トランスフェクト細胞を含有するカプセル、それを調製する方法、並びに免疫及びワクチン接種するためのその使用
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセル、これらのカプセルを調製する方法、対象の遺伝子によって分泌されたタンパク質の活性をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法であって、カプセルを多細胞生物に投与するステップと活性を検出するステップとを含む方法、このようなカプセルを含む医薬組成物、並びに対象のタンパク質を被検体に投与するためのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセル、これらのカプセルを調製する方法、及びこのカプセルを使用して、これらの細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するための方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、免疫及びワクチン接種用の抗原／免疫原及び／又はアジュバントの送達に使用することができる配合物、組成物、及び方法に関する。より詳細には、本発明は、より効率的及び効果的に免疫及びワクチン接種するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質機能のｉｎ ｖｉｖｏ評価は、新たな治療法の開発、特に新たなタンパク質治療を開発するための、新たな可溶性タンパク質又は未知の機能を有する可溶性タンパク質の評価への重要な段階である。このようなｉｎ ｖｉｖｏ評価又は試験には、薬物開発の特に初期に入手することが難しい相当量の精製タンパク質が必要とされる。この過程を短縮するためには、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させることが興味深い代替法である。
【０００４】
プラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、コストが低く安全に利用できるので、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させる有望な方法である（Ｄａｖｉｓ Ｈ．Ｌ．ら１９９９ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４，１５１〜１５９）。骨格筋線維へのＤＮＡのエレクトロポレーションは、適切な条件下で使用すると、ＤＮＡが細胞内に非常に効率的に取り込まれること、導入遺伝子が長期間発現されることなど多くの特定の利点があるが、エレクトロポレーションを筋肉に行う主要な利点は、血流中で生物活性タンパク質が産生及び分泌されるその潜在的可能性にあり、したがって離れた標的に作用を及ぼす、組換えタンパク質の局所的産生が可能となる（Ｆｅｅｗｅｌｌ Ｊ．Ｇ．ら２００１ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３，５７４〜５８３；Ｋｒｅｉｓｓら１９９９ Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１，２４５〜２５０；Ａｉｈａｒａ Ｈら１９９８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，８６７〜８７０；Ｌｉ Ｓ．ら２００１ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８，４００〜４０７）。
【０００５】
遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させる別の方法は、ＤＮＡの流体力学的送達である。この方法は、大量の裸のＤＮＡ水溶液の肝臓への急速静注を利用する。マウス及びラットに適用する場合、これは、肝臓での高レベルの遺伝子発現、並びに低レベルであるが腎臓、肺、心臓など他の器官での遺伝子発現を導入するための完全で効率的な手段である（Ｌｉｕ Ｆ．ら１９９９ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６（７），１２５８〜１２６６；Ｙａｎｇ Ｊ．ら２００１ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３（４），８４８〜８５９；Ｍａｒｕｙａｍａ Ｈ．ら２００２ Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．４（３），３３３〜３４１；Ｈｏｄｇｅｓ Ｂ．Ｌ．ら２００３ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ，３（６），９１１〜９１８）。
【０００６】
エレクトロポレーション及び流体力学的遺伝子送達法のどちらにおいても、導入遺伝子の分泌レベル又は産生タンパク質の転写後修飾に影響を与える可能性はほとんどない。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の機能を評価するのに適した第３の方法は、所望の遺伝子産物をｉｎ ｓｉｔｕで産生する、トランスジェニック細胞系のマイクロカプセル化細胞をマウス又はラットなどの実験動物に投与するものである。この手法では、細胞を宿主の免疫系から物理的に隔離するマトリックス内に細胞が封入される。栄養物、外部刺激、及び治療用タンパク質の通過が可能であるが、移植片拒絶の原因である免疫成分に不透過性であり、したがって移植片の生着を延長する選択透過膜が使用される（Ｌｉｍ Ｆ．ら１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，９０８〜９１０）。このような方法は、遺伝子治療（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ．ら１９９６ Ｂｌｏｏｄ，８７（１２），５０９５〜５１０３；Ｖｉｓｔｅｄ Ｔ．ら２００１ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３，２０１〜２１０）、インスリン依存性糖尿病（Ｓｕｎ Ｙ．ら１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ９８，１４１７〜１４２２）、及び抗癌療法（Ｒｅａｄ Ｔ−Ａ．ら１９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（５〜６），６５３〜６６３）のために開発されてきた。導入遺伝子の発現及び翻訳後修飾のレベルの完全な制御は、カプセル化される細胞系の選択性、カプセル内の細胞密度、及び発現カセットに調節エレメントを含む可能性によって可能である。発現すべき治療用タンパク質の特性に応じいくつかの生体適合性ポリマーを使用して細胞を固定化することができる。アルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）カプセルが最も頻繁に使用されているが（Ｌｉｍ Ｆ．ら１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，９０８〜９１０；Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ．ら１９９６ Ｂｌｏｏｄ，８７（１２），５０９５〜５１０３；Ｖｉｓｔｅｄ Ｔ．ら２００１ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３，２０１〜２１０；Ｓｕｎ Ｙ．ら１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ９８，１４１７〜１４２２；Ｒｅａｄ Ｔ−Ａ．ら１９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｉ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（５〜６），６５３〜６６３；Ｓｔｒａｎｄ Ｂ．Ｌ．ら２００２ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １９（５），６１５〜６３０を参照のこと）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル−ｃｏ−メタクリル酸メチル）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）など他のポリマーも使用することができる（Ｌａｈｏｏｔｉ Ｓ．ら２０００ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，９８７〜９９５）。カプセル化マトリックスは、完全に固体であるか、又は包含させた細胞を環境から隔離する膜のみと共に液体コアを含有することができる。
【０００８】
Ｓａｖｅｌｋｏｕｌら（Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ Ｈｕｕｂ Ｆ．Ｊ．ら１９９４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７０ １８５〜１９６頁）は、Ｉｌ−４又はＩＬ−５を産生する安定的にトランスフェクトされたサル細胞系ＣＶ１又はＣＨＯ−Ｋｉの細胞の調製及びカプセル化（２．３及び２．４、１８６頁参照）、並びにマウスへの前記カプセル化細胞の腹腔内（ｉ．ｐ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）注射を記載している。
【０００９】
国際公開第９３／００４３９号は、活性因子又は増強物質を産生する遺伝子改変した細胞系、特にラットＮＧＦ放出細胞系Ｎ８−２１の細胞のカプセル化を開示している（実施例１）。
【００１０】
上記の従来技術に記載のあらゆる例において、カプセル化細胞は、安定的にトランスフェクトされた細胞に由来する。
【００１１】
安定的にトランスフェクトされた細胞の作製は、トランスフェクトする遺伝子を細胞のゲノム中に組み込むことを必要とするので、労力を要し時間がかかる。これは、トランスフェクト細胞を選択培地中で長時間培養した後、培養細胞を段階希釈して、安定的にトランスフェクトされ対象のタンパク質を十分な量で産生する細胞クローンを単離することによって達成される（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）。
【００１２】
安定的にトランスフェクトされた細胞は通常、対象のタンパク質が高産生されるかどうかで選択される。安定的にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトした遺伝子を高度に長期間（数カ月まで）発現する利点がある。
【００１３】
しかし、上記の方法は、複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価など、高スループット及び／又は高スピードを必要とする用途には適していない。
【００１４】
本発明によって取り組まれる課題は、高スループットに適しており短期間内（例えば、１又は２又は３週間）に実施することができる、タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現させる方法を提供すること、及び従来技術の方法の欠点を有していない、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するための手段を提供することである。
【００１５】
上記の課題を、特許請求の範囲で定義される本発明によって解決する。
【００１６】
脊椎動物の免疫系の活性化は、病原体及び悪性腫瘍から動物を防御するための重要な機構である。この免疫系は、体液性及び細胞性の部門を含めた多くの相互作用成分からなる。体液性免疫には、抗原に直接結合する抗体が関与する。体液性免疫のエフェクターとしての抗体分子は、Ｂリンパ球によって分泌される。細胞性免疫には、非自己抗原を産生する他の細胞を認識し死滅させる分化した細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が関与する。ＣＴＬは、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩ分子に結合した、標的細胞の表面上に出現する分解されたペプチド断片に応答する。細胞内で産生されたタンパク質は、細胞代謝の一部としてペプチドに連続的に分解されることが理解されている。こうした断片は、ＭＨＣ分子に結合し、細胞表面に輸送される。したがって、細胞性免疫系は、体内のあらゆる細胞内で産生されたタンパク質のスペクトルを絶えずモニターしており、非自己抗原を産生するいかなる細胞をも排除するような態勢にある。
【００１７】
ワクチン接種は、抗原／免疫原に対して応答するように動物をプライミングする過程である。この抗原は、精製タンパク質、死滅／弱毒病原体に含まれるタンパク質として、又は次いで宿主細胞内で抗原を発現する遺伝子として（遺伝子免疫）投与することができる。この過程には、Ｔ及びＢリンパ球、他の種類のリンパ球様細胞、並びに抗原を処理し、この抗原を免疫系を活性化できる形で提示することができる分化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）が関与する。
【００１８】
ワクチンの有効性は、腫瘍又は病原体による、後の抗原チャレンジに対する防御の程度によって評価される。有効なワクチンは、最少回数の接種の後、疾患を標的とした介入に対する高力価で持続的な防御免疫を誘導することができる免疫原である。
【００１９】
ワクチン開発に成功した手法の数は、病原菌の数とほとんど同じぐらいである。技術が発展するにつれ、防御抗原／免疫原の性質を分子レベルで定義することが可能となる。近年、無細胞ワクチンが、種々の病原体由来のサブユニット（すなわち多成分系ワクチン）で投与することができ、有害反応の数を減少させる潜在的可能性を有するので、ワクチン開発のための好まれる方法となっている。サブユニットワクチンは、病原微生物由来の限定された精製防御抗原で構成されている。驚くべき成功例がいくつかあるが、現在使用されているサブユニットワクチンは少数である。おそらく、サブユニットワクチンの使用を妨害する最も困難な理由は、抗原送達の問題である。最適な抗原送達のためには、抗原がその生物学的状況下で抗原提示細胞に送達される必要があり、すなわち抗原には、食細胞によって容易に認識され取り込まれるリスクがある。大部分の抗原は、寄生生物−宿主細胞間相互作用にとって重要な三次元構造を有しているが、こうした構造の多くは抗原精製の際に失われる。
【００２０】
サブユニットワクチン製造に伴う問題の多くを回避するのに取られた１つの手法は、防御抗原をｉｎ ｖｉｖｏで発現するように遺伝子改変した、弱毒ワクチン及び弱毒細菌に基づく組換え生ワクチンビヒクル（すなわち、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、サルモネラ、及びウシ型結核菌種カルメットゲラン菌すなわちＢＣＧの組換え体）の開発である（Ｓｎａｐｐｅｒ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：６９８７〜６９９１，１９８８；Ｊａｃｋｅｔｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：２３１３〜２３１８，１９８８；Ｌａｍｂ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：Ｓ４４３〜Ｓ４４７，１９８９；Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：４４６〜４５１，１９８８を参照のこと）。
【００２１】
生細菌を使用したワクチン接種が研究されており、致死遺伝子をノックアウトするように突然変異が誘発された生細菌株を利用することが多い。生ワクチンには、抗原が先天性の免疫原の形で発現され；生送達システムが宿主内で複製及び持続し、したがって宿主の免疫系が再刺激され多回投与の必要性が回避され；生ベクター系は、抗原を精製する必要性をなくし、製造が安価であり；生ベクターは、複数の抗原を送達するように設計することができ、したがって個体にワクチン接種しなければならない回数が減少するという利点がある。しかし、この方法は、細菌が毒性に戻ることを可能にするさらなる突然変異が起こらないことを保障するような厳しい安全対策を必要とする。より確実な方法は、後に宿主がその抗体を産生できるタンパク質を発現する弱毒細菌を利用することである。細菌ベクターは、ワクチンの経口投与用に研究されることが多い。例えば、ＨＩＶ、ライム病、及びエプスタイン−バーウイルスから防御するための経口投与用にサルモネラ菌ベースのワクチンが研究されている。
【００２２】
また、バキュロウイルス、酵母、及び組織培養細胞が、ワクチンの製造において使用するために研究されてきた。各例は、バキュロウイルスを使用して、Ｅ型肝炎に対するワクチンで使用されるタンパク質を産生した米国特許第６２８７７５９号；酵母をベクターとして使用して、ワクチンで使用するためのヘリコバクターポリペプチドを産生した米国特許第６２９０９６２号；脊椎動物組織培養細胞を使用して、ワクチンで使用するための精製不活化デングウイルスを増殖させた米国特許第６２５４８７３号で示されている。こうした例のすべてにおいて、ベクターを使用して、後に精製されワクチンで使用されるはずの対象のタンパク質が産生された。
【００２３】
遺伝子免疫は、特定のタンパク質をコードしている遺伝子を動物自身の細胞内で発現させることによりこのタンパク質に対する免疫応答を誘導する別の手法である。ｉｎ ｖｉｖｏでの長期間の抗原提示によって生じた相当な抗原増幅及び免疫刺激は、抗原に対する確実な免疫（ｓｏｌｉｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導することができる。遺伝子免疫では、タンパク質精製及びアジュバントとの混合というどちらもワクチン開発に常に必要とされる困難な段階が省かれるため、特定のタンパク質に対する免疫応答を生じさせるためのワクチン接種プロトコールが簡素化される。遺伝子免疫は、タンパク質の単離を必要としないので、生化学的に精製すると高次構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を失う可能性があるタンパク質にとって特に価値がある。また、遺伝子ワクチンは、干渉を誘発することなく又は有効性に影響を及ぼすことなく混合して送達することもでき（Ｔａｎｇら，１９９２；Ｂａｒｒｙら，１９９５）、複数の抗原に対するワクチン接種計画を簡素化することができる。
【００２４】
ワクチンは、アジュバントを使用することによって増強されることが多い。ワクチンアジュバントは、ワクチン組成物中で任意の特定の抗原と共に得られる免疫応答を改善するのに有用である。アジュバントは、抗体及びエフェクターＴ細胞の量を増加させ、抗原の量及び注射の頻度を低減するのに使用される。抗原は、アジュバントを含まないワクチンとして投与されることもあるが、効果的なアジュバントなしでは、有用な免疫応答を刺激するのに十分な免疫原性を欠く抗原が多く存在する。アジュバントはまた、得られる免疫応答を増大させ、又は抗原投与量を低減することができるという点で、「自給自足」抗原の免疫応答を改善する。
【００２５】
分子ワクチン接種のためのアジュバント及び送達システムに関する包括的な総説については、Ｓｈｅｉｋｈ ＮＡ，Ａｌ−Ｓｈａｍｉｓｉ Ｍ，Ｍｏｒｒｏｗ ＷＪＷ；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０００，２：１（３７−５４）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
ワクチン開発が困難であった病原体又は腫瘍に対するワクチンを開発するためには、及び／又は十分に利用されなかったことによる市販ワクチンの失敗を克服するためには、ワクチンの免疫性及び／又は副作用の低下を可能にする抗原／免疫原送達の新たな方法を開発しなければならない。
【００２７】
抗原／免疫原を含む新たな医薬組成物及びワクチン送達法は、本出願に記載されており、適当な抗原及び／又はアジュバントをコードしている１種又は複数の遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞を送達した後、抗原／免疫原をｉｎ ｖｉｖｏで産生させるものである。この方法は、タンパク質ワクチンに伴う、抗原／免疫原の厄介な精製の必要性、又は遺伝子免疫に伴う、抗原／免疫原のｉｎ ｖｉｖｏ産生が低いことによる低効率など、上記の他のワクチン及びワクチン接種法の欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルに関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、細胞が動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である前記カプセルを提供する。
【００３０】
さらなる態様では、前記カプセルは、対象の遺伝子が、タンパク質を分泌するためのシグナル配列に融合しているカプセルである。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、カプセルは、発現カセット中に挿入された対象の遺伝子を含む。
【００３２】
さらなる態様では、カプセルは、プラスミド中に挿入された対象の遺伝子を含む。
【００３３】
本発明のさらに別の態様では、前記カプセルは、生体適合性ポリマー、アルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）を含む。
【００３４】
さらなる態様では、カプセルは、分離サイズが９０〜３０ｋＤａ、好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する生体適合性ポリマー膜を含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様では、カプセルは、平均直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである。
【００３６】
本発明の別の態様では、カプセルは、低剪断、微小重力条件下で維持された。
【００３７】
本発明はさらに、カプセルを調製する方法を提供し、この方法は、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む。
【００３８】
本発明はさらに、カプセルを調製する方法を提供し、この方法は、低剪断、微小重力条件下で維持するステップをさらに含む。
【００３９】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記多細胞生物において前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む。
【００４０】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを、哺乳動物である多細胞生物に投与するステップを含む。
【００４１】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びサルからなる群から選択される哺乳動物に投与するステップを含む。
【００４２】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、ｉ．ｐ．注射によって実施される、上記のカプセルを多細胞生物に投与するステップを含む。
【００４３】
本発明はさらに、動物におけるカプセル又は上記の方法の使用を提供し、この使用では、検出すべき活性が急速に生じ（例えば、注射後数時間又は１日若しくは複数日以内）、活性物質の投与後数日以内に完了する。
【００４４】
本発明はさらに、動物におけるカプセル又は上記の方法の使用を提供し、この使用では、検出すべき活性が、急速に生じ（例えば、注射後数時間又は１日若しくは複数日以内）、活性物質の投与後数日以内に完了し、動物は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝毒性を有するマウスである。
【００４５】
本発明はさらに、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、細胞に、抗原／免疫原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子がトランスフェクトされている、上記の医薬組成物を提供する。
【００４７】
本発明はさらに、抗原／免疫原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又は腫瘍抗原である、上記の医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、カプセルが、（１種又は複数の）抗原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子をそれぞれトランスフェクトした少なくとも２種類の細胞を含み、この２種の遺伝子が同一でない、上記の医薬組成物を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供する。
【００５０】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供し、このタンパク質は、免疫及びワクチン接種用の抗原である。
【００５１】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供し、被検体が、ヒト；げっ歯類、イヌ、ブタ及びサルを含めた研究目的で飼育された動物並びにイヌ及びネコを含めた、家畜及び飼育動物からなる群から選択される。
【００５２】
本発明はさらに、上記のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記カプセル又は組成物を被検体に投与するための手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルを提供する。
【００５４】
用語「１種又は複数のカプセル」は、同義的に使用され、細胞を環境から隔離する生体適合性ポリマー膜のみと共に細胞を含有するカプセル化マトリックスを指す。
【００５５】
用語「１種又は複数のカプセル」はさらに、生体適合性ポリマー膜内に封入又は包含された１種又は複数の細胞を指す。
【００５６】
用語「一過性にトランスフェクトされた細胞」又は「対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞」は、対象の遺伝子を当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）によって導入し、トランスフェクションの日から１４日以内に、好ましくは１０日以内に、対象の遺伝子によってコードされているタンパク質を発現する（１種又は複数の）細胞を指す。
【００５７】
用語「一過性にトランスフェクトされた」又は「対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした」はさらに、当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）により、事前選択した細胞中に対象の遺伝子を導入し、ここで、前記細胞は対象の遺伝子を含有するが、この遺伝子は、前記細胞のゲノム中に組み込まれないこと、又は細胞内で複製することができるエピソームベクター上に位置することを指す。
【００５８】
一過性にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション後細胞を培養する際に選択培地によるどんな選択圧をもかけることなく得ることが好ましい。
【００５９】
細胞培養で使用される選択培地は、当技術分野で周知である。長年にわたるトランスフェクション研究の間、いくつかの様々な薬剤選択マーカーが一般に使用されてきた。例えば、細菌のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターをトランスフェクトした細胞は、薬剤Ｇ−４１８の存在下で安定にトランスフェクトするかどうかで選択することができる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）「ＳＶ４０初期領域プロモーターの制御下にある細菌遺伝子を用いた哺乳動物細胞の抗生物質耐性への形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，３２７）。同様に、トランスフェクトされたベクターからのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現により、薬剤ハイグロマイシンＢに対する耐性が得られる（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．及びＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．（１９８４）「高等真核細胞を用いたＤＮＡ導入実験用の選択マーカーとしてのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，２９２９）。
【００６０】
代替戦略は、所与の細胞系において欠陥がある必須の遺伝子を担うベクターを使用することである。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子の発現に欠陥があるＣＨＯ細胞は、追加のヌクレオシドの存在下でしか生存しない。しかし、こうした細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するＤＮＡを安定にトランスフェクトすると、必要とされるヌクレオシドを合成する（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．及びＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．（１９８４）Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，４４７．）。ＤＨＦＲをマーカーとして使用するさらなる利点は、用量を増やしながらメトトレキセートに細胞を暴露すると、ＤＨＦＲ及び関連するトランスフェクトしたＤＮＡの遺伝子増幅が起こることである（Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．（１９８８）「培養細胞における遺伝子増幅（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，５９８９）。
【００６１】
用語「安定にトランスフェクトされた」又は「対象の遺伝子を安定にトランスフェクトした」又は「安定なトランスフェクション」は、当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）により、事前選択した細胞中に対象の遺伝子を導入し、ここで、前記対象の遺伝子は、前記細胞のゲノム中に組み込まれないこと、又はエピソームベクター上に位置し細胞内で複製されることを指す。
【００６２】
用語「対象の遺伝子」は、対象のタンパク質、すなわち、興味深い活性を有するタンパク質、又はその特性が興味深い、例えばそれを評価すべきタンパク質をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他のポリヌクレオチド、又はそのアナログを指す。
【００６３】
驚くべきことに、本発明者らにより、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞は、多細胞生物に投与する（例えば、注射する）ことができ、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質を、そのｉｎ ｖｉｖｏ活性又は作用を検出できるような十分な量ｉｎ ｖｉｖｏで産生することが判明した。
【００６４】
さらに驚くべきことに、前記カプセル化細胞は、トランスフェクションの当日に、又はその翌日若しくは数日後にも多細胞生物に投与することができ、前記タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性又は作用を検出することができる。
【００６５】
したがって、本発明は、投与の開始から１４日以内に、優先的には１０日以内に、さらにより好ましくは５日以内に、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を分析又は評価するための新規ツールを提供する。
【００６６】
第１の態様では、本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有する新規カプセルを提供する。
【００６７】
この細胞は、植物細胞又は動物細胞であってよい。この細胞は、動物細胞、特にハイブリドーマを含めた哺乳動物細胞であることが好ましい。特に好ましい細胞は、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ｒＣＨＯ−ｔＰＡ細胞、ｒＣＨＯ−Ｈｅｐ Ｂ表面抗原細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｒＨＥＫ２９３細胞である。本発明に従って培養することができるハイブリドーマの例には、例えば、ＤＡ４．４細胞、１２３Ａ細胞、１２７Ａ細胞、ＧＡＭＭＡ細胞、及び６７−９−Ｂ細胞が含まれる。本発明に従って培養することができる昆虫細胞の例には、例えば、鱗翅類細胞、Ｔｎ−３６８細胞、ＳＦ９細胞、ｒＳＦ９細胞、及びＨｉ−５細胞が含まれる（例えば、Ｉｋｏｎｏｍｏｕ Ｌら２００２，Ｎｏｖ〜Ｄｅｃ，１８（６），１３４５〜１３５５を参照のこと）。本発明に従って培養することができる非哺乳動物細胞の例には、例えば、ブラウンブルヘッド細胞系が含まれる（例えば、Ｂｕｃｋ ＣＤら１９８５，Ｆｅｂ，１０（２），１７１〜８４を参照のこと）。
【００６８】
上記で定義した対象の遺伝子は発現され、細胞からタンパク質が分泌される。優先的には、このタンパク質は成熟タンパク質として分泌される。優先的には、このタンパク質は、発現する場合、タンパク質を分泌するためのシグナルペプチドを含む。検討中の遺伝子が、タンパク質のシグナルペプチドをコードしている配列を有していない場合、このような配列、例えば、シグナル配列、プレ配列及び／又はプロ配列をその遺伝子配列に融合して、対象の遺伝子をタンパク質として発現、輸送及び分泌しやすいようにすることができる。
【００６９】
対象の遺伝子は、一般に、細胞の一過性トランスフェクションに適したベクターの一部である、プロモーター及び調節シグナルを含む発現カセット中に通常挿入される。
【００７０】
適当なベクターは、プラスミド又はエピソームベクターである。
【００７１】
細胞の一過性トランスフェクションに適したプラスミドの例は、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ｐＥＡＫベクターファミリー（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、又はｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）である。
【００７２】
対象の遺伝子を担うベクターの細胞へのトランスフェクションは、任意のトランスフェクション法、特にポリアミン法、ポリエチレンイミン法（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、リン酸カルシウム共沈法、又はリポフェクションによって実施することができる。ポリアミン法は、トランスフェクトした細胞の９０％超が得られるので好ましい。ショットガン法又はエレクトロポレーションは、高い細胞死亡率を伴い、これにより死細胞のカプセル化が高い割合でもたらされるはずであり、したがってカプセルの生産性が低下するのでこの用途には好ましくない。
【００７３】
生体適合性ポリマーは、安定に発現する細胞系の細胞をカプセル化するための、当技術分野で既知の生体適合性ポリマー、特にアルギナート塩、特にアルギナートナトリウム若しくはカリウム、及びアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）、並びにポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル−ｃｏ−メタクリル酸メチル）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）などの他のポリマーの中から選択することができる。好ましい生体適合性ポリマーはＡＰＡである。
【００７４】
このポリマーを工学処理して、選択透過膜、すなわち栄養物、酸素、外部刺激、及び分泌タンパク質に透過性があるが、移植片拒絶の原因である免疫成分に不透過性である膜が作製される。このような選択透過膜は通常、分離が９０〜３０、好ましくは９０〜５０又は８０〜５０ｋＤａ、さらにより好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する。分離は、選択透過膜を通して拡散することができる分子のサイズを定義する。
【００７５】
カプセルは通常、直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである。
【００７６】
本発明はまた、上記カプセルを調製する方法に関し、この方法は、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む。
【００７７】
カプセル化の後、この細胞は、カプセル内で増殖し続け、対象の遺伝子によって分泌される成熟タンパク質を、カプセルを維持する培地中に拡散する。
【００７８】
このカプセルは、成熟タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ拡散を低減し、機械的な理由によるカプセルのどんな破壊をも避ける、低剪断、微小重力条件下で維持することが好ましい。
【００７９】
本発明のカプセルを調製するすべてのステップは、短期間、通常１日又は２日以内に実施することができる。
【００８０】
細胞を含有するカプセルを数カ月まで保存するために、−８０℃で、又は液体窒素（−１９６℃）気相若しくは液相中で凍結させることができる。この凍結保存により、大量のカプセルを製造し、続いてその一定分量を様々な用途に（例えば、キット中に）使用することが可能となる。蘇生後、この細胞はカプセル内で増殖を再開し、対象のタンパク質を３〜１０日間産生し続ける。
【００８１】
さらなる態様では、本発明は、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトした細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を分析又は評価する方法に関し、この方法は、上記で定義したカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む。この活性は、局所活性又は全身活性であってよい。
【００８２】
本発明の方法に従って産生することができるタンパク質は、例えば、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン絨毛性ゴナドトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ−ｌａ、インターフェロンβ−ｌｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンγ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質、インターロイキン（例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、増殖因子（例えば、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、酸性及び塩基性線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子）、下垂体ペプチドホルモン、閉経期性腺刺激ホルモン、インスリン様成長因子（例えば、ソマトメジンＣ）、トロンボモジュリン、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質２、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、並びにその突然変異タンパク質、断片、可溶形、機能性誘導体、及び融合タンパク質を含めた対象のどんなタンパク質とすることもできる。
【００８３】
多細胞生物は、植物又は動物であってよい。特定の対象の動物は、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルなど薬学研究で一般に使用されている哺乳動物である。
【００８４】
特に興味深い哺乳動物は、マウス又はラットなどのげっ歯類であり、マウス、例えばＣ５７／ＢＬ６系マウスが好ましい。
【００８５】
検出する活性は、例えば、体温、組織又は体液の色、組織又は体液（例えば、血液、血清、血漿、糞便、痰、滑液、脳脊髄液、又は尿）中の所与の物質の濃度など、任意のパラメータに関するものでよい。
【００８６】
カプセルは、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内、皮下（ｓ．ｃ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与することができる。好ましい投与形態はｉ．ｐ．注射である。別の好ましい形態はｓ．ｃ．注射である。
【００８７】
カプセルはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で安定であり、包含する細胞を分解又は放出しない。
【００８８】
カプセルは、一過性発現が起こっている限り、すなわちカプセル投与（０日目）から通常３〜１４日目の間は成熟タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで放出するが、その放出の大部分は通常、１日目〜４、５又は６日目に起こる。成熟タンパク質が大量に放出される期間は通常３〜５日目であるが、これは検出すべき局所及び／又は全身活性を誘導するのに通常十分である。慢性作用を検出するためなど、必要な場合は、カプセルの投与を２回以上それぞれ別の時点で実施して、例えば、大量の成熟タンパク質の放出をより長期間維持することができる。
【００８９】
したがって、本発明のカプセルは、実験動物、例えばヒト疾患の動物モデルで使用することができる、薬学研究の有用なツールとなる。
【００９０】
この動物又は動物モデルは、誘導された検出すべき局所及び／又は全身活性が急速に（すなわち、数時間又は１日若しくは複数日以内に）生じ、活性物質（対象のタンパク質）の投与後数日以内に完了するものが好ましい。
【００９１】
このような動物モデルの一例は、以下で例示するが、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって肝毒性が誘発されたマウスである。
【００９２】
中毒性肝疾患は、ヒトの世界中の健康問題を代表し、薬理学的治療法がまだ発見されていない。例えば、肝硬変をもたらす活動性慢性肝炎は、活性化Ｔ細胞によって肝実質細胞が進行的に破壊される病状である。ＣｏｎＡ誘発肝毒性は、マウスで説明されているＴ細胞依存性アポトーシス性及び壊死性肝損傷の３つの実験モデルのうちの１つである。活性化抗ＣＤ３モノクローナル抗体又はスーパー抗原ＳＥＢのいずれかで誘発したＧａｌ Ｎ（Ｄ−ガラクトサミン）感作マウスは、重篤なアポトーシス性肝損傷及び二次的な壊死性肝損傷を発症する。植物のＴ細胞分裂促進レクチンＣｏｎＡの非感作マウスへの注射によっても、壊死に先行する肝アポトーシスがもたらされる。ＣｏｎＡは、全身へのＴＮＦα及びＩＦＮγ、並びに他の種々のサイトカインの放出を誘発する。傷害の８時間後、トランスアミナーゼの放出は重篤な肝臓破壊を示す。
【００９３】
ＴＮＦα及びＩＦＮγはどちらも、肝障害を誘発する上で肝損傷の決定的に重要なメディエータである。例えば、ＴＮＦαは、ＣｏｎＡ注射の後に産生される最初のサイトカインの１つであり、抗ＴＮＦα抗体は、疾患に対する防御を与える（Ｓｅｉｎｏら２００１，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ ２３４，６８１）。ＣｏｎＡ処理動物の血中トランスアミナーゼレベルの低下から判断して、抗ＩＦＮγ抗血清はマウスを有意に防御するので、後で誘導されるＩＦＮγも、肝損傷の決定的に重要なメディエータであると思われる（ＫｕｅｓｔｅｒｓらＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｙ １１１，４６２）。ＣｏｎＡ誘発肝毒性からの防御を与える処置を記載した様々な文献がある。ｒＩＬ６の単回投与により、トランスアミナーゼの放出が完全に阻害されたが、同じ投与計画でＴＮＦ産生の阻害は４０〜５０％しか誘導されなかった（Ｍｉｚｕｈａｒａら１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１５２９〜１５３７）。
【００９４】
数種の細胞型、ＣＤ４ Ｔ細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞が肝障害に関与することが示されている（Ｋａｎｅｋｏ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０００，１９１，１０５〜１１４）。抗ＣＤ４抗体は、Ｔ細胞の活性化及びその結果としての肝障害を遮断する（Ｔｉｅｇｓら１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，１９６〜２０３）。ＣＤ８に対するモノクローナル抗体のマウスへの前処置は防御に失敗したが、マクロファージの欠失は肝炎の誘発を阻止した。
【００９５】
興味深い動物モデルの別の例は、マウスＬＰＳ（リポ多糖）誘発ＴＮＦα放出モデルである。
【００９６】
ＬＰＳは、脂質及び炭水化物をどちらも含有する大分子である。ＬＰＳは、グラム陰性菌の細胞壁の主成分である。ＬＰＳは、原型的なエンドトキシンとして働き、多くの細胞型において炎症誘発性サイトカインの分泌を促進する。ＬＰＳは、Ｔｏｌｌ受容体４を介して先天性免疫系の食細胞によって認識される（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ Ｍ．らＴｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ｊｕｎ；２３（６）：３０１〜４）。ＬＰＳは、マクロファージ又はミクログリアをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで活性化するために広く使用されている（Ｔｏｂｉａｓ ＰＳらＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９３ Ａｐｒ；１８７（３〜５）：２２７〜３２）。マウスのＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出モデルはヒトの炎症状況に似ている。
【００９７】
本発明はさらに、細胞に１種又は複数の遺伝子を一過性にトランスフェクトした上記のカプセルを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、製薬上許容される１種又は複数の担体、希釈剤、或いは賦形剤を追加的に場合によって含む。
【００９８】
この遺伝子は、病原体由来の、１種又は複数の抗原／免疫原、或いは１種又は複数のその部分、或いは対象の１種又は複数のエピトープをコードすることができる。抗原／免疫原という用語は、宿主において免疫応答を誘発することが可能な任意のタンパク質又はその誘導体を指す。
【００９９】
好ましい実施形態では、病原体は、任意のウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、細菌、寄生生物、及び菌類からなる群から選択される。ウイルスには、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、ライノウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ヘパドナウイルス、及びヒト免疫不全ウイルスを含めたレトロウイルスが含まれる。細菌には、マイコバクテリア、スピロヘータ、リケッチア、クラミジア、及びマイコプラズマが含まれる。菌類には、酵母及びカビが含まれる。寄生生物には、住血吸虫、リーシュマニア、及びマラリア原虫が含まれる。この一覧には、本明細書に記載の方法に従ってその防御免疫応答を生じさせることができるあらゆる潜在的な病原体が含まれていないことは理解されよう。
【０１００】
特に、その遺伝子は、インフルエンザ血球凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃフラグメント、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、炭疽菌発芽因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ１６０、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、ボツリヌス毒素Ａ、及び結核菌ＨＳＰからなる群から選択される１種又は複数の抗原／免疫原をコードすることができる。
【０１０１】
別の実施形態では、遺伝子は、腫瘍由来の抗原／免疫原をコードすることができる。この腫瘍は、乳腺、卵巣、肺、脳、胃、腸管、膵臓、膀胱、前立腺、骨、又は造血性の細胞若しくは組織の腫瘍、或いは他の細胞又は組織の腫瘍とすることができる。特に、その遺伝子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒト癌胎児性抗原、及び前立腺特異的抗原からなる群から選択される１種又は複数の抗原／免疫原をコードすることができる。
【０１０２】
別の実施形態では、遺伝子は、抗体を生じるべく選択された任意の抗原／免疫原をコードすることができる。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができる。この抗体は、特に、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ドメイン抗体、又は短鎖抗体であってよい。この抗体は、例えば、研究、診断、治療、又は他の目的に有用であり得る。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、遺伝子は、アジュバントをコードすることができる。このアジュバントは、共刺激分子、サイトカイン、又はケモカインとすることができる。好ましいアジュバントは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＩＮＦγである。
【０１０４】
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）本明細書に記載の１種若しくは複数の抗原／免疫原及び／又はアジュバントをトランスフェクトした細胞を含有するか、或いは（ｂ）本明細書に記載の１種若しくは複数の抗原／免疫原及び／又はアジュバントから様々に選択したものをトランスフェクトした細胞群を含有するカプセルを含む。カプセル内の細胞の選択は、ワクチン接種の必要性に適合させることができることは理解されよう。これは、抗原／免疫原及びアジュバントの適切な選択、発現ベクター及び発現カセットの適切な選択、対象の遺伝子を発現する細胞型若しくは細胞系の適切な選択、並びに／又は本明細書及び当技術分野で記載されているカプセル化材料の適切な選択によって達成することができる。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物を被検体に投与するステップを含む、免疫する方法である。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用である。
【０１０７】
好ましい実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用であり、このタンパク質は、ワクチン接種用の抗原／免疫原である。
【０１０８】
好ましい実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用であり、このタンパク質は、抗体の標的として選択された抗原／免疫原である。特に、このカプセルは、被検体において、カプセル化細胞によって産生される事前選択した抗原に対する抗体応答を誘発させるのに使用される。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記カプセル又は組成物を被検体に適用するための手段である。
【０１１０】
この被検体は、動物とすることができ、有利には脊椎動物、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、又は魚類であり、より有利にはヒト、或いは飼育動物、家畜化動物、食物を生産する動物、飼料を生産する動物、家畜、狩猟動物、競争用動物、又は競技用動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、若しくはウマ、又はさらには家禽、例えば、シチメンチョウ、カモ、若しくはニワトリである。別の実施形態では、この脊椎動物は、それだけには限らないが、げっ歯類（マウス、モルモット、及びラットを含む）、イヌ、ブタ、及びサルを含めた研究目的で飼育された動物である。本発明の最も好ましい実施形態では、脊椎動物はヒトである。
【０１１１】
本明細書で開示されるカプセル又は医薬組成物は優先的には、非経口経路で被検体に投与される。例えば、個体に、腹腔内、皮内、皮下、又は筋肉内の方法によって接種することができる。
【０１１２】
本発明の他の特徴及び利点は、限定的な特性ではなく例示的なものを有する以下の実施例から明らかとなろう。実施例は、好都合なことには、添付の図面を参照することによって読まれよう。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１：ＩＬ−６をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、並びにマウスコンカナバリンＡモデルにおけるＩＬ−６血中レベル及びその活性の測定）
１．対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持
エプスタイン−バーウイルス核抗原を発現するヒト胎生腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）の細胞を、スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、英国）中で４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１ｍｌ／ｌフェノールレッド溶液（水中０．５％ｗ／ｖ、フェノールレッド：Ｓｉｇｍａ、米国）を補充したＥｘ細胞ＶＰＲＯ無血清培地（維持培地、ＪＲＨ、英国）中で懸濁状態で維持した。
【０１１４】
１．２ プラスミド調製
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内でＩＬ−６を発現させるためのプラスミドの構築
ヒトＩＬ−６の完全コード配列（ＯＲＦ）（図１、配列番号１）を含有するプラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社クローンＩＤ ＣＳ０ＤＩ０１９ＹＰ０５）。Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、このＯＲＦを哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ（図２Ａ及び２Ｂ）中にサブクローニングした。
【０１１５】
１．２．１ ６ＨＩＳタグ配列にインフレームで融合させたＧａｔｅｗａｙ適合性ＩＬ−６ ＯＲＦの作製
Ｇａｔｅｗａｙクローニングプロセスの第１段階は、２ステップのＰＣＲ反応を含み、この反応では、５’末端でａｔｔＢｌ組換え部位及びコザック配列に隣接し、３’末端で６ヒスチジン（６ＨＩＳ）タグをインフレームでコードする配列、終止コドン及びａｔｔＢ２組換え部位に隣接するＩＬ−６のＯＲＦ（Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｃＤＮＡ）が作製される。第１のＰＣＲ反応液（最終量５０μｌ中）は、２５ｎｇのＣＳ０ＤＩ０１９ＹＰ０５プラスミド、２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼ緩衝液、各０．５μｌの遺伝子特異的プライマー（１００μＭ）（ＥＸ１フォワード及びＥＸ１リバース）、及び０．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する。ＰＣＲ反応は、最初の変性ステップ９５℃で２分間、続いて９４℃で１５秒間及び６８℃で３０秒間を１２サイクル実施した。Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の使用説明書に従って使用して、反応混合液からＰＣＲ産物を直接精製した。第２のＰＣＲ反応液（最終量５０μｌ中）は、１０μｌの精製ＰＣＲ産物、２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼ緩衝液、各０．５μｌのＧａｔｅｗａｙ変換プライマー（１００μＭ）（ＧＣＰフォワード及びＧＣＰリバース）、及び０．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。第２のＰＣＲ反応の条件は、９５℃で１分間；９４℃で１５秒間、４５℃で３０秒間、及び６８℃で３．５分間を４サイクル；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で３．５分間を２５サイクルであった。ＰＣＲ産物を上記の通り精製した。
【０１１６】
１．２．２ ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２０１及び発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中へのＧａｔｅｗａｙ適合性ＩＬ−６ ＯＲＦのサブクローニング
Ｇａｔｅｗａｙクローニングプロセスの第２段階は、Ｇａｔｅｗａｙ修飾ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に以下の通りサブクローニングすることを含む。５μｌの精製ＰＣＲ産物を１．５μｌのｐＤＯＮＲ２０１ベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＢＰ緩衝液、及び１．５μｌのＢＰクロナーゼ酵素混合液（ＢＰ ｃｌｏｎａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間インキュベートする。この反応をプロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加によって停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応液の一定分量（２μｌ）を、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用したエレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢカナマイシンプレート上に蒔いた。Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、得られた１〜４個のコロニーからプラスミドミニプレップＤＮＡを調製し、次いで１．５μｌのプラスミド溶出物を、最終量１０μｌ中に１．５μｌのｐＥＡＫ１２ｄベクター（図２）（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲ緩衝液、及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組換え反応液に使用した。混合液を室温で１時間インキュベートし、プロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加によって反応停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応液（１μｌ）の一定分量を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。
【０１１７】
ｐＥＡＫ１２ｄプライマー（ｐＥＡＫ１２ｄ Ｆ及びｐＥＡＫ１２ｄ Ｒ）をＰＣＲ用に使用した以外は上記の通りコロニーＰＣＲを実施することにより、正しいインサートを含有するクローンを同定した。Ｑｉａｐｒｅｐ Ｔｕｒｂｏ ９６００ロボットシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するか、又はＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を手動で使用して、正しいインサートを含有するクローンからプラスミドミニプレップＤＮＡを単離し、ｐＥＡＫ１２ｄ Ｆ及びｐＥＡＫ１２ｄ Ｒプライマーを使用して配列を確認した。
【０１１８】
配列を確認したクローンの培養物５００ｍｌから、プラスミドｐＥＡＫ１２ｄ−１Ｌ６−６ＨＩＳ（プラスミド番号１１３８１、図３）のＣｓＣＩ勾配精製ｍａｘｉ−ｐｒｅｐＤＮＡを調製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、滅菌水で１μｇ／μｌの濃度で再懸濁させ、−２０℃で保存した。
表Ｉ
ＩＬ−６サブクローニング及びシークエンシング用プライマー
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
１．３ 細胞トランスフェクション
トランスフェクションの当日に、細胞を遠心分離し、スピナー容器（ＤａｓＧｉｐ，Ｄ）中の播種培地である１％ＦＢＳ及び４ｍｌ／ｌ ＩＴＳ−Ｘサプリメントを含有する２５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞１×１０６／ｍｌの密度で再懸濁させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、細胞に２：１の比のＰＥＩ：ＤＮＡをトランスフェクトした。１００ｍｌの播種培地中で、５００μｇの相当するプラスミドＤＮＡを１ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。この混合物を細胞懸濁液に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞懸濁液を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、細胞ペレットを５００ｍｌの維持培地で再懸濁させた。細胞は、カプセル化するまで５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。
【０１２１】
１．４ 細胞カプセル化
上記で得られたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡトランスフェクト細胞及び野生型ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、米国特許第６４５８２９６号に記載のエンカプスレータに類似するＩｎｏｔｅｃｈ ｒｅｓｅａｒｃｈエンカプスレータ（Ｉｎｏｔｅｃｈ、スイス）を使用してアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）カプセル内に封入した。細胞を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、２ｍｌ洗浄緩衝液で再懸濁させた（すべての薬品はＩｎｏｔｅｃｈ社、スイス）。この懸濁液に１．５％アルギナート溶液を細胞２．５×１０６／溶液ｍｌの最終細胞濃度が得られるまでゆっくり添加した。このアルギナート−細胞懸濁液をカプセル化装置に接続したシリンジ（Ｂｒａｕｎ Ｏｍｎｉｆｉｔ，Ｂｒａｕｎ，Ｄ）で吸い取った。表１に示したパラメータ、及び表２に記載のプロトコールを使用してカプセル化を実施した。すべての緩衝液は、製造元の使用説明書に従い滅菌蒸留水中、無菌条件下で調製した。
【０１２２】
カプセル化の最終ステップの最後に、カプセルを１００ｍｌの維持培地で再懸濁させ、滅菌スピナー容器（Ｄａｓｇｉｐ，Ｄ）に移した。カプセルをスピナー容器中で維持し、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下で一晩、又は動物に注射するまでインキュベートした。
【０１２３】
カプセルは、顕微鏡で測定すると４８５±１０μｍの平均直径を有していた。
表２ カプセル化パラメータ
【０１２４】
【表２】
表３ カプセル化プロトコール
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
１．５．低剪断、微小重力条件下でのカプセルの維持の改良
一方はスピナー容器中で、もう一方は、低剪断、微小重力（１０−１２ｇ）条件下、Ｓｙｎｔｅｃｏｎ社／ＮＡＳＡ（米国ヒューストン）によって製造された水平低速回転式容器（ｓｌｏｗ ｔｕｒｎｉｎｇ ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ）ＳＴＬＶ（商標）（米国特許第６７３０４９８号参照）を使用して、上記で得られたカプセルの維持について比較実験を実施した。この細胞は、空気中５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベータ内の維持培地中で維持した。試験されたカプセルは、野生型ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、又はｈ−ＩＬ−６のｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルであった。
【０１２７】
低剪断、微小重力下で、カプセルの目に見えた破壊が７日間起こらないことが示されたが、スピナー容器では、同じ期間無傷であったカプセルが、カプセルの破壊によって生じた浮遊している細胞によって目に見えて囲まれていった。ｈ−ＩＬ−６のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞については、ｉｎ ｖｉｔｒｏで放出されたｈ−ＩＬ−６は、スピナー容器よりも低剪断、微小重力下で実質的に少なかった。
【０１２８】
２ コンカナバリンＡモデル（ＣｏｎＡ）
材料及び方法：
２．１ 動物
すべての試験でＣ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齢）を使用した。常時、実験群あたり１０匹のマウスを使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１２９】
２．１ カプセル注射
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．注射した。
【０１３０】
２．２ コンカナバリンＡ注射
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）はＳｉｇｍａ社から購入した（参照番号Ｃ７２７５、Ｓｉｇｍａ，Ｄ）。カプセルの移植から７２時間後、ＣｏｎＡを１８ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した。ＣｏｎＡ注射から１．３０時間後と８時間後に血液試料を採取した。サイトカイン及びトランスアミナーゼレベルの測定は、以下に記載の通り実施した。
【０１３１】
２．４ 読取り
２．４．１ 血液試料採取
ＣｏｎＡ注射から１．３０時間後と８時間後に眼窩後の静脈洞から１００μｌの血液試料を採取した。屠殺するときに血液を心臓から採取した。
【０１３２】
２．４．２ 血液試料中のサイトカイン及びトランスアミナーゼの検出
ＴＨ１／ＴＨ２ ＣＢＡアッセイ（参照番号５５１２８７、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）を使用してサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、及びＩＦＮγのレベルを測定した。ＣＯＢＡＳ装置（Ｈｉｔａｃｈｉ、スイス）を使用して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、ＵＲＥＡの各血中パラメータを測定した。
【０１３３】
２．４．３ 血液及び細胞培養物上清中のｈ−ＩＬ６の検出
カプセル化及びトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からのｈＩＬ−６のｉｎ ｖｉｖｏでの分泌を追跡するために、カプセル注射後１２日間毎日、一日あたり５匹のマウスの血液を採取した。
並行してＩｎ ｖｉｔｒｏで上清を１０日目まで採取した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ、参照番号ＤＹ２０６）により検出を血清中で行った。すべての試料を希釈緩衝液で２倍希釈した。
【０１３４】
２．５ 結果：
２．５．１ トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルの注射
第１の実験では、トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を試験した。このようなカプセルは、正常な動物においてサイトカインレベル又は血中パラメータを変化させないことが以前に示されている。０日目及び２日目にこのカプセルを注射した。次いで、ＣｏｎＡを注射した。ＣｏｎＡ注射から１．５時間後及び８時間後にトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αレベルを測定した。
【０１３５】
図１に結果を示すが、この図は、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含むカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示したヒストグラムを表す。
【０１３６】
その図に示す通り、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したマウスにおいて、対照マウス（ＣｏｎＡ注射のみを施したマウス）と比較して、ＮＦ−α又はトランスアミナーゼＡＳＡＴ及びＡＬＡＴレベルの有意な変化は認められなかった。
【０１３７】
２．５．２ ｈＩＬ−６を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を含有するカプセルのＩｎ ｖｉｖｏ活性
ｈＩＬ−６は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣｏｎＡ誘発肝炎におけるトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αのレベルを低減することが分かっている（Ｍｉｚｕｈａｒａら１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９，１５２９〜１５３７）。
【０１３８】
第１の実験では、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを雄Ｃ５７ Ｂｌ／６にｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。カプセル注射の直後から毎日１２日間連続で血中ｈＩＬ−６レベルを測定した。
【０１３９】
図２Ａに結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した後１２日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルのグラフを表す。
【０１４０】
この図で示される通り、血中ｈＩＬ−６レベルは、ｉ．ｐ．カプセル注射後１日目から５日目の間でピーク値に達し、ｉ．ｐ．注射したマウスの血中ｈＩＬ−６レベルの値は常にｓ．ｃ．注射したマウスよりも実質的に大きかった。ｉ．ｐ．又はＳ．Ｃ．注射後８日目、血中ｈＩＬ−６レベルは、基底値に近い値に達した。
【０１４１】
再現性：上記の通り別々にカプセル化され、様々な群に分けられた細胞の同一プール、又は上記の通り別々に調製した細胞の様々なプールのいずれかを用いてこの実験を数回反復すると、いずれの場合においても、血中ｈＩＬ−６レベルは、カプセルのｉ．ｐ．注射後１日目から５日目の間でピーク値に達し、血中ｈＩＬ−６レベルの最大値、及び最初の５日間の積算値は有意差がない（２０％未満）ことが示された。
【０１４２】
第２の実験では、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを０日目及び３日目に雄Ｃ５７ Ｂｌ／６にｉ．ｐ．注射した。さらに、１８ｍｇ／ｋｇ ＣｏｎＡをｉ．ｖ．注射して肝炎を誘発させた。ＣｏｎＡ注射から１．５時間後及び８時間後にＴＮＦ−α及びトランスアミナーゼレベルを測定した。
【０１４３】
図２Ｂ〜Ｄに結果を示すが、これら図は、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムを表す。
【０１４４】
これらの図で示される通り、ＣｏｎＡ注射の後、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートしたカプセルを事前注射したＣｏｎＡ処置マウスのＴＮＦ−α及びトランスアミナーゼレベルは、トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ細胞を注射したＣｏｎＡ処置マウスと比較して有意に低かった。
【０１４５】
したがって、カプセルからｉｎ ｖｉｖｏで放出されたｈＩＬ−６は、ＣｏｎＡ誘発肝炎においてトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αのレベルを低下させる既知の予測された作用を有する。
【０１４６】
２．５．３ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ−ｈＩＬ６−ＨＩＳカプセルを様々な量注射した後の用量反応の確立
ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルに関する用量反応関係を確立するための実験を実施して、ＣｏｎＡ ＰＯＣモデルにおいてこの技術を使用できるかどうかを実証した。７００、３５０及び１００μｌのカプセルの注射後１日目、２日目及び３日目に、全身のｈＩＬ−６タンパク質産生を測定した。
【０１４７】
図３に結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセル７００、３５０、及び１００μｌのｉ．ｐ．注射後３日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルを示すヒストグラムを表す。図４Ａ〜Ｃに結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムを表す。
【０１４８】
これらの図で示される通り、血液中のｈＩＬ−６タンパク質の産生、並びにＴＮＦα及びトランスアミナーゼの下方制御に対する生物学的作用に関する用量効果を確立することができた。
【０１４９】
（実施例２：ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるその活性の測定）
１．ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１５０】
１．２ プラスミド調製
ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号７に関する図８Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号８に関する図８Ｂを参照のこと）を、国際公開第０３／０９３３１６号に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした（Ｍｅｉ Ｃｈｕｎｇ ＭｏｈらのＪ Ｈｅｐａｔｏｌ．２００５ Ｊｕｎ；４２（６）：８３３〜４１、Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ７、及びＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ２２；２８０（２９）：２７３６６〜７４、Ｅｐｕｂ ２００５ Ｍａｙ２５も参照のこと）。
【０１５１】
簡単に言えば、先ず、２ステップＰＣＲを使用してこの遺伝子をＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＥＮＴＲベクター中にクローニングした。ｐＥＡＫ１２ｄベクター中へのサブクローニングは、Ｇａｔｅｗａｙクローニングマニュアルに従って実施した。この遺伝子をゲノム配列からの３つのエクソンのＰＣＲ増幅によってクローニングした。
【０１５２】
使用したプライマーは以下である。
【０１５３】
【化１】
【０１５４】
１．３ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１５５】
１．４ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１５６】
２．ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデル
プロトコール
マウスにおけるＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のモデルは、国際公開第９８／３８１７９号に記載の通り設定した。
【０１５７】
一過性にトランスフェクトされたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の注射後３日目に、０．３ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ、スイス）をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（それぞれ８匹のマウスからなる群）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、仏国）にｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。９０分後、血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡキットを使用して血漿ＴＮＦαを測定した。デキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）をＰＢＳに溶解させ、注射し、１５分後ＬＰＳ誘発を行った。
【０１５８】
結果
図８Ｃを参照のこと。
【０１５９】
トランスフェクトしなかった、又はｈｅｐａＣＡＭを一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のいずれかをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．経路で注射したマウスにＬＰＳを注射すると、それぞれＴＮＦα放出の非阻害又は有意な阻害が認められた。ＬＰＳ誘発サイトカイン放出を８０％阻害したデキサメタゾンを陽性対照とした。したがって、ＨｅｐａＣＡＭは、ＬＰＳ誘発ＴＮＦαレベルを有意に下方制御した。
【０１６０】
こうした結果から、ｈｅｐａＣＡＭがＴＮＦα媒介の炎症疾患を治療するのに有用であろうことが示される。
【０１６１】
（実施例３：ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２をコードしているＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるその活性の測定）
１．ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．５ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１６２】
１．６ プラスミド調製
ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２遺伝子（遺伝子の配列：配列番号９に関する図９Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号１０に関する図９Ｂを参照のこと）を国際公開第２００４／０８５４６９号に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１６３】
使用したプライマーは以下である。
【０１６４】
【表４】
【０１６５】
１．７ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１６６】
１．８ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１６７】
２．ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデル
実施例２を参照のこと。
【０１６８】
結果
図９Ｂを参照のこと。
【０１６９】
トランスフェクトしなかった、又はＩＮＳＰ１１４ＳＶ２を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のいずれかをｉ．ｐ．経路で注射したマウスにＬＰＳを注射すると、それぞれＴＮＦα放出の非阻害又は有意な阻害が認められた。ＬＰＳ誘発サイトカイン放出を８０％阻害したデキサメタゾンを陽性対照とした。したがって、ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦαレベルを有意に下方制御した。
【０１７０】
こうした結果から、ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２がＴＮＦα媒介の炎症疾患を治療するのに有用であろうことが示される。
【０１７１】
（実施例４：ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、並びにマウスモデルにおける血中ＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値の測定）
１．ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：（実施例１参照）
【０１７２】
１．２ プラスミド精製
ＥＰＯ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号５に関する図１０Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号６に関する図１０Ｂを参照のこと）を、ＩＬ−６遺伝子に関する実施例１に記載のものに類似するプロトコール及び以下のプライマーを使用して発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１７３】
【表５】
【０１７４】
１．３ 細胞トランスフェクション
１．３．１：ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞の調製
トランスフェクションの当日に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を遠心分離し、スピナー容器（ＤａｓＧｉｐ，Ｄ）中の播種培地である１％ＦＢＳ及び４ｍｌ／ｌ ＩＴＳ−Ｘサプリメントを含有する２５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞１×１０６／ｍｌの密度で再懸濁させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、細胞に２：１の比のＰＥＩ：ＤＮＡをトランスフェクトした。１００ｍｌの播種培地中で、５００μｇの相当するプラスミドＤＮＡを１ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。この混合物を細胞懸濁液に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞懸濁液を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、細胞ペレットを５００ｍｌの維持培地で再懸濁させた。細胞は、カプセル化するまで５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。
【０１７５】
１．３．２：ＥＰＯ遺伝子をトランスフェクトした細胞の半安定プールの調製
この技術は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ耐性遺伝子をその骨格中に含むｐＥＡＫ１２ｄに挿入されたＥＰＯ遺伝子のエピソームによる複製、及び細胞の半安定プールを選択するためのピューロマイシン選択圧の適用に基づく。
【０１７６】
ＥＰＯ遺伝子の初回のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をＥｘ細胞ＶＰＲＯ無血清培地（細胞保存、維持培地、ＪＲＨ）中で懸濁状態で維持した。トランスフェクションの当日に、細胞を計数し、遠心分離し（低速）、ペレットを所望の量のトランスフェクション培地、すなわち１％ＦＣＳ（ＪＲＨ）及び４ｍｌ／ｌインスリントランスフェリンセレニウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（ＦＥＭＥ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁させて、生細胞１×１０６／ｍｌの細胞濃度を得た。上記の１．２におけるＰＥＡＫ１２ｄ中へのＥＰＯ遺伝子のクローニングによって得られたＤＮＡ保存液（１ｍｇ／ｍｌ保存液）をＦＥＭＥ培地に２ｍｇ／トランスフェクション１リットル量（２％ｅＧＦＰレポーター遺伝子を同時トランスフェクト）で希釈した。次いで、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、４ｍｇ／リットル量、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｃＤＮＡ溶液に添加し、ボルテックスでしっかり撹拌し（３０秒間）、室温で１０分間インキュベートした（「トランスフェクションミックス」の作製）。
【０１７７】
次いで、このトランスフェクションミックスをスピナー容器に添加し、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）内で９０分間インキュベートした。９０分後、ＰＥＩ−ＥＰＯ ｃＤＮＡ複合体のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中への組込みが可能となり、細胞を遠心分離し、Ｅｘ細胞ＶＰＲＯ無血清新鮮培地に再懸濁させ、例えば、単細胞懸濁物として維持した。次いで、トランスフェクションから２４〜４８時間後、無血清培地中で増殖させた上記のＥＰＯ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の試料を蛍光顕微鏡下で観察して、例えば、トランスフェクト細胞に蛍光をもたらしたレポーター遺伝子を視覚化した。蛍光が細胞の８０％超で認められた場合に限り、この培養物をさらなる半安定圧選択のために維持した。
【０１７８】
ピューロマイシン２重圧選択
トランスフェクションから７２時間後、ＥＰＯを発現するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を懸濁培養により増殖させた培地を７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＥｘ−細胞ＶＰＲＯ新鮮培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と交換し、このピューロマイシン選択圧を６日間維持した。この期間の間、乳酸濃度が１．３ｇ／ｌを超えると（乳酸による増殖阻害）、選択圧培地を新鮮選択圧培地と交換した（依然ピューロマイシンを含有する）。蛍光顕微鏡及び依然増殖している（集団倍加）懸濁細胞によって視覚化すると、非組換え細胞は死滅し（細胞のわずか１０％、ＰＥＩトランスフェクション効率が高いと８５％を超える）、ＥＰＯ組換え細胞は圧選択に耐えた。
【０１７９】
選択期間の最後に、培地を通常の増殖培地（ピューロマイシンなし）と交換し、細胞をタンパク質発現について２又は３週間モニターした。２回目のピューロマイシン選択圧（上記と同じ選択圧）を細胞懸濁物にさらに６日間施すと、例えば、すべての非組換え細胞が死滅することが確かめられた。
【０１８０】
細胞増殖をモニターし、例えば、カプセル化操作のために細胞を収集するのに十分な量の細胞を培養物中で維持しながら、この培養物の一部の凍結保存により少量の細胞保存液を置いておいた。
【０１８１】
得られた半安定細胞は、ＥＰＯ遺伝子を約３カ月発現することができる。
【０１８２】
１．４ 細胞カプセル化
１．３．１で得られた一過性にトランスフェクトした細胞、及び１．３．２で得られた半安定細胞を実施例１の１．４に記載の通りカプセル化した。
【０１８３】
２．マウスモデルにおける血中ＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値の測定
２．１ プロトコール
全ての試験で、Ｃ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齢）を使用した。常時、実験群あたり５匹のマウスを使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１８４】
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。ＥＰＯを一過性にトランスフェクトした細胞、及びＥＰＯをトランスフェクトした半安定細胞、又はトランスフェクトしなかった細胞を含有する７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。
【０１８５】
カプセル注射の後１０日間連続して、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｔｉｎ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ、カタログ番号ＤＥＰ００）を使用して血中ＥＰＯレベルを追跡した。ヘマトクリット値を測定した。
【０１８６】
２．２ 結果
図１０Ｃ及び１０Ｄから明らかであるが、一過性に又は安定にトランスフェクトしたカプセル化細胞を（ｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．経路）与えたマウスにおけるヘマトクリット値の増加（１０Ｄ）に対応する血中ＥＰＯ濃度の増加（１０Ｃ）を実験の１４日間測定した。トランスフェクトしなかったカプセル化細胞を与えた対照マウスではこのような効果は観察されなかった。意外なことに、また驚くべきことに、一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞を与えたマウスにおけるＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値は、安定にトランスフェクトしたカプセル化細胞を与えたマウスよりも高いレベルに達した。
【０１８７】
（実施例５：ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びマウスモデルにおける血中ｍＩＬ−１８ＢＰレベルの測定）
１．ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１８８】
１．２ プラスミド精製
ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号３に関する図１１Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号４に関する図１１Ｂ）を、Ｍａｌｌａｔ Ｚ．ら２００２ Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，４４１〜４４８頁に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１８９】
簡単に言えば、プラスミドｐＣＥＰ４−ｍＩＬ１８ＢＰ−ｄ ２３を鋳型として使用して、増幅反応を行った。ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ＋ＨｉｎＤＩＩＩで消化し、次いでＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（商標）スピンカラムキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によって精製し、ＨｉｎＤＩＩＩ＋ＮｏｔＩで消化したｐＥＡＫ８ベクター（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）にライゲートした。
【０１９０】
１．３ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１９１】
１．４ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１９２】
２．マウスモデルにおける血中ｍＩＬ−１８ＢＰレベルの測定
２．１ プロトコール
１７匹のＣ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齡）の群を使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１９３】
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。ｍＩＬ−１８ＢＰを一過性にトランスフェクトした細胞を含有する７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．注射した。
【０１９４】
カプセル注射の後８日間連続して、ｍ−ＩＬ１８ＢＰ用に実験室で作製したＥＬＩＳＡを使用して血中ＥＰＯレベルを追跡した。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡの手順は以下の通りである。
【０１９６】
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍコンビプレート１２ＥＢというプレートを使用した。コーティングは、０．１ｍｌの１×ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ抗マウスＩＬ−１８ＢＰであった。抗原親和性により、ウサギ血清からポリクローナル抗体を精製した。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートした後、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄し、１×ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、参照番号Ａ−２１５３）を用いて３７℃で１時間ブロッキングし、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄した。標準物は、ｍＩＬ−１８ＢＰ ３００ｎｇ／ｍｌ〜０．１ｎｇ／ｍｌであり、試料は１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中０．１ｍｌ、３７℃で２時間である。１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄を実施した。０．１ｍｌのビオチニル化抗マウスＩＬ１８ＢＰ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）０．３ｍｇ／ｍｌを３７℃で２時間添加した。１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄を実施し、０．１ｍｌのｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｅ２８８６）１／５０００を静かに添加し、室温で３０分間放置した。０．０５ｍｌの２０％Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。４９２ｎｍで読み取った。
【０１９７】
２．２ 結果
図１１Ｃから明らかであるが、血中ｍ−ＩＬ１８ＢＰレベルは、カプセルのｉ．ｐ．注射後３日目から６日目の間でピーク値に達し、８日目のｍ−ＩＬ１８ＢＰレベルは依然非常に高いままであった。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】ヒトＩＬ−６（ｈＩＬ−６）の完全コード配列及びその翻訳配列（配列番号１及び２）を示す図である。
【図２Ａ】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄの制限酵素地図である。
【図２Ｂ】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄの完全ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す図である。
【図３】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ−ＩＬ−６−６ＨＩＳの制限酵素地図である。
【図４】トランスフェクトされなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ａ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した後１２日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルのグラフである。
【図５Ｂ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ｃ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＡＳＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ｄ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図６】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセル７００、３５０、及び１００μｌそれぞれのｉ．ｐ．注射後３日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルを示すヒストグラムである。
【図７Ａ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＡＳＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図８Ａ】ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子の配列（配列番号７）を示す図である。
【図８Ｂ】ｈｅｐａＣＡＭ成熟タンパク質の配列（配列番号８）を示す図である。
【図８Ｃ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びｈｅｐａＣＡＭをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした異なる量のカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｉ．ｐ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図８Ｄ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びｈｅｐａＣＡＭをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした異なる量のカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｓ．ｃ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図９Ａ】ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２をコードしている遺伝子の配列（配列番号９）を示す図である。
【図９Ｂ】ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２成熟タンパク質の配列（配列番号１０）を示す図である。
【図９Ｃ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｉ．ｐ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図１０Ａ】ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）をコードしている遺伝子の配列（配列番号５）を示す図である。
【図１０Ｂ】ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）成熟タンパク質の配列（配列番号６）を示す図である。
【図１０Ｃ】ＥＰＯをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＥＰＯをコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及び対照カプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（トランスフェクトしなかった）をｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射してから０日目〜１５日目にＥＬＩＳＡによって測定したマウスの血中ＥＰＯ濃度を示すグラフである。
【図１０Ｄ】ＥＰＯをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びＥＰＯをコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射してから０日目〜１０日目のマウスにおけるヘマトクリット値（ヘマトクリット値（Ｈｔ）又はパック細胞容積（ＰＣＶ）は、赤血球が占める血液量の割合である）を示すグラフである。
【図１１Ａ】マウスＩＬ−１８結合タンパク質（ｍ−ＩＬ１８ＢＰ）の遺伝子の配列（配列番号３）を示す図である。
【図１１Ｂ】マウスＩＬ−１８結合タンパク質（ｍ−ＩＬ１８ＢＰ）の成熟タンパク質の配列（配列番号４）を示す図である。
【図１１Ｃ】ｍ−ＩＬ１８ＢＰをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のｉ．ｐ．注射から０日目〜８日目にＥＬＩＳＡによって測定したマウスの血中ｍ−ＩＬ１８ＢＰ濃度を示すヒストグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセル、これらのカプセルを調製する方法、及びこのカプセルを使用して、これらの細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するための方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、免疫及びワクチン接種用の抗原／免疫原及び／又はアジュバントの送達に使用することができる配合物、組成物、及び方法に関する。より詳細には、本発明は、より効率的及び効果的に免疫及びワクチン接種するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質機能のｉｎ ｖｉｖｏ評価は、新たな治療法の開発、特に新たなタンパク質治療を開発するための、新たな可溶性タンパク質又は未知の機能を有する可溶性タンパク質の評価への重要な段階である。このようなｉｎ ｖｉｖｏ評価又は試験には、薬物開発の特に初期に入手することが難しい相当量の精製タンパク質が必要とされる。この過程を短縮するためには、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させることが興味深い代替法である。
【０００４】
プラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、コストが低く安全に利用できるので、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させる有望な方法である（Ｄａｖｉｓ Ｈ．Ｌ．ら１９９９ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４，１５１〜１５９）。骨格筋線維へのＤＮＡのエレクトロポレーションは、適切な条件下で使用すると、ＤＮＡが細胞内に非常に効率的に取り込まれること、導入遺伝子が長期間発現されることなど多くの特定の利点があるが、エレクトロポレーションを筋肉に行う主要な利点は、血流中で生物活性タンパク質が産生及び分泌されるその潜在的可能性にあり、したがって離れた標的に作用を及ぼす、組換えタンパク質の局所的産生が可能となる（Ｆｅｅｗｅｌｌ Ｊ．Ｇ．ら２００１ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３，５７４〜５８３；Ｋｒｅｉｓｓら１９９９ Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１，２４５〜２５０；Ａｉｈａｒａ Ｈら１９９８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，８６７〜８７０；Ｌｉ Ｓ．ら２００１ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８，４００〜４０７）。
【０００５】
遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで直接発現させる別の方法は、ＤＮＡの流体力学的送達である。この方法は、大量の裸のＤＮＡ水溶液の肝臓への急速静注を利用する。マウス及びラットに適用する場合、これは、肝臓での高レベルの遺伝子発現、並びに低レベルであるが腎臓、肺、心臓など他の器官での遺伝子発現を導入するための完全で効率的な手段である（Ｌｉｕ Ｆ．ら１９９９ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６（７），１２５８〜１２６６；Ｙａｎｇ Ｊ．ら２００１ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３（４），８４８〜８５９；Ｍａｒｕｙａｍａ Ｈ．ら２００２ Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．４（３），３３３〜３４１；Ｈｏｄｇｅｓ Ｂ．Ｌ．ら２００３ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ，３（６），９１１〜９１８）。
【０００６】
エレクトロポレーション及び流体力学的遺伝子送達法のどちらにおいても、導入遺伝子の分泌レベル又は産生タンパク質の転写後修飾に影響を与える可能性はほとんどない。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の機能を評価するのに適した第３の方法は、所望の遺伝子産物をｉｎ ｓｉｔｕで産生する、トランスジェニック細胞系のマイクロカプセル化細胞をマウス又はラットなどの実験動物に投与するものである。この手法では、細胞を宿主の免疫系から物理的に隔離するマトリックス内に細胞が封入される。栄養物、外部刺激、及び治療用タンパク質の通過が可能であるが、移植片拒絶の原因である免疫成分に不透過性であり、したがって移植片の生着を延長する選択透過膜が使用される（Ｌｉｍ Ｆ．ら１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，９０８〜９１０）。このような方法は、遺伝子治療（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ．ら１９９６ Ｂｌｏｏｄ，８７（１２），５０９５〜５１０３；Ｖｉｓｔｅｄ Ｔ．ら２００１ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３，２０１〜２１０）、インスリン依存性糖尿病（Ｓｕｎ Ｙ．ら１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ９８，１４１７〜１４２２）、及び抗癌療法（Ｒｅａｄ Ｔ−Ａ．ら１９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（５〜６），６５３〜６６３）のために開発されてきた。導入遺伝子の発現及び翻訳後修飾のレベルの完全な制御は、カプセル化される細胞系の選択性、カプセル内の細胞密度、及び発現カセットに調節エレメントを含む可能性によって可能である。発現すべき治療用タンパク質の特性に応じいくつかの生体適合性ポリマーを使用して細胞を固定化することができる。アルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）カプセルが最も頻繁に使用されているが（Ｌｉｍ Ｆ．ら１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，９０８〜９１０；Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ．ら１９９６ Ｂｌｏｏｄ，８７（１２），５０９５〜５１０３；Ｖｉｓｔｅｄ Ｔ．ら２００１ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３，２０１〜２１０；Ｓｕｎ Ｙ．ら１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ９８，１４１７〜１４２２；Ｒｅａｄ Ｔ−Ａ．ら１９９９ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｉ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（５〜６），６５３〜６６３；Ｓｔｒａｎｄ Ｂ．Ｌ．ら２００２ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １９（５），６１５〜６３０を参照のこと）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル−ｃｏ−メタクリル酸メチル）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）など他のポリマーも使用することができる（Ｌａｈｏｏｔｉ Ｓ．ら２０００ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，９８７〜９９５）。カプセル化マトリックスは、完全に固体であるか、又は包含させた細胞を環境から隔離する膜のみと共に液体コアを含有することができる。
【０００８】
Ｓａｖｅｌｋｏｕｌら（Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ Ｈｕｕｂ Ｆ．Ｊ．ら１９９４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７０ １８５〜１９６頁）は、Ｉｌ−４又はＩＬ−５を産生する安定的にトランスフェクトされたサル細胞系ＣＶ１又はＣＨＯ−Ｋｉの細胞の調製及びカプセル化（２．３及び２．４、１８６頁参照）、並びにマウスへの前記カプセル化細胞の腹腔内（ｉ．ｐ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）注射を記載している。
【０００９】
国際公開第９３／００４３９号は、活性因子又は増強物質を産生する遺伝子改変した細胞系、特にラットＮＧＦ放出細胞系Ｎ８−２１の細胞のカプセル化を開示している（実施例１）。
【００１０】
上記の従来技術に記載のあらゆる例において、カプセル化細胞は、安定的にトランスフェクトされた細胞に由来する。
【００１１】
安定的にトランスフェクトされた細胞の作製は、トランスフェクトする遺伝子を細胞のゲノム中に組み込むことを必要とするので、労力を要し時間がかかる。これは、トランスフェクト細胞を選択培地中で長時間培養した後、培養細胞を段階希釈して、安定的にトランスフェクトされ対象のタンパク質を十分な量で産生する細胞クローンを単離することによって達成される（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）。
【００１２】
安定的にトランスフェクトされた細胞は通常、対象のタンパク質が高産生されるかどうかで選択される。安定的にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトした遺伝子を高度に長期間（数カ月まで）発現する利点がある。
【００１３】
しかし、上記の方法は、複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価など、高スループット及び／又は高スピードを必要とする用途には適していない。
【００１４】
本発明によって取り組まれる課題は、高スループットに適しており短期間内（例えば、１又は２又は３週間）に実施することができる、タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現させる方法を提供すること、及び従来技術の方法の欠点を有していない、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するための手段を提供することである。
【００１５】
上記の課題を、特許請求の範囲で定義される本発明によって解決する。
【００１６】
脊椎動物の免疫系の活性化は、病原体及び悪性腫瘍から動物を防御するための重要な機構である。この免疫系は、体液性及び細胞性の部門を含めた多くの相互作用成分からなる。体液性免疫には、抗原に直接結合する抗体が関与する。体液性免疫のエフェクターとしての抗体分子は、Ｂリンパ球によって分泌される。細胞性免疫には、非自己抗原を産生する他の細胞を認識し死滅させる分化した細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が関与する。ＣＴＬは、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩ分子に結合した、標的細胞の表面上に出現する分解されたペプチド断片に応答する。細胞内で産生されたタンパク質は、細胞代謝の一部としてペプチドに連続的に分解されることが理解されている。こうした断片は、ＭＨＣ分子に結合し、細胞表面に輸送される。したがって、細胞性免疫系は、体内のあらゆる細胞内で産生されたタンパク質のスペクトルを絶えずモニターしており、非自己抗原を産生するいかなる細胞をも排除するような態勢にある。
【００１７】
ワクチン接種は、抗原／免疫原に対して応答するように動物をプライミングする過程である。この抗原は、精製タンパク質、死滅／弱毒病原体に含まれるタンパク質として、又は次いで宿主細胞内で抗原を発現する遺伝子として（遺伝子免疫）投与することができる。この過程には、Ｔ及びＢリンパ球、他の種類のリンパ球様細胞、並びに抗原を処理し、この抗原を免疫系を活性化できる形で提示することができる分化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）が関与する。
【００１８】
ワクチンの有効性は、腫瘍又は病原体による、後の抗原チャレンジに対する防御の程度によって評価される。有効なワクチンは、最少回数の接種の後、疾患を標的とした介入に対する高力価で持続的な防御免疫を誘導することができる免疫原である。
【００１９】
ワクチン開発に成功した手法の数は、病原菌の数とほとんど同じぐらいである。技術が発展するにつれ、防御抗原／免疫原の性質を分子レベルで定義することが可能となる。近年、無細胞ワクチンが、種々の病原体由来のサブユニット（すなわち多成分系ワクチン）で投与することができ、有害反応の数を減少させる潜在的可能性を有するので、ワクチン開発のための好まれる方法となっている。サブユニットワクチンは、病原微生物由来の限定された精製防御抗原で構成されている。驚くべき成功例がいくつかあるが、現在使用されているサブユニットワクチンは少数である。おそらく、サブユニットワクチンの使用を妨害する最も困難な理由は、抗原送達の問題である。最適な抗原送達のためには、抗原がその生物学的状況下で抗原提示細胞に送達される必要があり、すなわち抗原には、食細胞によって容易に認識され取り込まれるリスクがある。大部分の抗原は、寄生生物−宿主細胞間相互作用にとって重要な三次元構造を有しているが、こうした構造の多くは抗原精製の際に失われる。
【００２０】
サブユニットワクチン製造に伴う問題の多くを回避するのに取られた１つの手法は、防御抗原をｉｎ ｖｉｖｏで発現するように遺伝子改変した、弱毒ワクチン及び弱毒細菌に基づく組換え生ワクチンビヒクル（すなわち、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、サルモネラ、及びウシ型結核菌種カルメットゲラン菌すなわちＢＣＧの組換え体）の開発である（Ｓｎａｐｐｅｒ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：６９８７〜６９９１，１９８８；Ｊａｃｋｅｔｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：２３１３〜２３１８，１９８８；Ｌａｍｂ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１：Ｓ４４３〜Ｓ４４７，１９８９；Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：４４６〜４５１，１９８８を参照のこと）。
【００２１】
生細菌を使用したワクチン接種が研究されており、致死遺伝子をノックアウトするように突然変異が誘発された生細菌株を利用することが多い。生ワクチンには、抗原が先天性の免疫原の形で発現され；生送達システムが宿主内で複製及び持続し、したがって宿主の免疫系が再刺激され多回投与の必要性が回避され；生ベクター系は、抗原を精製する必要性をなくし、製造が安価であり；生ベクターは、複数の抗原を送達するように設計することができ、したがって個体にワクチン接種しなければならない回数が減少するという利点がある。しかし、この方法は、細菌が毒性に戻ることを可能にするさらなる突然変異が起こらないことを保障するような厳しい安全対策を必要とする。より確実な方法は、後に宿主がその抗体を産生できるタンパク質を発現する弱毒細菌を利用することである。細菌ベクターは、ワクチンの経口投与用に研究されることが多い。例えば、ＨＩＶ、ライム病、及びエプスタイン−バーウイルスから防御するための経口投与用にサルモネラ菌ベースのワクチンが研究されている。
【００２２】
また、バキュロウイルス、酵母、及び組織培養細胞が、ワクチンの製造において使用するために研究されてきた。各例は、バキュロウイルスを使用して、Ｅ型肝炎に対するワクチンで使用されるタンパク質を産生した米国特許第６２８７７５９号；酵母をベクターとして使用して、ワクチンで使用するためのヘリコバクターポリペプチドを産生した米国特許第６２９０９６２号；脊椎動物組織培養細胞を使用して、ワクチンで使用するための精製不活化デングウイルスを増殖させた米国特許第６２５４８７３号で示されている。こうした例のすべてにおいて、ベクターを使用して、後に精製されワクチンで使用されるはずの対象のタンパク質が産生された。
【００２３】
遺伝子免疫は、特定のタンパク質をコードしている遺伝子を動物自身の細胞内で発現させることによりこのタンパク質に対する免疫応答を誘導する別の手法である。ｉｎ ｖｉｖｏでの長期間の抗原提示によって生じた相当な抗原増幅及び免疫刺激は、抗原に対する確実な免疫（ｓｏｌｉｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導することができる。遺伝子免疫では、タンパク質精製及びアジュバントとの混合というどちらもワクチン開発に常に必要とされる困難な段階が省かれるため、特定のタンパク質に対する免疫応答を生じさせるためのワクチン接種プロトコールが簡素化される。遺伝子免疫は、タンパク質の単離を必要としないので、生化学的に精製すると高次構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を失う可能性があるタンパク質にとって特に価値がある。また、遺伝子ワクチンは、干渉を誘発することなく又は有効性に影響を及ぼすことなく混合して送達することもでき（Ｔａｎｇら，１９９２；Ｂａｒｒｙら，１９９５）、複数の抗原に対するワクチン接種計画を簡素化することができる。
【００２４】
ワクチンは、アジュバントを使用することによって増強されることが多い。ワクチンアジュバントは、ワクチン組成物中で任意の特定の抗原と共に得られる免疫応答を改善するのに有用である。アジュバントは、抗体及びエフェクターＴ細胞の量を増加させ、抗原の量及び注射の頻度を低減するのに使用される。抗原は、アジュバントを含まないワクチンとして投与されることもあるが、効果的なアジュバントなしでは、有用な免疫応答を刺激するのに十分な免疫原性を欠く抗原が多く存在する。アジュバントはまた、得られる免疫応答を増大させ、又は抗原投与量を低減することができるという点で、「自給自足」抗原の免疫応答を改善する。
【００２５】
分子ワクチン接種のためのアジュバント及び送達システムに関する包括的な総説については、Ｓｈｅｉｋｈ ＮＡ，Ａｌ−Ｓｈａｍｉｓｉ Ｍ，Ｍｏｒｒｏｗ ＷＪＷ；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０００，２：１（３７−５４）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
ワクチン開発が困難であった病原体又は腫瘍に対するワクチンを開発するためには、及び／又は十分に利用されなかったことによる市販ワクチンの失敗を克服するためには、ワクチンの免疫性及び／又は副作用の低下を可能にする抗原／免疫原送達の新たな方法を開発しなければならない。
【００２７】
抗原／免疫原を含む新たな医薬組成物及びワクチン送達法は、本出願に記載されており、適当な抗原及び／又はアジュバントをコードしている１種又は複数の遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞を送達した後、抗原／免疫原をｉｎ ｖｉｖｏで産生させるものである。この方法は、タンパク質ワクチンに伴う、抗原／免疫原の厄介な精製の必要性、又は遺伝子免疫に伴う、抗原／免疫原のｉｎ ｖｉｖｏ産生が低いことによる低効率など、上記の他のワクチン及びワクチン接種法の欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルに関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、細胞が動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である前記カプセルを提供する。
【００３０】
さらなる態様では、前記カプセルは、対象の遺伝子が、タンパク質を分泌するためのシグナル配列に融合しているカプセルである。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、カプセルは、発現カセット中に挿入された対象の遺伝子を含む。
【００３２】
さらなる態様では、カプセルは、プラスミド中に挿入された対象の遺伝子を含む。
【００３３】
本発明のさらに別の態様では、前記カプセルは、生体適合性ポリマー、アルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）を含む。
【００３４】
さらなる態様では、カプセルは、分離サイズが９０〜３０ｋＤａ、好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する生体適合性ポリマー膜を含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様では、カプセルは、平均直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである。
【００３６】
本発明の別の態様では、カプセルは、低剪断、微小重力条件下で維持された。
【００３７】
本発明はさらに、カプセルを調製する方法を提供し、この方法は、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む。
【００３８】
本発明はさらに、カプセルを調製する方法を提供し、この方法は、低剪断、微小重力条件下で維持するステップをさらに含む。
【００３９】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記多細胞生物において前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む。
【００４０】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを、哺乳動物である多細胞生物に投与するステップを含む。
【００４１】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、上記のカプセルを、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びサルからなる群から選択される哺乳動物に投与するステップを含む。
【００４２】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトしカプセル化した細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法を提供し、この方法は、ｉ．ｐ．注射によって実施される、上記のカプセルを多細胞生物に投与するステップを含む。
【００４３】
本発明はさらに、動物におけるカプセル又は上記の方法の使用を提供し、この使用では、検出すべき活性が急速に生じ（例えば、注射後数時間又は１日若しくは複数日以内）、活性物質の投与後数日以内に完了する。
【００４４】
本発明はさらに、動物におけるカプセル又は上記の方法の使用を提供し、この使用では、検出すべき活性が、急速に生じ（例えば、注射後数時間又は１日若しくは複数日以内）、活性物質の投与後数日以内に完了し、動物は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝毒性を有するマウスである。
【００４５】
本発明はさらに、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、細胞に、抗原／免疫原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子がトランスフェクトされている、上記の医薬組成物を提供する。
【００４７】
本発明はさらに、抗原／免疫原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又は腫瘍抗原である、上記の医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、カプセルが、（１種又は複数の）抗原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子をそれぞれトランスフェクトした少なくとも２種類の細胞を含み、この２種の遺伝子が同一でない、上記の医薬組成物を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供する。
【００５０】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供し、このタンパク質は、免疫及びワクチン接種用の抗原である。
【００５１】
本発明はさらに、対象のタンパク質を被検体に投与するための、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルの使用を提供し、被検体が、ヒト；げっ歯類、イヌ、ブタ及びサルを含めた研究目的で飼育された動物並びにイヌ及びネコを含めた、家畜及び飼育動物からなる群から選択される。
【００５２】
本発明はさらに、上記のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記カプセル又は組成物を被検体に投与するための手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセルを提供する。
【００５４】
用語「１種又は複数のカプセル」は、同義的に使用され、細胞を環境から隔離する生体適合性ポリマー膜のみと共に細胞を含有するカプセル化マトリックスを指す。
【００５５】
用語「１種又は複数のカプセル」はさらに、生体適合性ポリマー膜内に封入又は包含された１種又は複数の細胞を指す。
【００５６】
用語「一過性にトランスフェクトされた細胞」又は「対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞」は、対象の遺伝子を当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）によって導入し、トランスフェクションの日から１４日以内に、好ましくは１０日以内に、対象の遺伝子によってコードされているタンパク質を発現する（１種又は複数の）細胞を指す。
【００５７】
用語「一過性にトランスフェクトされた」又は「対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした」はさらに、当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）により、事前選択した細胞中に対象の遺伝子を導入し、ここで、前記細胞は対象の遺伝子を含有するが、この遺伝子は、前記細胞のゲノム中に組み込まれないこと、又は細胞内で複製することができるエピソームベクター上に位置することを指す。
【００５８】
一過性にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション後細胞を培養する際に選択培地によるどんな選択圧をもかけることなく得ることが好ましい。
【００５９】
細胞培養で使用される選択培地は、当技術分野で周知である。長年にわたるトランスフェクション研究の間、いくつかの様々な薬剤選択マーカーが一般に使用されてきた。例えば、細菌のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターをトランスフェクトした細胞は、薬剤Ｇ−４１８の存在下で安定にトランスフェクトするかどうかで選択することができる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）「ＳＶ４０初期領域プロモーターの制御下にある細菌遺伝子を用いた哺乳動物細胞の抗生物質耐性への形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，３２７）。同様に、トランスフェクトされたベクターからのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現により、薬剤ハイグロマイシンＢに対する耐性が得られる（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．及びＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．（１９８４）「高等真核細胞を用いたＤＮＡ導入実験用の選択マーカーとしてのハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，２９２９）。
【００６０】
代替戦略は、所与の細胞系において欠陥がある必須の遺伝子を担うベクターを使用することである。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子の発現に欠陥があるＣＨＯ細胞は、追加のヌクレオシドの存在下でしか生存しない。しかし、こうした細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するＤＮＡを安定にトランスフェクトすると、必要とされるヌクレオシドを合成する（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．及びＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．（１９８４）Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，４４７．）。ＤＨＦＲをマーカーとして使用するさらなる利点は、用量を増やしながらメトトレキセートに細胞を暴露すると、ＤＨＦＲ及び関連するトランスフェクトしたＤＮＡの遺伝子増幅が起こることである（Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．（１９８８）「培養細胞における遺伝子増幅（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，５９８９）。
【００６１】
用語「安定にトランスフェクトされた」又は「対象の遺伝子を安定にトランスフェクトした」又は「安定なトランスフェクション」は、当技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら参照）により、事前選択した細胞中に対象の遺伝子を導入し、ここで、前記対象の遺伝子は、前記細胞のゲノム中に組み込まれないこと、又はエピソームベクター上に位置し細胞内で複製されることを指す。
【００６２】
用語「対象の遺伝子」は、対象のタンパク質、すなわち、興味深い活性を有するタンパク質、又はその特性が興味深い、例えばそれを評価すべきタンパク質をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他のポリヌクレオチド、又はそのアナログを指す。
【００６３】
驚くべきことに、本発明者らにより、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞は、多細胞生物に投与する（例えば、注射する）ことができ、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質を、そのｉｎ ｖｉｖｏ活性又は作用を検出できるような十分な量ｉｎ ｖｉｖｏで産生することが判明した。
【００６４】
さらに驚くべきことに、前記カプセル化細胞は、トランスフェクションの当日に、又はその翌日若しくは数日後にも多細胞生物に投与することができ、前記タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性又は作用を検出することができる。
【００６５】
したがって、本発明は、投与の開始から１４日以内に、優先的には１０日以内に、さらにより好ましくは５日以内に、対象の遺伝子によってコードされるタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を分析又は評価するための新規ツールを提供する。
【００６６】
第１の態様では、本発明は、対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有する新規カプセルを提供する。
【００６７】
この細胞は、植物細胞又は動物細胞であってよい。この細胞は、動物細胞、特にハイブリドーマを含めた哺乳動物細胞であることが好ましい。特に好ましい細胞は、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ｒＣＨＯ−ｔＰＡ細胞、ｒＣＨＯ−Ｈｅｐ Ｂ表面抗原細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｒＨＥＫ２９３細胞である。本発明に従って培養することができるハイブリドーマの例には、例えば、ＤＡ４．４細胞、１２３Ａ細胞、１２７Ａ細胞、ＧＡＭＭＡ細胞、及び６７−９−Ｂ細胞が含まれる。本発明に従って培養することができる昆虫細胞の例には、例えば、鱗翅類細胞、Ｔｎ−３６８細胞、ＳＦ９細胞、ｒＳＦ９細胞、及びＨｉ−５細胞が含まれる（例えば、Ｉｋｏｎｏｍｏｕ Ｌら２００２，Ｎｏｖ〜Ｄｅｃ，１８（６），１３４５〜１３５５を参照のこと）。本発明に従って培養することができる非哺乳動物細胞の例には、例えば、ブラウンブルヘッド細胞系が含まれる（例えば、Ｂｕｃｋ ＣＤら１９８５，Ｆｅｂ，１０（２），１７１〜８４を参照のこと）。
【００６８】
上記で定義した対象の遺伝子は発現され、細胞からタンパク質が分泌される。優先的には、このタンパク質は成熟タンパク質として分泌される。優先的には、このタンパク質は、発現する場合、タンパク質を分泌するためのシグナルペプチドを含む。検討中の遺伝子が、タンパク質のシグナルペプチドをコードしている配列を有していない場合、このような配列、例えば、シグナル配列、プレ配列及び／又はプロ配列をその遺伝子配列に融合して、対象の遺伝子をタンパク質として発現、輸送及び分泌しやすいようにすることができる。
【００６９】
対象の遺伝子は、一般に、細胞の一過性トランスフェクションに適したベクターの一部である、プロモーター及び調節シグナルを含む発現カセット中に通常挿入される。
【００７０】
適当なベクターは、プラスミド又はエピソームベクターである。
【００７１】
細胞の一過性トランスフェクションに適したプラスミドの例は、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ｐＥＡＫベクターファミリー（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、又はｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）である。
【００７２】
対象の遺伝子を担うベクターの細胞へのトランスフェクションは、任意のトランスフェクション法、特にポリアミン法、ポリエチレンイミン法（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、リン酸カルシウム共沈法、又はリポフェクションによって実施することができる。ポリアミン法は、トランスフェクトした細胞の９０％超が得られるので好ましい。ショットガン法又はエレクトロポレーションは、高い細胞死亡率を伴い、これにより死細胞のカプセル化が高い割合でもたらされるはずであり、したがってカプセルの生産性が低下するのでこの用途には好ましくない。
【００７３】
生体適合性ポリマーは、安定に発現する細胞系の細胞をカプセル化するための、当技術分野で既知の生体適合性ポリマー、特にアルギナート塩、特にアルギナートナトリウム若しくはカリウム、及びアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）、並びにポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル−ｃｏ−メタクリル酸メチル）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）などの他のポリマーの中から選択することができる。好ましい生体適合性ポリマーはＡＰＡである。
【００７４】
このポリマーを工学処理して、選択透過膜、すなわち栄養物、酸素、外部刺激、及び分泌タンパク質に透過性があるが、移植片拒絶の原因である免疫成分に不透過性である膜が作製される。このような選択透過膜は通常、分離が９０〜３０、好ましくは９０〜５０又は８０〜５０ｋＤａ、さらにより好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する。分離は、選択透過膜を通して拡散することができる分子のサイズを定義する。
【００７５】
カプセルは通常、直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである。
【００７６】
本発明はまた、上記カプセルを調製する方法に関し、この方法は、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む。
【００７７】
カプセル化の後、この細胞は、カプセル内で増殖し続け、対象の遺伝子によって分泌される成熟タンパク質を、カプセルを維持する培地中に拡散する。
【００７８】
このカプセルは、成熟タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ拡散を低減し、機械的な理由によるカプセルのどんな破壊をも避ける、低剪断、微小重力条件下で維持することが好ましい。
【００７９】
本発明のカプセルを調製するすべてのステップは、短期間、通常１日又は２日以内に実施することができる。
【００８０】
細胞を含有するカプセルを数カ月まで保存するために、−８０℃で、又は液体窒素（−１９６℃）気相若しくは液相中で凍結させることができる。この凍結保存により、大量のカプセルを製造し、続いてその一定分量を様々な用途に（例えば、キット中に）使用することが可能となる。蘇生後、この細胞はカプセル内で増殖を再開し、対象のタンパク質を３〜１０日間産生し続ける。
【００８１】
さらなる態様では、本発明は、対象の遺伝子によってコードされており、一過性にトランスフェクトした細胞によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を分析又は評価する方法に関し、この方法は、上記で定義したカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む。この活性は、局所活性又は全身活性であってよい。
【００８２】
本発明の方法に従って産生することができるタンパク質は、例えば、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン絨毛性ゴナドトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ−ｌａ、インターフェロンβ−ｌｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンγ受容体）、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質、インターロイキン（例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、増殖因子（例えば、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、酸性及び塩基性線維芽細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、グリア細胞系由来神経栄養因子）、下垂体ペプチドホルモン、閉経期性腺刺激ホルモン、インスリン様成長因子（例えば、ソマトメジンＣ）、トロンボモジュリン、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質２、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、並びにその突然変異タンパク質、断片、可溶形、機能性誘導体、及び融合タンパク質を含めた対象のどんなタンパク質とすることもできる。
【００８３】
多細胞生物は、植物又は動物であってよい。特定の対象の動物は、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルなど薬学研究で一般に使用されている哺乳動物である。
【００８４】
特に興味深い哺乳動物は、マウス又はラットなどのげっ歯類であり、マウス、例えばＣ５７／ＢＬ６系マウスが好ましい。
【００８５】
検出する活性は、例えば、体温、組織又は体液の色、組織又は体液（例えば、血液、血清、血漿、糞便、痰、滑液、脳脊髄液、又は尿）中の所与の物質の濃度など、任意のパラメータに関するものでよい。
【００８６】
カプセルは、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内、皮下（ｓ．ｃ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与することができる。好ましい投与形態はｉ．ｐ．注射である。別の好ましい形態はｓ．ｃ．注射である。
【００８７】
カプセルはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で安定であり、包含する細胞を分解又は放出しない。
【００８８】
カプセルは、一過性発現が起こっている限り、すなわちカプセル投与（０日目）から通常３〜１４日目の間は成熟タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで放出するが、その放出の大部分は通常、１日目〜４、５又は６日目に起こる。成熟タンパク質が大量に放出される期間は通常３〜５日目であるが、これは検出すべき局所及び／又は全身活性を誘導するのに通常十分である。慢性作用を検出するためなど、必要な場合は、カプセルの投与を２回以上それぞれ別の時点で実施して、例えば、大量の成熟タンパク質の放出をより長期間維持することができる。
【００８９】
したがって、本発明のカプセルは、実験動物、例えばヒト疾患の動物モデルで使用することができる、薬学研究の有用なツールとなる。
【００９０】
この動物又は動物モデルは、誘導された検出すべき局所及び／又は全身活性が急速に（すなわち、数時間又は１日若しくは複数日以内に）生じ、活性物質（対象のタンパク質）の投与後数日以内に完了するものが好ましい。
【００９１】
このような動物モデルの一例は、以下で例示するが、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって肝毒性が誘発されたマウスである。
【００９２】
中毒性肝疾患は、ヒトの世界中の健康問題を代表し、薬理学的治療法がまだ発見されていない。例えば、肝硬変をもたらす活動性慢性肝炎は、活性化Ｔ細胞によって肝実質細胞が進行的に破壊される病状である。ＣｏｎＡ誘発肝毒性は、マウスで説明されているＴ細胞依存性アポトーシス性及び壊死性肝損傷の３つの実験モデルのうちの１つである。活性化抗ＣＤ３モノクローナル抗体又はスーパー抗原ＳＥＢのいずれかで誘発したＧａｌ Ｎ（Ｄ−ガラクトサミン）感作マウスは、重篤なアポトーシス性肝損傷及び二次的な壊死性肝損傷を発症する。植物のＴ細胞分裂促進レクチンＣｏｎＡの非感作マウスへの注射によっても、壊死に先行する肝アポトーシスがもたらされる。ＣｏｎＡは、全身へのＴＮＦα及びＩＦＮγ、並びに他の種々のサイトカインの放出を誘発する。傷害の８時間後、トランスアミナーゼの放出は重篤な肝臓破壊を示す。
【００９３】
ＴＮＦα及びＩＦＮγはどちらも、肝障害を誘発する上で肝損傷の決定的に重要なメディエータである。例えば、ＴＮＦαは、ＣｏｎＡ注射の後に産生される最初のサイトカインの１つであり、抗ＴＮＦα抗体は、疾患に対する防御を与える（Ｓｅｉｎｏら２００１，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ ２３４，６８１）。ＣｏｎＡ処理動物の血中トランスアミナーゼレベルの低下から判断して、抗ＩＦＮγ抗血清はマウスを有意に防御するので、後で誘導されるＩＦＮγも、肝損傷の決定的に重要なメディエータであると思われる（ＫｕｅｓｔｅｒｓらＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｙ １１１，４６２）。ＣｏｎＡ誘発肝毒性からの防御を与える処置を記載した様々な文献がある。ｒＩＬ６の単回投与により、トランスアミナーゼの放出が完全に阻害されたが、同じ投与計画でＴＮＦ産生の阻害は４０〜５０％しか誘導されなかった（Ｍｉｚｕｈａｒａら１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１５２９〜１５３７）。
【００９４】
数種の細胞型、ＣＤ４ Ｔ細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞が肝障害に関与することが示されている（Ｋａｎｅｋｏ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０００，１９１，１０５〜１１４）。抗ＣＤ４抗体は、Ｔ細胞の活性化及びその結果としての肝障害を遮断する（Ｔｉｅｇｓら１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，１９６〜２０３）。ＣＤ８に対するモノクローナル抗体のマウスへの前処置は防御に失敗したが、マクロファージの欠失は肝炎の誘発を阻止した。
【００９５】
興味深い動物モデルの別の例は、マウスＬＰＳ（リポ多糖）誘発ＴＮＦα放出モデルである。
【００９６】
ＬＰＳは、脂質及び炭水化物をどちらも含有する大分子である。ＬＰＳは、グラム陰性菌の細胞壁の主成分である。ＬＰＳは、原型的なエンドトキシンとして働き、多くの細胞型において炎症誘発性サイトカインの分泌を促進する。ＬＰＳは、Ｔｏｌｌ受容体４を介して先天性免疫系の食細胞によって認識される（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ Ｍ．らＴｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ｊｕｎ；２３（６）：３０１〜４）。ＬＰＳは、マクロファージ又はミクログリアをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで活性化するために広く使用されている（Ｔｏｂｉａｓ ＰＳらＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９３ Ａｐｒ；１８７（３〜５）：２２７〜３２）。マウスのＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出モデルはヒトの炎症状況に似ている。
【００９７】
本発明はさらに、細胞に１種又は複数の遺伝子を一過性にトランスフェクトした上記のカプセルを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、製薬上許容される１種又は複数の担体、希釈剤、或いは賦形剤を追加的に場合によって含む。
【００９８】
この遺伝子は、病原体由来の、１種又は複数の抗原／免疫原、或いは１種又は複数のその部分、或いは対象の１種又は複数のエピトープをコードすることができる。抗原／免疫原という用語は、宿主において免疫応答を誘発することが可能な任意のタンパク質又はその誘導体を指す。
【００９９】
好ましい実施形態では、病原体は、任意のウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、細菌、寄生生物、及び菌類からなる群から選択される。ウイルスには、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、ライノウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ヘパドナウイルス、及びヒト免疫不全ウイルスを含めたレトロウイルスが含まれる。細菌には、マイコバクテリア、スピロヘータ、リケッチア、クラミジア、及びマイコプラズマが含まれる。菌類には、酵母及びカビが含まれる。寄生生物には、住血吸虫、リーシュマニア、及びマラリア原虫が含まれる。この一覧には、本明細書に記載の方法に従ってその防御免疫応答を生じさせることができるあらゆる潜在的な病原体が含まれていないことは理解されよう。
【０１００】
特に、その遺伝子は、インフルエンザ血球凝集素、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザＭ２、破傷風毒素Ｃフラグメント、炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、炭疽菌発芽因子、狂犬病糖タンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ１６０、マラリアＣＳＰ、マラリアＳＳＰ、マラリアＭＳＰ、マラリアｐｆｇ、ボツリヌス毒素Ａ、及び結核菌ＨＳＰからなる群から選択される１種又は複数の抗原／免疫原をコードすることができる。
【０１０１】
別の実施形態では、遺伝子は、腫瘍由来の抗原／免疫原をコードすることができる。この腫瘍は、乳腺、卵巣、肺、脳、胃、腸管、膵臓、膀胱、前立腺、骨、又は造血性の細胞若しくは組織の腫瘍、或いは他の細胞又は組織の腫瘍とすることができる。特に、その遺伝子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒト癌胎児性抗原、及び前立腺特異的抗原からなる群から選択される１種又は複数の抗原／免疫原をコードすることができる。
【０１０２】
別の実施形態では、遺伝子は、抗体を生じるべく選択された任意の抗原／免疫原をコードすることができる。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができる。この抗体は、特に、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ドメイン抗体、又は短鎖抗体であってよい。この抗体は、例えば、研究、診断、治療、又は他の目的に有用であり得る。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、遺伝子は、アジュバントをコードすることができる。このアジュバントは、共刺激分子、サイトカイン、又はケモカインとすることができる。好ましいアジュバントは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＩＮＦγである。
【０１０４】
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）本明細書に記載の１種若しくは複数の抗原／免疫原及び／又はアジュバントをトランスフェクトした細胞を含有するか、或いは（ｂ）本明細書に記載の１種若しくは複数の抗原／免疫原及び／又はアジュバントから様々に選択したものをトランスフェクトした細胞群を含有するカプセルを含む。カプセル内の細胞の選択は、ワクチン接種の必要性に適合させることができることは理解されよう。これは、抗原／免疫原及びアジュバントの適切な選択、発現ベクター及び発現カセットの適切な選択、対象の遺伝子を発現する細胞型若しくは細胞系の適切な選択、並びに／又は本明細書及び当技術分野で記載されているカプセル化材料の適切な選択によって達成することができる。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物を被検体に投与するステップを含む、免疫する方法である。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用である。
【０１０７】
好ましい実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用であり、このタンパク質は、ワクチン接種用の抗原／免疫原である。
【０１０８】
好ましい実施形態は、対象のタンパク質を被検体に投与するための、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物の使用であり、このタンパク質は、抗体の標的として選択された抗原／免疫原である。特に、このカプセルは、被検体において、カプセル化細胞によって産生される事前選択した抗原に対する抗体応答を誘発させるのに使用される。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記カプセル又は組成物を被検体に適用するための手段である。
【０１１０】
この被検体は、動物とすることができ、有利には脊椎動物、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、又は魚類であり、より有利にはヒト、或いは飼育動物、家畜化動物、食物を生産する動物、飼料を生産する動物、家畜、狩猟動物、競争用動物、又は競技用動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、若しくはウマ、又はさらには家禽、例えば、シチメンチョウ、カモ、若しくはニワトリである。別の実施形態では、この脊椎動物は、それだけには限らないが、げっ歯類（マウス、モルモット、及びラットを含む）、イヌ、ブタ、及びサルを含めた研究目的で飼育された動物である。本発明の最も好ましい実施形態では、脊椎動物はヒトである。
【０１１１】
本明細書で開示されるカプセル又は医薬組成物は優先的には、非経口経路で被検体に投与される。例えば、個体に、腹腔内、皮内、皮下、又は筋肉内の方法によって接種することができる。
【０１１２】
本発明の他の特徴及び利点は、限定的な特性ではなく例示的なものを有する以下の実施例から明らかとなろう。実施例は、好都合なことには、添付の図面を参照することによって読まれよう。
【実施例】
【０１１３】
（実施例１：ＩＬ−６をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、並びにマウスコンカナバリンＡモデルにおけるＩＬ−６血中レベル及びその活性の測定）
１．対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持
エプスタイン−バーウイルス核抗原を発現するヒト胎生腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）の細胞を、スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、英国）中で４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１ｍｌ／ｌフェノールレッド溶液（水中０．５％ｗ／ｖ、フェノールレッド：Ｓｉｇｍａ、米国）を補充したＥｘ細胞ＶＰＲＯ無血清培地（維持培地、ＪＲＨ、英国）中で懸濁状態で維持した。
【０１１４】
１．２ プラスミド調製
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内でＩＬ−６を発現させるためのプラスミドの構築
ヒトＩＬ−６の完全コード配列（ＯＲＦ）（図１、配列番号１）を含有するプラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社クローンＩＤ ＣＳ０ＤＩ０１９ＹＰ０５）。Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、このＯＲＦを哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ（図２Ａ及び２Ｂ）中にサブクローニングした。
【０１１５】
１．２．１ ６ＨＩＳタグ配列にインフレームで融合させたＧａｔｅｗａｙ適合性ＩＬ−６ ＯＲＦの作製
Ｇａｔｅｗａｙクローニングプロセスの第１段階は、２ステップのＰＣＲ反応を含み、この反応では、５’末端でａｔｔＢｌ組換え部位及びコザック配列に隣接し、３’末端で６ヒスチジン（６ＨＩＳ）タグをインフレームでコードする配列、終止コドン及びａｔｔＢ２組換え部位に隣接するＩＬ−６のＯＲＦ（Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｃＤＮＡ）が作製される。第１のＰＣＲ反応液（最終量５０μｌ中）は、２５ｎｇのＣＳ０ＤＩ０１９ＹＰ０５プラスミド、２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼ緩衝液、各０．５μｌの遺伝子特異的プライマー（１００μＭ）（ＥＸ１フォワード及びＥＸ１リバース）、及び０．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する。ＰＣＲ反応は、最初の変性ステップ９５℃で２分間、続いて９４℃で１５秒間及び６８℃で３０秒間を１２サイクル実施した。Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の使用説明書に従って使用して、反応混合液からＰＣＲ産物を直接精製した。第２のＰＣＲ反応液（最終量５０μｌ中）は、１０μｌの精製ＰＣＲ産物、２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼ緩衝液、各０．５μｌのＧａｔｅｗａｙ変換プライマー（１００μＭ）（ＧＣＰフォワード及びＧＣＰリバース）、及び０．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。第２のＰＣＲ反応の条件は、９５℃で１分間；９４℃で１５秒間、４５℃で３０秒間、及び６８℃で３．５分間を４サイクル；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で３．５分間を２５サイクルであった。ＰＣＲ産物を上記の通り精製した。
【０１１６】
１．２．２ ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２０１及び発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中へのＧａｔｅｗａｙ適合性ＩＬ−６ ＯＲＦのサブクローニング
Ｇａｔｅｗａｙクローニングプロセスの第２段階は、Ｇａｔｅｗａｙ修飾ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に以下の通りサブクローニングすることを含む。５μｌの精製ＰＣＲ産物を１．５μｌのｐＤＯＮＲ２０１ベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＢＰ緩衝液、及び１．５μｌのＢＰクロナーゼ酵素混合液（ＢＰ ｃｌｏｎａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間インキュベートする。この反応をプロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加によって停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応液の一定分量（２μｌ）を、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用したエレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢカナマイシンプレート上に蒔いた。Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、得られた１〜４個のコロニーからプラスミドミニプレップＤＮＡを調製し、次いで１．５μｌのプラスミド溶出物を、最終量１０μｌ中に１．５μｌのｐＥＡＫ１２ｄベクター（図２）（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲ緩衝液、及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組換え反応液に使用した。混合液を室温で１時間インキュベートし、プロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加によって反応停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応液（１μｌ）の一定分量を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。
【０１１７】
ｐＥＡＫ１２ｄプライマー（ｐＥＡＫ１２ｄ Ｆ及びｐＥＡＫ１２ｄ Ｒ）をＰＣＲ用に使用した以外は上記の通りコロニーＰＣＲを実施することにより、正しいインサートを含有するクローンを同定した。Ｑｉａｐｒｅｐ Ｔｕｒｂｏ ９６００ロボットシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するか、又はＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を手動で使用して、正しいインサートを含有するクローンからプラスミドミニプレップＤＮＡを単離し、ｐＥＡＫ１２ｄ Ｆ及びｐＥＡＫ１２ｄ Ｒプライマーを使用して配列を確認した。
【０１１８】
配列を確認したクローンの培養物５００ｍｌから、プラスミドｐＥＡＫ１２ｄ−１Ｌ６−６ＨＩＳ（プラスミド番号１１３８１、図３）のＣｓＣＩ勾配精製ｍａｘｉ−ｐｒｅｐＤＮＡを調製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、滅菌水で１μｇ／μｌの濃度で再懸濁させ、−２０℃で保存した。
表Ｉ
ＩＬ−６サブクローニング及びシークエンシング用プライマー
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
１．３ 細胞トランスフェクション
トランスフェクションの当日に、細胞を遠心分離し、スピナー容器（ＤａｓＧｉｐ，Ｄ）中の播種培地である１％ＦＢＳ及び４ｍｌ／ｌ ＩＴＳ−Ｘサプリメントを含有する２５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞１×１０６／ｍｌの密度で再懸濁させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、細胞に２：１の比のＰＥＩ：ＤＮＡをトランスフェクトした。１００ｍｌの播種培地中で、５００μｇの相当するプラスミドＤＮＡを１ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。この混合物を細胞懸濁液に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞懸濁液を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、細胞ペレットを５００ｍｌの維持培地で再懸濁させた。細胞は、カプセル化するまで５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。
【０１２１】
１．４ 細胞カプセル化
上記で得られたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡトランスフェクト細胞及び野生型ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、米国特許第６４５８２９６号に記載のエンカプスレータに類似するＩｎｏｔｅｃｈ ｒｅｓｅａｒｃｈエンカプスレータ（Ｉｎｏｔｅｃｈ、スイス）を使用してアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）カプセル内に封入した。細胞を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、２ｍｌ洗浄緩衝液で再懸濁させた（すべての薬品はＩｎｏｔｅｃｈ社、スイス）。この懸濁液に１．５％アルギナート溶液を細胞２．５×１０６／溶液ｍｌの最終細胞濃度が得られるまでゆっくり添加した。このアルギナート−細胞懸濁液をカプセル化装置に接続したシリンジ（Ｂｒａｕｎ Ｏｍｎｉｆｉｔ，Ｂｒａｕｎ，Ｄ）で吸い取った。表１に示したパラメータ、及び表２に記載のプロトコールを使用してカプセル化を実施した。すべての緩衝液は、製造元の使用説明書に従い滅菌蒸留水中、無菌条件下で調製した。
【０１２２】
カプセル化の最終ステップの最後に、カプセルを１００ｍｌの維持培地で再懸濁させ、滅菌スピナー容器（Ｄａｓｇｉｐ，Ｄ）に移した。カプセルをスピナー容器中で維持し、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下で一晩、又は動物に注射するまでインキュベートした。
【０１２３】
カプセルは、顕微鏡で測定すると４８５±１０μｍの平均直径を有していた。
表２ カプセル化パラメータ
【０１２４】
【表２】
表３ カプセル化プロトコール
【０１２５】
【表３】
【０１２６】
１．５．低剪断、微小重力条件下でのカプセルの維持の改良
一方はスピナー容器中で、もう一方は、低剪断、微小重力（１０−１２ｇ）条件下、Ｓｙｎｔｅｃｏｎ社／ＮＡＳＡ（米国ヒューストン）によって製造された水平低速回転式容器（ｓｌｏｗ ｔｕｒｎｉｎｇ ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ）ＳＴＬＶ（商標）（米国特許第６７３０４９８号参照）を使用して、上記で得られたカプセルの維持について比較実験を実施した。この細胞は、空気中５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベータ内の維持培地中で維持した。試験されたカプセルは、野生型ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、又はｈ−ＩＬ−６のｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルであった。
【０１２７】
低剪断、微小重力下で、カプセルの目に見えた破壊が７日間起こらないことが示されたが、スピナー容器では、同じ期間無傷であったカプセルが、カプセルの破壊によって生じた浮遊している細胞によって目に見えて囲まれていった。ｈ−ＩＬ−６のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞については、ｉｎ ｖｉｔｒｏで放出されたｈ−ＩＬ−６は、スピナー容器よりも低剪断、微小重力下で実質的に少なかった。
【０１２８】
２ コンカナバリンＡモデル（ＣｏｎＡ）
材料及び方法：
２．１ 動物
すべての試験でＣ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齢）を使用した。常時、実験群あたり１０匹のマウスを使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１２９】
２．１ カプセル注射
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．注射した。
【０１３０】
２．２ コンカナバリンＡ注射
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）はＳｉｇｍａ社から購入した（参照番号Ｃ７２７５、Ｓｉｇｍａ，Ｄ）。カプセルの移植から７２時間後、ＣｏｎＡを１８ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した。ＣｏｎＡ注射から１．３０時間後と８時間後に血液試料を採取した。サイトカイン及びトランスアミナーゼレベルの測定は、以下に記載の通り実施した。
【０１３１】
２．４ 読取り
２．４．１ 血液試料採取
ＣｏｎＡ注射から１．３０時間後と８時間後に眼窩後の静脈洞から１００μｌの血液試料を採取した。屠殺するときに血液を心臓から採取した。
【０１３２】
２．４．２ 血液試料中のサイトカイン及びトランスアミナーゼの検出
ＴＨ１／ＴＨ２ ＣＢＡアッセイ（参照番号５５１２８７、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）を使用してサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、及びＩＦＮγのレベルを測定した。ＣＯＢＡＳ装置（Ｈｉｔａｃｈｉ、スイス）を使用して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、ＵＲＥＡの各血中パラメータを測定した。
【０１３３】
２．４．３ 血液及び細胞培養物上清中のｈ−ＩＬ６の検出
カプセル化及びトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からのｈＩＬ−６のｉｎ ｖｉｖｏでの分泌を追跡するために、カプセル注射後１２日間毎日、一日あたり５匹のマウスの血液を採取した。
並行してＩｎ ｖｉｔｒｏで上清を１０日目まで採取した。市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ、参照番号ＤＹ２０６）により検出を血清中で行った。すべての試料を希釈緩衝液で２倍希釈した。
【０１３４】
２．５ 結果：
２．５．１ トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルの注射
第１の実験では、トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を試験した。このようなカプセルは、正常な動物においてサイトカインレベル又は血中パラメータを変化させないことが以前に示されている。０日目及び２日目にこのカプセルを注射した。次いで、ＣｏｎＡを注射した。ＣｏｎＡ注射から１．５時間後及び８時間後にトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αレベルを測定した。
【０１３５】
図１に結果を示すが、この図は、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含むカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示したヒストグラムを表す。
【０１３６】
その図に示す通り、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したマウスにおいて、対照マウス（ＣｏｎＡ注射のみを施したマウス）と比較して、ＮＦ−α又はトランスアミナーゼＡＳＡＴ及びＡＬＡＴレベルの有意な変化は認められなかった。
【０１３７】
２．５．２ ｈＩＬ−６を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を含有するカプセルのＩｎ ｖｉｖｏ活性
ｈＩＬ−６は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣｏｎＡ誘発肝炎におけるトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αのレベルを低減することが分かっている（Ｍｉｚｕｈａｒａら１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９，１５２９〜１５３７）。
【０１３８】
第１の実験では、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを雄Ｃ５７ Ｂｌ／６にｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。カプセル注射の直後から毎日１２日間連続で血中ｈＩＬ−６レベルを測定した。
【０１３９】
図２Ａに結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した後１２日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルのグラフを表す。
【０１４０】
この図で示される通り、血中ｈＩＬ−６レベルは、ｉ．ｐ．カプセル注射後１日目から５日目の間でピーク値に達し、ｉ．ｐ．注射したマウスの血中ｈＩＬ−６レベルの値は常にｓ．ｃ．注射したマウスよりも実質的に大きかった。ｉ．ｐ．又はＳ．Ｃ．注射後８日目、血中ｈＩＬ−６レベルは、基底値に近い値に達した。
【０１４１】
再現性：上記の通り別々にカプセル化され、様々な群に分けられた細胞の同一プール、又は上記の通り別々に調製した細胞の様々なプールのいずれかを用いてこの実験を数回反復すると、いずれの場合においても、血中ｈＩＬ−６レベルは、カプセルのｉ．ｐ．注射後１日目から５日目の間でピーク値に達し、血中ｈＩＬ−６レベルの最大値、及び最初の５日間の積算値は有意差がない（２０％未満）ことが示された。
【０１４２】
第２の実験では、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを０日目及び３日目に雄Ｃ５７ Ｂｌ／６にｉ．ｐ．注射した。さらに、１８ｍｇ／ｋｇ ＣｏｎＡをｉ．ｖ．注射して肝炎を誘発させた。ＣｏｎＡ注射から１．５時間後及び８時間後にＴＮＦ−α及びトランスアミナーゼレベルを測定した。
【０１４３】
図２Ｂ〜Ｄに結果を示すが、これら図は、ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムを表す。
【０１４４】
これらの図で示される通り、ＣｏｎＡ注射の後、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートしたカプセルを事前注射したＣｏｎＡ処置マウスのＴＮＦ−α及びトランスアミナーゼレベルは、トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ細胞を注射したＣｏｎＡ処置マウスと比較して有意に低かった。
【０１４５】
したがって、カプセルからｉｎ ｖｉｖｏで放出されたｈＩＬ−６は、ＣｏｎＡ誘発肝炎においてトランスアミナーゼ及びＴＮＦ−αのレベルを低下させる既知の予測された作用を有する。
【０１４６】
２．５．３ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ−ｈＩＬ６−ＨＩＳカプセルを様々な量注射した後の用量反応の確立
ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルに関する用量反応関係を確立するための実験を実施して、ＣｏｎＡ ＰＯＣモデルにおいてこの技術を使用できるかどうかを実証した。７００、３５０及び１００μｌのカプセルの注射後１日目、２日目及び３日目に、全身のｈＩＬ−６タンパク質産生を測定した。
【０１４７】
図３に結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセル７００、３５０、及び１００μｌのｉ．ｐ．注射後３日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルを示すヒストグラムを表す。図４Ａ〜Ｃに結果を示すが、この図は、ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムを表す。
【０１４８】
これらの図で示される通り、血液中のｈＩＬ−６タンパク質の産生、並びにＴＮＦα及びトランスアミナーゼの下方制御に対する生物学的作用に関する用量効果を確立することができた。
【０１４９】
（実施例２：ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるその活性の測定）
１．ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１５０】
１．２ プラスミド調製
ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号７に関する図８Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号８に関する図８Ｂを参照のこと）を、国際公開第０３／０９３３１６号に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした（Ｍｅｉ Ｃｈｕｎｇ ＭｏｈらのＪ Ｈｅｐａｔｏｌ．２００５ Ｊｕｎ；４２（６）：８３３〜４１、Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ７、及びＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ２２；２８０（２９）：２７３６６〜７４、Ｅｐｕｂ ２００５ Ｍａｙ２５も参照のこと）。
【０１５１】
簡単に言えば、先ず、２ステップＰＣＲを使用してこの遺伝子をＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＥＮＴＲベクター中にクローニングした。ｐＥＡＫ１２ｄベクター中へのサブクローニングは、Ｇａｔｅｗａｙクローニングマニュアルに従って実施した。この遺伝子をゲノム配列からの３つのエクソンのＰＣＲ増幅によってクローニングした。
【０１５２】
使用したプライマーは以下である。
【０１５３】
【化１】
【０１５４】
１．３ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１５５】
１．４ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１５６】
２．ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデル
プロトコール
マウスにおけるＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のモデルは、国際公開第９８／３８１７９号に記載の通り設定した。
【０１５７】
一過性にトランスフェクトされたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の注射後３日目に、０．３ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ、スイス）をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（それぞれ８匹のマウスからなる群）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、仏国）にｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。９０分後、血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡキットを使用して血漿ＴＮＦαを測定した。デキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）をＰＢＳに溶解させ、注射し、１５分後ＬＰＳ誘発を行った。
【０１５８】
結果
図８Ｃを参照のこと。
【０１５９】
トランスフェクトしなかった、又はｈｅｐａＣＡＭを一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のいずれかをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．経路で注射したマウスにＬＰＳを注射すると、それぞれＴＮＦα放出の非阻害又は有意な阻害が認められた。ＬＰＳ誘発サイトカイン放出を８０％阻害したデキサメタゾンを陽性対照とした。したがって、ＨｅｐａＣＡＭは、ＬＰＳ誘発ＴＮＦαレベルを有意に下方制御した。
【０１６０】
こうした結果から、ｈｅｐａＣＡＭがＴＮＦα媒介の炎症疾患を治療するのに有用であろうことが示される。
【０１６１】
（実施例３：ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２をコードしているＤＮＡを一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるその活性の測定）
１．ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．５ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１６２】
１．６ プラスミド調製
ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２遺伝子（遺伝子の配列：配列番号９に関する図９Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号１０に関する図９Ｂを参照のこと）を国際公開第２００４／０８５４６９号に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１６３】
使用したプライマーは以下である。
【０１６４】
【表４】
【０１６５】
１．７ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１６６】
１．８ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１６７】
２．ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデル
実施例２を参照のこと。
【０１６８】
結果
図９Ｂを参照のこと。
【０１６９】
トランスフェクトしなかった、又はＩＮＳＰ１１４ＳＶ２を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のいずれかをｉ．ｐ．経路で注射したマウスにＬＰＳを注射すると、それぞれＴＮＦα放出の非阻害又は有意な阻害が認められた。ＬＰＳ誘発サイトカイン放出を８０％阻害したデキサメタゾンを陽性対照とした。したがって、ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦαレベルを有意に下方制御した。
【０１７０】
こうした結果から、ＩＮＳＰ１１４ＳＶ２がＴＮＦα媒介の炎症疾患を治療するのに有用であろうことが示される。
【０１７１】
（実施例４：ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、並びにマウスモデルにおける血中ＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値の測定）
１．ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：（実施例１参照）
【０１７２】
１．２ プラスミド精製
ＥＰＯ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号５に関する図１０Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号６に関する図１０Ｂを参照のこと）を、ＩＬ−６遺伝子に関する実施例１に記載のものに類似するプロトコール及び以下のプライマーを使用して発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１７３】
【表５】
【０１７４】
１．３ 細胞トランスフェクション
１．３．１：ＥＰＯ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞の調製
トランスフェクションの当日に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を遠心分離し、スピナー容器（ＤａｓＧｉｐ，Ｄ）中の播種培地である１％ＦＢＳ及び４ｍｌ／ｌ ＩＴＳ−Ｘサプリメントを含有する２５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞１×１０６／ｍｌの密度で再懸濁させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して（Ｏ．Ｂｏｕｓｓｉｆら１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，７２９７〜７３０１頁）、細胞に２：１の比のＰＥＩ：ＤＮＡをトランスフェクトした。１００ｍｌの播種培地中で、５００μｇの相当するプラスミドＤＮＡを１ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と混合し、室温で１０分間インキュベートした。この混合物を細胞懸濁液に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞懸濁液を遠心分離し（２００×ｇ、１０分間、４℃）、細胞ペレットを５００ｍｌの維持培地で再懸濁させた。細胞は、カプセル化するまで５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。
【０１７５】
１．３．２：ＥＰＯ遺伝子をトランスフェクトした細胞の半安定プールの調製
この技術は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ耐性遺伝子をその骨格中に含むｐＥＡＫ１２ｄに挿入されたＥＰＯ遺伝子のエピソームによる複製、及び細胞の半安定プールを選択するためのピューロマイシン選択圧の適用に基づく。
【０１７６】
ＥＰＯ遺伝子の初回のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をＥｘ細胞ＶＰＲＯ無血清培地（細胞保存、維持培地、ＪＲＨ）中で懸濁状態で維持した。トランスフェクションの当日に、細胞を計数し、遠心分離し（低速）、ペレットを所望の量のトランスフェクション培地、すなわち１％ＦＣＳ（ＪＲＨ）及び４ｍｌ／ｌインスリントランスフェリンセレニウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（ＦＥＭＥ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁させて、生細胞１×１０６／ｍｌの細胞濃度を得た。上記の１．２におけるＰＥＡＫ１２ｄ中へのＥＰＯ遺伝子のクローニングによって得られたＤＮＡ保存液（１ｍｇ／ｍｌ保存液）をＦＥＭＥ培地に２ｍｇ／トランスフェクション１リットル量（２％ｅＧＦＰレポーター遺伝子を同時トランスフェクト）で希釈した。次いで、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、４ｍｇ／リットル量、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｃＤＮＡ溶液に添加し、ボルテックスでしっかり撹拌し（３０秒間）、室温で１０分間インキュベートした（「トランスフェクションミックス」の作製）。
【０１７７】
次いで、このトランスフェクションミックスをスピナー容器に添加し、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）内で９０分間インキュベートした。９０分後、ＰＥＩ−ＥＰＯ ｃＤＮＡ複合体のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中への組込みが可能となり、細胞を遠心分離し、Ｅｘ細胞ＶＰＲＯ無血清新鮮培地に再懸濁させ、例えば、単細胞懸濁物として維持した。次いで、トランスフェクションから２４〜４８時間後、無血清培地中で増殖させた上記のＥＰＯ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の試料を蛍光顕微鏡下で観察して、例えば、トランスフェクト細胞に蛍光をもたらしたレポーター遺伝子を視覚化した。蛍光が細胞の８０％超で認められた場合に限り、この培養物をさらなる半安定圧選択のために維持した。
【０１７８】
ピューロマイシン２重圧選択
トランスフェクションから７２時間後、ＥＰＯを発現するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を懸濁培養により増殖させた培地を７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＥｘ−細胞ＶＰＲＯ新鮮培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と交換し、このピューロマイシン選択圧を６日間維持した。この期間の間、乳酸濃度が１．３ｇ／ｌを超えると（乳酸による増殖阻害）、選択圧培地を新鮮選択圧培地と交換した（依然ピューロマイシンを含有する）。蛍光顕微鏡及び依然増殖している（集団倍加）懸濁細胞によって視覚化すると、非組換え細胞は死滅し（細胞のわずか１０％、ＰＥＩトランスフェクション効率が高いと８５％を超える）、ＥＰＯ組換え細胞は圧選択に耐えた。
【０１７９】
選択期間の最後に、培地を通常の増殖培地（ピューロマイシンなし）と交換し、細胞をタンパク質発現について２又は３週間モニターした。２回目のピューロマイシン選択圧（上記と同じ選択圧）を細胞懸濁物にさらに６日間施すと、例えば、すべての非組換え細胞が死滅することが確かめられた。
【０１８０】
細胞増殖をモニターし、例えば、カプセル化操作のために細胞を収集するのに十分な量の細胞を培養物中で維持しながら、この培養物の一部の凍結保存により少量の細胞保存液を置いておいた。
【０１８１】
得られた半安定細胞は、ＥＰＯ遺伝子を約３カ月発現することができる。
【０１８２】
１．４ 細胞カプセル化
１．３．１で得られた一過性にトランスフェクトした細胞、及び１．３．２で得られた半安定細胞を実施例１の１．４に記載の通りカプセル化した。
【０１８３】
２．マウスモデルにおける血中ＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値の測定
２．１ プロトコール
全ての試験で、Ｃ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齢）を使用した。常時、実験群あたり５匹のマウスを使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１８４】
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。ＥＰＯを一過性にトランスフェクトした細胞、及びＥＰＯをトランスフェクトした半安定細胞、又はトランスフェクトしなかった細胞を含有する７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した。
【０１８５】
カプセル注射の後１０日間連続して、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｔｉｎ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ、カタログ番号ＤＥＰ００）を使用して血中ＥＰＯレベルを追跡した。ヘマトクリット値を測定した。
【０１８６】
２．２ 結果
図１０Ｃ及び１０Ｄから明らかであるが、一過性に又は安定にトランスフェクトしたカプセル化細胞を（ｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．経路）与えたマウスにおけるヘマトクリット値の増加（１０Ｄ）に対応する血中ＥＰＯ濃度の増加（１０Ｃ）を実験の１４日間測定した。トランスフェクトしなかったカプセル化細胞を与えた対照マウスではこのような効果は観察されなかった。意外なことに、また驚くべきことに、一過性にトランスフェクトしたカプセル化細胞を与えたマウスにおけるＥＰＯ濃度及びヘマトクリット値は、安定にトランスフェクトしたカプセル化細胞を与えたマウスよりも高いレベルに達した。
【０１８７】
（実施例５：ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製、及びマウスモデルにおける血中ｍＩＬ−１８ＢＰレベルの測定）
１．ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を一過性にトランスフェクトした細胞を含有するカプセルの調製
１．１ 細胞の培養及び維持：実施例１参照
【０１８８】
１．２ プラスミド精製
ｍＩＬ−１８ＢＰ遺伝子（遺伝子の配列：配列番号３に関する図１１Ａ、及びタンパク質の配列：配列番号４に関する図１１Ｂ）を、Ｍａｌｌａｔ Ｚ．ら２００２ Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，４４１〜４４８頁に詳細に記載されている通り、発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ中にクローニングした。
【０１８９】
簡単に言えば、プラスミドｐＣＥＰ４−ｍＩＬ１８ＢＰ−ｄ ２３を鋳型として使用して、増幅反応を行った。ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ＋ＨｉｎＤＩＩＩで消化し、次いでＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（商標）スピンカラムキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によって精製し、ＨｉｎＤＩＩＩ＋ＮｏｔＩで消化したｐＥＡＫ８ベクター（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）にライゲートした。
【０１９０】
１．３ 細胞トランスフェクション：実施例１参照
【０１９１】
１．４ 細胞カプセル化：実施例１参照
【０１９２】
２．マウスモデルにおける血中ｍＩＬ−１８ＢＰレベルの測定
２．１ プロトコール
１７匹のＣ５７／ＢＬ６雄マウス（８週齡）の群を使用した。マウスを１２時間の明暗周期、標準条件下で維持し、放射線照射飼料及び水を任意に与えた。
【０１９３】
カプセル懸濁液をインキュベータから取り出し、層流フード内で数分放置してカプセルを沈殿させた。上澄液を除去し、濃縮したカプセルをシリンジで注意深く吸い上げた。ｍＩＬ−１８ＢＰを一過性にトランスフェクトした細胞を含有する７００μｌのカプセルを０．７ｍｍの針（参照番号５３１５８．０１、Ｐｏｌｙｌａｂｏ、スイス）で各マウスにゆっくりｉ．ｐ．注射した。
【０１９４】
カプセル注射の後８日間連続して、ｍ−ＩＬ１８ＢＰ用に実験室で作製したＥＬＩＳＡを使用して血中ＥＰＯレベルを追跡した。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡの手順は以下の通りである。
【０１９６】
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍコンビプレート１２ＥＢというプレートを使用した。コーティングは、０．１ｍｌの１×ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍｌ抗マウスＩＬ−１８ＢＰであった。抗原親和性により、ウサギ血清からポリクローナル抗体を精製した。Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートした後、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄し、１×ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、参照番号Ａ−２１５３）を用いて３７℃で１時間ブロッキングし、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄した。標準物は、ｍＩＬ−１８ＢＰ ３００ｎｇ／ｍｌ〜０．１ｎｇ／ｍｌであり、試料は１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中０．１ｍｌ、３７℃で２時間である。１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄を実施した。０．１ｍｌのビオチニル化抗マウスＩＬ１８ＢＰ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）０．３ｍｇ／ｍｌを３７℃で２時間添加した。１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄を実施し、０．１ｍｌのｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｅ２８８６）１／５０００を静かに添加し、室温で３０分間放置した。０．０５ｍｌの２０％Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。４９２ｎｍで読み取った。
【０１９７】
２．２ 結果
図１１Ｃから明らかであるが、血中ｍ−ＩＬ１８ＢＰレベルは、カプセルのｉ．ｐ．注射後３日目から６日目の間でピーク値に達し、８日目のｍ−ＩＬ１８ＢＰレベルは依然非常に高いままであった。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】ヒトＩＬ−６（ｈＩＬ−６）の完全コード配列及びその翻訳配列（配列番号１及び２）を示す図である。
【図２Ａ】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄの制限酵素地図である。
【図２Ｂ】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄの完全ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す図である。
【図３】哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ−ＩＬ−６−６ＨＩＳの制限酵素地図である。
【図４】トランスフェクトされなかったＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦα、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ａ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射した後１２日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルのグラフである。
【図５Ｂ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ｃ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＡＳＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図５Ｄ】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルを注射したＣｏｎＡ処置マウス、及び対照マウスの血液試料中で測定したＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図６】ｈＩＬ−６ ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセル７００、３５０、及び１００μｌそれぞれのｉ．ｐ．注射後３日間連続してマウスの血液中で測定したｈＩＬ−６レベルを示すヒストグラムである。
【図７Ａ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＡＳＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】ｈＩＬ−６−６ＨＩＳをコードしているｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を含有するカプセルをそれぞれ７００、３５０、及び１００μｌ注射したＣｏｎＡ処置マウス、並びに対照マウスの血液試料中で測定したＡＬＡＴレベルを示すヒストグラムである。
【図８Ａ】ｈｅｐａＣＡＭ遺伝子の配列（配列番号７）を示す図である。
【図８Ｂ】ｈｅｐａＣＡＭ成熟タンパク質の配列（配列番号８）を示す図である。
【図８Ｃ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びｈｅｐａＣＡＭをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした異なる量のカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｉ．ｐ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図８Ｄ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びｈｅｐａＣＡＭをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした異なる量のカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｓ．ｃ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図９Ａ】ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２をコードしている遺伝子の配列（配列番号９）を示す図である。
【図９Ｂ】ＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２成熟タンパク質の配列（配列番号１０）を示す図である。
【図９Ｃ】トランスフェクトしなかったカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びＩＮＳＰ１１４−ＳＶ２遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をｉ．ｐ．注射した後の、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出のマウスモデルにおけるＴＮＦαレベルを示すヒストグラムである。
【図１０Ａ】ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）をコードしている遺伝子の配列（配列番号５）を示す図である。
【図１０Ｂ】ヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）成熟タンパク質の配列（配列番号６）を示す図である。
【図１０Ｃ】ＥＰＯをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、ＥＰＯをコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及び対照カプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（トランスフェクトしなかった）をｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射してから０日目〜１５日目にＥＬＩＳＡによって測定したマウスの血中ＥＰＯ濃度を示すグラフである。
【図１０Ｄ】ＥＰＯをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞、及びＥＰＯをコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡをｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射してから０日目〜１０日目のマウスにおけるヘマトクリット値（ヘマトクリット値（Ｈｔ）又はパック細胞容積（ＰＣＶ）は、赤血球が占める血液量の割合である）を示すグラフである。
【図１１Ａ】マウスＩＬ−１８結合タンパク質（ｍ−ＩＬ１８ＢＰ）の遺伝子の配列（配列番号３）を示す図である。
【図１１Ｂ】マウスＩＬ−１８結合タンパク質（ｍ−ＩＬ１８ＢＰ）の成熟タンパク質の配列（配列番号４）を示す図である。
【図１１Ｃ】ｍ−ＩＬ１８ＢＰをコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトしたカプセル化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞のｉ．ｐ．注射から０日目〜８日目にＥＬＩＳＡによって測定したマウスの血中ｍ−ＩＬ１８ＢＰ濃度を示すヒストグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセル。
【請求項２】
細胞が動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
対象の遺伝子が、タンパク質を分泌するためのシグナル配列に融合している、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項４】
対象の遺伝子が発現カセット中に挿入されている、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項５】
対象の遺伝子がプラスミド中に挿入されている、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項６】
生体適合性ポリマーがアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）である、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項７】
生体適合性ポリマー膜が、分離サイズが９０〜３０ｋＤａ、好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項８】
平均直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項９】
低剪断、微小重力条件下で維持された、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項１０】
カプセルを調製する方法であって、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む方法。
【請求項１１】
低剪断、微小重力条件下で維持するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象の遺伝子によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法であって、請求項１から９までのいずれかに記載のカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む方法。
【請求項１３】
多細胞生物が哺乳動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びサルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カプセルの投与が腹控内注射によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出すべきｉｎ ｖｉｖｏ活性が前記タンパク質の投与後３〜１４日、好ましくは３〜５日以内に完全に誘導される、動物における請求項１２から１５までのいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１７】
動物が、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝毒性を有するマウスである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１から９までのいずれかに記載のカプセルを含む医薬組成物。
【請求項１９】
対象の遺伝子が、抗原／免疫原及び／又はアジュバントをコードしている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗原／免疫原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又は腫瘍抗原である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
カプセルが、（１種又は複数の）抗原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子をそれぞれトランスフェクトした少なくとも２種類の細胞を含み、この２種の遺伝子が同一でない、請求項１８から２１までのいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象のタンパク質を被検体に投与するための、請求項１から９までのいずれかに記載のカプセル又は請求項１８から２１までのいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
対象のタンパク質が免疫又はワクチン接種用の抗原である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
被検体が、ヒト；げっ歯類、イヌ、ブタ及びサルを含めた研究目的で飼育された動物並びにイヌ及びネコを含めた、家畜及び飼育動物からなる群から選択される、請求項２２又は２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
請求項１８から２１までのいずれかに記載のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記組成物を適用するための又は前記組成物を被検体に適用するための手段。
【請求項２６】
免疫又はワクチン接種用の医薬組成物を調製するための、請求項１から９までに記載のカプセルの使用。
【請求項１】
対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトし、生体適合性ポリマー膜内に包含させた細胞を含有するカプセル。
【請求項２】
細胞が動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
対象の遺伝子が、タンパク質を分泌するためのシグナル配列に融合している、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項４】
対象の遺伝子が発現カセット中に挿入されている、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項５】
対象の遺伝子がプラスミド中に挿入されている、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項６】
生体適合性ポリマーがアルギナート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギナート（ＡＰＡ）である、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項７】
生体適合性ポリマー膜が、分離サイズが９０〜３０ｋＤａ、好ましくは８０〜６０ｋＤａである孔を有する、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項８】
平均直径が１００〜１５００μｍ、好ましくは２５０〜６００μｍ、特に４４０〜５３０μｍである、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項９】
低剪断、微小重力条件下で維持された、前記請求項のいずれかに記載のカプセル。
【請求項１０】
カプセルを調製する方法であって、細胞に対象の遺伝子を一過性にトランスフェクトするステップと、一過性にトランスフェクトされた細胞をカプセル化するステップとを含む方法。
【請求項１１】
低剪断、微小重力条件下で維持するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象の遺伝子によって発現及び分泌されたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価する方法であって、請求項１から９までのいずれかに記載のカプセルを多細胞生物に投与するステップと、前記タンパク質の活性を検出するステップとを含む方法。
【請求項１３】
多細胞生物が哺乳動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びサルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カプセルの投与が腹控内注射によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出すべきｉｎ ｖｉｖｏ活性が前記タンパク質の投与後３〜１４日、好ましくは３〜５日以内に完全に誘導される、動物における請求項１２から１５までのいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１７】
動物が、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発肝毒性を有するマウスである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１から９までのいずれかに記載のカプセルを含む医薬組成物。
【請求項１９】
対象の遺伝子が、抗原／免疫原及び／又はアジュバントをコードしている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗原／免疫原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又は腫瘍抗原である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
カプセルが、（１種又は複数の）抗原及び／又はアジュバントをコードしている遺伝子をそれぞれトランスフェクトした少なくとも２種類の細胞を含み、この２種の遺伝子が同一でない、請求項１８から２１までのいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象のタンパク質を被検体に投与するための、請求項１から９までのいずれかに記載のカプセル又は請求項１８から２１までのいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
対象のタンパク質が免疫又はワクチン接種用の抗原である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
被検体が、ヒト；げっ歯類、イヌ、ブタ及びサルを含めた研究目的で飼育された動物並びにイヌ及びネコを含めた、家畜及び飼育動物からなる群から選択される、請求項２２又は２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
請求項１８から２１までのいずれかに記載のカプセル又は医薬組成物を含むキット、及び前記組成物を適用するための又は前記組成物を被検体に適用するための手段。
【請求項２６】
免疫又はワクチン接種用の医薬組成物を調製するための、請求項１から９までに記載のカプセルの使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｂ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｂ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【公表番号】特表２００８−５０９１２７（Ｐ２００８−５０９１２７Ａ）
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２４４２０（Ｐ２００７−５２４４２０）
【出願日】平成１７年８月２日（２００５．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２２９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１６２３８
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０７３９９４２７）ラボラトワ セローノ エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２日（２００５．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２２９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１６２３８
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（５０７３９９４２７）ラボラトワ セローノ エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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