トロポニンの分析のための高感度のシステムおよび方法
本発明は、心筋トロポニンの高感度検出のための方法、組成物、キットおよびシステムを提供する。そのような方法、組成物、キットおよびシステムは、心筋トロポニンの放出に関係する状態における診断、予後診断および治療方法の決定において有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のトロポニンの単一分子またはその断片もしくは複合体の有無を判定するための方法であって、
ｉ）前記分子、断片、または複合体を、存在する場合には標識で標識する工程と、
ｉｉ）前記標識の有無を検出する工程であって、前記標識の存在の検出は前記試料中のトロポニンの前記単一分子、断片、または複合体の存在を示す工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記トロポニンがトロポニンの心筋アイソフォームである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トロポニンが心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トロポニンがｃＴｎＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程において約５０ｐｇ／ｍｌ未満の検出限界でトロポニンの前記単一分子を検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トロポニンを約２０ｐｇ／ｍｌ未満の検出レベルで検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標識が蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光部分が該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が前記トロポニン分子、断片、または複合体の結合相手をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合相手が前記トロポニン分子、断片、または複合体に特異的な抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がトロポニン分子の特定の領域に特異的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸２７〜４１を含む領域に特異的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を固体支持体上に捕捉する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートおよび常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記固体支持体が前記固体支持体に結合する前記トロポニンまたはトロポニン複合体に特異的な捕捉相手を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記固体支持体への前記捕捉相手の前記結合が非共有結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固体支持体への前記捕捉相手の前記結合が共有結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記捕捉相手の前記共有結合は、前記捕捉相手が特定の方向で前記固体支持体と結合するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記特定の方向が前記捕捉相手への前記トロポニンまたはトロポニン複合体の特異的結合の最大化に役立つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記捕捉相手が抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸８７〜９１に特異的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸４１〜４９に特異的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が血液、血清、または血漿の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が血清試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識が蛍光部分を含み、工程ｉｉ）が前記標識を単一分子検出器に通過させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記単一分子検出器が、
ａ）前記蛍光部分を刺激するための電磁放射線源、
ｂ）前記蛍光部分を通過させるためのキャピラリーフローセル、
ｃ）前記キャピラリーフローセル内で前記蛍光部分を移動するための原動力源、
ｄ）前記電磁放射線源から放出される電磁放射線を受け取るための、前記キャピラリーフローセル内に画定されるインタロゲーション空間、
ｅ）前記刺激された蛍光部分の電磁気特性を測定するための、前記インタロゲーション空間に作動可能に接続された電磁放射線検出器、および
ｆ）前記インタロゲーション空間および前記検出器の間に位置し、０．６以上の開口数を有する顕微鏡対物レンズ
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
個体において診断、予後診断、または治療方法を決定するための方法であって、
ｉ）前記個体から得られる試料中の心筋トロポニンの濃度を決定するかまたは一連の試料中の心筋トロポニンの濃度を決定する工程であって、前記試料中の前記心筋トロポニンの検出限界が約５０ｐｇ／ｍｌ未満である心筋トロポニンアッセイで前記濃度を決定する工程と、
ｉｉ）前記試料中の前記濃度または前記一連の試料中の前記濃度に基づいて、前記個体において診断、予後診断、または治療方法を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
工程ｉｉ）が、前記濃度または一連の濃度を前記濃度の正常値と比較すること、前記濃度または一連の濃度を所定の閾値レベルと比較すること、前記濃度または一連の濃度をベースライン値と比較すること、および前記一連の濃度について濃度の変化率を決定することからなる群から選択される分析を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程ｉｉ）が、前記試料中の前記トロポニン濃度を所定の閾値濃度と比較して、試料濃度が閾値レベルよりも高い場合は診断、予後診断、または治療方法を決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記閾値濃度が、正常な個体群におけるトロポニンの９９パーセンタイル濃度を決定し、前記閾値濃度を前記９９パーセンタイル濃度で設定することによって決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
心臓ストレス試験中または心臓ストレス試験後に少なくとも１つの試料を採取する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＴからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記心筋トロポニンの濃度が全心筋トロポニンの濃度である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記心筋トロポニンの濃度が心筋トロポニン複合体、心筋トロポニン断片、リン酸化心筋トロポニン、酸化心筋トロポニン、またはそれらの組合せの濃度である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記心筋トロポニンの濃度を全心筋トロポニンと比較する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞の診断、予後診断、または治療方法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞の危険度レベルについての危険度階層化を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記濃度または一連の濃度は、前記個体によって心筋虚血症もしくは梗塞またはその可能性を示す１つ以上の症状が医療従事者に示された時点またはそれに近い時点で決定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の症状が胸部痛、胸部圧、腕部痛、異常なＥＫＧ、異常な酵素レベル、および息切れからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記濃度をトロポニンの単一分子またはその複合体もしくは断片を検出することを含む方法により決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を蛍光部分を含む標識で標識することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光部分が該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径５ミクロンのスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識が前記トロポニンの結合相手をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合相手が前記トロポニンに特異的な抗体を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を固体支持体上に捕捉する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートおよび常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記固体支持体が、前記固体支持体に結合する前記トロポニンまたはトロポニン複合体に特異的な捕捉相手を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
工程ｉ）が前記個体の別の指標を評価することをさらに含み、工程ｉｉ）が、前記トロポニン濃度および前記試料中の前記非トロポニンマーカーの前記別の指標の評価に基づいて、あるいは前記一連の試料中の前記濃度に基づいて、前記個体における診断、予後診断、または治療方法を決定することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６０】
前記別の指標が心筋虚血症または梗塞の臨床的な指標である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記別の指標が前記試料中または前記一連の試料中の１つ以上の非トロポニンマーカーの濃度である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つ以上のマーカーが心虚血のマーカーまたは炎症のマーカーおよびプラーク不安定性のマーカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の心虚血マーカーが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびその心筋分画ＣＫ心筋バンド（ＭＢ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ミオグロビン、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、未結合の遊離脂肪酸、心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、虚血修飾アルブミン、ミオシン軽鎖１、ミオシン軽鎖２からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上のマーカーが心筋傷害の１つ以上の特異的マーカーを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞ではない状態の診断、予後診断、または治療方法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項６６】
前記状態が心臓毒性である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記心臓毒性が前記個体への薬剤投与に関連する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記状態が、急性リウマチ熱、アミロイド沈着症、心臓外傷（挫傷、切除、ペーシング、ファイヤリング、電気除細動、カテーテル挿入および心臓手術を含む）、再かん流傷害、うっ血性心不全、末期腎不全、ＩＩ型糖原貯蔵症（ポンペ病）、心臓移植、輸血性ヘモシデローシスによる異常ヘモグロビン症、妊娠性高血圧を含む高血圧、しばしば不整脈を伴う低血圧症、甲状腺機能低下症、心筋炎、心膜炎、手術後の非心臓手術、肺動脈塞栓症、および敗血症からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
蛍光部分に結合されたトロポニンアイソフォームの結合相手を含むトロポニンアイソフォームの検出のための組成物であって、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である組成物。
【請求項７０】
前記結合相手が前記トロポニンアイソフォームに対する抗体を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記トロポニンアイソフォームが心筋アイソフォームである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７４】
前記心筋アイソフォームがｃＴｎＩおよびｃＴｎＴからなる群から選択される、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記心筋アイソフォームがｃＴｎＩである、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記抗体がトロポニン分子の特定の領域に特異的である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸２７〜４１を含む領域に特異的である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７９】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項８０】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
心筋トロポニンの濃度の決定のための一組の標準品を含む組成物であって、少なくとも１つの標準品は約１０ｐｇ／ｍｌ未満の心筋トロポニン濃度である組成物。
【請求項８２】
蛍光色素部分に結合された心筋トロポニンに対する抗体を含む組成物を含むキットであって、前記蛍光色素部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であり、前記組成物は好適な包装材で包装される、キット。
【請求項８３】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８５】
説明書をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８６】
固体支持体に結合される前記心筋トロポニンＩについての捕捉抗体を含む組成物をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートまたは常磁性微小粒子を含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
洗浄用緩衝液、アッセイ用緩衝液、溶出用緩衝液、およびキャリブレーター用希釈液からなる群から選択される構成要素をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８９】
前記心筋トロポニンの標準品をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項１】
試料中のトロポニンの単一分子またはその断片もしくは複合体の有無を判定するための方法であって、
ｉ）前記分子、断片、または複合体を、存在する場合には標識で標識する工程と、
ｉｉ）前記標識の有無を検出する工程であって、前記標識の存在の検出は前記試料中のトロポニンの前記単一分子、断片、または複合体の存在を示す工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記トロポニンがトロポニンの心筋アイソフォームである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トロポニンが心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）および心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トロポニンがｃＴｎＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程において約５０ｐｇ／ｍｌ未満の検出限界でトロポニンの前記単一分子を検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トロポニンを約２０ｐｇ／ｍｌ未満の検出レベルで検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標識が蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光部分が該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が前記トロポニン分子、断片、または複合体の結合相手をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合相手が前記トロポニン分子、断片、または複合体に特異的な抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がトロポニン分子の特定の領域に特異的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸２７〜４１を含む領域に特異的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を固体支持体上に捕捉する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートおよび常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記固体支持体が前記固体支持体に結合する前記トロポニンまたはトロポニン複合体に特異的な捕捉相手を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記固体支持体への前記捕捉相手の前記結合が非共有結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固体支持体への前記捕捉相手の前記結合が共有結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記捕捉相手の前記共有結合は、前記捕捉相手が特定の方向で前記固体支持体と結合するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記特定の方向が前記捕捉相手への前記トロポニンまたはトロポニン複合体の特異的結合の最大化に役立つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記捕捉相手が抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸８７〜９１に特異的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸４１〜４９に特異的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が血液、血清、または血漿の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が血清試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識が蛍光部分を含み、工程ｉｉ）が前記標識を単一分子検出器に通過させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記単一分子検出器が、
ａ）前記蛍光部分を刺激するための電磁放射線源、
ｂ）前記蛍光部分を通過させるためのキャピラリーフローセル、
ｃ）前記キャピラリーフローセル内で前記蛍光部分を移動するための原動力源、
ｄ）前記電磁放射線源から放出される電磁放射線を受け取るための、前記キャピラリーフローセル内に画定されるインタロゲーション空間、
ｅ）前記刺激された蛍光部分の電磁気特性を測定するための、前記インタロゲーション空間に作動可能に接続された電磁放射線検出器、および
ｆ）前記インタロゲーション空間および前記検出器の間に位置し、０．６以上の開口数を有する顕微鏡対物レンズ
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
個体において診断、予後診断、または治療方法を決定するための方法であって、
ｉ）前記個体から得られる試料中の心筋トロポニンの濃度を決定するかまたは一連の試料中の心筋トロポニンの濃度を決定する工程であって、前記試料中の前記心筋トロポニンの検出限界が約５０ｐｇ／ｍｌ未満である心筋トロポニンアッセイで前記濃度を決定する工程と、
ｉｉ）前記試料中の前記濃度または前記一連の試料中の前記濃度に基づいて、前記個体において診断、予後診断、または治療方法を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
工程ｉｉ）が、前記濃度または一連の濃度を前記濃度の正常値と比較すること、前記濃度または一連の濃度を所定の閾値レベルと比較すること、前記濃度または一連の濃度をベースライン値と比較すること、および前記一連の濃度について濃度の変化率を決定することからなる群から選択される分析を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程ｉｉ）が、前記試料中の前記トロポニン濃度を所定の閾値濃度と比較して、試料濃度が閾値レベルよりも高い場合は診断、予後診断、または治療方法を決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記閾値濃度が、正常な個体群におけるトロポニンの９９パーセンタイル濃度を決定し、前記閾値濃度を前記９９パーセンタイル濃度で設定することによって決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
心臓ストレス試験中または心臓ストレス試験後に少なくとも１つの試料を採取する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＴからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記心筋トロポニンの濃度が全心筋トロポニンの濃度である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記心筋トロポニンの濃度が心筋トロポニン複合体、心筋トロポニン断片、リン酸化心筋トロポニン、酸化心筋トロポニン、またはそれらの組合せの濃度である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記心筋トロポニンの濃度を全心筋トロポニンと比較する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞の診断、予後診断、または治療方法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞の危険度レベルについての危険度階層化を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記濃度または一連の濃度は、前記個体によって心筋虚血症もしくは梗塞またはその可能性を示す１つ以上の症状が医療従事者に示された時点またはそれに近い時点で決定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の症状が胸部痛、胸部圧、腕部痛、異常なＥＫＧ、異常な酵素レベル、および息切れからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記濃度をトロポニンの単一分子またはその複合体もしくは断片を検出することを含む方法により決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を蛍光部分を含む標識で標識することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光部分が該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは前記蛍光部分を含む直径５ミクロンのスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識が前記トロポニンの結合相手をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合相手が前記トロポニンに特異的な抗体を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記トロポニンまたはトロポニン複合体を固体支持体上に捕捉する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートおよび常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記固体支持体が、前記固体支持体に結合する前記トロポニンまたはトロポニン複合体に特異的な捕捉相手を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
工程ｉ）が前記個体の別の指標を評価することをさらに含み、工程ｉｉ）が、前記トロポニン濃度および前記試料中の前記非トロポニンマーカーの前記別の指標の評価に基づいて、あるいは前記一連の試料中の前記濃度に基づいて、前記個体における診断、予後診断、または治療方法を決定することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６０】
前記別の指標が心筋虚血症または梗塞の臨床的な指標である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記別の指標が前記試料中または前記一連の試料中の１つ以上の非トロポニンマーカーの濃度である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つ以上のマーカーが心虚血のマーカーまたは炎症のマーカーおよびプラーク不安定性のマーカーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の心虚血マーカーが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびその心筋分画ＣＫ心筋バンド（ＭＢ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ミオグロビン、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、未結合の遊離脂肪酸、心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、虚血修飾アルブミン、ミオシン軽鎖１、ミオシン軽鎖２からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上のマーカーが心筋傷害の１つ以上の特異的マーカーを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記診断、予後診断、または治療方法が心筋梗塞ではない状態の診断、予後診断、または治療方法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項６６】
前記状態が心臓毒性である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記心臓毒性が前記個体への薬剤投与に関連する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記状態が、急性リウマチ熱、アミロイド沈着症、心臓外傷（挫傷、切除、ペーシング、ファイヤリング、電気除細動、カテーテル挿入および心臓手術を含む）、再かん流傷害、うっ血性心不全、末期腎不全、ＩＩ型糖原貯蔵症（ポンペ病）、心臓移植、輸血性ヘモシデローシスによる異常ヘモグロビン症、妊娠性高血圧を含む高血圧、しばしば不整脈を伴う低血圧症、甲状腺機能低下症、心筋炎、心膜炎、手術後の非心臓手術、肺動脈塞栓症、および敗血症からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
蛍光部分に結合されたトロポニンアイソフォームの結合相手を含むトロポニンアイソフォームの検出のための組成物であって、前記蛍光部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である組成物。
【請求項７０】
前記結合相手が前記トロポニンアイソフォームに対する抗体を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記トロポニンアイソフォームが心筋アイソフォームである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７４】
前記心筋アイソフォームがｃＴｎＩおよびｃＴｎＴからなる群から選択される、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記心筋アイソフォームがｃＴｎＩである、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記抗体がトロポニン分子の特定の領域に特異的である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記抗体が心筋トロポニンＩのアミノ酸２７〜４１を含む領域に特異的である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記蛍光部分が少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む分子を含み、前記インドリウム環の３位炭素上の置換基は化学反応性基または共役基を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７９】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００からなる群から選択される色素を含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項８０】
前記蛍光部分がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
心筋トロポニンの濃度の決定のための一組の標準品を含む組成物であって、少なくとも１つの標準品は約１０ｐｇ／ｍｌ未満の心筋トロポニン濃度である組成物。
【請求項８２】
蛍光色素部分に結合された心筋トロポニンに対する抗体を含む組成物を含むキットであって、前記蛍光色素部分は該部分の励起波長で発光するレーザーによって刺激されたときに少なくとも約２００個の光子を放出することができ、前記レーザーは蛍光部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに集束され、前記レーザーによって前記スポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下であり、前記組成物は好適な包装材で包装される、キット。
【請求項８３】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＴである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
前記心筋トロポニンが心筋トロポニンＩである、請求項８２に記載のキット。
【請求項８５】
説明書をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８６】
固体支持体に結合される前記心筋トロポニンＩについての捕捉抗体を含む組成物をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８７】
前記固体支持体がマイクロタイタープレートまたは常磁性微小粒子を含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
洗浄用緩衝液、アッセイ用緩衝液、溶出用緩衝液、およびキャリブレーター用希釈液からなる群から選択される構成要素をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８９】
前記心筋トロポニンの標準品をさらに含む、請求項８２に記載のキット。
【図５】ｃＴｎＩの生物学的閾値（切捨て濃度）が、１０％の対応するＣＶにより９９パーセンタイルで確立された７ｐｇ／ｍｌのｃＴｎＩ濃度にあることを示す図である。
【図６】本発明のアナライザーシステムを用いて決定されたｃＴｎＩのアッセイ結果と、米国国立標準技術研究所によって提供された標準品測定値との相関（Ｒ２＝０．９９９９）を示す図である。
【図７】救急室において胸部痛を示した患者から得られた連続血清試料中のｃＴｎＩの検出を示す図である。本発明のアナライザーシステムで行われた測定と、市販の入手できるアッセイによって行われた測定との比較を示す図である。
【図８】ｃＴｎＩの正常な（非虚血）生物学的濃度および胸部痛を示す患者から得られた血清試料中のｃＴｎＩ濃度の分布を示す図である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図６】本発明のアナライザーシステムを用いて決定されたｃＴｎＩのアッセイ結果と、米国国立標準技術研究所によって提供された標準品測定値との相関（Ｒ２＝０．９９９９）を示す図である。
【図７】救急室において胸部痛を示した患者から得られた連続血清試料中のｃＴｎＩの検出を示す図である。本発明のアナライザーシステムで行われた測定と、市販の入手できるアッセイによって行われた測定との比較を示す図である。
【図８】ｃＴｎＩの正常な（非虚血）生物学的濃度および胸部痛を示す患者から得られた血清試料中のｃＴｎＩ濃度の分布を示す図である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５３２７０１（Ｐ２００９−５３２７０１Ａ）
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４３０３（Ｐ２００９−５０４３０３）
【出願日】平成１９年４月４日（２００７．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１４９４７
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０８２９６３４７）シングレックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月４日（２００７．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１４９４７
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０８２９６３４７）シングレックス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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