トリアゾール化合物およびその用途
【課題】本発明は、発根促進剤等の細胞分化促進剤の有効成分として有用な新規化合物を提供することを目的とする。また、本発明は、該化合物を含有する細胞分化促進剤を利用した、挿し木法、組織培養法などの方法によるクローン苗の生産性を向上させるための、発根方法および発根用培地を提供することを目的とする。
【解決手段】（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール、該化合物を有効成分とする細胞分化促進剤ならびにオーキシン活性促進剤、前記細胞分化促進剤またはオーキシン活性促進剤を含有する、植物のシュートの発根用培地、および前記細胞分化促進剤、オーキシン活性促進剤または発根用培地を用いるクローン苗の生産方法を提供する。
【解決手段】（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール、該化合物を有効成分とする細胞分化促進剤ならびにオーキシン活性促進剤、前記細胞分化促進剤またはオーキシン活性促進剤を含有する、植物のシュートの発根用培地、および前記細胞分化促進剤、オーキシン活性促進剤または発根用培地を用いるクローン苗の生産方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアゾール化合物及びその用途に関し、詳しくは、トリアゾール化合物、該化合物を用いる細胞分化促進剤、該細胞分化促進剤を含有する発根用培地、および、該細胞分化促進剤を用いるクローン苗の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
挿し穂を挿し床または培地に挿し付けて発根させる挿し木法や、植物組織を培養し不定芽などを採取してこれを発根させる組織培養法は、農業生産、植林、育種、その他の分野において、目的に適った形質を持つ均質な植物体（クローン苗）を大量に生産するための手段として利用されている。これらの方法において植物組織の発根能は、クローン苗の生産性に大きな影響を与えるため、発根能の向上を図ることは重要である。
【０００３】
特開２００１−２３１３５５号公報（特許文献１）には、ユーカリ属植物およびアカシア属植物から選ばれた植物の採穂母樹を挿し穂として採取する前に、パクロプトラゾールにより処理すると、発根能力が促されることが記載されている。
【０００４】
一方、特開２００２−４７１０８号公報（特許文献２）には、特定の構造を有するトリアゾール化合物が、植物におけるブラシノステロイドの代謝を阻害する作用を有し、植物の成長（生長）および発達の調節に有用であることが記載されている。また、特開２００３−１１３００８号公報（特許文献３）には、前記特許文献２に記載のトリアゾール化合物を、ベンジルアデニンなどの植物生長ホルモンとともに植物に作用させると、植物の成長が促進されることが記載されている。
【０００５】
一方、植物の成長過程においては主根から側根が分枝する。通常、側根数が多いほうが養分を効率よく吸収し植物の成長が早まる。従って主根からより多くの側根を分枝させることが植物の成長において重要である。例えば、非特許文献１には、塩ストレス環境下ではシロイヌナズナの側根数が増加することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２３１３５５号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１０８号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３００８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zolla G．et al．，J．Exp．Bot．2010 61(1)：211−224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１に記載の方法では、パクロプトラゾールにて採穂母樹をあらかじめ処理してから数ヶ月経過しないと挿し穂を得ることが困難であった。そのため、発根能の向上において即効性のあるものが求められていた。
【０００９】
一方特許文献２および３の方法は、植物の生長に関するブラシノステロイドの制御を行う方法である。よって、挿し木法のように挿し穂の発根を促進する技術、すなわち根組織の分化のみを促進する技術とは異なる。一般に挿し穂の発根を促進する条件は、植物の生長を促進する条件とは異なる。植物の生長を止める条件により挿し穂の発根が促進される場合も多い。
【００１０】
また、特許文献１に記載の方法は、植物に対する発根能が不十分であった。中でも、もともと発根能の低い植物（例えばユーカリ属植物など）にこの方法を適用した場合には、発根能の改善を見込めなかった。
【００１１】
更に、非特許文献１の方法には、側根数を充分に増加させることができないという問題があった。
【００１２】
本発明は、細胞分化促進剤の有効成分として有用な新規化合物を提供することを目的とする。該化合物の例としては、植物からの発根を促進して、その発根率を向上させる不定根発根促進剤の有効成分となり得る化合物が挙げられる。また、本発明は、該化合物を含有する細胞分化促進剤を利用した、挿し木法、組織培養法などの方法によるクローン苗の生産性を向上させるための、中でも発根能が低い植物種に属するクローン苗の生産性を向上させるための、発根方法および発根用培地を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の〔１〕〜〔１０〕を提供する。
〔１〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール。
〔２〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする細胞分化促進剤。
〔３〕細胞が植物細胞である上記〔２〕に記載の細胞分化促進剤。
〔４〕植物の発根促進剤である上記〔２〕又は〔３〕に記載の細胞分化促進剤。
〔５〕植物の不定根及び／又は側根形成促進剤である上記〔２〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤。
〔６〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とするオーキシン活性促進剤。
〔７〕上記〔２〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または上記〔６〕に記載のオーキシン活性促進剤を含有する、植物の発根用培地。
〔８〕植物を上記〔２〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または上記〔６〕に記載のオーキシン活性促進剤の存在下栽培し発根させる、クローン苗の生産方法。
〔９〕植物を上記〔７〕に記載の発根用培地にて栽培し、発根させる、クローン苗の生産方法。
〔１０〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを用いて、細胞の分化を促進する方法。
〔１１〕細胞が植物細胞である、上記〔１０〕に記載の細胞の分化を促進する方法。
〔１２〕細胞の分化が、植物の不定根及び／側根の形成促進である、上記〔１０〕または〔１１〕に記載の細胞の分化を促進する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規なトリアゾール化合物が提供される。該トリアゾール化合物は細胞の分化を促進することができる。例えば、不定根の形成、主根からの側根の形成を促進させ、発根率を向上させることができる。不定根及び側根形成の促進は、例えば、オーキシン類（以下、単に「オーキシン」ということもある）の活性の促進によりもたらされる。よって、本発明によれば、クローン苗の生産性を向上させることができる。本発明によれば、発根能が低い植物種のクローン苗の生産性を特に顕著に向上させることができる。従って、本発明は、広く様々な植物種のクローン苗の大量かつ迅速な生産に寄与するものであり、中でも、発根能が低い植物種であっても、クローン苗を大量かつ迅速に生産することを可能とし、その産業的利用に途を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例２における生育後のユーカリ植物体を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールとその用途に関する。（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは下記の式（１）で表される化合物である。
【００１７】
【化１】
【００１８】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールの由来は特に限定されない。例えば、天然物由来のもの、化学反応により合成されたものを用いることができる。化学反応による合成方法としては、例えば、ピナコリン（３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ）をハロゲン化した後に、１，２，４−トリアゾール、及び後述の化合物（ｂ）と反応させて（Ｅ）−１−（ｂｅｎｚｏ[ｄ][１，３]ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（化合物（２−４−１））を得て、化合物（２−４−１）を還元して製造することができる。反応条件は実施例に示す条件が例示される。
【００１９】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは、優れた細胞分化促進作用を有するので、細胞分化促進剤の有効成分として有用である。
【００２０】
本発明の細胞分化促進剤は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする。本発明の細胞分化促進剤は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分として含むものであればよく、必要に応じて、本発明の目的に反しない限り、他の成分（例えば、他の不定根形成促進剤、側根形成促進剤、オーキシンなどの不定根及び側根形成に関する植物ホルモンの活性促進剤）をあわせて含むもの（いわゆる組成物の形態）であってもよい。他の成分としては、例えば、国際出願第２０１１／６０２９３号明細書に記載の細胞分化促進剤が挙げられる。
【００２１】
細胞の例としては植物細胞が挙げられる。本発明の細胞分化促進剤は植物細胞の根細胞への分化、主根内部の内鞘組織の側根への分化（側根形成）を顕著に促進する効果を有する。よって、本発明の細胞分化促進剤は、不定根および／または側根形成促進剤として有用である。
【００２２】
本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤は、植物を栽培する際に存在させることにより、不定根形成促進効果及び側根形成促進効果を発揮する。
【００２３】
植物の種類は特に限定されない。植物は木本植物と草本植物とに分類されうるが、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤はこれらのいずれにも適用可能であり、木本植物に適用されることが好ましく、草本植物よりも発根能が劣っている木本植物に適用されることがより好ましい。木本植物としては、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）植物、スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）植物（スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）など）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）植物（サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、ユスラウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）など）、アボカド属（Ａｖｏｃａｄｏ）植物、マンゴー属(Ｍａｎｇｉｆｅｒａ)植物（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）など）、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）植物、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ）植物、クヌギ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）植物（クヌギなど（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属植物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属植物、バラ属（Ｒｏｓａ）植物、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）植物（チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）など）、ジャカランダ属（Ｊａｃａｒａｎｄａ）植物（ジャカランダ（Ｊａｃａｒａｎｄａ ｍｉｍｏｓｉｆｏｌｉａ）など）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）植物（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）など）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）植物（ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ Ｒｅｈｄｅｒ、Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）など）、ビャクダン属（Ｓａｎｔａｌｕｍ）植物（ビャクダン（サンダルウッド；Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）など）が例示される。このうち、ユーカリ、シロイヌナズナ、マツ、スギ、サクラ、マンゴー、アボカド、アカシア、ヤマモモ、クヌギ、ブドウ、リンゴ、バラ、ツバキ、チャ、ウメ、ユスラウメ、ジャカランタ等に適用した場合に、より本発明の効果を発揮しうる。中でもユーカリ属植物、シロイヌナズナ属植物、マツ属植物、スギ属植物、ツバキ属植物、マンゴー属植物、ワニナシ属植物が好ましく、難発根性として知られるユーカリ、マツ、スギ、チャ、マンゴー、アボカド等、側根が形成されにくいユーカリが好ましい。
【００２４】
ユーカリとしては、難発根性で知られるユーカリが好ましく、ユーカリ・グロビュラス、丸葉ユーカリなどがより好ましく、ユーカリ・グロビュラスが更に好ましい。
【００２５】
また、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤が適用可能な草本植物としては、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。このように、本発明においては、ナス科植物等の野菜類と共に、イネ、小麦等の穀物、豆類、トウモロコシなど食糧生産性植物にも一般に適用できるので、将来的な食糧生産技術の上からも大きな期待がもてる。また、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科等に属する植物のうち、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）はモデル植物として広く一般に用いられていることから、研究・開発の発展に貢献できる面でも大きな期待がもてる。
【００２６】
植物としては、植物体の一部または全部であればよい。不定根形成促進を期待する場合には、植物体の一部であることが好ましく、シュートであることがより好ましい。側根形成促進を期待する場合には、植物体全体であることが好ましい。
【００２７】
シュートとは、発根能を有する組織全般をいう。該組織としては、枝、茎、頂芽、腋芽、不定芽、葉、子葉、胚軸、不定胚、苗条原基等が例示される。シュートの由来は特に限定されず、温室や屋外に生育している植物個体から得られたものでもよいし、組織培養法により得られた培養組織であってもよいし、天然の植物体の一部の組織であってもよい。シュートは、挿し穂の母本植物や、多芽体から効率良く取得することができる。中でも、挿し穂（母本植物から得た挿し穂）、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは前記器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。
【００２８】
多芽体は、本発明を適用してクローン苗を生産しようとする植物から、頂芽や腋芽等を切取って、これを組織培養して誘導することができる。多芽体を、母本植物から採取した器官を無菌的に培養して、形成させるには、特開平８−２２８６２１号公報に記載の方法、条件に従って行い得る。その方法、条件は概ね次の通りである。まず、材料とする植物から頂芽、腋芽等の組織を採取し、採取した組織について、有効塩素量約０．５％〜約４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液または有効塩素量約５％〜約１５％の過酸化水素水溶液に約１０分〜約２０分間浸漬して表面殺菌を行う。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地に挿し付けて芽を開じょさせ、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させる。ユーカリ属やアカシア属の組織（例えば腋芽）を用いる場合には、固体培地は、ショ糖１〜５重量％、植物ホルモンとしてベンジルアデニン（以下、ＢＡと略す。）約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１ｍｇ／ｌ以下、ゲランガム約０．２重量％以上約０．３重量％若しくは寒天約０．５重量％以上約１重量％以下を含有するムラシゲスクーグ（以下、ＭＳと略す。）培地またはこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。こうして形成された多芽体からは活発にシュートが伸長してくる。多芽体自体は、適当に分割して多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地で培養することにより維持し、増殖させることができる。
【００２９】
一方、シュートとして挿し穂を用いてもよい。通常は挿し穂に対し、投与されることで、その効果を発揮する。挿し穂としては、植物の少なくとも一部であればよく、緑枝（当年枝）、熟枝（前年以前に伸びた枝）等の枝；頂芽や腋芽などの芽；葉、子葉；胚軸などが例示される。木本植物の場合の挿し穂は、通常は緑枝や熟枝であり、草本植物の場合の挿し穂は、通常は葉や芽であるが、これらには限定されない。
【００３０】
植物を本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤の存在下に栽培する方法は、特に制限はなく、植物の種類、部位、状態などから適宜選択できる。具体的には、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養する方法；不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に接触させる方法、が例示される。植物として、組織培養法により得られた培養組織を用いる場合には前者が好ましく、植物として挿し穂を用いる場合には前者、後者のいずれも好ましい。なお、上記例示した両方法の併用、すなわち、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養しつつ、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に接触させる方法を採用することも、もちろん可能である。
【００３１】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養する場合、発根用培地中の不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度は、好ましくは約０．０１μＭ以上約１００μＭ以下、さらに好ましくは約０．１μＭ以上約１０μＭ以下、とりわけ好ましくは約０．５μＭ以上約５μＭ以下である。
【００３２】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液（不定根及び／又は側根形成促進剤溶液）を植物に接触させる場合、その接触の方法は特に限定されず、植物の種類、部位、状態、栽培方法などから適宜選択しうる。例えば、植物へ溶液を直接散布する方法、支持体を溶液で浸潤させる方法が挙げられる。
【００３３】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液は、不定根及び／又は側根形成促進剤を、適当な溶媒（例えば、水など）に溶解させて調整され得る。水としては、脱イオン水、蒸留水、逆浸透水、水道水などが例示され、いずれも利用可能である。溶液における不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度は、約０．０１μＭ以上約１００μＭ以下であることが好ましく、約０．１μＭ以上約１０μＭ以下であることがより好ましく、約０．５μＭ以上約５μＭ以下であることがさらにより好ましい。
【００３４】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に直接散布する場合は、溶液を、スプレーなどを用いて霧状に、植物の一部または全体に散布すればよい溶液の散布量は、溶液中の不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度などにもより、一概には規定できないが、一般には１つの植物あたり約０．５ｍｌ以上約５．０ｍｌ以下が好ましく、約１．０ｍｌ以上約３．０ｍｌ以下がより好ましい。散布回数は、１回でも２回以上であってもよいが、少なくとも栽培開始時に散布することが好ましい。さらに栽培条件に応じて、栽培期間中に適宜（例えば数日（２日〜３日）おき）追加で散布を行ってもよい。
【００３５】
支持体を不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液で湿潤させる場合は、溶液を支持体上部から散水する方法、溶液を満たした容器内に支持体を置床し底面から潅水させる方法などが例示される。支持体上部から散水する場合、上部からの散水量としては、１つの植物あたり約１．０ｍｌ以上約１０ｍｌ以下が好ましく、約３．０ｍｌ以上約５．０ｍｌ以下がより好ましい。底面から潅水させる場合は、溶液が支持体に、実質的に均一に湿潤されればよい。支持体を溶液で湿潤させる場合、溶液のほかに別途発根用培地を用意し、両者で支持体を湿潤させてもよく、このことは前述したとおりである。
【００３６】
本発明において発根用培地とは、植物から発根させるために用いられる培地を意味する。発根用培地は、銀イオンおよび／または抗酸化剤を含有することが好ましく、銀イオンおよび抗酸化剤の両方を含有することがより好ましい。銀イオンは、チオ硫酸銀（ＳＴＳ、ＡｇＳ4Ｏ6）や硝酸銀等の銀化合物（銀イオン源）として培地中に添加すればよい。中でもＳＴＳは、培地に添加して植物体（例えばシュート）を培養すると、健全な根の発根・伸長が促進されるので、本発明で用いる銀イオン源として好ましい。これは、このＳＴＳに由来する銀イオンが、培地中で、チオ硫酸銀イオンの形態を取り、マイナスに帯電しているためと考えられる。発根用培地中に添加する銀イオンの濃度は、銀イオン源の種類その他の培養条件などにもよるが、銀イオン源の濃度として約０．５μＭ以上約６μＭ以下が好ましく、約２μＭ以上約６μＭ以下がより好ましい。
【００３７】
一方、抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等、公知のものを用いることができる。中でもアスコルビン酸は、培地への残留性が低いので、本発明で用いる抗酸化剤として好ましい。発根用培地中に添加する抗酸化剤の濃度は、約５ｍｇ／ｌ以上約２００ｍｇ／ｌ以下が好ましく、約２０ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下がより好ましい。
【００３８】
本発明で用いる発根用培地は、上記成分に加え、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類および植物ホルモン類等を含み得る。
【００３９】
無機成分としては、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素や、これらを含む無機塩が例示される。該無機塩としては例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ホウ酸、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等やこれらの水和物が挙げられる。無機成分として、上具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。
【００４０】
本発明で用いられる発根用培地においては、窒素、リン、カリウムが必須元素として含まれることが好ましい。よって、これら無機成分の具体例のうち、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩、リンを含む無機塩、およびカリウムを含む無機塩が好ましく、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩がより好ましい。無機成分は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は約０．１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することが好ましく、約１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ約０．１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるよう添加することが好ましく、約１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４１】
炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導体；脂肪酸等の有機酸；エタノール等の１級アルコール、などの化合物を使用することができる。炭素源として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。炭素源は、発根用培地中に約１ｇ／ｌ以上約１００ｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約１０ｇ／ｌ以上約１００ｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。しかし、培養を炭酸ガスを供給しながら行う場合には、培地は炭素源を含む必要は無く、含まないことが好ましい。ショ糖等の炭素源となりうる有機化合物は微生物の炭素源ともなるので、これらを添加した培地を用いる場合には、無菌環境下で培養を行う必要があるが、炭素源を含まない培地を用いることにより、非無菌環境下での培養が可能となる。
【００４２】
ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ４）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよび／またはリボフラビン（ビタミンＢ２）等を使用することができる。ビタミン類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。ビタミン類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約２００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１５０ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４３】
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、システイン、フェニルアラニンおよび／またはリジン等を使用することができる。アミノ酸類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。アミノ酸類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．１ｍｇ／ｌ以上約１０００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、２種以上の組み合わせの場合は、それぞれ発根用培地中に約０．２ｍｇ／ｌ以上約１０００ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましい。
【００４４】
また、植物ホルモン類としては、例えば、オーキシン類および／またはサイトカイニン類を使用することができる。オーキシン類としては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。また、サイトカイニン類としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンおよびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。植物ホルモン類としては、オーキシン類のみ、サイトカイニン類のみ、或いはオーキシン類とサイトカイニン類の両方を組み合わせて用いうる。植物ホルモン類は、１種を用いる場合には発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の場合にはそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４５】
なお、本発明においては、植物組織培養用培地として公知の培地に、必要に応じて不定根及び／又は側根形成促進剤を添加するほか、さらに銀イオンおよび／または抗酸化剤を添加し、さらにまた、炭素源、植物ホルモン類を適宜添加等して、発根用培地として用いてもよい。かかる植物組織培養用培地としては、例えば、ＭＳ培地、リンスマイヤースクーグ培地、ホワイト培地、ガンボーグのＢ−５培地、ニッチニッチ培地等を挙げることができる。中でも、ＭＳ培地およびガンボーグのＢ−５培地が好ましい。これらの培地は、必要に応じて適宜希釈等して用いることができる。
【００４６】
上記発根用培地は、液体培地、固体培地のいずれであってもよいが、液体培地の方が作業効率および移植時に根を傷つけることが少ない点で好ましい。液体培地の場合には培地組成を混合し調製してそのまま用い得る。また固体培地の場合には液体培地と同様に培地組成を混合し調製すると同時に、或いは調整後に、寒天またはゲランガム等の固化剤で固化させて使用しうる。固化剤の培地への添加量は、固化剤の種類や培地の組成によっても異なる。固化剤が寒天の場合０．５重量％以上１重量％以下であることが好ましい。固化剤がゲランガムの場合０．２重量％以上０．３重量％以下であることが好ましい。
【００４７】
発根用培地への植物の挿し付け方法は、培地の種類、培養条件等により適宜選択しうる。例えば植物がシュートの場合を挙げて説明すると次の通りである。発根用培地が固体培地の場合は、発根用培地に直接シュートの基部を挿し付けて培養すればよい。一方発根用培地が液体培地の場合は、例えば、後述の支持体を発根用培地で湿潤させたものにシュートの基部を挿し付けて培養すればよい。なお、発根用培地に挿し付ける時にシュートの基部に傷をつけるといった物理的刺激を加えることも、発根率の向上のために好ましい。シュートの基部とは、シュートの一端であって根が形成される領域（葉の形成される端部に対し反対側）を意味する。シュートとして多芽体を用いる場合の基部は、多芽体を分割する際の切断面を有する領域である。シュートの基部への傷のサイズ（大きさ、形状など）は特に限定されない。例えば、シュートとして多芽体を用いる場合、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるような傷を付けることが好ましい。傷を付ける際には、ハサミやナイフなどを用いることができる。
【００４８】
本発明において支持体とは、植物を支持するための支持体である。発根用培地（特に固体培地）を用いる場合などには、支持体は不要の場合があるが、それ以外の場合には通常支持体が利用される。
【００４９】
支持体は、栽培の期間中植物を指しつけた状態で保持できるものが好ましい。また、栽培にあたり液状の発根用培地を用いる場合には、通常、支持体に浸潤させて用いられる。よって支持体は液体で浸潤され得るものが好ましく、中でも、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液、或いは不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地により実質的に均一に湿潤され得るものが好ましい。発根用培地として、液体培地を用いる場合には、液体培地（不定根及び／又は側根形成促進剤を含まない）と不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液とを別個に支持体に添加してもよいし、予め調製した不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地を支持体に添加してもよい。支持体としては、従来慣用の支持体を用いることができ、特に限定されない。支持体としては例えば、砂、赤玉土等の自然土壌；籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライト、パーライト、ピートモス、ガラスビーズ等の人工土壌；発泡フェノール樹脂、ロックウール等の多孔性成形品などを挙げることができる。かかる支持体を培養容器内に入れ、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液、或いは不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地にて湿潤させることにより発根床が調製され得る。なお、発根用培地が固体培地の場合には、固体培地を直接培養容器に入れることで、発根床が調製され得る。
【００５０】
本発明においては、発根用培地または支持体を納めるための培養容器を用い得る。培養容器としては、従来慣用の培養容器を用いることができ、特に限定されない。例えば、育苗ポット、プラグトレーなどが例示される。培養容器は密閉型でもよいし開放型でもよいが、密閉型のものが好ましい。密閉型の培養容器を用いることにより、散布された不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を保持することができる。また、植物、例えばシュートやこれから形成されるクローン苗を取り巻く環境の湿度維持が容易となる。
【００５１】
シュートとして枝を用いる場合には、培養容器として密閉型の培養容器を用いることが好ましい。これによりシュートを高湿度下に置くことが容易となるので枝についた葉の蒸散作用が抑制され、従来行われていた葉の一部切除処理を省略することができる。
【００５２】
培養容器は、容器内への炭酸ガス供給が可能な容器であることがより好ましい。このような培養容器としては、二酸化炭素透過性の膜で蔽われた開口部を有する容器が例示される。このような容器を用いることにより、培養環境の湿度をも容易に調整しうる。開口部の形状は特に問わない。二酸化炭素透過性の膜の材料は特に限定されず、ポリテトラフルオロエチレンなどが例示される。また、膜の孔径も特に限定されず、約０．１μｍ以上約１μｍ以下のものなどが例示される。
【００５３】
植物を栽培する際の栽培条件としては、植物から発根させ得る条件である限り特に限定されない。栽培条件は、植物の種類、部位、状態、発根用培地の種類などにより一概に規定することは難しいが、例えば、温度は、約２３℃以上約２８℃以下であることがより好ましい。光強度は、光合成有効光量子束密度として表され、約１０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上約１０００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以下であることが好ましく、約５０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上約５００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以下であることがより好ましい。いずれの場合でも、例えばシュートの場合には、通常は約２週間以上約５週間以内で、シュートからの発根が観察されるようになる。
【００５４】
栽培は、約６５０ｎｍ以上約６７０ｎｍ以下の波長成分と約４５０ｎｍ以上約４７０ｎｍ以下の波長成分とを９：１〜７：３の割合で含む光の照射下で行うことが好ましく、これらの波長成分を９：１〜８：２の割合で含む光の照射下で行うことがより好ましい。かかる波長成分を含む光を照射して栽培を行うことで、植物からの発根がより促進され得る。
【００５５】
さらに、炭酸ガスを栽培環境中に、通常は３００ｐｐｍ以上２０００ｐｐｍ以下、好ましくは８００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下となるように供給することが好ましい。炭酸ガスの供給量の制御は、人工気象器等の設備や、二酸化炭素透過性の膜を開口部に有する培養容器などを利用して行われうる。
【００５６】
湿度は植物の種類等栽培条件に応じて調整することができる。通常は、５０％以上、好ましくは６０％以上である。また、ユーカリ属植物の場合、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましい。この湿度であることにより、植物からの発根を促進することができる。また上限については特に制限はない。
【００５７】
一方、シュートとして挿し穂を用いる場合には、遮光を行うことが好ましい。遮光率は、３０％以上７０％以下が好ましく、４０％以上６０％以下がより好ましい。
【００５８】
以上のようにして、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤を用いて、植物から不定根を発根させることができる。不定根が発根した状態のものは、通常、クローン苗と呼ばれる。本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤を用いて一定期間栽培（植物の種類、部位、状態などにもよるが、例えばユーカリの場合には１０日以上９０日以下程度）を続け、根を充実させてから、これを育苗容器、苗畑等に移植して育成し、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、その植物に適するように適宜設定すればよい。なお、不定芽や苗条原基等、培養組織由来のシュートを発根させた場合には、通常、育苗容器等への移植の前に、順化の過程を経る必要がある。
【００５９】
本発明の細胞分化促進剤は、以上説明したように不定根及び／又は側根形成促進剤として有用である。本発明における不定根形成促進作用および側根形成促進作用は、オーキシンの活性と類似しているので、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは、オーキシン活性促進剤の有効成分としても有用である。さらに、オーキシン活性促進剤は、オーキシン合成促進剤、オーキシン代謝（分解）阻害剤とも言い換え得る。
【００６０】
オーキシン活性促進剤の対象はオーキシン類である。オーキシン類の例は上述のとおりである。
【００６１】
［作用］
本発明では、植物を不定根及び／又は側根形成促進剤の存在下栽培することにより、前記植物から発根させることができる。その理由は、以下のように推察される。
【００６２】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールの不定根形成促進効果および側根形成促進効果は、植物の組織におけるオーキシン類の活性の促進もしくは合成の促進、またはオーキシン類の代謝（分解）阻害など、何らかの形でオーキシン類の働きに関わると考えられる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
以下の合成経路にて、実施例及び比較例で用いる化合物（３−４−１）及び化合物（ＭＡ６５）を合成した（下記の製造例）。
【００６５】
【化２】
反応Ａ：Ｂｒ2，ＡｌＣｌ3，ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ
反応Ｂ：１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ，Ｋ2ＣＯ3，ａｃｅｔｏｎｅ
反応Ｃ：Ｒ−Ｃ6Ｈ5ＣＨＯ，ＴＦＡ ｏｒ ＣＨ3ＣＯＯＨ，ｔｏｌｕｅｎｅ，ｒｅｆｌｕｘ（Ｒは、４−（ジメチルアミノ）フェニル基、またはベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル基を表す。）
反応Ｄ：ＮａＢＨ4，ＭｅＯＨ，ｏｎ ｉｃｅ
【００６６】
製造例１
３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））の合成（合成経路の反応Ａ及びＢ）
ピナコリン（３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ）（２５ｇ）をジエチルエーテル（７０ｍＬ）に溶解し、塩化アルミニウムを触媒量加えた。氷浴下で撹拌しながら臭素（２５ｇ）を徐々に加えた後、３０分間撹拌した。水を加え反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮し、粗１−ｂｒｏｍｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ混合物を得た。
【００６７】
得られた１−ｂｒｏｍｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ混合物をアセトン（１５０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（３５ｇ）、１，２，４−トリアゾール（２２ｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。水を加え反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。再結晶を行い、３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））の白色結晶を得た。
【００６８】
製造例２
１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（化合物群（２−１））の合成（合成経路の反応Ｃ）
３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））（０．８３ｇ）、４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．８２ｇ）をトルエン（４０ｍＬ）に溶解し、撹拌した。モルホリン（０．４８ｇ）、トリフルオロ酢酸（０．２７ｇ）を滴下した後、ソックスレー抽出器の抽出部にモレキュラーシーブ（４Ａ）を詰めて４時間加熱還流し、脱水した。反応液を室温で冷却し水を加えて反応停止後、酢酸エチルで有機相を３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：１）で精製し、幾何異性体を分離後、再結晶により化合物群（２−１）の各々の黄色結晶を得た（収率；２２．８％）。
【００６９】
化合物群（２−１）は以下の化合物により構成される。
【００７０】
化合物（２−１−１）：（Ｅ）−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−１−１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．０７３（ｓ，９Ｈ），３．０００（ｓ，６Ｈ），６．６４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．９８６（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），７．２０８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．０３１（ｓ，１Ｈ），８．２４１（ｓ，１Ｈ）
【００７１】
化合物（２−１−２）：（Ｚ）−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−１−２）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．２４１（ｓ，９Ｈ），２．９００（ｓ，６Ｈ），６．４９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．５５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．７４２（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０５７（ｓ，１Ｈ），８．２２１（ｓ，１Ｈ）
【００７２】
製造例３
（±）−Ｚ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−１−２））の合成（合成経路の反応Ｄ）
化合物（２−１−１）（０．１３ｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、氷浴で撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（１６．５ｍｇ）を徐々に加えて２時間撹拌した。水を加えた後酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：１）で精製し、（±）−Ｅ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−１−１））の白色結晶（０．１１ｇ）を得た（収率；８５％）。
【００７３】
化合物（３−１−２）〔ＭＡ６５〕
（±）−Ｚ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；０．８０３（ｓ，９Ｈ），２．９１８（ｓ，６Ｈ），３．６２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＯＨ），４．２０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＯＨ），６．４９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），６．６０７（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），６．６０８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．００２（ｓ，１Ｈ），８．０９８（ｓ，１Ｈ）
【００７４】
製造例４
１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−１）（化合物群（２−４）の合成）（合成経路の反応Ｃ）
製造例２において４−ジメチルアミノベンズアルデヒドの代わりに式（２）で表される化合物（ｂ）を用いたほかは同様にして、化合物群（２−４）を合成した。
【化３】
【００７５】
化合物群（２−４）は以下の化合物により構成される。
【００７６】
化合物（２−４−１）：（Ｅ）−１−（ｂｅｎｚｏ[ｄ][１，３]ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．０４５（ｓ，９Ｈ），６．００４（ｓ，２Ｈ），６．８１５（ｍ，３Ｈ），７．０５５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０４７（ｓ，１Ｈ），８．２４１（ｓ，１Ｈ）
【００７７】
化合物（２−４−２）：（Ｚ）−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−２）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．２１９（ｓ，９Ｈ），５．９２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），５．９５９（ｓ，２Ｈ），６．５８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ1＝８．５Ｈｚ，Ｊ2＝２．０Ｈｚ），６．７３６（ｓ，１Ｈ，８．５Ｈｚ），７．６０６（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０３６（ｓ，１Ｈ），８．２１０（ｓ，１Ｈ）
【００７８】
製造例５
（±）−Ｅ−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−４−１））の合成（合成経路の反応Ｄ）
化合物（２−１−１）の代わりに化合物（２−４−１）を用いたほかは製造例３と同様にして、化合物（３−４−１）を合成した。
【００７９】
化合物（３−４−１）：
（±）−Ｅ−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；０．６７８（ｓ，９Ｈ），４．２７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＯＨ），４．６２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＯＨ），６．０１５（ｓ，２Ｈ），６．８４８（ｍ，３Ｈ），７．２６５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０３７（ｓ，１Ｈ），８．４４１（ｓ，１Ｈ）
【００８０】
実施例１、比較例１及び比較例２（シロイヌナズナにおける発根試験）
角シャーレ（滅菌２号、栄研化学）に、オートクレーブした１／２ ＭＳ培地を入れて固化させ、以下の要領で滅菌したシロイヌナズナ種子を植えた。サージカルテープをシャーレに巻き、暗所、４℃で２日間低温処理を行った。その後、２２℃、連続光下にてバイオトロンにシャーレを立てかけて置き、４日間生育させた。その中から生育のよい個体を選抜した。
【００８１】
ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に化合物（３−４−１）（実施例１）、化合物（ＭＡ６５）（比較例１）をそれぞれ１μＭ溶かした各種化合物を処理した１／２ ＭＳ培地に植えかえた。これを同様にバイオトロンで６日間生育させ、生育後の単位主根長当たりの側根数（平均値）を算出した（ｎ＝７）。単位主根長当たりの側根数とは、主根１ｃｍあたりの側根の数であり、個体の側根の数をその主根の長さで割ったものを指す。また、化合物を添加しなかったほかは同様にして結果を得た（比較例２）。結果を表１に示す。
【００８２】
〔シロイヌナズナ種子の滅菌〕
シロイヌナズナ種子を７０％エタノールで３０分間滅菌した後、エタノールに１分間浸漬し、滅菌濾紙上で風乾した。
【００８３】
〔１／２ ＭＳ培地（１Ｌ）〕
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） ２．２ｇ
Ｓｕｃｒｏｓｅ １０．０ｇ
１０００×ビタミンストック １．０ｍＬ
【００８４】
以上の組成で調整した培地のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨで５．７に調整した後、蒸留水で１．０Ｌにメスアップし、植物用寒天（０．８％）を加え、オートクレーブした。
【００８５】
〔１０００×ビタミンストック〕
ニコチン酸 ５０ｍｇ
ピリドキシン塩酸塩 ５０ｍｇ
チアミン塩酸塩 ２０ｍｇ
グリシン ２００ｍｇ
ビオチン ５ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
【００８６】
約８０ｍＬの蒸留水で懸濁し、１Ｎ ＮａＯＨを溶解するまで加え、蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。
【００８７】
【表１】
【００８８】
実施例１（化合物（３−４−１））は、比較例２（無添加）よりも単位主根長あたりの側根数が多く、主根は短かった（表１）。実施例１の単位主根長あたりの側根数は、比較例１（化合物（ＭＡ６５））よりも多く、主根の長さは短かった（表１）。この結果は、本発明の細胞分化促進剤が、側根の発根を促進しかつ側根数の増加を促進することを示すものである。
【００８９】
実施例２、比較例３及び比較例４（ユーカリにおける発根試験）
挿し穂の材料として、ユーカリプタス・グロビュラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、以下、単にＥ．グロビュラスと略記する。）の難発根系統であるユーカリクローンＡ（Ｇ−００４）を用いた。すなわち採穂母樹から、５〜２０ｃｍの長さ、節が１〜３節、葉が２〜６葉程度に伸長した穂木を切り出し、挿し穂を調製した。
【００９０】
得られた挿し穂の基部を、化合物（３−４−１）（実施例２）、化合物（ＭＡ６５）（比較例３）をそれぞれ１μＭ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／ｌ、および植物ホルモンとしてＩＢＡ２ｍｇ／ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム ４１２．５ｍｇ／ｌ、硝酸カリウム ４７５ｍｇ／ｌ、リン酸２水素カリウム ４２．５２ｍｇ／ｌ、ヨウ化カリウム ０．２１ｍｇ／ｌ、なお、本培地に炭素源は添加されていない。）にて湿潤した発泡フェノール樹脂製多孔性支持体（スミザーズオアシス社製、商品名：オアシス）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で２ヶ月間培養を行った。なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦１０〜１１．５ｃｍ×横１０〜１１．５ｃｍ×高さ１０．０ｃｍ程度の、胴部がやや張出した形状の立方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化器械製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により培養容器内の湿度を８５％以上となるように調整した。
【００９１】
挿し穂は、この培養容器１個当たり１６本を挿し付けた。挿し穂の供試数（それぞれ５０本）と、２ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。また、化合物を添加しなかったほかは同様にして結果を得た（比較例３）。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
化合物（３−４−１）を用いた場合には、比較例４（無添加）よりもユーカリの発根率が顕著に高まり、比較例３（化合物（ＭＡ６５））よりも高い発根率を示した（表２）。更に、実施例２では比較例３よりも根数が多く、根が短かった（図１）。この結果は、本発明の細胞分化促進剤が、不定根の発根を促進しかつ不定根の発根数を増加させることを示している。
【００９４】
また、実施例１および実施例２の結果から、本発明の細胞分化促進剤は、オーキシンの活性を促進しているものと推測される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアゾール化合物及びその用途に関し、詳しくは、トリアゾール化合物、該化合物を用いる細胞分化促進剤、該細胞分化促進剤を含有する発根用培地、および、該細胞分化促進剤を用いるクローン苗の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
挿し穂を挿し床または培地に挿し付けて発根させる挿し木法や、植物組織を培養し不定芽などを採取してこれを発根させる組織培養法は、農業生産、植林、育種、その他の分野において、目的に適った形質を持つ均質な植物体（クローン苗）を大量に生産するための手段として利用されている。これらの方法において植物組織の発根能は、クローン苗の生産性に大きな影響を与えるため、発根能の向上を図ることは重要である。
【０００３】
特開２００１−２３１３５５号公報（特許文献１）には、ユーカリ属植物およびアカシア属植物から選ばれた植物の採穂母樹を挿し穂として採取する前に、パクロプトラゾールにより処理すると、発根能力が促されることが記載されている。
【０００４】
一方、特開２００２−４７１０８号公報（特許文献２）には、特定の構造を有するトリアゾール化合物が、植物におけるブラシノステロイドの代謝を阻害する作用を有し、植物の成長（生長）および発達の調節に有用であることが記載されている。また、特開２００３−１１３００８号公報（特許文献３）には、前記特許文献２に記載のトリアゾール化合物を、ベンジルアデニンなどの植物生長ホルモンとともに植物に作用させると、植物の成長が促進されることが記載されている。
【０００５】
一方、植物の成長過程においては主根から側根が分枝する。通常、側根数が多いほうが養分を効率よく吸収し植物の成長が早まる。従って主根からより多くの側根を分枝させることが植物の成長において重要である。例えば、非特許文献１には、塩ストレス環境下ではシロイヌナズナの側根数が増加することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２３１３５５号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１０８号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３００８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zolla G．et al．，J．Exp．Bot．2010 61(1)：211−224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献１に記載の方法では、パクロプトラゾールにて採穂母樹をあらかじめ処理してから数ヶ月経過しないと挿し穂を得ることが困難であった。そのため、発根能の向上において即効性のあるものが求められていた。
【０００９】
一方特許文献２および３の方法は、植物の生長に関するブラシノステロイドの制御を行う方法である。よって、挿し木法のように挿し穂の発根を促進する技術、すなわち根組織の分化のみを促進する技術とは異なる。一般に挿し穂の発根を促進する条件は、植物の生長を促進する条件とは異なる。植物の生長を止める条件により挿し穂の発根が促進される場合も多い。
【００１０】
また、特許文献１に記載の方法は、植物に対する発根能が不十分であった。中でも、もともと発根能の低い植物（例えばユーカリ属植物など）にこの方法を適用した場合には、発根能の改善を見込めなかった。
【００１１】
更に、非特許文献１の方法には、側根数を充分に増加させることができないという問題があった。
【００１２】
本発明は、細胞分化促進剤の有効成分として有用な新規化合物を提供することを目的とする。該化合物の例としては、植物からの発根を促進して、その発根率を向上させる不定根発根促進剤の有効成分となり得る化合物が挙げられる。また、本発明は、該化合物を含有する細胞分化促進剤を利用した、挿し木法、組織培養法などの方法によるクローン苗の生産性を向上させるための、中でも発根能が低い植物種に属するクローン苗の生産性を向上させるための、発根方法および発根用培地を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の〔１〕〜〔１０〕を提供する。
〔１〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール。
〔２〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする細胞分化促進剤。
〔３〕細胞が植物細胞である上記〔２〕に記載の細胞分化促進剤。
〔４〕植物の発根促進剤である上記〔２〕又は〔３〕に記載の細胞分化促進剤。
〔５〕植物の不定根及び／又は側根形成促進剤である上記〔２〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤。
〔６〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とするオーキシン活性促進剤。
〔７〕上記〔２〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または上記〔６〕に記載のオーキシン活性促進剤を含有する、植物の発根用培地。
〔８〕植物を上記〔２〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または上記〔６〕に記載のオーキシン活性促進剤の存在下栽培し発根させる、クローン苗の生産方法。
〔９〕植物を上記〔７〕に記載の発根用培地にて栽培し、発根させる、クローン苗の生産方法。
〔１０〕（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを用いて、細胞の分化を促進する方法。
〔１１〕細胞が植物細胞である、上記〔１０〕に記載の細胞の分化を促進する方法。
〔１２〕細胞の分化が、植物の不定根及び／側根の形成促進である、上記〔１０〕または〔１１〕に記載の細胞の分化を促進する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規なトリアゾール化合物が提供される。該トリアゾール化合物は細胞の分化を促進することができる。例えば、不定根の形成、主根からの側根の形成を促進させ、発根率を向上させることができる。不定根及び側根形成の促進は、例えば、オーキシン類（以下、単に「オーキシン」ということもある）の活性の促進によりもたらされる。よって、本発明によれば、クローン苗の生産性を向上させることができる。本発明によれば、発根能が低い植物種のクローン苗の生産性を特に顕著に向上させることができる。従って、本発明は、広く様々な植物種のクローン苗の大量かつ迅速な生産に寄与するものであり、中でも、発根能が低い植物種であっても、クローン苗を大量かつ迅速に生産することを可能とし、その産業的利用に途を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例２における生育後のユーカリ植物体を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールとその用途に関する。（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは下記の式（１）で表される化合物である。
【００１７】
【化１】
【００１８】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールの由来は特に限定されない。例えば、天然物由来のもの、化学反応により合成されたものを用いることができる。化学反応による合成方法としては、例えば、ピナコリン（３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ）をハロゲン化した後に、１，２，４−トリアゾール、及び後述の化合物（ｂ）と反応させて（Ｅ）−１−（ｂｅｎｚｏ[ｄ][１，３]ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（化合物（２−４−１））を得て、化合物（２−４−１）を還元して製造することができる。反応条件は実施例に示す条件が例示される。
【００１９】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは、優れた細胞分化促進作用を有するので、細胞分化促進剤の有効成分として有用である。
【００２０】
本発明の細胞分化促進剤は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする。本発明の細胞分化促進剤は、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分として含むものであればよく、必要に応じて、本発明の目的に反しない限り、他の成分（例えば、他の不定根形成促進剤、側根形成促進剤、オーキシンなどの不定根及び側根形成に関する植物ホルモンの活性促進剤）をあわせて含むもの（いわゆる組成物の形態）であってもよい。他の成分としては、例えば、国際出願第２０１１／６０２９３号明細書に記載の細胞分化促進剤が挙げられる。
【００２１】
細胞の例としては植物細胞が挙げられる。本発明の細胞分化促進剤は植物細胞の根細胞への分化、主根内部の内鞘組織の側根への分化（側根形成）を顕著に促進する効果を有する。よって、本発明の細胞分化促進剤は、不定根および／または側根形成促進剤として有用である。
【００２２】
本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤は、植物を栽培する際に存在させることにより、不定根形成促進効果及び側根形成促進効果を発揮する。
【００２３】
植物の種類は特に限定されない。植物は木本植物と草本植物とに分類されうるが、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤はこれらのいずれにも適用可能であり、木本植物に適用されることが好ましく、草本植物よりも発根能が劣っている木本植物に適用されることがより好ましい。木本植物としては、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）植物、スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）植物（スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）など）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）植物（サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ．）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、ユスラウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）など）、アボカド属（Ａｖｏｃａｄｏ）植物、マンゴー属(Ｍａｎｇｉｆｅｒａ)植物（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）など）、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）植物、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ）植物、クヌギ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）植物（クヌギなど（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ））、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）属植物、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属植物、バラ属（Ｒｏｓａ）植物、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）植物（チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）など）、ジャカランダ属（Ｊａｃａｒａｎｄａ）植物（ジャカランダ（Ｊａｃａｒａｎｄａ ｍｉｍｏｓｉｆｏｌｉａ）など）、ワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）植物（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）など）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）植物（ナシ（Ｐｙｒｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ Ｒｅｈｄｅｒ、Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）など）、ビャクダン属（Ｓａｎｔａｌｕｍ）植物（ビャクダン（サンダルウッド；Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）など）が例示される。このうち、ユーカリ、シロイヌナズナ、マツ、スギ、サクラ、マンゴー、アボカド、アカシア、ヤマモモ、クヌギ、ブドウ、リンゴ、バラ、ツバキ、チャ、ウメ、ユスラウメ、ジャカランタ等に適用した場合に、より本発明の効果を発揮しうる。中でもユーカリ属植物、シロイヌナズナ属植物、マツ属植物、スギ属植物、ツバキ属植物、マンゴー属植物、ワニナシ属植物が好ましく、難発根性として知られるユーカリ、マツ、スギ、チャ、マンゴー、アボカド等、側根が形成されにくいユーカリが好ましい。
【００２４】
ユーカリとしては、難発根性で知られるユーカリが好ましく、ユーカリ・グロビュラス、丸葉ユーカリなどがより好ましく、ユーカリ・グロビュラスが更に好ましい。
【００２５】
また、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤が適用可能な草本植物としては、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。このように、本発明においては、ナス科植物等の野菜類と共に、イネ、小麦等の穀物、豆類、トウモロコシなど食糧生産性植物にも一般に適用できるので、将来的な食糧生産技術の上からも大きな期待がもてる。また、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科等に属する植物のうち、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）はモデル植物として広く一般に用いられていることから、研究・開発の発展に貢献できる面でも大きな期待がもてる。
【００２６】
植物としては、植物体の一部または全部であればよい。不定根形成促進を期待する場合には、植物体の一部であることが好ましく、シュートであることがより好ましい。側根形成促進を期待する場合には、植物体全体であることが好ましい。
【００２７】
シュートとは、発根能を有する組織全般をいう。該組織としては、枝、茎、頂芽、腋芽、不定芽、葉、子葉、胚軸、不定胚、苗条原基等が例示される。シュートの由来は特に限定されず、温室や屋外に生育している植物個体から得られたものでもよいし、組織培養法により得られた培養組織であってもよいし、天然の植物体の一部の組織であってもよい。シュートは、挿し穂の母本植物や、多芽体から効率良く取得することができる。中でも、挿し穂（母本植物から得た挿し穂）、母本植物から採取した器官を無菌的に培養することにより得た多芽体、もしくは前記器官を無菌的に育成して得た茎葉であることが好ましい。
【００２８】
多芽体は、本発明を適用してクローン苗を生産しようとする植物から、頂芽や腋芽等を切取って、これを組織培養して誘導することができる。多芽体を、母本植物から採取した器官を無菌的に培養して、形成させるには、特開平８−２２８６２１号公報に記載の方法、条件に従って行い得る。その方法、条件は概ね次の通りである。まず、材料とする植物から頂芽、腋芽等の組織を採取し、採取した組織について、有効塩素量約０．５％〜約４％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液または有効塩素量約５％〜約１５％の過酸化水素水溶液に約１０分〜約２０分間浸漬して表面殺菌を行う。次いで、これを滅菌水で洗浄し、固体培地に挿し付けて芽を開じょさせ、伸長してきた茎葉を同じ組成の培地で継代培養することにより、多芽体を形成させる。ユーカリ属やアカシア属の組織（例えば腋芽）を用いる場合には、固体培地は、ショ糖１〜５重量％、植物ホルモンとしてベンジルアデニン（以下、ＢＡと略す。）約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１ｍｇ／ｌ以下、ゲランガム約０．２重量％以上約０．３重量％若しくは寒天約０．５重量％以上約１重量％以下を含有するムラシゲスクーグ（以下、ＭＳと略す。）培地またはこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を用いるのが好ましい。こうして形成された多芽体からは活発にシュートが伸長してくる。多芽体自体は、適当に分割して多芽体形成に用いた培地と同一組成の培地で培養することにより維持し、増殖させることができる。
【００２９】
一方、シュートとして挿し穂を用いてもよい。通常は挿し穂に対し、投与されることで、その効果を発揮する。挿し穂としては、植物の少なくとも一部であればよく、緑枝（当年枝）、熟枝（前年以前に伸びた枝）等の枝；頂芽や腋芽などの芽；葉、子葉；胚軸などが例示される。木本植物の場合の挿し穂は、通常は緑枝や熟枝であり、草本植物の場合の挿し穂は、通常は葉や芽であるが、これらには限定されない。
【００３０】
植物を本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤の存在下に栽培する方法は、特に制限はなく、植物の種類、部位、状態などから適宜選択できる。具体的には、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養する方法；不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に接触させる方法、が例示される。植物として、組織培養法により得られた培養組織を用いる場合には前者が好ましく、植物として挿し穂を用いる場合には前者、後者のいずれも好ましい。なお、上記例示した両方法の併用、すなわち、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養しつつ、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に接触させる方法を採用することも、もちろん可能である。
【００３１】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む発根用培地で植物を培養する場合、発根用培地中の不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度は、好ましくは約０．０１μＭ以上約１００μＭ以下、さらに好ましくは約０．１μＭ以上約１０μＭ以下、とりわけ好ましくは約０．５μＭ以上約５μＭ以下である。
【００３２】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液（不定根及び／又は側根形成促進剤溶液）を植物に接触させる場合、その接触の方法は特に限定されず、植物の種類、部位、状態、栽培方法などから適宜選択しうる。例えば、植物へ溶液を直接散布する方法、支持体を溶液で浸潤させる方法が挙げられる。
【００３３】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液は、不定根及び／又は側根形成促進剤を、適当な溶媒（例えば、水など）に溶解させて調整され得る。水としては、脱イオン水、蒸留水、逆浸透水、水道水などが例示され、いずれも利用可能である。溶液における不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度は、約０．０１μＭ以上約１００μＭ以下であることが好ましく、約０．１μＭ以上約１０μＭ以下であることがより好ましく、約０．５μＭ以上約５μＭ以下であることがさらにより好ましい。
【００３４】
不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を植物に直接散布する場合は、溶液を、スプレーなどを用いて霧状に、植物の一部または全体に散布すればよい溶液の散布量は、溶液中の不定根及び／又は側根形成促進剤の濃度などにもより、一概には規定できないが、一般には１つの植物あたり約０．５ｍｌ以上約５．０ｍｌ以下が好ましく、約１．０ｍｌ以上約３．０ｍｌ以下がより好ましい。散布回数は、１回でも２回以上であってもよいが、少なくとも栽培開始時に散布することが好ましい。さらに栽培条件に応じて、栽培期間中に適宜（例えば数日（２日〜３日）おき）追加で散布を行ってもよい。
【００３５】
支持体を不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液で湿潤させる場合は、溶液を支持体上部から散水する方法、溶液を満たした容器内に支持体を置床し底面から潅水させる方法などが例示される。支持体上部から散水する場合、上部からの散水量としては、１つの植物あたり約１．０ｍｌ以上約１０ｍｌ以下が好ましく、約３．０ｍｌ以上約５．０ｍｌ以下がより好ましい。底面から潅水させる場合は、溶液が支持体に、実質的に均一に湿潤されればよい。支持体を溶液で湿潤させる場合、溶液のほかに別途発根用培地を用意し、両者で支持体を湿潤させてもよく、このことは前述したとおりである。
【００３６】
本発明において発根用培地とは、植物から発根させるために用いられる培地を意味する。発根用培地は、銀イオンおよび／または抗酸化剤を含有することが好ましく、銀イオンおよび抗酸化剤の両方を含有することがより好ましい。銀イオンは、チオ硫酸銀（ＳＴＳ、ＡｇＳ4Ｏ6）や硝酸銀等の銀化合物（銀イオン源）として培地中に添加すればよい。中でもＳＴＳは、培地に添加して植物体（例えばシュート）を培養すると、健全な根の発根・伸長が促進されるので、本発明で用いる銀イオン源として好ましい。これは、このＳＴＳに由来する銀イオンが、培地中で、チオ硫酸銀イオンの形態を取り、マイナスに帯電しているためと考えられる。発根用培地中に添加する銀イオンの濃度は、銀イオン源の種類その他の培養条件などにもよるが、銀イオン源の濃度として約０．５μＭ以上約６μＭ以下が好ましく、約２μＭ以上約６μＭ以下がより好ましい。
【００３７】
一方、抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等、公知のものを用いることができる。中でもアスコルビン酸は、培地への残留性が低いので、本発明で用いる抗酸化剤として好ましい。発根用培地中に添加する抗酸化剤の濃度は、約５ｍｇ／ｌ以上約２００ｍｇ／ｌ以下が好ましく、約２０ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下がより好ましい。
【００３８】
本発明で用いる発根用培地は、上記成分に加え、無機成分、炭素源、ビタミン類、アミノ酸類および植物ホルモン類等を含み得る。
【００３９】
無機成分としては、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素や、これらを含む無機塩が例示される。該無機塩としては例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ホウ酸、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等やこれらの水和物が挙げられる。無機成分として、上具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。
【００４０】
本発明で用いられる発根用培地においては、窒素、リン、カリウムが必須元素として含まれることが好ましい。よって、これら無機成分の具体例のうち、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩、リンを含む無機塩、およびカリウムを含む無機塩が好ましく、窒素、リン、カリウム、窒素を含む無機塩がより好ましい。無機成分は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は約０．１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することが好ましく、約１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ約０．１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるよう添加することが好ましく、約１μＭ以上約１００ｍＭ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４１】
炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導体；脂肪酸等の有機酸；エタノール等の１級アルコール、などの化合物を使用することができる。炭素源として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。炭素源は、発根用培地中に約１ｇ／ｌ以上約１００ｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約１０ｇ／ｌ以上約１００ｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。しかし、培養を炭酸ガスを供給しながら行う場合には、培地は炭素源を含む必要は無く、含まないことが好ましい。ショ糖等の炭素源となりうる有機化合物は微生物の炭素源ともなるので、これらを添加した培地を用いる場合には、無菌環境下で培養を行う必要があるが、炭素源を含まない培地を用いることにより、非無菌環境下での培養が可能となる。
【００４２】
ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ４）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよび／またはリボフラビン（ビタミンＢ２）等を使用することができる。ビタミン類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。ビタミン類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約２００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の組み合わせの場合はそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１５０ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４３】
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、システイン、フェニルアラニンおよび／またはリジン等を使用することができる。アミノ酸類として、上記具体例の中から１種を選択して、或いは２種以上を組み合わせて用いうる。アミノ酸類は、発根用培地中の濃度が、１種の場合は発根用培地中に約０．１ｍｇ／ｌ以上約１０００ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、２種以上の組み合わせの場合は、それぞれ発根用培地中に約０．２ｍｇ／ｌ以上約１０００ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましい。
【００４４】
また、植物ホルモン類としては、例えば、オーキシン類および／またはサイトカイニン類を使用することができる。オーキシン類としては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。また、サイトカイニン類としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンおよびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。植物ホルモン類としては、オーキシン類のみ、サイトカイニン類のみ、或いはオーキシン類とサイトカイニン類の両方を組み合わせて用いうる。植物ホルモン類は、１種を用いる場合には発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。２種以上の場合にはそれぞれ、発根用培地中に約０．０１ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるよう添加することが好ましく、約０．０２ｍｇ／ｌ以上約１０ｍｇ／ｌ以下となるように添加することがより好ましい。
【００４５】
なお、本発明においては、植物組織培養用培地として公知の培地に、必要に応じて不定根及び／又は側根形成促進剤を添加するほか、さらに銀イオンおよび／または抗酸化剤を添加し、さらにまた、炭素源、植物ホルモン類を適宜添加等して、発根用培地として用いてもよい。かかる植物組織培養用培地としては、例えば、ＭＳ培地、リンスマイヤースクーグ培地、ホワイト培地、ガンボーグのＢ−５培地、ニッチニッチ培地等を挙げることができる。中でも、ＭＳ培地およびガンボーグのＢ−５培地が好ましい。これらの培地は、必要に応じて適宜希釈等して用いることができる。
【００４６】
上記発根用培地は、液体培地、固体培地のいずれであってもよいが、液体培地の方が作業効率および移植時に根を傷つけることが少ない点で好ましい。液体培地の場合には培地組成を混合し調製してそのまま用い得る。また固体培地の場合には液体培地と同様に培地組成を混合し調製すると同時に、或いは調整後に、寒天またはゲランガム等の固化剤で固化させて使用しうる。固化剤の培地への添加量は、固化剤の種類や培地の組成によっても異なる。固化剤が寒天の場合０．５重量％以上１重量％以下であることが好ましい。固化剤がゲランガムの場合０．２重量％以上０．３重量％以下であることが好ましい。
【００４７】
発根用培地への植物の挿し付け方法は、培地の種類、培養条件等により適宜選択しうる。例えば植物がシュートの場合を挙げて説明すると次の通りである。発根用培地が固体培地の場合は、発根用培地に直接シュートの基部を挿し付けて培養すればよい。一方発根用培地が液体培地の場合は、例えば、後述の支持体を発根用培地で湿潤させたものにシュートの基部を挿し付けて培養すればよい。なお、発根用培地に挿し付ける時にシュートの基部に傷をつけるといった物理的刺激を加えることも、発根率の向上のために好ましい。シュートの基部とは、シュートの一端であって根が形成される領域（葉の形成される端部に対し反対側）を意味する。シュートとして多芽体を用いる場合の基部は、多芽体を分割する際の切断面を有する領域である。シュートの基部への傷のサイズ（大きさ、形状など）は特に限定されない。例えば、シュートとして多芽体を用いる場合、シュートの基部（上述の切断面）を正面方向から見た際に十字型となるような傷を付けることが好ましい。傷を付ける際には、ハサミやナイフなどを用いることができる。
【００４８】
本発明において支持体とは、植物を支持するための支持体である。発根用培地（特に固体培地）を用いる場合などには、支持体は不要の場合があるが、それ以外の場合には通常支持体が利用される。
【００４９】
支持体は、栽培の期間中植物を指しつけた状態で保持できるものが好ましい。また、栽培にあたり液状の発根用培地を用いる場合には、通常、支持体に浸潤させて用いられる。よって支持体は液体で浸潤され得るものが好ましく、中でも、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液、或いは不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地により実質的に均一に湿潤され得るものが好ましい。発根用培地として、液体培地を用いる場合には、液体培地（不定根及び／又は側根形成促進剤を含まない）と不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液とを別個に支持体に添加してもよいし、予め調製した不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地を支持体に添加してもよい。支持体としては、従来慣用の支持体を用いることができ、特に限定されない。支持体としては例えば、砂、赤玉土等の自然土壌；籾殻燻炭、ココナッツ繊維、バーミキュライト、パーライト、ピートモス、ガラスビーズ等の人工土壌；発泡フェノール樹脂、ロックウール等の多孔性成形品などを挙げることができる。かかる支持体を培養容器内に入れ、不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液、或いは不定根及び／又は側根形成促進剤を含む液体培地にて湿潤させることにより発根床が調製され得る。なお、発根用培地が固体培地の場合には、固体培地を直接培養容器に入れることで、発根床が調製され得る。
【００５０】
本発明においては、発根用培地または支持体を納めるための培養容器を用い得る。培養容器としては、従来慣用の培養容器を用いることができ、特に限定されない。例えば、育苗ポット、プラグトレーなどが例示される。培養容器は密閉型でもよいし開放型でもよいが、密閉型のものが好ましい。密閉型の培養容器を用いることにより、散布された不定根及び／又は側根形成促進剤を含む溶液を保持することができる。また、植物、例えばシュートやこれから形成されるクローン苗を取り巻く環境の湿度維持が容易となる。
【００５１】
シュートとして枝を用いる場合には、培養容器として密閉型の培養容器を用いることが好ましい。これによりシュートを高湿度下に置くことが容易となるので枝についた葉の蒸散作用が抑制され、従来行われていた葉の一部切除処理を省略することができる。
【００５２】
培養容器は、容器内への炭酸ガス供給が可能な容器であることがより好ましい。このような培養容器としては、二酸化炭素透過性の膜で蔽われた開口部を有する容器が例示される。このような容器を用いることにより、培養環境の湿度をも容易に調整しうる。開口部の形状は特に問わない。二酸化炭素透過性の膜の材料は特に限定されず、ポリテトラフルオロエチレンなどが例示される。また、膜の孔径も特に限定されず、約０．１μｍ以上約１μｍ以下のものなどが例示される。
【００５３】
植物を栽培する際の栽培条件としては、植物から発根させ得る条件である限り特に限定されない。栽培条件は、植物の種類、部位、状態、発根用培地の種類などにより一概に規定することは難しいが、例えば、温度は、約２３℃以上約２８℃以下であることがより好ましい。光強度は、光合成有効光量子束密度として表され、約１０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上約１０００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以下であることが好ましく、約５０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以上約５００μｍｏｌ／ｍ2／ｓ以下であることがより好ましい。いずれの場合でも、例えばシュートの場合には、通常は約２週間以上約５週間以内で、シュートからの発根が観察されるようになる。
【００５４】
栽培は、約６５０ｎｍ以上約６７０ｎｍ以下の波長成分と約４５０ｎｍ以上約４７０ｎｍ以下の波長成分とを９：１〜７：３の割合で含む光の照射下で行うことが好ましく、これらの波長成分を９：１〜８：２の割合で含む光の照射下で行うことがより好ましい。かかる波長成分を含む光を照射して栽培を行うことで、植物からの発根がより促進され得る。
【００５５】
さらに、炭酸ガスを栽培環境中に、通常は３００ｐｐｍ以上２０００ｐｐｍ以下、好ましくは８００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下となるように供給することが好ましい。炭酸ガスの供給量の制御は、人工気象器等の設備や、二酸化炭素透過性の膜を開口部に有する培養容器などを利用して行われうる。
【００５６】
湿度は植物の種類等栽培条件に応じて調整することができる。通常は、５０％以上、好ましくは６０％以上である。また、ユーカリ属植物の場合、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましい。この湿度であることにより、植物からの発根を促進することができる。また上限については特に制限はない。
【００５７】
一方、シュートとして挿し穂を用いる場合には、遮光を行うことが好ましい。遮光率は、３０％以上７０％以下が好ましく、４０％以上６０％以下がより好ましい。
【００５８】
以上のようにして、本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤を用いて、植物から不定根を発根させることができる。不定根が発根した状態のものは、通常、クローン苗と呼ばれる。本発明の不定根及び／又は側根形成促進剤を用いて一定期間栽培（植物の種類、部位、状態などにもよるが、例えばユーカリの場合には１０日以上９０日以下程度）を続け、根を充実させてから、これを育苗容器、苗畑等に移植して育成し、植林等の所定の目的に使用可能な苗とすることができる。この間の用土や、苗を育成する際の温度・光強度等の条件は、その植物に適するように適宜設定すればよい。なお、不定芽や苗条原基等、培養組織由来のシュートを発根させた場合には、通常、育苗容器等への移植の前に、順化の過程を経る必要がある。
【００５９】
本発明の細胞分化促進剤は、以上説明したように不定根及び／又は側根形成促進剤として有用である。本発明における不定根形成促進作用および側根形成促進作用は、オーキシンの活性と類似しているので、（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールは、オーキシン活性促進剤の有効成分としても有用である。さらに、オーキシン活性促進剤は、オーキシン合成促進剤、オーキシン代謝（分解）阻害剤とも言い換え得る。
【００６０】
オーキシン活性促進剤の対象はオーキシン類である。オーキシン類の例は上述のとおりである。
【００６１】
［作用］
本発明では、植物を不定根及び／又は側根形成促進剤の存在下栽培することにより、前記植物から発根させることができる。その理由は、以下のように推察される。
【００６２】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールの不定根形成促進効果および側根形成促進効果は、植物の組織におけるオーキシン類の活性の促進もしくは合成の促進、またはオーキシン類の代謝（分解）阻害など、何らかの形でオーキシン類の働きに関わると考えられる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
以下の合成経路にて、実施例及び比較例で用いる化合物（３−４−１）及び化合物（ＭＡ６５）を合成した（下記の製造例）。
【００６５】
【化２】
反応Ａ：Ｂｒ2，ＡｌＣｌ3，ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ
反応Ｂ：１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ，Ｋ2ＣＯ3，ａｃｅｔｏｎｅ
反応Ｃ：Ｒ−Ｃ6Ｈ5ＣＨＯ，ＴＦＡ ｏｒ ＣＨ3ＣＯＯＨ，ｔｏｌｕｅｎｅ，ｒｅｆｌｕｘ（Ｒは、４−（ジメチルアミノ）フェニル基、またはベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル基を表す。）
反応Ｄ：ＮａＢＨ4，ＭｅＯＨ，ｏｎ ｉｃｅ
【００６６】
製造例１
３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））の合成（合成経路の反応Ａ及びＢ）
ピナコリン（３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ）（２５ｇ）をジエチルエーテル（７０ｍＬ）に溶解し、塩化アルミニウムを触媒量加えた。氷浴下で撹拌しながら臭素（２５ｇ）を徐々に加えた後、３０分間撹拌した。水を加え反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮し、粗１−ｂｒｏｍｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ混合物を得た。
【００６７】
得られた１−ｂｒｏｍｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ混合物をアセトン（１５０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（３５ｇ）、１，２，４−トリアゾール（２２ｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。水を加え反応を停止後、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。再結晶を行い、３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））の白色結晶を得た。
【００６８】
製造例２
１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（化合物群（２−１））の合成（合成経路の反応Ｃ）
３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ（化合物（ａ））（０．８３ｇ）、４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．８２ｇ）をトルエン（４０ｍＬ）に溶解し、撹拌した。モルホリン（０．４８ｇ）、トリフルオロ酢酸（０．２７ｇ）を滴下した後、ソックスレー抽出器の抽出部にモレキュラーシーブ（４Ａ）を詰めて４時間加熱還流し、脱水した。反応液を室温で冷却し水を加えて反応停止後、酢酸エチルで有機相を３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝３：１）で精製し、幾何異性体を分離後、再結晶により化合物群（２−１）の各々の黄色結晶を得た（収率；２２．８％）。
【００６９】
化合物群（２−１）は以下の化合物により構成される。
【００７０】
化合物（２−１−１）：（Ｅ）−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−１−１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．０７３（ｓ，９Ｈ），３．０００（ｓ，６Ｈ），６．６４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．９８６（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），７．２０８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．０３１（ｓ，１Ｈ），８．２４１（ｓ，１Ｈ）
【００７１】
化合物（２−１−２）：（Ｚ）−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−１−２）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．２４１（ｓ，９Ｈ），２．９００（ｓ，６Ｈ），６．４９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．５５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．７４２（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０５７（ｓ，１Ｈ），８．２２１（ｓ，１Ｈ）
【００７２】
製造例３
（±）−Ｚ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−１−２））の合成（合成経路の反応Ｄ）
化合物（２−１−１）（０．１３ｇ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、氷浴で撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム（１６．５ｍｇ）を徐々に加えて２時間撹拌した。水を加えた後酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターで減圧濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：１）で精製し、（±）−Ｅ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−１−１））の白色結晶（０．１１ｇ）を得た（収率；８５％）。
【００７３】
化合物（３−１−２）〔ＭＡ６５〕
（±）−Ｚ−１−（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；０．８０３（ｓ，９Ｈ），２．９１８（ｓ，６Ｈ），３．６２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＯＨ），４．２０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＯＨ），６．４９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），６．６０７（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），６．６０８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．００２（ｓ，１Ｈ），８．０９８（ｓ，１Ｈ）
【００７４】
製造例４
１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−１）（化合物群（２−４）の合成）（合成経路の反応Ｃ）
製造例２において４−ジメチルアミノベンズアルデヒドの代わりに式（２）で表される化合物（ｂ）を用いたほかは同様にして、化合物群（２−４）を合成した。
【化３】
【００７５】
化合物群（２−４）は以下の化合物により構成される。
【００７６】
化合物（２−４−１）：（Ｅ）−１−（ｂｅｎｚｏ[ｄ][１，３]ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−１）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．０４５（ｓ，９Ｈ），６．００４（ｓ，２Ｈ），６．８１５（ｍ，３Ｈ），７．０５５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０４７（ｓ，１Ｈ），８．２４１（ｓ，１Ｈ）
【００７７】
化合物（２−４−２）：（Ｚ）−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｎｅ（２−４−２）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；１．２１９（ｓ，９Ｈ），５．９２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），５．９５９（ｓ，２Ｈ），６．５８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ1＝８．５Ｈｚ，Ｊ2＝２．０Ｈｚ），６．７３６（ｓ，１Ｈ，８．５Ｈｚ），７．６０６（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０３６（ｓ，１Ｈ），８．２１０（ｓ，１Ｈ）
【００７８】
製造例５
（±）−Ｅ−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ（化合物（３−４−１））の合成（合成経路の反応Ｄ）
化合物（２−１−１）の代わりに化合物（２−４−１）を用いたほかは製造例３と同様にして、化合物（３−４−１）を合成した。
【００７９】
化合物（３−４−１）：
（±）−Ｅ−１−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）ｐｅｎｔ−１−ｅｎ−３−ｏｌ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，ｐｐｍ）δ；０．６７８（ｓ，９Ｈ），４．２７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＯＨ），４．６２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＯＨ），６．０１５（ｓ，２Ｈ），６．８４８（ｍ，３Ｈ），７．２６５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），８．０３７（ｓ，１Ｈ），８．４４１（ｓ，１Ｈ）
【００８０】
実施例１、比較例１及び比較例２（シロイヌナズナにおける発根試験）
角シャーレ（滅菌２号、栄研化学）に、オートクレーブした１／２ ＭＳ培地を入れて固化させ、以下の要領で滅菌したシロイヌナズナ種子を植えた。サージカルテープをシャーレに巻き、暗所、４℃で２日間低温処理を行った。その後、２２℃、連続光下にてバイオトロンにシャーレを立てかけて置き、４日間生育させた。その中から生育のよい個体を選抜した。
【００８１】
ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に化合物（３−４−１）（実施例１）、化合物（ＭＡ６５）（比較例１）をそれぞれ１μＭ溶かした各種化合物を処理した１／２ ＭＳ培地に植えかえた。これを同様にバイオトロンで６日間生育させ、生育後の単位主根長当たりの側根数（平均値）を算出した（ｎ＝７）。単位主根長当たりの側根数とは、主根１ｃｍあたりの側根の数であり、個体の側根の数をその主根の長さで割ったものを指す。また、化合物を添加しなかったほかは同様にして結果を得た（比較例２）。結果を表１に示す。
【００８２】
〔シロイヌナズナ種子の滅菌〕
シロイヌナズナ種子を７０％エタノールで３０分間滅菌した後、エタノールに１分間浸漬し、滅菌濾紙上で風乾した。
【００８３】
〔１／２ ＭＳ培地（１Ｌ）〕
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） ２．２ｇ
Ｓｕｃｒｏｓｅ １０．０ｇ
１０００×ビタミンストック １．０ｍＬ
【００８４】
以上の組成で調整した培地のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨで５．７に調整した後、蒸留水で１．０Ｌにメスアップし、植物用寒天（０．８％）を加え、オートクレーブした。
【００８５】
〔１０００×ビタミンストック〕
ニコチン酸 ５０ｍｇ
ピリドキシン塩酸塩 ５０ｍｇ
チアミン塩酸塩 ２０ｍｇ
グリシン ２００ｍｇ
ビオチン ５ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
【００８６】
約８０ｍＬの蒸留水で懸濁し、１Ｎ ＮａＯＨを溶解するまで加え、蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。
【００８７】
【表１】
【００８８】
実施例１（化合物（３−４−１））は、比較例２（無添加）よりも単位主根長あたりの側根数が多く、主根は短かった（表１）。実施例１の単位主根長あたりの側根数は、比較例１（化合物（ＭＡ６５））よりも多く、主根の長さは短かった（表１）。この結果は、本発明の細胞分化促進剤が、側根の発根を促進しかつ側根数の増加を促進することを示すものである。
【００８９】
実施例２、比較例３及び比較例４（ユーカリにおける発根試験）
挿し穂の材料として、ユーカリプタス・グロビュラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、以下、単にＥ．グロビュラスと略記する。）の難発根系統であるユーカリクローンＡ（Ｇ−００４）を用いた。すなわち採穂母樹から、５〜２０ｃｍの長さ、節が１〜３節、葉が２〜６葉程度に伸長した穂木を切り出し、挿し穂を調製した。
【００９０】
得られた挿し穂の基部を、化合物（３−４−１）（実施例２）、化合物（ＭＡ６５）（比較例３）をそれぞれ１μＭ、銀イオン源としてＳＴＳ（ＡｇＳ4Ｏ6）５μＭ、抗酸化剤としてアスコルビン酸５０ｍｇ／ｌ、および植物ホルモンとしてＩＢＡ２ｍｇ／ｌを添加した、４倍希釈ＭＳ培地（組成：硝酸アンモニウム ４１２．５ｍｇ／ｌ、硝酸カリウム ４７５ｍｇ／ｌ、リン酸２水素カリウム ４２．５２ｍｇ／ｌ、ヨウ化カリウム ０．２１ｍｇ／ｌ、なお、本培地に炭素源は添加されていない。）にて湿潤した発泡フェノール樹脂製多孔性支持体（スミザーズオアシス社製、商品名：オアシス）に挿し付け、炭酸ガス濃度１０００ｐｐｍ、温度２５℃、６５０〜６７０ｎｍの波長成分と４５０〜４７０ｎｍの波長成分とを８．２：１．８の割合で含む、光合成有効光量子束密度５１．３μｍｏｌ／ｍ2／Ｓの赤色光照射下で２ヶ月間培養を行った。なお、このとき培養容器としては、最大寸法が縦１０〜１１．５ｃｍ×横１０〜１１．５ｃｍ×高さ１０．０ｃｍ程度の、胴部がやや張出した形状の立方体のものを用いた。この培養容器の頂面には、孔径０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン製膜（ミリポア社製、商品名：ミリシール）を貼り付けた円形開口部１個が設けられている。培養容器内の炭酸ガスの濃度は、培養容器外の炭酸ガスが培養容器の開口部の炭酸ガス透過性の膜より透過するため、培養容器の開口部の膜より透過した濃度（約１０００ｐｐｍ）であった。赤色光照射の培養容器への照射は、光照射装置として商品名：ＣＣＦＬ光源ユニット、メーカー名：日本医化器械製作所を用いて行った。また、培養容器をパラフィルムで封鎖する事により培養容器内の湿度を８５％以上となるように調整した。
【００９１】
挿し穂は、この培養容器１個当たり１６本を挿し付けた。挿し穂の供試数（それぞれ５０本）と、２ヶ月間培養後に発根したシュートの数（発根数）から、発根率を算出した。また、化合物を添加しなかったほかは同様にして結果を得た（比較例３）。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
化合物（３−４−１）を用いた場合には、比較例４（無添加）よりもユーカリの発根率が顕著に高まり、比較例３（化合物（ＭＡ６５））よりも高い発根率を示した（表２）。更に、実施例２では比較例３よりも根数が多く、根が短かった（図１）。この結果は、本発明の細胞分化促進剤が、不定根の発根を促進しかつ不定根の発根数を増加させることを示している。
【００９４】
また、実施例１および実施例２の結果から、本発明の細胞分化促進剤は、オーキシンの活性を促進しているものと推測される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール。
【請求項２】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする細胞分化促進剤。
【請求項３】
細胞が植物細胞である請求項２に記載の細胞分化促進剤。
【請求項４】
植物の発根促進剤である請求項２又は３に記載の細胞分化促進剤。
【請求項５】
植物の不定根及び／又は側根形成促進剤である請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤。
【請求項６】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とするオーキシン活性促進剤。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または請求項６に記載のオーキシン活性促進剤を含有する、植物の発根用培地。
【請求項８】
植物を請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または請求項６に記載のオーキシン活性促進剤の存在下栽培し発根させる、クローン苗の生産方法。
【請求項９】
植物を請求項７に記載の発根用培地にて栽培し、発根させる、クローン苗の生産方法。
【請求項１０】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを用いて、細胞の分化を促進する方法。
【請求項１１】
細胞が植物細胞である、請求項１０に記載の細胞の分化を促進する方法。
【請求項１２】
細胞の分化が、植物の不定根及び／側根の形成促進である、請求項１０または１１に記載の細胞の分化を促進する方法。
【請求項１】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オール。
【請求項２】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とする細胞分化促進剤。
【請求項３】
細胞が植物細胞である請求項２に記載の細胞分化促進剤。
【請求項４】
植物の発根促進剤である請求項２又は３に記載の細胞分化促進剤。
【請求項５】
植物の不定根及び／又は側根形成促進剤である請求項２〜４のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤。
【請求項６】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを有効成分とするオーキシン活性促進剤。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または請求項６に記載のオーキシン活性促進剤を含有する、植物の発根用培地。
【請求項８】
植物を請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞分化促進剤または請求項６に記載のオーキシン活性促進剤の存在下栽培し発根させる、クローン苗の生産方法。
【請求項９】
植物を請求項７に記載の発根用培地にて栽培し、発根させる、クローン苗の生産方法。
【請求項１０】
（±）−Ｅ−１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４，４−ジメチル−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３−オールを用いて、細胞の分化を促進する方法。
【請求項１１】
細胞が植物細胞である、請求項１０に記載の細胞の分化を促進する方法。
【請求項１２】
細胞の分化が、植物の不定根及び／側根の形成促進である、請求項１０または１１に記載の細胞の分化を促進する方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−９５６６４（Ｐ２０１３−９５６６４Ａ）
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３６４２３（Ｐ２０１１−２３６４２３）
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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