トランスクリプションチップ
転写因子が結合し得るエレメント配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが基板上に固定化されてなるトランスクリプションチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、トランスクリプションチップおよび該チップを用いた転写因子の活性測定方法に関する。
【背景技術】
ＤＮＡチップは遺伝子多型やｍＲＮＡ発現量の変動量をプロファイルするツールであり、現在広い研究分野で利用されている。ゲノム情報の伝達体であるｍＲＮＡから翻訳されて得られる最終的な産物である蛋白質が、時々刻々変動する生命現象を担っている。そのため、ｍＲＮＡのプロファイリングから得られる情報よりも有用な情報が得られるものと考えられており、蛋白質を網羅的に解析するプロテオーム解析技術の開発が現在活発に行われている。
そのような現状の中で、蛋白質を基板上に捕捉し、その性状を効率的に解析するシステムが完成すれば、大規模解析やコスト面において、従来までの２次元電気泳動あるいは液体クロマトグラフィーを用いたプロテオーム解析法を凌駕する新技術となると推定される。これまで、プロテオーム解析をターゲットとしたチップとしては抗体チップが開発されている。抗体チップとは、チップ表面に抗体を多数固定化し、固定化した抗体それぞれと相互作用する抗原量をプロファイル化するツールである。ＤＮＡチップよりは後発であるが、直接蛋白質量の変動を解析することが可能なことから、将来的には創薬、毒性試験あるいは病態の診断等広い分野での応用が期待されている。
転写因子は、各遺伝子の上流領域のエレメント配列と呼ばれる領域に結合し、種々の遺伝子発現調節を担う蛋白質であることから、細胞の炎症応答、癌化と転写制御因子の活性化と深く関与しており、生物活性を保持した種々の転写因子の蛋白質レベルでのプロファイルを行うことは非常に重要である。
従来より、転写因子はゲルシフトアッセイと呼ばれるラジオアイソトープを用いたアクリルアミドゲル電気泳動を用いた手法により解析されているが、スループット、安全性に問題があり今後のプロテオミクス的手法には対応が難しいと考えられる。
本発明は、効率的に転写因子をプロファイリングする技術を提供することを目的とする
【図面の簡単な説明】
図１は、抗体チップとトランスクリプションチップを比較して示す。
図２は、固定化した遺伝子を示す。
図３は、ＦＩＴＣ標識したＮＦκＢ応答配列固定化チップ（ＰＲＤＩＩ−１）を示す
図４は、ＮＦκＢ応答配列の競合実験結果を示す。
図５は、固定化二本鎖ＤＮＡの検討結果を示す。
図６は、ブロッキング剤の検討結果を示す。
図７は、同時再現性試験と測定間再現性試験（ＤＬＣ）の結果を示す。
図８は、ＤＬＣチップのジーンダイヤＴＭの比較を示す。
図９は、有意水準５％における感度試験の結果を示す。
図１０は、Ａ：ＨｅＬａ細胞抽出液からのＮＦκＢの検出結果を示す。Ｂ：ジーンダイヤＴＭを用いたＨｅＬａ細胞炎症関連転写因子の発現プロファイリングを示す。
図１１は、二本鎖ＤＮＡのマイクロアレイ化の結果を示す。
図１２は、蛍光スキャナーによるＮＦκＢの特異的検出結果を示す。
図１３は、ＮＦκＢのｏｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎによるペプチドマップを示す。
図１４は、溶液中トリプシン分解により得られたＮＦκＢペプチドマップを示す。
図１５は、ＰＭＦによるデータベース倹索結果を示す。
図１６は、ｏｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｉｏｎの結果を示す。
図１７は、溶液中トリプシン分解により得られたＶＤＲペプチドマスフィンガープリントを示す。
図１８は、本発明のトランスクリプションチップからのＶＤＲの直接検出の結果を示す。
図１９は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ用のＤＬＣプレートの１例を示す。
図２０は、ダイヤモンド薄膜を有する基板の修飾方法を示す。
図２１は、ＮＦκＢのペプチドマスフィンガープリント（Ａ）ならびに、１７０１．１０ｍ／ｚ（Ｂ），１８０８．０１ｍ／ｚ（Ｃ），２４１３．３５ｍ／ｚ（Ｄ）の２次スペクトルを示す。
図２２は、ＭＡＳＣＯＴデータベースサーチにより得られたＮＦκＢ同定結果である。
【発明の開示】
本発明者は、基板上に転写因子の１以上のエレメント配列を含む１本鎖あるいは２本鎖ＤＮＡを固定化したトランスクリプションチップを作製し、該チップにより転写因子或いは該因子と相互作用する物質の発現量をＤＮＡ結合能という生物機能に基づいてプロファイルできることを見出した。本発明は、以下のトランスクリプションチップおよびそれを用いた転写因子のアッセイ方法を提供するものである。
１．転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが基板上に固定化されてなるトランスクリプションチップ。
２．各々に転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも２つのポリヌクレオチドが結合してなる項１に記載のチップ。
３．前記ポリヌクレオチドが各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を有する項１に記載のチップ。
４．前記基板が支持体上にダイヤモンド薄膜を形成したものである項１に記載のチップ。
５．前記ポリヌクレオチドがダイヤモンド薄膜と任意に適当なスペーサーを介して結合したものである項１に記載のチップ。
６．項１〜５のいずれかに記載のトランスクリプションチップに転写因子を含み得る試料を作用させる工程を含む、転写因子の結合をアッセイする方法。
７．前記試料が被験物質の存在下で培養された細胞の細胞溶解物である、被験物質の転写因子に対する影響を評価するための項６に記載の方法。
８．転写因子の結合を転写因子に対する抗体または質量分析を利用した方法を用いて検出する項６または７に記載の方法。
９．抗体を用いた検出がＥＬＩＳＡ法であり、質量分析を利用した方法がペプチドマスフィンガープリント法である項８に記載の方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のトランスクリプションチップは、抗体チップ、ＤＮＡチップのいずれとも異なっている（図１）。
転写因子は、各遺伝子の上流領域のエレメント配列と呼ばれる領域に結合し、種々の遺伝子発現調節を担う蛋白質であることから、細胞の炎症応答、癌化は転写制御因子の活性化と深く関与しており、生物活性を保持した種々の転写因子の蛋白質レベルでのプロファイルを行うことは非常に重要である。
転写因子は、ＤＮＡに結合して転写開始等の転写調節に関与する因子であり、例えば、ＮＦκＢ（例えばｐ５０、ｐ６５）、ＮＦＡＴｃ１、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｒｅｌ、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＰ１、ＡＰ−２、ＲＢＰ−Ｊ、Ｎｒｆ２、ＫＬＦ５、ＢＴＥＢ２、ＮＦ−ＡＴ、ＭＩＴＦ、ＲＵＮＸファミリー、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＨＩＦ１α、ＨＬＦ、Ｂｒｎ−３、ＥＢＰ、ＣＤＰ、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ、ＥＧＲ、Ｅｔｓ、Ｅｔｓ１／ＰＥＡ３、ＦＡＳＴ−１、ＢＲＣＡ１、ＨＮＦ−４、ＧＡＴＡ、ＮＦ−１、Ｍａｘ、ＩＲＦ−１、ＮＦＡＴｃ、ＮＦ−Ｅ１、ＮＦ−Ｅ２、１−Ｏｃｔ、ＭＥＦ−１、ＭＥＦ−２、Ｍｙｃ−Ｍａｘ、ｐ５３、Ｐａｘ−５、Ｐｂｘ１、ＴＲ、ＡｈＲ、ＥＲ、ＧＲ、ＭＲ、ＡＲ、ＶＤＲ、ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲ、ＰＰＡＲ、ＥＲＲ、ＲＯＲ、ＳＸＲ、ＰＸＲ、ＵＳＦ−１、Ｓｐ１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＣＯＵＰ−ＴＦ、Ｆｔｚ−Ｆ１、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＢＰ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨ、ＴＡＦ、ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩＩ、ＰｏｌＩＩＩ、ＥＬＬ、ＴＦＩＩＳ、Ｅｌｏｎｇｉｎ、Ｐ−ＴＥＦｂ、ＤＳＩＦ、ＣＢＰ／ｐ３００、ｐ１６０（ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＡＩＢ１）ＴＲＲＡＰ／ＧＣＮ５、ＮｃｏＲ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ、ＤＲＩＰ／ＴＲＡＰ、Ｓｍａｄ、などが例示される。
転写因子は哺乳類の転写因子が好ましく、特にヒトの転写因子が好ましい。
エレメント配列は公知であり、種々のエレメント配列を１または２以上含むポリヌクレオチドを適宜チップ上に形成することができる。具体的なエレメント配列としては、下記の実施例１のプライマーにおいて下線を引いてある配列（ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣおよびＧＧＧＡＡＡＴＴＣＣ；ＧＧＧＧＡＴＣＣＣおよびＧＧＧＡＴＣＣＣＣ；ＴＧＡＣＴＣＡＴおよびＡＴＧＡＧＴＣＡ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＡＡＣＡおよびＴＧＴＴＣＴ；ＴＧＡＣＧＴＣＡ）が例示される。他のエレメント配列としては、例えばＳａｇｒｏｖｅｓ，Ｔらの報告（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １：２１１−２１２（２００２））、Ｉｓｈｉｉ，Ｓらの報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１４１０−１４１３（１９８６））に記載されている。
該エレメント配列は、哺乳類の転写因子が結合し得るエレメント配列が好ましく、特にヒト転写因子が結合し得るエレメント配列が好ましい。
本発明のチップがその動態の把握を必要とする複数の転写因子に対応したオリゴヌクレオチドをチップ上に固定化していれば、１枚のチップで全ての転写因子のプロファイリングを行うことができるので好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみの転写因子に対応するオリゴヌクレオチドを固定化し、必要な数のチップを用いて転写因子のプロファイリングを行ってもよい。
１つのポリヌクレオチドには、エレメント配列は少なくとも１種含まれ得、同一のエレメント配列を１または複数個含んでいても良く、２種以上のエレメント配列を１つのポリヌクレオチド中に含んでいてもよい。
基板上に結合されるエレメント配列を含むポリヌクレオチドは、公知のエレメント配列の前後に適当なオリゴまたはポリヌクレオチドを結合させて人工的に作製してもよいが、各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を好ましく使用できる。ポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば１０〜５００個程度、好ましくは１５〜３００個程度、より好ましくは２０〜１００個程度である。
長すぎる塩基対は調製が困難であったり、自己相補的塩基対を生じたり、目的の部位と異なる部位でハイブリダイゼーションしたりして、目的のオリゴヌクレオチドが得られない可能性がある。
エレメント配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号１〜２２のポリヌクレオチドが例示される。
基板としては、ＤＮＡを結合させ得るものであればよく、特に限定されないが、例えばカルボキシメチルデキストランやカルボキシル基で末端修飾されＰＥＧのような水溶性高分子を基板表面に結合させてカルボキシル基を導入したものや、金属（特に金）の表面薄膜を有する基板などが使用できるが、好ましくは多数のカルボキシル残基が表面上に形成されたダイヤモンド薄膜を有するチップ、例えばジーンダイヤ（登録商標）、ＤＬＣチップが例示される。多数の２本鎖ＤＮＡを高密度に結合可能であることからダイヤモンド薄膜を有する基板が好ましく、特にジーンダイヤＴＭが好ましい。ダイヤモンド薄膜は、任意の支持体、例えばシリコン基板上に形成することができる。
ダイヤモンド薄膜上に、アミノ基、カルボキシル基などの置換基を導入する方法の概略を図２０に示す。
ＤＮＡと基板の結合は、カップリング試薬により行うことができる。カップリング試薬としては、通常のペプチド結合を形成するのに使用されている試薬が挙げられ、例えばカルボジイミド類（ＤＣＣ，ＷＳＣ），カルボニルジイミダゾールなどが例示される。或いは、基板のＣＯＯＨ末端基を上記カルボジイミド類、特に水溶性カルボジイミドを使用し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性エステルとし、５’または３’末端側にアミノ基などの結合性基を有するＤＮＡを結合することができる。ＤＮＡとの結合は、さらに適当なスペーサーを介して行い、基板とＤＮＡとの距離を適度に離してもよく、ＤＮＡの結合部位と転写因子の結合部位の間に適当な配例（例えばプロモーター由来の配列）を介在させ、転写因子の結合配例をトランスクリプションチップの基板から離してもよい。適当なプロモーターを使用することで、表面から一定のスペースを保った状態で転写因子の結合配列を固定化することが可能となり、転写因子のアッセイを、転写因子のモビリティを確保しつつ、行うことができる。
本願実施例では、５’末端にＮＨ２（ＣＨ２）１２を有するポリヌクレオチドを使用した。このような５’または３’末端にアミノ基のような結合性基を有する置換基（例えばＮＨ２（ＣＨ２）１２）を備えた修飾オリゴヌクレオチドは、公知の方法に従い製造でき、例えば以下の公開されている方法および特公平３−７４２３９号公報に従い製造することができる。
本発明のチップは、基板上に２本鎖ＤＮＡを結合させ、該２本鎖ＤＮＡのエレメント配列に転写因子を結合させて、該結合転写因子を質量分析または抗体を使用するなどの適当な検出方法に従い検出するために使用する。
２本鎖ＤＮＡの結合は、５’または３’末端側にアミノ基などの反応性基（これを介して基板にポリヌクレオチドを結合させる）を有する１本鎖ＤＮＡを基板に結合させた後にこれと相補性のポリヌクレオチドをハイブリダイスさせて行っても良く、或いは、少なくとも一方の鎖結合性基（例えばＮＨ２）を有する２本鎖ＤＮＡを直接基板に結合させてもよい。
このようにして作製されたトランスクリプションチップは、次に転写因子を含み得る試料と接触されて、転写因子をチップ上に結合させる。このような試料としては、哺乳類細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が好ましく、特にヒト細胞の細胞溶解物が好ましい。例えば各種のヒト細胞を種々の培養条件或いは種々の被験物質の存在下で培養し、その細胞溶解物の転写因子を本発明のチップを用いてプロファイリングすることにより、転写因子に及ぼす各種の因子の影響を定量的に評価することができる。
転写因子の定量は、該転写因子に対する抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を用いて免疫学的に測定するか、或いは、マススペクトルを使用して測定できる。例えば、マススペクトルとしては、転写因子を直接マススペクトルで測定してもよいが、チップに結合した転写因子をトリプシンのような適当なプロテアーゼで消化し、得られたペプチド断片をマススペクトルにより分析し、当該転写因子のプロテアーゼ消化物のマススペクトルパターン（マスフィンガープリント）と比較して、結合した転写因子の同定、定量分析を行うことが好ましい。マススペクトルとしては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなどが好ましく例示される。
ＥＬＩＳＡ法は、トリス系、スキムミルク系、ゼラチン系、エタノールアミン系などの種々のブロッキング剤で処理し、特異性を向上させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＩＴＣなどのフルオレセイン、ローダミン、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５などの蛍光色素、アクリジウムエステル、ルミノール、発光性アダマンタン化合物などの発光物質などで標識するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【実施例１】
（１）実験材料と方法
（ｉ）実験装置
蛍光スキャナー：ＣＲＢＩＯ ＩＩ（日立ソフトウェア（株））、マイクロアレイヤー：ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェア（株））、マイクロプレートリーダー：μＱｕａｎｔ（ＢＩＯ−ＴＥＫ）、プレートシェイカー：Ｍｉｃｒｏ ｍｉｘｅｒ ＭＸ−４（三共純薬）、ＣＯ２インキュベータ：ＨＥＲＡｃｅｌｌ（Ｋｅｎｄｒｏ）、質量分析装置：ＡＢＩ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ）
（ｉｉ）実験材料
チップ、プレート：ＤＬＣチップＣ４（３ｍｍ・３ｍｍ）（東洋綱鈑（株））、ジーンダイヤＴＭＣ４（３ｍｍ・３ｍｍ）（東洋鋼鈑（株））、９６穴Ｕ底マイクロプレート（グライナー）、ＮＦκＢ（ｐ５０）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
抗体：Ａｎｔｉ−ＮＦκＢ ｐ５０抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）、Ａｎｔｉ−ＮＦκＢ ｐ５０抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＃１００−４１６４）、ＰＯＤ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）、ＡＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ナカライテスク）、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（ナカライテスク）、ＢＤ Ｍｅｒｃｕｒｙ ＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ ｋｉｔ Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
試薬：ＷＳＣ（Ｄｏｊｉｎ）、ＮＨＳ（Ｗａｋｏ）、ＰＯＤ発色基質ＴＭＢＺ（住友ベークライト（株）＃ＭＬ−１１２０Ｔ）、活性化バッファー１（１０ｍＭ ＷＳＣ，０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ４．５））、活性化バッファー２（１００ｍＭ ＷＳＣ，２０ｍＭ ＮＨＳ，０．１Ｍ ＮａＰＢ（ｐＨ６．０））（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆａｒ）、ブロッキングバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、結合バッファー（１％ＢＳＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１００倍希釈ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ））、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ７．５），０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ＴＮＦα（Ｗａｋｏ ＃２０３−１５２６３）、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＳＩＧＭＡ ＃Ｐ１５８５）、シナピン酸溶液（１ｍｇ／ｍｌシナピン酸，５０％アセトニトリル，０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ））、α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｏｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（αＣＨＣＡ）溶夜（１ｍｇ／ｍｌ αＣＨＣＡ，５０％アセトニトリル，０．１％ＴＦＡ）、低塩濃度バッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＮａＣｌ）、トリプシン反応液（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム，０．１−４μｇ／ｍｌトリプシン）、ＧＦＸ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャム＃２７−９６０２−０１）、ＮＥ−ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＩＥＣＥ ＃７８８３３）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ
オリゴヌクレオチド：以下のプライマーならびにオリゴヌクレオチドを合成した。下線部は転写因子の認識配列（エレメント配列）を示す。オリゴヌクレオチドは、２本鎖の最終濃度５０μＭとなるように相補鎖とともに混合し、９５℃で５分間熱処理後徐々に冷却した。
（ｉｉｉ）実験方法
ｉ．エレメント配列固定化チップの作製（ＥＬＩＳＡ用）
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップをコート面を上にしてチップ（ＤＬＣあるいはジーンダイヤＴＭ）をセットした。次に種々の濃度の２本鎖ＤＮＡエレメント配列を含む活性化バッファー１を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに１時間室温でプレートシェイカーで振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、ブロッキングバッファーを２００μｌ添加し、室温で１時間振とうしたのち、４℃で保存した。
ｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡ）
洗浄バッファーで２回後、結合バッファーで希釈した種々の濃度のＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで２０００倍希釈した抗ＮＦκＢ抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで２０００倍希釈したＰＯＤ抗ウサギＩｇＧ２次抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで５回洗浄後、ＰＯＤ発色基質ＴＭＢＺの吸光に基づく４５０ｎｍの波長をマイクロプレート洗浄したリーダーで測定した。
ｉｉｉ．ＨｅＬａ細胞抽出液の調製
２５０ｃｍ２シャーレを用いて２５ｍｌの１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地でＨｅＬａ細胞を７０％コンフルエントまでＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。無血清培地に交換後、ＴＮＦαを１００ｎｇ／ｍｌになるように添加し、３０分間ＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。セルスクレイパーにて細胞を剥離させた後、遠心分離で（×１０００ｇ，５分）培地を除いた。ＰＢＳを添加して混和した後再び遠心分離（×１０００ｇ，５分）を行ない上清を廃棄した。細胞を含む沈殿に細胞溶解バッファーを添加し細胞を溶解し、遠心（×１０００ｇ，５分）後、上清を回収し、蛋白質濃度を測定した。１枚のチップあたり６０μｇの細胞抽出液由来蛋白質を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行った。一方、転写因子のプロファイリングには、ＴＮＦα刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＰＭＡ刺激（１μＭ）したＨｅＬａ細胞ならびにコントロール細胞由来の核抽出液を用いた。核抽出液にはピアス社のキットを用いた。１枚のチップあたり２０μｇ核抽出液由来蛋白質を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行った。
ｉｖ．チップへの２本鎖ＤＮＡのアレイ化
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップをコート面を上にしてＤＬＣチップをセットした。その後、活性化バッファー２を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに３０分間室温でプレートシェイカーで振とうした。蒸留水で２回洗浄後、遠心により乾燥させた。マイクロアレイヤー内に活性化されたＤＬＣをセットした後、２５μＭ、３０％グリセロールになるように調製した２本鎖オリゴヌクレオチドを１５０μｍピンを用いて活性化されたＤＬＣ上にスポットした。５０℃で１２時間インキュベートしたのち、ブロッキングバッファーを用いてブロックした後、４℃で保存した。
ｖ．トランスクリプションチップアレイの蛍光検出
洗浄バッファーで２回洗浄した後、結合バッファーで１００ｎｇ／ｍｌに希釈したＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで１００倍希釈した抗ＮＦκＢ抗体（ＲＣＫ社）を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで５０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、レーザー波長４７３ｎｍで励起し、ＦＩＴＣの蛍光に基づく５３５ｎｍの蛍光波長をＣＲＢＩＯ ＩＩマイクロアレイスキャナーで検出した。
ｖｉ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるトランスクリプションチップに捕捉された転写因子の検出
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップを、コート面を上にしてチップ（ＤＬＣあるいはジーンダイヤＴＭ）をセットした。次に種々の濃度の２本鎖ＤＮＡエレメント配列を含む活性化バッファー１を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに１時間室温でプレートシェイカーで振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、ブロッキングバッファーを２００μｌ添加し、室温で１時間振とうしたのち、４℃で保存した。洗浄バッファーで２回洗浄した後、結合バッファーで希釈した種々の濃度のＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、低塩濃度バッファーで洗浄した。その後チップを遠心により乾燥させた。ＭＡＬＤＩプレートにチップを両面テープで固定した後、１ｍｇ／ｍｌのシナピン酸溶液をマトリックスとして１μｌチップに添加し、乾燥させた。
ｖｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＤｉｇｅｓｔｉｏｎとＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
チップを新しいＥＬＩＳＡプレートに移し、チップ表面に１μｌのトリプシン反応液を添加し２〜６時間３７℃でインキュベートした後、１μｌの０．１％ＴＦＡを添加し反応を終結させた。その後１ｍｇ／ｍｌのαＣＨＣＡ溶液をマトリックスとして１μｌチップに添加し、乾燥させた。そのうち０．５μｌはＭＡＬＤＩプレートにスポットした。ペプチドマップはＭＳ−Ｆｉｔ Ｓｅａｒｃｈを用いて解析した。
ｖｉｉｉ タンデムマススペクトルによる捕捉分子の同定
上述の方法を用いてＤＬＣにＮＦκＢを捕捉し、Ｏｎ ｃｈｉｐトリプシン消化を行なった。次にＡＢＩ４７００ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎａｌｙｚｅｒにてＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔを質量補正に用いて、ペプチドマスフィンガープリントを取得した。得られたＮＦκＢのＰＭＦをタンデムマス解析に供した。
（３）実験結果
（Ａ）基礎的条件検討
ｉ．ジーンダイヤＴＭならびにＤＬＣチップへの２本鎖ＤＮＡの固定化
ＮＦκＢが認識するエレメント配列のうち、インターフェロンβ１遺伝子の上流配列にあるエレメント領域を含む領域をＰＲＤ ＦプライマーならびにＰＲＤ ＲＩプライマーを用いてＰＣＲ法で取得した（ＰＲＤ ＩＩ−１、図２）。ＰＣＲ産物をＧＦＸ精製キットを用いて精製後、固定化したところ、ＤＬＣチップ、ジーンダイヤＴＭともに２本鎖ＤＮＡが結合していることを確認した（図３）。
ｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡ最適条件の検討（ＤＬＣ）
ａ．競合阻害実験
チップに固定化した２本鎖ＤＮＡで転写因子を捕捉し、ＥＬＩＳＡにより特異的に検出することが可能かどうかを検討するため、結合バッファー中にＰＲＤＩＩ−１を添加し、固定化したＰＲＤＩＩ−１とＮＦκＢの結合において競合するかどうか検討した。一方コントロールとして結合バッファー中に固定化したＰＲＤＩＩ−１配列を含まない２本鎖オリゴヌクレオチドを添加して実験を行った。その結果、結合バッファー中にＰＲＤＩＩ−１を添加した場合は濃度依存的にＮＦκＢのチップへの捕捉は強く阻害されたが、コントロール配列を用いた場合はほとんど阻害効果は見られなかった（図４）。以上のことから、ＮＦκＢはＤＬＣチップ上のＰＲＤＩＩ配列を特異的に認識し結合していることが示唆された。
ｂ．ＤＮＡ固定化配列の検討
ＮＦκＢ ＥＬＩＳＡ条件を検討するため、長さやコピー数の異なるエレメントＤＮＡ配列を含んだ２本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法あるいは合成法で作製し検討した。ＰＲＤＩＩ配列を１コピー含むＰＲＤＩＩ−１とＰＲＤＩＩ−２を比較した場合、ＰＲＤＩＩ−２を固定化する方が、ＮＦκＢをトラップする効率が優れていた（図５）。また、ＰＲＤＩＩ−２と同じエレメント配列を６コピー含むＰＣＲ産物（ＰＲＤＩＩ×６）と比較しても、ＰＲＤＩＩ−２の方が固定化効率が優れていた。次に、ＰＣＲ法を用いず、人工合成により作製したオリゴヌクレオチドを用いてＮＦκＢを効率的に捕捉可能か検討した。イムノグロブリン由来ＮＦκＢ結合エレメント配列ＩｇκＢを２コピー含む２本鎖オリゴヌクレオチドならびに、ＰＲＤＩＩ配列を２コピー含むオリゴヌクレオチドＰＲＤＩＩいずれを用いても、ＰＲＤＩＩ−２と同等あるいはそれ以上のＮＦκＢのトラップ効率を示した（図５）。
以上の結果から、ＥＬＩＳＡ検出系においては、ＰＣＲ産物ならびに２本鎖オリゴヌクレオチドの末端側（固相化部位と反対の液相側）にＮＦκＢ認識配列が近い認識配列が効率的にＮＦκＢをトラップさせることが可能で、内部の認識配列は立体障害によりＮＦκＢ−抗体複合体がアクセスされにくく、コピー数は、ＮＦκＢのトラップに重要ではないことが示唆された。しかし、ＡＰ１配列を固定化したチップやＤＮＡを固定化しなかったネガティブコントロールからも３０−５０％程度の発色が見られたことから、ブロッキング条件を検討し特異性を向上させる必要があることが明らかとなった。
ｃ．ブロッキング条件の検討
ＥＬＩＳＡの特異性を向上させるため、種々のブロッキング剤の検討を行なった。ブロッキングバッファーとして、トリス系（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、スキムミルク系（５％スキムミルク，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＢＳＡ系（５％ＢＳＡ，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ゼラチン系（２．５％ゼラチン，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ならびにエタノールアミン系（０．５Ｍエタノールアミン，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた。その結果、いずれも特異性に関して大きな差異が見られなかった（図６）。以後、非蛋白性のブロッキング剤としてトリスを用いた。また、ブロッキングの反応時間を室温１時間から、室温１時間の後に、４℃ Ｏ／Ｎのステップを加えることで測定間再現性を高めることが出来た。
ｉｉｉ．再現性の検討
前項で最適化された条件を用いてＤＬＣチップの同時再現性ならびに測定間再現性を検討した。その結果、同時再現性、測定間再現性において良好な成績を示した（図７）。
ｉｖ．ジーンダイヤＴＭ（ダイヤモンドチップ）とＤＬＣチップの比較
ａ．濃度変化による定量性の比較
ＤＬＣチップとジーンダイヤＴＭの性能を比較するために種々のＮＦκＢ濃度で同一条件で比較を行なった。その結果、ほぼ同様の定量性を示したが、低濃度域においてはジーンダイヤＴＭのほうがＮＦκＢ検出において優れていた（図８）。
ｂ．検出限界の比較
低濃度域（１０ｎｇ／ｍｌ）以下でのプロファイルを詳細に解析するために、それぞれのチップにおける検出限界の算定を試みた。その結果ジーンダイヤＴＭでは１．０ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌいずれにおいてもＰＲＤＩＩを固定化したチップは、ＡＰ１配列を固定した配列とＤＮＡを固定化しなかったチップに対して、有意差水準５％で有意差判定すると有意差が見られたが、ＤＬＣは１．０ｎｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）においてのみＡＰ１固定化チップならびにＤＮＡを固定化しなかったチップに対する有意差が見られた（図２．１．３−９）。また０．３３ｎｇ／ｍｌにおいてはＡＰ１固定化チップに対してのみ有意差が見られたことから、検出限界は、ＡＰ１をコントロールとした場合はいずれも０．３３ｎｇ／ｍｌ（６．７ｐＭ）以下であることが明らかとなった。従ってｐＭオーダーの低濃度サンプルからＮＦκＢを検出可能であることが示唆された。これらのことから他の転写因子に対しても同様に高感度なＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡシステムの構築が可能であると考えられる。
（Ｂ）トランスクリプションチップの応用
ｉ．細胞培養液からの転写因子の検出
ＨｅＬａ細胞の培養細胞抽出液から転写因子ＮＦκＢ ｐ５０を捕捉できるかどうかＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行ない検討した。その結果、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した細胞抽出液からは、ＴＮＦα刺激をしなかったコントロール細胞抽出液と比較して、ＰＲＤＩＩを固定化したチップから強く発色が見られた（図１０Ａ）。
その他の転写因子においてもＴＮＦα刺激、あるいはＰＭＡ刺激（１０ｎＭ）処理を行うことにより、種々の転写因子の発現量が変動するかどうか検討を行った。本法においては、ＡＰ標識２次抗体を用いた。その結果、ＮＦκＢ ｐ５０以外にも多くの転写因子（ＮＦκＢ ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＣＲＥＢ）を特異的に捕捉することができた（図１０Ｂ）。
ｉｉ．トランスクリプションチップのマイクロアレイ化
これまでに，ＤＮＡ２本鎖を固相に固定化して、ＤＮＡ結合蛋白質を捕捉しＥＬＩＳＡ法を用いて検出するという試みは行なわれているが、スループット性や多重同時検出数が限られるため、プロテオーム解析のための技術として問題は解決されていない。本項では、これらの方法に変わる技術としてＤＬＣチップを用いたトランスクリプションマイクロアレイチップの開発に関して報告する。
ａ．２本鎖ＤＮＡのアレイ化の検討
ＦＩＴＣ標識されたＰＲＤ ＩＩのオリゴヌクレオチドを９スポット固定化したＤＬＣチップをＣＲＢＩＯ ＩＩ蛍光スキャナーを用いて検出した（図１１）。アレイヤーを用いてスポットした場合も同様に２本鎖ＤＮＡを固定化できることが明らかとなった。
ｂ．トランスクリプションマイクロアレイチップからＮＦκＢの特異的検出
ＦＩＴＣラベルを行なわないＰＲＤＩＩ、ＡＰ１、ｐ５３、ＶＤＲＥ、ＲＡＲＥ、ＧＲＥ、ＴＲＥ、ＧＲＥ、ＥＲＥ以上９種のエレメント配列を含むオリゴヌクレオチドを同様にＤＬＣチップ上に固定化した。この９種の転写因子をアレイ化したＤＬＣチップにＮＦκＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、蛍光イムノアッセイにより検出を試みた。その結果ＮＦκＢの認識配列であるＰＲＤＩＩを含むオリゴヌクレオチドからのみ蛍光が検出された。以上のことから、ＮＦκＢはエレメント配列をアレイ化したＤＬＣチップ上で特異的に検出できることが明らかとなった（図１２）。従って、他のエレメント配列に結合する転写因子を特異的に認識する抗体を組み合わせることにより、一度に複数の転写因子を少量のサンプルから検出するシステムを構築することが可能となる。
ｉｉｉ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる転写因子の検出
転写因子をＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡで検出する方法は、特異的抗体を用いて同時に多くの転写因子を解析するシステムとしては、ＥＬＩＳＡやゲルシフトアッセイと比較した場合、スループットに優れた方法である。しかし、このシステムは既知の転写因子を検出することは可能であるが、未知蛋白質の同定は不可能である。現在のプロテオーム解析においては、未知蛋白質の同定は非常に重要な命題であることから、トランスクリプションチップを用いて蛋白質を同定する技術開発は非常に有用性が高いと考えられる。本項目では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ質量分析系を用いた転写因子の検出法の開発について報告する。
ａ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法によるＮＦκＢのＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＲＭＦ）
チップ上でトリプシン分解を行うことは一般的には困難である。その原因として、疎水表面上での酵素活性の失活あるいは、立体障害による基質部位のマスク等が挙げられている。しかし、トランスクリプションチップは低塩濃度で２本鎖ＤＮＡが解離するため、ＤＮＡ蛋白質相互作用が低塩濃度では失われ容易にタンパク質が酵素反応液中に遊離されること、またチップ表面はＤＮＡが共有結合で固定されているため親水性を示すと考えられることからトランスクリプションチップはＯｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行う上で理想的なチップであると考えられた。２ｐｍｏｌ／ｃｈｉｐのＮＦκＢを添加・反応させた後、Ｏｎ ｃｈｉｐトリプシン分解を行った。その後、チップ上に存在するペプチドをＺｉｐ Ｔｉｐ精製チップにより精製しＭＡＬＤＩプレートで検出、あるいはトランスクリプションチップ上からの直接検出の２通りの方法を行った。
その結果、Ｏｎ ｃｈｉｐでトリプシン分解を行い、Ｚｉｐ Ｔｉｐにより精製後、ＭＡＬＤＩプレートに試料を添加した場合は理想的なペプチドマップが観察された（図１３）。またこれは、溶液中でトリプシン（４μｇ／ｍｌ）を用いてＮＦκＢを分解して観察されるペプチドマップと非常に良く一致していた（図１４）。このペプチドマスフィンガープリント情報をもとに、ＭＳ−ＦＩＴ Ｓｅａｒｃｈによりデータベース検索を行った結果、ＮＦκＢが非常に高いスコアでヒットしたことから、多くのＮＦκＢ由来ペプチドを捕捉していることが確認された（図１５）。
ｂ．ＰＭＦ法によるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のＯｎ Ｃｈｉｐ検出・同定
次に５００ｆｍｏｌ／ｃｈｉｐのビタミンＤ受容体を、その認識配列であるエレメント配列ＶＤＲＥを固定化したチップでトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った後、ＭＡＬＤＩプレートにサンプルを添加したところ、ＮＦκＢ同様に溶液中でトリプシン分解を行った試料と同様にペプチドマップが得られた（図１６、図１７）。
一方、トランスクリプションチップ上に直接レーザー照射を行い、直接ペプチドマップを観察できるかどうかも試みた。その結果、チップ上から直接ＶＤＲのペプチドマップを観察することが出来た（図１８）。
ｃ．タンデムマススペクトル解析による転写因子の同定
ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）法は、質量分析により、試料中に含有されるタンパク質の同定に用いられるが、得られるスペクトルピーク数が少ないと、試料中に含まれる目的タンパク質の同定を行なうことは難しい。そこで、侠雑物を多く含んだ試料から、目的とするタンパク質を同定する場合、タンデムマススペクトル解析による同定がしばしば行なわれる。しかし、タンデムマススペクトルは一般的にペプチドマスフィンガープリント法と比較すると感度が低いことが難点であった。
ＮＦκＢを固定化したトランスクリプションチップから、質量補正して得られたペプチドマスフィンガープリント（図２１Ａ）から、１７０１．１０ｍ／ｚ，１８０８．０１ｍ／ｚ，２４１３．３５ｍ／ｚのピークについては、タンデムマス解析を行なった（図２１Ｂ，Ｃ，Ｄ）。それぞれのピークから、２次スペクトルを得ることが出来たことから、ＭＡＳＣＯＴデータベースサーチにこれらの分析結果を供した。その結果いずれのペプチドもＮＦκＢのデータベース上の質量データーと良く一致した（図２２）。以上の結果は、トランスクリプションチップがエレメントＤＮＡを介し、効率的にＮＦκＢを捕捉することが可能であり、その結果タンデムマス解析を行い得ることをしている。
（４）本発明の応用の可能性
（Ａ）トランスクリプションチップを用いた転写因子高感度定量検出
エレメント配列をＤＬＣチップあるいはジーンダイヤＴＭ上に固定化したチップ（トランスクリプションチップ）に蛋白質（転写因子）を捕捉させ、高感度で特異性の高い実験系を構築し、高感度な定量検出系を確立することが本研究の第一の大きな課題である。この課題を解決するためには、転写因子の捕捉能が高いＤＮＡ固定化チップを作製し、転写因子や抗体の非特異的結合をできる限り抑制できるアッセイ系の確立が重要であった。ブロッキング条件など結合反応条件の検討、固定化するＤＮＡ配列の検討を行うことで、以上の課題に対応した。
転写因子ＮＦκＢの認識配列（エレメント配列）部分は、コピー数よりむしろ、固定化した２本鎖ＤＮＡ内での位置が重要と思われる結果が得られた（図５）。２本鎖ＤＮＡのエレメント配列の位置が液層側から近いほうがＮＦκＢの捕捉能が高かった。オリゴヌクレオチドの表面側から離れた位置に存在する内部の認識配列は立体障害により転写因子−抗体複合体が形成されにくいことが示唆された。従って高感度な検出を実現する一般的な方法として、２本鎖オリゴヌクレオチドの表面側（固相化部位と反対側）近くにエレメント配列を設計することが転写因子の捕捉能に重要であると示唆された。固定化するＤＮＡにはオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物いずれも固定化が可能なことを明らかにしたことから、オリゴヌクレオチドを用いた通常のアッセイに加えて、ある特定の遺伝子領域をＰＣＲ法により取得し固定化することで、特定の遺伝子領域における転写開始複合体について将来解析可能になると考えられた。
アッセイの非特異的結合を減少させるためにはブロッキング条件の検討は重要であった。結合バッファー中のＢＳＡ濃度が１％の場合が最適な条件であった。また実験系構築時において、非特異的結合の影響と思われる陰性コントロールからのアッセイ値の上昇がしばしば見られたが、トリス緩衝液を用いたブロッキングの時間を長く取る（４℃、Ｏ／Ｎ）ことで、再現性が高い実験系を構築することができた（図７）。
以上の点を中心に検討した結果、最終的にジーンダイヤＴＭを用いた場合０．３３ｎｇ／ｍｌまで、ＤＬＣチップを用いた場合１．００ｎｇ／ｍｌまで検出限界が得られた。また、ＨｅＬａ細胞核抽出液を用いて、ＴＮＦα刺激や、ＰＭＡ刺激によって活性化された炎症系転写因子の蛋白質レベルのプロファイリングを行うことが可能となった。
（Ｂ）２本鎖ＤＮＡの高集積化（マイクロアレイ化）チップを用いた転写因子の検出
小規模な研究用途としては、従来の技術ですでに転写因子のプロファイリング・定量に関しては達成していると言えるが、今後のプロテオーム解析的な立場での診断・創薬への支援システムとしては、スループット性とサンプル消費量の点から考慮すると実用化には至っていない現状である。
本成果のＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡの結果で示したように３ｍｍ×３ｍｍサイズで定量的測定を可能にしたことから、カラススライド２枚程度のサイズで９６ウェルマイクロプレートと同数の定量的な高感度測定が可能としている。
さらに、Ｏｎ ｃｈｉｐ蛍光イムノアッセイにおいては、２本鎖ＤＮＡをマイクロアレイ化したトランスクリプションチップの作製を行うことで、２本鎖ＤＮＡを３ｍｍ×３ｍｍサイズのチップに９スポットのＤＮＡを固定化したチップからＮＦκＢがＰＲＤＩＩ配列に特異的に結合していることをモニターすることができた（図１２）。
（Ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた転写因子の検出・同定
質量分析計を用いて蛋白質を検出することで、ＥＬＩＳＡでは検出が困難な、未知蛋白質の検出・同定あるいは翻訳後修飾の解析などが可能となる。
現在、サイファージェン社ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた蛋白チップシステムが市販化されており、このシステムを用いて、抗体を固定化した蛋白チップが開発されているが、スループット性、質量分析精度の点においては十分とはいえない。
一方、ＤＮＡを固定化したトランスクリプションチップに関しても、転写因子は一般的に分子量が５万程度のものが多く、質量情報から同定を行うのは現在の質量分析計の精度では困難であった。そこで、トリプシン分解によるペプチドマスフィンガープリント法を用いて、ＤＮＡを高密度に固定化可能なダイヤモンド（ＤＬＣ）チップとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたシステムを用いれば、チップ上から直接転写因子の分子の質量情報を取得できるのではないかと考え、検出システムを作成した結果、初めてチップ上からの直接転写因子の検出・同定を実現をすることができた（図１８）。さらには、タンデムマススペクトル解析と組み合わせることで、チップに捕捉した転写因子の検出・同定を行なうことが可能となった（図２１）。
本発明によれば、ｏｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡにより高感度なトランスクリプションチップを用いた多数の転写因子のプロファイリングが実現され、培養細胞抽出液や組織から転写因子を高感度に検出・定量化が可能となり、創薬時における、スクリーニングや毒性予測のツールとして、あるいは診断情報のツールとして使用可能である。
また、ペプチドマスフィンガープリント法を用いて直接チップ上から転写因子の同定を行うことが可能である。さらに、タンデムマススペクトル解析が可能であったことから、侠雑物を含む試料中からの転写因子の同定を行い得る。
イオン化レーザーの焦点位置に対応するトランスクリプションチップ（図１９）を用いることで従来から用いられているＭＡＬＤＩプレート以上の感度ならびに精度を保持した転写因子の検出．同定が行い得る。
本発明により、効率的に転写因子をプロファイリングすることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【技術分野】
本発明は、トランスクリプションチップおよび該チップを用いた転写因子の活性測定方法に関する。
【背景技術】
ＤＮＡチップは遺伝子多型やｍＲＮＡ発現量の変動量をプロファイルするツールであり、現在広い研究分野で利用されている。ゲノム情報の伝達体であるｍＲＮＡから翻訳されて得られる最終的な産物である蛋白質が、時々刻々変動する生命現象を担っている。そのため、ｍＲＮＡのプロファイリングから得られる情報よりも有用な情報が得られるものと考えられており、蛋白質を網羅的に解析するプロテオーム解析技術の開発が現在活発に行われている。
そのような現状の中で、蛋白質を基板上に捕捉し、その性状を効率的に解析するシステムが完成すれば、大規模解析やコスト面において、従来までの２次元電気泳動あるいは液体クロマトグラフィーを用いたプロテオーム解析法を凌駕する新技術となると推定される。これまで、プロテオーム解析をターゲットとしたチップとしては抗体チップが開発されている。抗体チップとは、チップ表面に抗体を多数固定化し、固定化した抗体それぞれと相互作用する抗原量をプロファイル化するツールである。ＤＮＡチップよりは後発であるが、直接蛋白質量の変動を解析することが可能なことから、将来的には創薬、毒性試験あるいは病態の診断等広い分野での応用が期待されている。
転写因子は、各遺伝子の上流領域のエレメント配列と呼ばれる領域に結合し、種々の遺伝子発現調節を担う蛋白質であることから、細胞の炎症応答、癌化と転写制御因子の活性化と深く関与しており、生物活性を保持した種々の転写因子の蛋白質レベルでのプロファイルを行うことは非常に重要である。
従来より、転写因子はゲルシフトアッセイと呼ばれるラジオアイソトープを用いたアクリルアミドゲル電気泳動を用いた手法により解析されているが、スループット、安全性に問題があり今後のプロテオミクス的手法には対応が難しいと考えられる。
本発明は、効率的に転写因子をプロファイリングする技術を提供することを目的とする
【図面の簡単な説明】
図１は、抗体チップとトランスクリプションチップを比較して示す。
図２は、固定化した遺伝子を示す。
図３は、ＦＩＴＣ標識したＮＦκＢ応答配列固定化チップ（ＰＲＤＩＩ−１）を示す
図４は、ＮＦκＢ応答配列の競合実験結果を示す。
図５は、固定化二本鎖ＤＮＡの検討結果を示す。
図６は、ブロッキング剤の検討結果を示す。
図７は、同時再現性試験と測定間再現性試験（ＤＬＣ）の結果を示す。
図８は、ＤＬＣチップのジーンダイヤＴＭの比較を示す。
図９は、有意水準５％における感度試験の結果を示す。
図１０は、Ａ：ＨｅＬａ細胞抽出液からのＮＦκＢの検出結果を示す。Ｂ：ジーンダイヤＴＭを用いたＨｅＬａ細胞炎症関連転写因子の発現プロファイリングを示す。
図１１は、二本鎖ＤＮＡのマイクロアレイ化の結果を示す。
図１２は、蛍光スキャナーによるＮＦκＢの特異的検出結果を示す。
図１３は、ＮＦκＢのｏｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎによるペプチドマップを示す。
図１４は、溶液中トリプシン分解により得られたＮＦκＢペプチドマップを示す。
図１５は、ＰＭＦによるデータベース倹索結果を示す。
図１６は、ｏｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｉｏｎの結果を示す。
図１７は、溶液中トリプシン分解により得られたＶＤＲペプチドマスフィンガープリントを示す。
図１８は、本発明のトランスクリプションチップからのＶＤＲの直接検出の結果を示す。
図１９は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ用のＤＬＣプレートの１例を示す。
図２０は、ダイヤモンド薄膜を有する基板の修飾方法を示す。
図２１は、ＮＦκＢのペプチドマスフィンガープリント（Ａ）ならびに、１７０１．１０ｍ／ｚ（Ｂ），１８０８．０１ｍ／ｚ（Ｃ），２４１３．３５ｍ／ｚ（Ｄ）の２次スペクトルを示す。
図２２は、ＭＡＳＣＯＴデータベースサーチにより得られたＮＦκＢ同定結果である。
【発明の開示】
本発明者は、基板上に転写因子の１以上のエレメント配列を含む１本鎖あるいは２本鎖ＤＮＡを固定化したトランスクリプションチップを作製し、該チップにより転写因子或いは該因子と相互作用する物質の発現量をＤＮＡ結合能という生物機能に基づいてプロファイルできることを見出した。本発明は、以下のトランスクリプションチップおよびそれを用いた転写因子のアッセイ方法を提供するものである。
１．転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが基板上に固定化されてなるトランスクリプションチップ。
２．各々に転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも２つのポリヌクレオチドが結合してなる項１に記載のチップ。
３．前記ポリヌクレオチドが各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を有する項１に記載のチップ。
４．前記基板が支持体上にダイヤモンド薄膜を形成したものである項１に記載のチップ。
５．前記ポリヌクレオチドがダイヤモンド薄膜と任意に適当なスペーサーを介して結合したものである項１に記載のチップ。
６．項１〜５のいずれかに記載のトランスクリプションチップに転写因子を含み得る試料を作用させる工程を含む、転写因子の結合をアッセイする方法。
７．前記試料が被験物質の存在下で培養された細胞の細胞溶解物である、被験物質の転写因子に対する影響を評価するための項６に記載の方法。
８．転写因子の結合を転写因子に対する抗体または質量分析を利用した方法を用いて検出する項６または７に記載の方法。
９．抗体を用いた検出がＥＬＩＳＡ法であり、質量分析を利用した方法がペプチドマスフィンガープリント法である項８に記載の方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明のトランスクリプションチップは、抗体チップ、ＤＮＡチップのいずれとも異なっている（図１）。
転写因子は、各遺伝子の上流領域のエレメント配列と呼ばれる領域に結合し、種々の遺伝子発現調節を担う蛋白質であることから、細胞の炎症応答、癌化は転写制御因子の活性化と深く関与しており、生物活性を保持した種々の転写因子の蛋白質レベルでのプロファイルを行うことは非常に重要である。
転写因子は、ＤＮＡに結合して転写開始等の転写調節に関与する因子であり、例えば、ＮＦκＢ（例えばｐ５０、ｐ６５）、ＮＦＡＴｃ１、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｒｅｌ、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＰ１、ＡＰ−２、ＲＢＰ−Ｊ、Ｎｒｆ２、ＫＬＦ５、ＢＴＥＢ２、ＮＦ−ＡＴ、ＭＩＴＦ、ＲＵＮＸファミリー、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＨＩＦ１α、ＨＬＦ、Ｂｒｎ−３、ＥＢＰ、ＣＤＰ、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ、ＥＧＲ、Ｅｔｓ、Ｅｔｓ１／ＰＥＡ３、ＦＡＳＴ−１、ＢＲＣＡ１、ＨＮＦ−４、ＧＡＴＡ、ＮＦ−１、Ｍａｘ、ＩＲＦ−１、ＮＦＡＴｃ、ＮＦ−Ｅ１、ＮＦ−Ｅ２、１−Ｏｃｔ、ＭＥＦ−１、ＭＥＦ−２、Ｍｙｃ−Ｍａｘ、ｐ５３、Ｐａｘ−５、Ｐｂｘ１、ＴＲ、ＡｈＲ、ＥＲ、ＧＲ、ＭＲ、ＡＲ、ＶＤＲ、ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲ、ＰＰＡＲ、ＥＲＲ、ＲＯＲ、ＳＸＲ、ＰＸＲ、ＵＳＦ−１、Ｓｐ１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ６、ＣＯＵＰ−ＴＦ、Ｆｔｚ−Ｆ１、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＢＰ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨ、ＴＡＦ、ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩＩ、ＰｏｌＩＩＩ、ＥＬＬ、ＴＦＩＩＳ、Ｅｌｏｎｇｉｎ、Ｐ−ＴＥＦｂ、ＤＳＩＦ、ＣＢＰ／ｐ３００、ｐ１６０（ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＡＩＢ１）ＴＲＲＡＰ／ＧＣＮ５、ＮｃｏＲ、ＳＭＲＴ、ＨＤＡＣ、ＤＲＩＰ／ＴＲＡＰ、Ｓｍａｄ、などが例示される。
転写因子は哺乳類の転写因子が好ましく、特にヒトの転写因子が好ましい。
エレメント配列は公知であり、種々のエレメント配列を１または２以上含むポリヌクレオチドを適宜チップ上に形成することができる。具体的なエレメント配列としては、下記の実施例１のプライマーにおいて下線を引いてある配列（ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣおよびＧＧＧＡＡＡＴＴＣＣ；ＧＧＧＧＡＴＣＣＣおよびＧＧＧＡＴＣＣＣＣ；ＴＧＡＣＴＣＡＴおよびＡＴＧＡＧＴＣＡ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡおよびＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴ；ＡＧＡＡＣＡおよびＴＧＴＴＣＴ；ＴＧＡＣＧＴＣＡ）が例示される。他のエレメント配列としては、例えばＳａｇｒｏｖｅｓ，Ｔらの報告（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １：２１１−２１２（２００２））、Ｉｓｈｉｉ，Ｓらの報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１４１０−１４１３（１９８６））に記載されている。
該エレメント配列は、哺乳類の転写因子が結合し得るエレメント配列が好ましく、特にヒト転写因子が結合し得るエレメント配列が好ましい。
本発明のチップがその動態の把握を必要とする複数の転写因子に対応したオリゴヌクレオチドをチップ上に固定化していれば、１枚のチップで全ての転写因子のプロファイリングを行うことができるので好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみの転写因子に対応するオリゴヌクレオチドを固定化し、必要な数のチップを用いて転写因子のプロファイリングを行ってもよい。
１つのポリヌクレオチドには、エレメント配列は少なくとも１種含まれ得、同一のエレメント配列を１または複数個含んでいても良く、２種以上のエレメント配列を１つのポリヌクレオチド中に含んでいてもよい。
基板上に結合されるエレメント配列を含むポリヌクレオチドは、公知のエレメント配列の前後に適当なオリゴまたはポリヌクレオチドを結合させて人工的に作製してもよいが、各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を好ましく使用できる。ポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば１０〜５００個程度、好ましくは１５〜３００個程度、より好ましくは２０〜１００個程度である。
長すぎる塩基対は調製が困難であったり、自己相補的塩基対を生じたり、目的の部位と異なる部位でハイブリダイゼーションしたりして、目的のオリゴヌクレオチドが得られない可能性がある。
エレメント配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号１〜２２のポリヌクレオチドが例示される。
基板としては、ＤＮＡを結合させ得るものであればよく、特に限定されないが、例えばカルボキシメチルデキストランやカルボキシル基で末端修飾されＰＥＧのような水溶性高分子を基板表面に結合させてカルボキシル基を導入したものや、金属（特に金）の表面薄膜を有する基板などが使用できるが、好ましくは多数のカルボキシル残基が表面上に形成されたダイヤモンド薄膜を有するチップ、例えばジーンダイヤ（登録商標）、ＤＬＣチップが例示される。多数の２本鎖ＤＮＡを高密度に結合可能であることからダイヤモンド薄膜を有する基板が好ましく、特にジーンダイヤＴＭが好ましい。ダイヤモンド薄膜は、任意の支持体、例えばシリコン基板上に形成することができる。
ダイヤモンド薄膜上に、アミノ基、カルボキシル基などの置換基を導入する方法の概略を図２０に示す。
ＤＮＡと基板の結合は、カップリング試薬により行うことができる。カップリング試薬としては、通常のペプチド結合を形成するのに使用されている試薬が挙げられ、例えばカルボジイミド類（ＤＣＣ，ＷＳＣ），カルボニルジイミダゾールなどが例示される。或いは、基板のＣＯＯＨ末端基を上記カルボジイミド類、特に水溶性カルボジイミドを使用し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの活性エステルとし、５’または３’末端側にアミノ基などの結合性基を有するＤＮＡを結合することができる。ＤＮＡとの結合は、さらに適当なスペーサーを介して行い、基板とＤＮＡとの距離を適度に離してもよく、ＤＮＡの結合部位と転写因子の結合部位の間に適当な配例（例えばプロモーター由来の配列）を介在させ、転写因子の結合配例をトランスクリプションチップの基板から離してもよい。適当なプロモーターを使用することで、表面から一定のスペースを保った状態で転写因子の結合配列を固定化することが可能となり、転写因子のアッセイを、転写因子のモビリティを確保しつつ、行うことができる。
本願実施例では、５’末端にＮＨ２（ＣＨ２）１２を有するポリヌクレオチドを使用した。このような５’または３’末端にアミノ基のような結合性基を有する置換基（例えばＮＨ２（ＣＨ２）１２）を備えた修飾オリゴヌクレオチドは、公知の方法に従い製造でき、例えば以下の公開されている方法および特公平３−７４２３９号公報に従い製造することができる。
本発明のチップは、基板上に２本鎖ＤＮＡを結合させ、該２本鎖ＤＮＡのエレメント配列に転写因子を結合させて、該結合転写因子を質量分析または抗体を使用するなどの適当な検出方法に従い検出するために使用する。
２本鎖ＤＮＡの結合は、５’または３’末端側にアミノ基などの反応性基（これを介して基板にポリヌクレオチドを結合させる）を有する１本鎖ＤＮＡを基板に結合させた後にこれと相補性のポリヌクレオチドをハイブリダイスさせて行っても良く、或いは、少なくとも一方の鎖結合性基（例えばＮＨ２）を有する２本鎖ＤＮＡを直接基板に結合させてもよい。
このようにして作製されたトランスクリプションチップは、次に転写因子を含み得る試料と接触されて、転写因子をチップ上に結合させる。このような試料としては、哺乳類細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）が好ましく、特にヒト細胞の細胞溶解物が好ましい。例えば各種のヒト細胞を種々の培養条件或いは種々の被験物質の存在下で培養し、その細胞溶解物の転写因子を本発明のチップを用いてプロファイリングすることにより、転写因子に及ぼす各種の因子の影響を定量的に評価することができる。
転写因子の定量は、該転写因子に対する抗体を使用し、ＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を用いて免疫学的に測定するか、或いは、マススペクトルを使用して測定できる。例えば、マススペクトルとしては、転写因子を直接マススペクトルで測定してもよいが、チップに結合した転写因子をトリプシンのような適当なプロテアーゼで消化し、得られたペプチド断片をマススペクトルにより分析し、当該転写因子のプロテアーゼ消化物のマススペクトルパターン（マスフィンガープリント）と比較して、結合した転写因子の同定、定量分析を行うことが好ましい。マススペクトルとしては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなどが好ましく例示される。
ＥＬＩＳＡ法は、トリス系、スキムミルク系、ゼラチン系、エタノールアミン系などの種々のブロッキング剤で処理し、特異性を向上させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＩＴＣなどのフルオレセイン、ローダミン、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５などの蛍光色素、アクリジウムエステル、ルミノール、発光性アダマンタン化合物などの発光物質などで標識するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【実施例１】
（１）実験材料と方法
（ｉ）実験装置
蛍光スキャナー：ＣＲＢＩＯ ＩＩ（日立ソフトウェア（株））、マイクロアレイヤー：ＳＰＢＩＯ（日立ソフトウェア（株））、マイクロプレートリーダー：μＱｕａｎｔ（ＢＩＯ−ＴＥＫ）、プレートシェイカー：Ｍｉｃｒｏ ｍｉｘｅｒ ＭＸ−４（三共純薬）、ＣＯ２インキュベータ：ＨＥＲＡｃｅｌｌ（Ｋｅｎｄｒｏ）、質量分析装置：ＡＢＩ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＳＴＲ（アプライドバイオシステムズ）
（ｉｉ）実験材料
チップ、プレート：ＤＬＣチップＣ４（３ｍｍ・３ｍｍ）（東洋綱鈑（株））、ジーンダイヤＴＭＣ４（３ｍｍ・３ｍｍ）（東洋鋼鈑（株））、９６穴Ｕ底マイクロプレート（グライナー）、ＮＦκＢ（ｐ５０）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
抗体：Ａｎｔｉ−ＮＦκＢ ｐ５０抗体（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）、Ａｎｔｉ−ＮＦκＢ ｐ５０抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＃１００−４１６４）、ＰＯＤ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）、ＡＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ナカライテスク）、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（ナカライテスク）、ＢＤ Ｍｅｒｃｕｒｙ ＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ ｋｉｔ Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
試薬：ＷＳＣ（Ｄｏｊｉｎ）、ＮＨＳ（Ｗａｋｏ）、ＰＯＤ発色基質ＴＭＢＺ（住友ベークライト（株）＃ＭＬ−１１２０Ｔ）、活性化バッファー１（１０ｍＭ ＷＳＣ，０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ４．５））、活性化バッファー２（１００ｍＭ ＷＳＣ，２０ｍＭ ＮＨＳ，０．１Ｍ ＮａＰＢ（ｐＨ６．０））（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆａｒ）、ブロッキングバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、結合バッファー（１％ＢＳＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１００倍希釈ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ））、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ７．５），０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ＴＮＦα（Ｗａｋｏ ＃２０３−１５２６３）、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＳＩＧＭＡ ＃Ｐ１５８５）、シナピン酸溶液（１ｍｇ／ｍｌシナピン酸，５０％アセトニトリル，０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ））、α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｏｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（αＣＨＣＡ）溶夜（１ｍｇ／ｍｌ αＣＨＣＡ，５０％アセトニトリル，０．１％ＴＦＡ）、低塩濃度バッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＮａＣｌ）、トリプシン反応液（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム，０．１−４μｇ／ｍｌトリプシン）、ＧＦＸ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャム＃２７−９６０２−０１）、ＮＥ−ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＩＥＣＥ ＃７８８３３）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ
オリゴヌクレオチド：以下のプライマーならびにオリゴヌクレオチドを合成した。下線部は転写因子の認識配列（エレメント配列）を示す。オリゴヌクレオチドは、２本鎖の最終濃度５０μＭとなるように相補鎖とともに混合し、９５℃で５分間熱処理後徐々に冷却した。
（ｉｉｉ）実験方法
ｉ．エレメント配列固定化チップの作製（ＥＬＩＳＡ用）
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップをコート面を上にしてチップ（ＤＬＣあるいはジーンダイヤＴＭ）をセットした。次に種々の濃度の２本鎖ＤＮＡエレメント配列を含む活性化バッファー１を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに１時間室温でプレートシェイカーで振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、ブロッキングバッファーを２００μｌ添加し、室温で１時間振とうしたのち、４℃で保存した。
ｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡ）
洗浄バッファーで２回後、結合バッファーで希釈した種々の濃度のＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで２０００倍希釈した抗ＮＦκＢ抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで２０００倍希釈したＰＯＤ抗ウサギＩｇＧ２次抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで５回洗浄後、ＰＯＤ発色基質ＴＭＢＺの吸光に基づく４５０ｎｍの波長をマイクロプレート洗浄したリーダーで測定した。
ｉｉｉ．ＨｅＬａ細胞抽出液の調製
２５０ｃｍ２シャーレを用いて２５ｍｌの１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地でＨｅＬａ細胞を７０％コンフルエントまでＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。無血清培地に交換後、ＴＮＦαを１００ｎｇ／ｍｌになるように添加し、３０分間ＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。セルスクレイパーにて細胞を剥離させた後、遠心分離で（×１０００ｇ，５分）培地を除いた。ＰＢＳを添加して混和した後再び遠心分離（×１０００ｇ，５分）を行ない上清を廃棄した。細胞を含む沈殿に細胞溶解バッファーを添加し細胞を溶解し、遠心（×１０００ｇ，５分）後、上清を回収し、蛋白質濃度を測定した。１枚のチップあたり６０μｇの細胞抽出液由来蛋白質を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行った。一方、転写因子のプロファイリングには、ＴＮＦα刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＰＭＡ刺激（１μＭ）したＨｅＬａ細胞ならびにコントロール細胞由来の核抽出液を用いた。核抽出液にはピアス社のキットを用いた。１枚のチップあたり２０μｇ核抽出液由来蛋白質を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行った。
ｉｖ．チップへの２本鎖ＤＮＡのアレイ化
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップをコート面を上にしてＤＬＣチップをセットした。その後、活性化バッファー２を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに３０分間室温でプレートシェイカーで振とうした。蒸留水で２回洗浄後、遠心により乾燥させた。マイクロアレイヤー内に活性化されたＤＬＣをセットした後、２５μＭ、３０％グリセロールになるように調製した２本鎖オリゴヌクレオチドを１５０μｍピンを用いて活性化されたＤＬＣ上にスポットした。５０℃で１２時間インキュベートしたのち、ブロッキングバッファーを用いてブロックした後、４℃で保存した。
ｖ．トランスクリプションチップアレイの蛍光検出
洗浄バッファーで２回洗浄した後、結合バッファーで１００ｎｇ／ｍｌに希釈したＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで１００倍希釈した抗ＮＦκＢ抗体（ＲＣＫ社）を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、抗体希釈バッファーで５０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、レーザー波長４７３ｎｍで励起し、ＦＩＴＣの蛍光に基づく５３５ｎｍの蛍光波長をＣＲＢＩＯ ＩＩマイクロアレイスキャナーで検出した。
ｖｉ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるトランスクリプションチップに捕捉された転写因子の検出
ポリプロピレン製９６穴Ｕ底マイクロプレートにチップを、コート面を上にしてチップ（ＤＬＣあるいはジーンダイヤＴＭ）をセットした。次に種々の濃度の２本鎖ＤＮＡエレメント配列を含む活性化バッファー１を５０μｌ添加し、プレートをシールした。つぎに１時間室温でプレートシェイカーで振とうした。洗浄バッファーで２回洗浄後、ブロッキングバッファーを２００μｌ添加し、室温で１時間振とうしたのち、４℃で保存した。洗浄バッファーで２回洗浄した後、結合バッファーで希釈した種々の濃度のＮＦκＢを添加し、１時間室温で振とうした。洗浄バッファーで３回洗浄後、低塩濃度バッファーで洗浄した。その後チップを遠心により乾燥させた。ＭＡＬＤＩプレートにチップを両面テープで固定した後、１ｍｇ／ｍｌのシナピン酸溶液をマトリックスとして１μｌチップに添加し、乾燥させた。
ｖｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＤｉｇｅｓｔｉｏｎとＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
チップを新しいＥＬＩＳＡプレートに移し、チップ表面に１μｌのトリプシン反応液を添加し２〜６時間３７℃でインキュベートした後、１μｌの０．１％ＴＦＡを添加し反応を終結させた。その後１ｍｇ／ｍｌのαＣＨＣＡ溶液をマトリックスとして１μｌチップに添加し、乾燥させた。そのうち０．５μｌはＭＡＬＤＩプレートにスポットした。ペプチドマップはＭＳ−Ｆｉｔ Ｓｅａｒｃｈを用いて解析した。
ｖｉｉｉ タンデムマススペクトルによる捕捉分子の同定
上述の方法を用いてＤＬＣにＮＦκＢを捕捉し、Ｏｎ ｃｈｉｐトリプシン消化を行なった。次にＡＢＩ４７００ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎａｌｙｚｅｒにてＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＭＡＬＤＩ−ＭＳ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔを質量補正に用いて、ペプチドマスフィンガープリントを取得した。得られたＮＦκＢのＰＭＦをタンデムマス解析に供した。
（３）実験結果
（Ａ）基礎的条件検討
ｉ．ジーンダイヤＴＭならびにＤＬＣチップへの２本鎖ＤＮＡの固定化
ＮＦκＢが認識するエレメント配列のうち、インターフェロンβ１遺伝子の上流配列にあるエレメント領域を含む領域をＰＲＤ ＦプライマーならびにＰＲＤ ＲＩプライマーを用いてＰＣＲ法で取得した（ＰＲＤ ＩＩ−１、図２）。ＰＣＲ産物をＧＦＸ精製キットを用いて精製後、固定化したところ、ＤＬＣチップ、ジーンダイヤＴＭともに２本鎖ＤＮＡが結合していることを確認した（図３）。
ｉｉ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡ最適条件の検討（ＤＬＣ）
ａ．競合阻害実験
チップに固定化した２本鎖ＤＮＡで転写因子を捕捉し、ＥＬＩＳＡにより特異的に検出することが可能かどうかを検討するため、結合バッファー中にＰＲＤＩＩ−１を添加し、固定化したＰＲＤＩＩ−１とＮＦκＢの結合において競合するかどうか検討した。一方コントロールとして結合バッファー中に固定化したＰＲＤＩＩ−１配列を含まない２本鎖オリゴヌクレオチドを添加して実験を行った。その結果、結合バッファー中にＰＲＤＩＩ−１を添加した場合は濃度依存的にＮＦκＢのチップへの捕捉は強く阻害されたが、コントロール配列を用いた場合はほとんど阻害効果は見られなかった（図４）。以上のことから、ＮＦκＢはＤＬＣチップ上のＰＲＤＩＩ配列を特異的に認識し結合していることが示唆された。
ｂ．ＤＮＡ固定化配列の検討
ＮＦκＢ ＥＬＩＳＡ条件を検討するため、長さやコピー数の異なるエレメントＤＮＡ配列を含んだ２本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法あるいは合成法で作製し検討した。ＰＲＤＩＩ配列を１コピー含むＰＲＤＩＩ−１とＰＲＤＩＩ−２を比較した場合、ＰＲＤＩＩ−２を固定化する方が、ＮＦκＢをトラップする効率が優れていた（図５）。また、ＰＲＤＩＩ−２と同じエレメント配列を６コピー含むＰＣＲ産物（ＰＲＤＩＩ×６）と比較しても、ＰＲＤＩＩ−２の方が固定化効率が優れていた。次に、ＰＣＲ法を用いず、人工合成により作製したオリゴヌクレオチドを用いてＮＦκＢを効率的に捕捉可能か検討した。イムノグロブリン由来ＮＦκＢ結合エレメント配列ＩｇκＢを２コピー含む２本鎖オリゴヌクレオチドならびに、ＰＲＤＩＩ配列を２コピー含むオリゴヌクレオチドＰＲＤＩＩいずれを用いても、ＰＲＤＩＩ−２と同等あるいはそれ以上のＮＦκＢのトラップ効率を示した（図５）。
以上の結果から、ＥＬＩＳＡ検出系においては、ＰＣＲ産物ならびに２本鎖オリゴヌクレオチドの末端側（固相化部位と反対の液相側）にＮＦκＢ認識配列が近い認識配列が効率的にＮＦκＢをトラップさせることが可能で、内部の認識配列は立体障害によりＮＦκＢ−抗体複合体がアクセスされにくく、コピー数は、ＮＦκＢのトラップに重要ではないことが示唆された。しかし、ＡＰ１配列を固定化したチップやＤＮＡを固定化しなかったネガティブコントロールからも３０−５０％程度の発色が見られたことから、ブロッキング条件を検討し特異性を向上させる必要があることが明らかとなった。
ｃ．ブロッキング条件の検討
ＥＬＩＳＡの特異性を向上させるため、種々のブロッキング剤の検討を行なった。ブロッキングバッファーとして、トリス系（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、スキムミルク系（５％スキムミルク，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ＢＳＡ系（５％ＢＳＡ，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ゼラチン系（２．５％ゼラチン，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ならびにエタノールアミン系（０．５Ｍエタノールアミン，１５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた。その結果、いずれも特異性に関して大きな差異が見られなかった（図６）。以後、非蛋白性のブロッキング剤としてトリスを用いた。また、ブロッキングの反応時間を室温１時間から、室温１時間の後に、４℃ Ｏ／Ｎのステップを加えることで測定間再現性を高めることが出来た。
ｉｉｉ．再現性の検討
前項で最適化された条件を用いてＤＬＣチップの同時再現性ならびに測定間再現性を検討した。その結果、同時再現性、測定間再現性において良好な成績を示した（図７）。
ｉｖ．ジーンダイヤＴＭ（ダイヤモンドチップ）とＤＬＣチップの比較
ａ．濃度変化による定量性の比較
ＤＬＣチップとジーンダイヤＴＭの性能を比較するために種々のＮＦκＢ濃度で同一条件で比較を行なった。その結果、ほぼ同様の定量性を示したが、低濃度域においてはジーンダイヤＴＭのほうがＮＦκＢ検出において優れていた（図８）。
ｂ．検出限界の比較
低濃度域（１０ｎｇ／ｍｌ）以下でのプロファイルを詳細に解析するために、それぞれのチップにおける検出限界の算定を試みた。その結果ジーンダイヤＴＭでは１．０ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌいずれにおいてもＰＲＤＩＩを固定化したチップは、ＡＰ１配列を固定した配列とＤＮＡを固定化しなかったチップに対して、有意差水準５％で有意差判定すると有意差が見られたが、ＤＬＣは１．０ｎｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）においてのみＡＰ１固定化チップならびにＤＮＡを固定化しなかったチップに対する有意差が見られた（図２．１．３−９）。また０．３３ｎｇ／ｍｌにおいてはＡＰ１固定化チップに対してのみ有意差が見られたことから、検出限界は、ＡＰ１をコントロールとした場合はいずれも０．３３ｎｇ／ｍｌ（６．７ｐＭ）以下であることが明らかとなった。従ってｐＭオーダーの低濃度サンプルからＮＦκＢを検出可能であることが示唆された。これらのことから他の転写因子に対しても同様に高感度なＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡシステムの構築が可能であると考えられる。
（Ｂ）トランスクリプションチップの応用
ｉ．細胞培養液からの転写因子の検出
ＨｅＬａ細胞の培養細胞抽出液から転写因子ＮＦκＢ ｐ５０を捕捉できるかどうかＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡを行ない検討した。その結果、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した細胞抽出液からは、ＴＮＦα刺激をしなかったコントロール細胞抽出液と比較して、ＰＲＤＩＩを固定化したチップから強く発色が見られた（図１０Ａ）。
その他の転写因子においてもＴＮＦα刺激、あるいはＰＭＡ刺激（１０ｎＭ）処理を行うことにより、種々の転写因子の発現量が変動するかどうか検討を行った。本法においては、ＡＰ標識２次抗体を用いた。その結果、ＮＦκＢ ｐ５０以外にも多くの転写因子（ＮＦκＢ ｐ６５、ｃ−Ｒｅｌ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＣＲＥＢ）を特異的に捕捉することができた（図１０Ｂ）。
ｉｉ．トランスクリプションチップのマイクロアレイ化
これまでに，ＤＮＡ２本鎖を固相に固定化して、ＤＮＡ結合蛋白質を捕捉しＥＬＩＳＡ法を用いて検出するという試みは行なわれているが、スループット性や多重同時検出数が限られるため、プロテオーム解析のための技術として問題は解決されていない。本項では、これらの方法に変わる技術としてＤＬＣチップを用いたトランスクリプションマイクロアレイチップの開発に関して報告する。
ａ．２本鎖ＤＮＡのアレイ化の検討
ＦＩＴＣ標識されたＰＲＤ ＩＩのオリゴヌクレオチドを９スポット固定化したＤＬＣチップをＣＲＢＩＯ ＩＩ蛍光スキャナーを用いて検出した（図１１）。アレイヤーを用いてスポットした場合も同様に２本鎖ＤＮＡを固定化できることが明らかとなった。
ｂ．トランスクリプションマイクロアレイチップからＮＦκＢの特異的検出
ＦＩＴＣラベルを行なわないＰＲＤＩＩ、ＡＰ１、ｐ５３、ＶＤＲＥ、ＲＡＲＥ、ＧＲＥ、ＴＲＥ、ＧＲＥ、ＥＲＥ以上９種のエレメント配列を含むオリゴヌクレオチドを同様にＤＬＣチップ上に固定化した。この９種の転写因子をアレイ化したＤＬＣチップにＮＦκＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、蛍光イムノアッセイにより検出を試みた。その結果ＮＦκＢの認識配列であるＰＲＤＩＩを含むオリゴヌクレオチドからのみ蛍光が検出された。以上のことから、ＮＦκＢはエレメント配列をアレイ化したＤＬＣチップ上で特異的に検出できることが明らかとなった（図１２）。従って、他のエレメント配列に結合する転写因子を特異的に認識する抗体を組み合わせることにより、一度に複数の転写因子を少量のサンプルから検出するシステムを構築することが可能となる。
ｉｉｉ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる転写因子の検出
転写因子をＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡで検出する方法は、特異的抗体を用いて同時に多くの転写因子を解析するシステムとしては、ＥＬＩＳＡやゲルシフトアッセイと比較した場合、スループットに優れた方法である。しかし、このシステムは既知の転写因子を検出することは可能であるが、未知蛋白質の同定は不可能である。現在のプロテオーム解析においては、未知蛋白質の同定は非常に重要な命題であることから、トランスクリプションチップを用いて蛋白質を同定する技術開発は非常に有用性が高いと考えられる。本項目では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ質量分析系を用いた転写因子の検出法の開発について報告する。
ａ．Ｏｎ Ｃｈｉｐ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法によるＮＦκＢのＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＲＭＦ）
チップ上でトリプシン分解を行うことは一般的には困難である。その原因として、疎水表面上での酵素活性の失活あるいは、立体障害による基質部位のマスク等が挙げられている。しかし、トランスクリプションチップは低塩濃度で２本鎖ＤＮＡが解離するため、ＤＮＡ蛋白質相互作用が低塩濃度では失われ容易にタンパク質が酵素反応液中に遊離されること、またチップ表面はＤＮＡが共有結合で固定されているため親水性を示すと考えられることからトランスクリプションチップはＯｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行う上で理想的なチップであると考えられた。２ｐｍｏｌ／ｃｈｉｐのＮＦκＢを添加・反応させた後、Ｏｎ ｃｈｉｐトリプシン分解を行った。その後、チップ上に存在するペプチドをＺｉｐ Ｔｉｐ精製チップにより精製しＭＡＬＤＩプレートで検出、あるいはトランスクリプションチップ上からの直接検出の２通りの方法を行った。
その結果、Ｏｎ ｃｈｉｐでトリプシン分解を行い、Ｚｉｐ Ｔｉｐにより精製後、ＭＡＬＤＩプレートに試料を添加した場合は理想的なペプチドマップが観察された（図１３）。またこれは、溶液中でトリプシン（４μｇ／ｍｌ）を用いてＮＦκＢを分解して観察されるペプチドマップと非常に良く一致していた（図１４）。このペプチドマスフィンガープリント情報をもとに、ＭＳ−ＦＩＴ Ｓｅａｒｃｈによりデータベース検索を行った結果、ＮＦκＢが非常に高いスコアでヒットしたことから、多くのＮＦκＢ由来ペプチドを捕捉していることが確認された（図１５）。
ｂ．ＰＭＦ法によるビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のＯｎ Ｃｈｉｐ検出・同定
次に５００ｆｍｏｌ／ｃｈｉｐのビタミンＤ受容体を、その認識配列であるエレメント配列ＶＤＲＥを固定化したチップでトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてＯｎ ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った後、ＭＡＬＤＩプレートにサンプルを添加したところ、ＮＦκＢ同様に溶液中でトリプシン分解を行った試料と同様にペプチドマップが得られた（図１６、図１７）。
一方、トランスクリプションチップ上に直接レーザー照射を行い、直接ペプチドマップを観察できるかどうかも試みた。その結果、チップ上から直接ＶＤＲのペプチドマップを観察することが出来た（図１８）。
ｃ．タンデムマススペクトル解析による転写因子の同定
ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）法は、質量分析により、試料中に含有されるタンパク質の同定に用いられるが、得られるスペクトルピーク数が少ないと、試料中に含まれる目的タンパク質の同定を行なうことは難しい。そこで、侠雑物を多く含んだ試料から、目的とするタンパク質を同定する場合、タンデムマススペクトル解析による同定がしばしば行なわれる。しかし、タンデムマススペクトルは一般的にペプチドマスフィンガープリント法と比較すると感度が低いことが難点であった。
ＮＦκＢを固定化したトランスクリプションチップから、質量補正して得られたペプチドマスフィンガープリント（図２１Ａ）から、１７０１．１０ｍ／ｚ，１８０８．０１ｍ／ｚ，２４１３．３５ｍ／ｚのピークについては、タンデムマス解析を行なった（図２１Ｂ，Ｃ，Ｄ）。それぞれのピークから、２次スペクトルを得ることが出来たことから、ＭＡＳＣＯＴデータベースサーチにこれらの分析結果を供した。その結果いずれのペプチドもＮＦκＢのデータベース上の質量データーと良く一致した（図２２）。以上の結果は、トランスクリプションチップがエレメントＤＮＡを介し、効率的にＮＦκＢを捕捉することが可能であり、その結果タンデムマス解析を行い得ることをしている。
（４）本発明の応用の可能性
（Ａ）トランスクリプションチップを用いた転写因子高感度定量検出
エレメント配列をＤＬＣチップあるいはジーンダイヤＴＭ上に固定化したチップ（トランスクリプションチップ）に蛋白質（転写因子）を捕捉させ、高感度で特異性の高い実験系を構築し、高感度な定量検出系を確立することが本研究の第一の大きな課題である。この課題を解決するためには、転写因子の捕捉能が高いＤＮＡ固定化チップを作製し、転写因子や抗体の非特異的結合をできる限り抑制できるアッセイ系の確立が重要であった。ブロッキング条件など結合反応条件の検討、固定化するＤＮＡ配列の検討を行うことで、以上の課題に対応した。
転写因子ＮＦκＢの認識配列（エレメント配列）部分は、コピー数よりむしろ、固定化した２本鎖ＤＮＡ内での位置が重要と思われる結果が得られた（図５）。２本鎖ＤＮＡのエレメント配列の位置が液層側から近いほうがＮＦκＢの捕捉能が高かった。オリゴヌクレオチドの表面側から離れた位置に存在する内部の認識配列は立体障害により転写因子−抗体複合体が形成されにくいことが示唆された。従って高感度な検出を実現する一般的な方法として、２本鎖オリゴヌクレオチドの表面側（固相化部位と反対側）近くにエレメント配列を設計することが転写因子の捕捉能に重要であると示唆された。固定化するＤＮＡにはオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物いずれも固定化が可能なことを明らかにしたことから、オリゴヌクレオチドを用いた通常のアッセイに加えて、ある特定の遺伝子領域をＰＣＲ法により取得し固定化することで、特定の遺伝子領域における転写開始複合体について将来解析可能になると考えられた。
アッセイの非特異的結合を減少させるためにはブロッキング条件の検討は重要であった。結合バッファー中のＢＳＡ濃度が１％の場合が最適な条件であった。また実験系構築時において、非特異的結合の影響と思われる陰性コントロールからのアッセイ値の上昇がしばしば見られたが、トリス緩衝液を用いたブロッキングの時間を長く取る（４℃、Ｏ／Ｎ）ことで、再現性が高い実験系を構築することができた（図７）。
以上の点を中心に検討した結果、最終的にジーンダイヤＴＭを用いた場合０．３３ｎｇ／ｍｌまで、ＤＬＣチップを用いた場合１．００ｎｇ／ｍｌまで検出限界が得られた。また、ＨｅＬａ細胞核抽出液を用いて、ＴＮＦα刺激や、ＰＭＡ刺激によって活性化された炎症系転写因子の蛋白質レベルのプロファイリングを行うことが可能となった。
（Ｂ）２本鎖ＤＮＡの高集積化（マイクロアレイ化）チップを用いた転写因子の検出
小規模な研究用途としては、従来の技術ですでに転写因子のプロファイリング・定量に関しては達成していると言えるが、今後のプロテオーム解析的な立場での診断・創薬への支援システムとしては、スループット性とサンプル消費量の点から考慮すると実用化には至っていない現状である。
本成果のＯｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡの結果で示したように３ｍｍ×３ｍｍサイズで定量的測定を可能にしたことから、カラススライド２枚程度のサイズで９６ウェルマイクロプレートと同数の定量的な高感度測定が可能としている。
さらに、Ｏｎ ｃｈｉｐ蛍光イムノアッセイにおいては、２本鎖ＤＮＡをマイクロアレイ化したトランスクリプションチップの作製を行うことで、２本鎖ＤＮＡを３ｍｍ×３ｍｍサイズのチップに９スポットのＤＮＡを固定化したチップからＮＦκＢがＰＲＤＩＩ配列に特異的に結合していることをモニターすることができた（図１２）。
（Ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた転写因子の検出・同定
質量分析計を用いて蛋白質を検出することで、ＥＬＩＳＡでは検出が困難な、未知蛋白質の検出・同定あるいは翻訳後修飾の解析などが可能となる。
現在、サイファージェン社ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた蛋白チップシステムが市販化されており、このシステムを用いて、抗体を固定化した蛋白チップが開発されているが、スループット性、質量分析精度の点においては十分とはいえない。
一方、ＤＮＡを固定化したトランスクリプションチップに関しても、転写因子は一般的に分子量が５万程度のものが多く、質量情報から同定を行うのは現在の質量分析計の精度では困難であった。そこで、トリプシン分解によるペプチドマスフィンガープリント法を用いて、ＤＮＡを高密度に固定化可能なダイヤモンド（ＤＬＣ）チップとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いたシステムを用いれば、チップ上から直接転写因子の分子の質量情報を取得できるのではないかと考え、検出システムを作成した結果、初めてチップ上からの直接転写因子の検出・同定を実現をすることができた（図１８）。さらには、タンデムマススペクトル解析と組み合わせることで、チップに捕捉した転写因子の検出・同定を行なうことが可能となった（図２１）。
本発明によれば、ｏｎ ｃｈｉｐ ＥＬＩＳＡにより高感度なトランスクリプションチップを用いた多数の転写因子のプロファイリングが実現され、培養細胞抽出液や組織から転写因子を高感度に検出・定量化が可能となり、創薬時における、スクリーニングや毒性予測のツールとして、あるいは診断情報のツールとして使用可能である。
また、ペプチドマスフィンガープリント法を用いて直接チップ上から転写因子の同定を行うことが可能である。さらに、タンデムマススペクトル解析が可能であったことから、侠雑物を含む試料中からの転写因子の同定を行い得る。
イオン化レーザーの焦点位置に対応するトランスクリプションチップ（図１９）を用いることで従来から用いられているＭＡＬＤＩプレート以上の感度ならびに精度を保持した転写因子の検出．同定が行い得る。
本発明により、効率的に転写因子をプロファイリングすることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが基板上に固定化されてなるトランスクリプションチップ。
【請求項２】
各々に転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも２つのポリヌクレオチドが結合してなる請求項１に記載のチップ。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を有する請求項１に記載のチップ。
【請求項４】
前記基板が支持体上にダイヤモンド薄膜を形成したものである請求項１に記載のチップ。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがダイヤモンド薄膜と任意に適当なスペーサーを介して結合したものである請求項１に記載のチップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のトランスクリプションチップに転写因子を含み得る試料を作用させる工程を含む、転写因子の結合をアッセイする方法。
【請求項７】
前記試料が被験物質の存在下で培養された細胞の細胞溶解物である、被験物質の転写因子に対する影響を評価するための請求項６に記載の方法。
【請求項８】
転写因子の結合を転写因子に対する抗体または質量分析を利用した方法を用いて検出する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
抗体を用いた検出がＥＬＩＳＡ法であり、質量分析を利用した方法がペプチドマスフィンガープリント法である請求項８に記載の方法。
【請求項１】
転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが基板上に固定化されてなるトランスクリプションチップ。
【請求項２】
各々に転写因子が結合し得る１以上のエレメント配列を含む少なくとも２つのポリヌクレオチドが結合してなる請求項１に記載のチップ。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが各遺伝子の上流（５’）側のプロモーターの部分配列を有する請求項１に記載のチップ。
【請求項４】
前記基板が支持体上にダイヤモンド薄膜を形成したものである請求項１に記載のチップ。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがダイヤモンド薄膜と任意に適当なスペーサーを介して結合したものである請求項１に記載のチップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のトランスクリプションチップに転写因子を含み得る試料を作用させる工程を含む、転写因子の結合をアッセイする方法。
【請求項７】
前記試料が被験物質の存在下で培養された細胞の細胞溶解物である、被験物質の転写因子に対する影響を評価するための請求項６に記載の方法。
【請求項８】
転写因子の結合を転写因子に対する抗体または質量分析を利用した方法を用いて検出する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
抗体を用いた検出がＥＬＩＳＡ法であり、質量分析を利用した方法がペプチドマスフィンガープリント法である請求項８に記載の方法。
【図２１】
【図２２】
【図２２】
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７８４
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６２４２（Ｐ２００５−５０６２４２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６７９６
【国際出願日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６７９６
【国際出願日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
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