トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７およびその検出のための方法
【課題】植物分子生物学の分野に関し、植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡ構築物、昆虫抵抗性トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡの存在を検出するアッセイを提供する。
【解決手段】トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡ植物発現構築物。ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキット、プライマー。
【解決手段】トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡ植物発現構築物。ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキット、プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、本発明の実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡ構築物に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に関し、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡの存在を検出するアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）植物ＤＡＳ−５９１２２−７（トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７またはトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７とも呼ばれる）に関し、さらにトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡ植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代における導入遺伝子／隣接挿入領域の検出に関する。
【０００３】
トウモロコシは、重要な作物であり、世界の多くの地域における主要な食料源である。化学農薬などの保護対策の使用にかかわらず、害虫によって引き起こされる被害は、世界のトウモロコシ収穫高の損失の主要な要因である。このような事情に鑑みて、虫害を制御し、従来の化学農薬の必要性を減少させるために、トウモロコシなどの作物に昆虫抵抗性を付与するための遺伝子組み換えが行われてきた。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の１つの群は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）由来のδ−エンドトキシンである。δ−エンドトキシンは、綿、ジャガイモ、米、ヒマワリ、およびトウモロコシなどの作物中でうまく発現して、害虫に対して優れた制御をもたらすことが証明されている。（特許文献１、非特許文献１〜４、Ｂｉｎｇ ＪＷら（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）。
【０００４】
植物における外来遺伝子の発現は、植物ゲノム中の位置によって（おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）に起因するか、または組込部位に近い転写調節因子（例えば、エンハンサー）の近接性に起因して）影響を受けることが知られている（非特許文献５）。同時に、ゲノムの異なる位置での導入遺伝子の存在は、植物の全体的な表現型に異なる方法で影響を及ぼす。このような理由で、導入された目的の遺伝子の最適な発現を特徴とするイベントを同定するために、多数のイベントのスクリーニングをすることがしばしば必要である。例えば、イベント間で、導入された遺伝子の発現レベルに幅広いバリエーションが存在し得ることが、植物および他の生物において観察されている。また、空間的または時間的な発現パターン（これは、導入された遺伝子構築物中に存在する転写調節因子から予期されるパターンに一致しない場合がある）の差異（例えば、種々の植物組織中の導入遺伝子の相対的発現における差異）も存在し得る。このため、数百から数千もの異なるイベントを作製し、これらのイベントを、商業目的のために望ましい導入遺伝子発現のレベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベントは、導入遺伝子を他の遺伝的背景に、従来の育種方法を用いた有性異系交配（ｓｅｘｕａｌ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ）によって遺伝子移入するのに有用である。このような交配の後代は、もとの形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持している。このストラテジーは、局所的な生育条件に十分適応した多数の変種において信頼性の高い遺伝子発現を保証するために用いられる。
【０００５】
特定のイベントの存在を検出可能であることは、有性交配の後代が目的の導入遺伝子を含んでいるか否かを決定するために有利である。また、特定のイベントを検出する方法は、例えば、組換え作物に由来する食品の市販前承認および表示を要する規定を遵守するために役立つか、あるいは、環境モニタリング、圃場での作物の性質のモニタリング、または収穫作物に由来する製品のモニタリングに用いるために、ならびに規制条項または契約条項の対象になる団体の遵守を保証するのに用いるために役立つ。
【０００６】
当該分野で公知の任意の核酸検出方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない）によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などのような、頻繁に用いられる遺伝因子に焦点を当てる。なぜなら、多くのＤＮＡ構築物にとって、コード領域は交換可能であるためである。その結果、このような方法は、挿入された異種ＤＮＡに隣接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でなければ、異なるイベント（特に、同じＤＮＡ構築物または非常に類似した構築物を用いて作製されたイベント）を区別するのに有用ではない場合がある。例えば、イベント特異的ＰＣＲアッセイは、選良イベントＧＡＴ−ＺＭ１の検出について、特許文献２に記載される。従って、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の同定のための簡単かつ判別可能な方法を有することが所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０１／１３７３１号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，３９５，４８５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｒｌａｋ，ＦＪら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０年，第８巻，ｐ．９３９−９４３
【非特許文献２】Ｐｅｒｌａｋ，ＦＪ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３年，第２２巻，ｐ．３１３−３２１
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，第１１巻，ｐ．１１５１−１１５５
【非特許文献４】Ｔｕら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１８巻，ｐ．１１０１−１１０４
【非特許文献５】Ｗｅｉｓｉｎｇら，１９８８年，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，第２２巻，ｐ．４２１−４７７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性の単子葉植物作物を作製および選択する方法に関する。より具体的には、植物細胞および植物中で発現されると昆虫に対する抵抗性を付与する、ＤＮＡ構築物を提供する。本発明の１つの局面によれば、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能なＤＮＡ構築物が提供され、このＤＮＡ構築物は、植物細胞および植物中で発現されると、これらの植物細胞および植物に対して昆虫抵抗性を付与する。このＤＮＡ構築物は、ＰＨＩ１７６６２Ａと称されるＤＮＡ分子から構成され、３つの導入遺伝子発現カセットを含む。第一の発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３４Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ−１）遺伝子のプロモーター、５’側非翻訳エキソン、および第１イントロンを含むＤＮＡ分子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＱｕａｉｌ（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を含む。ＤＮＡ構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３５Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするＤＮＡ分子（Ｈｅｒｔｉｇら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１７１−１７４）を含む。ＤＮＡ構築物の第３の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照）に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ
７０：２５−３７）に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を含む。このＤＮＡ構築物を含む植物も提供される。
【００１０】
本発明の別の実施形態によれば、ＤＡＳ−５９１２２−７と称される新規のトウモロコシ植物を同定するための組成物および方法が提供され、これらの方法は、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’および／または３’隣接配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。ＰＣＲ反応に用いられるとトランスジェニックイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特有のアンプリコンを生成するプライマー配列を含む、ＤＮＡ分子が提供される。これらの分子は、以下：
５’−ＧＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１）；
５’−ＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号２）；
５’−ＡＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＴ−３’（配列番号３）；
５’−ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号４）；
５’−ＧＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号５）；
５’−ＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡ−３’（配列番号６）；
５’−ＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡ−３’（配列番号７）；
５’−ＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴ−３’（配列番号８）；
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号９）；５’−ＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１０）；５’−ＧＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴ−３’（配列番号１１）；
５’−ＧＡＣＧＧＧＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号１２）；５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＡ−３’（配列番号１３）；５’−ＣＴＡＣＧＴＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１４）；
５’−ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡ−３’（配列番号１５）；５’−ＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号１６）；５’−ＣＡＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１７）；５’−ＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１８）
５’−ＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＣＧＴＡＣＧＣＡＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３６）；
５’−ＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣＣＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３７）
およびこれらの相補体からなる群より選択され得る。これらの分子を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の実施形態である。さらに、これらのプライマー配列を利用する、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの同定のためのキットが提供される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７の特異的同定方法を開発するのに用いられ得る、本明細書中に記載されるＤＡＳ−５９１２２−７の特異的な隣接配列に関する。より詳細には、本発明は、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’および／または３’隣接領域（それぞれ、配列番号１９（５’隣接領域）および配列番号２０（３’隣接領域））に関し、これらの領域は、特異的プライマーおよびプローブの開発に用いられ得る。本発明のさらなる実施形態は、このよう特異的プライマーまたはプローブの使用に基づく、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７の存在についての同定方法に関する。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に相当するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＤＮＡを含むサンプルと、ＤＮＡプライマーセット（このＤＮＡプライマーセットは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応に用いると、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成する）とを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行うことによって、アンプリコンを生成する工程；および（ｃ）アンプリコンを検出する工程。
【００１３】
新規の導入遺伝子／隣接挿入領域（配列番号２１（５’隣接領域＋１０００内部領域）および配列番号２２（３’隣接領域＋１０００内部領域））を含み、かつ、配列番号２１および配列番号２２に相同または相補的なＤＮＡ分子は、本発明の実施形態である。
【００１４】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域を含むＤＮＡ配列（配列番号２１）は、本発明の実施形態である。トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号２１のトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７由来のトウモロコシゲノム配列および／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１５】
さらに、新規導入遺伝子／隣接挿入領域を含むＤＮＡ配列（配列番号２２）が提供される。トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号２２のトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７由来のトウモロコシゲノム配列および／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１６】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号２１のＤＮＡ配列の少なくとも１１個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むＤＮＡ配列またはその相補体、および配列番号２１の類似の長さの５’隣接トウモロコシＤＮＡ配列またはその相補体が、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号２１に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【００１７】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号２２のＤＮＡ配列の少なくとも１１個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むＤＮＡ配列またはその相補体、および配列番号２２の類似の長さの３’隣接トウモロコシＤＮＡ配列またはその相補体が、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号２２に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【００１８】
より具体的には、ＤＮＡプライマーセットを含む１対のＤＮＡ分子であって、配列番号１８またはその相補体および配列番号１またはその相補体；配列番号２またはその相補体および配列番号１７またはその相補体；配列番号１０またはその相補体および配列番号９またはその相補体；配列番号８またはその相補体および配列番号１７またはその相補体；ならびに配列番号３６またはその相補体および配列番号３７またはその相補体と同定される１対のＤＮＡ分子は、本発明の実施形態である。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態としては、配列番号１８および配列番号１のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号２および配列番号１７のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号１０および配列番号９のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号８および配列番号１７のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；ならびに配列番号３６および配列番号３７のＤＮＡ分子を含むアンプリコンが挙げられる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態としては、イベントＤＡＳ−５９１２２−７を検出するかまたは特徴付けるのに有用な、以下のプライマーが挙げられる：配列番号１１またはその相補体；配列番号５またはその相補体；配列番号４またはその相補体；配列番号７またはその相補体；配列番号６またはその相補体；配列番号３またはその相補体；配列番号１８またはその相補体；配列番号１４またはその相補体；配列番号１３またはその相補体；配列番号１５またはその相補体；配列番号１７またはその相補体；配列番号１６またはその相補体；および配列番号１２またはその相補体。さらなる実施形態としては、上記のプライマーのいずれかを組み合わせることによって生成されるアンプリコンも挙げられる。
【００２１】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルと、ＤＮＡプローブ（トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたＤＮＡと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない分子）を接触させる工程；（ｂ）このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。より具体的には、サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程からなる：（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルと、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントに特有の配列（例えば、結合配列）からなるＤＮＡプローブ分子（このＤＮＡプローブ分子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない）を接触させる工程；（ｂ）このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。
【００２２】
さらに、配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するキットおよび方法が提供される。
【００２３】
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される、ＤＡＳ−５９１２２−７の少なくとも１つの結合配列ならびにその相補体を含む、ＤＮＡ分子が提供され；この結合配列は、ゲノム中に挿入される異種ＤＮＡと、この挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞由来のＤＮＡ（すなわち、隣接ＤＮＡ）との結合部をつなぎ、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントに特徴的である。
【００２４】
本発明の別の実施形態によれば、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法であって、以下の工程を包含する：（ａ）昆虫に対する抵抗性を付与する本発明の発現カセットを含む、第一の親トウモロコシ系統と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ系統とを有性交配させることによって、複数の後代植物を作製する工程；および（ｂ）昆虫抵抗性の後代植物を選択する工程。このような方法は、必要に応じて、この後代植物を第二の親トウモロコシ系統に戻し交雑して、昆虫抵抗性の純粋種トウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、トウモロコシ細胞をＤＮＡ構築物ＰＨＩ１７６６２Ａ（配列番号２４）で形質転換する工程、この形質転換したトウモロコシ細胞を、トウモロコシ植物へと成長させる工程、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を選択する工程、およびこのトウモロコシ植物を、繁殖性のトウモロコシ植物へとさらに成長させる工程を包含する、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する方法を提供する。繁殖性のトウモロコシ植物は、適合性のトウモロコシ品種と自家受粉または交配して、昆虫抵抗性後代を作製し得る。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、さらに、生物学的サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのＤＮＡ検出キットに関する。このキットは、ＰＣＲ同定プロトコルに用いられる、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一のプライマー、およびＤＡＳ−５９１２２−７の外来ＤＮＡ内かまたは隣接ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第二のプライマーを含む。本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の特異的領域と８０％〜１００％の間の配列同一性を有する配列に相当するか、またはこの配列に相補的な配列を有する、特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の５’または３’隣接領域の一部を含む特異的領域に相当する。
【００２７】
本発明の実施形態に含まれる方法およびキットは、限定されないが、以下のような異なる目的に用いられ得る：植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品（生鮮品もしくは加工品）などの製品中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するために；さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料とを分離する目的で、トランスジェニック植物材料を同定するのに用いられ得る；さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７を含む植物材料の質を決定するのに用いられ得る。これらのキットはまた、検出方法の実行に必要な試薬および材料も含み得る。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物またはその一部（トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７およびこれに由来する後代の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核、および卵子の核が挙げられるが、これらに限定されない）に関する。ＤＮＡプライマー分子が特異的アンプリコン生成物を提供する、トウモロコシ植物および種子のＤＡＳ−５９１２２−７は、本発明の実施形態である。
【００２９】
本発明の前述のおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面から、より明らかになる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単離されたＤＮＡ分子であって、以下：
ａ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２０に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２３に示されるヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列；および
ｅ）配列番号２２に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目２）
ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットであって、該キットが、配列番号１９内または配列番号２０内の配列を認識する、少なくとも１つの第一のプライマーを含む、キット。
（項目３）
項目２に記載のキットであって、以下：
ａ）配列番号２４の配列；および
ｂ）配列番号２０の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、少なくとも１つの第二のプライマーをさらに含む、キット。
（項目４）
上記第一のプライマーが、以下：
ａ）配列番号１９の配列；および
ｂ）配列番号２０の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、項目２に記載のキット。
（項目５）
上記少なくとも第一および第二のプライマーがそれぞれ、以下：
ａ）配列番号１８および配列番号１の配列；
ｂ）配列番号１０および配列番号９の配列；
ｃ）配列番号２および配列番号１７の配列；
ｄ）配列番号８および配列番号１７の配列；ならびに
ｅ）配列番号３６および配列番号３７の配列
からなる群より選択される１対の配列を含む、項目３に記載のキット。
（項目６）
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代の結合部ＤＮＡに特異的なＤＮＡ検出キットであって、以下：
ａ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列；および
ｂ）配列番号２２に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択される配列に相同または相補的な、ＤＮＡ検出方法において機能するために十分な長さの連続するＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目７）
生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットであって、該キットが、以下：
ａ）配列番号１９および配列番号２４の配列；ならびに
ｂ）配列番号２０および配列番号２４の配列
からなる群より選択される配列にハイブリダイズし、該配列と連続する配列を含む、特異的プローブを含む、キット。
（項目８）
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する、配列番号２１または配列番号２２に相同または相補的な十分な長さの連続するヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目９）
第一、第二、および第三の発現カセットを含むＤＮＡ構築物であって、
該第一の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（ａ）トウモロコシユビキチンプロモーター；
（ｂ）トウモロコシユビキチン遺伝子の５’側非翻訳エキソン；
（ｃ）トウモロコシユビキチン第１イントロン；
（ｄ）Ｃｒｙ３４Ａｂ１をコードするＤＮＡ分子；および
（ｅ）ＰｉｎＩＩ転写ターミネーター
を含み；
該第二の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（ｉ）コムギペルオキシダーゼプロモーター；
（ｉｉ）Ｃｒｙ３５Ａｂ１をコードするＤＮＡ分子；および
（ｉｉｉ）ＰｉｎＩＩ転写ターミネーター
を含み；そして
該第三の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（１）ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；
（２）ｐａｔをコードするＤＮＡ分子；および
（３）（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーター
を含む、ＤＮＡ構築物。
（項目１０）
項目９に記載のＤＮＡ構築物を含む植物。
（項目１１）
上記植物が、トウモロコシ植物である、項目１０に記載の植物。
（項目１２）
生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための方法であって、配列番号１９または配列番号２０内の配列を特異的に認識するプローブまたは第一のプライマーを用いて、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
（項目１３）
少なくとも２つのプライマーであって、上記第一のプライマーが、配列番号１９または配列番号２０内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号２０または配列番号２４内の配列を認識する、プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、上記生物学的サンプル中に存在する核酸からＤＮＡフラグメントを増幅する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記第一のプライマーが、配列番号１９内の配列を認識し、そして上記第二のプライマーが、配列番号２４内の配列を認識する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記第一のプライマーが、配列番号２０内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号２０内の配列を認識する、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号１８および配列番号１の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号１０および配列番号９の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号２および配列番号１７の配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号８および配列番号１７の配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号３６および配列番号３７の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約５５５ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約３１３ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約５４７ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約７５４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約１０４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
生物学的サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７またはその後代の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）以下：
ｉ）配列番号１８および配列番号１の配列；
ｉｉ）配列番号１０および配列番号９の配列；
ｉｉｉ）配列番号２および配列番号１７の配列；ならびに
ｉｖ）配列番号８および配列番号１７の配列
からなる群より選択される、１対のＤＮＡプライマー分子を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を行って、ＤＮＡアンプリコン分子を生成する工程；ならびに
（ｅ）該ＤＮＡ増幅反応における該ＤＮＡアンプリコン分子の検出が、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在を示す、該ＤＮＡアンプリコン分子を検出する工程を包含する、方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法によって生成されるアンプリコンのいずれか１つを含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目２８）
サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）トウモロコシＤＮＡを含む該サンプルと、ポリヌクレオチドプローブであって、該ポリヌクレオチドプローブは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、非ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物ＤＮＡとは該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに
（ｃ）該ＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ハイブリダイゼーションの検出が、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目２９）
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、単離されたＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
（項目３０）
配列番号１、２、８、９、１０、１７および１８からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、項目２９に記載の単離されたＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
（項目３１）
第一のＤＮＡ分子および第二のＤＮＡ分子を含む、１対のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が、ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物またはその後代から抽出されるＤＮＡに特徴的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために、以下：
ａ）配列番号２１に示される配列またはその相補体；および
ｂ）配列番号２２に示される配列またはその相補体
からなる群より選択される配列の、十分な長さの連続するヌクレオチドのＤＮＡ分子。
（項目３２）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される配列ならびにその相補体を含む結合配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目３３）
種子サンプル中の配列番号１９もしくは配列番号２０内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域の検出を包含する、種子純度を確認する方法。
（項目３４）
イベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在について種子をスクリーニングする方法であって、種子ロットのサンプル中の配列番号１９または配列番号２０内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域の検出を包含する、方法。
（項目３５）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するＤＮＡが、植物ゲノムの一部を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部。
（項目３６）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するＤＮＡが、植物ゲノムの一部を形成する、項目３５に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の子孫植物。
（項目３７）
項目３５または３６に記載の植物の種子。
（項目３８）
項目３５または３６に記載の植物と交配させる工程、ならびに、配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体について分析することにより後代を選択する工程を包含する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法。
（項目３９）
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離されたＤＮＡ配列。
（項目４０）
各々が少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、かつ、ＤＮＡ増幅手順において一緒に用いられた場合にイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成する、１対の単離されたＤＮＡ配列。
（項目４１）
各々の配列が、以下：
ａ）配列番号２１の配列；および
ｂ）配列番号２２の配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列の中から選択される、項目４０に記載の１対の単離されたＤＮＡ配列。
（項目４２）
トウモロコシ組織中のＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）プライマー対の各々が、配列番号２１または配列番号２２由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、該プライマー対の各メンバーが、上記ＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、プライマー対を選択する工程；
（ｂ）該トウモロコシ組織のサンプルを該プライマー対と接触させる工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅を行い、そしてアンプリコンについて分析する工程
を包含する、方法。
（項目４３）
上記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７またはその相補体からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
トウモロコシ組織中のＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該トウモロコシ組織のサンプルを、配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに
（ｃ）該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程
を包含する、方法。
（項目４５）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブを含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目４６）
プライマー対の各々が、配列番号２１および配列番号２２の中から少なくとも１０個のヌクレオチドを含む、プライマー対を含むＤＮＡ検出キットであって、該プライマー対の各々が、上記ＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、ＤＮＡ検出キット。
（項目４７）
上記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７ならびにその相補体からなる群より選択される、項目４６に記載のＤＮＡ検出キット。
（項目４８）
配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキット。
（項目４９）
配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−２】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−３】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−４】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図２】図２は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の３つの別個の部分に分かれている；トウモロコシゲノムＤＮＡを含む５’境界領域、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含む３’境界領域。挿入物の概略図の下の２つの矢印は、５’および３’ゲノムウォーキングフラグメントに由来する配列の始点および終点を示している。挿入物の概略図の下の他のボックスは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノムＤＮＡから増幅され、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物ならびに５’および３’挿入物／境界結合領域にわたって配列決定された、ＰＣＲフラグメントを表す。
【図３】図３は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の３つの別個の部分に分かれている；トウモロコシゲノムＤＮＡを含む５’境界領域、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含む３’境界領域。挿入物の概略図の下のボックスは、ゲノム境界領域に位置するか、またはイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のゲノムＤＮＡから増幅されたトウモロコシゲノムＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡ挿入物の５’および３’結合領域を横断して位置する、ＰＣＲフラグメントを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
以下の定義および方法は、本発明をよりよく規定し、かつ、本発明の実施において当業者を導くために提供される。他に断らない限り、用語は、関連分野の当業者によって慣例的用法に従って理解されるべきである。分子生物学の共通語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，第５版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４にも見出され得る。米国特許法施行規則１．８２２に示されるようなＤＮＡ塩基に関する命名法が用いられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」とは、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「トウモロコシ（ｃｏｒｎ）」とは、Ｚｅａ ｍａｙｓまたはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）を意味し、野生種トウモロコシを含む、トウモロコシと交配され得るすべての植物品種を含む。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＳ−５９１２２−７特異的」とは、植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品（生鮮品もしくは加工品）などの製品中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を差別的に同定するのに適したヌクレオチド配列をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「昆虫抵抗性」および「害虫に影響を与える」とは、任意の発育段階で、昆虫の摂食、成長、および／または行動に変化を生じさせることをいい、この変化としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：昆虫の殺虫；成長の遅延；生殖能力の抑制；摂食の阻害；など。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「殺虫活性」および「殺虫力」は、多数のパラメータによって測定され得る、生物または物質（例えば、タンパク質など）の活性をいうために同義的に用いられ、これらのパラメータとしては、この生物または物質を餌として常食した後、および／あるいはこの生物または物質に適当な時間曝露した後の、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避性、ならびに害虫の他の行動変化および物理的変化が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「殺虫性タンパク質」は、それ自体で、または他のタンパク質と組み合わせて、殺虫活性を示すタンパク質である。
【００３７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「コードする」または「コードされる」は、特定の核酸に関連して使用される場合には、この核酸が、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を誘導するのに必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされている情報は、コドンの使用により特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでいてもよく、このような介在性の非翻訳配列を欠いていてもよい（例えば、ｃＤＮＡのように）。
【００３８】
「遺伝子」とは、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをいう。「天然型遺伝子」とは、遺伝子自体の調節配列とともに天然に見出されるような遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されることのない調節配列およびコード配列を含む、天然型遺伝子ではない任意の遺伝子をいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または、同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置に存在する天然型遺伝子をいう。「外来」とは、所定の位置には通常見出されない材料をいう。従って、「外来ＤＮＡ」は、組換えＤＮＡと、新たに導入され再配列された植物ＤＮＡの両方を含み得る。「外来」遺伝子とは、宿主生物中で通常見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子をいう。外来遺伝子は、非天然型の生物中に挿入された天然型遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。組換ＤＮＡが挿入された、植物ゲノム中の部位は、「挿入部位」または「標的部位」と呼ばれ得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「挿入ＤＮＡ」とは、植物材料を形質転換するのに用いられる発現カセット内の異種ＤＮＡをいい、一方、「隣接ＤＮＡ」は、植物などの生物中に天然に存在するゲノムＤＮＡか、元の挿入ＤＮＡ分子（例えば、形質転換事象に関与するフラグメント）にとって外来性の、形質転換プロセスによって導入された外来（異種）ＤＮＡのいずれかで存在し得る。「隣接領域」または「隣接配列」とは、本明細書中で使用される場合、元の外来挿入ＤＮＡ分子のすぐ上流に隣接して、または、元の外来挿入ＤＮＡ分子のすぐ下流に隣接して位置する、少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対、そして最大５０００塩基対までの配列をいう。外来ＤＮＡのランダムな組み込みを引き起こす形質転換手順により、各形質転換体に特徴的かつ特有の異なる隣接領域を含む形質転換体が生じる。組換えＤＮＡが従来の交配によって植物に導入される場合、その隣接領域は、一般に変化しない。形質転換体はまた、１つの異種挿入ＤＮＡとゲノムＤＮＡの断片間に、または２つのゲノムＤＮＡの断片間に、または２つの異種ＤＮＡの断片間に、特有の結合部を含む。「結合部」は、２つの特定のＤＮＡフラグメントが結合する点である。例えば、結合部は、挿入ＤＮＡが隣接ＤＮＡと結合するところに存在する。２つのＤＮＡフラグメントが、天然の生物において見出される様式を改変した様式で結合する、形質転換生物にも、結合点が存在する。「結合部ＤＮＡ」とは、結合点を含むＤＮＡをいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、核酸に関する「異種」は、外来種が起源であるか、あるいは同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、組成および／または遺伝子座がその天然型から実質的に改変されている核酸である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結するプロモーターは、このヌクレオチド配列が由来する種とは異なる種に由来し得るか、あるいは同じ種に由来する場合は、プロモーターは、天然にはこのヌクレオチド配列に作動可能に連結して見出されない。異種タンパク質は、外来種が起源であってもよく、または同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、その本来の型から実質的に改変されている。
【００４１】
「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列をいい、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【００４２】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御し得るヌクレオチド配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーター配列は、近位の上流因子およびより遠位の上流因子からなり、後者のより遠位の上流因子は、しばしばエンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るヌクレオチド配列であり、かつ、プロモーターの内在的な因子であっても、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種因子であってもよい。プロモーターは、その全体が天然型遺伝子に由来してもよく、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子で構成されていてもよく、さらには合成ヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターは、異なる組織型または細胞型において、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を行わせ得ることが、当業者に理解される。核酸フラグメントを、ほとんどの細胞型においてほとんどいつでも発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な、種々の型の新しいプロモーターは、常に発見され続けており、多数の例が、ＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇによる編集物（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２に見出され得る。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さの核酸フラグメントが同じプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００４３】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するヌクレオチド配列をいう。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性および／または翻訳効率を含む、多数のパラメータに影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は、記載されている（ＴｕｒｎｅｒおよびＦｏｓｔｅｒ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５−２３６）。
【００４４】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列をいい、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０に例示される。
【００４５】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード配列によって決定される特定の順序で配列される、アミノ酸の鎖である。
【００４６】
ＤＮＡ構築物は、１つ以上の発現カセットを提供する、連結されたＤＮＡ分子の集合体である。ＤＮＡ構築物は、細菌細胞中で自己複製することが可能であり、かつ、機能的な遺伝因子（すなわち、中でも、プロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、３’終結領域）を提供するＤＮＡ分子を導入するのに有用な、種々のエンドヌクレアーゼ酵素の制限部位を含むプラスミドであってもよく；あるいは、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ分子の直鎖状の集合体（例えば、発現カセット）であってもよい。ＤＮＡ構築物中に含まれる発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写をもたらすのに必要な遺伝因子を含む。発現カセットは、原核細胞または真核細胞中で発現されるように設計され得る。本発明の実施形態の発現カセットは、植物細胞中で発現されるように設計される。
【００４７】
本発明の実施形態のＤＮＡ分子は、目的の生物における発現のための発現カセット中に提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された５’および３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していることを意味し、そして２つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には、これらの核酸配列が隣接し、かつ同じリーディングフレーム中に存在することを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーター配列と第二の配列の間の機能的結合を指すことが意図され、このプロモーター配列が、第二の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始させ、かつ媒介する。このカセットは、生物に同時形質転換される少なくとも１つのさらなる遺伝子をさらに含み得る。あるいは、さらなる遺伝子（単数または複数）が、複数の発現カセットまたは複数のＤＮＡ構築物上に提供され得る。
【００４８】
発現カセットは、５’から３’の転写方向に、以下を含む：宿主としての役割を果たす生物において機能的な、転写および翻訳開始領域、コード領域、ならびに転写および翻訳終結領域。転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物にとって天然または類似であっても、あるいは外来または異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列であっても、あるいは合成配列であってもよい。発現カセットは、発現カセット構築物中に５’リーダー配列をさらに含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を促進するように作用し得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、その遺伝子型が、異種核酸の存在によって改変された、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位、または植物（最初にそのように改変されたこれらのトランスジェニック、およびこの最初のトランスジェニックからの有性交配または無性増殖によって作製されたものを含む）を含むと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック」は、従来の植物育種方法によるか、または天然に存在するイベント（例えば、ランダムな交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異）による、ゲノム（染色体のまたは染色体外の）の改変を含まない。
【００５０】
トランスジェニック「イベント」は、目的の導入遺伝子を含む核酸発現カセット、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入によって生じる植物個体群の再分化、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる特定の植物の選択を含む、異種ＤＮＡ構築物（単数または複数）を用いた植物細胞の形質転換によって作製される。イベントは、導入遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」はまた、形質転換体と異種ＤＮＡを含む別の変種との間の有性異系交配によって作製された後代をいう。反復親への戻し交配が繰り返された後でさえ、形質転換親由来の挿入ＤＮＡおよび隣接ＤＮＡは、同じ染色体位置で交配の後代に存在する。用語「イベント」はまた、挿入ＤＮＡおよびこの挿入ＤＮＡに直接隣接した隣接配列を含む、もとの形質転換体由来のＤＮＡをいい、この隣接配列は、挿入ＤＮＡを含む親株（例えば、もとの形質転換体および自家受粉により生じる後代）と挿入ＤＮＡを含まない親株との有性交配の結果として、目的の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に移入されることが予期される。
【００５１】
昆虫抵抗性ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物は、以下の工程によって育種され得る：昆虫抵抗性を付与する本発明の実施形態の発現カセットを用いた形質転換によって誘導された、トランスジェニックＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物およびその後代から成長したトウモロコシ植物からなる第一の親トウモロコシ植物と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ植物との第一の有性交配によって、複数の第一の後代植物を作製する工程；次いで、昆虫に対して抵抗性を示す第一の後代植物を選択する工程；およびこの第一の後代植物を自家受粉させることによって、複数の第二の後代植物を作製する工程；次いで、この第二の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択する工程。これらの工程は、第一の昆虫抵抗性後代植物または第二の昆虫抵抗性後代植物を、第二の親トウモロコシ植物または第３の親トウモロコシ植物に戻し交雑することにより、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、およびそれらの後代への言及を含む。予め本発明のＤＮＡ分子で形質転換されており、従って少なくとも部分的にトランスジェニック細胞からなる、トランスジェニック植物またはそれらの後代を起源とする、例えば植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、ならびに花、茎、果実、葉、および根を含む、本発明の範囲内にあると理解されるトランスジェニック植物の部位もまた、本発明の実施形態である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「植物細胞」は、限定されないが、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。本発明の方法に用いられ得る植物のクラスは、一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む、形質転換技術を受け入れ可能な高等植物のクラスと同程度に広い。
【００５４】
「形質転換」とは、遺伝学的に安定した遺伝を生じる、宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物という。植物の形質転換方法の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）および粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号、本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。さらなる形質転換方法は、以下に開示される。
【００５５】
このように、本発明の単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能な、組換え構築物（典型的には、ＤＮＡ構築物）中に組み込まれ得る。このような構築物は、ポリペプチドのコード配列を所定の宿主細胞内で転写および翻訳することが可能な複製系および配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定なトランスフェクションに適した、またはトランスジェニック植物の構築に適した多数のベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（１９８５；補遺、１９８７）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＦｌｅｖｉｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下に１つ以上のクローン化植物遺伝子ならびに優性選択マーカーを含む。このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性もしくは構成的発現、環境的にもしくは発生的に調節された発現、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【００５６】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、２つの独立的に分離している付加された外来遺伝子を含む子孫を作製することも可能であることも、理解されるべきである。適切な後代の自家受粉により、両方の付加された外来遺伝子のホモ接合体である植物を作製し得る。親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配もまた、栄養体生殖と同様に企図される。種々の形質および作物に一般に用いられる他の育種方法の記載は、いくつかの参考文献の１つに見出され得る（例えば、Ｆｅｈｒ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｓ Ｊ．編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７））。
【００５７】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素）が付着された単離核酸である。このようなプローブは、標的核酸鎖（本発明の場合には、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のＤＮＡを含むサンプルに由来するか、またはトウモロコシ植物に由来する、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来の単離ＤＮＡ鎖）に相補的である。本発明に従うプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のみならず、ポリアミド、および標的ＤＮＡ配列に特異的に結合してこの標的ＤＮＡ配列の存在を検出するのに用いられ得る、他のプローブ材料も含む。
【００５８】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離核酸である。本発明のプライマー対とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用をいう。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅に用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号を参照のこと；これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００５９】
プローブおよびプライマーは、操作者によって決定されたハイブリダイゼーション条件または反応条件において、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択された検出方法に役立つのに十分な長さの任意の長さであってもよい。一般に、１１ヌクレオチド以上、１８ヌクレオチド以上、および２２ヌクレオチド以上の長さが用いられる。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズする。標的ＤＮＡ配列と異なり、かつ標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を保持しているプローブが、従来の方法によって設計され得るが、本発明の実施形態に従うプローブおよびプライマーは、標的配列と隣接するヌクレオチドの完全なＤＮＡ配列類似性を有し得る。プローブは、プライマーとして用いられ得るが、一般に、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅プロセスでは用いられない。
【００６０】
特異的プライマーは、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための「特異的プローブ」として用いられ得るアンプリコンを生成するために、組込みフラグメントを増幅するのに用いられ得る。プローブが、生物学的サンプルの核酸と、プローブのサンプルへの結合を可能にする条件下でハイブリダイズされる場合、この結合は検出され得るので、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在を示すことが可能になる。このような結合プローブの同定は、当該分野で記載されている。本発明の実施形態において、特異的プローブは、最適条件下でイベントの５’または３’隣接領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、そしてまた、この領域と隣接する外来ＤＮＡの一部を含む配列である。特異的プローブは、イベントの特定の領域に対して、少なくとも８０％の、８０〜８５％の間の、８５〜９０％の間の、９０〜９５％の間の、および９５〜１００％の間の同一性（または相補性）を有する配列を含み得る。
【００６１】
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期更新）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２」）；およびＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；およびＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５（著作権），１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）のＰＣＲプライマー分析ツールのような、その目的を意図したコンピュータープログラムを用いて、既知の配列から得られ得る。さらに、この配列が視覚的にスキャンされ得、そしてプライマーが当業者に公知のガイドラインを用いて手動で同定される。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「キット」とは、本発明の方法の実施形態（より詳細には、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７の同定）を実行するための試薬一式をいう。本発明のキットが用いられ得、その構成要素は、品質管理（例えば、種子ロットの純度）の目的、植物材料あるいは植物材料を含むかまたは植物材料に由来する材料（例えば、限定されないが、食品または飼料製品）中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を検出する目的のために、特別に調整され得る。本明細書中で使用される場合、「植物材料」とは、植物から得られるか、または植物に由来する材料をいう。
【００６３】
本明細書中に開示される隣接ＤＮＡ配列および挿入配列に基づくプライマーならびにプローブは、従来の方法によって（例えば、このような配列をリクローニングし、かつ配列決定することによって）、開示された配列を確認するために（そして必要な場合には、補正するために）用いられ得る。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法が、サンプル中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を同定するのに用いられ得る。核酸分子またはそのフラグメントは、ある特定の状況下で、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、これらの２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成し得る場合、互いに特異的にハイブリダイズし得るといわれる。
【００６４】
核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書中で使用される場合、分子は、これらの分子の１つのすべてのヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すといわれる。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「最低限に相補的」であるといわれる。同様に、これらの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「相補的」であるといわれる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＨａｙｍｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））によって記載されており、従って、完全な相補性からの逸脱は、このような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げることのない限り、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、用いられる特定の溶媒および塩濃度下で安定な二本鎖構造が形成され得るのに十分に相補的な配列であることが必要であるにすぎない。
【００６５】
ハイブリダイゼーション反応における特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。熱融点（Ｔｍ）は、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、以下のＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（１９８４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４）から概算され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、ハイブリッドの塩基対長さである。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％よりも高い同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃低下させ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体についてのＴｍよりも約５℃低く選択される。しかし、厳しくストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェンシーの条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
【００６６】
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較される核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件（例えば、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃にて２×ＳＳＣの洗浄）は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０〜８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。本発明の核酸は、中程度にストリンジェントな条件下で、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントまたはその相補体あるいはそのいずれかのフラグメントに特有の１つ以上の核酸分子に、特異的にハイブリダイズし得る。
【００６８】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。従って、任意の２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アラインメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７におけるように改変）である。
【００６９】
これらの数学アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。このような実行としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）；ＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラム（バージョン３．０，著作権 １９９７）；ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１，ＵＳＡから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ。これらのプログラムを使用するアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実行され得る。
【００７０】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５−６５（１９９２）、ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：３０７−３３１（１９９４）によって、十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムおよびＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）前出のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）前出のアルゴリズムに基づく。データベース類似性検索に用いられ得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては、以下が挙げられる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；ならびにヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１９章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと。アラインメントはまた、目視検査によって手動で実行され得る。
【００７１】
比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中）が、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行するために用いられ得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のためのＢＬＡＳＴＸ）が用いられ得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列との関連において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性パーセントが使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって、しばしば異なることが理解される。このような保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存的置換をスコア付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、このマッチ位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００７４】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、ＤＮＡ熱増幅反応において、プライマー対が、標的核酸配列（この標的核酸配列に、対応する野生型配列を有するプライマー（またはその相補体）が結合し、好ましくは特有の増幅産物（アンプリコン）を産生する）にのみハイブリダイズすることを可能にする条件である。
【００７５】
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含むサンプル中の標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「増幅したＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅産物をいう。例えば、有性交配の結果得られたトウモロコシ植物が、本発明のトウモロコシ植物に由来するトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含むか否かを決定するために、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出されたＤＮＡを、ＤＮＡプライマー対（挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する隣接配列に由来する第一のプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来し、イベントＤＮＡの存在の診断に用いるアンプリコンを生成する第二のプライマーを含む）を用いた核酸増幅方法に供し得る。あるいは、第二のプライマーは、隣接配列に由来し得る。アンプリコンは、イベントに特徴的でもある長さおよび配列を有する。アンプリコンは、プライマー対に１ヌクレオチド塩基対を合わせた長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって生成可能なアンプリコンの任意の長さまでの長さの範囲であり得る。あるいは、プライマー対は、ＰＨＩ１７６６２Ａ発現構築物の挿入ヌクレオチド配列全体およびトランスジェニック挿入物に隣接する配列を含む、アンプリコン（図１（配列番号２３）を参照、サイズ約１２Ｋｂ）を生成するように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列から得られ得る。隣接配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列から距離を置いて配置されてもよく、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界までか、または約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを特異的に排除する。
【００７７】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、当該分野で公知の種々の核酸増幅方法のいずれかによっても達成され得る。種々の増幅方法が当該分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される。ＰＣＲ増幅方法は、２２Ｋｂ以下のゲノムＤＮＡおよび４２Ｋｂ以下のバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９，１９９４）。これらの方法およびＤＮＡ増幅の分野で公知の他の方法は、本発明の実施形態の実施に用いられ得る。特定のＰＣＲプロトコルにおける多数のパラメータは、特定の実験室条件に調整される必要があり得、わずかに変更され得るが、なおも類似の結果の収集を可能にすることが理解される。これらの調整は、当業者には明らかである。
【００７８】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出され得、その技術としては、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４１６７−４１７５，１９９４）（ここでは、隣接する隣接ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方と重複する、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される）が挙げられるが、これに限定されない。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル中に固定化される。目的の領域のＰＣＲ（挿入配列中に１つのプライマーおよび隣接する隣接配列中に１つのプライマーを用いて）の後、一本鎖ＰＣＲ産物は、固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、そしてＤＮＡポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いた、一塩基伸長反応のためのテンプレートとして機能する。読み出しは、蛍光であっても、またはＥＬＩＳＡベースであってもよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７９】
別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，２０００）によって記載されるようなパイロシーケンシング技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列中に１つのプライマーおよび隣接配列中に１つのプライマー）にハイブリダイズされ、そしてＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に添加され、そして取り込みにより、測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基または多塩基伸長による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００８０】
Ｃｈｅｎらによって記載されるような蛍光偏光（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２−４９８，１９９９）もまた、本発明のアンプリコンを検出するために用いられ得る方法である。この方法を用いて、オリゴヌクレオチドは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ中に１つのプライマーおよび隣接ＤＮＡ配列中に１つのプライマー）にハイブリダイズされ、そしてＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰの取り込みを生じる。取り込みは、蛍光光度計を用いて、偏光の変化として測定され得る。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００８１】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載されており、製造業者によって提供される説明書で十分に理解される。手短に言うと、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションによって、ＦＲＥＴプローブのクエンチング部分から、蛍光部分の切断および遊離が生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００８２】
分子ビーコンは、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６）に記載されるような配列検出における使用のために記載されている。手短に言えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。ＦＲＥＴプローブの特有の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分を近接した状態で保持する二次構造を含むものとなる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマーおよび隣接配列中に１つのプライマー）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。成功したＰＣＲ増幅の後、ＦＲＥＴプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションによって、プローブの二次構造の除去ならびに蛍光部分およびクエンチング部分の空間的分離が生じる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００８３】
アンプリコン中に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応によって生成されたアンプリコンを検出するために用いられる、さらに別の方法である。
【００８４】
本発明の実施形態は、以下の実施例においてさらに規定される。これらの実施例は、単なる例示として示されることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認し得、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態の種々の変更および改変を行って、種々の用法および条件に適合させ得る。従って、本発明の実施形態の種々の改変は、本明細書中に示されかつ記載される改変の他にも、前述の記載から当業者には明らかである。このような改変も、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【００８５】
本明細書中に示される各参考文献の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
実施例１。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によるトウモロコシの形質転換、ならびにＣｒｙ３４Ａｂ１およびＣｒｙ３５Ａｂ１（Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１）遺伝子を含むトランスジェニック植物の再分化
ＰＨＩ１７６６２Ａと称される、約７．４ＫｂのＤＮＡ分子（配列番号２４）は、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３４Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ−１）遺伝子のプロモーター、５’側非翻訳エキソン、および第１イントロンを含むＤＮＡ分子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＱｕａｉｌ（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を含む、第一の導入遺伝子発現カセットを含む。ＤＮＡ構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３５Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするＤＮＡ分子（Ｈｅｒｔｉｇら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１７１−１７４）を含む。ＤＮＡ構築物の第３の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照）に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を含み、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いた。
【００８７】
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５ Ａｂ１トウモロコシ植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によって得られ、Ｚｈａｏの方法を用いた（米国特許第５，９８１，８４０号、およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９８／３２３２６；これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）。手短に言えば、未熟胚をトウモロコシから単離し、これらの胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液（懸濁液中で、この細菌は、ＰＨＩ１７６６２ ＤＮＡ（配列番号２４）を、少なくとも１つの未熟胚の少なくとも１つの細胞に移入させ得る）と接触させた（工程１：感染工程）。具体的には、この工程では、未熟胚を、播種の開始のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液中に浸漬した。これらの胚を、ある期間、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとともに共培養した（工程２：共培養工程）。具体的には、未熟胚を、感染工程の後に固形培地上で培養した。この共培養期間の後、「休止」工程を行った。この休止工程では、植物形質転換体に対する選択薬剤を添加せず、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの増殖を阻害することが知られている少なくとも１つの抗生物質の存在下で、胚をインキュベートした（工程３：休止工程）。特に、未熟胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの除去および感染細胞の休止期のために、抗生物質を含むが選択薬剤を含まない固形培地上で培養する。次に、播種した胚を、選択薬剤を含む培地で培養し、増殖する形質転換カルスを回収した（工程４：選択工程）。具体的には、未熟胚を、形質転換細胞の選択的増殖を生じる選択薬剤を含む固形培地上で培養した。次いで、カルスを植物に再分化させ（工程５：再分化工程）、そして、具体的には、選択培地上で増殖したカルスを固形培地上で培養して、植物を再分化させた。個々の胚は、培養の間、物理的に分離した状態で維持し、そして外植片の大部分は選択培地上で枯死した。
【００８８】
生存しかつ健全に形成された胚である、グルホシネート耐性カルス組織には、推定形質転換イベントを表す固有の識別コードを付与し、継続的に新鮮な選択培地に移した。それぞれ固有のイベントに由来する組織から植物を再分化させ、温室に移した。葉のサンプルを分子分析のために採取して、ＰＣＲにより導入遺伝子の存在を確認し、そしてＥＬＩＳＡによりＣｒｙ３４／３５Ａｂ１タンパク質の発現を確認した。次いで、植物を、ウェスタンコーンルートワーム害虫を用いた全植物体バイオアッセイに供した。陽性の植物を近交系と交配して、最初の形質転換植物から種子を得た。多くの系を圃場において評価した。ＤＡＳ−５９１２２−７イベントは、昆虫抵抗性および農業生産力を含む優れた特性の組み合わせに基づいて、独立したトランスジェニックイベントの個体群から選択した。
【００８９】
実施例２。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７の同定
イベントＤＡＳ−５９１２２−７からの種子を評価した。Ｔ１Ｓ２種子は、Ｈｉ−ＩＩバックグラウンドへの形質転換の後、近交系ＰＨ０９Ｂとの交配および２回の自家交配を行ったことを表す。全ての種子を、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）から得た。主要な特徴付けは、側方流動デバイスを用いた除草剤の葉面塗布およびＣｒｙ３４Ａｂｌ発現による、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性の確認によって、本研究の間に植物葉組織について行った。
【００９０】
本研究のコントロール物質を、検体バックグラウンドを代表する未改変の種子と定義した。Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂバックグラウンドのコントロール種子を、陰性コントロールとして用いた。これらの未改変の種子は、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子、およびｐａｔ遺伝子の植物転写単位を含まない。全ての種子を、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）から得た。
【００９１】
２つのさらなるＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベント（イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６）に由来するＤＮＡサンプルを、イベント特異的ＰＣＲ分析のための陰性コントロールとして用いた。これらの２つのイベントは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７を作製するのに用いたベクターと同じベクターを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によって作製されたので、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子、およびｐａｔ遺伝子の植物転写単位を含んだ。しかし、イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６中のＴ−ＤＮＡの挿入部位（ゲノムＤＮＡ境界領域を含む）は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中のＴ−ＤＮＡの挿入部位とは異なった。イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６に由来するＤＮＡサンプルを単離し、そしてサザンブロット分析によって特徴付けした。（データは示さず）。
【００９２】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のトウモトコシ種子および未改変のコントロール種子（Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂ）を、ＤｕＰｏｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で生育チャンバー内に植えて、ＤＮＡ分析に十分な数の植物を作製した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７の特徴付けのために、１０個のＴ１Ｓ２種子を植えた。同じく１０個の種子を、それぞれの未改変のコントロール系統につき植えた。１つのポットあたり１個の種子を植え、そのポットを一意に同定した。光および水の調節を含む、植え付けおよび生育条件により、健全な植物の生育がもたらされた。
【００９３】
コントロール植物およびイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物の各々について、葉のサンプルを採取した。各サンプルについて、成長点の上から十分な葉材料を採取し、予めラベル表示したサンプル袋に入れた。採取後に、これらのサンプルをドライアイスの上に配置し、そして超低温フリーザーに移した。すべてのサンプルを、加工するまで凍結状態に維持した。すべての葉のサンプルを、植物識別名および採取日で一意にラベル付けした。
【００９４】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるＣｒｙ３４Ａｂ１タンパク質の発現およびコントロールにおける発現の非存在を確認するために、すべてのイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物およびコントロール植物から葉のサンプルを採取し、そしてＣｒｙ３４Ａｂ１に特異的な側方流動デバイス（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を用いて、トランスジェニックタンパク質についてスクリーニングした。葉のパンチ打ち抜き試料（Ｌｅａｆ ｐｕｎｃｈ）を各植物から採取し、Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝食塩水溶液中で粉砕して、タンパク質を粗抽出した。ストリップデバイスを抽出物中に軽く浸して、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質の存在または非存在を決定した。イムノアッセイの結果を用いて、表１に示すように、分子分析の前に検体植物の同一性を確認した。
【００９５】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７植物におけるフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の発現を確認するために、除草剤の葉面塗布を行った。本研究に用いたすべての植物に葉面塗布を行って、植物の同一性を確認した。植物を、Ｒ１生育段階の前にアッセイした。ＰＡＴ発現トランスジェニック植物の同定のための除草剤の葉面塗布について当該分野で公知の標準手順に従って、アッセイを行った。具体的には、各植物の１枚の葉の一部を、グルホシネート除草剤であるＢａｓｔａ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ）の約２％水溶液で処理し、塗布４〜１２日後に、塗布を行った葉の領域における褐色または壊死組織について、視覚的に検査した。各植物の結果を記録し、表１に示すような各試験植物におけるＰＡＴの発現を決定するために用いた。表１に示すように、イベントＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２世代について試験した１０種の植物のうち、６種の植物は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＰＡＴの両方を発現したが、４種の植物は、いずれのタンパク質も発現しなかった。すべての未改変のコントロールは、ＣｒｙＡｂ１およびＰＡＴの両方のアッセイについて陰性と出た（データは示さず）。
【００９６】
表１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＰＡＴタンパク質発現ならびにＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのサザンハイブリダイゼーションデータ
【００９７】
【表１】
１．陽性のＣｒｙ３４Ａｂ１発現は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質検出に特異的な、イムノアッセイに基づく側方流動デバイスによって決定されるようなタンパク質発現の検出を示す。陰性は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質が検出されないことを示す。陽性のＰＡＴ発現は、除草剤処理に抵抗性であった植物を示し、そして陰性は、除草剤に感受性であった植物を示す。
【００９８】
２．＋は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルを示し；−は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルがないことを示す。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブは、１．９１５ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブは、２．６０７ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そしてｐａｔ遺伝子プローブは、３．４ｋｂ境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット分析によって決定されるような単一のインタクトなＴ−ＤＮＡ挿入と一致していた。
【００９９】
実施例３．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７のサザンブロット分析
１グラム量の葉サンプルを液体窒素下で粉砕し、ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いるか、または標準尿素抽出緩衝液手順を用いて単離した。抽出後にＤＮＡを、ＤＮＡ品質を決定するためにアガロースゲル上で可視化し、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および分光蛍光分析を用いて定量した。
【０１００】
１Ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、アガロースゲル上のＤＮＡフラグメントサイズを推定した。
【０１０１】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７植物から単離されたゲノムＤＮＡを、当該分野で公知の標準手順を用いて、Ｎｃｏ Ｉで消化し、電気泳動的に分離し、ナイロン膜に転写し、そしてｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブ、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブおよびｐａｔ遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。ブロットをＸ線フィルムに１期間以上曝露して、ハイブリダイズしているフラグメントを検出し、かつ分子量標準を可視化した。次いで、画像をＸ線フィルム撮影によって、および／またはＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（商標）機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いた検出によって、デジタル形式で取り込んだ。検出されたバンドのサイズを、各プローブについて記録した。サザンブロット分析を、試験植物における挿入の存在を検証する手段として用い、イベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のすべての植物が、表１に示すような挿入と同じ挿入を含むことを確認した。（サザンブロットは図示せず。）サザンブロット分析は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７がプラスミドＰＨＰ１７６６２に由来するＴ−ＤＮＡ領域のインタクトなコピーからなる単一挿入を含むことを示し、一方、ヌル分離個体は、タンパク質発現分析によって決定されたように、遺伝子プローブにハイブリダイズしなかった。さらに、２つのタンパク質を発現するイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物は、サザンブロットで同一のハイブリダイゼーションパターンを示した（データは示さず）。具体的には、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブは、１．９１５ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブは、２．６０７ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そしてｐａｔ遺伝子プローブは、３．４ｋｂ境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット結果によって決定されるような単一のインタクトなＴ−ＤＮＡ挿入と一致していた。
【０１０２】
実施例４。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７のＴ−ＤＮＡ挿入および隣接境界領域の配列決定
Ｔ−ＤＮＡ挿入および隣接境界領域を、図２および３に図示するように、ＰＣＲに基づく方法を用いてＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ５９１２２−７からクローン化した。具体的には、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入物の５’および３’末端に接する配列を、２つのゲノムウォーキング技術を用いて得た。第一のウォーキング方法は、本質的には、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）について記載されるような方法であり、そして第二の方法は、Ｓｔｏｖｅｒ（２００１年、Ｕ．Ｃ．Ｉｒｖｉｎｅ（私信））によって記載されるように改変された、Ｄｅｖｏｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（９）：１６４４−１６４５に概説されたｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅプロトコルに従って行った。
【０１０３】
手短に言えば、ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ法のために、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｓｍａ ＩおよびＳｔｕ Ｉ、ならびにｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ法のために、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、およびＸｂａ Ｉ）で消化し、次いでＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ法のための平滑末端アダプターおよびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ法に用いた制限酵素に特異的なアダプターに連結した。両方のゲノムウォーキング法のためのアダプターは、ＰＣＲの間のアダプターの３’末端の伸長を阻止するように設計し、したがって非特異的増幅を減少させるかまたは排除した。次いで、アダプター連結したゲノムＤＮＡフラグメントを、ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｅｒライブラリーまたはｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅライブラリー（各制限酵素につき１つのライブラリー）と称した。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７の３つの個々のＴ１Ｓ２植物（植物ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １、ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ ２およびＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １０）から、ならびに１つのＨｉ−ＩＩおよび１つのＰＨ０９Ｂコントロール植物から単離されたゲノムＤＮＡから、ライブラリーを調製した。
【０１０４】
ライブラリーの構築後に、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、標的配列を増幅させるために、ネステッドＰＣＲ増幅を完了させた。一次ＰＣＲ増幅は、アダプターに同一性を有する１つのプライマーおよび１つの遺伝子特異的プライマーを用いた。アダプタープライマーは、一次ＰＣＲの第一サイクルでの産物を増幅せず、遺伝子特異的プライマーからの産物のみを生成する。アダプタープライマーのアニーリングおよびアダプタープライマーからの増幅は、相補鎖が遺伝子特異的プライマーから生成した後にのみ起こる。一次ＰＣＲ増幅の後、二次ネステッドＰＣＲ反応を行って、ゲノムＰＣＲ反応の特異性を増加させた。ネステッドプライマーは、一次ＰＣＲに用いたそれぞれのプライマーにとって内部の遺伝子特異的およびアダプター特異的配列からなった。
【０１０５】
５’隣接境界配列についてネステッドＰＣＲを、挿入されたＴ−ＤＮＡの５’末端に特異的なプライマーとともに、消化されたＤＮＡ上に連結されたアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。同様に、３’隣接境界配列のクローニングを、挿入されたＴ−ＤＮＡの３’末端に特異的なプライマーおよびアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。Ｔ−ＤＮＡ領域内のＴ−ＤＮＡの右境界配列および左境界配列にとって内部のＤＮＡ配列を、トウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト（ｗａｌｋｉｎｇ ｏｕｔ）」のための開始点として用いた。なぜなら、これらのＤＮＡ配列は、ゲノムウォーキングプライマーを固着する特有の配列（内在性トウモロコシゲノム配列に相同ではない）を示すためである。
【０１０６】
ネステッドＰＣＲによって生成した産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した（データは示さず）。１つ以上のイベントＤＡＳ−５９１２２−７ ＤＮＡサンプルから調製したライブラリーで見られ、かつ、Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９ＢゲノムＤＮＡサンプルから調製したライブラリーに存在しないフラグメントを、さらなる特徴付けのために同定した。同定されたＰＣＲ増幅フラグメントを、予備的なゲル電気泳動で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、そして配列決定に直接供するか、またはＤＮＡ配列決定の前に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドベクターにクローン化した。配列決定反応を、ネステッドＰＣＲ増幅に用いたプライマーを用いるか、またはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。得られた配列を用いてさらなる遺伝子特異的プライマーを設計し、未知のトウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト」を継続した。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の末端から少なくとも５００ｂｐの境界配列が得られるまで、複数回のゲノムウォーキングを行った。
【０１０７】
隣接境界配列の妥当性を保証するために、イベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のゲノムＤＮＡについてのさらなるイベント特異的ＰＣＲ増幅を行った。増幅されたフラグメントを、Ｔ−ＤＮＡ挿入領域から５’および３’境界ゲノムＤＮＡの中に重複する配列の領域をさらに伸長するために、配列決定した。プライマー（表２に示す）を、Ｔ−ＤＮＡとトウモロコシゲノムＤＮＡとの特有の結合部をつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット０３−Ｏ−５０６／０２−Ｏ−４７６（配列番号１０／配列番号９）は、５’結合部をつないで、３１３ｂｐのフラグメント（ｂｐ２４２７からｂｐ２７３９まで、図１参照）を増幅し、プライマーセット０２−Ｏ−４４７／０３−Ｏ−５７７（配列番号８／配列番号１７）は、３’結合部をつないで、７５４ｂｐのフラグメント（ｂｐ９６２３からｂｐ１０３７６まで、図１参照）を増幅した。
【０１０８】
表２。プライマー配列
【０１０９】
【表２】
１．イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列中の位置（図１参照）。塩基１〜２５９３＝５’境界、塩基２５９４〜９９３６＝Ｔ−ＤＮＡ挿入物、塩基９９３７〜１１９２２＝３’境界。
【０１１０】
トウモロコシゲノム中に挿入されたＤＮＡ配列を検証するために、ＰＣＲを行って、イベントＤＡＳ−５９１２２−７から、挿入されたＴ−ＤＮＡを増幅、クローン化、および配列決定した。表３に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号１１／配列番号５）；（配列番号４／配列番号７）；および（配列番号６／配列番号３）を用いて、２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７）と称される３つの重複するフラグメント（イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのＴ−ＤＮＡ挿入物ｂｐ２６８７〜ｂｐ９８４６のＴ−ＤＮＡの５’領域から３’領域までに及ぶ配列を示す（図１参照））を増幅した。ＰＣＲアンプリコン情報を表３に報告し、そしてプライマー配列を表２に列挙した。
【０１１１】
表３。ＰＣＲプライマーおよびアンプリコンの記載
【０１１２】
【表３】
１．イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列中の位置（図１参照）。塩基１〜２５９３＝５’境界、塩基２５９４〜９９３６＝Ｔ−ＤＮＡ挿入物、塩基９９３７〜１１９２２＝３’境界。
【０１１３】
ＰＣＲ ＧＣ２ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ポリメラーゼキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を製造業者の説明書に従って使用して、挿入フラグメント（２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７））を増幅した。手短に言えば、５０μＬの反応物は、５’および３’プライマー（最終濃度０．２μＭ）、ならびに４０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、植物ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １およびＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ ２由来のゲノムＤＮＡ調製物を用いて、２連で設計した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９５℃で１分間の初期変性、続いて９４℃／９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で５分間を３５サイクル、ならびに６８℃で６分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、エチジウムブロマイドで染色した１×ＴＢＥ（８９ｍＭトリスホウ酸塩，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲルを通して電気泳動した。
【０１１４】
ＰＣＲフラグメント２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７）を、エチジウムブロマイドで染色した１×ＴＢＥ中の０．８％アガロースゲルからフラグメントを切り出すことによって精製し、そしてこのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースから精製した。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドベクターにクローン化した。クローン化フラグメントを、プラスミドＤＮＡの少量調製（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）およびＮｏｔ Ｉでの制限酵素消化によって確認した。次いで、プラスミドクローンおよび／または精製されたＰＣＲ挿入フラグメントを、完全な挿入物の配列決定に供した。配列決定反応を、既知のＴ−ＤＮＡ配列に特異的であるように設計されたプライマーを用いるか、またはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）は、すべてのＰＣＲプライマー（ＰＣＲ反応において、最終濃度０．２〜０．４μＭで用いた）を合成した。
【０１１５】
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７、ＤＡＳ−４５２１４−４、およびＤＡＳ−４５２１６−６、ならびに未改変のコントロール系統Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂから単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応を用いて、以下を確認した：（１）イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列決定された境界領域におけるトウモロコシゲノムＤＮＡの存在、および（２）イベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるＴ−ＤＮＡ挿入物とゲノムＤＮＡ境界の結合部を横断するイベント特異的増幅。
【０１１６】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入物に隣接する境界配列を増幅するために設計されたＰＣＲプライマーを用いて、未改変のコントロール系統およびイベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるこれらの領域の存在を確認した。５’および３’境界について、それぞれ２つのプライマーセット（計４セット）を試験した。プライマーセット０３−Ｏ−７８４／０３−Ｏ−５６４（配列番号１８／配列番号１４）および０３−Ｏ−７８４／０３−Ｏ−５４３（配列番号１８／配列番号１３）を用いて、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の境界配列５’からＴ−ＤＮＡ挿入物まで、それぞれ１３６ｂｐフラグメントおよび２６３ｂｐフラグメントを増幅した（図２および３）。同様に、プライマーセット０３−Ｏ−５６９／０３−Ｏ−５７７（配列番号１５／配列番号１７）および０３−Ｏ−５７０／０３−Ｏ−５４２（配列番号１６／配列番号１２）を用いて、３’ゲノム境界から、それぞれ２２７ｂｐフラグメントおよび４９２ｂｐフラグメントを増幅した（図２および図３）。
【０１１７】
境界配列とＴ−ＤＮＡ挿入物の結合部を横断するフラグメントを増幅するように設計されたプライマーを用いて、イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのイベント特異的なＰＣＲフラグメントを構築した。２つの結合部につき、１つのプライマーセットを選択した。プライマーセット０３−Ｏ−７８４／０２−Ｏ−２１５（配列番号１８／配列番号１）を、５’結合部を横断する５５５ｂｐフラグメントを増幅するように設計し、そしてプライマーセット０２−Ｏ−２１９／０３−Ｏ−５７７（配列番号２／配列番号１７）を、３’結合部で５４７ｂｐフラグメントを増幅するように設計した。内在性トウモロコシインベルターゼ遺伝子に基づくプライマーのセットである、ＩＶＲ１（Ｏ１９７）（配列番号３９）５’−ＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣ−３’およびＩＶＲ２（Ｏ１９８）（配列番号４０）５’−ＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＡＴＣ−３’（Ｈｕｒｓｔら、（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ５（６）：５７９−５８６）を用いて、すべてのトウモロコシゲノムＤＮＡサンプルに対する内部陽性コントロールとして２２６ｂｐ増幅産物を生成した。
【０１１８】
すべてのＰＣＲプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃによって合成され、ＰＣＲ反応において最終濃度０．２〜０．４μＭで用いられた。ＰＣＲプライマー配列を表２に列挙する。ＰＣＲ増幅のために、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣ ２ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造業者の説明書に従って使用した。ＰＣＲ反応物５０μＬ当たり、約１０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレートを使用した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９４℃で５分間の初期テンプレート変性、続いて９５℃で１分間、６０℃で２分間、および７２℃で３分間を３５サイクル、ならびに７２℃で７分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、１×ＴＢＥおよびエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルを通して電気泳動した。
【０１１９】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のＴ−ＤＮＡ挿入物および境界領域について得られた配列決定データを検討し、Ｓｅｑｍａｎ ＩＩ（商標）ソフトウェアバージョン４．０．５（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアセンブルした。イベントＤＡＳ−５９１２２−７に存在する挿入物に隣接する５’および３’境界配列を、ＧｅｎＢａｎｋ公開データベースに対する相同性検索に用いて、トウモロコシゲノム中の挿入部位をさらに特徴決定した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７における隣接境界とＴ−ＤＮＡ挿入物との間の結合領域中のオープンリーディングフレームを同定する分析を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ８．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ（商標），Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて行った。
【０１２０】
全体で、イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノムＤＮＡに由来する１１９２２ｂｐの配列を確認した（図１参照）。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の５’末端で、２５９３ｂｐの隣接境界配列が同定され、そして１９８６ｂｐの隣接境界配列が、ゲノムウォーキング実験で得られたフラグメントの３’末端で得られた。２２Ｉ−１（２５０１ｂｐ）（配列番号２５）、２２Ｉ−２（３０２７ｂｐ）（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（２８３０ｂｐ）（配列番号２７）と称される、３つの重複するフラグメント（イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのＴ−ＤＮＡ挿入物ｂｐ２６８７〜ｂｐ９８４６のＴ−ＤＮＡの５’領域から３’領域までに及ぶ配列を示す（図１参照））を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーセットを用いて、全体で７１６０ｂｐのＴ−ＤＮＡ挿入物をクローン化および配列決定した。トウモロコシゲノムＤＮＡとＴ−ＤＮＡ挿入物の５’および３’結合部とをそれぞれつなぐ、２つのＰＣＲフラグメント、Ｏ５０６／Ｏ４７６（配列番号１０／配列番号９）およびＯ４４７／Ｏ５７７（配列番号８／配列番号１７）から、Ｔ−ＤＮＡ挿入領域の残りを配列決定した。用いたプライマーは、Ｔ−ＤＮＡの特有の結合部とトウモロコシゲノムＤＮＡとをつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット０３−Ｏ−５０６／０３−Ｏ−４７６（配列番号１０／配列番号９）は、５’結合部をつないで、３１３ｂｐのフラグメント（ｂｐ２４２７からｂｐ２７３９まで）を増幅し、そしてプライマーセット０３−Ｏ−４４７／０３−Ｏ−５７７（配列番号８／配列番号１７）は、３’結合部をつないで、７５４ｂｐのフラグメント（ｂｐ９６２３からｂｐ１０３７６まで）を増幅した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７における、合わせて合計７３４３ｂｐのＴ−ＤＮＡ挿入物を、クローン化および配列決定し（ｂｐ２５９４からｂｐ９９３６まで、図１参照）、そして形質転換プラスミド（ＰＨＰ１７６６２）の配列と比較した。ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２で異なる２つのヌクレオチドが、Ｔ−ＤＮＡ挿入物の非翻訳コムギペルオキシダーゼプロモーター領域に認められた（図１参照）。Ｔ−ＤＮＡ挿入物のオープンリーディングフレーム組成に影響を及ぼす塩基変化は認められなかった。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の３’および５’末端領域のいずれも、Ｔ−ＤＮＡの右側境界領域を含む５’末端の最後の２２ｂｐおよびＴ−ＤＮＡの左側境界領域を含む３’末端の２５ｂｐが欠失している以外は、インタクトであることが見出された。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ゲノムへのＴ−ＤＮＡ挿入に重要な役割を果たすことが知られているが、この結果は予想外のものではなかった。なぜなら、挿入はしばしば、特にＴ−ＤＮＡの左側境界で不完全であるためである（Ｔｉｎｌａｎｄ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １（６）：１７８−１８４）。
【０１２１】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノム境界領域のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析は、公的に利用可能な配列（Ｒｅｌｅａｓｅ １３８．０ ＧｅｎＢａｎｋ，２００３年１０月２５日）との制限された相同性を示した。５’境界領域の分析により、トウモロコシゲノム配列およびＥＳＴ（発現配列タグ）配列に対して有意な相同性を有する２つの領域が見出された。第一の領域は、１７９ｂｐ（境界配列のｂｐ４７７〜ｂｐ６５５）を含み、いくつかの分子マーカー、染色体配列、および種々のＥＳＴのアラインメントによって得られるコンセンサス配列に対して類似性を示す。第二の領域は、５’境界配列のｂｐ１０８０〜ｂｐ１１５３（７４ｂｐ）に存在し、多数の異なるトウモロコシＥＳＴおよびゲノム配列に対して類似性を示す。３’境界領域はまた、植物ＤＮＡ配列に対して類似性のある２つの小さな不連続領域も有した。内部３’領域の１６２ｂｐ（ｂｐ９９５４〜ｂｐ１０１１５）は、２つのゲノムＺｅａ ｍａｙｓアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ１）遺伝子の３’非翻訳末端に対して、およびいくつかのＥＳＴコンセンサス配列に対して類似性を示した。３’境界（ｂｐ１０５９３〜ｂｐ１０６４９）の中央の比較的小さな領域（５７ｂｐ）は、複数のトウモロコシゲノム配列に由来する非コード領域に対して類似性を示した。
【０１２２】
全体としては、いずれのゲノム境界配列においても１７９塩基対を超える相同領域は同定されず、また、同じ既知配列に由来する２つ以上の相同領域も見出されなかった。イベントＤＡＳ−５９１２２−７境界配列に類似性を示す個々の付加物（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）を試験して、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入が、特徴付けされたタンパク質コード配列中に存在するか否かを決定した。類似の領域は、任意の既知のタンパク質コード配列中には存在しなかった。全形質転換プラスミド配列（ＰＨＰ１７６６２）と、イベントＤＡＳ−５９１２２−７境界配列との局所アラインメントは、有意な相同性を示さなかった。このことは、Ｔ−ＤＮＡ挿入物に隣接する境界領域が、形質転換プラスミドのフラグメントを含まなかったことを示す。したがって、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入部位に隣接するゲノム配列の同定および特徴付けは、既知の配列に対して有意な相同性を有する領域が存在しないことによって制限された。
【０１２３】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７中のトウモロコシゲノム境界配列とＴ−ＤＮＡ挿入物の間の５’および３’結合領域を、新しいオープンリーディングフレームの存在について分析した。有効なサイズ（＞１００アミノ酸）のオープンリーディングフレームは、５’または３’境界結合領域において同定されなかった。このことは、Ｔ−ＤＮＡ挿入の結果として新しいオープンリーディングフレームが生成されなかったことを示す。さらに、相同性検索は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７において、Ｔ−ＤＮＡ挿入によって分断された疑いのある、境界領域中の内在性トウモロコシオープンリーディングフレームの存在を示さなかった。
【０１２４】
実施例５。ＰＣＲプライマー
ＤＮＡイベント特異的プライマー対を用いて、ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成した。これらのイベントプライマー対としては、配列番号１８および配列番号１；配列番号２および配列番号１７；配列番号１０および配列番号９；ならびに配列番号８および配列番号１７；ならびに配列番号３６および配列番号３７が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応に用いた場合にＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なＤＮＡアンプリコンを生成する、配列番号２１および配列番号２２に由来する任意のプライマー対も、本発明の実施形態である。ＤＮＡプライマーまたはその相補体を用いてＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンＤＮＡ分子を生成する、これらの方法の任意の改変は、当該分野の通常の技術範囲内である。さらに、内在性トウモロコシ遺伝子の増幅のためのＩＶＲ１（Ｏ１９７）／ＩＶＲ２（Ｏ１９８）（配列番号３９／配列番号４０）を含む、コントロールプライマー対は、反応条件についての内部標準として含まれる。
【０１２５】
ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの存在について試験するための植物組織ＤＮＡ抽出物の分析には、陽性の組織ＤＮＡ抽出物コントロール（トランスジェニック配列を含むことが分かっているＤＮＡサンプル）が含まれるべきである。陽性コントロールの増幅の成功は、ＰＣＲが、標的配列の増幅を可能にする条件下で行われたことを示す。陰性（または野生型）のＤＮＡ抽出物コントロール（その中に提供されるテンプレートＤＮＡが、非トランスジェニック植物から調製されるゲノムＤＮＡであるか、または非ＤＡＳ−５９１２２−７トランスジェニック植物から調製されるゲノムＤＮＡのいずれかである）も含まれるべきである。さらに、テンプレートトウモロコシＤＮＡ抽出物を含まない陰性コントロールは、ＰＣＲプロトコルに用いる試薬および条件の有用な判断基準である。
【０１２６】
十分な長さのさらなるＤＮＡプライマー分子が、ＤＮＡ増幅方法の当業者によって配列番号２１および配列番号２２から選択され得、そしてイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンの生成のために、条件が最適化され得る。これらのＤＮＡプライマー配列を、これらの実施例に示した方法に修正を加えて使用することは、本発明の範囲内である。十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子が、イベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的な配列番号２１および配列番号２２に由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子が、イベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なＰＨＩ１７６６２Ａの遺伝因子のいずれかに由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。ＤＡＳ−５９１２２−７アンプリコンのアッセイは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００）またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーを使用することによって、あるいは当業者に公知の方法および装置によって、実行され得る。
【０１２７】
本発明の原理を図示および記載してきたが、本発明は、このような原理から逸脱することなく配置および詳細が変更され得ることが、当業者には明らかなはずである。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての変更を特許請求する。
【０１２８】
本明細書中で引用される全ての刊行物および公開特許文献は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが具体的かつ個々に示されたと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、本発明の実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡ構築物に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に関し、そしてサンプルおよびその組成物中におけるトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡの存在を検出するアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）植物ＤＡＳ−５９１２２−７（トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７またはトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７とも呼ばれる）に関し、さらにトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７のＤＮＡ植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代における導入遺伝子／隣接挿入領域の検出に関する。
【０００３】
トウモロコシは、重要な作物であり、世界の多くの地域における主要な食料源である。化学農薬などの保護対策の使用にかかわらず、害虫によって引き起こされる被害は、世界のトウモロコシ収穫高の損失の主要な要因である。このような事情に鑑みて、虫害を制御し、従来の化学農薬の必要性を減少させるために、トウモロコシなどの作物に昆虫抵抗性を付与するための遺伝子組み換えが行われてきた。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の１つの群は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）由来のδ−エンドトキシンである。δ−エンドトキシンは、綿、ジャガイモ、米、ヒマワリ、およびトウモロコシなどの作物中でうまく発現して、害虫に対して優れた制御をもたらすことが証明されている。（特許文献１、非特許文献１〜４、Ｂｉｎｇ ＪＷら（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）。
【０００４】
植物における外来遺伝子の発現は、植物ゲノム中の位置によって（おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）に起因するか、または組込部位に近い転写調節因子（例えば、エンハンサー）の近接性に起因して）影響を受けることが知られている（非特許文献５）。同時に、ゲノムの異なる位置での導入遺伝子の存在は、植物の全体的な表現型に異なる方法で影響を及ぼす。このような理由で、導入された目的の遺伝子の最適な発現を特徴とするイベントを同定するために、多数のイベントのスクリーニングをすることがしばしば必要である。例えば、イベント間で、導入された遺伝子の発現レベルに幅広いバリエーションが存在し得ることが、植物および他の生物において観察されている。また、空間的または時間的な発現パターン（これは、導入された遺伝子構築物中に存在する転写調節因子から予期されるパターンに一致しない場合がある）の差異（例えば、種々の植物組織中の導入遺伝子の相対的発現における差異）も存在し得る。このため、数百から数千もの異なるイベントを作製し、これらのイベントを、商業目的のために望ましい導入遺伝子発現のレベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベントは、導入遺伝子を他の遺伝的背景に、従来の育種方法を用いた有性異系交配（ｓｅｘｕａｌ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ）によって遺伝子移入するのに有用である。このような交配の後代は、もとの形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持している。このストラテジーは、局所的な生育条件に十分適応した多数の変種において信頼性の高い遺伝子発現を保証するために用いられる。
【０００５】
特定のイベントの存在を検出可能であることは、有性交配の後代が目的の導入遺伝子を含んでいるか否かを決定するために有利である。また、特定のイベントを検出する方法は、例えば、組換え作物に由来する食品の市販前承認および表示を要する規定を遵守するために役立つか、あるいは、環境モニタリング、圃場での作物の性質のモニタリング、または収穫作物に由来する製品のモニタリングに用いるために、ならびに規制条項または契約条項の対象になる団体の遵守を保証するのに用いるために役立つ。
【０００６】
当該分野で公知の任意の核酸検出方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない）によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などのような、頻繁に用いられる遺伝因子に焦点を当てる。なぜなら、多くのＤＮＡ構築物にとって、コード領域は交換可能であるためである。その結果、このような方法は、挿入された異種ＤＮＡに隣接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でなければ、異なるイベント（特に、同じＤＮＡ構築物または非常に類似した構築物を用いて作製されたイベント）を区別するのに有用ではない場合がある。例えば、イベント特異的ＰＣＲアッセイは、選良イベントＧＡＴ−ＺＭ１の検出について、特許文献２に記載される。従って、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の同定のための簡単かつ判別可能な方法を有することが所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０１／１３７３１号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，３９５，４８５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｒｌａｋ，ＦＪら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０年，第８巻，ｐ．９３９−９４３
【非特許文献２】Ｐｅｒｌａｋ，ＦＪ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３年，第２２巻，ｐ．３１３−３２１
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，第１１巻，ｐ．１１５１−１１５５
【非特許文献４】Ｔｕら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００年，第１８巻，ｐ．１１０１−１１０４
【非特許文献５】Ｗｅｉｓｉｎｇら，１９８８年，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，第２２巻，ｐ．４２１−４７７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の実施形態は、昆虫抵抗性の単子葉植物作物を作製および選択する方法に関する。より具体的には、植物細胞および植物中で発現されると昆虫に対する抵抗性を付与する、ＤＮＡ構築物を提供する。本発明の１つの局面によれば、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能なＤＮＡ構築物が提供され、このＤＮＡ構築物は、植物細胞および植物中で発現されると、これらの植物細胞および植物に対して昆虫抵抗性を付与する。このＤＮＡ構築物は、ＰＨＩ１７６６２Ａと称されるＤＮＡ分子から構成され、３つの導入遺伝子発現カセットを含む。第一の発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３４Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ−１）遺伝子のプロモーター、５’側非翻訳エキソン、および第１イントロンを含むＤＮＡ分子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＱｕａｉｌ（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を含む。ＤＮＡ構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３５Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするＤＮＡ分子（Ｈｅｒｔｉｇら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１７１−１７４）を含む。ＤＮＡ構築物の第３の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照）に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ
７０：２５−３７）に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を含む。このＤＮＡ構築物を含む植物も提供される。
【００１０】
本発明の別の実施形態によれば、ＤＡＳ−５９１２２−７と称される新規のトウモロコシ植物を同定するための組成物および方法が提供され、これらの方法は、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’および／または３’隣接配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。ＰＣＲ反応に用いられるとトランスジェニックイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特有のアンプリコンを生成するプライマー配列を含む、ＤＮＡ分子が提供される。これらの分子は、以下：
５’−ＧＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１）；
５’−ＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号２）；
５’−ＡＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＴ−３’（配列番号３）；
５’−ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号４）；
５’−ＧＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号５）；
５’−ＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡ−３’（配列番号６）；
５’−ＧＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡ−３’（配列番号７）；
５’−ＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴ−３’（配列番号８）；
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号９）；５’−ＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１０）；５’−ＧＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴ−３’（配列番号１１）；
５’−ＧＡＣＧＧＧＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号１２）；５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＡ−３’（配列番号１３）；５’−ＣＴＡＣＧＴＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号１４）；
５’−ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＡ−３’（配列番号１５）；５’−ＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号１６）；５’−ＣＡＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１７）；５’−ＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１８）
５’−ＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＣＧＴＡＣＧＣＡＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３６）；
５’−ＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣＣＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３７）
およびこれらの相補体からなる群より選択され得る。これらの分子を含むトウモロコシ植物および種子は、本発明の実施形態である。さらに、これらのプライマー配列を利用する、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの同定のためのキットが提供される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７の特異的同定方法を開発するのに用いられ得る、本明細書中に記載されるＤＡＳ−５９１２２−７の特異的な隣接配列に関する。より詳細には、本発明は、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’および／または３’隣接領域（それぞれ、配列番号１９（５’隣接領域）および配列番号２０（３’隣接領域））に関し、これらの領域は、特異的プライマーおよびプローブの開発に用いられ得る。本発明のさらなる実施形態は、このよう特異的プライマーまたはプローブの使用に基づく、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７の存在についての同定方法に関する。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に相当するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＤＮＡを含むサンプルと、ＤＮＡプライマーセット（このＤＮＡプライマーセットは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応に用いると、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成する）とを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行うことによって、アンプリコンを生成する工程；および（ｃ）アンプリコンを検出する工程。
【００１３】
新規の導入遺伝子／隣接挿入領域（配列番号２１（５’隣接領域＋１０００内部領域）および配列番号２２（３’隣接領域＋１０００内部領域））を含み、かつ、配列番号２１および配列番号２２に相同または相補的なＤＮＡ分子は、本発明の実施形態である。
【００１４】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域を含むＤＮＡ配列（配列番号２１）は、本発明の実施形態である。トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号２１のトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７由来のトウモロコシゲノム配列および／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１５】
さらに、新規導入遺伝子／隣接挿入領域を含むＤＮＡ配列（配列番号２２）が提供される。トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに配列番号２２のトウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７由来のトウモロコシゲノム配列および／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１６】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号２１のＤＮＡ配列の少なくとも１１個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むＤＮＡ配列またはその相補体、および配列番号２１の類似の長さの５’隣接トウモロコシＤＮＡ配列またはその相補体が、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号２１に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【００１７】
本発明の別の実施形態によれば、配列番号２２のＤＮＡ配列の少なくとも１１個以上のヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むＤＮＡ配列またはその相補体、および配列番号２２の類似の長さの３’隣接トウモロコシＤＮＡ配列またはその相補体が、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的である。従って、本発明の実施形態は、配列番号２２に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
【００１８】
より具体的には、ＤＮＡプライマーセットを含む１対のＤＮＡ分子であって、配列番号１８またはその相補体および配列番号１またはその相補体；配列番号２またはその相補体および配列番号１７またはその相補体；配列番号１０またはその相補体および配列番号９またはその相補体；配列番号８またはその相補体および配列番号１７またはその相補体；ならびに配列番号３６またはその相補体および配列番号３７またはその相補体と同定される１対のＤＮＡ分子は、本発明の実施形態である。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態としては、配列番号１８および配列番号１のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号２および配列番号１７のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号１０および配列番号９のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；配列番号８および配列番号１７のＤＮＡ分子を含むアンプリコン；ならびに配列番号３６および配列番号３７のＤＮＡ分子を含むアンプリコンが挙げられる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態としては、イベントＤＡＳ−５９１２２−７を検出するかまたは特徴付けるのに有用な、以下のプライマーが挙げられる：配列番号１１またはその相補体；配列番号５またはその相補体；配列番号４またはその相補体；配列番号７またはその相補体；配列番号６またはその相補体；配列番号３またはその相補体；配列番号１８またはその相補体；配列番号１４またはその相補体；配列番号１３またはその相補体；配列番号１５またはその相補体；配列番号１７またはその相補体；配列番号１６またはその相補体；および配列番号１２またはその相補体。さらなる実施形態としては、上記のプライマーのいずれかを組み合わせることによって生成されるアンプリコンも挙げられる。
【００２１】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルと、ＤＮＡプローブ（トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたＤＮＡと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない分子）を接触させる工程；（ｂ）このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。より具体的には、サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、このような方法は、以下の工程からなる：（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルと、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントに特有の配列（例えば、結合配列）からなるＤＮＡプローブ分子（このＤＮＡプローブ分子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７から抽出されたＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、コントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとは、このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない）を接触させる工程；（ｂ）このサンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程。
【００２２】
さらに、配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するキットおよび方法が提供される。
【００２３】
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される、ＤＡＳ−５９１２２−７の少なくとも１つの結合配列ならびにその相補体を含む、ＤＮＡ分子が提供され；この結合配列は、ゲノム中に挿入される異種ＤＮＡと、この挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞由来のＤＮＡ（すなわち、隣接ＤＮＡ）との結合部をつなぎ、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントに特徴的である。
【００２４】
本発明の別の実施形態によれば、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法であって、以下の工程を包含する：（ａ）昆虫に対する抵抗性を付与する本発明の発現カセットを含む、第一の親トウモロコシ系統と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ系統とを有性交配させることによって、複数の後代植物を作製する工程；および（ｂ）昆虫抵抗性の後代植物を選択する工程。このような方法は、必要に応じて、この後代植物を第二の親トウモロコシ系統に戻し交雑して、昆虫抵抗性の純粋種トウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、トウモロコシ細胞をＤＮＡ構築物ＰＨＩ１７６６２Ａ（配列番号２４）で形質転換する工程、この形質転換したトウモロコシ細胞を、トウモロコシ植物へと成長させる工程、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を選択する工程、およびこのトウモロコシ植物を、繁殖性のトウモロコシ植物へとさらに成長させる工程を包含する、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する方法を提供する。繁殖性のトウモロコシ植物は、適合性のトウモロコシ品種と自家受粉または交配して、昆虫抵抗性後代を作製し得る。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、さらに、生物学的サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのＤＮＡ検出キットに関する。このキットは、ＰＣＲ同定プロトコルに用いられる、ＤＡＳ−５９１２２−７の５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一のプライマー、およびＤＡＳ−５９１２２−７の外来ＤＮＡ内かまたは隣接ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第二のプライマーを含む。本発明のさらなる実施形態は、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の特異的領域と８０％〜１００％の間の配列同一性を有する配列に相当するか、またはこの配列に相補的な配列を有する、特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７の５’または３’隣接領域の一部を含む特異的領域に相当する。
【００２７】
本発明の実施形態に含まれる方法およびキットは、限定されないが、以下のような異なる目的に用いられ得る：植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品（生鮮品もしくは加工品）などの製品中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するために；さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料とを分離する目的で、トランスジェニック植物材料を同定するのに用いられ得る；さらに、またはあるいは、これらの方法およびキットは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７を含む植物材料の質を決定するのに用いられ得る。これらのキットはまた、検出方法の実行に必要な試薬および材料も含み得る。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物またはその一部（トウモロコシ植物ＤＡＳ−５９１２２−７およびこれに由来する後代の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核、および卵子の核が挙げられるが、これらに限定されない）に関する。ＤＮＡプライマー分子が特異的アンプリコン生成物を提供する、トウモロコシ植物および種子のＤＡＳ−５９１２２−７は、本発明の実施形態である。
【００２９】
本発明の前述のおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面から、より明らかになる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
単離されたＤＮＡ分子であって、以下：
ａ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２０に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２３に示されるヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列；および
ｅ）配列番号２２に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目２）
ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットであって、該キットが、配列番号１９内または配列番号２０内の配列を認識する、少なくとも１つの第一のプライマーを含む、キット。
（項目３）
項目２に記載のキットであって、以下：
ａ）配列番号２４の配列；および
ｂ）配列番号２０の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、少なくとも１つの第二のプライマーをさらに含む、キット。
（項目４）
上記第一のプライマーが、以下：
ａ）配列番号１９の配列；および
ｂ）配列番号２０の配列
からなる群より選択される配列内のヌクレオチド配列を認識する、項目２に記載のキット。
（項目５）
上記少なくとも第一および第二のプライマーがそれぞれ、以下：
ａ）配列番号１８および配列番号１の配列；
ｂ）配列番号１０および配列番号９の配列；
ｃ）配列番号２および配列番号１７の配列；
ｄ）配列番号８および配列番号１７の配列；ならびに
ｅ）配列番号３６および配列番号３７の配列
からなる群より選択される１対の配列を含む、項目３に記載のキット。
（項目６）
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代の結合部ＤＮＡに特異的なＤＮＡ検出キットであって、以下：
ａ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列；および
ｂ）配列番号２２に示されるヌクレオチド配列
からなる群より選択される配列に相同または相補的な、ＤＮＡ検出方法において機能するために十分な長さの連続するＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目７）
生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキットであって、該キットが、以下：
ａ）配列番号１９および配列番号２４の配列；ならびに
ｂ）配列番号２０および配列番号２４の配列
からなる群より選択される配列にハイブリダイズし、該配列と連続する配列を含む、特異的プローブを含む、キット。
（項目８）
トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７およびその後代に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する、配列番号２１または配列番号２２に相同または相補的な十分な長さの連続するヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目９）
第一、第二、および第三の発現カセットを含むＤＮＡ構築物であって、
該第一の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（ａ）トウモロコシユビキチンプロモーター；
（ｂ）トウモロコシユビキチン遺伝子の５’側非翻訳エキソン；
（ｃ）トウモロコシユビキチン第１イントロン；
（ｄ）Ｃｒｙ３４Ａｂ１をコードするＤＮＡ分子；および
（ｅ）ＰｉｎＩＩ転写ターミネーター
を含み；
該第二の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（ｉ）コムギペルオキシダーゼプロモーター；
（ｉｉ）Ｃｒｙ３５Ａｂ１をコードするＤＮＡ分子；および
（ｉｉｉ）ＰｉｎＩＩ転写ターミネーター
を含み；そして
該第三の発現カセットが、作動可能に連結した状態で、以下：
（１）ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；
（２）ｐａｔをコードするＤＮＡ分子；および
（３）（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーター
を含む、ＤＮＡ構築物。
（項目１０）
項目９に記載のＤＮＡ構築物を含む植物。
（項目１１）
上記植物が、トウモロコシ植物である、項目１０に記載の植物。
（項目１２）
生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための方法であって、配列番号１９または配列番号２０内の配列を特異的に認識するプローブまたは第一のプライマーを用いて、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
（項目１３）
少なくとも２つのプライマーであって、上記第一のプライマーが、配列番号１９または配列番号２０内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号２０または配列番号２４内の配列を認識する、プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、上記生物学的サンプル中に存在する核酸からＤＮＡフラグメントを増幅する工程をさらに包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記第一のプライマーが、配列番号１９内の配列を認識し、そして上記第二のプライマーが、配列番号２４内の配列を認識する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記第一のプライマーが、配列番号２０内の配列を認識し、そして第二のプライマーが、配列番号２０内の配列を認識する、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号１８および配列番号１の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号１０および配列番号９の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号２および配列番号１７の配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号８および配列番号１７の配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
上記第一および第二のプライマーが、それぞれ配列番号３６および配列番号３７の配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約５５５ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約３１３ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約５４７ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約７５４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
ＤＡＳ−５９１２２−７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約１０４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
生物学的サンプル中のトウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７またはその後代の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）以下：
ｉ）配列番号１８および配列番号１の配列；
ｉｉ）配列番号１０および配列番号９の配列；
ｉｉｉ）配列番号２および配列番号１７の配列；ならびに
ｉｖ）配列番号８および配列番号１７の配列
からなる群より選択される、１対のＤＮＡプライマー分子を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を行って、ＤＮＡアンプリコン分子を生成する工程；ならびに
（ｅ）該ＤＮＡ増幅反応における該ＤＮＡアンプリコン分子の検出が、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在を示す、該ＤＮＡアンプリコン分子を検出する工程を包含する、方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法によって生成されるアンプリコンのいずれか１つを含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目２８）
サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７イベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）トウモロコシＤＮＡを含む該サンプルと、ポリヌクレオチドプローブであって、該ポリヌクレオチドプローブは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、非ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物ＤＮＡとは該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに
（ｃ）該ＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ハイブリダイゼーションの検出が、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目２９）
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、単離されたＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
（項目３０）
配列番号１、２、８、９、１０、１７および１８からなる群より選択される配列、またはその相補体を含む、項目２９に記載の単離されたＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
（項目３１）
第一のＤＮＡ分子および第二のＤＮＡ分子を含む、１対のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子が、ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物またはその後代から抽出されるＤＮＡに特徴的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために、以下：
ａ）配列番号２１に示される配列またはその相補体；および
ｂ）配列番号２２に示される配列またはその相補体
からなる群より選択される配列の、十分な長さの連続するヌクレオチドのＤＮＡ分子。
（項目３２）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される配列ならびにその相補体を含む結合配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
（項目３３）
種子サンプル中の配列番号１９もしくは配列番号２０内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域の検出を包含する、種子純度を確認する方法。
（項目３４）
イベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在について種子をスクリーニングする方法であって、種子ロットのサンプル中の配列番号１９または配列番号２０内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、ＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域の検出を包含する、方法。
（項目３５）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するＤＮＡが、植物ゲノムの一部を形成する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部。
（項目３６）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体を有するＤＮＡが、植物ゲノムの一部を形成する、項目３５に記載の昆虫抵抗性トウモロコシ植物の子孫植物。
（項目３７）
項目３５または３６に記載の植物の種子。
（項目３８）
項目３５または３６に記載の植物と交配させる工程、ならびに、配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列ならびにその相補体について分析することにより後代を選択する工程を包含する、昆虫抵抗性トウモロコシ植物を作製する方法。
（項目３９）
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離されたＤＮＡ配列。
（項目４０）
各々が少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、かつ、ＤＮＡ増幅手順において一緒に用いられた場合にイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成する、１対の単離されたＤＮＡ配列。
（項目４１）
各々の配列が、以下：
ａ）配列番号２１の配列；および
ｂ）配列番号２２の配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列の中から選択される、項目４０に記載の１対の単離されたＤＮＡ配列。
（項目４２）
トウモロコシ組織中のＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）プライマー対の各々が、配列番号２１または配列番号２２由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、該プライマー対の各メンバーが、上記ＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、プライマー対を選択する工程；
（ｂ）該トウモロコシ組織のサンプルを該プライマー対と接触させる工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅を行い、そしてアンプリコンについて分析する工程
を包含する、方法。
（項目４３）
上記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７またはその相補体からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
トウモロコシ組織中のＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入の存在を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該トウモロコシ組織のサンプルを、配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に置く工程；ならびに
（ｃ）該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程
を包含する、方法。
（項目４５）
配列番号３２、３３、３４、および３５からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列ならびにその相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドプローブを含む、ＤＮＡ検出キット。
（項目４６）
プライマー対の各々が、配列番号２１および配列番号２２の中から少なくとも１０個のヌクレオチドを含む、プライマー対を含むＤＮＡ検出キットであって、該プライマー対の各々が、上記ＤＡＳ−５９１２２−７イベント挿入に特徴的な配列の両側にある、ＤＮＡ検出キット。
（項目４７）
上記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、３６および３７ならびにその相補体からなる群より選択される、項目４６に記載のＤＮＡ検出キット。
（項目４８）
配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するためのキット。
（項目４９）
配列番号２３内のＤＡＳ−５９１２２−７特異的領域を検出する、生物学的サンプル中のＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−２】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−３】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図１−４】図１は、トランスジェニック挿入物ＰＨＩ１７６６２Ａ、およびこのトランスジェニック挿入物に隣接する配列を示すＤＮＡ配列（配列番号２３）である。５’境界領域および３’境界領域（それぞれ、ｂｐ１〜ｂｐ２５９３およびｂｐ９９３７〜ｂｐ１１９２２）に下線を引いている。形質転換プラスミドＰＨＰ１７６６２との比較に基づく２つのヌクレオチドの相違（ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２）は、太字および下線で記載される。
【図２】図２は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の３つの別個の部分に分かれている；トウモロコシゲノムＤＮＡを含む５’境界領域、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含む３’境界領域。挿入物の概略図の下の２つの矢印は、５’および３’ゲノムウォーキングフラグメントに由来する配列の始点および終点を示している。挿入物の概略図の下の他のボックスは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノムＤＮＡから増幅され、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物ならびに５’および３’挿入物／境界結合領域にわたって配列決定された、ＰＣＲフラグメントを表す。
【図３】図３は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７挿入領域の概略図であり、この挿入領域は、以下の３つの別個の部分に分かれている；トウモロコシゲノムＤＮＡを含む５’境界領域、インタクトなＴ−ＤＮＡ挿入物、およびトウモロコシゲノムＤＮＡを含む３’境界領域。挿入物の概略図の下のボックスは、ゲノム境界領域に位置するか、またはイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のゲノムＤＮＡから増幅されたトウモロコシゲノムＤＮＡを含むＴ−ＤＮＡ挿入物の５’および３’結合領域を横断して位置する、ＰＣＲフラグメントを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
以下の定義および方法は、本発明をよりよく規定し、かつ、本発明の実施において当業者を導くために提供される。他に断らない限り、用語は、関連分野の当業者によって慣例的用法に従って理解されるべきである。分子生物学の共通語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，第５版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４にも見出され得る。米国特許法施行規則１．８２２に示されるようなＤＮＡ塩基に関する命名法が用いられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」とは、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「トウモロコシ（ｃｏｒｎ）」とは、Ｚｅａ ｍａｙｓまたはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）を意味し、野生種トウモロコシを含む、トウモロコシと交配され得るすべての植物品種を含む。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＳ−５９１２２−７特異的」とは、植物中、植物材料中、あるいは限定されないが、植物材料を含むかまたは植物材料に由来する、食品または飼料製品（生鮮品もしくは加工品）などの製品中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を差別的に同定するのに適したヌクレオチド配列をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「昆虫抵抗性」および「害虫に影響を与える」とは、任意の発育段階で、昆虫の摂食、成長、および／または行動に変化を生じさせることをいい、この変化としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：昆虫の殺虫；成長の遅延；生殖能力の抑制；摂食の阻害；など。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「殺虫活性」および「殺虫力」は、多数のパラメータによって測定され得る、生物または物質（例えば、タンパク質など）の活性をいうために同義的に用いられ、これらのパラメータとしては、この生物または物質を餌として常食した後、および／あるいはこの生物または物質に適当な時間曝露した後の、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避性、ならびに害虫の他の行動変化および物理的変化が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「殺虫性タンパク質」は、それ自体で、または他のタンパク質と組み合わせて、殺虫活性を示すタンパク質である。
【００３７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「コードする」または「コードされる」は、特定の核酸に関連して使用される場合には、この核酸が、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を誘導するのに必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされている情報は、コドンの使用により特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでいてもよく、このような介在性の非翻訳配列を欠いていてもよい（例えば、ｃＤＮＡのように）。
【００３８】
「遺伝子」とは、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをいう。「天然型遺伝子」とは、遺伝子自体の調節配列とともに天然に見出されるような遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されることのない調節配列およびコード配列を含む、天然型遺伝子ではない任意の遺伝子をいう。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または、同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置に存在する天然型遺伝子をいう。「外来」とは、所定の位置には通常見出されない材料をいう。従って、「外来ＤＮＡ」は、組換えＤＮＡと、新たに導入され再配列された植物ＤＮＡの両方を含み得る。「外来」遺伝子とは、宿主生物中で通常見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子をいう。外来遺伝子は、非天然型の生物中に挿入された天然型遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。組換ＤＮＡが挿入された、植物ゲノム中の部位は、「挿入部位」または「標的部位」と呼ばれ得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「挿入ＤＮＡ」とは、植物材料を形質転換するのに用いられる発現カセット内の異種ＤＮＡをいい、一方、「隣接ＤＮＡ」は、植物などの生物中に天然に存在するゲノムＤＮＡか、元の挿入ＤＮＡ分子（例えば、形質転換事象に関与するフラグメント）にとって外来性の、形質転換プロセスによって導入された外来（異種）ＤＮＡのいずれかで存在し得る。「隣接領域」または「隣接配列」とは、本明細書中で使用される場合、元の外来挿入ＤＮＡ分子のすぐ上流に隣接して、または、元の外来挿入ＤＮＡ分子のすぐ下流に隣接して位置する、少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対、そして最大５０００塩基対までの配列をいう。外来ＤＮＡのランダムな組み込みを引き起こす形質転換手順により、各形質転換体に特徴的かつ特有の異なる隣接領域を含む形質転換体が生じる。組換えＤＮＡが従来の交配によって植物に導入される場合、その隣接領域は、一般に変化しない。形質転換体はまた、１つの異種挿入ＤＮＡとゲノムＤＮＡの断片間に、または２つのゲノムＤＮＡの断片間に、または２つの異種ＤＮＡの断片間に、特有の結合部を含む。「結合部」は、２つの特定のＤＮＡフラグメントが結合する点である。例えば、結合部は、挿入ＤＮＡが隣接ＤＮＡと結合するところに存在する。２つのＤＮＡフラグメントが、天然の生物において見出される様式を改変した様式で結合する、形質転換生物にも、結合点が存在する。「結合部ＤＮＡ」とは、結合点を含むＤＮＡをいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、核酸に関する「異種」は、外来種が起源であるか、あるいは同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、組成および／または遺伝子座がその天然型から実質的に改変されている核酸である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結するプロモーターは、このヌクレオチド配列が由来する種とは異なる種に由来し得るか、あるいは同じ種に由来する場合は、プロモーターは、天然にはこのヌクレオチド配列に作動可能に連結して見出されない。異種タンパク質は、外来種が起源であってもよく、または同じ種に由来する場合は、意図的な人間の介入によって、その本来の型から実質的に改変されている。
【００４１】
「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列をいい、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【００４２】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御し得るヌクレオチド配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーター配列は、近位の上流因子およびより遠位の上流因子からなり、後者のより遠位の上流因子は、しばしばエンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るヌクレオチド配列であり、かつ、プロモーターの内在的な因子であっても、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種因子であってもよい。プロモーターは、その全体が天然型遺伝子に由来してもよく、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる因子で構成されていてもよく、さらには合成ヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターは、異なる組織型または細胞型において、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を行わせ得ることが、当業者に理解される。核酸フラグメントを、ほとんどの細胞型においてほとんどいつでも発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な、種々の型の新しいプロモーターは、常に発見され続けており、多数の例が、ＯｋａｍｕｒｏおよびＧｏｌｄｂｅｒｇによる編集物（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２に見出され得る。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さの核酸フラグメントが同じプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００４３】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するヌクレオチド配列をいう。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性および／または翻訳効率を含む、多数のパラメータに影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は、記載されている（ＴｕｒｎｅｒおよびＦｏｓｔｅｒ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５−２３６）。
【００４４】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列をいい、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０に例示される。
【００４５】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード配列によって決定される特定の順序で配列される、アミノ酸の鎖である。
【００４６】
ＤＮＡ構築物は、１つ以上の発現カセットを提供する、連結されたＤＮＡ分子の集合体である。ＤＮＡ構築物は、細菌細胞中で自己複製することが可能であり、かつ、機能的な遺伝因子（すなわち、中でも、プロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、３’終結領域）を提供するＤＮＡ分子を導入するのに有用な、種々のエンドヌクレアーゼ酵素の制限部位を含むプラスミドであってもよく；あるいは、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ分子の直鎖状の集合体（例えば、発現カセット）であってもよい。ＤＮＡ構築物中に含まれる発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写をもたらすのに必要な遺伝因子を含む。発現カセットは、原核細胞または真核細胞中で発現されるように設計され得る。本発明の実施形態の発現カセットは、植物細胞中で発現されるように設計される。
【００４７】
本発明の実施形態のＤＮＡ分子は、目的の生物における発現のための発現カセット中に提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された５’および３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していることを意味し、そして２つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には、これらの核酸配列が隣接し、かつ同じリーディングフレーム中に存在することを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーター配列と第二の配列の間の機能的結合を指すことが意図され、このプロモーター配列が、第二の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始させ、かつ媒介する。このカセットは、生物に同時形質転換される少なくとも１つのさらなる遺伝子をさらに含み得る。あるいは、さらなる遺伝子（単数または複数）が、複数の発現カセットまたは複数のＤＮＡ構築物上に提供され得る。
【００４８】
発現カセットは、５’から３’の転写方向に、以下を含む：宿主としての役割を果たす生物において機能的な、転写および翻訳開始領域、コード領域、ならびに転写および翻訳終結領域。転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物にとって天然または類似であっても、あるいは外来または異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列であっても、あるいは合成配列であってもよい。発現カセットは、発現カセット構築物中に５’リーダー配列をさらに含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を促進するように作用し得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、その遺伝子型が、異種核酸の存在によって改変された、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位、または植物（最初にそのように改変されたこれらのトランスジェニック、およびこの最初のトランスジェニックからの有性交配または無性増殖によって作製されたものを含む）を含むと理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック」は、従来の植物育種方法によるか、または天然に存在するイベント（例えば、ランダムな交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異）による、ゲノム（染色体のまたは染色体外の）の改変を含まない。
【００５０】
トランスジェニック「イベント」は、目的の導入遺伝子を含む核酸発現カセット、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入によって生じる植物個体群の再分化、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる特定の植物の選択を含む、異種ＤＮＡ構築物（単数または複数）を用いた植物細胞の形質転換によって作製される。イベントは、導入遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」はまた、形質転換体と異種ＤＮＡを含む別の変種との間の有性異系交配によって作製された後代をいう。反復親への戻し交配が繰り返された後でさえ、形質転換親由来の挿入ＤＮＡおよび隣接ＤＮＡは、同じ染色体位置で交配の後代に存在する。用語「イベント」はまた、挿入ＤＮＡおよびこの挿入ＤＮＡに直接隣接した隣接配列を含む、もとの形質転換体由来のＤＮＡをいい、この隣接配列は、挿入ＤＮＡを含む親株（例えば、もとの形質転換体および自家受粉により生じる後代）と挿入ＤＮＡを含まない親株との有性交配の結果として、目的の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に移入されることが予期される。
【００５１】
昆虫抵抗性ＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物は、以下の工程によって育種され得る：昆虫抵抗性を付与する本発明の実施形態の発現カセットを用いた形質転換によって誘導された、トランスジェニックＤＡＳ−５９１２２−７トウモロコシ植物およびその後代から成長したトウモロコシ植物からなる第一の親トウモロコシ植物と、昆虫抵抗性を欠く第二の親トウモロコシ植物との第一の有性交配によって、複数の第一の後代植物を作製する工程；次いで、昆虫に対して抵抗性を示す第一の後代植物を選択する工程；およびこの第一の後代植物を自家受粉させることによって、複数の第二の後代植物を作製する工程；次いで、この第二の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択する工程。これらの工程は、第一の昆虫抵抗性後代植物または第二の昆虫抵抗性後代植物を、第二の親トウモロコシ植物または第３の親トウモロコシ植物に戻し交雑することにより、昆虫に対して抵抗性を示すトウモロコシ植物を作製する工程をさらに含み得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、およびそれらの後代への言及を含む。予め本発明のＤＮＡ分子で形質転換されており、従って少なくとも部分的にトランスジェニック細胞からなる、トランスジェニック植物またはそれらの後代を起源とする、例えば植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、ならびに花、茎、果実、葉、および根を含む、本発明の範囲内にあると理解されるトランスジェニック植物の部位もまた、本発明の実施形態である。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「植物細胞」は、限定されないが、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む。本発明の方法に用いられ得る植物のクラスは、一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む、形質転換技術を受け入れ可能な高等植物のクラスと同程度に広い。
【００５４】
「形質転換」とは、遺伝学的に安定した遺伝を生じる、宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物という。植物の形質転換方法の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）および粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号、本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。さらなる形質転換方法は、以下に開示される。
【００５５】
このように、本発明の単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に導入可能であり、かつ宿主細胞内で複製可能な、組換え構築物（典型的には、ＤＮＡ構築物）中に組み込まれ得る。このような構築物は、ポリペプチドのコード配列を所定の宿主細胞内で転写および翻訳することが可能な複製系および配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定なトランスフェクションに適した、またはトランスジェニック植物の構築に適した多数のベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（１９８５；補遺、１９８７）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＦｌｅｖｉｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下に１つ以上のクローン化植物遺伝子ならびに優性選択マーカーを含む。このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性もしくは構成的発現、環境的にもしくは発生的に調節された発現、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【００５６】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、２つの独立的に分離している付加された外来遺伝子を含む子孫を作製することも可能であることも、理解されるべきである。適切な後代の自家受粉により、両方の付加された外来遺伝子のホモ接合体である植物を作製し得る。親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配もまた、栄養体生殖と同様に企図される。種々の形質および作物に一般に用いられる他の育種方法の記載は、いくつかの参考文献の１つに見出され得る（例えば、Ｆｅｈｒ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｓ Ｊ．編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７））。
【００５７】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素）が付着された単離核酸である。このようなプローブは、標的核酸鎖（本発明の場合には、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のＤＮＡを含むサンプルに由来するか、またはトウモロコシ植物に由来する、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７由来の単離ＤＮＡ鎖）に相補的である。本発明に従うプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のみならず、ポリアミド、および標的ＤＮＡ配列に特異的に結合してこの標的ＤＮＡ配列の存在を検出するのに用いられ得る、他のプローブ材料も含む。
【００５８】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離核酸である。本発明のプライマー対とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用をいう。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅に用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号を参照のこと；これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００５９】
プローブおよびプライマーは、操作者によって決定されたハイブリダイゼーション条件または反応条件において、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択された検出方法に役立つのに十分な長さの任意の長さであってもよい。一般に、１１ヌクレオチド以上、１８ヌクレオチド以上、および２２ヌクレオチド以上の長さが用いられる。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズする。標的ＤＮＡ配列と異なり、かつ標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を保持しているプローブが、従来の方法によって設計され得るが、本発明の実施形態に従うプローブおよびプライマーは、標的配列と隣接するヌクレオチドの完全なＤＮＡ配列類似性を有し得る。プローブは、プライマーとして用いられ得るが、一般に、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅プロセスでは用いられない。
【００６０】
特異的プライマーは、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を同定するための「特異的プローブ」として用いられ得るアンプリコンを生成するために、組込みフラグメントを増幅するのに用いられ得る。プローブが、生物学的サンプルの核酸と、プローブのサンプルへの結合を可能にする条件下でハイブリダイズされる場合、この結合は検出され得るので、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７の存在を示すことが可能になる。このような結合プローブの同定は、当該分野で記載されている。本発明の実施形態において、特異的プローブは、最適条件下でイベントの５’または３’隣接領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、そしてまた、この領域と隣接する外来ＤＮＡの一部を含む配列である。特異的プローブは、イベントの特定の領域に対して、少なくとも８０％の、８０〜８５％の間の、８５〜９０％の間の、９０〜９５％の間の、および９５〜１００％の間の同一性（または相補性）を有する配列を含み得る。
【００６１】
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期更新）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２」）；およびＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；およびＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５（著作権），１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）のＰＣＲプライマー分析ツールのような、その目的を意図したコンピュータープログラムを用いて、既知の配列から得られ得る。さらに、この配列が視覚的にスキャンされ得、そしてプライマーが当業者に公知のガイドラインを用いて手動で同定される。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「キット」とは、本発明の方法の実施形態（より詳細には、生物学的サンプル中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７の同定）を実行するための試薬一式をいう。本発明のキットが用いられ得、その構成要素は、品質管理（例えば、種子ロットの純度）の目的、植物材料あるいは植物材料を含むかまたは植物材料に由来する材料（例えば、限定されないが、食品または飼料製品）中のイベントＤＡＳ−５９１２２−７を検出する目的のために、特別に調整され得る。本明細書中で使用される場合、「植物材料」とは、植物から得られるか、または植物に由来する材料をいう。
【００６３】
本明細書中に開示される隣接ＤＮＡ配列および挿入配列に基づくプライマーならびにプローブは、従来の方法によって（例えば、このような配列をリクローニングし、かつ配列決定することによって）、開示された配列を確認するために（そして必要な場合には、補正するために）用いられ得る。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法が、サンプル中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を同定するのに用いられ得る。核酸分子またはそのフラグメントは、ある特定の状況下で、他の核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、これらの２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成し得る場合、互いに特異的にハイブリダイズし得るといわれる。
【００６４】
核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書中で使用される場合、分子は、これらの分子の１つのすべてのヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すといわれる。２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「最低限に相補的」であるといわれる。同様に、これらの分子は、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールした状態で保持され得るのに十分な安定性で互いにハイブリダイズし得る場合、「相補的」であるといわれる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＨａｙｍｅｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））によって記載されており、従って、完全な相補性からの逸脱は、このような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げることのない限り、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、用いられる特定の溶媒および塩濃度下で安定な二本鎖構造が形成され得るのに十分に相補的な配列であることが必要であるにすぎない。
【００６５】
ハイブリダイゼーション反応における特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。熱融点（Ｔｍ）は、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、以下のＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（１９８４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４）から概算され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、ハイブリッドの塩基対長さである。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％よりも高い同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃低下させ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体についてのＴｍよりも約５℃低く選択される。しかし、厳しくストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェンシーの条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
【００６６】
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望されるＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されることを理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件下で比較される核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件（例えば、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃にて２×ＳＳＣの洗浄）は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０〜８．３）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃におけるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中の洗浄が挙げられる。本発明の核酸は、中程度にストリンジェントな条件下で、ＤＡＳ−５９１２２−７イベントまたはその相補体あるいはそのいずれかのフラグメントに特有の１つ以上の核酸分子に、特異的にハイブリダイズし得る。
【００６８】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野において周知である。従って、任意の２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学アルゴリズムの非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アラインメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７におけるように改変）である。
【００６９】
これらの数学アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を決定するための配列の比較に利用され得る。このような実行としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）；ＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラム（バージョン３．０，著作権 １９９７）；ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１，ＵＳＡから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ。これらのプログラムを使用するアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実行され得る。
【００７０】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４（１９８８）；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５−６５（１９９２）、ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：３０７−３３１（１９９４）によって、十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムおよびＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）前出のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）前出のアルゴリズムに基づく。データベース類似性検索に用いられ得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては、以下が挙げられる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；ならびにヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１９章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと。アラインメントはまた、目視検査によって手動で実行され得る。
【００７１】
比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中）が、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実行するために用いられ得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のためのＢＬＡＳＴＸ）が用いられ得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸配列またはポリペプチド配列との関連において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大に一致するように整列された場合に同一である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパク質に関して配列同一性パーセントが使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって、しばしば異なることが理解される。このような保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するように上方に調整され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整をするための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく、部分的なものとして保存的置換をスコア付けすることを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように計算される。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を得ること、このマッチ位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００７４】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、ＤＮＡ熱増幅反応において、プライマー対が、標的核酸配列（この標的核酸配列に、対応する野生型配列を有するプライマー（またはその相補体）が結合し、好ましくは特有の増幅産物（アンプリコン）を産生する）にのみハイブリダイズすることを可能にする条件である。
【００７５】
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含むサンプル中の標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「増幅したＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅産物をいう。例えば、有性交配の結果得られたトウモロコシ植物が、本発明のトウモロコシ植物に由来するトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含むか否かを決定するために、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出されたＤＮＡを、ＤＮＡプライマー対（挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する隣接配列に由来する第一のプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来し、イベントＤＮＡの存在の診断に用いるアンプリコンを生成する第二のプライマーを含む）を用いた核酸増幅方法に供し得る。あるいは、第二のプライマーは、隣接配列に由来し得る。アンプリコンは、イベントに特徴的でもある長さおよび配列を有する。アンプリコンは、プライマー対に１ヌクレオチド塩基対を合わせた長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって生成可能なアンプリコンの任意の長さまでの長さの範囲であり得る。あるいは、プライマー対は、ＰＨＩ１７６６２Ａ発現構築物の挿入ヌクレオチド配列全体およびトランスジェニック挿入物に隣接する配列を含む、アンプリコン（図１（配列番号２３）を参照、サイズ約１２Ｋｂ）を生成するように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列から得られ得る。隣接配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列から距離を置いて配置されてもよく、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界までか、または約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを特異的に排除する。
【００７７】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、当該分野で公知の種々の核酸増幅方法のいずれかによっても達成され得る。種々の増幅方法が当該分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される。ＰＣＲ増幅方法は、２２Ｋｂ以下のゲノムＤＮＡおよび４２Ｋｂ以下のバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９，１９９４）。これらの方法およびＤＮＡ増幅の分野で公知の他の方法は、本発明の実施形態の実施に用いられ得る。特定のＰＣＲプロトコルにおける多数のパラメータは、特定の実験室条件に調整される必要があり得、わずかに変更され得るが、なおも類似の結果の収集を可能にすることが理解される。これらの調整は、当業者には明らかである。
【００７８】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出され得、その技術としては、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４１６７−４１７５，１９９４）（ここでは、隣接する隣接ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方と重複する、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される）が挙げられるが、これに限定されない。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル中に固定化される。目的の領域のＰＣＲ（挿入配列中に１つのプライマーおよび隣接する隣接配列中に１つのプライマーを用いて）の後、一本鎖ＰＣＲ産物は、固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得、そしてＤＮＡポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いた、一塩基伸長反応のためのテンプレートとして機能する。読み出しは、蛍光であっても、またはＥＬＩＳＡベースであってもよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７９】
別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，２０００）によって記載されるようなパイロシーケンシング技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列中に１つのプライマーおよび隣接配列中に１つのプライマー）にハイブリダイズされ、そしてＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に添加され、そして取り込みにより、測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基または多塩基伸長による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００８０】
Ｃｈｅｎらによって記載されるような蛍光偏光（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２−４９８，１９９９）もまた、本発明のアンプリコンを検出するために用いられ得る方法である。この方法を用いて、オリゴヌクレオチドは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部と重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、目的の領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ中に１つのプライマーおよび隣接ＤＮＡ配列中に１つのプライマー）にハイブリダイズされ、そしてＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰの取り込みを生じる。取り込みは、蛍光光度計を用いて、偏光の変化として測定され得る。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長による、導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００８１】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載されており、製造業者によって提供される説明書で十分に理解される。手短に言うと、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中に１つのプライマー）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションによって、ＦＲＥＴプローブのクエンチング部分から、蛍光部分の切断および遊離が生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００８２】
分子ビーコンは、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６）に記載されるような配列検出における使用のために記載されている。手短に言えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブは、隣接および挿入ＤＮＡの接合部に重複するように設計されている。ＦＲＥＴプローブの特有の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分を近接した状態で保持する二次構造を含むものとなる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列中に１つのプライマーおよび隣接配列中に１つのプライマー）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルされる。成功したＰＣＲ増幅の後、ＦＲＥＴプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションによって、プローブの二次構造の除去ならびに蛍光部分およびクエンチング部分の空間的分離が生じる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる、隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００８３】
アンプリコン中に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応によって生成されたアンプリコンを検出するために用いられる、さらに別の方法である。
【００８４】
本発明の実施形態は、以下の実施例においてさらに規定される。これらの実施例は、単なる例示として示されることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認し得、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態の種々の変更および改変を行って、種々の用法および条件に適合させ得る。従って、本発明の実施形態の種々の改変は、本明細書中に示されかつ記載される改変の他にも、前述の記載から当業者には明らかである。このような改変も、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【００８５】
本明細書中に示される各参考文献の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
実施例１。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によるトウモロコシの形質転換、ならびにＣｒｙ３４Ａｂ１およびＣｒｙ３５Ａｂ１（Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１）遺伝子を含むトランスジェニック植物の再分化
ＰＨＩ１７６６２Ａと称される、約７．４ＫｂのＤＮＡ分子（配列番号２４）は、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３４Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ−１）遺伝子のプロモーター、５’側非翻訳エキソン、および第１イントロンを含むＤＮＡ分子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＱｕａｉｌ（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を含む、第一の導入遺伝子発現カセットを含む。ＤＮＡ構築物の第二の導入遺伝子発現カセットは、ジャガイモから単離されたＰｉｎ ＩＩ転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｇｙｈｅｕｎｇ Ａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１：１１５−１２２）に作動可能に連結された、Ｃｒｙ３５Ａｂ１と同定されたＢ．ｔ．δ−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号および同第６，３４０，５９３号）に作動可能に連結された、コムギペルオキシダーゼプロモーターをコードするＤＮＡ分子（Ｈｅｒｔｉｇら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１７１−１７４）を含む。ＤＮＡ構築物の第３の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’側転写ターミネーターを含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照）に作動可能に連結された、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を含み、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いた。
【００８７】
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５ Ａｂ１トウモロコシ植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によって得られ、Ｚｈａｏの方法を用いた（米国特許第５，９８１，８４０号、およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９８／３２３２６；これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）。手短に言えば、未熟胚をトウモロコシから単離し、これらの胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液（懸濁液中で、この細菌は、ＰＨＩ１７６６２ ＤＮＡ（配列番号２４）を、少なくとも１つの未熟胚の少なくとも１つの細胞に移入させ得る）と接触させた（工程１：感染工程）。具体的には、この工程では、未熟胚を、播種の開始のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液中に浸漬した。これらの胚を、ある期間、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとともに共培養した（工程２：共培養工程）。具体的には、未熟胚を、感染工程の後に固形培地上で培養した。この共培養期間の後、「休止」工程を行った。この休止工程では、植物形質転換体に対する選択薬剤を添加せず、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの増殖を阻害することが知られている少なくとも１つの抗生物質の存在下で、胚をインキュベートした（工程３：休止工程）。特に、未熟胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの除去および感染細胞の休止期のために、抗生物質を含むが選択薬剤を含まない固形培地上で培養する。次に、播種した胚を、選択薬剤を含む培地で培養し、増殖する形質転換カルスを回収した（工程４：選択工程）。具体的には、未熟胚を、形質転換細胞の選択的増殖を生じる選択薬剤を含む固形培地上で培養した。次いで、カルスを植物に再分化させ（工程５：再分化工程）、そして、具体的には、選択培地上で増殖したカルスを固形培地上で培養して、植物を再分化させた。個々の胚は、培養の間、物理的に分離した状態で維持し、そして外植片の大部分は選択培地上で枯死した。
【００８８】
生存しかつ健全に形成された胚である、グルホシネート耐性カルス組織には、推定形質転換イベントを表す固有の識別コードを付与し、継続的に新鮮な選択培地に移した。それぞれ固有のイベントに由来する組織から植物を再分化させ、温室に移した。葉のサンプルを分子分析のために採取して、ＰＣＲにより導入遺伝子の存在を確認し、そしてＥＬＩＳＡによりＣｒｙ３４／３５Ａｂ１タンパク質の発現を確認した。次いで、植物を、ウェスタンコーンルートワーム害虫を用いた全植物体バイオアッセイに供した。陽性の植物を近交系と交配して、最初の形質転換植物から種子を得た。多くの系を圃場において評価した。ＤＡＳ−５９１２２−７イベントは、昆虫抵抗性および農業生産力を含む優れた特性の組み合わせに基づいて、独立したトランスジェニックイベントの個体群から選択した。
【００８９】
実施例２。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７の同定
イベントＤＡＳ−５９１２２−７からの種子を評価した。Ｔ１Ｓ２種子は、Ｈｉ−ＩＩバックグラウンドへの形質転換の後、近交系ＰＨ０９Ｂとの交配および２回の自家交配を行ったことを表す。全ての種子を、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）から得た。主要な特徴付けは、側方流動デバイスを用いた除草剤の葉面塗布およびＣｒｙ３４Ａｂｌ発現による、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）活性の確認によって、本研究の間に植物葉組織について行った。
【００９０】
本研究のコントロール物質を、検体バックグラウンドを代表する未改変の種子と定義した。Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂバックグラウンドのコントロール種子を、陰性コントロールとして用いた。これらの未改変の種子は、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子、およびｐａｔ遺伝子の植物転写単位を含まない。全ての種子を、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）から得た。
【００９１】
２つのさらなるＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベント（イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６）に由来するＤＮＡサンプルを、イベント特異的ＰＣＲ分析のための陰性コントロールとして用いた。これらの２つのイベントは、イベントＤＡＳ−５９１２２−７を作製するのに用いたベクターと同じベクターを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換によって作製されたので、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子、およびｐａｔ遺伝子の植物転写単位を含んだ。しかし、イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６中のＴ−ＤＮＡの挿入部位（ゲノムＤＮＡ境界領域を含む）は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中のＴ−ＤＮＡの挿入部位とは異なった。イベントＤＡＳ−４５２１４−４およびイベントＤＡＳ−４５２１６−６に由来するＤＮＡサンプルを単離し、そしてサザンブロット分析によって特徴付けした。（データは示さず）。
【００９２】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のトウモトコシ種子および未改変のコントロール種子（Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂ）を、ＤｕＰｏｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で生育チャンバー内に植えて、ＤＮＡ分析に十分な数の植物を作製した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７の特徴付けのために、１０個のＴ１Ｓ２種子を植えた。同じく１０個の種子を、それぞれの未改変のコントロール系統につき植えた。１つのポットあたり１個の種子を植え、そのポットを一意に同定した。光および水の調節を含む、植え付けおよび生育条件により、健全な植物の生育がもたらされた。
【００９３】
コントロール植物およびイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物の各々について、葉のサンプルを採取した。各サンプルについて、成長点の上から十分な葉材料を採取し、予めラベル表示したサンプル袋に入れた。採取後に、これらのサンプルをドライアイスの上に配置し、そして超低温フリーザーに移した。すべてのサンプルを、加工するまで凍結状態に維持した。すべての葉のサンプルを、植物識別名および採取日で一意にラベル付けした。
【００９４】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるＣｒｙ３４Ａｂ１タンパク質の発現およびコントロールにおける発現の非存在を確認するために、すべてのイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物およびコントロール植物から葉のサンプルを採取し、そしてＣｒｙ３４Ａｂ１に特異的な側方流動デバイス（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を用いて、トランスジェニックタンパク質についてスクリーニングした。葉のパンチ打ち抜き試料（Ｌｅａｆ ｐｕｎｃｈ）を各植物から採取し、Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝食塩水溶液中で粉砕して、タンパク質を粗抽出した。ストリップデバイスを抽出物中に軽く浸して、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質の存在または非存在を決定した。イムノアッセイの結果を用いて、表１に示すように、分子分析の前に検体植物の同一性を確認した。
【００９５】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７植物におけるフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の発現を確認するために、除草剤の葉面塗布を行った。本研究に用いたすべての植物に葉面塗布を行って、植物の同一性を確認した。植物を、Ｒ１生育段階の前にアッセイした。ＰＡＴ発現トランスジェニック植物の同定のための除草剤の葉面塗布について当該分野で公知の標準手順に従って、アッセイを行った。具体的には、各植物の１枚の葉の一部を、グルホシネート除草剤であるＢａｓｔａ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ）の約２％水溶液で処理し、塗布４〜１２日後に、塗布を行った葉の領域における褐色または壊死組織について、視覚的に検査した。各植物の結果を記録し、表１に示すような各試験植物におけるＰＡＴの発現を決定するために用いた。表１に示すように、イベントＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２世代について試験した１０種の植物のうち、６種の植物は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＰＡＴの両方を発現したが、４種の植物は、いずれのタンパク質も発現しなかった。すべての未改変のコントロールは、ＣｒｙＡｂ１およびＰＡＴの両方のアッセイについて陰性と出た（データは示さず）。
【００９６】
表１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＰＡＴタンパク質発現ならびにＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのサザンハイブリダイゼーションデータ
【００９７】
【表１】
１．陽性のＣｒｙ３４Ａｂ１発現は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質検出に特異的な、イムノアッセイに基づく側方流動デバイスによって決定されるようなタンパク質発現の検出を示す。陰性は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質が検出されないことを示す。陽性のＰＡＴ発現は、除草剤処理に抵抗性であった植物を示し、そして陰性は、除草剤に感受性であった植物を示す。
【００９８】
２．＋は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルを示し；−は、サザンブロットによるハイブリダイゼーションシグナルがないことを示す。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブは、１．９１５ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブは、２．６０７ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そしてｐａｔ遺伝子プローブは、３．４ｋｂ境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット分析によって決定されるような単一のインタクトなＴ−ＤＮＡ挿入と一致していた。
【００９９】
実施例３．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７のサザンブロット分析
１グラム量の葉サンプルを液体窒素下で粉砕し、ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いるか、または標準尿素抽出緩衝液手順を用いて単離した。抽出後にＤＮＡを、ＤＮＡ品質を決定するためにアガロースゲル上で可視化し、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および分光蛍光分析を用いて定量した。
【０１００】
１Ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、アガロースゲル上のＤＮＡフラグメントサイズを推定した。
【０１０１】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７植物から単離されたゲノムＤＮＡを、当該分野で公知の標準手順を用いて、Ｎｃｏ Ｉで消化し、電気泳動的に分離し、ナイロン膜に転写し、そしてｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブ、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブおよびｐａｔ遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。ブロットをＸ線フィルムに１期間以上曝露して、ハイブリダイズしているフラグメントを検出し、かつ分子量標準を可視化した。次いで、画像をＸ線フィルム撮影によって、および／またはＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（商標）機器（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いた検出によって、デジタル形式で取り込んだ。検出されたバンドのサイズを、各プローブについて記録した。サザンブロット分析を、試験植物における挿入の存在を検証する手段として用い、イベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のすべての植物が、表１に示すような挿入と同じ挿入を含むことを確認した。（サザンブロットは図示せず。）サザンブロット分析は、イベントＤＡＳ−５９１２２−７がプラスミドＰＨＰ１７６６２に由来するＴ−ＤＮＡ領域のインタクトなコピーからなる単一挿入を含むことを示し、一方、ヌル分離個体は、タンパク質発現分析によって決定されたように、遺伝子プローブにハイブリダイズしなかった。さらに、２つのタンパク質を発現するイベントＤＡＳ−５９１２２−７植物は、サザンブロットで同一のハイブリダイゼーションパターンを示した（データは示さず）。具体的には、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子プローブは、１．９１５ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、ｃｒｙ３５Ａｂ１遺伝子プローブは、２．６０７ｋｂの予想される内部のＴ−ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そしてｐａｔ遺伝子プローブは、３．４ｋｂ境界フラグメントにハイブリダイズし、サザンブロット結果によって決定されるような単一のインタクトなＴ−ＤＮＡ挿入と一致していた。
【０１０２】
実施例４。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１トウモロコシ系統ＤＡＳ−５９１２２−７のＴ−ＤＮＡ挿入および隣接境界領域の配列決定
Ｔ−ＤＮＡ挿入および隣接境界領域を、図２および３に図示するように、ＰＣＲに基づく方法を用いてＢ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ５９１２２−７からクローン化した。具体的には、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入物の５’および３’末端に接する配列を、２つのゲノムウォーキング技術を用いて得た。第一のウォーキング方法は、本質的には、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）について記載されるような方法であり、そして第二の方法は、Ｓｔｏｖｅｒ（２００１年、Ｕ．Ｃ．Ｉｒｖｉｎｅ（私信））によって記載されるように改変された、Ｄｅｖｏｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（９）：１６４４−１６４５に概説されたｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅプロトコルに従って行った。
【０１０３】
手短に言えば、ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ法のために、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｓｍａ ＩおよびＳｔｕ Ｉ、ならびにｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ法のために、ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、およびＸｂａ Ｉ）で消化し、次いでＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ法のための平滑末端アダプターおよびｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ法に用いた制限酵素に特異的なアダプターに連結した。両方のゲノムウォーキング法のためのアダプターは、ＰＣＲの間のアダプターの３’末端の伸長を阻止するように設計し、したがって非特異的増幅を減少させるかまたは排除した。次いで、アダプター連結したゲノムＤＮＡフラグメントを、ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｅｒライブラリーまたはｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅライブラリー（各制限酵素につき１つのライブラリー）と称した。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７の３つの個々のＴ１Ｓ２植物（植物ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １、ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ ２およびＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １０）から、ならびに１つのＨｉ−ＩＩおよび１つのＰＨ０９Ｂコントロール植物から単離されたゲノムＤＮＡから、ライブラリーを調製した。
【０１０４】
ライブラリーの構築後に、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、標的配列を増幅させるために、ネステッドＰＣＲ増幅を完了させた。一次ＰＣＲ増幅は、アダプターに同一性を有する１つのプライマーおよび１つの遺伝子特異的プライマーを用いた。アダプタープライマーは、一次ＰＣＲの第一サイクルでの産物を増幅せず、遺伝子特異的プライマーからの産物のみを生成する。アダプタープライマーのアニーリングおよびアダプタープライマーからの増幅は、相補鎖が遺伝子特異的プライマーから生成した後にのみ起こる。一次ＰＣＲ増幅の後、二次ネステッドＰＣＲ反応を行って、ゲノムＰＣＲ反応の特異性を増加させた。ネステッドプライマーは、一次ＰＣＲに用いたそれぞれのプライマーにとって内部の遺伝子特異的およびアダプター特異的配列からなった。
【０１０５】
５’隣接境界配列についてネステッドＰＣＲを、挿入されたＴ−ＤＮＡの５’末端に特異的なプライマーとともに、消化されたＤＮＡ上に連結されたアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。同様に、３’隣接境界配列のクローニングを、挿入されたＴ−ＤＮＡの３’末端に特異的なプライマーおよびアダプター配列に相補的なプライマーを用いて開始した。Ｔ−ＤＮＡ領域内のＴ−ＤＮＡの右境界配列および左境界配列にとって内部のＤＮＡ配列を、トウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト（ｗａｌｋｉｎｇ ｏｕｔ）」のための開始点として用いた。なぜなら、これらのＤＮＡ配列は、ゲノムウォーキングプライマーを固着する特有の配列（内在性トウモロコシゲノム配列に相同ではない）を示すためである。
【０１０６】
ネステッドＰＣＲによって生成した産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した（データは示さず）。１つ以上のイベントＤＡＳ−５９１２２−７ ＤＮＡサンプルから調製したライブラリーで見られ、かつ、Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９ＢゲノムＤＮＡサンプルから調製したライブラリーに存在しないフラグメントを、さらなる特徴付けのために同定した。同定されたＰＣＲ増幅フラグメントを、予備的なゲル電気泳動で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、そして配列決定に直接供するか、またはＤＮＡ配列決定の前に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドベクターにクローン化した。配列決定反応を、ネステッドＰＣＲ増幅に用いたプライマーを用いるか、またはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。得られた配列を用いてさらなる遺伝子特異的プライマーを設計し、未知のトウモロコシゲノム配列への「ウォーキングアウト」を継続した。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の末端から少なくとも５００ｂｐの境界配列が得られるまで、複数回のゲノムウォーキングを行った。
【０１０７】
隣接境界配列の妥当性を保証するために、イベントＤＡＳ−５９１２２−７由来のゲノムＤＮＡについてのさらなるイベント特異的ＰＣＲ増幅を行った。増幅されたフラグメントを、Ｔ−ＤＮＡ挿入領域から５’および３’境界ゲノムＤＮＡの中に重複する配列の領域をさらに伸長するために、配列決定した。プライマー（表２に示す）を、Ｔ−ＤＮＡとトウモロコシゲノムＤＮＡとの特有の結合部をつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット０３−Ｏ−５０６／０２−Ｏ−４７６（配列番号１０／配列番号９）は、５’結合部をつないで、３１３ｂｐのフラグメント（ｂｐ２４２７からｂｐ２７３９まで、図１参照）を増幅し、プライマーセット０２−Ｏ−４４７／０３−Ｏ−５７７（配列番号８／配列番号１７）は、３’結合部をつないで、７５４ｂｐのフラグメント（ｂｐ９６２３からｂｐ１０３７６まで、図１参照）を増幅した。
【０１０８】
表２。プライマー配列
【０１０９】
【表２】
１．イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列中の位置（図１参照）。塩基１〜２５９３＝５’境界、塩基２５９４〜９９３６＝Ｔ−ＤＮＡ挿入物、塩基９９３７〜１１９２２＝３’境界。
【０１１０】
トウモロコシゲノム中に挿入されたＤＮＡ配列を検証するために、ＰＣＲを行って、イベントＤＡＳ−５９１２２−７から、挿入されたＴ−ＤＮＡを増幅、クローン化、および配列決定した。表３に示したＰＣＲプライマーセット（配列番号１１／配列番号５）；（配列番号４／配列番号７）；および（配列番号６／配列番号３）を用いて、２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７）と称される３つの重複するフラグメント（イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのＴ−ＤＮＡ挿入物ｂｐ２６８７〜ｂｐ９８４６のＴ−ＤＮＡの５’領域から３’領域までに及ぶ配列を示す（図１参照））を増幅した。ＰＣＲアンプリコン情報を表３に報告し、そしてプライマー配列を表２に列挙した。
【０１１１】
表３。ＰＣＲプライマーおよびアンプリコンの記載
【０１１２】
【表３】
１．イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列中の位置（図１参照）。塩基１〜２５９３＝５’境界、塩基２５９４〜９９３６＝Ｔ−ＤＮＡ挿入物、塩基９９３７〜１１９２２＝３’境界。
【０１１３】
ＰＣＲ ＧＣ２ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ポリメラーゼキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を製造業者の説明書に従って使用して、挿入フラグメント（２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７））を増幅した。手短に言えば、５０μＬの反応物は、５’および３’プライマー（最終濃度０．２μＭ）、ならびに４０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、植物ＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ １およびＤＡＳ−５９１２２−７ Ｔ１Ｓ２ ２由来のゲノムＤＮＡ調製物を用いて、２連で設計した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９５℃で１分間の初期変性、続いて９４℃／９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で５分間を３５サイクル、ならびに６８℃で６分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、エチジウムブロマイドで染色した１×ＴＢＥ（８９ｍＭトリスホウ酸塩，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲルを通して電気泳動した。
【０１１４】
ＰＣＲフラグメント２２Ｉ−１（配列番号２５）、２２Ｉ−２（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（配列番号２７）を、エチジウムブロマイドで染色した１×ＴＢＥ中の０．８％アガロースゲルからフラグメントを切り出すことによって精製し、そしてこのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースから精製した。ＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドベクターにクローン化した。クローン化フラグメントを、プラスミドＤＮＡの少量調製（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）およびＮｏｔ Ｉでの制限酵素消化によって確認した。次いで、プラスミドクローンおよび／または精製されたＰＣＲ挿入フラグメントを、完全な挿入物の配列決定に供した。配列決定反応を、既知のＴ−ＤＮＡ配列に特異的であるように設計されたプライマーを用いるか、またはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターとの使用に特異的なプライマーを用いて行った。Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）は、すべてのＰＣＲプライマー（ＰＣＲ反応において、最終濃度０．２〜０．４μＭで用いた）を合成した。
【０１１５】
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７、ＤＡＳ−４５２１４−４、およびＤＡＳ−４５２１６−６、ならびに未改変のコントロール系統Ｈｉ−ＩＩおよびＰＨ０９Ｂから単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ反応を用いて、以下を確認した：（１）イベントＤＡＳ−５９１２２−７の配列決定された境界領域におけるトウモロコシゲノムＤＮＡの存在、および（２）イベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるＴ−ＤＮＡ挿入物とゲノムＤＮＡ境界の結合部を横断するイベント特異的増幅。
【０１１６】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入物に隣接する境界配列を増幅するために設計されたＰＣＲプライマーを用いて、未改変のコントロール系統およびイベントＤＡＳ−５９１２２−７におけるこれらの領域の存在を確認した。５’および３’境界について、それぞれ２つのプライマーセット（計４セット）を試験した。プライマーセット０３−Ｏ−７８４／０３−Ｏ−５６４（配列番号１８／配列番号１４）および０３−Ｏ−７８４／０３−Ｏ−５４３（配列番号１８／配列番号１３）を用いて、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の境界配列５’からＴ−ＤＮＡ挿入物まで、それぞれ１３６ｂｐフラグメントおよび２６３ｂｐフラグメントを増幅した（図２および３）。同様に、プライマーセット０３−Ｏ−５６９／０３−Ｏ−５７７（配列番号１５／配列番号１７）および０３−Ｏ−５７０／０３−Ｏ−５４２（配列番号１６／配列番号１２）を用いて、３’ゲノム境界から、それぞれ２２７ｂｐフラグメントおよび４９２ｂｐフラグメントを増幅した（図２および図３）。
【０１１７】
境界配列とＴ−ＤＮＡ挿入物の結合部を横断するフラグメントを増幅するように設計されたプライマーを用いて、イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのイベント特異的なＰＣＲフラグメントを構築した。２つの結合部につき、１つのプライマーセットを選択した。プライマーセット０３−Ｏ−７８４／０２−Ｏ−２１５（配列番号１８／配列番号１）を、５’結合部を横断する５５５ｂｐフラグメントを増幅するように設計し、そしてプライマーセット０２−Ｏ−２１９／０３−Ｏ−５７７（配列番号２／配列番号１７）を、３’結合部で５４７ｂｐフラグメントを増幅するように設計した。内在性トウモロコシインベルターゼ遺伝子に基づくプライマーのセットである、ＩＶＲ１（Ｏ１９７）（配列番号３９）５’−ＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣ−３’およびＩＶＲ２（Ｏ１９８）（配列番号４０）５’−ＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＡＴＣ−３’（Ｈｕｒｓｔら、（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ５（６）：５７９−５８６）を用いて、すべてのトウモロコシゲノムＤＮＡサンプルに対する内部陽性コントロールとして２２６ｂｐ増幅産物を生成した。
【０１１８】
すべてのＰＣＲプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃによって合成され、ＰＣＲ反応において最終濃度０．２〜０．４μＭで用いられた。ＰＣＲプライマー配列を表２に列挙する。ＰＣＲ増幅のために、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣ ２ ＰＣＲキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造業者の説明書に従って使用した。ＰＣＲ反応物５０μＬ当たり、約１０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレートを使用した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９４℃で５分間の初期テンプレート変性、続いて９５℃で１分間、６０℃で２分間、および７２℃で３分間を３５サイクル、ならびに７２℃で７分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅産物を紫外線下で可視化し、続いて、１×ＴＢＥおよびエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルを通して電気泳動した。
【０１１９】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のＴ−ＤＮＡ挿入物および境界領域について得られた配列決定データを検討し、Ｓｅｑｍａｎ ＩＩ（商標）ソフトウェアバージョン４．０．５（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアセンブルした。イベントＤＡＳ−５９１２２−７に存在する挿入物に隣接する５’および３’境界配列を、ＧｅｎＢａｎｋ公開データベースに対する相同性検索に用いて、トウモロコシゲノム中の挿入部位をさらに特徴決定した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７における隣接境界とＴ−ＤＮＡ挿入物との間の結合領域中のオープンリーディングフレームを同定する分析を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ８．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ（商標），Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて行った。
【０１２０】
全体で、イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノムＤＮＡに由来する１１９２２ｂｐの配列を確認した（図１参照）。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の５’末端で、２５９３ｂｐの隣接境界配列が同定され、そして１９８６ｂｐの隣接境界配列が、ゲノムウォーキング実験で得られたフラグメントの３’末端で得られた。２２Ｉ−１（２５０１ｂｐ）（配列番号２５）、２２Ｉ−２（３０２７ｂｐ）（配列番号２６）、および２２Ｉ−３（２８３０ｂｐ）（配列番号２７）と称される、３つの重複するフラグメント（イベントＤＡＳ−５９１２２−７についてのＴ−ＤＮＡ挿入物ｂｐ２６８７〜ｂｐ９８４６のＴ−ＤＮＡの５’領域から３’領域までに及ぶ配列を示す（図１参照））を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーセットを用いて、全体で７１６０ｂｐのＴ−ＤＮＡ挿入物をクローン化および配列決定した。トウモロコシゲノムＤＮＡとＴ−ＤＮＡ挿入物の５’および３’結合部とをそれぞれつなぐ、２つのＰＣＲフラグメント、Ｏ５０６／Ｏ４７６（配列番号１０／配列番号９）およびＯ４４７／Ｏ５７７（配列番号８／配列番号１７）から、Ｔ−ＤＮＡ挿入領域の残りを配列決定した。用いたプライマーは、Ｔ−ＤＮＡの特有の結合部とトウモロコシゲノムＤＮＡとをつなぐフラグメントを増幅するために、ゲノムウォーキング実験から得られた配列に基づいて設計した。プライマーセット０３−Ｏ−５０６／０３−Ｏ−４７６（配列番号１０／配列番号９）は、５’結合部をつないで、３１３ｂｐのフラグメント（ｂｐ２４２７からｂｐ２７３９まで）を増幅し、そしてプライマーセット０３−Ｏ−４４７／０３−Ｏ−５７７（配列番号８／配列番号１７）は、３’結合部をつないで、７５４ｂｐのフラグメント（ｂｐ９６２３からｂｐ１０３７６まで）を増幅した。イベントＤＡＳ−５９１２２−７における、合わせて合計７３４３ｂｐのＴ−ＤＮＡ挿入物を、クローン化および配列決定し（ｂｐ２５９４からｂｐ９９３６まで、図１参照）、そして形質転換プラスミド（ＰＨＰ１７６６２）の配列と比較した。ｂｐ６５２６およびｂｐ６５６２で異なる２つのヌクレオチドが、Ｔ−ＤＮＡ挿入物の非翻訳コムギペルオキシダーゼプロモーター領域に認められた（図１参照）。Ｔ−ＤＮＡ挿入物のオープンリーディングフレーム組成に影響を及ぼす塩基変化は認められなかった。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の３’および５’末端領域のいずれも、Ｔ−ＤＮＡの右側境界領域を含む５’末端の最後の２２ｂｐおよびＴ−ＤＮＡの左側境界領域を含む３’末端の２５ｂｐが欠失している以外は、インタクトであることが見出された。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ゲノムへのＴ−ＤＮＡ挿入に重要な役割を果たすことが知られているが、この結果は予想外のものではなかった。なぜなら、挿入はしばしば、特にＴ−ＤＮＡの左側境界で不完全であるためである（Ｔｉｎｌａｎｄ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １（６）：１７８−１８４）。
【０１２１】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７のゲノム境界領域のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析は、公的に利用可能な配列（Ｒｅｌｅａｓｅ １３８．０ ＧｅｎＢａｎｋ，２００３年１０月２５日）との制限された相同性を示した。５’境界領域の分析により、トウモロコシゲノム配列およびＥＳＴ（発現配列タグ）配列に対して有意な相同性を有する２つの領域が見出された。第一の領域は、１７９ｂｐ（境界配列のｂｐ４７７〜ｂｐ６５５）を含み、いくつかの分子マーカー、染色体配列、および種々のＥＳＴのアラインメントによって得られるコンセンサス配列に対して類似性を示す。第二の領域は、５’境界配列のｂｐ１０８０〜ｂｐ１１５３（７４ｂｐ）に存在し、多数の異なるトウモロコシＥＳＴおよびゲノム配列に対して類似性を示す。３’境界領域はまた、植物ＤＮＡ配列に対して類似性のある２つの小さな不連続領域も有した。内部３’領域の１６２ｂｐ（ｂｐ９９５４〜ｂｐ１０１１５）は、２つのゲノムＺｅａ ｍａｙｓアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ１）遺伝子の３’非翻訳末端に対して、およびいくつかのＥＳＴコンセンサス配列に対して類似性を示した。３’境界（ｂｐ１０５９３〜ｂｐ１０６４９）の中央の比較的小さな領域（５７ｂｐ）は、複数のトウモロコシゲノム配列に由来する非コード領域に対して類似性を示した。
【０１２２】
全体としては、いずれのゲノム境界配列においても１７９塩基対を超える相同領域は同定されず、また、同じ既知配列に由来する２つ以上の相同領域も見出されなかった。イベントＤＡＳ−５９１２２−７境界配列に類似性を示す個々の付加物（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）を試験して、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入が、特徴付けされたタンパク質コード配列中に存在するか否かを決定した。類似の領域は、任意の既知のタンパク質コード配列中には存在しなかった。全形質転換プラスミド配列（ＰＨＰ１７６６２）と、イベントＤＡＳ−５９１２２−７境界配列との局所アラインメントは、有意な相同性を示さなかった。このことは、Ｔ−ＤＮＡ挿入物に隣接する境界領域が、形質転換プラスミドのフラグメントを含まなかったことを示す。したがって、イベントＤＡＳ−５９１２２−７中の挿入部位に隣接するゲノム配列の同定および特徴付けは、既知の配列に対して有意な相同性を有する領域が存在しないことによって制限された。
【０１２３】
イベントＤＡＳ−５９１２２−７中のトウモロコシゲノム境界配列とＴ−ＤＮＡ挿入物の間の５’および３’結合領域を、新しいオープンリーディングフレームの存在について分析した。有効なサイズ（＞１００アミノ酸）のオープンリーディングフレームは、５’または３’境界結合領域において同定されなかった。このことは、Ｔ−ＤＮＡ挿入の結果として新しいオープンリーディングフレームが生成されなかったことを示す。さらに、相同性検索は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ３４／３５Ａｂ１イベントＤＡＳ−５９１２２−７において、Ｔ−ＤＮＡ挿入によって分断された疑いのある、境界領域中の内在性トウモロコシオープンリーディングフレームの存在を示さなかった。
【０１２４】
実施例５。ＰＣＲプライマー
ＤＮＡイベント特異的プライマー対を用いて、ＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンを生成した。これらのイベントプライマー対としては、配列番号１８および配列番号１；配列番号２および配列番号１７；配列番号１０および配列番号９；ならびに配列番号８および配列番号１７；ならびに配列番号３６および配列番号３７が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応に用いた場合にＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なＤＮＡアンプリコンを生成する、配列番号２１および配列番号２２に由来する任意のプライマー対も、本発明の実施形態である。ＤＮＡプライマーまたはその相補体を用いてＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンＤＮＡ分子を生成する、これらの方法の任意の改変は、当該分野の通常の技術範囲内である。さらに、内在性トウモロコシ遺伝子の増幅のためのＩＶＲ１（Ｏ１９７）／ＩＶＲ２（Ｏ１９８）（配列番号３９／配列番号４０）を含む、コントロールプライマー対は、反応条件についての内部標準として含まれる。
【０１２５】
ＤＡＳ−５９１２２−７イベントの存在について試験するための植物組織ＤＮＡ抽出物の分析には、陽性の組織ＤＮＡ抽出物コントロール（トランスジェニック配列を含むことが分かっているＤＮＡサンプル）が含まれるべきである。陽性コントロールの増幅の成功は、ＰＣＲが、標的配列の増幅を可能にする条件下で行われたことを示す。陰性（または野生型）のＤＮＡ抽出物コントロール（その中に提供されるテンプレートＤＮＡが、非トランスジェニック植物から調製されるゲノムＤＮＡであるか、または非ＤＡＳ−５９１２２−７トランスジェニック植物から調製されるゲノムＤＮＡのいずれかである）も含まれるべきである。さらに、テンプレートトウモロコシＤＮＡ抽出物を含まない陰性コントロールは、ＰＣＲプロトコルに用いる試薬および条件の有用な判断基準である。
【０１２６】
十分な長さのさらなるＤＮＡプライマー分子が、ＤＮＡ増幅方法の当業者によって配列番号２１および配列番号２２から選択され得、そしてイベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なアンプリコンの生成のために、条件が最適化され得る。これらのＤＮＡプライマー配列を、これらの実施例に示した方法に修正を加えて使用することは、本発明の範囲内である。十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子が、イベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的な配列番号２１および配列番号２２に由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子が、イベントＤＡＳ−５９１２２−７に特徴的なＰＨＩ１７６６２Ａの遺伝因子のいずれかに由来する、アンプリコンは、本発明の実施形態である。ＤＡＳ−５９１２２−７アンプリコンのアッセイは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００）またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーを使用することによって、あるいは当業者に公知の方法および装置によって、実行され得る。
【０１２７】
本発明の原理を図示および記載してきたが、本発明は、このような原理から逸脱することなく配置および詳細が変更され得ることが、当業者には明らかなはずである。本発明者らは、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての変更を特許請求する。
【０１２８】
本明細書中で引用される全ての刊行物および公開特許文献は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが具体的かつ個々に示されたと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１】
本明細書に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２４５００４（Ｐ２０１２−２４５００４Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１８０２３７（Ｐ２０１２−１８０２３７）
【出願日】平成２４年８月１５日（２０１２．８．１５）
【分割の表示】特願２００７−５３４７５０（Ｐ２００７−５３４７５０）の分割
【原出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（５００２０７８９９）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (7)
【出願人】（３９００３９１９２）ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１８０２３７（Ｐ２０１２−１８０２３７）
【出願日】平成２４年８月１５日（２０１２．８．１５）
【分割の表示】特願２００７−５３４７５０（Ｐ２００７−５３４７５０）の分割
【原出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（５００２０７８９９）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (7)
【出願人】（３９００３９１９２）ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【Ｆターム（参考）】
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