トキソカラ症を検出するための組換え抗原
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トキソカラ症を検出するための組換え抗原に関する。より詳細には、本発明は、ＴＥＳ遺伝子に由来するポリヌクレオチドを有するベクター、及びｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したトキソカラ幼虫に由来する組換えＴＥＳ抗原のポリペプチドを提供する。本発明は、組換えＴＥＳ抗原を使用してトキソカラ症を検出するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
トキソカラ症は、回虫、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）、又はネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）により引き起されるヒトの蠕虫感染症である。この感染症は、十分に発育したトキソカラ種の感染幼虫を含有する孵化卵を摂取する場合に生じる。ヒト腸中の幼虫は、腸壁を透過し血管を通って移動して、肝臓、筋肉、及び肺、さらに目及び脳にさえ達するだろう。したがって、トキソカラ症を診断及び検出するための方法は、その予防及び治療に重要である。
【０００３】
従来技術にはトキソカラ症の検出又は診断に関するいかなる特許技術もほとんど存在しない。従来技術で開示されている線虫寄生生物に関する血清学的及び免疫学的研究のほとんどは、米国特許第６１０３４８４号明細書に記述されているようなイヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）などのイヌ糸状虫症を診断することを目的としている。
【０００４】
幾つかの特許技術は、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、オステラジア（Ｏｓｔｅｒａｇｉａ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、及びトキソカラ属などの種を含む線虫寄生生物の種々の種に対する抗体を産生及び検出することを目標としている。米国特許第５９４８６４４号明細書では、１１ｋＤａ、１７ｋＤａ、３ＯｋＤａ、３７ｋＤａ、及び８１ｋＤａの分子量を有する排泄−分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドセグメントが開示されている。それとは別に、４０ｋＤａの分子量を有する寄生線虫種に由来する精製された抗原も、米国特許第５８７１７３８号明細書に開示されている。これら発明は、抗原及び関連分子に対する抗体、該抗体を含む抗体組成物、及び該抗原を含むワクチンなどを提供するのに役立つ。しかしながら、これら方法は複雑であり、使用されるタンパク質は特異的でない。
【０００５】
該特許技術のほとんどでは、線虫寄生生物の検出に、より高い分子量のタンパク質が使用される。加えて、開示されている方法では、トキソカラ症を特異的に検出又は診断することが可能ではない。しかしながら、たとえ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの限定培地中で維持されたイヌ回虫（Ｔ．ｃａｎｉｓ）第二期感染幼虫（Ｌ２）に由来する排泄‐分泌抗原が、ヒトトキソカラ症の免疫診断、回虫症、フィラリア症、及び糞線虫症の患者に由来する血清試料を使用するイムノアッセイに広範に使用されているとしても、天然ＴＥＳとの交差反応性を示す。
【０００６】
したがって、本発明により、トキソカラ症を特異的に検出することが可能な抗原を革新して、従来技術の欠点を克服することが望まれている。低分子量の抗原は、トキソカラ症を検出するための高分子タンパク質よりも特異的であることが示されているため、トキソカラ幼虫に由来する好適なタンパク質は、この疾患のためのより有用でより有効な血清診断マーカーの開発に適用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６１０３４８４号
【特許文献２】米国特許第５９４８６４４号
【特許文献３】米国特許第５８７１７３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主要目的は、トキソカラ症を特異的に及び効果的に検出又は診断することが可能な組換えタンパク質又は抗原を開発することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、トキソカラ症を検出するための、より高感度でより特異的な、より低い分子量を有する抗原を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、生体試料中のトキソカラ症を検出する際に、組換え抗原として使用することができるＴＥＳポリペプチドを発現するベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体の存在を検出及び診断するための、特異的で高感度の信頼性が高い方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前述の目的の少なくとも１つは、本発明により全体的に又は部分的に満たされており、本発明の実施形態の１つは、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターについて記述している。好ましくは、ベクターは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグ付ベクターである。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを含む細菌細胞である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の１つによると、ポリペプチドは、組換えタンパク質又は抗原である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、ｂ）該クローンを発現ベクターで発現して該ポリペプチドを得ること、およびｃ）該ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法である。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ−２６遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は完全コード配列（ｃｄｓ）に由来する。好ましくは、発現ベクターはＧＳＴタグ付ベクターである。
【００１９】
当業者であれば、本発明は、これら目的を実施して、言及された結果及び利点並びにそこに備わっているものを得るのに十分に適合していることを容易に認識するだろう。本明細書に記述されている実施形態は、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。
【００２０】
本発明についての理解を容易にするために、添付の図面には、好ましい実施形態が例示されており、それを検討することにより、本発明、その構築及び操作、並びにその利点の多くは、以下の説明と関連して考慮されると容易に理解及び評価されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するためのポリペプチドが挿入されたベクターのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＴＥＳ−２６のＯＲＦ又は完全ｃｄｓによりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドを示す図である。
【図３】ＴＥＳ−２６遺伝子を検出及び特定するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、及び本発明の好ましい実施形態の１つにより記述されているクローニングベクターを示す図である。
【図４】本発明の好ましい実施形態の１つにより記述されている、ＴＥＳ−２６遺伝子の増幅ＲＴ−ＰＣＴ産物の電気泳動ゲルを示す図であり、レーン２には７９３ｂｐのバンドサイズが示されている。レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカーであり、レーン４及びレーン５は、それぞれＲＴ−ＰＣＲ反応の陽性及び陰性対照である。
【図５】分子量が６９ｋＤａの精製ＴＥＳ−２６ ＧＳＴ融合タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）プロファイル（レーン３）を示す図である。レーン１はタンパク質サイズマーカーである。
【図６】種々の分類の血清を用いて探索された組換えＴＥＳ−２６抗原に関するウエスタンブロット分析を示す図である。レーン１はタンパク質サイズマーカーであり、レーン２〜４は、３人の異なるトキソカラ症患者を指し、レーン５は鞭虫症患者を指し、レーン６はトキソプラズマ症患者を指し、レーン７及び８は健常正常体を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、トキソカラ症を検出するための組換え抗原に関する。より詳細には、本発明は、ＴＥＳ遺伝子に由来するポリヌクレオチドを有するベクター、及びｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したトキソカラ幼虫に由来する組換えＴＥＳ抗原のポリペプチドを提供する。本発明は、組換えＴＥＳ抗原を使用してトキソカラ症を検出するための方法も提供する。
【００２３】
下記において、本発明は、本発明の好ましい実施形態に従って、添付の説明及び図面を参照することにより記述される。しかしながら、本発明の好ましい実施形態及び図面に説明を限定することは、単に本発明の考察を容易にするために過ぎないことが理解されるべきであり、当業者であれば、添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、種々の改変を考案することができることを起想する。
【００２４】
本発明は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを開示する。
【００２５】
本発明の１つの実施形態は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。図１は、ＴＥＳ−２６タンパク質を有する発現ベクターのアミノ酸配列を示しており、それを配列番号１と称する。ＴＥＳポリペプチドのアミノ酸配列は、図２に示されている。このポリペプチドの発現に使用される好ましいベクターは、ＧＳＴタグ付ベクターであり、ＧＳＴタグ付ベクターは、好ましくは市販のｐＥＴ４２「ｂ」型である。
【００２６】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓに由来していてもよく、ＴＥＳ遺伝子は、好ましくは、２６ｋＤａタンパク質をコードするＴＥＳ−２６遺伝子である。検出に使用することができる生体試料には、ヒト血清、血漿、又は全血（抗凝血剤を有するか又は有していない）が含まれる。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを内包する細菌細胞である。細菌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる発現宿主である。本発明の好ましい実施形態によると、細菌宿主は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０、又はＮｏｖａＢｌｕｅであってもよく、それらは市販されている。最も好ましい実施形態では、ＢＬ２１（ＤＥ３）が、細菌宿主として使用される。しかしながら、本発明は、ポリペプチドの発現に利用可能な好適な宿主の使用を制限することを意図していない。
【００２８】
本発明は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドも開示する。このポリペプチドは、グリコシル化されていない。ポリペプチドのグリコシル化は、糖部分を認識する他の生物に対する抗体との交差反応を増加させることに結び付く場合がある。したがって、本発明の非グリコシル化ポリペプチドは、そのような交差反応により影響を受けないであろう。非グリコシル化ポリペプチドは、分子量が低く、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体の存在を、感度良く、特異的に、及び高信頼性で検出及び特定するために使用するためにも好適である。
【００２９】
この組換えタンパク質は、ｒＴＥＳ−２６としても知られており、ヒトトキソカラ症を検出するために、単独抗原として、又はｒＴＥＳ−３０及び／若しくはｒＴＥＳ−１２０などの他の組換え抗原と組み合わせて使用することができる。その上、このｒＴＥＳ−２６は、マイクロプレートＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタンブロット、及び凝集アッセイなどのイムノアッセイに使用することができる。ｒＴＥＳ−２６は、通過画分検査（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔ）及びイムノクロマトグラフィー検査（側方流動検査）などの迅速検査を開発するために使用することもできる。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、ｂ）該クローンを発現ベクターで発現して該ポリペプチドを得ること、およびｃ）該ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法である。
【００３１】
先述の説明に示されているように、適用されるポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓに由来しており、ＴＥＳ遺伝子は好ましくはＴＥＳ−２６である。図２に例示されているのは、本方法で使用されるポリペプチドである。このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされている。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は、トキソカラ種を含有する生体試料中のＴＥＳ−２６遺伝子を検出及び特定するために設計された配列番号３及び配列番号４のヌクレオチド配列を含む１組のプライマーを開示する。図３に示されている配列番号３及び配列番号４の順方向及び逆方向プライマーは、ＧｅｎＢａｎｋから得られるＴＥＳ−２６遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓを参照することにより設計される。ＲＴ−ＰＣＲは、好ましくは、ＴＥＳ−２６遺伝子のヌクレオチド断片を得るために、生体試料に由来するＲＮＡを使用して実施される。
【００３３】
結果的に、ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子は、末端部がＡである新しく精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物であり、好ましくはクローニングベクターにクローニングされ、クローニングベクターは好ましくはＴＯＰＯベクターである。しかしながら、本発明は、ｐＪＥＴ１．２、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ、ｐＣＲＴＭ ＩＩ、ｐＧＥＭ［Ｒ］−Ｔ、又はｐＬＵＧ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ ＴＡクローニングベクターなどの任意の他の市販のＰＣＲクローニングベクターの使用を制限することを意図していない。商業的に取得することができる好適なＴＯＰＯベクターは、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターである。その後、クローニングされたプラスミドは、コンピテント細菌細胞に転換され、コンピテント細菌細胞は、好ましくは市販の大腸菌宿主である。その後、組換えプラスミドの方向性は、両ＴＥＳ遺伝子特異的プライマー（配列番号３及び配列番号４）を使用して、及びベクター特異的Ｍ１３Ｒプライマー（配列番号５）を、ＴＥＳ遺伝子特異的な逆方向プライマー（配列番号４）と共に使用して、ＰＣＲスクリーニングにより確認することができる。プライマー配列は、図３に示されている。操作された遺伝子の存在は、好ましくはＤＮＡ配列決定法により確認される。
【００３４】
塩基突然変異は、クローニングプロセス中に生じる場合がある。したがって、発現宿主への形質転換前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＲに基づく指定部位突然変異誘発を実施して、ＴＥＳ−２６−ＴＯＰＯベクター組換えプラスミドに生じた塩基エラーを修正することができる。市販の塩基突然変異修復キットを適用することができる。図４の電気泳動ゲルに示されているように、ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のＯＲＦの増幅ＲＴ−ＰＣＲ産物（レーン２）は、およそ７９３ｂｐのバンドサイズを示す。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態の１つに記述されているように、組換えプラスミド及び発現ベクターは、ＧＳＴタグ付ベクター、例えばｐＥＴ４２「ｂ」型ベクターにサブクローニングされる前に、制限酵素で消化することができる。しかしながら、本発明は、標的とされたポリペプチドを産生するために利用可能な他の好適な発現ベクターの使用を制限することを意図していない。ＤＮＡ配列決定で確認した後、構築されたプラスミドを形質転換プロセスにかけ、形質転換プロセスでは、細菌細胞又は宿主が適用される。先述の説明で示されているように、細菌細胞は、好ましくはＢＬ２１（ＤＥ３）である。しかしながら、利用可能な他の好適な宿主も、このポリペプチドを発現するために適用することができる。
【００３６】
組換え細菌は、対数期の中間部まで培養することができ、その後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現が誘導される。培養物は、３時間後に回収され、十分な量の組換えタンパク質が活性又は可溶性形態で存在する場合、天然条件下で精製することができる。組換え細菌細胞を溶解緩衝液中で溶解し、ＧＳＴ樹脂を使用して精製する親和性精製法を適用することができる。その後、このＧＳＴタグは、第Ｘａ因子酵素などの制限等級の部位特異的プロテアーゼにより切断又は除去される。
【００３７】
標的タンパク質を切断した後、第Ｘａ因子は、アフィニティークロマトグラフィーで除去される。切断又は除去は、電気泳動法により確認することができる。タンパク質及びポリペプチドのサイズを決定するために適用することができる最も好ましい方法の１つは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。しかしながら、本発明は、同様に他の好適な方法の使用を制限することを意図していない。図５に示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定された発現標的タンパク質のサイズは、およそ６９ｋＤａである。ＧＳＴタグは、タンパク質の免疫原性に影響及ぼす場合があるおよそ２６ｋＤａの大型分子であるため、したがって、イムノアッセイを開発する前にＧＳＴタグを除去することが必要であった。ＧＳＴタグを切断又は除去した後、ＴＥＳ−２６組換えタンパク質の分子量は、およそ３０〜３４ｋＤａを示す。
【００３８】
随意に、組換えタンパク質の免疫反応性の分析を実施することができる。使用される好ましい方法は、ウエスタンブロットである。図６は、トキソカラ症、鞭虫症、トキソプラズマ症に罹患している患者に由来する血清、及び健常正常体に由来する血清を含む種々の分類の血清を用いて探索された組換えＴＥＳ−２６抗原についてのウエスタンブロット分析を示す。図６に示されているように、切断型ＴＥＳ−２６組換えタンパク質の抗原性は、トキソカラ症患者に由来する血清試料中でのみ反応性である。健常個体及び他の蠕虫感染に由来する血清はどれも、いかなる反応性も示さない。
【００３９】
前記の説明に示されているように、その後、ＴＥＳ−２６の精製組換えタンパク質を使用してＥＬＩＳＡ検査を開発することができ、そのＥＬＩＳＡ検査は、好ましくは、イヌ回虫に感染した患者に由来する血清中の特異的抗体を検出するためのＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡ検査である。好ましい手順は、以下の例でさらに記述されている。続いて、これらアッセイの感度及び特異性は、一群のトキソカラ症血清、健常正常体、及び他の蠕虫関連感染を使用して、トキソカラ症の検出におけるその有用性について評価される。本発明のＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡ ｒＴＥＳ−２６抗原は、７８％〜８５％の感度レベル、及び９５％〜９９％の特異性レベルを達成可能である。
【００４０】
本開示は、添付の特許請求の範囲に含まれているもの並びに上記で説明されているものを含む。本発明は、その好ましい形態で、ある程度詳細に記述されているが、好ましい形態の本開示は、単なる例としてなされているに過ぎず、本発明の範囲から逸脱せずに、構築の詳細並びに部分の組合せ及び配置における多数の変更を用いることができることが理解される。
【００４１】
実施例
本発明は、以下の例を参照してさらに記述することができる。これらの例は、本発明の様々な態様及び実施形態を例示するために提供されており、開示された発明を限定することはいかなる点でも意図されておらず、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例１】
【００４２】
実施例１：ＴＥＳ−２６遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅
ＴＥＳ−２６遺伝子の配列（オープンリーディングフレーム又は完全ｃｄｓ）を、Ｇｅｎｂａｎｋから取得した（受入番号：Ｕ２９７６１）。プライマーは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉバージョン６．０（Ｉｎｆｏｒｍａｃ Ｉｎｃ．社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を用いて設計及び分析した。使用した順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示されている。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｅａｓｙ−Ａ（商標）高フィデリティーＰＣＲクローニング酵素キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を用いた市販のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用することにより実施した。実験反応は、３９．５μｌの無ＲＮａｓｅ水、５μｌの１Ｏ×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μｌの順方向及び逆方向プライマー（各々２０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの４０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１μｌのｍＲＮＡ試料、１μｌの希釈ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ（２．５Ｕ／μｌ）、及び０．５μｌのＥａｓｙ−Ａ ＨｉＦｉ ＰＣＲクローニング酵素を含んでいた。その後全成分を０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加し、５０μｌの総反応容積にした。増幅プロセスを以下のように実施した：４２℃で１５分間の第１鎖合成；９５℃で１分間のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ不活化；９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のテンプレート−プライマーのアニーリング、６８℃で２分間の伸長（４０サイクル）、及び６８℃で５分間の最終伸長。
【実施例２】
【００４３】
実施例２：ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のクローニング 末端部がＡである新しく精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（ＰＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）にクローニングし、その後ＴＯＰ１Ｏ大腸菌宿主（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）に形質転換した。その後、組換えプラスミドの方向性を、両遺伝子特異的プライマー（ＴＥＳ２６Ｆ及びＴＥＳ２６Ｒ）を使用して、及びベクター特異的プライマー（Ｍ１３Ｒ）を、遺伝子特異的プライマー（ＴＥＳ２６Ｒ）と共に使用して、ＰＣＲスクリーニングにより確認した。この後でＤＮＡ配列決定を行い、次いで、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉソフトウェア バージョン６．０（Ｉｎｆｏｒｍａｃ Ｉｎｃ．社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を使用して、操作された遺伝子の配列を公開配列と比較した。
【実施例３】
【００４４】
実施例３：塩基突然変異の修復 ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＲに基づく指定部位突然変異誘発を、市販キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を使用して実施して、ＴＥＳ−２６組換えプラスミド（ＴＥＳ−２６／ＴＯＰＯ）の４つの塩基エラー（１２４、５０２、６１３、及び７６８ｂｐ）を修正した。ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のＯＲＦの増幅ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動法により示されている。
【実施例４】
【００４５】
実施例４：細菌発現ベクターへのサブクローニング 組換えプラスミド及び発現ベクターを、ＥｃｏＲ１酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製、米国）で消化した。消化した後、ＴＥＳ−２６組換えプラスミドを、Ｔ４迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を使用して、ｐＥＴ４２「ｂ」型（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）にサブクローニングした。構築体をＤＮＡ配列決定により確認した後、組換えプラスミドを発現宿主、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）に形質転換した。
【実施例５】
【００４６】
実施例５：ＴＥＳ−２６の発現及び精製 組換え細菌を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するテリフィックブロス（ＴＢ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）中で培養し、ＯＤ６００が対数期の中間部（ＯＤ６００＝０．５）に達するまで３７℃でインキュベートした。その後、インキュベーター振とう器中３０℃で、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて発現を誘導した。その後、培養物を３時間後に回収した。続いて、組換え細菌細胞を、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを含有する溶解緩衝液中でフレンチプレスを使用することにより溶解し、ＧＳＴ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用して精製した。制限等級の部位特異的プロテアーゼである第Ｘａ因子酵素を、市販キット（第Ｘａ因子切断捕捉キット、Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用してＧＳＴタグを特異的に切断／除去するために使用した。標的タンパク質を切断した後、第Ｘａ因子を、Ｘａｒｒｅｓｔ（商標）アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより除去した。発現された標的タンパク質のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定した。
【実施例６】
【００４７】
実施例６：ウエスタンブロット 組換えタンパク質の免疫反応性を、血清試料中のＩｇＧ４抗体を検出することに基づくウエスタンブロット法により分析した。ｒＴＥＳ−２６（２０μｇ／ｍｌ）を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、セミドライ式トランスブロット（ＢｉｏＲａｄ社製、米国）を使用してニトロセルロース膜（Ｏｓｍｏｎｉｃ社製、米国）に移した。膜を切断して細片にし、１％カゼインブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製、ドイツ）で１時間ブロッキングした。続いて、細片を、血清試料（０．５％ブロッキング溶液で１：１００に希釈）と共に４℃で終夜インキュベートし、その後、１：２０００（０．５％ブロッキング溶液中）のモノクローナル抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）と共に３０分間インキュベートした。ＢＭ化学ルミネセンスブロッティング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製、ドイツ）及びＸ線フィルム（コダック社製、米国）を使用して、ブロットを現像した。
【実施例７】
【００４８】
実施例７：酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ｒＴＥＳ−２６抗原に基づくＥＬＩＳＡを開発し、アッセイの感度及び特異性を検証するために、トキソカラ感染、他の蠕虫関連感染、及び健常個体を含む一群の血清を使用して実験室評価を実施した。９６穴平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）の各ウエルを、０．０２Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍｌの至適濃度のｒＴＥＳ−２６を１００μｌ使用してコーティングした。その後、プレートにカバーをかけ、加湿チャンバー中４℃で終夜、及び３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％（容積／容積）のツイーン−２０、ｐＨ７．２を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄して、あらゆる未吸着抗原を除去した。５×５分間の洗浄ステップの後、各ウエルを、１．０％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を用いて、３７℃で１時間ブロッキングした。前述のようにプレートを再び洗浄し、その後、各血清希釈液（ＰＢＳで１：５０に希釈された１００μｌのヒト血清）を重複して各ウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。過剰な血清を洗い流した後、１：１０００に至適稀釈（ＰＢＳ中）されたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。最終洗浄ステップの後、２’，２−アジノ−ビス［３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸−ジアンモニウム塩］（ＡＢＴＳ）基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を添加し、吸光度４０５ｎｍ（基準４９０ｎｍ）での光学密度（Ｏ．Ｄ）を、ＥＬＩＳＡ分光光度計（Ｔｅｃａｎ社製、スウェーデン）を使用して３０分後に測定した。陽性を決定するためのカットオフ値（ＣＯＶ）として、０．２００のＯ．Ｄ測定値を使用して、陽性と陰性を識別した。このＣＯＶは、平均Ｏ．Ｄ．測定値に、健常個体由来の３０個の血清試料の３標準偏差（ＳＤ）を加えた値に基づいていた。Ｏ．Ｄ測定値をＰＢＳ（ブランクとして）でブランクし、０．２００と等しい及び／又はそれを超えるＯ．Ｄ測定値を、陽性症例として解釈した。ＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡの感度及び特異性の評価結果は、表１に示されている。
感度評価：
【００４９】
【表１】
【００５０】
特異性評価：
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トキソカラ症を検出するための組換え抗原に関する。より詳細には、本発明は、ＴＥＳ遺伝子に由来するポリヌクレオチドを有するベクター、及びｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したトキソカラ幼虫に由来する組換えＴＥＳ抗原のポリペプチドを提供する。本発明は、組換えＴＥＳ抗原を使用してトキソカラ症を検出するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
トキソカラ症は、回虫、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）、又はネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）により引き起されるヒトの蠕虫感染症である。この感染症は、十分に発育したトキソカラ種の感染幼虫を含有する孵化卵を摂取する場合に生じる。ヒト腸中の幼虫は、腸壁を透過し血管を通って移動して、肝臓、筋肉、及び肺、さらに目及び脳にさえ達するだろう。したがって、トキソカラ症を診断及び検出するための方法は、その予防及び治療に重要である。
【０００３】
従来技術にはトキソカラ症の検出又は診断に関するいかなる特許技術もほとんど存在しない。従来技術で開示されている線虫寄生生物に関する血清学的及び免疫学的研究のほとんどは、米国特許第６１０３４８４号明細書に記述されているようなイヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）などのイヌ糸状虫症を診断することを目的としている。
【０００４】
幾つかの特許技術は、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、オステラジア（Ｏｓｔｅｒａｇｉａ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、及びトキソカラ属などの種を含む線虫寄生生物の種々の種に対する抗体を産生及び検出することを目標としている。米国特許第５９４８６４４号明細書では、１１ｋＤａ、１７ｋＤａ、３ＯｋＤａ、３７ｋＤａ、及び８１ｋＤａの分子量を有する排泄−分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドセグメントが開示されている。それとは別に、４０ｋＤａの分子量を有する寄生線虫種に由来する精製された抗原も、米国特許第５８７１７３８号明細書に開示されている。これら発明は、抗原及び関連分子に対する抗体、該抗体を含む抗体組成物、及び該抗原を含むワクチンなどを提供するのに役立つ。しかしながら、これら方法は複雑であり、使用されるタンパク質は特異的でない。
【０００５】
該特許技術のほとんどでは、線虫寄生生物の検出に、より高い分子量のタンパク質が使用される。加えて、開示されている方法では、トキソカラ症を特異的に検出又は診断することが可能ではない。しかしながら、たとえ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの限定培地中で維持されたイヌ回虫（Ｔ．ｃａｎｉｓ）第二期感染幼虫（Ｌ２）に由来する排泄‐分泌抗原が、ヒトトキソカラ症の免疫診断、回虫症、フィラリア症、及び糞線虫症の患者に由来する血清試料を使用するイムノアッセイに広範に使用されているとしても、天然ＴＥＳとの交差反応性を示す。
【０００６】
したがって、本発明により、トキソカラ症を特異的に検出することが可能な抗原を革新して、従来技術の欠点を克服することが望まれている。低分子量の抗原は、トキソカラ症を検出するための高分子タンパク質よりも特異的であることが示されているため、トキソカラ幼虫に由来する好適なタンパク質は、この疾患のためのより有用でより有効な血清診断マーカーの開発に適用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６１０３４８４号
【特許文献２】米国特許第５９４８６４４号
【特許文献３】米国特許第５８７１７３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主要目的は、トキソカラ症を特異的に及び効果的に検出又は診断することが可能な組換えタンパク質又は抗原を開発することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、トキソカラ症を検出するための、より高感度でより特異的な、より低い分子量を有する抗原を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、生体試料中のトキソカラ症を検出する際に、組換え抗原として使用することができるＴＥＳポリペプチドを発現するベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体の存在を検出及び診断するための、特異的で高感度の信頼性が高い方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前述の目的の少なくとも１つは、本発明により全体的に又は部分的に満たされており、本発明の実施形態の１つは、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターについて記述している。好ましくは、ベクターは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグ付ベクターである。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを含む細菌細胞である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の１つによると、ポリペプチドは、組換えタンパク質又は抗原である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、ｂ）該クローンを発現ベクターで発現して該ポリペプチドを得ること、およびｃ）該ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法である。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ−２６遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は完全コード配列（ｃｄｓ）に由来する。好ましくは、発現ベクターはＧＳＴタグ付ベクターである。
【００１９】
当業者であれば、本発明は、これら目的を実施して、言及された結果及び利点並びにそこに備わっているものを得るのに十分に適合していることを容易に認識するだろう。本明細書に記述されている実施形態は、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。
【００２０】
本発明についての理解を容易にするために、添付の図面には、好ましい実施形態が例示されており、それを検討することにより、本発明、その構築及び操作、並びにその利点の多くは、以下の説明と関連して考慮されると容易に理解及び評価されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するためのポリペプチドが挿入されたベクターのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＴＥＳ−２６のＯＲＦ又は完全ｃｄｓによりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドを示す図である。
【図３】ＴＥＳ−２６遺伝子を検出及び特定するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、及び本発明の好ましい実施形態の１つにより記述されているクローニングベクターを示す図である。
【図４】本発明の好ましい実施形態の１つにより記述されている、ＴＥＳ−２６遺伝子の増幅ＲＴ−ＰＣＴ産物の電気泳動ゲルを示す図であり、レーン２には７９３ｂｐのバンドサイズが示されている。レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカーであり、レーン４及びレーン５は、それぞれＲＴ−ＰＣＲ反応の陽性及び陰性対照である。
【図５】分子量が６９ｋＤａの精製ＴＥＳ−２６ ＧＳＴ融合タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）プロファイル（レーン３）を示す図である。レーン１はタンパク質サイズマーカーである。
【図６】種々の分類の血清を用いて探索された組換えＴＥＳ−２６抗原に関するウエスタンブロット分析を示す図である。レーン１はタンパク質サイズマーカーであり、レーン２〜４は、３人の異なるトキソカラ症患者を指し、レーン５は鞭虫症患者を指し、レーン６はトキソプラズマ症患者を指し、レーン７及び８は健常正常体を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、トキソカラ症を検出するための組換え抗原に関する。より詳細には、本発明は、ＴＥＳ遺伝子に由来するポリヌクレオチドを有するベクター、及びｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したトキソカラ幼虫に由来する組換えＴＥＳ抗原のポリペプチドを提供する。本発明は、組換えＴＥＳ抗原を使用してトキソカラ症を検出するための方法も提供する。
【００２３】
下記において、本発明は、本発明の好ましい実施形態に従って、添付の説明及び図面を参照することにより記述される。しかしながら、本発明の好ましい実施形態及び図面に説明を限定することは、単に本発明の考察を容易にするために過ぎないことが理解されるべきであり、当業者であれば、添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、種々の改変を考案することができることを起想する。
【００２４】
本発明は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを開示する。
【００２５】
本発明の１つの実施形態は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。図１は、ＴＥＳ−２６タンパク質を有する発現ベクターのアミノ酸配列を示しており、それを配列番号１と称する。ＴＥＳポリペプチドのアミノ酸配列は、図２に示されている。このポリペプチドの発現に使用される好ましいベクターは、ＧＳＴタグ付ベクターであり、ＧＳＴタグ付ベクターは、好ましくは市販のｐＥＴ４２「ｂ」型である。
【００２６】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓに由来していてもよく、ＴＥＳ遺伝子は、好ましくは、２６ｋＤａタンパク質をコードするＴＥＳ−２６遺伝子である。検出に使用することができる生体試料には、ヒト血清、血漿、又は全血（抗凝血剤を有するか又は有していない）が含まれる。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを内包する細菌細胞である。細菌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる発現宿主である。本発明の好ましい実施形態によると、細菌宿主は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０、又はＮｏｖａＢｌｕｅであってもよく、それらは市販されている。最も好ましい実施形態では、ＢＬ２１（ＤＥ３）が、細菌宿主として使用される。しかしながら、本発明は、ポリペプチドの発現に利用可能な好適な宿主の使用を制限することを意図していない。
【００２８】
本発明は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドも開示する。このポリペプチドは、グリコシル化されていない。ポリペプチドのグリコシル化は、糖部分を認識する他の生物に対する抗体との交差反応を増加させることに結び付く場合がある。したがって、本発明の非グリコシル化ポリペプチドは、そのような交差反応により影響を受けないであろう。非グリコシル化ポリペプチドは、分子量が低く、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体の存在を、感度良く、特異的に、及び高信頼性で検出及び特定するために使用するためにも好適である。
【００２９】
この組換えタンパク質は、ｒＴＥＳ−２６としても知られており、ヒトトキソカラ症を検出するために、単独抗原として、又はｒＴＥＳ−３０及び／若しくはｒＴＥＳ−１２０などの他の組換え抗原と組み合わせて使用することができる。その上、このｒＴＥＳ−２６は、マイクロプレートＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウエスタンブロット、及び凝集アッセイなどのイムノアッセイに使用することができる。ｒＴＥＳ−２６は、通過画分検査（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔ）及びイムノクロマトグラフィー検査（側方流動検査）などの迅速検査を開発するために使用することもできる。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、ｂ）該クローンを発現ベクターで発現して該ポリペプチドを得ること、およびｃ）該ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法である。
【００３１】
先述の説明に示されているように、適用されるポリヌクレオチド配列は、ＴＥＳ遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓに由来しており、ＴＥＳ遺伝子は好ましくはＴＥＳ−２６である。図２に例示されているのは、本方法で使用されるポリペプチドである。このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされている。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は、トキソカラ種を含有する生体試料中のＴＥＳ−２６遺伝子を検出及び特定するために設計された配列番号３及び配列番号４のヌクレオチド配列を含む１組のプライマーを開示する。図３に示されている配列番号３及び配列番号４の順方向及び逆方向プライマーは、ＧｅｎＢａｎｋから得られるＴＥＳ−２６遺伝子のＯＲＦ又は完全ｃｄｓを参照することにより設計される。ＲＴ−ＰＣＲは、好ましくは、ＴＥＳ−２６遺伝子のヌクレオチド断片を得るために、生体試料に由来するＲＮＡを使用して実施される。
【００３３】
結果的に、ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子は、末端部がＡである新しく精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物であり、好ましくはクローニングベクターにクローニングされ、クローニングベクターは好ましくはＴＯＰＯベクターである。しかしながら、本発明は、ｐＪＥＴ１．２、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ、ｐＣＲＴＭ ＩＩ、ｐＧＥＭ［Ｒ］−Ｔ、又はｐＬＵＧ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ ＴＡクローニングベクターなどの任意の他の市販のＰＣＲクローニングベクターの使用を制限することを意図していない。商業的に取得することができる好適なＴＯＰＯベクターは、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターである。その後、クローニングされたプラスミドは、コンピテント細菌細胞に転換され、コンピテント細菌細胞は、好ましくは市販の大腸菌宿主である。その後、組換えプラスミドの方向性は、両ＴＥＳ遺伝子特異的プライマー（配列番号３及び配列番号４）を使用して、及びベクター特異的Ｍ１３Ｒプライマー（配列番号５）を、ＴＥＳ遺伝子特異的な逆方向プライマー（配列番号４）と共に使用して、ＰＣＲスクリーニングにより確認することができる。プライマー配列は、図３に示されている。操作された遺伝子の存在は、好ましくはＤＮＡ配列決定法により確認される。
【００３４】
塩基突然変異は、クローニングプロセス中に生じる場合がある。したがって、発現宿主への形質転換前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＲに基づく指定部位突然変異誘発を実施して、ＴＥＳ−２６−ＴＯＰＯベクター組換えプラスミドに生じた塩基エラーを修正することができる。市販の塩基突然変異修復キットを適用することができる。図４の電気泳動ゲルに示されているように、ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のＯＲＦの増幅ＲＴ−ＰＣＲ産物（レーン２）は、およそ７９３ｂｐのバンドサイズを示す。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態の１つに記述されているように、組換えプラスミド及び発現ベクターは、ＧＳＴタグ付ベクター、例えばｐＥＴ４２「ｂ」型ベクターにサブクローニングされる前に、制限酵素で消化することができる。しかしながら、本発明は、標的とされたポリペプチドを産生するために利用可能な他の好適な発現ベクターの使用を制限することを意図していない。ＤＮＡ配列決定で確認した後、構築されたプラスミドを形質転換プロセスにかけ、形質転換プロセスでは、細菌細胞又は宿主が適用される。先述の説明で示されているように、細菌細胞は、好ましくはＢＬ２１（ＤＥ３）である。しかしながら、利用可能な他の好適な宿主も、このポリペプチドを発現するために適用することができる。
【００３６】
組換え細菌は、対数期の中間部まで培養することができ、その後イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現が誘導される。培養物は、３時間後に回収され、十分な量の組換えタンパク質が活性又は可溶性形態で存在する場合、天然条件下で精製することができる。組換え細菌細胞を溶解緩衝液中で溶解し、ＧＳＴ樹脂を使用して精製する親和性精製法を適用することができる。その後、このＧＳＴタグは、第Ｘａ因子酵素などの制限等級の部位特異的プロテアーゼにより切断又は除去される。
【００３７】
標的タンパク質を切断した後、第Ｘａ因子は、アフィニティークロマトグラフィーで除去される。切断又は除去は、電気泳動法により確認することができる。タンパク質及びポリペプチドのサイズを決定するために適用することができる最も好ましい方法の１つは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。しかしながら、本発明は、同様に他の好適な方法の使用を制限することを意図していない。図５に示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定された発現標的タンパク質のサイズは、およそ６９ｋＤａである。ＧＳＴタグは、タンパク質の免疫原性に影響及ぼす場合があるおよそ２６ｋＤａの大型分子であるため、したがって、イムノアッセイを開発する前にＧＳＴタグを除去することが必要であった。ＧＳＴタグを切断又は除去した後、ＴＥＳ−２６組換えタンパク質の分子量は、およそ３０〜３４ｋＤａを示す。
【００３８】
随意に、組換えタンパク質の免疫反応性の分析を実施することができる。使用される好ましい方法は、ウエスタンブロットである。図６は、トキソカラ症、鞭虫症、トキソプラズマ症に罹患している患者に由来する血清、及び健常正常体に由来する血清を含む種々の分類の血清を用いて探索された組換えＴＥＳ−２６抗原についてのウエスタンブロット分析を示す。図６に示されているように、切断型ＴＥＳ−２６組換えタンパク質の抗原性は、トキソカラ症患者に由来する血清試料中でのみ反応性である。健常個体及び他の蠕虫感染に由来する血清はどれも、いかなる反応性も示さない。
【００３９】
前記の説明に示されているように、その後、ＴＥＳ−２６の精製組換えタンパク質を使用してＥＬＩＳＡ検査を開発することができ、そのＥＬＩＳＡ検査は、好ましくは、イヌ回虫に感染した患者に由来する血清中の特異的抗体を検出するためのＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡ検査である。好ましい手順は、以下の例でさらに記述されている。続いて、これらアッセイの感度及び特異性は、一群のトキソカラ症血清、健常正常体、及び他の蠕虫関連感染を使用して、トキソカラ症の検出におけるその有用性について評価される。本発明のＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡ ｒＴＥＳ−２６抗原は、７８％〜８５％の感度レベル、及び９５％〜９９％の特異性レベルを達成可能である。
【００４０】
本開示は、添付の特許請求の範囲に含まれているもの並びに上記で説明されているものを含む。本発明は、その好ましい形態で、ある程度詳細に記述されているが、好ましい形態の本開示は、単なる例としてなされているに過ぎず、本発明の範囲から逸脱せずに、構築の詳細並びに部分の組合せ及び配置における多数の変更を用いることができることが理解される。
【００４１】
実施例
本発明は、以下の例を参照してさらに記述することができる。これらの例は、本発明の様々な態様及び実施形態を例示するために提供されており、開示された発明を限定することはいかなる点でも意図されておらず、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例１】
【００４２】
実施例１：ＴＥＳ−２６遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅
ＴＥＳ−２６遺伝子の配列（オープンリーディングフレーム又は完全ｃｄｓ）を、Ｇｅｎｂａｎｋから取得した（受入番号：Ｕ２９７６１）。プライマーは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉバージョン６．０（Ｉｎｆｏｒｍａｃ Ｉｎｃ．社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を用いて設計及び分析した。使用した順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示されている。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｅａｓｙ−Ａ（商標）高フィデリティーＰＣＲクローニング酵素キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を用いた市販のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用することにより実施した。実験反応は、３９．５μｌの無ＲＮａｓｅ水、５μｌの１Ｏ×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μｌの順方向及び逆方向プライマー（各々２０ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの４０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１μｌのｍＲＮＡ試料、１μｌの希釈ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ（２．５Ｕ／μｌ）、及び０．５μｌのＥａｓｙ−Ａ ＨｉＦｉ ＰＣＲクローニング酵素を含んでいた。その後全成分を０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加し、５０μｌの総反応容積にした。増幅プロセスを以下のように実施した：４２℃で１５分間の第１鎖合成；９５℃で１分間のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ不活化；９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のテンプレート−プライマーのアニーリング、６８℃で２分間の伸長（４０サイクル）、及び６８℃で５分間の最終伸長。
【実施例２】
【００４３】
実施例２：ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のクローニング 末端部がＡである新しく精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（ＰＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ＴＡ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）にクローニングし、その後ＴＯＰ１Ｏ大腸菌宿主（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）に形質転換した。その後、組換えプラスミドの方向性を、両遺伝子特異的プライマー（ＴＥＳ２６Ｆ及びＴＥＳ２６Ｒ）を使用して、及びベクター特異的プライマー（Ｍ１３Ｒ）を、遺伝子特異的プライマー（ＴＥＳ２６Ｒ）と共に使用して、ＰＣＲスクリーニングにより確認した。この後でＤＮＡ配列決定を行い、次いで、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉソフトウェア バージョン６．０（Ｉｎｆｏｒｍａｃ Ｉｎｃ．社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）を使用して、操作された遺伝子の配列を公開配列と比較した。
【実施例３】
【００４４】
実施例３：塩基突然変異の修復 ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＣＲに基づく指定部位突然変異誘発を、市販キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を使用して実施して、ＴＥＳ−２６組換えプラスミド（ＴＥＳ−２６／ＴＯＰＯ）の４つの塩基エラー（１２４、５０２、６１３、及び７６８ｂｐ）を修正した。ＴＥＳ−２６をコードする遺伝子のＯＲＦの増幅ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動法により示されている。
【実施例４】
【００４５】
実施例４：細菌発現ベクターへのサブクローニング 組換えプラスミド及び発現ベクターを、ＥｃｏＲ１酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製、米国）で消化した。消化した後、ＴＥＳ−２６組換えプラスミドを、Ｔ４迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を使用して、ｐＥＴ４２「ｂ」型（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）にサブクローニングした。構築体をＤＮＡ配列決定により確認した後、組換えプラスミドを発現宿主、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）に形質転換した。
【実施例５】
【００４６】
実施例５：ＴＥＳ−２６の発現及び精製 組換え細菌を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するテリフィックブロス（ＴＢ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）中で培養し、ＯＤ６００が対数期の中間部（ＯＤ６００＝０．５）に達するまで３７℃でインキュベートした。その後、インキュベーター振とう器中３０℃で、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて発現を誘導した。その後、培養物を３時間後に回収した。続いて、組換え細菌細胞を、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを含有する溶解緩衝液中でフレンチプレスを使用することにより溶解し、ＧＳＴ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用して精製した。制限等級の部位特異的プロテアーゼである第Ｘａ因子酵素を、市販キット（第Ｘａ因子切断捕捉キット、Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用してＧＳＴタグを特異的に切断／除去するために使用した。標的タンパク質を切断した後、第Ｘａ因子を、Ｘａｒｒｅｓｔ（商標）アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、ドイツ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより除去した。発現された標的タンパク質のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定した。
【実施例６】
【００４７】
実施例６：ウエスタンブロット 組換えタンパク質の免疫反応性を、血清試料中のＩｇＧ４抗体を検出することに基づくウエスタンブロット法により分析した。ｒＴＥＳ−２６（２０μｇ／ｍｌ）を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、セミドライ式トランスブロット（ＢｉｏＲａｄ社製、米国）を使用してニトロセルロース膜（Ｏｓｍｏｎｉｃ社製、米国）に移した。膜を切断して細片にし、１％カゼインブロッキング溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製、ドイツ）で１時間ブロッキングした。続いて、細片を、血清試料（０．５％ブロッキング溶液で１：１００に希釈）と共に４℃で終夜インキュベートし、その後、１：２０００（０．５％ブロッキング溶液中）のモノクローナル抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）と共に３０分間インキュベートした。ＢＭ化学ルミネセンスブロッティング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製、ドイツ）及びＸ線フィルム（コダック社製、米国）を使用して、ブロットを現像した。
【実施例７】
【００４８】
実施例７：酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ｒＴＥＳ−２６抗原に基づくＥＬＩＳＡを開発し、アッセイの感度及び特異性を検証するために、トキソカラ感染、他の蠕虫関連感染、及び健常個体を含む一群の血清を使用して実験室評価を実施した。９６穴平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐ、デンマーク）の各ウエルを、０．０２Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍｌの至適濃度のｒＴＥＳ−２６を１００μｌ使用してコーティングした。その後、プレートにカバーをかけ、加湿チャンバー中４℃で終夜、及び３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％（容積／容積）のツイーン−２０、ｐＨ７．２を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄して、あらゆる未吸着抗原を除去した。５×５分間の洗浄ステップの後、各ウエルを、１．０％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を用いて、３７℃で１時間ブロッキングした。前述のようにプレートを再び洗浄し、その後、各血清希釈液（ＰＢＳで１：５０に希釈された１００μｌのヒト血清）を重複して各ウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。過剰な血清を洗い流した後、１：１０００に至適稀釈（ＰＢＳ中）されたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社製、米国）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。最終洗浄ステップの後、２’，２−アジノ−ビス［３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸−ジアンモニウム塩］（ＡＢＴＳ）基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ドイツ）を添加し、吸光度４０５ｎｍ（基準４９０ｎｍ）での光学密度（Ｏ．Ｄ）を、ＥＬＩＳＡ分光光度計（Ｔｅｃａｎ社製、スウェーデン）を使用して３０分後に測定した。陽性を決定するためのカットオフ値（ＣＯＶ）として、０．２００のＯ．Ｄ測定値を使用して、陽性と陰性を識別した。このＣＯＶは、平均Ｏ．Ｄ．測定値に、健常個体由来の３０個の血清試料の３標準偏差（ＳＤ）を加えた値に基づいていた。Ｏ．Ｄ測定値をＰＢＳ（ブランクとして）でブランクし、０．２００と等しい及び／又はそれを超えるＯ．Ｄ測定値を、陽性症例として解釈した。ＩｇＧ４−ＥＬＩＳＡの感度及び特異性の評価結果は、表１に示されている。
感度評価：
【００４９】
【表１】
【００５０】
特異性評価：
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを含む細菌細胞。
【請求項４】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項５】
組換えタンパク質である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項７】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、
ｂ）前記クローンを発現ベクターで発現して前記ポリペプチドを得ること、及び
ｃ）前記ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が、ＴＥＳ−２６遺伝子のオープンリーディングフレーム又は完全コード配列に由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが組換えタンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベクターを含む細菌細胞。
【請求項４】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項５】
組換えタンパク質である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクター及びＴＥＳ−２６遺伝子によりコードされた、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項７】
生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的配列をクローニングすること、
ｂ）前記クローンを発現ベクターで発現して前記ポリペプチドを得ること、及び
ｃ）前記ポリペプチドを使用してイムノアッセイを開発し、生体試料中にあるトキソカラ種に対する抗体を検出することを含む方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が、ＴＥＳ−２６遺伝子のオープンリーディングフレーム又は完全コード配列に由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが組換えタンパク質である、請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１１３２５（Ｐ２０１２−５１１３２５Ａ）
【公表日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０６１９（Ｐ２０１１−５４０６１９）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／００００４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８０８４
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５０１０８４２５９）ユニヴァーシティ サインズ マレーシア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＡＩＮＳ ＭＡＬＡＹＳＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１８００，ＰＵＬＡＵ ＰＩＮＡＮＧ，ＭＡＬＡＹＳＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／００００４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８０８４
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５０１０８４２５９）ユニヴァーシティ サインズ マレーシア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＡＩＮＳ ＭＡＬＡＹＳＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１８００，ＰＵＬＡＵ ＰＩＮＡＮＧ，ＭＡＬＡＹＳＩＡ
【Ｆターム（参考）】
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