トランスフェクション剤としてのリポポリアミン及びその医薬的使用
【課題】ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション、特に核酸のベクター導入に有効に使用可能な新規化合物を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、Ｒ４は一般式（ＩＩ）の基を表し、式中、Ｒ６及びＲ７はＣ１０〜Ｃ２２脂肪族基などを表し、Ｒ５は置換された天然アミノ酸側鎖などを表す。
【解決手段】式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、Ｒ４は一般式（ＩＩ）の基を表し、式中、Ｒ６及びＲ７はＣ１０〜Ｃ２２脂肪族基などを表し、Ｒ５は置換された天然アミノ酸側鎖などを表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポポリアミンファミリーに属する新規化合物、該化合物を含有する医薬組成物、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのためのその適用並びにその製造方法に関する。
【発明の開示】
【０００２】
多数の遺伝病は１種以上の核酸の発現障害及び／又は異常発現即ち発現不足又は過剰発現に関連している。遺伝子治療はクローン化遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞発現によりこのような遺伝異常を治療することを主眼とする。
【０００３】
今日、この種の遺伝情報の細胞内送達方法として数種の方法が提案されている。特に、化学的又は生化学的ベクターを利用するものが挙げられる。合成ベクターはトランスフェクトしようとするＤＮＡを圧縮する機能と、その細胞固定並びにその細胞質膜及び場合により２つの核膜通過を助長する機能との２つの主機能をもつ。
【０００４】
このトランスフェクション方法は、カチオン脂質の利用に基づく技術の開発により著しい進歩を遂げた。例えば、正電荷をもつカチオン脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、負電荷をもつＤＮＡとリポソーム又は小ベジクル形態で自然に相互作用し、細胞膜と融合することが可能な脂質−ＤＮＡ複合体を形成し、こうしてＤＮＡの細胞内送達を可能にすることが判明した。しかし、この分子はトランスフェクションの点では有効であるが、非生分解性であり、細胞に毒性であるという欠点がある。
【０００５】
ＤＯＴＭＡ以来、所謂「スペーサー」アームを介してアミノ基に結合した親油基というこの構造モデルで他のカチオン脂質も開発された。そのうちでは、親油基として２個の脂肪酸又は１個のコレステロール誘導体を含み、更に、場合によりアミノ基として第４級アンモニウム基を含むものを挙げることができる。このカチオン脂質の分類の代表例として、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＢＴ又はＣｈＯＴＢを特に挙げることができる。この他、ＤＯＳＣやＣｈＯＳＣ等のように、第４級アンモニウム基の代わりにコリン基の存在を特徴とする化合物もある。しかし、一般にこれらの化合物のトランスフェクション活性は依然としてかなり低い。
【０００６】
別の分類のカチオン脂質であるリポポリアミンも報告されている。本発明の意味では、リポポリアミンなる用語は所謂スペーサー領域を介して親油領域と結合した少なくとも１個の親水ポリアミン領域を含む両親媒性分子を意味する。リポポリアミンの正電荷をもつポリアミン領域は負電荷をもつ核酸と可逆的に結合することができる。この相互作用は核酸を著しく圧縮する。親油領域は脂質膜から形成される核脂質粒子を覆うことにより、このイオン相互作用を外部媒質に対して非感受性にする。この種の化合物では、カチオン基は２個の第１級アンモニウム基と２個の第２級アンモニウム基との４個のアンモニウム基を含むＬ−５−カルボキシスペルミン基により置換することができる。この種の化合物としては特にＤＯＧＳとＤＰＰＥＳが挙げられる。これらのリポポリアミンは一次内分泌細胞のトランスフェクションに特に有効である。
【０００７】
実際に、理想的な合成トランスフェクション剤は広い細胞範囲で高いトランスフェクションレベルをもち、使用用量で無毒性であるか又は非常に低毒性であり、更に処理細胞のレベルで副作用が全くないように生分解性でなければならない。
【０００８】
本発明は詳細には、独自のポリアミンフラクションをもち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション、特に核酸のベクター導入に有効に使用可能な新規リポポリアミンを提案することを目的とする。
【０００９】
本発明の第１の目的は一般式Ｉ：
【００１０】
【化６】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、
ｑはＲ１、Ｒ２及びＲ３の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
Ｒ及びＲ’は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ’−ＮＨ２基を表し、ｑ’はＲ及びＲ’の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
ｍ、ｎ及びｐは各々独立して０〜６の整数を表し、但しｎが２以上のとき、ｍは異なる値をとることができ、Ｒ３は一般式Ｉ中で異なる意味をもち、
Ｒ４は一般式ＩＩ：
【００１１】
【化７】
の基を表し、式中、
Ｒ６及びＲ７は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２脂肪族基を表し、２個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
ｕは０〜１０から選択される整数であり、但しｕが２以上の整数であるとき、Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びｒは各モチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ５）ｒ−Ｙ］中で異なる意味をもつことができ、
Ｘは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
Ｒ５は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
ｒは１〜１０の整数を表し、但しｒが１であるとき、Ｒ５は天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが２以上であるとき、Ｒ５は水素原子を表す］により表されることを特徴とするＤ、Ｌ又はＤＬ形リポポリアミン及びその塩を提供することである。
【００１２】
天然アミノ酸側鎖とは、特に本発明の意味では例えばアルギニン側鎖のようにアミジニウムモチーフを含む鎖を意味する。上述のように、この鎖は飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２４直鎖、分枝鎖もしくは環状脂肪族基（例えばコレステリル基、アラキドニル基又はレチノイル基）又はモノもしくはポリ芳香族基（例えば置換又は非置換ベンジルオキシカルボニル、ベンジルエステル及びローダミニル誘導体）により置換されていてもよい。
【００１３】
一般式（Ｉ）のこれらの新規生成物は医薬的に許容可能な非毒性塩の形態をとることができる。これらの非毒性塩は鉱酸（塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸又は蓚酸）、無機塩（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム）又は有機塩（トリエチルアミン、ピペリジン、ベンジルアミン等の第３級アミン）との塩を含む。
【００１４】
本発明による化合物の例としては、特に下記亜一般式：
【００１５】
【化８】
（式中、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は上記と同義である）の化合物を挙げることができる。上記式中、好ましくはＲ４はＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６及びＲ７は亜式ＩＩＩ〜ＸＩＩにおいて（ＣＨ２）１７ＣＨ３、（ＣＨ２）１１ＣＨ３、（ＣＨ２）１３ＣＨ３又は（ＣＨ２）１２ＣＨ３から選択される同一基を表す。
【００１６】
特に有利な態様において、本発明の化合物は該化合物が結合した核酸の移送を指向させることが可能なターゲティング成分を更に含む。好ましくは、このターゲティング成分はＲ５置換基により表されるアミノ酸側鎖のレベルで一般式Ｉの化合物に組み込まれる。より好ましくは、ターゲティング成分は本発明による化合物に共有又は非共有的に結合される。
【００１７】
このようなターゲティング成分としては、所定細胞型又は所望の所定組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）に核酸の移送を指向させることが可能な細胞外ターゲティング成分が挙げられる。例えば、標的細胞型の表面に存在する細胞レセプターのリガンドが挙げられ、例えば糖、葉酸、トランスフェリン、インスリン、アシアロオロソムコイドタンパク質又は細胞外レセプターにより認識される任意の生物活性分子等である。また、例えばトランスフェクトされるＤＮＡを核の内部に優先的に蓄積する核局在シグナル配列（ｎｌｓ）のように、所定の優先的細胞区画（ミトコンドリア、核等）に向けて核酸移送を指向させることが可能な細胞内ターゲティングでもよい。
【００１８】
より一般には、本発明の範囲で利用可能なターゲティング成分としては糖類、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ステロイド又は脂質が挙げられる。好ましくは、糖類及び／又はペブチド（例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞レセプターのリガンド又はそのフラグメント、レセプター又はレセプターフラグメント等）である。特に、成長因子レセプター、サイトカインレセプター、細胞レクチンレセプター又は接着タンパク質レセプター（例えばインテグリン）のリガンドが挙げられる。また、トランスフェリンのレセプター、脂質ＨＤＬ及びＬＤＬも挙げられる。ターゲティング成分は更に、アシアロ糖タンパク質レセプター等のレクチンをターゲティングすることが可能な糖や、イムノグロブリンのＦｃフラグメントのレセプターをターゲティングすることが可能な抗体Ｆａｂフラグメントでもよい。
【００１９】
同様に、一般式Ｉの化合物の例えばアミノ酸側鎖Ｒ５にビオチン、ローダミン、葉酸型のマーカー物質を結合することも考えられる。このマーカー物質は更に、インテグリン型の接着タンパク質の一次及び／又は二次レセプターの認識エピトープ
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む直鎖又は環状ペプチド又はプソイドペプチド配列でもよい。
【００２０】
本発明のリポポリアミンの例としては、後記実施例に詳細に記載する下記化合物を特に挙げることができる。
【００２１】
【化９】
【００２２】
本発明の特に代表的な化合物としては、下記一般式の化合物を特に挙げることができる。
【００２３】
【化１０】
【００２４】
本発明の範囲内で、本発明によるリポポリアミンを誘導する非対称官能化ポリアミンを製造するための新規固相方法も開発された。
【００２５】
従来、非対称官能化ポリアミンの製造は直鎖又は分枝鎖対称ポリアミンに選択的に修飾を導入する必要により制限されている。ポリアミンの第１アミノ基と第２アミノ基の化学的差異により、アルキル化、ミカエリス型付加又はアシル化等の反応を実施するためには高い選択性が必要である。更に、このような化学的差異により要求される選択性は、ポリアミンで行われるような複数の第１及び第２アミン群での選択的アシル化に適合しない。このような制約に対する従来の対応は、「ポリアミノ化」することが可能なアミノ基と適当に保護された非対称官能基をもつモノマーブロックから非対称官能化ポリアミンを構築する方法であった。従って、このアプローチには複数段階からなる面倒な合成ストラテジーが必要であり、特に官能基の直交保護が必要であった。
【００２６】
本発明の範囲内で開発された方法は、詳細には上記型の合成に伴う従来の欠点を解消するを目的とする。この方法は、対称ポリアミンのアルキル化又は還元アルキル化により一次アミノ基のみで選択的に官能化されたポリアミンを容易且つ迅速に得られるという顕著な利点がある。
【００２７】
本発明の方法の原理は固相合成法の利用に基づき、アルキル化剤とポリアミンの二分子反応を助長し、ポリアミンのポリアルキル化を回避する。より詳細には、本発明は固体支持体に共有結合したアルキル化剤と対称ポリアミンの二分子反応により予め得られた少なくとも１個の非対称ポリアミンフラクションに少なくとも１個の脂質フラクションを結合することを特徴とする方法に関する。このアプローチによると、アルキル化剤はエステル化又はアミド化によりポリマー支持体に共有結合している。対称ポリアミンは二分子反応により固相アルキル化剤と反応し、支持体に結合した単官能化非対称ポリアミンを生じる。生成物の遊離アミンは一般にＢＯＣ又はＺ型の保護基により固相で保護されており、最終的に生成物は固相支持体から分離される。これらのポリアミノ酸を適宜脂質フラクションに結合すると、所望のトランスフェクション剤が得られる。この結合には、例えばＢＯＰ、Ｐｙｂｏｐ、ＢｏｐＣｌ及びＤＣＣ等の慣用ペプチド結合剤を利用することができる。本方法は、場合によりトレーサーペプチド、糖類又は蛍光プローブを分子に導入して完全トランスフェクション剤を固体支持体に結合することも可能である。当然のことながら、遊離リポポリアミンにこの型のグラフトを実施できることが判明した。
【００２８】
本方法の実施可能性は、複数の直鎖又は分枝鎖非対称官能化ポリアミノ酸の合成により立証された。
【００２９】
本発明は更に、上記のようなリポポリアミンの直接又は医薬組成物としての任意の治療的適用にも関する。
【００３０】
上述のように、一般式Ｉの化合物は核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに特に有利であることが判明した。これらの化合物はＤＮＡを有効に圧縮し、非常に低毒性であるという利点がある。
【００３１】
本発明の組成物から最大限の効果を得るためには、核酸の負電荷に対する該当リポポリアミンの正電荷の比であるＲ比が最適となるように、一般式Ｉの化合物と核酸の夫々の比率を決定することが好ましい。この最適比は特にｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの使用方式や、トランスフェクトしようとする細胞型により異なり、場合に応じて最適化される。この最適化は当業者に自明である。
【００３２】
本発明の医薬組成物において、ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸でもリボ核酸でもよい。天然又は人工起源のいずれの配列でもよく、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列又は修飾もしくは非修飾オリゴヌクレオチドの合成もしくは半合成配列が挙げられる。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス等に由来するものであり得る。これらの核酸は当業者に公知の任意方法により得られ、特に、バンクスクリーニング、化学的合成又はバンクスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混合方法により得られる。更に、プラスミドベクター等のベクターに組み込んでもよい。
【００３３】
特にデオキシリボ核酸については、１本鎖でも２本鎖でもよいし、短いオリゴヌクレオチドでもより長い配列でもよい。これらのデオキシリボ核酸は治療遺伝子、転写又は複製調節配列、修飾又は非修飾アンチセンス配列、他の細胞成分との結合領域等を含み得る。
【００３４】
本発明の意味では、治療遺伝子とは特に治療効果をもつタンパク質産物をコードする任意遺伝子を意味する。こうしてコードされるタンパク質産物はタンパク質、ペプチド等であり得る。このタンパク質産物はターゲット細胞に対して同種であり得る（即ちターゲット細胞が疾病をもたないときにターゲット細胞で正常に発現される産物）。この場合、タンパク質の発現は例えば細胞における不十分な発現や、不活性であるか又は修飾により弱活性となったタンパク質の発現を解消し、あるいは前記タンパク質を過剰発現させることができる。治療遺伝子は安定性の増加、活性改変等の性質をもつ細胞タンパク質の突然変異体をコードするものでもよい。タンパク質産物はターゲット細胞に対して異種でもよい。その場合には、発現されるタンパク質は例えば細胞に欠失している活性を補充又は付加し、疾病に対抗するこ又は免疫応答を刺激することができる。
【００３５】
本発明の意味での治療物質としては、より特定的には酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（仏国特許出願第９２０３１２０号））、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等、ジストロフィン又はミニジストロフィン（仏国特許出願第９１１１９４７号））、膵臓線維症に関連するタンパク質ＣＦＴＲ、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等（仏国特許出願第９３０４７４５号））、凝血に関与する因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡの修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他の輸送タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されるアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、代謝酵素（例えばリポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−α−コレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ）、脂質輸送タンパク質（例えばコレステロールエステル輸送タンパク質やリン脂質輸送タンパク質）、ＨＤＬ結合タンパク質又は例えばＬＤＬレセプター、レムナントキロミクロンレセプター及びスカベンジャーレセプター等から選択されるレセプターを挙げることができる。
【００３６】
治療核酸は更に、ターゲット細胞で発現されると遺伝子発現又は細胞ｍＲＮＡ転写を調節することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は、ヨーロッパ特許第１４０３０８号に記載の技術により、例えば細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡターゲット細胞に転写され、こうしてそのタンパク質翻訳を阻止することができる。治療遺伝子は更に、ターゲットＲＮＡを選択的に破壊することが可能なリボソームをコードする配列も含む（ヨーロッパ特許第３２１２０１号）。
【００３７】
上述のように、核酸は更に、ヒト又は動物で免疫応答を発生することが可能な抗原ペプチドをコードする１個以上の遺伝子を含んでいてもよい。従って、この特定態様によると、本発明はヒト又は動物で特に微生物、ウイルス又は癌に対するワクチン又は免疫治療を実現することができる。特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ヨーロッパ特許第１８５５７３号）、偽狂犬病ウイルス、シンシチウム形成ウイルス、他のウイルスの特異的抗原ペプチド又は腫瘍特異的抗原ペプチド（ヨーロッパ特許第２５９２１２号）を挙げることができる。
【００３８】
好ましくは、核酸は更に細胞又は所望臓器において治療遺伝子及び／又は抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列も含む。このような配列としては、これらの配列が感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与する配列が挙げられる。異なる起源の配列でもよい（他のタンパク質の発現に関与、あるいは合成配列でもよい）。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、感染させようとする細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。また、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化配列や調節配列等を付加してこれらの発現配列を修飾してもよい。誘導又は抑制プロモーターでもよい。
【００３９】
更に、核酸は合成治療物質をターゲット細胞の分泌経路に導くシグナル配列も特に治療遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。核酸は更に合成治療物質を細胞の特定区画に導くシグナル配列も含んでいてもよい。
【００４０】
別の態様において、本発明は核酸と、本発明のリポポリアミンと、リポポリアミン／核酸複合体に結合してトランスフェクション能を改善することが可能なアジュバントを含む組成物に関する。本願出願人は実際に、リポポリアミン／核酸複合体に結合することが可能な所定のアジュバント（例えば脂質、ペプチド又はタンパク質）の存在下でリポポリアミンのトランスフェクション能を予想外に増加できることを立証した。
【００４１】
この点で、本発明の組成物はアジュバントとして１種以上の中性脂質を含み得る。このような組成物は特にＲ比が小さいときに特に有利である。本願出願人は実際に、中性脂質を加えると核脂質粒子の形成を改善し、驚くべきことに細胞膜を撹乱して粒子の細胞侵入を助長できることを立証した。
【００４２】
より好ましくは、本発明の範囲内で使用する中性脂質は２個の脂肪鎖をもつ脂質である。
【００４３】
生理的条件下で両性イオン性又はイオン電荷をもたない天然又は合成脂質を使用すると特に有利である。脂質は特にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン及びその１〜３倍Ｎ−メチル化誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（例えば特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（例えば特にスフィンゴミエリン）又はアシアロガングリオシド（例えば特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択することができる。
【００４４】
これらの種々の脂質は当業者に周知の慣用技術により合成するか又は臓器（例えば脳）もしく胎児から抽出することにより得られる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒を用いて実施することができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ参照）。
【００４５】
ごく最近になって本願出願人は前記核酸の凝縮レベルに直接又は間接的に作用する化合物をアジュバントとして使用すると特に有利であることも立証した（ＷＯ９６／２５５０８）。
【００４６】
リポポリアミンをベースとするトランスフェクション組成物中にこのような化合物が存在すると、この組成物の量を著しく低減でき、この組成物のトランスフェクション活性を損なわずに毒物学的面で有益な結果が得られる。それどころか、組成物のトランスフェクションレベルは向上するという利点がある。
【００４７】
核酸の凝縮レベルに作用する化合物とは、核酸を直接又は間接的に圧縮する化合物として定義される。より詳細には、この化合物はトランスフェクトしようとする核酸のレベルに直接作用するか、又はこの核酸の凝縮に直接関与する付加化合物のレベルに作用することができる。核酸のレベルに直接作用するものが好ましい。
【００４８】
好ましい態様によると、核酸の凝縮レベルに作用するこの物質は全体又は一部をペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／又は（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフ数は２〜１０である。本発明による化合物の構造において、これらのモチーフは連続又は不連続的に反復し得る。従って、これらのモチーフは生化学的結合（例えば１個以上のアミノ酸）又は化学的結合により分離することができる。このような物質は全体又は一部がヒストン、ヌクレオリン、プロタミン及び／又はそれらの誘導体の１種から誘導されるものでもよい。
【００４９】
好ましくは、本発明の組成物は核酸１当量当たりアジュバント０．０１〜２０当量（重量／重量）、より好ましくは０．５〜５当量を含む。
【００５０】
本発明による組成物は局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は特に所望臓器のレベルに直接注射するための注射用製剤又は局所投与（皮膚及び／又は粘膜）用として医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。このようなキャリヤーとしては、特に等張滅菌溶液又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えると注射可能な溶質を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。注射に使用する核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて選択できる。特に投与方法については、組織又は循環経路への直接注射や、培養細胞処理後の注射又は移植によるｉｎ ｖｉｖｏ再移植が挙げられる。
【００５１】
従って、本発明は上記条件下で上記疾病を治療することが可能な核酸と一般式Ｉの化合物のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ併用投与を特徴とする、疾病治療に特に有利な方法を提供する。より詳細には、この方法はタンパク質又は核酸産物の不足に起因する疾病に適用することができ、投与する核酸は前記タンパク質産物をコードするか又は前記核酸産物を含む。
【００５２】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞トランスフェクションのための本発明のリポポリアミンの全使用に及ぶ。
【００５３】
以下、実施例及び図面により本発明をより詳細に説明するが、これらの説明は例示に過ぎず、本発明を制限するとみなすべきではない。
【００５４】
略語及び記号
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＢＯＣ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：ジシクロヘキシル尿素
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＯＤＡ：ジオクタデシルアミン
ＥＰ：石油エーテル
ＥｔＯＨ：エタノール
ＮＥｔ３：トリエチルアミン
Ｒｆ：前端保持率
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳ：テトラメチルシラン
ＵＶ：紫外線
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
ＣｌＺ：ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル
Ａ−化学合成用材料及び方法
１．材料
ａ）化合物
−出発ポリアミンは例えばスペルミジン、スペルミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、フェニレンジアミン、ジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）等の市販品でもよいし、分枝鎖ポリアミン製造用として市販されている例えばジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）、アミン、スペルミジン、スペルミン等のアミンの完全なシアノエチル化により常法で合成してもよい。
−アルキル化剤はアルキル化方法に応じて次のように選択される。慣用アルキル化にはブロモ酢酸、ω−ハロゲノカルボン酸を使用し、還元アルキル化にはω−アルデヒドカルボン酸（例えばグリオキサル酸、コハク酸準アルデヒド等）又はケト酸（例えばアセト酢酸又はピルビン酸等）を使用する。
−使用するポリマーは固相ペプチド合成（メリフィールド合成）用に市販されている樹脂、例えば遊離酸基をもつ生成物を提供するＯ−クロロトリチルクロリド樹脂、ＨＭＰ樹脂や、Ｒｉｎｋ型樹脂である。ポリアミノ酸は、固相で予備合成したブロモアルキル基をもつペプチド又はω−アルデヒド酸で直接合成することができる。
−Ａｌｄｒｉｃｈ製品ジオクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ＢＯＰ、ＤＭＡＰ、クロロギ酸ベンジルは市販品である。ＮａＣｌ及びＮａＨＣＯ３溶液は飽和溶液であり、ＫＨＳＯ４溶液は０．５Ｍである。
ｂ）物理的測定
陽子ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ ４００スペクトロメーターで６００ＭＨｚで記録した。
【００５５】
質量スペクトルはＡＰＩ−ＭＳ／ＩＩＩで測定した。
ｃ）クロマトグラフィー技術
ＨＰＬＣ分析はＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ装置にオート
サンプラーＡＳ−２０００Ａ、インテリジェントポンプＬ−６２００Ａ及び紫外−可視検出器Ｌ−４０００を取り付け、分析用分離には２２０ｎｍ、分取用分離には２３５ｎｍの波長に調節して実施した。分析用分離カラムはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＢＵ−３００ ａｑｕａｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ ７ｍ，３００Ａ ３００×４．６ｍｍカラムを使用し、分取用分離カラムはＢｉｏｒａｄ製Ｂｉｏｓｉｌ Ｃ１８ ＨＬ ９０−１０ ２５０×１０ｍｍカラムを使用した。移動相はＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）である。分析用分離流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、分取用分離流速は４ｍｌ／ｍｉｎに調節する。
【００５６】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は厚さ０．２ｍｍのＭｅｒｃｋシリカゲルプレートで実施した。
【００５７】
カラムクロマトグラフィーは粒度０．０６３〜０．２００ｍｍのシリカゲル６０ Ｍｅｒｃｋで実施した。
【００５８】
カラムクロマトグラフィーの検出は紫外線（２５４ｎｍ）を用いるか、アミン又はアミドの検出にはニンヒドリンを用いて１５０℃に加熱しながらニンヒドリンのエタノール溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌ ＥｔＯＨ）を噴霧（弱いスプレー）し、第１級アミンの検出にはフルオレサミンを用いて溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌアセトン）を噴霧し、あるいはヨードを用いてヨード粉末でプレートを覆うことにより実施した。
【００５９】
カラムクロマトグラフィーは粒度０．０６３〜０．２００ｍｍのシリカゲル６０ Ｍｅｒｃｋで実施した。
ｄ）固相合成ＳＰＰＳ法
固相合成は手動製造用ＳＰＰＳペプチド合成用手動反応器で実施し、撹拌機はＦｌａｓｋ Ｓｈａｋｅｒ モデルＡ５−６０２１である。ＳＰＰＳでポリアミンの固相結合及びポリアミンの保護後にＫａｉｓｅｒ試験を行う［Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．，Ｃｏｌｅｓｃｏｌｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｏｓｓｉｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．及びＣｏｏｋ，Ｐ．Ｉ． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（２），５９５（１９７０）］。実施例でＳＰＰＳに使用した樹脂はスイス、ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ製クロロトリチルクロリド樹脂である。
２．一般操作方法
ａ）（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアミノプロピル）−１−４−ジアミノブタンの製造により例示する対称ポリアミンの合成
２リットル容三頚丸底フラスコに１−４−ジアミノブタン１４７ｇと脱イオン水１０００ｍｌを仕込む。溶液を磁気撹拌する。温度を３８℃に維持しながら等圧フラスコによりアクリロニトリル４４３ｇを１時間かけて加える。次いで還流冷却器を取り付け、１時間かけて混合物を水浴で８０℃まで昇温させる。フルオレサミン試験は陰性であり、過剰のアクリロニトリルを４０℃で減圧蒸発させる。
【００６０】
２相が得られる。下部の有機相を分離し、水３００ｍｌで洗浄し、１０００ｍｌ容丸底フラスコに移す。水／メタノール（１：１ｖ／ｖ）混合物１７０ｍｌを加える。一晩結晶化させる。翌日、結晶を細孔度３の５００ｍｌ容ガラス濾過器で濾過する。
【００６１】
ケーキをガラス濾過器でメタノール（２×１７０ｍｌ）とエーテル（２×１５０ｍｌ）で洗浄する。生成物を減圧デシケーター（２６ｍｍ）で一晩連続乾燥する。こうして生成物４６１ｇ（収率９３％）が得られる。生成物をＮＭＲとＭＳにより分析した処、分析値は整合していた。生成物を精製せずに水素化する。
【００６２】
１リットル容イノックスオートクレーブに上記ポリニトリル３０ｇ（０．１モル）を仕込む。同時にビーカーでエタノール１４０ｍｌ（９５％）とＮａＯＨ８ｇ（０．２モル）の溶液を調製する。ＮａＯＨが可溶化したらこの溶液をオートクレーブに加える。オートクレーブに窒素を通し、炭素担持ラネーニッケル８ｍｌを加える。オートクレーブを閉じる。初期水素化圧は５２気圧であり、周囲温度で５時間かけて２８．５気圧まで下げる。懸濁液を濾紙で濾過し、濾渣をエタノール（２×２５ｍｌ）で洗浄し、濾液を減圧乾燥して濃縮する。油状物を水３０ｍｌと混合し、ＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌで抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した後、減圧蒸発させる。黄色っぽい液体油状物（２７ｇ、収率８５％）が得られる。
【００６３】
生成物をＴＬＣ（単スポット）、ＮＭＲ及びＭＳにより分析した処、分析値は整合していた。生成物を精製せずに使用する。
ｂ）方法Ａ：酸基のポリマー支持体固定
クロロトリチルクロリド樹脂（５ｇ、１．２ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ樹脂）をＳＰＰＳ反応器に仕込み、ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌを加え、混合物を５分間撹拌する。ブロモ酢酸（１．０５ｇ、７ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（０．９５ｍｌ，７．５ｍｍｏｌ）を加える。反応器を周囲温度で２時間撹拌する。液体を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０）及びＭｅＯＨ（２×５０ｍｌ）で洗浄する。最後に樹脂を窒素流下に乾燥する。
ｃ）方法Ｂ：ポリアミンとブロモアセチル樹脂の反応
ポリアミン（１０モル倍）をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌに溶かし、方法Ａにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を周囲温度で２時間撹拌する。溶媒を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０ｍｌ）で洗浄すると、Ｋａｉｓｅｒ試験は陽性である。
ｄ）樹脂上のポリアミノ酸の保護
方法Ｃ：
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４８ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（５０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）に溶かし、方法Ｂにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を一晩撹拌する。翌日、Ｋａｉｓｅｒ試験は陰性である。溶媒を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×５０ｍｌ）及びエーテル（２×５０ｍｌ）で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。Ｋａｉｓｅｒ試験は依然として陰性である。
方法Ｄ：
方法Ｂにより得られた樹脂（１．５ｇ）を丸底フラスコに入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）、次いでＤＩＥＡ（２０ｍｍｏｌ）を加える。混合物を磁気撹拌し、クロロギ酸ベンジル（１４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下する。ｐＨはＤＩＥＡを加えて１１に維持する。一晩後、樹脂をＳＰＰＳ反応器に移し、濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×２０ｍｌ）及びエーテル（２×２０ｍｌ）で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。
ｅ）方法Ｅ：樹脂からの保護ポリアミノ酸の分離
磁気棒を備える２５０ｍｌ容丸底フラスコに、方法Ｃ及びＤにより得られた樹脂を加える。ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌとＣＦ３ＣＨ２ＯＨ ２５ｍｌからなる溶液を加え、混合物を２時間撹拌する。溶液を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）で洗浄し、こうして得られた有機相を集めて減圧蒸発させる。次に、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）を溶離剤としてＳｉＯ２上でフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製する。生成物を含むフラクションをＴＬＣにより同定する。（詳細については下記実施例参照。）
ｆ）方法Ｆ：アミノ酸とジリピジルアミンの結合
Ｂｏｃ−アミノ酸（１０ｍｍｏｌ）とＣ１２〜Ｃ２２ジリピジルアミン（１０ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌ容丸底フラスコに加える。ＣＨＣｌ３（１００ｍｌ）を加え、完全に溶解するまで混合物を撹拌する。次いでＴＥＡ（３０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（３３ｍｍｏｌ）を加える。ＴＥＡを加えてｐＨを１０に維持し、反応物を２時間撹拌する。反応の完了後（ＴＬＣ）、クロロホルムを蒸発させ、固形分を酢酸エチル（３００ｍｌ）にとる。有機相をＫＨＳＯ４（４×１００ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（４×１００ｍｌ）及びＮａＣｌ（４×１００ｍｌ）で洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をＴＬＣ、ＮＭＲ及びＭＳにより分析し、精製せずに使用する。収率は約９０％である。
ｇ）保護ポリアミノ酸とジリピジルアミド酸の結合と、Ｂｏｃ及びＺ保護基の分離
方法Ｇ：
方法Ｆにより得られた生成物（９ｍｍｏｌ）を磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、冷ＴＦＡ（４℃）を加える（３０ｍｌ）。溶液を１時間撹拌する。ＴＦＡを減圧蒸発させる。ＤＭＦ（７０ｍｌ）を加えて生成物を溶かす。ＴＥＡ（３０ｍｍｏｌ）を加えた後、方法Ｅにより得られた保護ポリアミノ酸（９ｍｍｏｌ）を加える。ｐＨを１０に調整し、ＢＯＰ（３３ｍｍｏｌ）を加える。溶液を２時間撹拌後、ＴＬＣを行う。結合の完了後（ＴＬＣ）、ＫＨＳＯ４溶液（７００ｍｌ）を加え、生成物を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出する。有機相をＫＨＳＯ４（３×５０）、ＮａＨＣＯ４（３×５０）及びＮａＣｌ（３×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をＮＭＲ、ＴＬＣ及びＭＳにより分析し、予備精製せずに脱保護する。ＴＦＡ（５０ｍｌ）を生成物に加え、溶液を１．５時間撹拌し、ＴＦＡを蒸発させる。生成物がＴＦＡで分離可能なＺ又はＣｌＺ基をまだ含んでいる場合には、方法Ｈを直接実施する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製する（実施例参照）。
方法Ｈ：
方法Ｇにより得られた生成物がＺ又はＣｌＺ基を含んでいる場合には、磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、１０ｍｌ ＭｅＯＨ／ｇ生成物に溶かす。Ｐｄ／Ｃ（１０％、１ｇ／ｇ生成物）とギ酸アンモニウム（１ｇ／ｇ生成物）を周囲温度で加える。ＨＰＬＣにより水素化を行う。２時間後に反応を終了し、混合物を濾過し、濾渣をＭｅＯＨ １０ｍｌで洗浄する。軟蒸留水を加え、溶液を凝固させ、凍結乾燥する。最終生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。
ｈ）方法Ｉ：Ｂｏｃ保護基の脱保護
丸底フラスコ中のＢｏｃ基（１ｍｍｏｌ）を含む生成物にトリフルオロ酢酸（５０ｍｌ）を加える。溶液を１．５時間撹拌し、ＴＦＡを蒸発させる。アミンを完全に脱保護し、精製せずに結合に使用する。
Ｂ−生物学的試験材料及び方法
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入に使用したプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−ＬＵＣは、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出したヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含むＭｌｕ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントの挿入により、プラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はプラスミドｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導される構築物である。
２．トランスフェクションに使用した溶液の調製プロトコール
本発明に記載する生成物はエタノール又は水に２０ｍＭに溶かした後、最終エタノール濃度が１０％未満となるように水で希釈する。
【００６４】
生理的血清（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で希釈した核酸溶液を１／１（ｖ／ｖ）の比でリポフェクタント溶液に加える。ボルテックス均質化と周囲温度で１５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ／リポフェクタント溶液を最終濃度９％（ｖ／ｖ）でウェルに分配し、無タンパク質（血清）成長培地で洗浄し、無血清又は非無血清培地で再培養した。
Ｃ−ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ材料
１．材料
ａ）実験モデル：
−雌成体（＞８週）マウスＣ５７／ＢＬ６。
−腫瘍フラグメントを脇腹の皮下に移植して動物間で継代することにより得られる３ＬＬ（ルイス肺癌）型腫瘍。
ｂ）使用したプラスミド：
ｐＸＬ２６２２：ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流にｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを挿入することにより、基本プラスミドｐＧＬ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導される。このプラスミドはＰＥＧ沈殿法（Ａｕｓｕｂｅｌ）により得られ、 ＤＮＡ約１０μｇ／μｌの濃度で４℃で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８中に保存する。
２．プロトコール
注射溶液：まずトランスフェクトしようとするＤＮＡを緩衝液に可溶化した後、配列番号１のペプチド（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）２を加え、２０分後に高濃度（２０又は４０ｍＭ）のカチオン脂質溶液を混合物に加える。全生成物の添加後、混合物はＤＮＡ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）、ペプチド（０．７５ｍｇ／ｍｌ）及びカチオン脂質以外に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｄ−グルコース及び５ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．２を含有している。溶液の調製から２０〜３０分後に注射を行う。
【実施例】
【００６５】
実施例１：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（６）の合成
ａ−｛Ｂｏｃ−［３−（Ｂｏｃ−｛４−［Ｂｏｃ−（３−Ｂｏｃ−アミノプロピル）アミノ］ブチル｝アミノ）プロピル］アミノ｝酢酸（３）の合成
方法Ａにより得られた樹脂を方法Ｂ、Ｃ及びＥによりスペルミンと反応させる。保護生成物をＳｉＯ２上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は４０％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝４．２２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：１．４０（４ｓ，３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）； １．４６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．６４及び１．７４（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ２．９６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）； ３．１５（ｍｔ，８Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）； ３．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）； ３．８３（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ＭＨ＋：６６１。
ｂ−｛Ｚ−［３−（Ｚ−｛４−［Ｚ−（３−Ｚ−アミノプロピル）アミノ］ブチル｝アミノ）プロピル］アミノ｝酢酸（４）の合成
方法Ａにより得られた樹脂を方法Ｂ、Ｃ及びＤによりスペルミンと反応させる。保護生成物をＳｉＯ２上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は２０％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８５（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝６．９２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４１３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４９（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．７４及び１．８１（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ３．０７（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯベンジル）； ３．１５−３．３０（ｍｔ，８Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）； ３．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＯ）； ３．７０（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）； ５．０７，５．１０，５．１２及び５．１３（４ｓ，各２Ｈ：ＡｒＣＨ２ＯＣＯＮ）； ６．６５（ｍｆ，１Ｈ：ＮＨＣＯ）； ７．２５−７．４０（ｍｔ，２０Ｈ：芳香族Ｈ）。
ＭＨ＋：７９７。
ｃ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ジオクタデシルアミド（５）
方法ＦによりＢｏｃ−Ｇｌｙをジオクタデシルアミンに結合する（収率９０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：６７９。
１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２９（ｍｔ，６０Ｈ；脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．４９（ｓ，９Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）； １．５５（ｍｔ，４Ｈ；各脂肪鎖の１ＣＨ２）； ３．１５及び３．３３（２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，各２Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．９５（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）； ５．５７（ｍｆ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ｄ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１８］２（６）
生成物（３）と（５）又は（４）と（５）を方法Ｇにより結合する。生成物をＢｏｃ保護生成物は方法Ｇ、Ｚ保護生成物は方法Ｈに記載したように脱保護する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．３５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＢＹＫ２０５３１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度３００Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８３（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２３（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．４３及び１．５３（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）； １．６３（ｍ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．９６（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ２．９３，３．００及び３．２２（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ＮＣＨ２）； ３．８３（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）； ４．０３（ｓ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：８２１。
【００６６】
実施例２：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１８］２（７）の合成
生成物（３）を方法Ｆによりジオクタデシルアミンと結合し、方法Ｇにより脱保護する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＦ３ＣＯＯＤ ２／３とＣＤ３ＣＯＯＤｄ４ １／３の混合物中，ｄ（ｐｐｍ））：０．７８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．５２（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）； １．８０（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； ２．２３及び２．３２（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ３．１０−３．４０（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ＮＣＨ２）； ４．１５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：７６４。
【００６７】
実施例３：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇＮ［（ＣＨ２）１８］２（９）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｚ２）ジオクタデシルアミド（８）
本生成物は、方法ＦによりＢｏｃＡｒｇ（Ｚ２）とジオクタデシルアミンを結合して合成する（収率９１％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：１０４６。
ｂ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇＮ［（ＣＨ２）１８］２（９）
生成物（３）又は（４）を方法Ｇにより生成物（８）と結合し、方法Ｇ（Ｂｏｃ）及び／又はＨ（Ｚ）により脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．８３分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ）））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖のＣＨ２）；１．４０−１．８０（ｍｔ，１２Ｈ：ＣＨ２）；１．９３（ｍ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８０−３．１０（３ｍｔ，１６Ｈ：ＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．４２（ｍｔ，２Ｈ：アミドのＣＨ２Ｎ）；３．７７（ｍｔ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．６７（ｍｔ，１Ｈ：ＮＣＨＣＯＮ）；６．８０−７．５０（広幅ｍｆ，２Ｈ：ＮＨ２）；７．７８，７．９２，８．８０及び９．０３（夫々ｍｔ及び３ｍｆ、夫々１Ｈ，２Ｈ，４Ｈ及び１Ｈ：ＣＯＮＨ，ＮＨ及びＮＨ２）。ＭＨ＋：９２０。
【００６８】
実施例４：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇ（Ｚ）２Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１０）の合成
生成物（３）を方法Ｇにより生成物（８）と結合し、同一方法によりＢｏｃ基を分離する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１７．７５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４０及び１．５７（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，８Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８５−３．０５（ｍｔ，合計１４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．７５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；３．８５及び３．９５（２ｍｔ，各１Ｈ：ＣＨ２ＮＣ）；４．６７（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．０７及び５．２５（夫々限界ＡＢ及びｓ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，各２Ｈ：ＮＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；７．２５−７．４５（ｍｔ，１０Ｈ：芳香族Ｈ）；７．９５，８．８５，９．９０及び９．２０（４ｍｆ：互換Ｈ）。
ＭＨ＋：１１８８。
【００６９】
実施例５：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ローダミン）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１３）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）ジオクタデシルアミド（１１）
本生成物は、方法ＦによりＢｏｃＬｙｓ（ＣｌＺ）をジオクタデシルアミンと結合することにより合成した（収率８９％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：９１８。
ｂ−ＢｏｃＨＮ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣｌＺ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１２）
（Ｂｏｃを脱保護せずに）生成物（３）を方法Ｇにより生成物（１１）に結合する。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４２３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．３２（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４４（２ｓ，合計３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５０−１．８０（ｍｔ，１６Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２及びプロピルの中心のＣＨ２）；３．００（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；３．０５（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）；３．１５−３．４０（ｍｔ，１４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２，ＣＨ２ＮＣＨ２及びＣＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ）；３．８０（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；５．９７及び６．５３（２ｍｔ，各１Ｈ：ＯＣＯＮＨ及びＮＨＣＯＯ）；７．０８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）；７．３０−７．５０（ｍｔ，４Ｈ：芳香族Ｈ）。
ｃ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ローダミン）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１３）
生成物（１２）のリジン上のＣｌＺ基を方法Ｈにより分離し、こうして得られた生成物を減圧乾燥し、エーテルにとり、ＮａＨＣＯ３とＮａＣｌで濯ぐ。エーテルをＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。
【００７０】
脱保護生成物７７ｍｇ（６０μＭ）をＭｅＯＨ ３ｍｌに溶かし、ＤＩＥＡ（６４μＬ）を加えた後、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（３０ｍｇ，６８μＭ）を加え、溶液を１７時間撹拌し、反応をＴＬＣによりモニターする。翌日、溶液を減圧乾燥して濃縮する。次にＴＦＡ（４ｍｌ）を加え、１時間撹拌する。ＴＦＡを蒸発させ、粗生成物を準分取ＨＰＣＬにより精製する（最終収率３０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（ＭｅＯＨ）。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝６１．５５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［１００／０］、３〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１３３５。
【００７１】
実施例６：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ビオチニル）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１４）の合成
生成物（１２）を方法Ｈにより脱保護し（２７１ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶かす。ＤＩＥＡ（０．１１ｍｌ）を加えた後、ビオチン（５６．４ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１０２ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ；ｐＨは１０（ＤＩＥＡ）に維持）を加え、反応の終了をフルオレサミン試験により確認する。生成物を方法Ｆに記載したように回収し、精製せずにＴＦＡ（５ｍｌ）で１時間脱保護する。ＴＦＡを蒸発させ、生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製する（収率５０％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．１２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１１１８。
【００７２】
実施例７：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１６）の合成
ａ−｛ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨＢｏｃ｝（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＯＨ（１５）
生成物（１）を方法Ｂによりポリマーに固定し、方法Ｃにより保護し、方法Ｅにより樹脂から分離する。生成物をＳｉＯ２上で精製する（収率３５％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度４３３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４２（ｓ，３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．６５−１．８５（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．７６（ｍｔ，１２Ｈ：ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２）；３．０６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；３．２９（ｍｔ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．８６（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ＭＨ＋：７７５。
ｂ−｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１６）
生成物（１５）を方法Ｇにより生成物（５）と結合する。生成物を方法Ｇにより脱保護し、準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥する（収率５５％）。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝３８．７２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８６Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．３０（ｍ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．５５（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９７（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８０−３．０５，３．０６及び３．２８（夫々ｍｔ及び２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１８Ｈ，２Ｈ及び４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．８０（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０３（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；６．００−９．００（広幅ｍｆ：ＮＨ２及びＮＨ）；８．２７（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：９３５。
【００７３】
実施例８：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１７）の合成
（３）の代わりに生成物（１５）を使用することにより生成物（７）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥する。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝３８分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２９（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．５２（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６８（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９０−２，１０（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９０，２．９５−３．１５，３．１８及び３．１５（夫々ｔ，ｍｔ及び広幅２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，合計２４Ｈ：ＮＣＨ２）；４．０２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：８７８。
【００７４】
実施例９：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１９）の合成
ａ−｛ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＯＨ（１８）
生成物（１）の代わりにトリス（アミノエチル）アミンを使用することにより生成物（１５）と同様に合成する（収率２９％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５５（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４４（ｓ，２７Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；２．５８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．６６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；
３．０４（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；
３．２８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；
３．７６（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）；６．０６（ｍｆ，２Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：５０５。
ｂ−｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１９）
（１５）の代わりに（１８）を使用することにより生成物（１７）と同様に合成する（収率６５％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．１５−１．３５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４５及び１．５５（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；２．６４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．７５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；２．９５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．０８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．２５（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．８８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；７．７５（残留広幅ｍｆ：ＮＨ）；８．６８（残留ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：７６５。
【００７５】
実施例１０：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２０）の合成
（５）の代わりにジオクタデシルアミンを使用することにより生成物（１９）と同様に合成する（収率７３％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１００．１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７０８。
【００７６】
実施例１１：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２１）（ＲＰＲ１２７８８８Ａ）の合成
生成物（１２）を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）、次いで方法Ｉにより脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１１．７６分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８９２。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３５−１．７５（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８２，２．９８，３．０６及び３．１０−３．５０（夫々２ｔ，ｍｔ及び２ｍｆ、Ｊ＝７Ｈｚ，合計１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７３（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．１８（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７７】
実施例１２：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２２）（ＲＰＲ１２２７５９Ａ）の合成
生成物（１２）を方法Ｉにより脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１６．７９分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０６０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３７３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３０−１．７５（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．９８，３．０６及び２．９０−３．５０（夫々２ｍｔ及びｍｆ，合計１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．５９（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１６（ｓ，２Ｈ：ＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；６．８５（ｍｆ，１Ｈ：ＯＣＯＮＨ）；７．３５−７．５５（ｍｔ，５Ｈ：芳香族Ｈ）；８．１５（ｍｆ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７８】
実施例１３：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣＨＯ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２４）（ＲＰＲ１２２７６０Ａ）の合成
ａ−ＮＨＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＬｙｓＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２３）
生成物（１２）を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）により脱保護し（収率６５％）、精製せずに使用する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２０．８２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣＨＯ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２４）
生成物（２３）を方法Ｇによりギ酸と結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．６０分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９２０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３５−１．７０（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９８（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．８５−３．５０（ｍｔ，１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；７．６０（ｍｆ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）；８．０５（広幅ｓ，１Ｈ：アルデヒドのＣＨ）；８．１８（ｍｆ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７９】
実施例１４：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ［コレステリル］Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２５）（ＲＰＲ１２８１４２Ａ）の合成
（ＢＯＰ試薬を使用せずに）生成物（２３）を方法Ｇによりクロロギ酸コレステリルと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２１．６６分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１３０４。
１ＨＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．６８及び０．９８（２ｓ，各３Ｈ：コレステリルの１８位ＣＨ３及び１９位ＣＨ３）；０．８６（ｍｔ，１２Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３並びにコレステリルの２６及び２７位ＣＨ３）；０．９１（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ：コレステリルの２１位ＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；０．８０−２．３０（ｍｔ，４２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，コレステリルの１、２、４、７、１１、１２、１５、１６、２２、２３及び２４位のＣＨ２，コレステリルの８、９、１４、１７、２０及び２５位のＣＨ，リシルの中心の（ＣＨ２）３並びにプロピルのＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．８８及び２．９６（２ｍｔ，合計１４Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２）；３．２０−３．５０（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６４（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．２３（ｍｔ，１Ｈ：コレステリルの３位ＣＨ）；４．６３（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．３０（ｍｔ，１Ｈ：コレステリルの６位ＣＨ）；６．９８（ｍｔ，１Ｈ：ＮＨＣＯＯ）；７．９０（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）；８．６０−９．０１（互換ｍｆ）。
【００８０】
実施例１５：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ［アラキドニル］Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２６）（ＲＰＲ１３０６０５）の合成
生成物（２３）を方法Ｇにより窒素流下で遮光下にアラキドン酸と結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２０．６７分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１１７７。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）； ０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ：アラキドニルのＣＨ３）；
１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；
１．３５−１．７５（ｍｔ，１８Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，アラキドニルの中心の（ＣＨ２）３，アラキドニルの中心のＣＨ２及びリシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．０２（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．１０（ｍｔ，６Ｈ：ＣＯＣＨ２及びアラキドニルの２個の＝ＣＣＨ２）；２．８０，２．９７，３．０６及び３．１０−３．５０（夫々ｍｔ，ｔ，ｍｔ及び２ｍｆ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計２４Ｈ：アラキドニルの＝ＣＣＨ２Ｃ＝，リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７３（ｄｄ，Ｊ＝８及び５Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．３８（ｍｔ，８Ｈ：アラキドニルのＣＨ＝ＣＨ）。
【００８１】
実施例１６：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２８）（ＲＰＲ１２６０９７Ａ）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−Ｂｚ）−ジオクタデシルアミン（２７）
本生成物は方法ＦによりＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）とジオクタデシルアミンを結合して合成する（収率９０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８８（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２８）
生成物（３）又は（４）を方法Ｇ、次いで方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ脱保護）により生成物（２７）と結合する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１４．６４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８９３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．５６（ｍｆ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６０−２．００（ｍｔ，２Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．７３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２）２）；１．９８（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．３２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；３．００，３．０６及び３．４５（夫々ｔ及び２ｍｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１６Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．８５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．１９（広幅ｓ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）。
【００８２】
実施例１７：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（Ｏ−Ｂｚ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２９）（ＲＰＲ１２３０２７Ａ）の合成
生成物（３）を方法Ｇにより生成物（２７）と結合し、脱保護（Ｂｏｃ）する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１６．０２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９８３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４１３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．５５（ｍｆ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．７５−２．００（ｍｔ，２Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．９９（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．４７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；２．９５，３．０５及び３．４０（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．８５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１４（限界ＡＢ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２Ｈ：ベンジルのＣＨ２）；７．３５（ｍｔ，５Ｈ：ベンジルの芳香族Ｈ）；８．２３（ｍｆ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）。
【００８３】
実施例１８：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３１）（ＲＰＲ１３０５９６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３０）
生成物（３）を生成物（２７）に結合し、側鎖のＯＢｚ保護基を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）により分離し、精製せずに使用する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２２．８４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１２９３。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３１）
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．７１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８４】
実施例１９：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３２）（ＲＰＲ１３０５９５Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２．２７分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８５】
実施例２０：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（マンノサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３３）（ＲＰＲ１３０５９８Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−マンノサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２．９８分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８６】
実施例２１：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（Ｎ（ＣＨ３）２）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３４）（ＲＰＲ１３１１１１Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇによりジメチルアミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１４．４４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９２０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４３及び１．６０（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．６５及び１．８５−２．００（２ｍｔ，各１Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．３２（限界ＡＢ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；２．８０及び２．９２（２ｓ，各３Ｈ：ＣＯＮ（ＣＨ３）２）；２．８５−３．０５（ｍｔ，１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２）；３．００，３．２２，３．４５及び３．５８（４ｍｔ，各１Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７８（ＡＢ，Ｊ＝１６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．７２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）；８．８５及び８．９０−９．１５（互換ｍｆ）。
【００８７】
実施例２２：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１１ＣＨ３］２（３５）（ＲＰＲ１２２７６７Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝９．５４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：６５３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４０３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９３（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３３（ｍｔ，３６Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）９）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５及び２．００（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．００（２ｍｔ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．５８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０５（ｓ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
【００８８】
実施例２３：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１２ＣＨ３］２（３６）（ＲＰＲ１２２７７４Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジトリドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１０．６４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：６８１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３３（ｍｔ，４０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１０）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．００（２ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；８．６０（広幅ｓ，１Ｈ：グルシルのＣＯＮＨ）。
【００８９】
実施例２４：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１３ＣＨ３］２（３７）（ＲＰＲ１２２７６６Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジテトラドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝９．９２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７０９。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１１）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．０８（夫々ｍｔ及びｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）； ８．１０（ｍｆ，１Ｈ：グルシルのＣＯＮＨ）。
【００９０】
実施例２５：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４Ｎ［（ＣＨ２）３ＮＨ２］ＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３９）（ＲＰＲ１２６０９６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４Ｎ［（ＣＨ２）３ＮＨＢｏｃ］ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（３８）の合成
生成物（３）の合成中にＳｉＯ２上で精製時に副産物（３８）を回収する。収率は８％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：５６１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：１．３０−１．６１（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．４０（ｓ，２７Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５６（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．６８及び３．１１（夫々広幅ｔ及びｔ、Ｊ＝７Ｈｚ，各４Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；２．９０及び２．９６（２ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，各２Ｈ：プロピルのＢｏｃＮＨＣＨ２）；３．１８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４［Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ２］ＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３９）
生成物（３８）と（５）を方法Ｇにより結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．６０分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８２１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：各脂肪鎖のＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４６及び１．５４（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９１（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．８５−３．１５（ｍｔ，１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．２４（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７６（ｍｆ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０５（広幅ｓ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
【００９１】
実施例２６：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４１）（ＲＰＲ１２２７８６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｈ（４０）
溶液としてのＮａＣＮＢＨ３とコハク酸準アルデヒドの存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物（４０）を合成する。
【００９２】
２００ｍｌ容丸底フラスコにスペルミン１．８ｇ、メタノール６０ｍｌ及びＮａＣＮＢＨ３ ０．１３８ｇを仕込む。溶液を激しく磁気撹拌する。等圧フラスコによりコハク酸準アルデヒド５．５ｍｌ（１５％）とメタノール３０ｍｌの溶液を１００分間かけて注入する。撹拌を１００分間維持する。アミンをＢｏｃ基により次のように保護する。媒質にＴＥＡ２．８ｍｌを注いだ後、メタノール３０ｍｌに可溶化したジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート８．８ｇを加える。撹拌下に一晩維持する。媒質を減圧濃縮し、生成物を酢酸エチルにとり、ＮａＨＣＯ３３×５０ｍｌで抽出し、水相を集めてエーテル（３×１００ｍｌ）で濯ぐ。ＫＨＳＯ４を加えて水相のｐＨを３まで下げ、生成物４１の沈殿による濁りを確認し、混合物を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。生成物を精製せずに使用する。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４１）
生成物（４０）とジオクタデシルアミンを方法Ｇにより結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．０４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７９２。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２２（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．８８（ｍｔ，２Ｈ：アミノペンタノイルの中心のＣＨ２）；１．９９（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．４２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：アミノペンタノイルのＣＯＣＨ２）；２．９６，３．０３及び３．２２（３ｍｔ，合計１８Ｈ：アミノペンタノイルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）。
【００９３】
実施例２７：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４２）（ＲＰＲ１２８５０６Ａ）の合成
ＢｏｃＧｌｙの代わりにＢｏｃ６−アミノカプロン酸を使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．９４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８７７。
１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４８（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２及びアミノヘキサノイルの中心の（ＣＨ２）３）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．２７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：アミノヘキサノイルのＣＯＣＨ２）；２．８５−３．３０（ｍｔ，１８Ｈ：アミノヘキサノイルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７０（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；７．９０−９．１０（互換ｍｆ）。
【００９４】
実施例２８：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（１１−アミドウンデカニルヘプタ−Ｏ−アセチルラクトース）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４３）（ＲＰＲ１３０７６５Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより１１−アミノウンデカニルヘプタ−Ｏ−アセチルラクトースと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．９１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１６８０。
【００９５】
実施例２９：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｓｍ（β−ＮＡｃ（Ａｃ）３）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４５）（ＲＰＲ１３１２８３Ａ）の合成
ａ−Ｆｍｏｃ−Ａｓｍ−β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ（Ａｃ）３−ジオクタデシルアミン（４４）
本生成物は方法ＦによりＦｍｏｃ−Ａｓｍ−β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ（Ａｃ）３−ＯＨとジオクタデシルアミンを結合することにより合成する。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６７（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２５．３１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｓｍ（β−ＮＡｃ（Ａｃ）３）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４５）
生成物（４５）のＦｍｏｃ基を分離する。
【００９６】
生成物（４５）０．７ｇにＤＭＦ２０ｍｌとジエチルアミン２ｍｌを注ぐ。撹拌下に６時間維持した後、媒質を減圧濃縮する。得られた生成物を方法Ｇにより生成物（３）に結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．３５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１２０７。
【００９７】
実施例３０：
生成物（６）の大規模溶液合成
溶液としてのＮａＣＮＢＨ３とグリオキシル酸の存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物（６）を合成する。
【００９８】
２ｌ容丸底フラスコにスペルミン１８．２ｇ、メタノール５００ｍｌ及びＮａＣＮＢＨ３ ２ｇを仕込む。溶液を激しく磁気撹拌する。等圧フラスコによりメタノール３００ｍｌ中のグリオキシル酸８．４５ｇの溶液を１００分間かけて注入する。撹拌を一晩維持する。アミンをＢｏｃ基により次のように保護する。媒質にＴＥＡ１４ｍｌを注いだ後、ＴＨＦ２００ｍｌに可溶化したジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート１００ｇを加える。撹拌下に一晩維持する。媒質を減圧濃縮し、生成物を酢酸エチル（２５０ｍｌ）にとり、ＫＨＳＯ４（６×１００ｍｌ）、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（３×１００）で濯ぎ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）を溶離剤としてシリカカラムで生成物を精製する。生成物を含むフラクションをＴＬＣにより同定し、再び集めて減圧蒸発させると、生成物（６）１０ｇが得られる（合計合成収率１７％）。
【００９９】
分析ＨＰＬＣ、質量スペクトル及びＮＭＲの分析値は固相法により得られる生成物に一致する。
【０１００】
実施例３１：
（７）ＲＰＲ１２０５３４Ａ、（６）１２０５３５Ａ及び（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比（アミン／リン酸）の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３、３ＬＬ又はウサギＳＭＣ］１×１０５個のサンプルを、５％ＣＯ２下で電荷比を変えてリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液により３７℃で２時間処理し、各サンプルに核酸２μｇを投与する。最終濃度８％のウシ胎児血清を添加後、ＣＯ２インキュベーターで４０時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
【０１０１】
ルシフェラーゼ活性はルシフェリン、補酵素Ａ及びＡＴＰの存在下で１０秒間の発光［ＲＬＵ＝相対光単位］により定量し、処理細胞２０００個に対する割合として表す。得られた結果を図１、２及び３に示す。
【０１０２】
これらの図から明らかなように、脂質部分とポリアミンの間の「スペーサー」アームにグリシンが存在すると、低いナノモルカチオン脂質／μｇＤＮＡ比で良好なトランスフェクション効率が得られる。
【０１０３】
実施例３２：
（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ、（１９）１２０５２８Ａ、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比（アミン／リン酸）の効果
２ｃｍ２の指数増殖期のＮＩＨ ３Ｔ３細胞１×１０５個のサンプルを、５％ＣＯ２下で電荷比を変えてリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液により３７℃で２時間処理し、各サンプルに核酸１μｇを投与する。最終濃度８％のウシ胎児血清を添加後、ＣＯ２インキュベーターで４０時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
【０１０４】
ルシフェラーゼ活性は細胞の溶解後に得られる上清中で１０秒間の発光［ＲＬＵ＝相対光単位］により定量し、タンパク質１ｍｇに対する割合として表す。得られた結果を図４に示す。「スペーサー」アームにグリシン残基が存在すると有利であることは本実施例からも明白である。
【０１０５】
実施例３３：
（６）１２０５３５、（４１）ＲＰＲ１２２７８６及び（４２）ＲＰＲ１２８５０６によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー長の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３及びＨｅＬａ］１×１０５個のサンプルを、血清タンパク質の不在下で３７℃、５％ＣＯ２下の湿潤雰囲気でカチオン脂質濃度を変えてカチオン脂質／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ混合物により２時間処理する。次いで細胞増殖培地に最終濃度８％のウシ胎児血清を加え、ＣＯ２インキュベーターで更に４０時間インキュベーション後にトランス遺伝子の発現を測定する。
【０１０６】
スペーサーの構造特性は以下の通りである。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
下表Ｉは得られた結果を示し、試験材料の各々で得られた最大効率を表す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
トランスフェクション効率は処理細胞２１０３個当たりのＲＬＵ／１０秒として与える。括弧内はナノモル脂質／μｇＤＮＡ比を示す。
【０１１１】
実験１及び２では異なるプラスミドを使用し、実験１及び２で夫々細胞１１０５個当たりＤＮＡ１μｇ及び０．５μｇの用量とする。
【０１１２】
実施例３４：
（６）ＲＰＲ１２０５３５によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー構造の効果
補助細胞系（３ＬＬ細胞）を導入した以外は上記実施例に記載したと同一の実験条件下で、Ａｒｇ型、Ｌｙｓ型又はＧｌｕ型の基で「スペーサー」を置換することにより修飾したカチオン脂質（６）ＲＰＲ１２０５３５を用いて得られたトランスフェクション効率を比較した。
【０１１３】
種々のスペーサーの構造は以下の通りである。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
トランスフェクション効率は処理細胞２１０３個当たりのＲＬＵ／１０秒として与える。
実験１及び２では異なるプラスミドを使用し、実験１及び２で夫々細胞１１０５個当たりＤＮＡ０．５μｇ及び１μｇの用量とした。結果を分析した処、該当細胞に応じて、好ましくは置換したアミノ酸鎖の存在は良好なトランスフェクション効率をもたらすことが判明した。
【表４】
【０１１６】
実施例３４：
（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａによるリポフェクタント／ＤＮＡ混合物中のＤＯＰＥの存在の効果
実施例３１で使用したと同一のプロトコールに従い、トランスフェクション混合物にＤＮＡを添加する前にカチオン脂質（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａに種々のモル比でＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を加えた。
細胞の溶解後に上清中のルシフェラーゼ活性を定量し、タンパク質１ｍｇに対する割合を計算する（図５）。
リポフェクタント混合物中にＤＯＰＥが存在すると、（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａの濃度が低い場合にトランスフェクション効率を改善することができる。
【０１１７】
実施例３５：
（６）ＲＰＲ１２０５３５Ａ、（９）１２０５３１Ａ及び（１０）ＲＰＲ１２１６５０Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす血清の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３又はＨｅＬａ］１×１０５個のサンプルを、血清の不在下で２時間又は培地中の血清の存在下でリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液（リポフェクタント３ナノモル／μｇＤＮＡ）により処理する。本実施例では各サンプルに核酸２μｇを投与する。細胞溶解液の上清中のルシフェラーゼの発現を調べ、ＲＬＵ／１０秒で表し、タンパク質１ｍｇに対する割合を計算する。結果を分析した処、血清の存在はトランスフェクションにさほど影響しないことが判明した。
【０１１８】
実施例３６：
（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ、（１９）１２０５２８Ａ、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５ＡによるＤＮＡ／リポフェクタント混合物中の核酸濃度の効果
実施例３１に記載した条件下で、ナノモルリポフェクタント／μｇＤＮＡ比を最適化し、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のサンプルにトランスフェクトする（実施例３２参照、（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ及び（１９）ＲＰＲ１２０５２８Ａでは比＝６、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５Ａでは比＝３）。各サンプルに加えるＤＮＡの量は０．５〜２μｇとする。結果を図６に示す。
指数増殖期の細胞１×１０５個にプラスミドＤＮＡ１μｇをトランスフェクトするのが好ましい選択であると思われ、実際に、ＤＮＡの使用量が増加すると細胞に接触するカチオン脂質の濃度が増加し、場合によっては毒性の問題を生じる。ＤＮＡ濃度が低いと、トランスフェクション効率との比例が得られなくなる。
【０１１９】
実施例３７：
本発明によるリポポリアミンのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション試験
腫瘍移植後７日のマウスをケタミン＋キシラジンで麻酔し、上記のように調製した本発明によるリポポリアミンを含む溶液を注射する。注射から２日後に腫瘍組織を取り出し、計量後に細切し、溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ１５３ Ａ）５００μｌ中で粉砕する。遠心分離（２００００ｇで１０分間）後、１０μｌを分取し、試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）５０μｌと混合後に得られた合計発光をルミノメーターＬｕｍａｔ ＬＢ ９５０１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定し、１０秒間積分することによりルシフェラーゼ活性を評価する。得られた活性を腫瘍溶解液の合計上清中の推定ＲＬＵ（相対光単位）又は注射ＤＮＡμｇ当たりのＲＬＵとして表す。表ＩＩＩは得られた結果を示す。
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】種々のカチオン脂質によるＮＩＨ ３Ｔ３細胞（マウス胎児繊維芽細胞）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図２】種々のカチオン脂質によるウサギＳＭＣ細胞（ウサギ大動脈平滑筋細胞の一次培養物）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図３】種々のカチオン脂質による３ＬＬ細胞（ルイス肺癌）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図４】種々のカチオン脂質によるＮＩＨ ３Ｔ３細胞（マウス胎児繊維芽細胞）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図５】３ＬＬ細胞のトランスフェクション効率に及ぼすＤＯＰＥ濃度の効果を表すグラフである。
【図６】ナノモルリポフェクタント／μｇＤＮＡ比を一定にしてＤＮＡ量を変えた場合のＮＩＨ ３Ｔ３細胞のトランスフェクションを表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポポリアミンファミリーに属する新規化合物、該化合物を含有する医薬組成物、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのためのその適用並びにその製造方法に関する。
【発明の開示】
【０００２】
多数の遺伝病は１種以上の核酸の発現障害及び／又は異常発現即ち発現不足又は過剰発現に関連している。遺伝子治療はクローン化遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞発現によりこのような遺伝異常を治療することを主眼とする。
【０００３】
今日、この種の遺伝情報の細胞内送達方法として数種の方法が提案されている。特に、化学的又は生化学的ベクターを利用するものが挙げられる。合成ベクターはトランスフェクトしようとするＤＮＡを圧縮する機能と、その細胞固定並びにその細胞質膜及び場合により２つの核膜通過を助長する機能との２つの主機能をもつ。
【０００４】
このトランスフェクション方法は、カチオン脂質の利用に基づく技術の開発により著しい進歩を遂げた。例えば、正電荷をもつカチオン脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、負電荷をもつＤＮＡとリポソーム又は小ベジクル形態で自然に相互作用し、細胞膜と融合することが可能な脂質−ＤＮＡ複合体を形成し、こうしてＤＮＡの細胞内送達を可能にすることが判明した。しかし、この分子はトランスフェクションの点では有効であるが、非生分解性であり、細胞に毒性であるという欠点がある。
【０００５】
ＤＯＴＭＡ以来、所謂「スペーサー」アームを介してアミノ基に結合した親油基というこの構造モデルで他のカチオン脂質も開発された。そのうちでは、親油基として２個の脂肪酸又は１個のコレステロール誘導体を含み、更に、場合によりアミノ基として第４級アンモニウム基を含むものを挙げることができる。このカチオン脂質の分類の代表例として、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＢＴ又はＣｈＯＴＢを特に挙げることができる。この他、ＤＯＳＣやＣｈＯＳＣ等のように、第４級アンモニウム基の代わりにコリン基の存在を特徴とする化合物もある。しかし、一般にこれらの化合物のトランスフェクション活性は依然としてかなり低い。
【０００６】
別の分類のカチオン脂質であるリポポリアミンも報告されている。本発明の意味では、リポポリアミンなる用語は所謂スペーサー領域を介して親油領域と結合した少なくとも１個の親水ポリアミン領域を含む両親媒性分子を意味する。リポポリアミンの正電荷をもつポリアミン領域は負電荷をもつ核酸と可逆的に結合することができる。この相互作用は核酸を著しく圧縮する。親油領域は脂質膜から形成される核脂質粒子を覆うことにより、このイオン相互作用を外部媒質に対して非感受性にする。この種の化合物では、カチオン基は２個の第１級アンモニウム基と２個の第２級アンモニウム基との４個のアンモニウム基を含むＬ−５−カルボキシスペルミン基により置換することができる。この種の化合物としては特にＤＯＧＳとＤＰＰＥＳが挙げられる。これらのリポポリアミンは一次内分泌細胞のトランスフェクションに特に有効である。
【０００７】
実際に、理想的な合成トランスフェクション剤は広い細胞範囲で高いトランスフェクションレベルをもち、使用用量で無毒性であるか又は非常に低毒性であり、更に処理細胞のレベルで副作用が全くないように生分解性でなければならない。
【０００８】
本発明は詳細には、独自のポリアミンフラクションをもち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション、特に核酸のベクター導入に有効に使用可能な新規リポポリアミンを提案することを目的とする。
【０００９】
本発明の第１の目的は一般式Ｉ：
【００１０】
【化６】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、
ｑはＲ１、Ｒ２及びＲ３の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
Ｒ及びＲ’は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ’−ＮＨ２基を表し、ｑ’はＲ及びＲ’の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
ｍ、ｎ及びｐは各々独立して０〜６の整数を表し、但しｎが２以上のとき、ｍは異なる値をとることができ、Ｒ３は一般式Ｉ中で異なる意味をもち、
Ｒ４は一般式ＩＩ：
【００１１】
【化７】
の基を表し、式中、
Ｒ６及びＲ７は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２脂肪族基を表し、２個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
ｕは０〜１０から選択される整数であり、但しｕが２以上の整数であるとき、Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びｒは各モチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ５）ｒ−Ｙ］中で異なる意味をもつことができ、
Ｘは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
Ｒ５は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
ｒは１〜１０の整数を表し、但しｒが１であるとき、Ｒ５は天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが２以上であるとき、Ｒ５は水素原子を表す］により表されることを特徴とするＤ、Ｌ又はＤＬ形リポポリアミン及びその塩を提供することである。
【００１２】
天然アミノ酸側鎖とは、特に本発明の意味では例えばアルギニン側鎖のようにアミジニウムモチーフを含む鎖を意味する。上述のように、この鎖は飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ２４直鎖、分枝鎖もしくは環状脂肪族基（例えばコレステリル基、アラキドニル基又はレチノイル基）又はモノもしくはポリ芳香族基（例えば置換又は非置換ベンジルオキシカルボニル、ベンジルエステル及びローダミニル誘導体）により置換されていてもよい。
【００１３】
一般式（Ｉ）のこれらの新規生成物は医薬的に許容可能な非毒性塩の形態をとることができる。これらの非毒性塩は鉱酸（塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸又は蓚酸）、無機塩（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム）又は有機塩（トリエチルアミン、ピペリジン、ベンジルアミン等の第３級アミン）との塩を含む。
【００１４】
本発明による化合物の例としては、特に下記亜一般式：
【００１５】
【化８】
（式中、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は上記と同義である）の化合物を挙げることができる。上記式中、好ましくはＲ４はＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６及びＲ７は亜式ＩＩＩ〜ＸＩＩにおいて（ＣＨ２）１７ＣＨ３、（ＣＨ２）１１ＣＨ３、（ＣＨ２）１３ＣＨ３又は（ＣＨ２）１２ＣＨ３から選択される同一基を表す。
【００１６】
特に有利な態様において、本発明の化合物は該化合物が結合した核酸の移送を指向させることが可能なターゲティング成分を更に含む。好ましくは、このターゲティング成分はＲ５置換基により表されるアミノ酸側鎖のレベルで一般式Ｉの化合物に組み込まれる。より好ましくは、ターゲティング成分は本発明による化合物に共有又は非共有的に結合される。
【００１７】
このようなターゲティング成分としては、所定細胞型又は所望の所定組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）に核酸の移送を指向させることが可能な細胞外ターゲティング成分が挙げられる。例えば、標的細胞型の表面に存在する細胞レセプターのリガンドが挙げられ、例えば糖、葉酸、トランスフェリン、インスリン、アシアロオロソムコイドタンパク質又は細胞外レセプターにより認識される任意の生物活性分子等である。また、例えばトランスフェクトされるＤＮＡを核の内部に優先的に蓄積する核局在シグナル配列（ｎｌｓ）のように、所定の優先的細胞区画（ミトコンドリア、核等）に向けて核酸移送を指向させることが可能な細胞内ターゲティングでもよい。
【００１８】
より一般には、本発明の範囲で利用可能なターゲティング成分としては糖類、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ステロイド又は脂質が挙げられる。好ましくは、糖類及び／又はペブチド（例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞レセプターのリガンド又はそのフラグメント、レセプター又はレセプターフラグメント等）である。特に、成長因子レセプター、サイトカインレセプター、細胞レクチンレセプター又は接着タンパク質レセプター（例えばインテグリン）のリガンドが挙げられる。また、トランスフェリンのレセプター、脂質ＨＤＬ及びＬＤＬも挙げられる。ターゲティング成分は更に、アシアロ糖タンパク質レセプター等のレクチンをターゲティングすることが可能な糖や、イムノグロブリンのＦｃフラグメントのレセプターをターゲティングすることが可能な抗体Ｆａｂフラグメントでもよい。
【００１９】
同様に、一般式Ｉの化合物の例えばアミノ酸側鎖Ｒ５にビオチン、ローダミン、葉酸型のマーカー物質を結合することも考えられる。このマーカー物質は更に、インテグリン型の接着タンパク質の一次及び／又は二次レセプターの認識エピトープ
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む直鎖又は環状ペプチド又はプソイドペプチド配列でもよい。
【００２０】
本発明のリポポリアミンの例としては、後記実施例に詳細に記載する下記化合物を特に挙げることができる。
【００２１】
【化９】
【００２２】
本発明の特に代表的な化合物としては、下記一般式の化合物を特に挙げることができる。
【００２３】
【化１０】
【００２４】
本発明の範囲内で、本発明によるリポポリアミンを誘導する非対称官能化ポリアミンを製造するための新規固相方法も開発された。
【００２５】
従来、非対称官能化ポリアミンの製造は直鎖又は分枝鎖対称ポリアミンに選択的に修飾を導入する必要により制限されている。ポリアミンの第１アミノ基と第２アミノ基の化学的差異により、アルキル化、ミカエリス型付加又はアシル化等の反応を実施するためには高い選択性が必要である。更に、このような化学的差異により要求される選択性は、ポリアミンで行われるような複数の第１及び第２アミン群での選択的アシル化に適合しない。このような制約に対する従来の対応は、「ポリアミノ化」することが可能なアミノ基と適当に保護された非対称官能基をもつモノマーブロックから非対称官能化ポリアミンを構築する方法であった。従って、このアプローチには複数段階からなる面倒な合成ストラテジーが必要であり、特に官能基の直交保護が必要であった。
【００２６】
本発明の範囲内で開発された方法は、詳細には上記型の合成に伴う従来の欠点を解消するを目的とする。この方法は、対称ポリアミンのアルキル化又は還元アルキル化により一次アミノ基のみで選択的に官能化されたポリアミンを容易且つ迅速に得られるという顕著な利点がある。
【００２７】
本発明の方法の原理は固相合成法の利用に基づき、アルキル化剤とポリアミンの二分子反応を助長し、ポリアミンのポリアルキル化を回避する。より詳細には、本発明は固体支持体に共有結合したアルキル化剤と対称ポリアミンの二分子反応により予め得られた少なくとも１個の非対称ポリアミンフラクションに少なくとも１個の脂質フラクションを結合することを特徴とする方法に関する。このアプローチによると、アルキル化剤はエステル化又はアミド化によりポリマー支持体に共有結合している。対称ポリアミンは二分子反応により固相アルキル化剤と反応し、支持体に結合した単官能化非対称ポリアミンを生じる。生成物の遊離アミンは一般にＢＯＣ又はＺ型の保護基により固相で保護されており、最終的に生成物は固相支持体から分離される。これらのポリアミノ酸を適宜脂質フラクションに結合すると、所望のトランスフェクション剤が得られる。この結合には、例えばＢＯＰ、Ｐｙｂｏｐ、ＢｏｐＣｌ及びＤＣＣ等の慣用ペプチド結合剤を利用することができる。本方法は、場合によりトレーサーペプチド、糖類又は蛍光プローブを分子に導入して完全トランスフェクション剤を固体支持体に結合することも可能である。当然のことながら、遊離リポポリアミンにこの型のグラフトを実施できることが判明した。
【００２８】
本方法の実施可能性は、複数の直鎖又は分枝鎖非対称官能化ポリアミノ酸の合成により立証された。
【００２９】
本発明は更に、上記のようなリポポリアミンの直接又は医薬組成物としての任意の治療的適用にも関する。
【００３０】
上述のように、一般式Ｉの化合物は核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに特に有利であることが判明した。これらの化合物はＤＮＡを有効に圧縮し、非常に低毒性であるという利点がある。
【００３１】
本発明の組成物から最大限の効果を得るためには、核酸の負電荷に対する該当リポポリアミンの正電荷の比であるＲ比が最適となるように、一般式Ｉの化合物と核酸の夫々の比率を決定することが好ましい。この最適比は特にｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの使用方式や、トランスフェクトしようとする細胞型により異なり、場合に応じて最適化される。この最適化は当業者に自明である。
【００３２】
本発明の医薬組成物において、ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸でもリボ核酸でもよい。天然又は人工起源のいずれの配列でもよく、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列又は修飾もしくは非修飾オリゴヌクレオチドの合成もしくは半合成配列が挙げられる。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス等に由来するものであり得る。これらの核酸は当業者に公知の任意方法により得られ、特に、バンクスクリーニング、化学的合成又はバンクスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混合方法により得られる。更に、プラスミドベクター等のベクターに組み込んでもよい。
【００３３】
特にデオキシリボ核酸については、１本鎖でも２本鎖でもよいし、短いオリゴヌクレオチドでもより長い配列でもよい。これらのデオキシリボ核酸は治療遺伝子、転写又は複製調節配列、修飾又は非修飾アンチセンス配列、他の細胞成分との結合領域等を含み得る。
【００３４】
本発明の意味では、治療遺伝子とは特に治療効果をもつタンパク質産物をコードする任意遺伝子を意味する。こうしてコードされるタンパク質産物はタンパク質、ペプチド等であり得る。このタンパク質産物はターゲット細胞に対して同種であり得る（即ちターゲット細胞が疾病をもたないときにターゲット細胞で正常に発現される産物）。この場合、タンパク質の発現は例えば細胞における不十分な発現や、不活性であるか又は修飾により弱活性となったタンパク質の発現を解消し、あるいは前記タンパク質を過剰発現させることができる。治療遺伝子は安定性の増加、活性改変等の性質をもつ細胞タンパク質の突然変異体をコードするものでもよい。タンパク質産物はターゲット細胞に対して異種でもよい。その場合には、発現されるタンパク質は例えば細胞に欠失している活性を補充又は付加し、疾病に対抗するこ又は免疫応答を刺激することができる。
【００３５】
本発明の意味での治療物質としては、より特定的には酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（仏国特許出願第９２０３１２０号））、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等、ジストロフィン又はミニジストロフィン（仏国特許出願第９１１１９４７号））、膵臓線維症に関連するタンパク質ＣＦＴＲ、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等（仏国特許出願第９３０４７４５号））、凝血に関与する因子（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡの修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他の輸送タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びアポ（ａ）から選択されるアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタンパク質に対応する遺伝子、代謝酵素（例えばリポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−α−コレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ）、脂質輸送タンパク質（例えばコレステロールエステル輸送タンパク質やリン脂質輸送タンパク質）、ＨＤＬ結合タンパク質又は例えばＬＤＬレセプター、レムナントキロミクロンレセプター及びスカベンジャーレセプター等から選択されるレセプターを挙げることができる。
【００３６】
治療核酸は更に、ターゲット細胞で発現されると遺伝子発現又は細胞ｍＲＮＡ転写を調節することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は、ヨーロッパ特許第１４０３０８号に記載の技術により、例えば細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡターゲット細胞に転写され、こうしてそのタンパク質翻訳を阻止することができる。治療遺伝子は更に、ターゲットＲＮＡを選択的に破壊することが可能なリボソームをコードする配列も含む（ヨーロッパ特許第３２１２０１号）。
【００３７】
上述のように、核酸は更に、ヒト又は動物で免疫応答を発生することが可能な抗原ペプチドをコードする１個以上の遺伝子を含んでいてもよい。従って、この特定態様によると、本発明はヒト又は動物で特に微生物、ウイルス又は癌に対するワクチン又は免疫治療を実現することができる。特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ヨーロッパ特許第１８５５７３号）、偽狂犬病ウイルス、シンシチウム形成ウイルス、他のウイルスの特異的抗原ペプチド又は腫瘍特異的抗原ペプチド（ヨーロッパ特許第２５９２１２号）を挙げることができる。
【００３８】
好ましくは、核酸は更に細胞又は所望臓器において治療遺伝子及び／又は抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列も含む。このような配列としては、これらの配列が感染細胞で機能できるときに該当遺伝子の発現に天然に関与する配列が挙げられる。異なる起源の配列でもよい（他のタンパク質の発現に関与、あるいは合成配列でもよい）。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。例えば、感染させようとする細胞のゲノムに由来するプロモーター配列が挙げられる。また、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化配列や調節配列等を付加してこれらの発現配列を修飾してもよい。誘導又は抑制プロモーターでもよい。
【００３９】
更に、核酸は合成治療物質をターゲット細胞の分泌経路に導くシグナル配列も特に治療遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。核酸は更に合成治療物質を細胞の特定区画に導くシグナル配列も含んでいてもよい。
【００４０】
別の態様において、本発明は核酸と、本発明のリポポリアミンと、リポポリアミン／核酸複合体に結合してトランスフェクション能を改善することが可能なアジュバントを含む組成物に関する。本願出願人は実際に、リポポリアミン／核酸複合体に結合することが可能な所定のアジュバント（例えば脂質、ペプチド又はタンパク質）の存在下でリポポリアミンのトランスフェクション能を予想外に増加できることを立証した。
【００４１】
この点で、本発明の組成物はアジュバントとして１種以上の中性脂質を含み得る。このような組成物は特にＲ比が小さいときに特に有利である。本願出願人は実際に、中性脂質を加えると核脂質粒子の形成を改善し、驚くべきことに細胞膜を撹乱して粒子の細胞侵入を助長できることを立証した。
【００４２】
より好ましくは、本発明の範囲内で使用する中性脂質は２個の脂肪鎖をもつ脂質である。
【００４３】
生理的条件下で両性イオン性又はイオン電荷をもたない天然又は合成脂質を使用すると特に有利である。脂質は特にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン及びその１〜３倍Ｎ−メチル化誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（例えば特にガラクトセレブロシド）、スフィンゴ脂質（例えば特にスフィンゴミエリン）又はアシアロガングリオシド（例えば特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２）から選択することができる。
【００４４】
これらの種々の脂質は当業者に周知の慣用技術により合成するか又は臓器（例えば脳）もしく胎児から抽出することにより得られる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒を用いて実施することができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ参照）。
【００４５】
ごく最近になって本願出願人は前記核酸の凝縮レベルに直接又は間接的に作用する化合物をアジュバントとして使用すると特に有利であることも立証した（ＷＯ９６／２５５０８）。
【００４６】
リポポリアミンをベースとするトランスフェクション組成物中にこのような化合物が存在すると、この組成物の量を著しく低減でき、この組成物のトランスフェクション活性を損なわずに毒物学的面で有益な結果が得られる。それどころか、組成物のトランスフェクションレベルは向上するという利点がある。
【００４７】
核酸の凝縮レベルに作用する化合物とは、核酸を直接又は間接的に圧縮する化合物として定義される。より詳細には、この化合物はトランスフェクトしようとする核酸のレベルに直接作用するか、又はこの核酸の凝縮に直接関与する付加化合物のレベルに作用することができる。核酸のレベルに直接作用するものが好ましい。
【００４８】
好ましい態様によると、核酸の凝縮レベルに作用するこの物質は全体又は一部をペプチドモチーフ（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）及び／又は（ＡＴＰＡＫＫＡＡ）から構成され、モチーフ数は２〜１０である。本発明による化合物の構造において、これらのモチーフは連続又は不連続的に反復し得る。従って、これらのモチーフは生化学的結合（例えば１個以上のアミノ酸）又は化学的結合により分離することができる。このような物質は全体又は一部がヒストン、ヌクレオリン、プロタミン及び／又はそれらの誘導体の１種から誘導されるものでもよい。
【００４９】
好ましくは、本発明の組成物は核酸１当量当たりアジュバント０．０１〜２０当量（重量／重量）、より好ましくは０．５〜５当量を含む。
【００５０】
本発明による組成物は局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は特に所望臓器のレベルに直接注射するための注射用製剤又は局所投与（皮膚及び／又は粘膜）用として医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。このようなキャリヤーとしては、特に等張滅菌溶液又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えると注射可能な溶質を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。注射に使用する核酸の用量及び投与回数は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて選択できる。特に投与方法については、組織又は循環経路への直接注射や、培養細胞処理後の注射又は移植によるｉｎ ｖｉｖｏ再移植が挙げられる。
【００５１】
従って、本発明は上記条件下で上記疾病を治療することが可能な核酸と一般式Ｉの化合物のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ併用投与を特徴とする、疾病治療に特に有利な方法を提供する。より詳細には、この方法はタンパク質又は核酸産物の不足に起因する疾病に適用することができ、投与する核酸は前記タンパク質産物をコードするか又は前記核酸産物を含む。
【００５２】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞トランスフェクションのための本発明のリポポリアミンの全使用に及ぶ。
【００５３】
以下、実施例及び図面により本発明をより詳細に説明するが、これらの説明は例示に過ぎず、本発明を制限するとみなすべきではない。
【００５４】
略語及び記号
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＢＯＣ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：ジシクロヘキシル尿素
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＯＤＡ：ジオクタデシルアミン
ＥＰ：石油エーテル
ＥｔＯＨ：エタノール
ＮＥｔ３：トリエチルアミン
Ｒｆ：前端保持率
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳ：テトラメチルシラン
ＵＶ：紫外線
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
ＣｌＺ：ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル
Ａ−化学合成用材料及び方法
１．材料
ａ）化合物
−出発ポリアミンは例えばスペルミジン、スペルミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、フェニレンジアミン、ジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）等の市販品でもよいし、分枝鎖ポリアミン製造用として市販されている例えばジアミノエタン（プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等）、アミン、スペルミジン、スペルミン等のアミンの完全なシアノエチル化により常法で合成してもよい。
−アルキル化剤はアルキル化方法に応じて次のように選択される。慣用アルキル化にはブロモ酢酸、ω−ハロゲノカルボン酸を使用し、還元アルキル化にはω−アルデヒドカルボン酸（例えばグリオキサル酸、コハク酸準アルデヒド等）又はケト酸（例えばアセト酢酸又はピルビン酸等）を使用する。
−使用するポリマーは固相ペプチド合成（メリフィールド合成）用に市販されている樹脂、例えば遊離酸基をもつ生成物を提供するＯ−クロロトリチルクロリド樹脂、ＨＭＰ樹脂や、Ｒｉｎｋ型樹脂である。ポリアミノ酸は、固相で予備合成したブロモアルキル基をもつペプチド又はω−アルデヒド酸で直接合成することができる。
−Ａｌｄｒｉｃｈ製品ジオクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ＢＯＰ、ＤＭＡＰ、クロロギ酸ベンジルは市販品である。ＮａＣｌ及びＮａＨＣＯ３溶液は飽和溶液であり、ＫＨＳＯ４溶液は０．５Ｍである。
ｂ）物理的測定
陽子ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ ４００スペクトロメーターで６００ＭＨｚで記録した。
【００５５】
質量スペクトルはＡＰＩ−ＭＳ／ＩＩＩで測定した。
ｃ）クロマトグラフィー技術
ＨＰＬＣ分析はＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ装置にオート
サンプラーＡＳ−２０００Ａ、インテリジェントポンプＬ−６２００Ａ及び紫外−可視検出器Ｌ−４０００を取り付け、分析用分離には２２０ｎｍ、分取用分離には２３５ｎｍの波長に調節して実施した。分析用分離カラムはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＢＵ−３００ ａｑｕａｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ ７ｍ，３００Ａ ３００×４．６ｍｍカラムを使用し、分取用分離カラムはＢｉｏｒａｄ製Ｂｉｏｓｉｌ Ｃ１８ ＨＬ ９０−１０ ２５０×１０ｍｍカラムを使用した。移動相はＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）である。分析用分離流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、分取用分離流速は４ｍｌ／ｍｉｎに調節する。
【００５６】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は厚さ０．２ｍｍのＭｅｒｃｋシリカゲルプレートで実施した。
【００５７】
カラムクロマトグラフィーは粒度０．０６３〜０．２００ｍｍのシリカゲル６０ Ｍｅｒｃｋで実施した。
【００５８】
カラムクロマトグラフィーの検出は紫外線（２５４ｎｍ）を用いるか、アミン又はアミドの検出にはニンヒドリンを用いて１５０℃に加熱しながらニンヒドリンのエタノール溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌ ＥｔＯＨ）を噴霧（弱いスプレー）し、第１級アミンの検出にはフルオレサミンを用いて溶液（４０ｍｇ／１００ｍｌアセトン）を噴霧し、あるいはヨードを用いてヨード粉末でプレートを覆うことにより実施した。
【００５９】
カラムクロマトグラフィーは粒度０．０６３〜０．２００ｍｍのシリカゲル６０ Ｍｅｒｃｋで実施した。
ｄ）固相合成ＳＰＰＳ法
固相合成は手動製造用ＳＰＰＳペプチド合成用手動反応器で実施し、撹拌機はＦｌａｓｋ Ｓｈａｋｅｒ モデルＡ５−６０２１である。ＳＰＰＳでポリアミンの固相結合及びポリアミンの保護後にＫａｉｓｅｒ試験を行う［Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．，Ｃｏｌｅｓｃｏｌｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｏｓｓｉｎｅｒ，Ｃ．Ｄ．及びＣｏｏｋ，Ｐ．Ｉ． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４（２），５９５（１９７０）］。実施例でＳＰＰＳに使用した樹脂はスイス、ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ製クロロトリチルクロリド樹脂である。
２．一般操作方法
ａ）（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアミノプロピル）−１−４−ジアミノブタンの製造により例示する対称ポリアミンの合成
２リットル容三頚丸底フラスコに１−４−ジアミノブタン１４７ｇと脱イオン水１０００ｍｌを仕込む。溶液を磁気撹拌する。温度を３８℃に維持しながら等圧フラスコによりアクリロニトリル４４３ｇを１時間かけて加える。次いで還流冷却器を取り付け、１時間かけて混合物を水浴で８０℃まで昇温させる。フルオレサミン試験は陰性であり、過剰のアクリロニトリルを４０℃で減圧蒸発させる。
【００６０】
２相が得られる。下部の有機相を分離し、水３００ｍｌで洗浄し、１０００ｍｌ容丸底フラスコに移す。水／メタノール（１：１ｖ／ｖ）混合物１７０ｍｌを加える。一晩結晶化させる。翌日、結晶を細孔度３の５００ｍｌ容ガラス濾過器で濾過する。
【００６１】
ケーキをガラス濾過器でメタノール（２×１７０ｍｌ）とエーテル（２×１５０ｍｌ）で洗浄する。生成物を減圧デシケーター（２６ｍｍ）で一晩連続乾燥する。こうして生成物４６１ｇ（収率９３％）が得られる。生成物をＮＭＲとＭＳにより分析した処、分析値は整合していた。生成物を精製せずに水素化する。
【００６２】
１リットル容イノックスオートクレーブに上記ポリニトリル３０ｇ（０．１モル）を仕込む。同時にビーカーでエタノール１４０ｍｌ（９５％）とＮａＯＨ８ｇ（０．２モル）の溶液を調製する。ＮａＯＨが可溶化したらこの溶液をオートクレーブに加える。オートクレーブに窒素を通し、炭素担持ラネーニッケル８ｍｌを加える。オートクレーブを閉じる。初期水素化圧は５２気圧であり、周囲温度で５時間かけて２８．５気圧まで下げる。懸濁液を濾紙で濾過し、濾渣をエタノール（２×２５ｍｌ）で洗浄し、濾液を減圧乾燥して濃縮する。油状物を水３０ｍｌと混合し、ＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌで抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した後、減圧蒸発させる。黄色っぽい液体油状物（２７ｇ、収率８５％）が得られる。
【００６３】
生成物をＴＬＣ（単スポット）、ＮＭＲ及びＭＳにより分析した処、分析値は整合していた。生成物を精製せずに使用する。
ｂ）方法Ａ：酸基のポリマー支持体固定
クロロトリチルクロリド樹脂（５ｇ、１．２ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ樹脂）をＳＰＰＳ反応器に仕込み、ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌを加え、混合物を５分間撹拌する。ブロモ酢酸（１．０５ｇ、７ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＥＡ（０．９５ｍｌ，７．５ｍｍｏｌ）を加える。反応器を周囲温度で２時間撹拌する。液体を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０）及びＭｅＯＨ（２×５０ｍｌ）で洗浄する。最後に樹脂を窒素流下に乾燥する。
ｃ）方法Ｂ：ポリアミンとブロモアセチル樹脂の反応
ポリアミン（１０モル倍）をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌに溶かし、方法Ａにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を周囲温度で２時間撹拌する。溶媒を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０ｍｌ）で洗浄すると、Ｋａｉｓｅｒ試験は陽性である。
ｄ）樹脂上のポリアミノ酸の保護
方法Ｃ：
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４８ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（５０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）に溶かし、方法Ｂにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を一晩撹拌する。翌日、Ｋａｉｓｅｒ試験は陰性である。溶媒を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×５０ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×５０ｍｌ）及びエーテル（２×５０ｍｌ）で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。Ｋａｉｓｅｒ試験は依然として陰性である。
方法Ｄ：
方法Ｂにより得られた樹脂（１．５ｇ）を丸底フラスコに入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）、次いでＤＩＥＡ（２０ｍｍｏｌ）を加える。混合物を磁気撹拌し、クロロギ酸ベンジル（１４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下する。ｐＨはＤＩＥＡを加えて１１に維持する。一晩後、樹脂をＳＰＰＳ反応器に移し、濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２とｉＰｒＯＨ（１０×２０ｍｌ）及びエーテル（２×２０ｍｌ）で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。
ｅ）方法Ｅ：樹脂からの保護ポリアミノ酸の分離
磁気棒を備える２５０ｍｌ容丸底フラスコに、方法Ｃ及びＤにより得られた樹脂を加える。ＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌとＣＦ３ＣＨ２ＯＨ ２５ｍｌからなる溶液を加え、混合物を２時間撹拌する。溶液を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍｌ）で洗浄し、こうして得られた有機相を集めて減圧蒸発させる。次に、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）を溶離剤としてＳｉＯ２上でフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製する。生成物を含むフラクションをＴＬＣにより同定する。（詳細については下記実施例参照。）
ｆ）方法Ｆ：アミノ酸とジリピジルアミンの結合
Ｂｏｃ−アミノ酸（１０ｍｍｏｌ）とＣ１２〜Ｃ２２ジリピジルアミン（１０ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌ容丸底フラスコに加える。ＣＨＣｌ３（１００ｍｌ）を加え、完全に溶解するまで混合物を撹拌する。次いでＴＥＡ（３０ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（３３ｍｍｏｌ）を加える。ＴＥＡを加えてｐＨを１０に維持し、反応物を２時間撹拌する。反応の完了後（ＴＬＣ）、クロロホルムを蒸発させ、固形分を酢酸エチル（３００ｍｌ）にとる。有機相をＫＨＳＯ４（４×１００ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（４×１００ｍｌ）及びＮａＣｌ（４×１００ｍｌ）で洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をＴＬＣ、ＮＭＲ及びＭＳにより分析し、精製せずに使用する。収率は約９０％である。
ｇ）保護ポリアミノ酸とジリピジルアミド酸の結合と、Ｂｏｃ及びＺ保護基の分離
方法Ｇ：
方法Ｆにより得られた生成物（９ｍｍｏｌ）を磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、冷ＴＦＡ（４℃）を加える（３０ｍｌ）。溶液を１時間撹拌する。ＴＦＡを減圧蒸発させる。ＤＭＦ（７０ｍｌ）を加えて生成物を溶かす。ＴＥＡ（３０ｍｍｏｌ）を加えた後、方法Ｅにより得られた保護ポリアミノ酸（９ｍｍｏｌ）を加える。ｐＨを１０に調整し、ＢＯＰ（３３ｍｍｏｌ）を加える。溶液を２時間撹拌後、ＴＬＣを行う。結合の完了後（ＴＬＣ）、ＫＨＳＯ４溶液（７００ｍｌ）を加え、生成物を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出する。有機相をＫＨＳＯ４（３×５０）、ＮａＨＣＯ４（３×５０）及びＮａＣｌ（３×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をＮＭＲ、ＴＬＣ及びＭＳにより分析し、予備精製せずに脱保護する。ＴＦＡ（５０ｍｌ）を生成物に加え、溶液を１．５時間撹拌し、ＴＦＡを蒸発させる。生成物がＴＦＡで分離可能なＺ又はＣｌＺ基をまだ含んでいる場合には、方法Ｈを直接実施する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製する（実施例参照）。
方法Ｈ：
方法Ｇにより得られた生成物がＺ又はＣｌＺ基を含んでいる場合には、磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、１０ｍｌ ＭｅＯＨ／ｇ生成物に溶かす。Ｐｄ／Ｃ（１０％、１ｇ／ｇ生成物）とギ酸アンモニウム（１ｇ／ｇ生成物）を周囲温度で加える。ＨＰＬＣにより水素化を行う。２時間後に反応を終了し、混合物を濾過し、濾渣をＭｅＯＨ １０ｍｌで洗浄する。軟蒸留水を加え、溶液を凝固させ、凍結乾燥する。最終生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。
ｈ）方法Ｉ：Ｂｏｃ保護基の脱保護
丸底フラスコ中のＢｏｃ基（１ｍｍｏｌ）を含む生成物にトリフルオロ酢酸（５０ｍｌ）を加える。溶液を１．５時間撹拌し、ＴＦＡを蒸発させる。アミンを完全に脱保護し、精製せずに結合に使用する。
Ｂ−生物学的試験材料及び方法
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入に使用したプラスミド
プラスミドｐＣＭＶ−ＬＵＣは、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出したヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含むＭｌｕ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントの挿入により、プラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はプラスミドｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導される構築物である。
２．トランスフェクションに使用した溶液の調製プロトコール
本発明に記載する生成物はエタノール又は水に２０ｍＭに溶かした後、最終エタノール濃度が１０％未満となるように水で希釈する。
【００６４】
生理的血清（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で希釈した核酸溶液を１／１（ｖ／ｖ）の比でリポフェクタント溶液に加える。ボルテックス均質化と周囲温度で１５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ／リポフェクタント溶液を最終濃度９％（ｖ／ｖ）でウェルに分配し、無タンパク質（血清）成長培地で洗浄し、無血清又は非無血清培地で再培養した。
Ｃ−ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ材料
１．材料
ａ）実験モデル：
−雌成体（＞８週）マウスＣ５７／ＢＬ６。
−腫瘍フラグメントを脇腹の皮下に移植して動物間で継代することにより得られる３ＬＬ（ルイス肺癌）型腫瘍。
ｂ）使用したプラスミド：
ｐＸＬ２６２２：ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流にｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から抽出したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを挿入することにより、基本プラスミドｐＧＬ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）から誘導される。このプラスミドはＰＥＧ沈殿法（Ａｕｓｕｂｅｌ）により得られ、 ＤＮＡ約１０μｇ／μｌの濃度で４℃で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８中に保存する。
２．プロトコール
注射溶液：まずトランスフェクトしようとするＤＮＡを緩衝液に可溶化した後、配列番号１のペプチド（ＫＴＰＫＫＡＫＫＰ）２を加え、２０分後に高濃度（２０又は４０ｍＭ）のカチオン脂質溶液を混合物に加える。全生成物の添加後、混合物はＤＮＡ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）、ペプチド（０．７５ｍｇ／ｍｌ）及びカチオン脂質以外に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｄ−グルコース及び５ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．２を含有している。溶液の調製から２０〜３０分後に注射を行う。
【実施例】
【００６５】
実施例１：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（６）の合成
ａ−｛Ｂｏｃ−［３−（Ｂｏｃ−｛４−［Ｂｏｃ−（３−Ｂｏｃ−アミノプロピル）アミノ］ブチル｝アミノ）プロピル］アミノ｝酢酸（３）の合成
方法Ａにより得られた樹脂を方法Ｂ、Ｃ及びＥによりスペルミンと反応させる。保護生成物をＳｉＯ２上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は４０％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝４．２２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：１．４０（４ｓ，３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）； １．４６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．６４及び１．７４（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ２．９６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）； ３．１５（ｍｔ，８Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）； ３．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）； ３．８３（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ＭＨ＋：６６１。
ｂ−｛Ｚ−［３−（Ｚ−｛４−［Ｚ−（３−Ｚ−アミノプロピル）アミノ］ブチル｝アミノ）プロピル］アミノ｝酢酸（４）の合成
方法Ａにより得られた樹脂を方法Ｂ、Ｃ及びＤによりスペルミンと反応させる。保護生成物をＳｉＯ２上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は２０％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８５（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝６．９２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４１３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４９（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．７４及び１．８１（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ３．０７（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯベンジル）； ３．１５−３．３０（ｍｔ，８Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）； ３．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＯ）； ３．７０（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）； ５．０７，５．１０，５．１２及び５．１３（４ｓ，各２Ｈ：ＡｒＣＨ２ＯＣＯＮ）； ６．６５（ｍｆ，１Ｈ：ＮＨＣＯ）； ７．２５−７．４０（ｍｔ，２０Ｈ：芳香族Ｈ）。
ＭＨ＋：７９７。
ｃ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ジオクタデシルアミド（５）
方法ＦによりＢｏｃ−Ｇｌｙをジオクタデシルアミンに結合する（収率９０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：６７９。
１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２９（ｍｔ，６０Ｈ；脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．４９（ｓ，９Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）； １．５５（ｍｔ，４Ｈ；各脂肪鎖の１ＣＨ２）； ３．１５及び３．３３（２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，各２Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．９５（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）； ５．５７（ｍｆ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ｄ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１８］２（６）
生成物（３）と（５）又は（４）と（５）を方法Ｇにより結合する。生成物をＢｏｃ保護生成物は方法Ｇ、Ｚ保護生成物は方法Ｈに記載したように脱保護する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．３５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＢＹＫ２０５３１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度３００Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８３（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２３（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．４３及び１．５３（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）； １．６３（ｍ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； １．９６（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ２．９３，３．００及び３．２２（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ＮＣＨ２）； ３．８３（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）； ４．０３（ｓ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：８２１。
【００６６】
実施例２：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１８］２（７）の合成
生成物（３）を方法Ｆによりジオクタデシルアミンと結合し、方法Ｇにより脱保護する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＦ３ＣＯＯＤ ２／３とＣＤ３ＣＯＯＤｄ４ １／３の混合物中，ｄ（ｐｐｍ））：０．７８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）； １．２０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）； １．５２（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）； １．８０（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）； ２．２３及び２．３２（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）； ３．１０−３．４０（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ＮＣＨ２）； ４．１５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：７６４。
【００６７】
実施例３：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇＮ［（ＣＨ２）１８］２（９）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｚ２）ジオクタデシルアミド（８）
本生成物は、方法ＦによりＢｏｃＡｒｇ（Ｚ２）とジオクタデシルアミンを結合して合成する（収率９１％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：１０４６。
ｂ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇＮ［（ＣＨ２）１８］２（９）
生成物（３）又は（４）を方法Ｇにより生成物（８）と結合し、方法Ｇ（Ｂｏｃ）及び／又はＨ（Ｚ）により脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．８３分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ）））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖のＣＨ２）；１．４０−１．８０（ｍｔ，１２Ｈ：ＣＨ２）；１．９３（ｍ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８０−３．１０（３ｍｔ，１６Ｈ：ＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．４２（ｍｔ，２Ｈ：アミドのＣＨ２Ｎ）；３．７７（ｍｔ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．６７（ｍｔ，１Ｈ：ＮＣＨＣＯＮ）；６．８０−７．５０（広幅ｍｆ，２Ｈ：ＮＨ２）；７．７８，７．９２，８．８０及び９．０３（夫々ｍｔ及び３ｍｆ、夫々１Ｈ，２Ｈ，４Ｈ及び１Ｈ：ＣＯＮＨ，ＮＨ及びＮＨ２）。ＭＨ＋：９２０。
【００６８】
実施例４：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｒｇ（Ｚ）２Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１０）の合成
生成物（３）を方法Ｇにより生成物（８）と結合し、同一方法によりＢｏｃ基を分離する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１７．７５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４０及び１．５７（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，８Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８５−３．０５（ｍｔ，合計１４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．７５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；３．８５及び３．９５（２ｍｔ，各１Ｈ：ＣＨ２ＮＣ）；４．６７（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．０７及び５．２５（夫々限界ＡＢ及びｓ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，各２Ｈ：ＮＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；７．２５−７．４５（ｍｔ，１０Ｈ：芳香族Ｈ）；７．９５，８．８５，９．９０及び９．２０（４ｍｆ：互換Ｈ）。
ＭＨ＋：１１８８。
【００６９】
実施例５：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ローダミン）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１３）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）ジオクタデシルアミド（１１）
本生成物は、方法ＦによりＢｏｃＬｙｓ（ＣｌＺ）をジオクタデシルアミンと結合することにより合成した（収率８９％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．９２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：９１８。
ｂ−ＢｏｃＨＮ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣｌＺ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１２）
（Ｂｏｃを脱保護せずに）生成物（３）を方法Ｇにより生成物（１１）に結合する。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４２３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．３２（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４４（２ｓ，合計３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５０−１．８０（ｍｔ，１６Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２及びプロピルの中心のＣＨ２）；３．００（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；３．０５（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＨ２ＮＣＯＯ）；３．１５−３．４０（ｍｔ，１４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２，ＣＨ２ＮＣＨ２及びＣＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２Ｎ）；３．８０（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；５．９７及び６．５３（２ｍｔ，各１Ｈ：ＯＣＯＮＨ及びＮＨＣＯＯ）；７．０８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）；７．３０−７．５０（ｍｔ，４Ｈ：芳香族Ｈ）。
ｃ−Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ローダミン）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１３）
生成物（１２）のリジン上のＣｌＺ基を方法Ｈにより分離し、こうして得られた生成物を減圧乾燥し、エーテルにとり、ＮａＨＣＯ３とＮａＣｌで濯ぐ。エーテルをＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。
【００７０】
脱保護生成物７７ｍｇ（６０μＭ）をＭｅＯＨ ３ｍｌに溶かし、ＤＩＥＡ（６４μＬ）を加えた後、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（３０ｍｇ，６８μＭ）を加え、溶液を１７時間撹拌し、反応をＴＬＣによりモニターする。翌日、溶液を減圧乾燥して濃縮する。次にＴＦＡ（４ｍｌ）を加え、１時間撹拌する。ＴＦＡを蒸発させ、粗生成物を準分取ＨＰＣＬにより精製する（最終収率３０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（ＭｅＯＨ）。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝６１．５５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［１００／０］、３〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１３３５。
【００７１】
実施例６：
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ビオチニル）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１４）の合成
生成物（１２）を方法Ｈにより脱保護し（２７１ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶かす。ＤＩＥＡ（０．１１ｍｌ）を加えた後、ビオチン（５６．４ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（１０２ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ；ｐＨは１０（ＤＩＥＡ）に維持）を加え、反応の終了をフルオレサミン試験により確認する。生成物を方法Ｆに記載したように回収し、精製せずにＴＦＡ（５ｍｌ）で１時間脱保護する。ＴＦＡを蒸発させ、生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製する（収率５０％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．１２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［４０／６０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１１１８。
【００７２】
実施例７：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１６）の合成
ａ−｛ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨＢｏｃ｝（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＯＨ（１５）
生成物（１）を方法Ｂによりポリマーに固定し、方法Ｃにより保護し、方法Ｅにより樹脂から分離する。生成物をＳｉＯ２上で精製する（収率３５％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度４３３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４２（ｓ，３６Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．６５−１．８５（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．７６（ｍｔ，１２Ｈ：ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２）；３．０６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；３．２９（ｍｔ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．８６（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ＭＨ＋：７７５。
ｂ−｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１６）
生成物（１５）を方法Ｇにより生成物（５）と結合する。生成物を方法Ｇにより脱保護し、準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥する（収率５５％）。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝３８．７２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８６Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．３０（ｍ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．５５（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９７（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８０−３．０５，３．０６及び３．２８（夫々ｍｔ及び２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１８Ｈ，２Ｈ及び４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．８０（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０３（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；６．００−９．００（広幅ｍｆ：ＮＨ２及びＮＨ）；８．２７（ｍｔ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：９３５。
【００７３】
実施例８：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３｝２Ｎ（ＣＨ２）４Ｎ｛（ＣＨ２）３ＮＨ２｝（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１７）の合成
（３）の代わりに生成物（１５）を使用することにより生成物（７）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥する。
ＨＰＬＣ（準分取），Ｒｔ＝３８分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．２９（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．５２（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６８（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２ＣＨ２）；１．９０−２，１０（ｍｔ，８Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９０，２．９５−３．１５，３．１８及び３．１５（夫々ｔ，ｍｔ及び広幅２ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，合計２４Ｈ：ＮＣＨ２）；４．０２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）。
ＭＨ＋：８７８。
【００７４】
実施例９：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１９）の合成
ａ−｛ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＯＨ（１８）
生成物（１）の代わりにトリス（アミノエチル）アミンを使用することにより生成物（１５）と同様に合成する（収率２９％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５５（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，８：２）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：１．４４（ｓ，２７Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；２．５８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．６６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；
３．０４（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；
３．２８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２）；
３．７６（ｓ，２Ｈ：ＯＣＯＮＣＨ２ＣＯＯ）；６．０６（ｍｆ，２Ｈ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：５０５。
ｂ−｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（１９）
（１５）の代わりに（１８）を使用することにより生成物（１７）と同様に合成する（収率６５％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：ＣＨ３）；１．１５−１．３５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心のＣＨ２）；１．４５及び１．５５（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；２．６４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ：ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．７５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；２．９５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ：ＮＣＨ２）；３．０８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２）；３．２５（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．８８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ：ＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；７．７５（残留広幅ｍｆ：ＮＨ）；８．６８（残留ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ：ＣＯＮＨ）。
ＭＨ＋：７６５。
【００７５】
実施例１０：
｛Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２｝２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２０）の合成
（５）の代わりにジオクタデシルアミンを使用することにより生成物（１９）と同様に合成する（収率７３％）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１００．１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：１０分［１００／０］、１０〜４５分［０／１００］、４５〜１４０分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７０８。
【００７６】
実施例１１：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２１）（ＲＰＲ１２７８８８Ａ）の合成
生成物（１２）を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）、次いで方法Ｉにより脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１１．７６分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８９２。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３５−１．７５（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．８２，２．９８，３．０６及び３．１０−３．５０（夫々２ｔ，ｍｔ及び２ｍｆ、Ｊ＝７Ｈｚ，合計１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７３（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．１８（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７７】
実施例１２：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２２）（ＲＰＲ１２２７５９Ａ）の合成
生成物（１２）を方法Ｉにより脱保護する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１６．７９分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０６０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３７３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３０−１．７５（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．９８，３．０６及び２．９０−３．５０（夫々２ｍｔ及びｍｆ，合計１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．５９（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１６（ｓ，２Ｈ：ＣＯＯＣＨ２Ａｒ）；６．８５（ｍｆ，１Ｈ：ＯＣＯＮＨ）；７．３５−７．５５（ｍｔ，５Ｈ：芳香族Ｈ）；８．１５（ｍｆ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７８】
実施例１３：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣＨＯ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２４）（ＲＰＲ１２２７６０Ａ）の合成
ａ−ＮＨＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＬｙｓＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２３）
生成物（１２）を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）により脱保護し（収率６５％）、精製せずに使用する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２０．８２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ（ＣＨＯ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２４）
生成物（２３）を方法Ｇによりギ酸と結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．６０分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９２０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．３５−１．７０（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，リシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９８（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．８５−３．５０（ｍｔ，１８Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）； ３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；７．６０（ｍｆ，１Ｈ：ＣＯＮＨ）；８．０５（広幅ｓ，１Ｈ：アルデヒドのＣＨ）；８．１８（ｍｆ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）。
【００７９】
実施例１４：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ［コレステリル］Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２５）（ＲＰＲ１２８１４２Ａ）の合成
（ＢＯＰ試薬を使用せずに）生成物（２３）を方法Ｇによりクロロギ酸コレステリルと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２１．６６分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１３０４。
１ＨＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．６８及び０．９８（２ｓ，各３Ｈ：コレステリルの１８位ＣＨ３及び１９位ＣＨ３）；０．８６（ｍｔ，１２Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３並びにコレステリルの２６及び２７位ＣＨ３）；０．９１（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ：コレステリルの２１位ＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；０．８０−２．３０（ｍｔ，４２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，コレステリルの１、２、４、７、１１、１２、１５、１６、２２、２３及び２４位のＣＨ２，コレステリルの８、９、１４、１７、２０及び２５位のＣＨ，リシルの中心の（ＣＨ２）３並びにプロピルのＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．８８及び２．９６（２ｍｔ，合計１４Ｈ：リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２）；３．２０−３．５０（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６４（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．２３（ｍｔ，１Ｈ：コレステリルの３位ＣＨ）；４．６３（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．３０（ｍｔ，１Ｈ：コレステリルの６位ＣＨ）；６．９８（ｍｔ，１Ｈ：ＮＨＣＯＯ）；７．９０（ｍｔ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＨ）；８．６０−９．０１（互換ｍｆ）。
【００８０】
実施例１５：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＬｙｓ［アラキドニル］Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２６）（ＲＰＲ１３０６０５）の合成
生成物（２３）を方法Ｇにより窒素流下で遮光下にアラキドン酸と結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２０．６７分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１１７７。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）； ０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ：アラキドニルのＣＨ３）；
１．３１（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；
１．３５−１．７５（ｍｔ，１８Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２，アラキドニルの中心の（ＣＨ２）３，アラキドニルの中心のＣＨ２及びリシルの中心の（ＣＨ２）３）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．０２（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．１０（ｍｔ，６Ｈ：ＣＯＣＨ２及びアラキドニルの２個の＝ＣＣＨ２）；２．８０，２．９７，３．０６及び３．１０−３．５０（夫々ｍｔ，ｔ，ｍｔ及び２ｍｆ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計２４Ｈ：アラキドニルの＝ＣＣＨ２Ｃ＝，リシルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７３（ｄｄ，Ｊ＝８及び５Ｈｚ，１Ｈ：リシルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．３８（ｍｔ，８Ｈ：アラキドニルのＣＨ＝ＣＨ）。
【００８１】
実施例１６：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２８）（ＲＰＲ１２６０９７Ａ）の合成
ａ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−Ｂｚ）−ジオクタデシルアミン（２７）
本生成物は方法ＦによりＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）とジオクタデシルアミンを結合して合成する（収率９０％）。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８８（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２８）
生成物（３）又は（４）を方法Ｇ、次いで方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ脱保護）により生成物（２７）と結合する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１４．６４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８９３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．５６（ｍｆ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６０−２．００（ｍｔ，２Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．７３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心のＣＨ２）２）；１．９８（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．３２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；３．００，３．０６及び３．４５（夫々ｔ及び２ｍｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１６Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．８５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．１９（広幅ｓ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）。
【００８２】
実施例１７：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（Ｏ−Ｂｚ）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（２９）（ＲＰＲ１２３０２７Ａ）の合成
生成物（３）を方法Ｇにより生成物（２７）と結合し、脱保護（Ｂｏｃ）する。最終生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１６．０２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９８３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４１３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３０（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．５５（ｍｆ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．７５−２．００（ｍｔ，２Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．９９（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．４７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；２．９５，３．０５及び３．４０（３ｍｔ，合計１６Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６２（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．８５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；５．１４（限界ＡＢ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２Ｈ：ベンジルのＣＨ２）；７．３５（ｍｔ，５Ｈ：ベンジルの芳香族Ｈ）；８．２３（ｍｆ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）。
【００８３】
実施例１８：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３１）（ＲＰＲ１３０５９６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃＣＨ２ＣＯＧｌｕＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３０）
生成物（３）を生成物（２７）に結合し、側鎖のＯＢｚ保護基を方法Ｈ（Ｃｌ−Ｚ）により分離し、精製せずに使用する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２２．８４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１２９３。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３１）
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．７１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８４】
実施例１９：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（ガラクトサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３２）（ＲＰＲ１３０５９５Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２．２７分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８５】
実施例２０：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（マンノサミド）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３３）（ＲＰＲ１３０５９８Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより塩酸Ｄ（＋）−マンノサミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１２．９８分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１０５４。
【００８６】
実施例２１：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（Ｎ（ＣＨ３）２）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３４）（ＲＰＲ１３１１１１Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇによりジメチルアミンと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１４．４４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：９２０。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２５（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４３及び１．６０（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．６５及び１．８５−２．００（２ｍｔ，各１Ｈ：グルタリルの中心のＣＨ２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．３２（限界ＡＢ，２Ｈ：グルタリルのＣＯＣＨ２）；２．８０及び２．９２（２ｓ，各３Ｈ：ＣＯＮ（ＣＨ３）２）；２．８５−３．０５（ｍｔ，１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２）；３．００，３．２２，３．４５及び３．５８（４ｍｔ，各１Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７８（ＡＢ，Ｊ＝１６Ｈｚ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．７５（ｍｔ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＣＨＣＯＮ）；８．７２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ：グルタリルのＣＯＮＨ）；８．８５及び８．９０−９．１５（互換ｍｆ）。
【００８７】
実施例２２：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１１ＣＨ３］２（３５）（ＲＰＲ１２２７６７Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝９．５４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：６５３。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度４０３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９３（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３３（ｍｔ，３６Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）９）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５及び２．００（２ｍｔ，各２Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．００（２ｍｔ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．５８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０５（ｓ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
【００８８】
実施例２３：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１２ＣＨ３］２（３６）（ＲＰＲ１２２７７４Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジトリドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１０．６４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：６８１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３３（ｍｔ，４０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１０）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．００（２ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）；８．６０（広幅ｓ，１Ｈ：グルシルのＣＯＮＨ）。
【００８９】
実施例２４：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１３ＣＨ３］２（３７）（ＲＰＲ１２２７６６Ａ）の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジテトラドデシルアミンを使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝９．９２分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７０９。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３９３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．９０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．３１（ｍｔ，４４Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１１）；１．５８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７６（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；２．００（ｍｔ，４Ｈ：プロピルの中心のＣＨ２）；２．９８及び３．０８（夫々ｍｔ及びｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，合計１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．３０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．６５（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ：グルシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）； ８．１０（ｍｆ，１Ｈ：グルシルのＣＯＮＨ）。
【００９０】
実施例２５：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４Ｎ［（ＣＨ２）３ＮＨ２］ＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３９）（ＲＰＲ１２６０９６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４Ｎ［（ＣＨ２）３ＮＨＢｏｃ］ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（３８）の合成
生成物（３）の合成中にＳｉＯ２上で精製時に副産物（３８）を回収する。収率は８％である。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３２（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＭＨ＋：５６１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：１．３０−１．６１（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．４０（ｓ，２７Ｈ：Ｃ（ＣＨ３）３）；１．５６（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．６８及び３．１１（夫々広幅ｔ及びｔ、Ｊ＝７Ｈｚ，各４Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；２．９０及び２．９６（２ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，各２Ｈ：プロピルのＢｏｃＮＨＣＨ２）；３．１８（ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＯ）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４［Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ２］ＣＨ２ＣＯＧｌｙＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（３９）
生成物（３８）と（５）を方法Ｇにより結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．６０分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８２１。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６にＣＤ３ＣＯＯＤ ｄ４数滴を滴下，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：各脂肪鎖のＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４６及び１．５４（２ｍｔ，各２Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．６３（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９１（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．８５−３．１５（ｍｔ，１２Ｈ：ブチルのＮＣＨ２及びプロピルのＮＣＨ２）；３．２４（ｍｔ，４Ｈ：脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７６（ｍｆ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；４．０５（広幅ｓ，２Ｈ：グリシルのＣＯＮＣＨ２ＣＯＮ）。
【００９１】
実施例２６：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４１）（ＲＰＲ１２２７８６Ａ）の合成
ａ−ＢｏｃＮＨ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）４ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＮＢｏｃ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｈ（４０）
溶液としてのＮａＣＮＢＨ３とコハク酸準アルデヒドの存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物（４０）を合成する。
【００９２】
２００ｍｌ容丸底フラスコにスペルミン１．８ｇ、メタノール６０ｍｌ及びＮａＣＮＢＨ３ ０．１３８ｇを仕込む。溶液を激しく磁気撹拌する。等圧フラスコによりコハク酸準アルデヒド５．５ｍｌ（１５％）とメタノール３０ｍｌの溶液を１００分間かけて注入する。撹拌を１００分間維持する。アミンをＢｏｃ基により次のように保護する。媒質にＴＥＡ２．８ｍｌを注いだ後、メタノール３０ｍｌに可溶化したジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート８．８ｇを加える。撹拌下に一晩維持する。媒質を減圧濃縮し、生成物を酢酸エチルにとり、ＮａＨＣＯ３３×５０ｍｌで抽出し、水相を集めてエーテル（３×１００ｍｌ）で濯ぐ。ＫＨＳＯ４を加えて水相のｐＨを３まで下げ、生成物４１の沈殿による濁りを確認し、混合物を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。生成物を精製せずに使用する。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４１）
生成物（４０）とジオクタデシルアミンを方法Ｇにより結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．０４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：７９２。
１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，温度３８３Ｋ，ｄ（ｐｐｍ））：０．８５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２２（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４８（ｍｔ，４Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２）；１．７２（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．８８（ｍｔ，２Ｈ：アミノペンタノイルの中心のＣＨ２）；１．９９（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．４２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：アミノペンタノイルのＣＯＣＨ２）；２．９６，３．０３及び３．２２（３ｍｔ，合計１８Ｈ：アミノペンタノイルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）。
【００９３】
実施例２７：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＮ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４２）（ＲＰＲ１２８５０６Ａ）の合成
ＢｏｃＧｌｙの代わりにＢｏｃ６−アミノカプロン酸を使用する以外は生成物（６）と同様に合成する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションをＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１３．９４分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：８７７。
１ＨＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ ｄ６，ｄ（ｐｐｍ））：０．８７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ：脂肪鎖のＣＨ３）；１．２８（ｍｔ，６０Ｈ：脂肪鎖の中心の（ＣＨ２）１５）；１．４８（ｍｔ，１０Ｈ：各脂肪鎖の１ＣＨ２及びアミノヘキサノイルの中心の（ＣＨ２）３）；１．６５（ｍｔ，４Ｈ：ブチルの中心の（ＣＨ２）２）；１．９５（ｍｔ，４Ｈ：プロピルのＣＨ２）；２．２７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ：アミノヘキサノイルのＣＯＣＨ２）；２．８５−３．３０（ｍｔ，１８Ｈ：アミノヘキサノイルのＮＣＨ２，ブチルのＮＣＨ２，プロピルのＮＣＨ２及び脂肪鎖のＮＣＨ２）；３．７０（広幅ｓ，２Ｈ：ＮＣＨ２ＣＯＮ）；７．９０−９．１０（互換ｍｆ）。
【００９４】
実施例２８：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＧｌｕ（１１−アミドウンデカニルヘプタ−Ｏ−アセチルラクトース）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４３）（ＲＰＲ１３０７６５Ａ）の合成
生成物（３０）を方法Ｇにより１１−アミノウンデカニルヘプタ−Ｏ−アセチルラクトースと結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．９１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１６８０。
【００９５】
実施例２９：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｓｍ（β−ＮＡｃ（Ａｃ）３）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４５）（ＲＰＲ１３１２８３Ａ）の合成
ａ−Ｆｍｏｃ−Ａｓｍ−β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ（Ａｃ）３−ジオクタデシルアミン（４４）
本生成物は方法ＦによりＦｍｏｃ−Ａｓｍ−β−Ｇｌｃ−ＮＡｃ（Ａｃ）３−ＯＨとジオクタデシルアミンを結合することにより合成する。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６７（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ，９：１）。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝２５．３１分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ｂ−ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨＣＨ２ＣＯＡｓｍ（β−ＮＡｃ（Ａｃ）３）Ｎ［（ＣＨ２）１７ＣＨ３］２（４５）
生成物（４５）のＦｍｏｃ基を分離する。
【００９６】
生成物（４５）０．７ｇにＤＭＦ２０ｍｌとジエチルアミン２ｍｌを注ぐ。撹拌下に６時間維持した後、媒質を減圧濃縮する。得られた生成物を方法Ｇにより生成物（３）に結合する。生成物を準分取ＨＰＬＣにより精製し、フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。
ＨＰＬＣ，Ｒｔ＝１５．３５分（Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ：３分［６０／４０］、３〜２０分［０／１００］、３５分［０／１００］）。
ＭＨ＋：１２０７。
【００９７】
実施例３０：
生成物（６）の大規模溶液合成
溶液としてのＮａＣＮＢＨ３とグリオキシル酸の存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物（６）を合成する。
【００９８】
２ｌ容丸底フラスコにスペルミン１８．２ｇ、メタノール５００ｍｌ及びＮａＣＮＢＨ３ ２ｇを仕込む。溶液を激しく磁気撹拌する。等圧フラスコによりメタノール３００ｍｌ中のグリオキシル酸８．４５ｇの溶液を１００分間かけて注入する。撹拌を一晩維持する。アミンをＢｏｃ基により次のように保護する。媒質にＴＥＡ１４ｍｌを注いだ後、ＴＨＦ２００ｍｌに可溶化したジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート１００ｇを加える。撹拌下に一晩維持する。媒質を減圧濃縮し、生成物を酢酸エチル（２５０ｍｌ）にとり、ＫＨＳＯ４（６×１００ｍｌ）、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（３×１００）で濯ぎ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させる。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）を溶離剤としてシリカカラムで生成物を精製する。生成物を含むフラクションをＴＬＣにより同定し、再び集めて減圧蒸発させると、生成物（６）１０ｇが得られる（合計合成収率１７％）。
【００９９】
分析ＨＰＬＣ、質量スペクトル及びＮＭＲの分析値は固相法により得られる生成物に一致する。
【０１００】
実施例３１：
（７）ＲＰＲ１２０５３４Ａ、（６）１２０５３５Ａ及び（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比（アミン／リン酸）の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３、３ＬＬ又はウサギＳＭＣ］１×１０５個のサンプルを、５％ＣＯ２下で電荷比を変えてリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液により３７℃で２時間処理し、各サンプルに核酸２μｇを投与する。最終濃度８％のウシ胎児血清を添加後、ＣＯ２インキュベーターで４０時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
【０１０１】
ルシフェラーゼ活性はルシフェリン、補酵素Ａ及びＡＴＰの存在下で１０秒間の発光［ＲＬＵ＝相対光単位］により定量し、処理細胞２０００個に対する割合として表す。得られた結果を図１、２及び３に示す。
【０１０２】
これらの図から明らかなように、脂質部分とポリアミンの間の「スペーサー」アームにグリシンが存在すると、低いナノモルカチオン脂質／μｇＤＮＡ比で良好なトランスフェクション効率が得られる。
【０１０３】
実施例３２：
（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ、（１９）１２０５２８Ａ、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比（アミン／リン酸）の効果
２ｃｍ２の指数増殖期のＮＩＨ ３Ｔ３細胞１×１０５個のサンプルを、５％ＣＯ２下で電荷比を変えてリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液により３７℃で２時間処理し、各サンプルに核酸１μｇを投与する。最終濃度８％のウシ胎児血清を添加後、ＣＯ２インキュベーターで４０時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
【０１０４】
ルシフェラーゼ活性は細胞の溶解後に得られる上清中で１０秒間の発光［ＲＬＵ＝相対光単位］により定量し、タンパク質１ｍｇに対する割合として表す。得られた結果を図４に示す。「スペーサー」アームにグリシン残基が存在すると有利であることは本実施例からも明白である。
【０１０５】
実施例３３：
（６）１２０５３５、（４１）ＲＰＲ１２２７８６及び（４２）ＲＰＲ１２８５０６によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー長の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３及びＨｅＬａ］１×１０５個のサンプルを、血清タンパク質の不在下で３７℃、５％ＣＯ２下の湿潤雰囲気でカチオン脂質濃度を変えてカチオン脂質／ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ混合物により２時間処理する。次いで細胞増殖培地に最終濃度８％のウシ胎児血清を加え、ＣＯ２インキュベーターで更に４０時間インキュベーション後にトランス遺伝子の発現を測定する。
【０１０６】
スペーサーの構造特性は以下の通りである。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
下表Ｉは得られた結果を示し、試験材料の各々で得られた最大効率を表す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
トランスフェクション効率は処理細胞２１０３個当たりのＲＬＵ／１０秒として与える。括弧内はナノモル脂質／μｇＤＮＡ比を示す。
【０１１１】
実験１及び２では異なるプラスミドを使用し、実験１及び２で夫々細胞１１０５個当たりＤＮＡ１μｇ及び０．５μｇの用量とする。
【０１１２】
実施例３４：
（６）ＲＰＲ１２０５３５によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー構造の効果
補助細胞系（３ＬＬ細胞）を導入した以外は上記実施例に記載したと同一の実験条件下で、Ａｒｇ型、Ｌｙｓ型又はＧｌｕ型の基で「スペーサー」を置換することにより修飾したカチオン脂質（６）ＲＰＲ１２０５３５を用いて得られたトランスフェクション効率を比較した。
【０１１３】
種々のスペーサーの構造は以下の通りである。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
トランスフェクション効率は処理細胞２１０３個当たりのＲＬＵ／１０秒として与える。
実験１及び２では異なるプラスミドを使用し、実験１及び２で夫々細胞１１０５個当たりＤＮＡ０．５μｇ及び１μｇの用量とした。結果を分析した処、該当細胞に応じて、好ましくは置換したアミノ酸鎖の存在は良好なトランスフェクション効率をもたらすことが判明した。
【表４】
【０１１６】
実施例３４：
（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａによるリポフェクタント／ＤＮＡ混合物中のＤＯＰＥの存在の効果
実施例３１で使用したと同一のプロトコールに従い、トランスフェクション混合物にＤＮＡを添加する前にカチオン脂質（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａに種々のモル比でＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を加えた。
細胞の溶解後に上清中のルシフェラーゼ活性を定量し、タンパク質１ｍｇに対する割合を計算する（図５）。
リポフェクタント混合物中にＤＯＰＥが存在すると、（９）ＲＰＲ１２０５３１Ａの濃度が低い場合にトランスフェクション効率を改善することができる。
【０１１７】
実施例３５：
（６）ＲＰＲ１２０５３５Ａ、（９）１２０５３１Ａ及び（１０）ＲＰＲ１２１６５０Ａによるトランスフェクション効率に及ぼす血清の効果
２ｃｍ２の指数増殖期の細胞［ＮＩＨ ３Ｔ３又はＨｅＬａ］１×１０５個のサンプルを、血清の不在下で２時間又は培地中の血清の存在下でリポフェクタント／ｐＣＭＶ−ＬＵＣ溶液（リポフェクタント３ナノモル／μｇＤＮＡ）により処理する。本実施例では各サンプルに核酸２μｇを投与する。細胞溶解液の上清中のルシフェラーゼの発現を調べ、ＲＬＵ／１０秒で表し、タンパク質１ｍｇに対する割合を計算する。結果を分析した処、血清の存在はトランスフェクションにさほど影響しないことが判明した。
【０１１８】
実施例３６：
（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ、（１９）１２０５２８Ａ、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５ＡによるＤＮＡ／リポフェクタント混合物中の核酸濃度の効果
実施例３１に記載した条件下で、ナノモルリポフェクタント／μｇＤＮＡ比を最適化し、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のサンプルにトランスフェクトする（実施例３２参照、（２０）ＲＰＲ１２０５２７Ａ及び（１９）ＲＰＲ１２０５２８Ａでは比＝６、（１７）ＲＰＲ１２０５２６Ａ及び（１６）ＲＰＲ１２０５２５Ａでは比＝３）。各サンプルに加えるＤＮＡの量は０．５〜２μｇとする。結果を図６に示す。
指数増殖期の細胞１×１０５個にプラスミドＤＮＡ１μｇをトランスフェクトするのが好ましい選択であると思われ、実際に、ＤＮＡの使用量が増加すると細胞に接触するカチオン脂質の濃度が増加し、場合によっては毒性の問題を生じる。ＤＮＡ濃度が低いと、トランスフェクション効率との比例が得られなくなる。
【０１１９】
実施例３７：
本発明によるリポポリアミンのｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション試験
腫瘍移植後７日のマウスをケタミン＋キシラジンで麻酔し、上記のように調製した本発明によるリポポリアミンを含む溶液を注射する。注射から２日後に腫瘍組織を取り出し、計量後に細切し、溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ１５３ Ａ）５００μｌ中で粉砕する。遠心分離（２００００ｇで１０分間）後、１０μｌを分取し、試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）５０μｌと混合後に得られた合計発光をルミノメーターＬｕｍａｔ ＬＢ ９５０１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定し、１０秒間積分することによりルシフェラーゼ活性を評価する。得られた活性を腫瘍溶解液の合計上清中の推定ＲＬＵ（相対光単位）又は注射ＤＮＡμｇ当たりのＲＬＵとして表す。表ＩＩＩは得られた結果を示す。
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】種々のカチオン脂質によるＮＩＨ ３Ｔ３細胞（マウス胎児繊維芽細胞）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図２】種々のカチオン脂質によるウサギＳＭＣ細胞（ウサギ大動脈平滑筋細胞の一次培養物）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図３】種々のカチオン脂質による３ＬＬ細胞（ルイス肺癌）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図４】種々のカチオン脂質によるＮＩＨ ３Ｔ３細胞（マウス胎児繊維芽細胞）の処理後のトランスフェクション効率の測定を表すグラフである。
【図５】３ＬＬ細胞のトランスフェクション効率に及ぼすＤＯＰＥ濃度の効果を表すグラフである。
【図６】ナノモルリポフェクタント／μｇＤＮＡ比を一定にしてＤＮＡ量を変えた場合のＮＩＨ ３Ｔ３細胞のトランスフェクションを表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、
ｑはＲ１、Ｒ２及びＲ３の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
Ｒ及びＲ’は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ’−ＮＨ２基を表し、ｑ’はＲ及びＲ’の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
ｍ、ｎ及びｐは各々独立して０〜６の整数を表し、但しｎが２以上のとき、ｍは異なる値をとることができ、Ｒ３は一般式Ｉ中で異なる意味をもち、
Ｒ４は一般式ＩＩ：
【化２】
の基を表し、式中、
Ｒ６及びＲ７は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２脂肪族基を表し、２個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
ｕは０〜１０から選択される整数であり、但しｕが２以上の整数であるとき、Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びｒは各モチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ５）ｒ−Ｙ］中で異なる意味をもつことができ、
Ｘは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
Ｒ５は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
ｒは１〜１０の整数を表し、但しｒが１であるとき、Ｒ５は置換又は非置換天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが２以上であるとき、Ｒ５は水素原子を表す］により表されることを特徴し、但し、Ｎ−デシル尿素ならびに下記式：
【化３】
に示す化合物を除く、Ｄ、Ｌ又はＤＬ形リポポリアミン及びその塩。
【請求項２】
下記亜式：
【化４】
（式中、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は請求項１に定義した意味をもつ）の１個により表されることを特徴とする請求項１に記載のリポポリアミン。
【請求項３】
Ｒ４がＮＲ６Ｒ７基であり、Ｒ６及びＲ７は亜式ＩＩＩ〜ＸＩにおいて（ＣＨ２）１７ＣＨ３、（ＣＨ２）１１ＣＨ３、（ＣＨ２）１３ＣＨ３又は（ＣＨ２）１２ＣＨ３から選択される同一基を表すことを特徴とする請求項２に記載のリポポリアミン。
【請求項４】
細胞外又は細胞内ターゲティング成分に結合していることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項５】
Ｒ５置換基により表されるアミノ酸側鎖のレベルにターゲティング成分を含むことを特徴とする請求項４に記載のリポポリアミン。
【請求項６】
前記ターゲティング成分が標的細胞型の表面に存在する細胞レセプターのリガンドであることを特徴とする請求項４又は５に記載のリポポリアミン。
【請求項７】
前記ターゲティング成分が糖類、ペプチド、脂質ＨＤＬもしくはＬＤＬ、ステロイド及び／又はオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項８】
前記ターゲティング成分が核局在シグナル配列により表されることを特徴とする請求項４又は５に記載のリポポリアミン。
【請求項９】
Ｒ５により表されるアミノ酸側鎖のレベルにビオチン、ローダミン、葉酸又はエピトープＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む直鎖もしくは環状ペプチドもしくはプソイドペプチド配列型のマーカー物質を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項１０】
下記化合物から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【化５】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ’基を表し、
ｑはＲ１、Ｒ２及びＲ３の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
Ｒ及びＲ’は各々独立して水素原子又は−（ＣＨ２）ｑ’−ＮＨ２基を表し、ｑ’はＲ及びＲ’の各基で独立して１、２、３、４、５及び６であり、
ｍ、ｎ及びｐは各々独立して０〜６の整数を表し、但しｎが２以上のとき、ｍは異なる値をとることができ、Ｒ３は一般式Ｉ中で異なる意味をもち、
Ｒ４は一般式ＩＩ：
【化２】
の基を表し、式中、
Ｒ６及びＲ７は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２脂肪族基を表し、２個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
ｕは０〜１０から選択される整数であり、但しｕが２以上の整数であるとき、Ｒ５、Ｘ、Ｙ及びｒは各モチーフ［Ｘ−（ＣＨＲ５）ｒ−Ｙ］中で異なる意味をもつことができ、
Ｘは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Ｙはカルボニル基又はメチレン基を表し、
Ｒ５は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
ｒは１〜１０の整数を表し、但しｒが１であるとき、Ｒ５は置換又は非置換天然アミノ酸側鎖を表し、ｒが２以上であるとき、Ｒ５は水素原子を表す］により表されることを特徴し、但し、Ｎ−デシル尿素ならびに下記式：
【化３】
に示す化合物を除く、Ｄ、Ｌ又はＤＬ形リポポリアミン及びその塩。
【請求項２】
下記亜式：
【化４】
（式中、Ｒ４、Ｒ６及びＲ７は請求項１に定義した意味をもつ）の１個により表されることを特徴とする請求項１に記載のリポポリアミン。
【請求項３】
Ｒ４がＮＲ６Ｒ７基であり、Ｒ６及びＲ７は亜式ＩＩＩ〜ＸＩにおいて（ＣＨ２）１７ＣＨ３、（ＣＨ２）１１ＣＨ３、（ＣＨ２）１３ＣＨ３又は（ＣＨ２）１２ＣＨ３から選択される同一基を表すことを特徴とする請求項２に記載のリポポリアミン。
【請求項４】
細胞外又は細胞内ターゲティング成分に結合していることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項５】
Ｒ５置換基により表されるアミノ酸側鎖のレベルにターゲティング成分を含むことを特徴とする請求項４に記載のリポポリアミン。
【請求項６】
前記ターゲティング成分が標的細胞型の表面に存在する細胞レセプターのリガンドであることを特徴とする請求項４又は５に記載のリポポリアミン。
【請求項７】
前記ターゲティング成分が糖類、ペプチド、脂質ＨＤＬもしくはＬＤＬ、ステロイド及び／又はオリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項８】
前記ターゲティング成分が核局在シグナル配列により表されることを特徴とする請求項４又は５に記載のリポポリアミン。
【請求項９】
Ｒ５により表されるアミノ酸側鎖のレベルにビオチン、ローダミン、葉酸又はエピトープＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む直鎖もしくは環状ペプチドもしくはプソイドペプチド配列型のマーカー物質を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【請求項１０】
下記化合物から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のリポポリアミン。
【化５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２９７９０（Ｐ２００９−２９７９０Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６１４２１（Ｐ２００８−１６１４２１）
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【分割の表示】特願平９−５１８６２１の分割
【原出願日】平成８年１１月８日（１９９６．１１．８）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【分割の表示】特願平９−５１８６２１の分割
【原出願日】平成８年１１月８日（１９９６．１１．８）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
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