トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及びその使用
【課題】トウモロコシの種子中の脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット及びその使用を提供する。
【解決手段】トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗するＱＴＬに連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、上記方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代において種子中の脂肪含量の高い系統を作出する高脂肪含量系統の作出方法。
【効果】簡便、確実に脂肪含量の向上した個体を選抜することができ、また、本手法を用いることで、幼苗段階での選抜が可能となる。
【解決手段】トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗するＱＴＬに連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、上記方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代において種子中の脂肪含量の高い系統を作出する高脂肪含量系統の作出方法。
【効果】簡便、確実に脂肪含量の向上した個体を選抜することができ、また、本手法を用いることで、幼苗段階での選抜が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウモロコシ自殖系統の育成過程における高脂肪含量個体の選抜方法に関するものであり、更に詳しくは、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及び該プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別し、高脂肪含有系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出する方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、脂肪含量関連量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いて、トウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片長により遺伝子型を判別することにより、従来の脂肪含量の測定を行うことなく、脂肪含量の向上した個体の選抜を可能とする新しい高脂肪含量系統の作出方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
飼料用トウモロコシにおいて、トウモロコシ種子の脂肪含量の向上は子実の栄養強化に有効であることから、従来、多くの高脂肪含量系統の品種が作出されている。通常、トウモロコシ種子の粗脂肪含量は、３−４％であるが、高脂肪含量系統ではそれ以上の脂肪含量を示し、１０％を超えるものも少なくない。
【０００４】
一般に、高脂肪含量系統の選抜では、脂肪含量以外の重要な形質（耐病性や耐倒伏性などの農業特性）に基づいて個体選抜し、自殖（戻し交配の場合、反復親との交配）し、その後、得られた種子の脂肪含量を測定し、更に、選抜を行う手法が採られている。
【０００５】
この時の脂肪含量の測定は、一般的な食品の分析と同様に、ソックスレー抽出法等の化学的手法によって行われるが、これらの分析法は、高度な技術を要するうえ、数１０グラムの検体を必要とする。したがって、上記手法では、１個体（１雌穂）から得られる種子量が少ないと、分析を行い、かつ次世代での播種に用いる種子を確保することができなくなる場合もある。また、脂肪含量に基づく選抜では、脂肪含量に関与する遺伝子の有無を確認していないため、交配を重ねるにつれ、高脂肪含量系統由来の遺伝子が失われる危険がある。
【０００６】
本発明以前に、先行技術として、高脂肪含量系統のＩｌｌｉｎｏｉｓ Ｈｉｇｈ Ｏｉｌに由来する解析集団による脂肪含量関連ＱＴＬの探索が行われている（非特許文献１、２）。しかしながら、これらは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーを用いており、マーカー選抜のためには、より緊密で簡便に調査することを可能とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用したマーカーの開発が望まれていた。
【０００７】
また、トウモロコシ種子の脂肪含量は、量的形質であり、同形質に関与する遺伝子は数１０個存在すると考えられており、解析集団が異なれば、また、新たなＱＴＬが明らかになることが予想された。
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３４：９０８−９１５（１９９４）
【非特許文献２】Ｓｕｇｈｒｏｕｅ ａｎｄ Ｒｏｃｈｅｆｏｒｄ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８７：９１６−９２４（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中で、本発明者らは、上記問題を解決すべく、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｈｉｇｈ Ｏｉｌとは異なった遺伝的背景を持つ高脂肪含量集団Ｒ Ａｌｅｘｈｏ Ｃ２３（Ｍ）より選抜された高脂肪含量系統ＧＹ２２０を片親とする品種ＫＹ１１５より派生した３解析集団を育成し、ＡＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーを用いた連鎖地図を作成し、各個体の脂肪含量測定結果とともにＱＴＬ解析を行うことにより、脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）及びこれらに連鎖するＤＮＡマーカーを検出するために好適なプライマーセットの構築を試みた。
【００１０】
その結果、トウモロコシ種子の脂肪含量に関する３つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が第１、第４及び第６染色体上に座乗することを見出した。更に、各ＱＴＬの周辺に関してＳＳＲマーカーを増やし、より高密度の連鎖地図を作成することにより、上記遺伝子座に、より緊密に連鎖するＳＳＲマーカーを検出できるプライマーセットを構築することに成功し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーの検出を可能とするプライマーセット、該プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、該方法により高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出する方法、及びその高脂肪含量系統を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができるプライマーセット。
（２）ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーである、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有する、前記（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法。
（５）前記（４）に記載の方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出することを特徴とする高脂肪含量系統の作出方法。
（６）前記（５）に記載の系統作出方法により作出されたトウモロコシの系統であって、トウモロコシ種子中の脂肪含量の高い、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量関連ＱＴＬを有することを特徴とする高脂肪含量系統。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができることを特徴とするものである。本発明では、上記ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーであること、上記プライマーセットが、配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００１４】
また、本発明は、上記したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、上記方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い系統を作出する高脂肪含量系統の作出方法、上記の系統作出方法によって得られる、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量ＱＴＬを有する高脂肪含量系統の点に特徴を有するものである。
【００１５】
本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座に連鎖し、遺伝子型の判定に利用可能なＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットに関するものである。以下、本発明のプライマーセット及びその効果的な利用方法について説明する。
【００１６】
本発明では、第１、第４及び第６染色体上に座乗する脂肪含量関連ＱＴＬに対し、緊密に連鎖するマーカーをそれぞれ複数個見出している。しかしながら、本発明に係るＤＮＡマーカーはこれらに限定されるものではなく、育種素材として用いる高脂肪含量系統及び任意の通常系統間でこれらのマーカーで多型が見られない場合には、新たなマーカーが必要になる。
【００１７】
本発明では、各々のマーカーを調査するためのプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いによりマーカーの遺伝子型を判定する。本発明が対象とするＤＮＡマーカーは、脂肪含量関連ＱＴＬの近傍に座乗しているため、上記ＰＣＲによる遺伝子型の判別結果から、各個体の脂肪含量関連ＱＴＬが、高脂肪含量系統或いは通常系統のいずれに由来するかを判別することが可能となる。
【００１８】
また、本発明では、上記の方法で高脂肪含量系統由来の脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を得ることにより、高脂肪含量系統を作出することが可能となる。
【００１９】
本発明を利用する際に用いる高脂肪含量系統には、例えば、本発明者らが解析に用いたＲ Ａｌｅｘｈｏ（Ｍ）Ｃ２３由来の系統ＧＹ２２０を用いることが望ましいが、これらに制限されるものではない。トウモロコシ種子中の脂肪含量は、量的形質であり、複数の遺伝子座によって決定される形質である。そのため、本発明で見出されたＱＴＬが、必ずしもすべての高脂肪含量系統の脂肪含量向上に寄与しているとは限らない。他の高脂肪含量系統を育種素材として用いる場合、まず、本発明で見出された各遺伝子座がその系統の脂肪含量向上に寄与していることを確認しておくことが望ましい。
【００２０】
上記のＤＮＡマーカーの遺伝子型判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出法には、特別な制約は無く、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられているＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変し行えば良い。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。
【００２１】
ＤＮＡマーカーの遺伝子型判定の際に行うＰＣＲの条件は、後記する実施例に例示されているが、これらに限定されるものではなく、プライマーセットや使用機器に合わせて適宜変更することができる。同様に、電気泳動条件も変更可能であり、増幅断片長の差が十分にあれば、アガロースゲルを用いることもできる。
【００２２】
本発明では、脂肪含量関連遺伝子座の解析のための解析集団が用いられる。解析集団としては、例えば、高脂肪含量Ｆ１品種ＫＹ１１５（ＧＹ２２０／１１４５）を自殖、或いは自殖系統Ｎａ４２又はＨ９５との交配により得られる、解析用集団（例えば、ＫＹ１１５ Ｆ２ １９９個体、ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２ １２７個体、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１ ２１４個体）が例示されるが、これらに制限されるものではない。各個体は、例えば、葉片より適宜の手法によりＤＮＡを抽出し、後の解析に用いる。得られる自殖種子は、ジエチルエーテル抽出法等で脂肪含量を測定する。
【００２３】
次に、連鎖地図の作成には、例えば、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーが用いられる。ＡＦＬＰ解析には、例えば、Ｖｏｓらの方法及びＭｙｂｕｒｇらの方法が用いられる。ＡＦＬＰ解析におけるゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、例えば、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行う。ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、例えば、蛍光色素で標識して用いる。多型の検出は、ＤＮＡシークエンサで行うことができる。
【００２４】
ＳＳＲマーカーは、例えば、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）で公開されたものが用いられる。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、例えば、順方向プライマーはＩＲＤ８００等の蛍光色素で標識して用いる。ＳＳＲ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通りの条件で行うことができる。
【００２５】
ＰＣＲの条件として、好適には、例えば、１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間が例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらの条件は適宜変更することができる。
【００２６】
連鎖地図は、ＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査の結果をもとに、連鎖解析ソフトウェアで作成する。ＱＴＬ解析は、上述の連鎖地図と各個体の脂肪含量をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアを用いて行う。各マーカーの多型調査結果をもとに、例えば、ＬＯＤ＝３．０で連鎖解析を行い、連鎖地図を作成する。例えば、ＫＹ１１５ Ｆ２集団では、２３９マーカー（ＳＳＲマーカー４２個及びＡＦＬＰマーカー１９７個）をもとに、２〜４個のマーカーからなる小さな連鎖群を除き、１１個の大きな連鎖群が形成される。これらの連鎖群は、座乗しているＳＳＲマーカーからそれぞれ１０本のトウモロコシ染色体に対応することが示された。
【００２７】
同様に、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団では、２４０マーカーにより１０本の染色体に対応する１０個の大きな連鎖群と４つの小さな連鎖群が見られた。ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団では、３４１マーカーにより３０連鎖群が形成され、そのうちの９連鎖群が第１から第９染色体に対応していた。ただし、第１０染色体に関しては、連鎖解析に用いたＳＳＲマーカーに、第１０染色体に座乗するものが無かったため、対応する連鎖群は確認されていない。
【００２８】
解析集団の連鎖地図と各個体の脂肪含量に基づき、単純区間マッピング法によりＱＴＬ解析を行い、その結果、１４個のＱＴＬが検出され、このうち、複数の解析集団でほぼ同位置に検出された第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬに注目した。第１染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、それぞれ１６．９％と１６．８％の寄与率が示された。
【００２９】
同様に、第４染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団で検出され、１２．６％と２８．０％の寄与率を示し、第６染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、２０．６％と２６．８％の寄与率を示した。
【００３０】
トウモロコシでは、染色体上のおおよその位置をＢｉｎ番号で表記するが、これは、遺伝地図を約２０ｃＭ（センチモルガン）ずつ１００の領域に分割したもので、染色体番号と二桁の数字で表す。第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬは、それぞれ１．０３、４．０７〜４．０８、６．０１〜６．０５の領域に座乗していることが判明した。
【００３１】
上記の３つの脂肪含量関連ＱＴＬに、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、Ｂｉｎ番号をもとに、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅより、各ＱＴＬの周辺に座乗すると思われるＳＳＲマーカーを選び出した。ＫＹ１１５ Ｆ２集団に対して、これらのマーカーの多型を調査し、上述のＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーの調査結果に加えて、同ＱＴＬ周辺の高密度連鎖地図を作成した。
【００３２】
その後、ＱＴＬ解析ソフトウェアによる複合区間マッピング法によるＱＴＬ解析を行った。解析の結果、調査した第１、第４及び第６染色体上にＬＯＤスコア２．５以上の領域がそれぞれ１箇所ずつ存在し、ＱＴＬの存在が示された。各染色体のＬＯＤスコアのピークより１０ｃＭ（センチモルガン）以内にあるＳＳＲマーカーは、第１染色体上のＱＴＬには７個、第４染色体上のＱＴＬには１２個、第６染色体上のＱＴＬには４個見られた。そこで、各ＱＴＬの遺伝子型を検出できるプライマーセットを構築した。
【００３３】
本発明では、脂肪含量関連遺伝子座の解析集団としては、上述の解析用集団の場合と同様にして他の任意の解析用集団を利用することができる。連鎖地図の作成におけるＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査、連鎖解析、ＱＴＬ解析の手法及び手段についても任意の手法及び手段を利用することができる。また、本発明において、脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体の選抜、その後代の育成、作出の方法は常法に従って行うことが可能であり、特に制限されるものではない。
【００３４】
本発明では、例えば、上述のプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行う、増幅されるＤＮＡの断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子座を識別するが、表１に、脂肪含量関連ＱＴＬ近傍のマーカーの増幅断片長の例を示す。本発明では、このような増幅断片長の違いに基づいて供試した個体の系統を判定することが可能となる。表１において、増幅断片長は電気泳動像から推定した。
【００３５】
【表１】
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。
（２）トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、上記脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。
（３）上記ＤＮＡマーカーにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法を提供することができる。
（４）本発明により提供されるプライマーセットを用いて脂肪含量関連遺伝子座の遺伝子型を判定することにより、脂肪含量の向上したトウモロコシ自殖系統を効率的かつ確実に作出することができる。
（５）高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代において種子中の脂肪含量の高い系統を作出する方法及びその高脂肪含量系統を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
１）解析集団
脂肪含量関連遺伝子座の解析のため、高脂肪含量Ｆ１品種ＫＹ１１５（ＧＹ２２０／１１４５）を自殖、或いは自殖系統Ｎａ４２又はＨ９５との交配により、３つの解析用集団（ＫＹ１１５ Ｆ２ １９９個体、ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２ １２７個体、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１ ２１４個体）を用意した。各個体は、葉片よりＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出し、後の解析に用いた。得られた自殖種子は、財団法人 日本食品分析センターに依頼し、ジエチルエーテル抽出法で脂肪含量を測定した。
【００３９】
３集団それぞれの各個体の脂肪含量の分布は、正規分布に従っていた。脂肪含量の平均は、ＫＹ１１５ Ｆ２集団が最も高かった（図１）。
【００４０】
２）連鎖地図作成
連鎖地図の作成には、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを用いた。ＡＦＬＰ解析は、Ｖｏｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４（１９９５））及びＭｙｂｕｒｇらの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：３４８−３５７（２００１））に倣って行った。
【００４１】
ＡＦＬＰ解析におけるゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、ＩＲＤ７００或いはＩＲＤ８００蛍光色素（アロカ社製）で標識されたものを用いた。多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。
【００４２】
ＳＳＲマーカーは、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）で公開されたものを用いた。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、順方向プライマーはＩＲＤ８００蛍光色素で標識した。ＳＳＲ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通り、以下の条件で行った。
【００４３】
１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間。そして、多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。
【００４４】
連鎖地図は、ＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査の結果をもとに、連鎖解析ソフトウェアとして、ＪｏｉｎＭａｐ（Ｓｔａｍ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７３９−７４４（１９９３））を用いて作成した。ＱＴＬ解析は、上述の連鎖地図と各個体の脂肪含量をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアとして、ＭａｐＱＴＬ（Ｖａｎ ＯｏｉｊｅｎとＭａｌｉｅｐａａｒｄ，Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩＶ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（１９９６））を用いて行った。
【００４５】
各マーカーの多型調査結果をもとに、ＬＯＤ＝３．０で連鎖解析を行い、連鎖地図を作成した結果、ＫＹ１１５ Ｆ２集団では、２３９マーカー（ＳＳＲマーカー４２個及びＡＦＬＰマーカー１９７個）をもとに、２〜４個のマーカーからなる小さな連鎖群を除き、１１個の大きな連鎖群が形成された。これらの連鎖群は、座乗しているＳＳＲマーカーからそれぞれ１０本のトウモロコシ染色体に対応することが示された。
【００４６】
同様に、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団では、２４０マーカーにより１０本の染色体に対応する１０個の大きな連鎖群と４つの小さな連鎖群が見られた。ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団では、３４１マーカーにより３０連鎖群が形成され、そのうちの９連鎖群が第１から第９染色体に対応していた。ただし、第１０染色体に関しては、連鎖解析に用いたＳＳＲマーカーに、第１０染色体に座乗するものが無かった。そのため、対応する連鎖群は確認できなかった。
【００４７】
３解析集団の連鎖地図と各個体の脂肪含量に基づき、単純区間マッピング法によりＱＴＬ解析を行った。その結果、１４個のＱＴＬが検出された。このうち、複数の解析集団でほぼ同位置に検出された第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬに注目した。第１染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、それぞれ１６．９％と１６．８％の寄与率が示された。
【００４８】
同様に、第４染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団で検出され、１２．６％と２８．０％の寄与率を示し、第６染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、２０．６％と２６．８％の寄与率を示した（表２）。
【００４９】
【表２】
【００５０】
トウモロコシでは、染色体上のおおよその位置をＢｉｎ番号で表記するが、これは、遺伝地図を約２０ｃＭ（センチモルガン）ずつ１００の領域に分割したもので、染色体番号と二桁の数字で表す（Ｇａｒｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３４：９１７−９３０）。第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬは、それぞれ１．０３、４．０７〜４．０８、６．０１〜６．０５の領域に座乗していた。
【００５１】
上記の３つの脂肪含量関連ＱＴＬに、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、Ｂｉｎ番号をもとに、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅより、各ＱＴＬの周辺に座乗すると思われるＳＳＲマーカーを選び出した。ＫＹ１１５ Ｆ２集団に対して新たに追加したＳＳＲマーカーの多型を調査し、上述のＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーの調査結果に加えて、同ＱＴＬ周辺の高密度連鎖地図を作成した。
【００５２】
その後、ＱＴＬ解析ソフトウェアとして、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＱＴＬ Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ（Ｗａｎｇ Ｓ．，Ｃ．Ｊ．Ｂａｓｔｅｎ，ａｎｄ Ｚ．−Ｂ．Ｚｅｎｇ（２００６）．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ．（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｇｅｎ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ｑｔｌｃａｒｔ／ＷＱＴＬＣａｒｔ．ｈｔｍ））を用いて、複合区間マッピング法によるＱＴＬ解析を行った。
【００５３】
解析の結果、調査した第１、第４及び第６染色体上にＬＯＤスコア２．５以上の領域がそれぞれ１箇所ずつ存在し、ＱＴＬの存在が示された。各染色体のＬＯＤスコアのピークより１０ｃＭ（センチモルガン）以内にあるＳＳＲマーカーは、第１染色体上のＱＴＬには７個、第４染色体上のＱＴＬには１２個、第６染色体上のＱＴＬには４個見られた。これらのマーカーを検出できるプライマーセットを構築し、利用することで、各ＱＴＬの遺伝子型判定が可能となった（表３、図２）。
【００５４】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上詳述したように、本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット及びその使用に係るものであり、本発明により、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、上記脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。本発明により提供されるプライマーセットを用いて脂肪含量関連遺伝子座の遺伝子型を判定することにより、脂肪含量の向上したトウモロコシ自殖系統を効率的かつ確実に作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明で用いた解析集団における各個体の脂肪含量の分布を示す図である。グラフは、上からＫＹ１１５ Ｆ２集団、ＫＹ１１５とＮａ４２間のＦ２集団、ＫＹ１１５とＨ９５間のＢＣ１集団の結果を示す。中段及び下段の図では、両親（ＫＹ１１５及びＮａ４２もしくはＨ９５）の脂肪含量を図中に矢印で示す。
【図２】脂肪含量関連遺伝子座に連鎖することが示されたＤＮＡマーカーでの遺伝子型判定の一例を示す図である。図中では、ｕｍｃ２３１８、ｐｈｉ４５２６９３、ｕｍｃ２１３５の３マーカーについて同時に遺伝子型の調査を行っている。図中、“Ｍ”はサイズマーカーを示し、図左にサイズマーカーの塩基数を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウモロコシ自殖系統の育成過程における高脂肪含量個体の選抜方法に関するものであり、更に詳しくは、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するプライマーセット及び該プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別し、高脂肪含有系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出する方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、脂肪含量関連量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出できるプライマーセットを用いて、トウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片長により遺伝子型を判別することにより、従来の脂肪含量の測定を行うことなく、脂肪含量の向上した個体の選抜を可能とする新しい高脂肪含量系統の作出方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
飼料用トウモロコシにおいて、トウモロコシ種子の脂肪含量の向上は子実の栄養強化に有効であることから、従来、多くの高脂肪含量系統の品種が作出されている。通常、トウモロコシ種子の粗脂肪含量は、３−４％であるが、高脂肪含量系統ではそれ以上の脂肪含量を示し、１０％を超えるものも少なくない。
【０００４】
一般に、高脂肪含量系統の選抜では、脂肪含量以外の重要な形質（耐病性や耐倒伏性などの農業特性）に基づいて個体選抜し、自殖（戻し交配の場合、反復親との交配）し、その後、得られた種子の脂肪含量を測定し、更に、選抜を行う手法が採られている。
【０００５】
この時の脂肪含量の測定は、一般的な食品の分析と同様に、ソックスレー抽出法等の化学的手法によって行われるが、これらの分析法は、高度な技術を要するうえ、数１０グラムの検体を必要とする。したがって、上記手法では、１個体（１雌穂）から得られる種子量が少ないと、分析を行い、かつ次世代での播種に用いる種子を確保することができなくなる場合もある。また、脂肪含量に基づく選抜では、脂肪含量に関与する遺伝子の有無を確認していないため、交配を重ねるにつれ、高脂肪含量系統由来の遺伝子が失われる危険がある。
【０００６】
本発明以前に、先行技術として、高脂肪含量系統のＩｌｌｉｎｏｉｓ Ｈｉｇｈ Ｏｉｌに由来する解析集団による脂肪含量関連ＱＴＬの探索が行われている（非特許文献１、２）。しかしながら、これらは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーを用いており、マーカー選抜のためには、より緊密で簡便に調査することを可能とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用したマーカーの開発が望まれていた。
【０００７】
また、トウモロコシ種子の脂肪含量は、量的形質であり、同形質に関与する遺伝子は数１０個存在すると考えられており、解析集団が異なれば、また、新たなＱＴＬが明らかになることが予想された。
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，３４：９０８−９１５（１９９４）
【非特許文献２】Ｓｕｇｈｒｏｕｅ ａｎｄ Ｒｏｃｈｅｆｏｒｄ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８７：９１６−９２４（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中で、本発明者らは、上記問題を解決すべく、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｈｉｇｈ Ｏｉｌとは異なった遺伝的背景を持つ高脂肪含量集団Ｒ Ａｌｅｘｈｏ Ｃ２３（Ｍ）より選抜された高脂肪含量系統ＧＹ２２０を片親とする品種ＫＹ１１５より派生した３解析集団を育成し、ＡＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーを用いた連鎖地図を作成し、各個体の脂肪含量測定結果とともにＱＴＬ解析を行うことにより、脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）及びこれらに連鎖するＤＮＡマーカーを検出するために好適なプライマーセットの構築を試みた。
【００１０】
その結果、トウモロコシ種子の脂肪含量に関する３つの量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が第１、第４及び第６染色体上に座乗することを見出した。更に、各ＱＴＬの周辺に関してＳＳＲマーカーを増やし、より高密度の連鎖地図を作成することにより、上記遺伝子座に、より緊密に連鎖するＳＳＲマーカーを検出できるプライマーセットを構築することに成功し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーの検出を可能とするプライマーセット、該プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムＤＮＡのＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、該方法により高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出する方法、及びその高脂肪含量系統を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができるプライマーセット。
（２）ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーである、前記（１）に記載のプライマーセット。
（３）配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有する、前記（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法。
（５）前記（４）に記載の方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出することを特徴とする高脂肪含量系統の作出方法。
（６）前記（５）に記載の系統作出方法により作出されたトウモロコシの系統であって、トウモロコシ種子中の脂肪含量の高い、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量関連ＱＴＬを有することを特徴とする高脂肪含量系統。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができることを特徴とするものである。本発明では、上記ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーであること、上記プライマーセットが、配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００１４】
また、本発明は、上記したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法、上記方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い系統を作出する高脂肪含量系統の作出方法、上記の系統作出方法によって得られる、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量ＱＴＬを有する高脂肪含量系統の点に特徴を有するものである。
【００１５】
本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関連する量的形質遺伝子座に連鎖し、遺伝子型の判定に利用可能なＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットに関するものである。以下、本発明のプライマーセット及びその効果的な利用方法について説明する。
【００１６】
本発明では、第１、第４及び第６染色体上に座乗する脂肪含量関連ＱＴＬに対し、緊密に連鎖するマーカーをそれぞれ複数個見出している。しかしながら、本発明に係るＤＮＡマーカーはこれらに限定されるものではなく、育種素材として用いる高脂肪含量系統及び任意の通常系統間でこれらのマーカーで多型が見られない場合には、新たなマーカーが必要になる。
【００１７】
本発明では、各々のマーカーを調査するためのプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いによりマーカーの遺伝子型を判定する。本発明が対象とするＤＮＡマーカーは、脂肪含量関連ＱＴＬの近傍に座乗しているため、上記ＰＣＲによる遺伝子型の判別結果から、各個体の脂肪含量関連ＱＴＬが、高脂肪含量系統或いは通常系統のいずれに由来するかを判別することが可能となる。
【００１８】
また、本発明では、上記の方法で高脂肪含量系統由来の脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を得ることにより、高脂肪含量系統を作出することが可能となる。
【００１９】
本発明を利用する際に用いる高脂肪含量系統には、例えば、本発明者らが解析に用いたＲ Ａｌｅｘｈｏ（Ｍ）Ｃ２３由来の系統ＧＹ２２０を用いることが望ましいが、これらに制限されるものではない。トウモロコシ種子中の脂肪含量は、量的形質であり、複数の遺伝子座によって決定される形質である。そのため、本発明で見出されたＱＴＬが、必ずしもすべての高脂肪含量系統の脂肪含量向上に寄与しているとは限らない。他の高脂肪含量系統を育種素材として用いる場合、まず、本発明で見出された各遺伝子座がその系統の脂肪含量向上に寄与していることを確認しておくことが望ましい。
【００２０】
上記のＤＮＡマーカーの遺伝子型判定に用いるゲノムＤＮＡの抽出法には、特別な制約は無く、植物の葉片からのＤＮＡ抽出で一般的に用いられているＣＴＡＢ法などを必要に応じて改変し行えば良い。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。
【００２１】
ＤＮＡマーカーの遺伝子型判定の際に行うＰＣＲの条件は、後記する実施例に例示されているが、これらに限定されるものではなく、プライマーセットや使用機器に合わせて適宜変更することができる。同様に、電気泳動条件も変更可能であり、増幅断片長の差が十分にあれば、アガロースゲルを用いることもできる。
【００２２】
本発明では、脂肪含量関連遺伝子座の解析のための解析集団が用いられる。解析集団としては、例えば、高脂肪含量Ｆ１品種ＫＹ１１５（ＧＹ２２０／１１４５）を自殖、或いは自殖系統Ｎａ４２又はＨ９５との交配により得られる、解析用集団（例えば、ＫＹ１１５ Ｆ２ １９９個体、ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２ １２７個体、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１ ２１４個体）が例示されるが、これらに制限されるものではない。各個体は、例えば、葉片より適宜の手法によりＤＮＡを抽出し、後の解析に用いる。得られる自殖種子は、ジエチルエーテル抽出法等で脂肪含量を測定する。
【００２３】
次に、連鎖地図の作成には、例えば、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーが用いられる。ＡＦＬＰ解析には、例えば、Ｖｏｓらの方法及びＭｙｂｕｒｇらの方法が用いられる。ＡＦＬＰ解析におけるゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、例えば、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行う。ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、例えば、蛍光色素で標識して用いる。多型の検出は、ＤＮＡシークエンサで行うことができる。
【００２４】
ＳＳＲマーカーは、例えば、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）で公開されたものが用いられる。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、例えば、順方向プライマーはＩＲＤ８００等の蛍光色素で標識して用いる。ＳＳＲ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例えば、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通りの条件で行うことができる。
【００２５】
ＰＣＲの条件として、好適には、例えば、１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間が例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらの条件は適宜変更することができる。
【００２６】
連鎖地図は、ＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査の結果をもとに、連鎖解析ソフトウェアで作成する。ＱＴＬ解析は、上述の連鎖地図と各個体の脂肪含量をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアを用いて行う。各マーカーの多型調査結果をもとに、例えば、ＬＯＤ＝３．０で連鎖解析を行い、連鎖地図を作成する。例えば、ＫＹ１１５ Ｆ２集団では、２３９マーカー（ＳＳＲマーカー４２個及びＡＦＬＰマーカー１９７個）をもとに、２〜４個のマーカーからなる小さな連鎖群を除き、１１個の大きな連鎖群が形成される。これらの連鎖群は、座乗しているＳＳＲマーカーからそれぞれ１０本のトウモロコシ染色体に対応することが示された。
【００２７】
同様に、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団では、２４０マーカーにより１０本の染色体に対応する１０個の大きな連鎖群と４つの小さな連鎖群が見られた。ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団では、３４１マーカーにより３０連鎖群が形成され、そのうちの９連鎖群が第１から第９染色体に対応していた。ただし、第１０染色体に関しては、連鎖解析に用いたＳＳＲマーカーに、第１０染色体に座乗するものが無かったため、対応する連鎖群は確認されていない。
【００２８】
解析集団の連鎖地図と各個体の脂肪含量に基づき、単純区間マッピング法によりＱＴＬ解析を行い、その結果、１４個のＱＴＬが検出され、このうち、複数の解析集団でほぼ同位置に検出された第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬに注目した。第１染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、それぞれ１６．９％と１６．８％の寄与率が示された。
【００２９】
同様に、第４染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団で検出され、１２．６％と２８．０％の寄与率を示し、第６染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、２０．６％と２６．８％の寄与率を示した。
【００３０】
トウモロコシでは、染色体上のおおよその位置をＢｉｎ番号で表記するが、これは、遺伝地図を約２０ｃＭ（センチモルガン）ずつ１００の領域に分割したもので、染色体番号と二桁の数字で表す。第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬは、それぞれ１．０３、４．０７〜４．０８、６．０１〜６．０５の領域に座乗していることが判明した。
【００３１】
上記の３つの脂肪含量関連ＱＴＬに、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、Ｂｉｎ番号をもとに、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅより、各ＱＴＬの周辺に座乗すると思われるＳＳＲマーカーを選び出した。ＫＹ１１５ Ｆ２集団に対して、これらのマーカーの多型を調査し、上述のＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーの調査結果に加えて、同ＱＴＬ周辺の高密度連鎖地図を作成した。
【００３２】
その後、ＱＴＬ解析ソフトウェアによる複合区間マッピング法によるＱＴＬ解析を行った。解析の結果、調査した第１、第４及び第６染色体上にＬＯＤスコア２．５以上の領域がそれぞれ１箇所ずつ存在し、ＱＴＬの存在が示された。各染色体のＬＯＤスコアのピークより１０ｃＭ（センチモルガン）以内にあるＳＳＲマーカーは、第１染色体上のＱＴＬには７個、第４染色体上のＱＴＬには１２個、第６染色体上のＱＴＬには４個見られた。そこで、各ＱＴＬの遺伝子型を検出できるプライマーセットを構築した。
【００３３】
本発明では、脂肪含量関連遺伝子座の解析集団としては、上述の解析用集団の場合と同様にして他の任意の解析用集団を利用することができる。連鎖地図の作成におけるＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査、連鎖解析、ＱＴＬ解析の手法及び手段についても任意の手法及び手段を利用することができる。また、本発明において、脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体の選抜、その後代の育成、作出の方法は常法に従って行うことが可能であり、特に制限されるものではない。
【００３４】
本発明では、例えば、上述のプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行う、増幅されるＤＮＡの断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子座を識別するが、表１に、脂肪含量関連ＱＴＬ近傍のマーカーの増幅断片長の例を示す。本発明では、このような増幅断片長の違いに基づいて供試した個体の系統を判定することが可能となる。表１において、増幅断片長は電気泳動像から推定した。
【００３５】
【表１】
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。
（２）トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、上記脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。
（３）上記ＤＮＡマーカーにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法を提供することができる。
（４）本発明により提供されるプライマーセットを用いて脂肪含量関連遺伝子座の遺伝子型を判定することにより、脂肪含量の向上したトウモロコシ自殖系統を効率的かつ確実に作出することができる。
（５）高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代において種子中の脂肪含量の高い系統を作出する方法及びその高脂肪含量系統を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
１）解析集団
脂肪含量関連遺伝子座の解析のため、高脂肪含量Ｆ１品種ＫＹ１１５（ＧＹ２２０／１１４５）を自殖、或いは自殖系統Ｎａ４２又はＨ９５との交配により、３つの解析用集団（ＫＹ１１５ Ｆ２ １９９個体、ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２ １２７個体、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１ ２１４個体）を用意した。各個体は、葉片よりＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出し、後の解析に用いた。得られた自殖種子は、財団法人 日本食品分析センターに依頼し、ジエチルエーテル抽出法で脂肪含量を測定した。
【００３９】
３集団それぞれの各個体の脂肪含量の分布は、正規分布に従っていた。脂肪含量の平均は、ＫＹ１１５ Ｆ２集団が最も高かった（図１）。
【００４０】
２）連鎖地図作成
連鎖地図の作成には、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー及び単純反復配列（ＳＳＲ）マーカーを用いた。ＡＦＬＰ解析は、Ｖｏｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４（１９９５））及びＭｙｂｕｒｇらの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：３４８−３５７（２００１））に倣って行った。
【００４１】
ＡＦＬＰ解析におけるゲノムＤＮＡの制限酵素消化は、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ、もしくはＰｓｔＩ及びＭｓｅＩの組合せで行い、ＥｃｏＲＩプライマー及びＰｓｔＩプライマーは、ＩＲＤ７００或いはＩＲＤ８００蛍光色素（アロカ社製）で標識されたものを用いた。多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。
【００４２】
ＳＳＲマーカーは、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭａｉｚｅＧＤＢ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｉｚｅｇｄｂ．ｏｒｇ／）で公開されたものを用いた。各ＳＳＲマーカーのプライマーペアのうち、順方向プライマーはＩＲＤ８００蛍光色素で標識した。ＳＳＲ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＭａｉｚｅＧＤＢに記載の通り、以下の条件で行った。
【００４３】
１）９４℃ ５分、２）９４℃ １分間、６５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ２サイクル、３）９４℃ １分間、６５℃（１サイクル毎に１℃下げる）１分間、７２℃ １．５分間 １０サイクル、４）９４℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １．５分間 ３０サイクル、５）７２℃ ７分間。そして、多型の検出は、ＤＮＡアナリシスシステム ＬＩＣ−４２００Ｌ−２（アロカ社製）で行った。
【００４４】
連鎖地図は、ＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーでの多型調査の結果をもとに、連鎖解析ソフトウェアとして、ＪｏｉｎＭａｐ（Ｓｔａｍ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７３９−７４４（１９９３））を用いて作成した。ＱＴＬ解析は、上述の連鎖地図と各個体の脂肪含量をもとに、ＱＴＬ解析ソフトウェアとして、ＭａｐＱＴＬ（Ｖａｎ ＯｏｉｊｅｎとＭａｌｉｅｐａａｒｄ，Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩＶ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（１９９６））を用いて行った。
【００４５】
各マーカーの多型調査結果をもとに、ＬＯＤ＝３．０で連鎖解析を行い、連鎖地図を作成した結果、ＫＹ１１５ Ｆ２集団では、２３９マーカー（ＳＳＲマーカー４２個及びＡＦＬＰマーカー１９７個）をもとに、２〜４個のマーカーからなる小さな連鎖群を除き、１１個の大きな連鎖群が形成された。これらの連鎖群は、座乗しているＳＳＲマーカーからそれぞれ１０本のトウモロコシ染色体に対応することが示された。
【００４６】
同様に、ＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団では、２４０マーカーにより１０本の染色体に対応する１０個の大きな連鎖群と４つの小さな連鎖群が見られた。ＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団では、３４１マーカーにより３０連鎖群が形成され、そのうちの９連鎖群が第１から第９染色体に対応していた。ただし、第１０染色体に関しては、連鎖解析に用いたＳＳＲマーカーに、第１０染色体に座乗するものが無かった。そのため、対応する連鎖群は確認できなかった。
【００４７】
３解析集団の連鎖地図と各個体の脂肪含量に基づき、単純区間マッピング法によりＱＴＬ解析を行った。その結果、１４個のＱＴＬが検出された。このうち、複数の解析集団でほぼ同位置に検出された第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬに注目した。第１染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、それぞれ１６．９％と１６．８％の寄与率が示された。
【００４８】
同様に、第４染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｈ９５ ＢＣ１集団で検出され、１２．６％と２８．０％の寄与率を示し、第６染色体上のＱＴＬは、ＫＹ１１５ Ｆ２集団及びＫＹ１１５／Ｎａ４２ Ｆ２集団で検出され、２０．６％と２６．８％の寄与率を示した（表２）。
【００４９】
【表２】
【００５０】
トウモロコシでは、染色体上のおおよその位置をＢｉｎ番号で表記するが、これは、遺伝地図を約２０ｃＭ（センチモルガン）ずつ１００の領域に分割したもので、染色体番号と二桁の数字で表す（Ｇａｒｄｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３４：９１７−９３０）。第１、第４及び第６染色体上のＱＴＬは、それぞれ１．０３、４．０７〜４．０８、６．０１〜６．０５の領域に座乗していた。
【００５１】
上記の３つの脂肪含量関連ＱＴＬに、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、Ｂｉｎ番号をもとに、Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅより、各ＱＴＬの周辺に座乗すると思われるＳＳＲマーカーを選び出した。ＫＹ１１５ Ｆ２集団に対して新たに追加したＳＳＲマーカーの多型を調査し、上述のＡＦＬＰ及びＳＳＲマーカーの調査結果に加えて、同ＱＴＬ周辺の高密度連鎖地図を作成した。
【００５２】
その後、ＱＴＬ解析ソフトウェアとして、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＱＴＬ Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ（Ｗａｎｇ Ｓ．，Ｃ．Ｊ．Ｂａｓｔｅｎ，ａｎｄ Ｚ．−Ｂ．Ｚｅｎｇ（２００６）．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ．（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｇｅｎ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ｑｔｌｃａｒｔ／ＷＱＴＬＣａｒｔ．ｈｔｍ））を用いて、複合区間マッピング法によるＱＴＬ解析を行った。
【００５３】
解析の結果、調査した第１、第４及び第６染色体上にＬＯＤスコア２．５以上の領域がそれぞれ１箇所ずつ存在し、ＱＴＬの存在が示された。各染色体のＬＯＤスコアのピークより１０ｃＭ（センチモルガン）以内にあるＳＳＲマーカーは、第１染色体上のＱＴＬには７個、第４染色体上のＱＴＬには１２個、第６染色体上のＱＴＬには４個見られた。これらのマーカーを検出できるプライマーセットを構築し、利用することで、各ＱＴＬの遺伝子型判定が可能となった（表３、図２）。
【００５４】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上詳述したように、本発明は、トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセット及びその使用に係るものであり、本発明により、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、上記脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットを提供することができる。本発明により提供されるプライマーセットを用いて脂肪含量関連遺伝子座の遺伝子型を判定することにより、脂肪含量の向上したトウモロコシ自殖系統を効率的かつ確実に作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明で用いた解析集団における各個体の脂肪含量の分布を示す図である。グラフは、上からＫＹ１１５ Ｆ２集団、ＫＹ１１５とＮａ４２間のＦ２集団、ＫＹ１１５とＨ９５間のＢＣ１集団の結果を示す。中段及び下段の図では、両親（ＫＹ１１５及びＮａ４２もしくはＨ９５）の脂肪含量を図中に矢印で示す。
【図２】脂肪含量関連遺伝子座に連鎖することが示されたＤＮＡマーカーでの遺伝子型判定の一例を示す図である。図中では、ｕｍｃ２３１８、ｐｈｉ４５２６９３、ｕｍｃ２１３５の３マーカーについて同時に遺伝子型の調査を行っている。図中、“Ｍ”はサイズマーカーを示し、図左にサイズマーカーの塩基数を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができるプライマーセット。
【請求項２】
ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有する、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出することを特徴とする高脂肪含量系統の作出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の系統作出方法により作出されたトウモロコシの系統であって、トウモロコシ種子中の脂肪含量の高い、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量関連ＱＴＬを有することを特徴とする高脂肪含量系統。
【請求項１】
トウモロコシ種子中の脂肪含量関連遺伝子座に連鎖するＤＮＡマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ種子中の脂肪含量に関与する第１、第４及び第６染色体上に座乗する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連鎖するＤＮＡマーカーを検出することができるプライマーセット。
【請求項２】
ＤＮＡマーカーが、トウモロコシゲノムＤＮＡ中に存在し、脂肪含量関連ＱＴＬから１０センチモルガンの範囲内に位置するＤＮＡマーカーである、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列表の配列番号１〜２３の順方向プライマー及び２４〜４６の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列を有する、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載したプライマーセットを用いてトウモロコシ個体より抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片の長さの違いにより脂肪含量関連ＱＴＬの遺伝子型を識別する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により、高脂肪含量系統に由来する脂肪含量関連ＱＴＬを有する個体を選抜し、その後代においてトウモロコシ種子中の脂肪含量の高い高脂肪含量系統を作出することを特徴とする高脂肪含量系統の作出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の系統作出方法により作出されたトウモロコシの系統であって、トウモロコシ種子中の脂肪含量の高い、第１、第４及び第６染色体上に脂肪含量関連ＱＴＬを有することを特徴とする高脂肪含量系統。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２２０２６９（Ｐ２００８−２２０２６９Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６３３１１（Ｐ２００７−６３３１１）
【出願日】平成１９年３月１３日（２００７．３．１３）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１３日（２００７．３．１３）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
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