられる特定の溶媒および塩濃度下で安定な二本鎖構造が形成され得るのに十分に相補的な配列であることが必要であるにすぎない。
【0065】
ハイブリダイゼーション反応における特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。熱融点(Tm)は、相補的な標的配列の50%が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度およびpHで)である。DNA−DNAハイブリッドについては、Tmは、以下のMeinkothおよびWahlの式(1984年、Anal.Biochem.138:267−284)から概算され得る:Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)−0.61(%form)−500/L;式中、Mは、1価カチオンのモル濃度であり、%GCは、DNA中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、%formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてLは、ハイブリッドの塩基対長さである。Tmは、1%のミスマッチにつき約1℃低下する;従って、Tm、ハイブリダイゼーション、および/または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、90%よりも高い同一性を有する配列が求められる場合、Tmを10℃低下させ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特定の配列およびその相補体についてのTmよりも約5℃低く選択される。しかし、厳しくストリンジェントな条件は、Tmよりも1、2、3、または4℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得;中程度にストリンジェントな条件は、Tmよりも6、7、8、9、または10℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得;低いストリンジェンシーの条件は、Tmよりも11、12、13、14、15、または20℃低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用し得る。
【0066】
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるTmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび/または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が45℃(水溶液)または32℃(ホルムアミド溶液)よりも低いTmを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにSSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes、第1部、第2章(Elsevier,New York);およびAusubelら編(1995)Current Protocols in Molecular Biology、第2章(Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York)に見出される。Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)を参照のこと。
【0067】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較される核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件(例えば、約45℃にて6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)の後、50℃にて2×SSCの洗浄)は、当業者に公知であるか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6において見出され得る。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.5M Naイオン未満であり、典型的には約0.01〜1.0M Naイオン濃度(または他の塩)(pH7.0〜8.3)であり、そして温度が、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃であり、そして長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより大きい)については少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤(例えば、ホルムアミド)の添加によって達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、30〜35%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝溶液を用いた37℃におけるハイブリダイゼーション、および50〜55℃における1×〜2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム)中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、40〜45%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS中の37℃におけるハイブリダイゼーション、および55〜60℃における0.5×〜1×SSC中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDS中の37℃におけるハイブリダイゼーション、および60〜65℃における0.1×SSC中の洗浄が挙げられる。本発明の核酸は、中程度にストリンジェントな条件下で、DAS−59122−7イベントまたはその相補体あるいはそのいずれかのフラグメントに特有の1つ以上の核酸分子に、特異的にハイブリダイズし得る。
【0068】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。従って、任意の2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学アルゴリズムの非限定的な例は、MyersおよびMiller(1988)CABIOS 4:11−17のアルゴリズム;Smithら(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所的相同性アルゴリズム;NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443−453の相同性アラインメントアルゴリズム;PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444−2448の類似性検索方法;KarlinおよびAltschul(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA 87:2264のアルゴリズム(KarlinおよびAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877におけるように改変)である。
【0069】
これらの数学アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。このような実行としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:PC/Geneプログラム(Intelligenetics,Mountain View,Californiaから入手可能)のCLUSTAL;ALIGNプログラム(バージョン2.0);ALIGN PLUSプログラム(バージョン3.0,著作権 1997);ならびにWisconsin Genetics Software Package,バージョン10(Accelrys,9685 Scranton Road,San Diego,CA 92121,USAから入手可能)のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA。これらのプログラムを使用するアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実行され得る。
【0070】
CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp,Gene 73:237−244(1988);HigginsおよびSharp,CABIOS 5:151−153(1989);Corpetら、Nucleic Acids Research 16:10881−90(1988);Huangら、Computer Applications in the Biosciences 8:155−65(1992)、ならびにPearsonら、Methods in Molecular Biology 24:307−331(1994)によって、十分に記載されている。ALIGNプログラムおよびALIGN PLUSプログラムは、MyersおよびMiller(1988)前出のアルゴリズムに基づく。Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403のBLASTプログラムは、KarlinおよびAltschul(1990)前出のアルゴリズムに基づく。データベース類似性検索に用いられ得るプログラムのBLASTファミリーとしては、以下が挙げられる:ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのBLASTN;タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのBLASTX;タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのBLASTP;ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのTBLASTN;ならびにヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのTBLASTX。Current Protocols in Molecular Biology,第19章,Ausubelら編,Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York(1995)を参照のこと。アラインメントはまた、目視検査によって手動で実行され得る。
【0071】
比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Gapped BLAST(BLAST 2.0中)が、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されるように利用され得る。あるいは、PSI−BLAST(BLAST 2.0中)が、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行するために用いられ得る。Altschulら(1997)前出を参照のこと。BLAST、Gapped BLAST、PSI−BLASTを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、ヌクレオチド配列のためのBLASTN、タンパク質のためのBLASTX)が用いられ得る。www.ncbi.hlm.nih.gov.を参照のこと。
【0072】
本明細書中で使用される場合、2つの核酸配列またはポリペプチド配列との関連において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である2つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性パーセントが使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって、しばしば異なることが理解される。このような保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存的置換をスコア付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が1のスコアを与えられ、そして非保存的置換が0のスコアを与えられる場合、保存的置換は、0と1との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムPC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)において実行されるように計算される。
【0073】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された2つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列(これは、付加または欠失を含まない)と比較して、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。この割合(%)は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、このマッチ位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に100をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【0074】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅(例えば、PCRによる)に関して、「ストリンジェントな条件」は、DNA熱増幅反応において、プライマー対が、標的核酸配列(この標的核酸配列に、対応する野生型配列を有するプライマー(またはその相補体)が結合し、好ましくは特有の増幅産物(アンプリコン)を産生する)にのみハイブリダイズすることを可能にする条件である。
【0075】
用語「(標的配列)に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含むサンプル中の標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【0076】
本明細書中で使用される場合、「増幅したDNA」または「アンプリコン」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅産物をいう。例えば、有性交配の結果得られたトウモロコシ植物が、本発明のトウモロコシ植物に由来するトランスジェニックイベントゲノムDNAを含むか否かを決定するために、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出されたDNAを、DNAプライマー対(挿入された異種DNAの挿入部位に隣接する隣接配列に由来する第一のプライマー、および挿入された異種DNAに由来し、イベントDNAの存在の診断に用いるアンプリコンを生成する第二のプライマーを含む)を用いた核酸増幅方法に供し得る。あるいは、第二のプライマーは、隣接配列に由来し得る。アンプリコンは、イベントに特徴的でもある長さおよび配列を有する。アンプリコンは、プライマー対に1ヌクレオチド塩基対を合わせた長さから、DNA増幅プロトコルによって生成可能なアンプリコンの任意の長さまでの長さの範囲であり得る。あるいは、プライマー対は、PHI17662A発現構築物の挿入ヌクレオチド配列全体およびトランスジェニック挿入物に隣接する配列を含む、アンプリコン(図1(配列番号23)を参照、サイズ約12Kb)を生成するように、挿入DNAの両側の隣接配列から得られ得る。隣接配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入DNA配列から距離を置いて配置されてもよく、この距離は、1ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界までか、または約2万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、DNA熱増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを特異的に排除する。
【0077】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、当該分野で公知の種々の核酸増幅方法のいずれかによっても達成され得る。種々の増幅方法が当該分野で公知であり、とりわけ、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号ならびにPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innisら編,Academic press,San Diego,1990に記載される。PCR増幅方法は、22Kb以下のゲノムDNAおよび42Kb以下のバクテリオファージDNAを増幅するために開発された(Chengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695−5699,1994)。これらの方法およびDNA増幅の分野で公知の他の方法は、本発明の実施形態の実施に用いられ得る。特定のPCRプロトコルにおける多数のパラメータは、特定の実験室条件に調整される必要があり得、わずかに変更され得るが、なおも類似の結果の収集を可能にすることが理解される。これらの調整は、当業者には明らかである。
【0078】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出され得、その技術としては、Genetic Bit Analysis(Nikiforovら,Nucleic Acid Res.22:4167−4175,1994)(ここでは、隣接する隣接DNA配列および挿入DNA配列の両方と重複する、DNAオリゴヌクレオチドが設計される)が挙げられるが、これに限定されない。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル中に固定化される。目的の領域のPCR(挿入配列中に1つのプライマーおよび隣接する隣接配列中に1つのプライマーを用いて)の後、一本鎖PCR産物は、固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、そしてDNAポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ddNTPを用いた、一塩基伸長反応のためのテンプレートとして機能する。読み出しは、蛍光であっても、またはELISAベースであってもよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、挿入/隣接配列の存在を示す。
【0079】
別の検出方法は、Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18−24,2000)によって記載されるようなパイロシーケンシング技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するDNAと挿入DNAの接合部に重複するように設計されている。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖PCR産物(挿入配列中に1つのプライマーおよび隣接配列中に1つのプライマー)にハイブリダイズされ、そしてDNAポリメラーゼ、ATP、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン5’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。dNTPは個々に添加され、そして取り込みにより、測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基または多塩基伸長による、導入遺伝子挿入/隣接配列の存在を示す。
【0080】
Chenらによって記載されるような蛍光偏光(Genome Res.9:492−498,1999)もまた、本発明のアンプリコンを検出するために用いられ得る方法である。この方法を用いて、オリゴヌクレオチドは、隣接および挿入DNAの接合部と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖PCR産物(挿入DNA中に1つのプライマーおよび隣接DNA配列中に1つのプライマー)にハイブリダイズされ、そしてDNAポリメラーゼおよび蛍光標識ddNTPの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長により、ddNTPの取り込みを生じる。取り込みは、蛍光光度計を用いて、偏光の変化として測定され得る。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、導入遺伝子挿入/隣接配列の存在を示す。
【0081】
Taqman(登録商標)(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)は、DNA配列の存在を検出および定量する方法として記載されており、製造業者によって提供される説明書で十分に理解される。手短に言うと、FRETオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入DNAの接合部に重複するように設計されている。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DNA配列中に1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中に1つのプライマー)は、耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルされる。FRETプローブのハイブリダイゼーションによって、FRETプローブのクエンチング部分から、蛍光部分の切断および遊離が生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接/導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【0082】
分子ビーコンは、Tyangiら(Nature Biotech.14:303−308,1996)に記載されるような配列検出における使用のために記載されている。手短に言えば、FRETオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入DNAの接合部に重複するように設計されている。FRETプローブの特有の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分を近接した状態で保持する二次構造を含むものとなる。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DNA配列中に1つのプライマーおよび隣接配列中に1つのプライマー)は、耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルされる。成功したPCR増幅の後、FRETプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションによって、プローブの二次構造の除去ならびに蛍光部分およびクエンチング部分の空間的分離が生じる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接/導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【0083】
アンプリコン中に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、PCR反応によって生成されたアンプリコンを検出するために用いられる、さらに別の方法である。
【0084】
本発明の実施形態は、以下の実施例においてさらに規定される。これらの実施例は、単なる例示として示されることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認し得、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態の種々の変更および改変を行って、種々の用法および条件に適合させ得る。従って、本発明の実施形態の種々の改変は、本明細書中に示されかつ記載される改変の他にも、前述の記載から当業者には明らかである。このような改変も、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【0085】
本明細書中に示される各参考文献の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【0086】
実施例1。Agrobacterium形質転換によるトウモロコシの形質転換、ならびにCry34Ab1およびCry35Ab1(Cry34/35Ab1)遺伝子を含むトランスジェニック植物の再分化
PHI17662Aと称される、約7.4KbのDNA分子(配列番号24)は、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry34Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,127,180号、同第6,624,145号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン(Ubi−1)遺伝子のプロモーター、5’側非翻訳エキソン、および第1イントロンを含むDNA分子(Christensenら(1992)Plant Mol.Biol.18:675−689、ならびにChristensenおよびQuail(1996)Transgenic Res.5:213−218)を含む、第一の導入遺伝子発現カセットを含む。DNA構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたPin II転写ターミネーターを含むDNA分子(Gyheung Anら(1989)Plant Cell.1:115−122)に作動可能に連結された、Cry35Ab1と同定されたB.t.δ−エンドトキシンをコードするDNA分子(米国特許第6,083,499号、同第6,548,291号および同第6,340,593号)に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするDNA分子(Hertigら(1991)Plant Mol.Biol.16:171−174)を含む。DNA構築物の第3の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S由来の3’側転写ターミネーターを含むDNA分子(Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59を参照)に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子をコードするDNA分子(Wohlleben W.ら(1988)Gene 70:25−37)に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターのDNA分子(Odell J.T.ら(1985)Nature 313:810−812;Mitsuharaら(1996)Plant Cell Physiol.37:49−59)を含み、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いた。
【0087】
B.t.Cry34/35 Ab1トウモロコシ植物は、Agrobacterium形質転換によって得られ、Zhaoの方法を用いた(米国特許第5,981,840号、およびPCT特許公開WO98/32326;これらの内容は、本明細書中に参考として援用される)。手短に言えば、未熟胚をトウモロコシから単離し、これらの胚を、Agrobacteriumの懸濁液(懸濁液中で、この細菌は、PHI17662 DNA(配列番号24)を、少なくとも1つの未熟胚の少なくとも1つの細胞に移入させ得る)と接触させた(工程1:感染工程)。具体的には、この工程では、未熟胚を、播種の開始のためにAgrobacterium懸濁液中に浸漬した。これらの胚を、ある期間、Agrobacteriumとともに共培養した(工程2:共培養工程)。具体的には、未熟胚を、感染工程の後に固形培地上で培養した。この共培養期間の後、「休止」工程を行った。この休止工程では、植物形質転換体に対する選択薬剤を添加せず、Agrobacteriumの増殖を阻害することが知られている少なくとも1つの抗生物質の存在下で、胚をインキュベートした(工程3:休止工程)。特に、未熟胚を、Agrobacteriumの除去および感染細胞の休止期のために、抗生物質を含むが選択薬剤を含まない固形培地上で培養する。次に、播種した胚を、選択薬剤を含む培地で培養し、増殖する形質転換カルスを回収した(工程4:選択工程)。具体的には、未熟胚を、形質転換細胞の選択的増殖を生じる選択薬剤を含む固形培地上で培養した。次いで、カルスを植物に再分化させ(工程5:再分化工程)、そして、具体的には、選択培地上で増殖したカルスを固形培地上で培養して、植物を再分化させた。個々の胚は、培養の間、物理的に分離した状態で維持し、そして外植片の大部分は選択培地上で枯死した。
【0088】
生存しかつ健全に形成された胚である、グルホシネート耐性カルス組織には、推定形質転換イベントを表す固有の識別コードを付与し、継続的に新鮮な選択培地に移した。それぞれ固有のイベントに由来する組織から植物を再分化させ、温室に移した。葉のサンプルを分子分析のために採取して、PCRにより導入遺伝子の存在を確認し、そしてELISAによりCry34/35Ab1タンパク質の発現を確認した。次いで、植物を、ウェスタンコーンルートワーム害虫を用いた全植物体バイオアッセイに供した。陽性の植物を近交系と交配して、最初の形質転換植物から種子を得た。多くの系を圃場において評価した。DAS−59122−7イベントは、昆虫抵抗性および農業生産力を含む優れた特性の組み合わせに基づいて、独立したトランスジェニックイベントの個体群から選択した。
【0089】
実施例2。Bacillus thuringiensis Cry34/35Ab1トウモロコシ系統DAS−59122−7の同定
イベントDAS−59122−7からの種子を評価した。T1S2種子は、Hi−IIバックグラウンドへの形質転換の後、近交系PH09Bとの交配および2回の自家交配を行ったことを表す。全ての種子を、Pioneer Hi−Bred(Johnston,IA)から得た。主要な特徴付けは、側方流動デバイスを用いた除草剤の葉面塗布およびCry34Abl発現による、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)活性の確認によって、本研究の間に植物葉組織について行った。
【0090】
本研究のコントロール物質を、検体バックグラウンドを代表する未改変の種子と定義した。Hi−IIおよびPH09Bバックグラウンドのコントロール種子を、陰性コントロールとして用いた。これらの未改変の種子は、cry34Ab1遺伝子、cry35Ab1遺伝子、およびpat遺伝子の植物転写単位を含まない。全ての種子を、Pioneer Hi−Bred(Johnston,IA)から得た。
【0091】
2つのさらなるB.t.Cry34/35Ab1イベント(イベントDAS−45214−4およびイベントDAS−45216−6)に由来するDNAサンプルを、イベント特異的PCR分析のための陰性コントロールとして用いた。これらの2つのイベントは、イベントDAS−59122−7を作製するのに用いたベクターと同じベクターを用いてAgrobacterium形質転換によって作製されたので、cry34Ab1遺伝子、cry35Ab1遺伝子、およびpat遺伝子の植物転写単位を含んだ。しかし、イベントDAS−45214−4およびイベントDAS−45216−6中のT−DNAの挿入部位(ゲノムDNA境界領域を含む)は、イベントDAS−59122−7中のT−DNAの挿入部位とは異なった。イベントDAS−45214−4およびイベントDAS−45216−6に由来するDNAサンプルを単離し、そしてサザンブロット分析によって特徴付けした。(データは示さず)。
【0092】
イベントDAS−59122−7のトウモトコシ種子および未改変のコントロール種子(Hi−IIおよびPH09B)を、DuPont Experimental Station(Wilmington,DE)で生育チャンバー内に植えて、DNA分析に十分な数の植物を作製した。イベントDAS−59122−7の特徴付けのために、10個のT1S2種子を植えた。同じく10個の種子を、それぞれの未改変のコントロール系統につき植えた。1つのポットあたり1個の種子を植え、そのポットを一意に同定した。光および水の調節を含む、植え付けおよび生育条件により、健全な植物の生育がもたらされた。
【0093】
コントロール植物およびイベントDAS−59122−7植物の各々について、葉のサンプルを採取した。各サンプルについて、成長点の上から十分な葉材料を採取し、予めラベル表示したサンプル袋に入れた。採取後に、これらのサンプルをドライアイスの上に配置し、そして超低温フリーザーに移した。すべてのサンプルを、加工するまで凍結状態に維持した。すべての葉のサンプルを、植物識別名および採取日で一意にラベル付けした。
【0094】
イベントDAS−59122−7におけるCry34Ab1タンパク質の発現およびコントロールにおける発現の非存在を確認するために、すべてのイベントDAS−59122−7植物およびコントロール植物から葉のサンプルを採取し、そしてCry34Ab1に特異的な側方流動デバイス(Strategic Diagnostics,Inc.,Newark,DE)を用いて、トランスジェニックタンパク質についてスクリーニングした。葉のパンチ打ち抜き試料(Leaf punch)を各植物から採取し、Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水溶液中で粉砕して、タンパク質を粗抽出した。ストリップデバイスを抽出物中に軽く浸して、Cry34Ab1タンパク質の存在または非存在を決定した。イムノアッセイの結果を用いて、表1に示すように、分子分析の前に検体植物の同一性を確認した。
【0095】
イベントDAS−59122−7植物におけるフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)の発現を確認するために、除草剤の葉面塗布を行った。本研究に用いたすべての植物に葉面塗布を行って、植物の同一性を確認した。植物を、R1生育段階の前にアッセイした。PAT発現トランスジェニック植物の同定のための除草剤の葉面塗布について当該分野で公知の標準手順に従って、アッセイを行った。具体的には、各植物の1枚の葉の一部を、グルホシネート除草剤であるBasta(登録商標)(Bayer CropScience)の約2%水溶液で処理し、塗布4〜12日後に、塗布を行った葉の領域における褐色または壊死組織について、視覚的に検査した。各植物の結果を記録し、表1に示すような各試験植物におけるPATの発現を決定するために用いた。表1に示すように、イベントDAS−59122−7 T1S2世代について試験した10種の植物のうち、6種の植物は、Cry34Ab1およびPATの両方を発現したが、4種の植物は、いずれのタンパク質も発現しなかった。すべての未改変のコントロールは、CryAb1およびPATの両方のアッセイについて陰性と出た(データは示さず)。
【0096】
表1:Cry34Ab1およびPATタンパク質発現ならびにB.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7についてのサザンハイブリダイゼーションデータ
【0097】
【表1】

1.陽性のCry34Ab1発現は、Cry34Ab1タンパク質検出に特異的な、イムノアッセイに基づく側方流動デバイスによって決定されるようなタンパク質発現の検出を示す。陰性は、Cry34Ab1タンパク質が検出されないことを示す。陽性のPAT発現は、除草剤処理に抵抗性であった植物を示し、そして陰性は、除草剤に感受性であった植物を示す。
【0098】
2.+は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルを示し;−は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルがないことを示す。cry34Ab1遺伝子プローブは、1.915kbの予想される内部のT−DNAフラグメントにハイブリダイズし、cry35Ab1遺伝子プローブは、2.607kbの予想される内部のT−DNAフラグメントにハイブリダイズし、そしてpat遺伝子プローブは、3.4kb境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット分析によって決定されるような単一のインタクトなT−DNA挿入と一致していた。
【0099】
実施例3.Bacillus thuringiensis Cry34/35Ab1トウモロコシ系統DAS−59122−7のサザンブロット分析
1グラム量の葉サンプルを液体窒素下で粉砕し、ゲノムDNAを、DNeasy(登録商標)Plant Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いるか、または標準尿素抽出緩衝液手順を用いて単離した。抽出後にDNAを、DNA品質を決定するためにアガロースゲル上で可視化し、Pico Green(登録商標)試薬(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)および分光蛍光分析を用いて定量した。
【0100】
1Kb DNA Ladder(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて、アガロースゲル上のDNAフラグメントサイズを推定した。
【0101】
イベントDAS−59122−7植物から単離されたゲノムDNAを、当該分野で公知の標準手順を用いて、Nco Iで消化し、電気泳動的に分離し、ナイロン膜に転写し、そしてcry34Ab1遺伝子プローブ、cry35Ab1遺伝子プローブおよびpat遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。ブロットをX線フィルムに1期間以上曝露して、ハイブリダイズしているフラグメントを検出し、かつ分子量標準を可視化した。次いで、画像をX線フィルム撮影によって、および/またはLumi−Imager(商標)機器(Roche,Indianapolis,IN)を用いた検出によって、デジタル形式で取り込んだ。検出されたバンドのサイズを、各プローブについて記録した。サザンブロット分析を、試験植物における挿入の存在を検証する手段として用い、イベントDAS−59122−7由来のすべての植物が、表1に示すような挿入と同じ挿入を含むことを確認した。(サザンブロットは図示せず。)サザンブロット分析は、イベントDAS−59122−7がプラスミドPHP17662に由来するT−DNA領域のインタクトなコピーからなる単一挿入を含むことを示し、一方、ヌル分離個体は、タンパク質発現分析によって決定されたように、遺伝子プローブにハイブリダイズしなかった。さらに、2つのタンパク質を発現するイベントDAS−59122−7植物は、サザンブロットで同一のハイブリダイゼーションパターンを示した(データは示さず)。具体的には、cry34Ab1遺伝子プローブは、1.915kbの予想される内部のT−DNAフラグメントにハイブリダイズし、cry35Ab1遺伝子プローブは、2.607kbの予想される内部のT−DNAフラグメントにハイブリダイズし、そしてpat遺伝子プローブは、3.4kb境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット結果によって決定されるような単一のインタクトなT−DNA挿入と一致していた。
【0102】
実施例4。Bacillus thuringiensis Cry34/35Ab1トウモロコシ系統DAS−59122−7のT−DNA挿入および隣接境界領域の配列決定
T−DNA挿入および隣接境界領域を、図2および3に図示するように、PCRに基づく方法を用いてB.t.Cry34/35Ab1イベントDAS59122−7からクローン化した。具体的には、イベントDAS−59122−7中の挿入物の5’および3’末端に接する配列を、2つのゲノムウォーキング技術を用いて得た。第一のウォーキング方法は、本質的には、Universal Genome Walker Kit(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)について記載されるような方法であり、そして第二の方法は、Stover(2001年、U.C.Irvine(私信))によって記載されるように改変された、Devonら(1995)Nucleic Acids Research 23(9):1644−1645に概説されたsplinkeretteプロトコルに従って行った。
【0103】
手短に言えば、ゲノムDNAを種々の制限酵素(Universal Genome Walker法のために、Dra I、EcoR V、Pvu II、Sma IおよびStu I、ならびにsplinkerette法のために、BamH I、EcoR I、Hind III、およびXba I)で消化し、次いでGenome Walker法のための平滑末端アダプターおよびsplinkerette法に用いた制限酵素に特異的なアダプターに連結した。両方のゲノムウォーキング法のためのアダプターは、PCRの間のアダプターの3’末端の伸長を阻止するように設計し、したがって非特異的増幅を減少させるかまたは排除した。次いで、アダプター連結したゲノムDNAフラグメントを、genome walkerライブラリーまたはsplinkeretteライブラリー(各制限酵素につき1つのライブラリー)と称した。B.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7の3つの個々のT1S2植物(植物DAS−59122−7 T1S2 1、DAS−59122−7 T1S2 2およびDAS−59122−7 T1S2 10)から、ならびに1つのHi−IIおよび1つのPH09Bコントロール植物から単離されたゲノムDNAから、ライブラリーを調製した。
【0104】
ライブラリーの構築後に、Advantage(商標)−GC Genomic PCRキット(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)を用いて、標的配列を増幅させるために、ネステッドPCR増幅を完了させた。一次PCR増幅は、アダプターに同一性を有する1つのプライマーおよび1つの遺伝子特異的プライマーを用いた。アダプタープライマーは、一次PCRの第一サイクルでの産物を増幅せず、遺伝子特異的プライマーからの産物のみを生成する。アダプタープライマーのアニーリングおよびアダプタープライマーからの増幅は、相補鎖が遺伝子特異的プライマーから生成した後にのみ起こる。一次PCR増幅の後、二次ネステッドPCR反応を行って、ゲノムPCR反応の特異性を増加させた。ネステッドプライマーは、一次PCRに用いたそれぞれのプライマーにとって内部の遺伝子特異的およびアダプター特異的配列からなった。
【0105】
5’隣接境界配列についてネステッドPCRを、挿入されたT−DNAの5’末端に特異的なプライマーとともに、消化されたDNA上に連結されたアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。同様に、3’隣接境界配列のクローニングを、挿入されたT−DNAの3’末端に特異的なプライマーおよびアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。T−DNA領域内のT−DNAの右境界配列および左境界配列にとって内部のDNA配列を、トウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト(walking out)」のための開始点として用いた。なぜなら、これらのDNA配列は、ゲノムウォーキングプライマーを固着する特有の配列(内在性トウモロコシゲノム配列に相同ではない)を示すためである。
【0106】
ネステッドPCRによって生成した産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した(データは示さず)。1つ以上のイベントDAS−59122−7 DNAサンプルから調製したライブラリーで見られ、かつ、Hi−IIおよびPH09BゲノムDNAサンプルから調製したライブラリーに存在しないフラグメントを、さらなる特徴付けのために同定した。同定されたPCR増幅フラグメントを、予備的なゲル電気泳動で分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて単離し、そして配列決定に直接供するか、またはDNA配列決定の前に、pGEM−T Easy Vector System I(Promega Corp.,Madison,WI)を用いてpGEM−T Easyプラスミドベクターにクローン化した。配列決定反応を、ネステッドPCR増幅に用いたプライマーを用いるか、またはpGEM−T Easyベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。得られた配列を用いてさらなる遺伝子特異的プライマーを設計し、未知のトウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト」を継続した。T−DNA挿入物の末端から少なくとも500bpの境界配列が得られるまで、複数回のゲノムウォーキングを行った。
【0107】
隣接境界配列の妥当性を保証するために、イベントDAS−59122−7由来のゲノムDNAについてのさらなるイベント特異的PCR増幅を行った。増幅されたフラグメントを、T−DNA挿入領域から5’および3’境界ゲノムDNAの中に重複する配列の領域をさらに伸長するために、配列決定した。プライマー(表2に示す)を、T−DNAとトウモロコシゲノムDNAとの特有の結合部をつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット03−O−506/02−O−476(配列番号10/配列番号9)は、5’結合部をつないで、313bpのフラグメント(bp2427からbp2739まで、図1参照)を増幅し、プライマーセット02−O−447/03−O−577(配列番号8/配列番号17)は、3’結合部をつないで、754bpのフラグメント(bp9623からbp10376まで、図1参照)を増幅した。
【0108】
表2。プライマー配列
【0109】
【表2】

1.イベントDAS−59122−7の配列中の位置(図1参照)。塩基1〜2593=5’境界、塩基2594〜9936=T−DNA挿入物、塩基9937〜11922=3’境界。
【0110】
トウモロコシゲノム中に挿入されたDNA配列を検証するために、PCRを行って、イベントDAS−59122−7から、挿入されたT−DNAを増幅、クローン化、および配列決定した。表3に示したPCRプライマーセット(配列番号11/配列番号5);(配列番号4/配列番号7);および(配列番号6/配列番号3)を用いて、22I−1(配列番号25)、22I−2(配列番号26)、および22I−3(配列番号27)と称される3つの重複するフラグメント(イベントDAS−59122−7についてのT−DNA挿入物bp2687〜bp9846のT−DNAの5’領域から3’領域までに及ぶ配列を示す(図1参照))を増幅した。PCRアンプリコン情報を表3に報告し、そしてプライマー配列を表2に列挙した。
【0111】
表3。PCRプライマーおよびアンプリコンの記載
【0112】
【表3】

1.イベントDAS−59122−7の配列中の位置(図1参照)。塩基1〜2593=5’境界、塩基2594〜9936=T−DNA挿入物、塩基9937〜11922=3’境界。
【0113】
PCR GC2 Advantage(商標)ポリメラーゼキット(BD Biosciences Clontech,Inc.)を製造業者の説明書に従って使用して、挿入フラグメント(22I−1(配列番号25)、22I−2(配列番号26)、および22I−3(配列番号27))を増幅した。手短に言えば、50μLの反応物は、5’および3’プライマー(最終濃度0.2μM)、ならびに40ngのゲノムDNAを含んだ。PCR反応を、植物DAS−59122−7 T1S2 1およびDAS−59122−7 T1S2 2由来のゲノムDNA調製物を用いて、2連で設計した。PCR条件は、以下のとおりであった:95℃で1分間の初期変性、続いて94℃/95℃で30秒間、55℃で30秒間、および68℃で5分間を35サイクル、ならびに68℃で6分間の最終伸長。PCR増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、エチジウムブロマイドで染色した1×TBE(89mMトリスホウ酸塩,2mM EDTA,pH8.3)中の1%アガロースゲルを通して電気泳動した。
【0114】
PCRフラグメント22I−1(配列番号25)、22I−2(配列番号26)、および22I−3(配列番号27)を、エチジウムブロマイドで染色した1×TBE中の0.8%アガロースゲルからフラグメントを切り出すことによって精製し、そしてこのフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いてアガロースから精製した。PCRフラグメントを、pGEM−T Easy Vector System I(Promega Corp.)を用いてpGEM−T Easyプラスミドベクターにクローン化した。クローン化フラグメントを、プラスミドDNAの少量調製(QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen)およびNot Iでの制限酵素消化によって確認した。次いで、プラスミドクローンおよび/または精製されたPCR挿入フラグメントを、完全な挿入物の配列決定に供した。配列決定反応を、既知のT−DNA配列に特異的であるように設計されたプライマーを用いるか、またはpGEM−T Easyベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。Sigma−Genosys,Inc.(The Woodlands,TX)は、すべてのPCRプライマー(PCR反応において、最終濃度0.2〜0.4μMで用いた)を合成した。
【0115】
B.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7、DAS−45214−4、およびDAS−45216−6、ならびに未改変のコントロール系統Hi−IIおよびPH09Bから単離したゲノムDNAを用いたPCR反応を用いて、以下を確認した:(1)イベントDAS−59122−7の配列決定された境界領域におけるトウモロコシゲノムDNAの存在、および(2)イベントDAS−59122−7におけるT−DNA挿入物とゲノムDNA境界の結合部を横断するイベント特異的増幅。
【0116】
イベントDAS−59122−7中の挿入物に隣接する境界配列を増幅するために設計されたPCRプライマーを用いて、未改変のコントロール系統およびイベントDAS−59122−7におけるこれらの領域の存在を確認した。5’および3’境界について、それぞれ2つのプライマーセット(計4セット)を試験した。プライマーセット03−O−784/03−O−564(配列番号18/配列番号14)および03−O−784/03−O−543(配列番号18/配列番号13)を用いて、イベントDAS−59122−7中の境界配列5’からT−DNA挿入物まで、それぞれ136bpフラグメントおよび263bpフラグメントを増幅した(図2および3)。同様に、プライマーセット03−O−569/03−O−577(配列番号15/配列番号17)および03−O−570/03−O−542(配列番号16/配列番号12)を用いて、3’ゲノム境界から、それぞれ227bpフラグメントおよび492bpフラグメントを増幅した(図2および図3)。
【0117】
境界配列とT−DNA挿入物の結合部を横断するフラグメントを増幅するように設計されたプライマーを用いて、イベントDAS−59122−7についてのイベント特異的なPCRフラグメントを構築した。2つの結合部につき、1つのプライマーセットを選択した。プライマーセット03−O−784/02−O−215(配列番号18/配列番号1)を、5’結合部を横断する555bpフラグメントを増幅するように設計し、そしてプライマーセット02−O−219/03−O−577(配列番号2/配列番号17)を、3’結合部で547bpフラグメントを増幅するように設計した。内在性トウモロコシインベルターゼ遺伝子に基づくプライマーのセットである、IVR1(O197)(配列番号39)5’−CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC−3’およびIVR2(O198)(配列番号40)5’−GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC−3’(Hurstら、(1999)Molecular Breeding 5(6):579−586)を用いて、すべてのトウモロコシゲノムDNAサンプルに対する内部陽性コントロールとして226bp増幅産物を生成した。
【0118】
すべてのPCRプライマーは、Sigma−Genosys,Incによって合成され、PCR反応において最終濃度0.2〜0.4μMで用いられた。PCRプライマー配列を表2に列挙する。PCR増幅のために、Advantage(商標)−GC 2 PCRキット(BD Biosciences)を、製造業者の説明書に従って使用した。PCR反応物50μL当たり、約10〜100ngのゲノムDNAテンプレートを使用した。PCR条件は、以下のとおりであった:94℃で5分間の初期テンプレート変性、続いて95℃で1分間、60℃で2分間、および72℃で3分間を35サイクル、ならびに72℃で7分間の最終伸長。PCR増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、1×TBEおよびエチジウムブロマイドを含む1%アガロースゲルを通して電気泳動した。
【0119】
イベントDAS−59122−7のT−DNA挿入物および境界領域について得られた配列決定データを検討し、Seqman II(商標)ソフトウェアバージョン4.0.5(DNAStar,Inc.,Madison,WI)を用いてアセンブルした。イベントDAS−59122−7に存在する挿入物に隣接する5’および3’境界配列を、GenBank公開データベースに対する相同性検索に用いて、トウモロコシゲノム中の挿入部位をさらに特徴決定した。イベントDAS−59122−7における隣接境界とT−DNA挿入物との間の結合領域中のオープンリーディングフレームを同定する分析を、Vector NTI 8.0(InforMax(商標),Inc.,Frederick,MD)を用いて行った。
【0120】
全体で、イベントDAS−59122−7のゲノムDNAに由来する11922bpの配列を確認した(図1参照)。T−DNA挿入物の5’末端で、2593bpの隣接境界配列が同定され、そして1986bpの隣接境界配列が、ゲノムウォーキング実験で得られたフラグメントの3’末端で得られた。22I−1(2501bp)(配列番号25)、22I−2(3027bp)(配列番号26)、および22I−3(2830bp)(配列番号27)と称される、3つの重複するフラグメント(イベントDAS−59122−7についてのT−DNA挿入物bp2687〜bp9846のT−DNAの5’領域から3’領域までに及ぶ配列を示す(図1参照))を増幅するように設計されたPCRプライマーセットを用いて、全体で7160bpのT−DNA挿入物をクローン化および配列決定した。トウモロコシゲノムDNAとT−DNA挿入物の5’および3’結合部とをそれぞれつなぐ、2つのPCRフラグメント、O506/O476(配列番号10/配列番号9)およびO447/O577(配列番号8/配列番号17)から、T−DNA挿入領域の残りを配列決定した。用いたプライマーは、T−DNAの特有の結合部とトウモロコシゲノムDNAとをつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット03−O−506/03−O−476(配列番号10/配列番号9)は、5’結合部をつないで、313bpのフラグメント(bp2427からbp2739まで)を増幅し、そしてプライマーセット03−O−447/03−O−577(配列番号8/配列番号17)は、3’結合部をつないで、754bpのフラグメント(bp9623からbp10376まで)を増幅した。イベントDAS−59122−7における、合わせて合計7343bpのT−DNA挿入物を、クローン化および配列決定し(bp2594からbp9936まで、図1参照)、そして形質転換プラスミド(PHP17662)の配列と比較した。bp6526およびbp6562で異なる2つのヌクレオチドが、T−DNA挿入物の非翻訳コムギペルオキシダーゼプロモーター領域に認められた(図1参照)。T−DNA挿入物のオープンリーディングフレーム組成に影響を及ぼす塩基変化は認められなかった。T−DNA挿入物の3’および5’末端領域のいずれも、T−DNAの右側境界領域を含む5’末端の最後の22bpおよびT−DNAの左側境界領域を含む3’末端の25bpが欠失している以外は、インタクトであることが見出された。T−DNA境界配列は、ゲノムへのT−DNA挿入に重要な役割を果たすことが知られているが、この結果は予想外のものではなかった。なぜなら、挿入はしばしば、特にT−DNAの左側境界で不完全であるためである(Tinland(1996)Trends in Plant Science 1(6):178−184)。
【0121】
イベントDAS−59122−7のゲノム境界領域のBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析は、公的に利用可能な配列(Release 138.0 GenBank,2003年10月25日)との制限された相同性を示した。5’境界領域の分析により、トウモロコシゲノム配列およびEST(発現配列タグ)配列に対して有意な相同性を有する2つの領域が見出された。第一の領域は、179bp(境界配列のbp477〜bp655)を含み、いくつかの分子マーカー、染色体配列、および種々のESTのアラインメントによって得られるコンセンサス配列に対して類似性を示す。第二の領域は、5’境界配列のbp1080〜bp1153(74bp)に存在し、多数の異なるトウモロコシESTおよびゲノム配列に対して類似性を示す。3’境界領域はまた、植物DNA配列に対して類似性のある2つの小さな不連続領域も有した。内部3’領域の162bp(bp9954〜bp10115)は、2つのゲノムZea maysアルコールデヒドロゲナーゼ(adh1)遺伝子の3’非翻訳末端に対して、およびいくつかのESTコンセンサス配列に対して類似性を示した。3’境界(bp10593〜bp10649)の中央の比較的小さな領域(57bp)は、複数のトウモロコシゲノム配列に由来する非コード領域に対して類似性を示した。
【0122】
全体としては、いずれのゲノム境界配列においても179塩基対を超える相同領域は同定されず、また、同じ既知配列に由来する2つ以上の相同領域も見出されなかった。イベントDAS−59122−7境界配列に類似性を示す個々の付加物(accessions)を試験して、イベントDAS−59122−7中の挿入が、特徴付けされたタンパク質コード配列中に存在するか否かを決定した。類似の領域は、任意の既知のタンパク質コード配列中には存在しなかった。全形質転換プラスミド配列(PHP17662)と、イベントDAS−59122−7境界配列との局所アラインメントは、有意な相同性を示さなかった。このことは、T−DNA挿入物に隣接する境界領域が、形質転換プラスミドのフラグメントを含まなかったことを示す。したがって、イベントDAS−59122−7中の挿入部位に隣接するゲノム配列の同定および特徴付けは、既知の配列に対して有意な相同性を有する領域が存在しないことによって制限された。
【0123】
イベントDAS−59122−7中のトウモロコシゲノム境界配列とT−DNA挿入物の間の5’および3’結合領域を、新しいオープンリーディングフレームの存在について分析した。有効なサイズ(>100アミノ酸)のオープンリーディングフレームは、5’または3’境界結合領域において同定されなかった。このことは、T−DNA挿入の結果として新しいオープンリーディングフレームが生成されなかったことを示す。さらに、相同性検索は、B.t.Cry34/35Ab1イベントDAS−59122−7において、T−DNA挿入によって分断された疑いのある、境界領域中の内在性トウモロコシオープンリーディングフレームの存在を示さなかった。
【0124】
実施例5。PCRプライマー
DNAイベント特異的プライマー対を用いて、DAS−59122−7に特徴的なアンプリコンを生成した。これらのイベントプライマー対としては、配列番号18および配列番号1;配列番号2および配列番号17;配列番号10および配列番号9;ならびに配列番号8および配列番号17;ならびに配列番号36および配列番号37が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプライマー対に加えて、DNA増幅反応に用いた場合にDAS−59122−7に特徴的なDNAアンプリコンを生成する、配列番号21および配列番号22に由来する任意のプライマー対も、本発明の実施形態である。DNAプライマーまたはその相補体を用いてDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンDNA分子を生成する、これらの方法の任意の改変は、当該分野の通常の技術範囲内である。さらに、内在性トウモロコシ遺伝子の増幅のためのIVR1(O197)/IVR2(O198)(配列番号39/配列番号40)を含む、コントロールプライマー対は、反応条件についての内部標準として含まれる。
【0125】
DAS−59122−7イベントの存在について試験するための植物組織DNA抽出物の分析には、陽性の組織DNA抽出物コントロール(トランスジェニック配列を含むことが分かっているDNAサンプル)が含まれるべきである。陽性コントロールの増幅の成功は、PCRが、標的配列の増幅を可能にする条件下で行われたことを示す。陰性(または野生型)のDNA抽出物コントロール(その中に提供されるテンプレートDNAが、非トランスジェニック植物から調製されるゲノムDNAであるか、または非DAS−59122−7トランスジェニック植物から調製されるゲノムDNAのいずれかである)も含まれるべきである。さらに、テンプレートトウモロコシDNA抽出物を含まない陰性コントロールは、PCRプロトコルに用いる試薬および条件の有用な判断基準である。
【0126】
十分な長さのさらなるDNAプライマー分子が、DNA増幅方法の当業者によって配列番号21および配列番号22から選択され得、そしてイベントDAS−59122−7に特徴的なアンプリコンの生成のために、条件が最適化され得る。これらのDNAプライマー配列を、これらの実施例に示した方法に修正を加えて使用することは、本発明の範囲内である。十分な長さの少なくとも1つのDNAプライマー分子が、イベントDAS−59122−7に特徴的な配列番号21および配列番号22に由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。十分な長さの少なくとも1つのDNAプライマー分子が、イベントDAS−59122−7に特徴的なPHI17662Aの遺伝因子のいずれかに由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。DAS−59122−7アンプリコンのアッセイは、Stratagene Robocycler(MJ Engine,Perkin−Elmer 9700)またはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーを使用することによって、あるいは当業者に公知の方法および装置によって、実行され得る。
【0127】
本発明の原理を図示および記載してきたが、本発明は、このような原理から逸脱することなく配置および詳細が変更され得ることが、当業者には明らかなはずである。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての変更を特許請求する。
【0128】
本明細書中で引用される全ての刊行物および公開特許文献は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが具体的かつ個々に示されたと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の単離されたDNA分子。

【図1−1】
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【図1−2】
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【図1−3】
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【図1−4】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2012−245004(P2012−245004A)
【公開日】平成24年12月13日(2012.12.13)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−180237(P2012−180237)
【出願日】平成24年8月15日(2012.8.15)
【分割の表示】特願2007−534750(P2007−534750)の分割
【原出願日】平成17年9月28日(2005.9.28)
【出願人】(500207899)パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル, インコーポレイテッド (7)
【出願人】(390039192)ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Dow AgroSciences LLC
【出願人】(505400118)イー.アイ. デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【Fターム(参考)】