トール様レセプター１４（ＴＬＲ１４）及びそれらの使用
【課題】トール様レセプター活性を有する単離されたポリペプチド又は変異体又はそれらの断片の提供。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該ポリペプチドはＴＬＲ１４活性を示す。ＴＬＲ１４はさまざまなリガンドを認識し、免疫及び炎症性遺伝子の誘導を導く一連のシグナル伝達経路を活性化する。本発明のペプチドと相互作用する又は結合する、及び／又はその生物学的機能又は活性又は別の物質のそれらを妨害するペプチド又は化学化合物のような物質を、スクリーニングする又は探索する方法。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、該ポリペプチドはＴＬＲ１４活性を示す。ＴＬＲ１４はさまざまなリガンドを認識し、免疫及び炎症性遺伝子の誘導を導く一連のシグナル伝達経路を活性化する。本発明のペプチドと相互作用する又は結合する、及び／又はその生物学的機能又は活性又は別の物質のそれらを妨害するペプチド又は化学化合物のような物質を、スクリーニングする又は探索する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
序論
トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、炎症及び細菌感染への宿主応答に中心的役割を果たしている。ＴＬＲファミリーのメンバーは、トール−ＩＬ−ＩＲ（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる細胞質ドメイン及び一連のロイシンリッチリピートから成る細胞外領域により特徴付けられる。多様な微生物成分によるトール様レセプターの占拠は、誘導可能シクロオキシゲナーゼ、接着分子及びケモカインのような多数の炎症誘発性タンパク質の発現を導く。ヒトＴＬＲは現在同定されている。最初に発見されたＴＬＲ、ＴＬＲ４は細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）への応答のためには必須である（１、２）。ＴＬＲ２はＴＬＲ１及び６とカップルして、各々ジアシル−及びトリアシル−リポペプチドを認識する。ＴＬＲ５は細菌フラゲリンを認識し及び応答し（３）、そしてＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡ中に存在するメチル化されていないＣｐＧモチーフの認識に必要とされる（４）。ＴＬＲ１１、１２及び１３は最近マウスにおいて記述されてきたが、ヒトオルソログは見いだされていない（５、６）。適切なリガンドによるＴＬＲの刺激は、転写因子ＮＦ−κＢの活性化、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／ｐ４４の活性化も導く。
【０００２】
ＮＦ−κＢの活性化は、細胞質ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質、ＭｙＤ８８に依存する（７、８、９）。ＭｙＤ８８は、アダプタータンパク質ＴＲＩＦを動員するＴＬＲ３を除く全ＴＬＲファミリーに対してアダプタータンパク質として働く（１０）。ＮＦ−κＢを活性化することに加えて、ＴＲＩＦは転写因子インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）に依存する遺伝子の誘導にも必要とされる（１１）。この経路は、ＭｙＤ８８依存経路と称され、ウイルス起源の病原体を避けるために重要であることが示されている（１２）。別のＴＩＲアダプタータンパク質、ＭｙＤ８８アダプター様（ＭａＩ、ＴＩＲＡＰとしても知られている）は、ＭｙＤ８８依存経路に含まれており（１３、１４）、そしてＴＬＲ２及びＴＬＲ４仲介シグナル伝達に特異的に必要とされている（１５、１６）。
【０００３】
感染の間、多様なリガンドによるＴＬＲの占拠は、サイトカイン及びケモカインのような炎症性メディエーターの産生及び免疫エフェクター細胞の活性化を導く。この協調化された応答は侵入している病原体を取り除くために計画されているが、多くの例において、細菌産物は宿主由来のメディエーターの制御されていないネットワークを活性化し、それは多器官不全、心血管虚脱及び最終的に死を導くことができる。敗血症と称されるこの状態は、病院の集中治療室における死亡の主原因であり、世界中で増加し続けている。それ故、ＴＬＲタンパク質に対するアンタゴニストは、過敏性免疫応答の有害な効果を相殺するために有用な手段であろう。ＴＬＲ４シグナル伝達の妨害は、ＬＰＳの毒性効果を相殺する手段として綿密に試験されている。現在の療法には、ＴＬＲ４及びその共働レセプターＣＤ１４に対する抗体、及び該レセプターへの結合についてＬＰＳと競合する合成リピドＡ類似体を中和することが含まれる（１７、１８）。
【０００４】
敗血症に加え、療法は、ウイルス感染と戦う手段として他のＴＬＲも目標にしている。例えば、ＴＬＲ７アゴニスト、イミキモドがヒトパピローマウイルスにより引き起こされる性器ヘルペスの治療に成功裡に使用されてきた（１９）。自己免疫疾患の場合において、ＴＬＲアゴニストは、適応Ｔｈ２応答を、アレルギーの発生を防止するであろうＴｈ１免疫応答にシフトさせる手段と考えられている。より長期の目標には、ＴＬＲシグナル伝達経路の下流構成要素での薬物療法学の開発が含まれるであろう。それ故、ＴＬＲシグナル伝達のすべての側面を完全に理解することが重要である。
【０００５】
ＴＬＲファミリーのさらなるメンバー、及びＴＬＲシグナル伝達経路の側面の同定は、有益な薬学的可能性を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-2088 (1998).
【非特許文献２】Qureshi, S.T. et al. J.Exp.Med. 189, 615-625 (1999).
【非特許文献３】Hayashi, F. et al. Nature 410, 1099-1103(2001).
【非特許文献４】Hemmi, H. et al. Nature 408, 740-745 (2000).
【非特許文献５】Zhang, D. et al. Science 303, 1522-1526 (2004).
【非特許文献６】Tabeta, K. et al. PNAS 101, 3516-3521 (2004)
【非特許文献７】Hemmi, H. et al. Nature Immunol. 3, 196-200 (2002).
【非特許文献８】Adachi, O. et al. Immunity 9, 143-150 (1998).
【非特許文献９】Takeuchi, O. et al, J.Immunol. 164, 554-557 (2000).
【非特許文献１０】Yamamoto, M. et al. J Immunol. 169, 6668-72 (2002).
【非特許文献１１】Kaisho, T. et al. J.Immunol. 166, 5688-5694 (2001).
【非特許文献１２】Servant, MJ. et al. J. Biochem. Pharmacol. 64, 985-992 (2002).
【非特許文献１３】Fizgerald, K.A. et al. Nature 413, 78-83(2001).
【非特許文献１４】Horng, T. et al. Nature Immunol. 2, 835-841 (2001).
【非特許文献１５】Yamamoto, M. et al. Nature 420, 324-329 (2002).
【非特許文献１６】Horng, T. et al. Nature 420, 329-33(2002).
【非特許文献１７】Axtelle, T. & Pribble, J. J. Endotoxin Res. 7, 310-314 (2001).
【非特許文献１８】Lynn, M. et al. J Infect Dis. 187, 631-639 (2003).
【非特許文献１９】Berman, B. Int. J. Dermatol. 29, 7-11 (2002).
【非特許文献２０】Smith, R. et al. Genome Res. 6, 454-462 (1996).
【非特許文献２１】Quandt, K. et al. Nucleic Acids Res. 23, 4878-4884 (1995).
【非特許文献２２】Xu, Y. et al. Nature 408, 111-5 (2000).
【発明の概要】
【０００７】
本発明に従うと、配列番号１のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む単離されたポリペプチドが提供される。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む単離されたポリペプチドも提供する。
【０００８】
本発明の一つの態様において、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、変異体は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の一つの態様において、変異体は欠失又は挿入修飾を含む。該変異体は、翻訳後修飾も含むことができる。
本発明の一つの態様において、該断片は、配列番号１又は２の少なくとも１２の連続したアミノ酸を含むペプチドである。
【００１０】
本発明の一つの態様において、本明細書で前に記載したポリペプチドは、トール様レセプター活性を示す。該トール様レセプターはＴＬＲ１４活性であることができる。
本発明の一つの態様において、該ポリペプチドは免疫調節活性を示す。
【００１１】
本発明は、本明細書で前に記載したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
本発明はさらに、配列番号３の核酸配列又はその変異体又は断片、又はそれらと相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号４の核酸配列又はその変異体又は断片、又はそれらと相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、配列番号３又は４の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含む。
本発明の別の態様において、該断片は配列番号３又は４の少なくとも１７の連続した核酸を含む。
【００１３】
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、前記セグメントをコードする天然ｃＤＮＡと少なくとも８０％の同一性を示す。
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、トール様レセプター又はペプチド又はそれらの融合タンパク質をコードする。
【００１４】
本発明は、配列番号３、配列番号４の核酸配列又は変異体又はそれらの断片、又はそれらと相補的な配列を含む組換え核酸も提供する。
本発明はさらに、配列番号１又は２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む精製されたタンパク質又はペプチドを提供する。好ましくは、該タンパク質又はペプチドの断片は、配列番号１又は２の少なくとも１２の連続するアミノ酸を含む。
【００１５】
本発明の一つの態様において、該タンパク質又はペプチドは哺乳類起源である。該タンパク質はヒト起源であることができる。
本発明の一つの態様において、該タンパク質又はペプチドは、少なくとも１００ｋＤａの分子量を有する。該タンパク質又はペプチドはグリコシル化形態であることができる。
【００１６】
本発明の一つの態様は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質又はペプチドを提供する。
本発明のタンパク質又はペプチドは、トール様レセプター官能性／活性を示すことができる。
【００１７】
本発明は、配列番号１又は２又は変異体又はそれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質も提供する。該タンパク質はトール様レセプタータンパク質、特にＴＬＲ１４であることができる。
【００１８】
本発明は、本発明のタンパク質又はペプチドの抗原性断片も提供する。
本発明は、本明細書において前に記載したポリヌクレオチドを含む組換えベクターも提供する。本発明は、該組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明はさらに、活性成分として該組換えベクターを含む遺伝子療法剤を提供する。
【００１９】
本発明の一つの側面は、本明細書において前に記載したポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。
本発明は：
配列番号１又は２のアミノ酸配列又はそれらの断片又は変異体を含むタンパク質；及び
検出又は精製タグ；
のいずれか一つ又はそれより多くを含む融合化合物又はキメラ分子も提供する。
【００２０】
本発明の一つの態様において、該検出又は精製タグは、ＦＬＡＧ配列、Ｈｉｓ６配列、Ｉｇ配列及び別のレセプタータンパク質の異種ポリペプチドのいずれか一つ又はそれより多くから選択される。
【００２１】
本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列及びＴＬＲリガンドを含む、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含むリガンド／レセプターも提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンドはＣｐＧ核酸である。
【００２２】
本発明は、本明細書において前に記載したタンパク質の抗原決定基を含む免疫原も提供する。
本発明はさらに、本明細書において前に記載したポリペプチド又はタンパク質又はペプチドのエピトープに特異的に結合する、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそれらの断片を提供する。該抗体は、固定化された形態で調製することができる。該抗体は、ビーズ、磁性ビーズ、スライド又は容器へのコンジュゲーション又は付着により固定することができる。該抗体は、臭化シアン活性化セファロースへ固定化させる、又はグルタルアルデヒド架橋有り又は無しでポリオレフィン表面へ吸着させることができる。
【００２３】
本発明は、トール様レセプター活性を変調する化合物を同定するための方法も提供し、それは：
配列番号１又は２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含むポリペプチドと試験サンプルを接触させること；
トール様レセプター活性のマーカーについてモニターすること；及び
トール様レセプター活性を変調する化合物を同定すること；
の工程を含む。
【００２４】
本発明の一つの態様において、該トール様レセプター活性のマーカーは：
（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化
（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は
（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン
のいずれか一つ以上を含む。
【００２５】
一つの態様において、該方法は、各（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも２つの、試験サンプルと比べた量の相違を決定する工程を含む。
別の態様において、該方法は、各（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも３つの、試験サンプルと比べた量の相違を決定する工程を含む。
【００２６】
一つの場合において、試験サンプルのタンパク質と比べた量が決定される。もしくは、核酸マイクロアレイを使用して試験サンプルのｍＲＮＡと比べた量が決定される。トール様レセプター活性はＴＬＲ１４活性であることができる。
【００２７】
本発明の一つの態様において、ＴＬＲ活性を活性化する、又は阻害する化合物は：
（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化
（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は
（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン
の少なくとも一つ以上の、試験サンプルと比較した量、発現、活性又はリン酸化を決定することにより同定される。
【００２８】
別の態様において、ＴＬＲ活性を変調することが可能な化合物は、本明細書において前に記載した方法により同定される。
本発明は、本発明の化合物及び薬学的に許容できる坦体を含む医薬組成物も提供する。
【００２９】
本発明は：配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むＴＬＲ１４ポリペプチド又は配列番号３又は４の核酸を含むポリヌクレオチドの活性を変調する試薬又は化合物；及び
薬学的に許容できる坦体；
を含む医薬組成物も提供する。
【００３０】
本発明の一つの態様において、試薬はＴＬＲ１４アゴニスト又はアンタゴニストである。
好ましくは、坦体化合物は、水、塩水及び緩衝液のいずれか一つ以上から選択される水性化合物である。該組成物は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与の形態であることができる。
【００３１】
本発明の一つの態様において、該化合物又は組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、ＣＮＳ疾患、腫瘍性疾患及び感染性疾患及び／又は免疫仲介障害のいずれか一つ以上の治療のための医薬の製造において使用される。
【００３２】
本発明の一つの態様において、障害は、感染、外傷又は損傷、慢性炎症性疾患、移植片拒絶又は移植片対宿主疾患、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、タイプ１糖尿病又は関節リウマチ、喘息又はアトピー疾患及びアレルギー性脳脊髄炎により誘発された敗血症又は急性炎症のいずれか一つ以上から選択される。
【００３３】
他の免疫仲介障害には、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、アテローム性動脈硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群に二次的な乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬合反応によるアレルギー応答、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー喘息、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮症、鞘膜炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、突発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイド症、原発性胆汁性肝硬変、後部葡萄膜炎、間質性肺線維症、アルツハイマー病又は小児脂肪便症のいずれか一つ以上が含まれる。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するＴＬＲ１４ポリペプチド又は変異体に対するアゴニスト又はアンタゴニストを提供する。
本発明は、細胞と哺乳類ＴＬＲ１４のアゴニスト又はアンタゴニストを接触させることを含む、細胞又は組織培養細胞の生理機能又は発育を変調する方法も提供する。
【００３５】
本発明はさらに、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する又は促進することが可能な化合物をスクリーニングする方法を提供し：
本明細書において前に記載したタンパク質をコードする遺伝子、及びＮＦ−κＢの活性化に付随する検出可能なシグナルを提供する成分を有する細胞を提供すること；
形質転換細胞中の遺伝子の発現を提供する条件下で形質転換細胞を培養すること；
形質転換細胞とスクリーニングのための一つ又はそれより多くの化合物を接触させること；
検出可能なシグナルを測定すること；及び
検出可能なシグナルを測定することにより活性化剤化合物又は阻害剤化合物を単離すること又は同定すること；
の工程を含む。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、医薬化合物として単離された又は同定された化合物を最適化することの工程を含む。
本発明は、トール様レセプター活性を変調することが可能な化合物をスクリーニングするためのキットも提供し：
本発明のタンパク質をコードする遺伝子、及びＮＦ−κＢの活性化により検出可能なシグナルを提供する成分を有する細胞；
検出可能なシグナルを測定するための試薬；
を含む。
【００３７】
本発明の一つの態様において、遺伝子はトール様レセプターＴＬＲ１４をコードする。
本発明は、免疫性又は炎症性障害の治療のための医薬の製造における、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するＴＬＲ１４の活性を阻害することができる配列番号１又は２のアミノ酸配列の断片又は変異体を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００３８】
本発明は、アジュバント又はワクチン製剤の製造における、本明細書において前に記載したポリペプチド、ポリヌクレオチド又は化合物の使用も提供する。
本発明は哺乳類レセプター、トール様レセプター１４（ＴＬＲ１４）及びその生物学的活性に関する。それは該ポリペプチドをコードする核酸、及びその生産及び使用のための方法を含む。本発明の核酸は、本明細書に含まれているクローン化相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列とのそれらの類似性により一部特徴付けられる。
【００３９】
特定の態様において、本発明は、配列番号１又は２と少なくとも１２アミノ酸にわたって同一性を示す実質的に純粋な又は組換えＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド、配列番号１又は２のＴＬＲ１４の天然配列、ＴＬＲ１４配列組成物を含む融合タンパク質：新規ＴＬＲ（ＴＬＲ１４）の群より選択される組成物を含む。具体的態様において、組成物は、配列番号１又は２の成熟配列を含むか、又は翻訳後修飾を欠いており、又は組成物は、ヒトのような霊長類を含む哺乳類から選択される温血動物からのものであり、配列番号１又は２の少なくとも一つのポリペプチドを含んでなり；グリコシル化されており、天然のグリコシル化で少なくとも１００ｋＤａの分子量を有し、合成ポリペプチドであり；別の化学部分にコンジュゲートされており；天然配列よりも５分の１の置換しかなく又は天然配列からの欠失又は挿入変異体である、タンパク質又はペプチドであることができる。具体的態様において、ＴＬＲ、ＴＬＲの抗原性断片、ＴＬＲに対する抗体、ＴＬＲに対する抗体断片、ＴＬＲリガンドに対する抗体が固定化された形態を含む。固定化は、ビーズ、磁性ビーズ、スライド又は容器へのコンジュゲーション又は付着によるものであることができる。固定化は、当該技術分野では公知の方法による臭化シアン活性化セファロースへの固定化、又はグルタルアルデヒド架橋有り又は無しでのポリオレフィン表面への吸着であることができる。
【００４０】
他の態様は、滅菌ＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド又はＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド及び担体を含んでなり、担体は水、塩水及び／又は緩衝液を含む水性化合物であり、及び／又は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与のために製剤されている。
【００４１】
特定の融合タンパク質態様において、本発明は、配列番号１又は２の成熟タンパク質配列、ＦＬＡＧ又はＨｉｓ６又はＩｇ配列を含む検出又は精製タグ；又は別のレセプタータンパク質配列を含む融合タンパク質を提供する。
【００４２】
多様なキット態様は、ＴＬＲ１４タンパク質又はポリペプチド、及び：タンパク質又はポリペプチドを含むコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）；及び／又はキット中の試薬の使用又は廃棄のための説明書、を含むキットを含む。
【００４３】
結合化合物態様は、ＴＬＲ１４タンパク質に特異的に結合する抗体からの抗原結合部位を含むものを含み、該タンパク質は霊長類タンパク質であり；結合化合物はＦｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ２断片であり；結合化合物は別の化学部分又は抗体にコンジュゲートされており；配列番号１又は２の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して産生され；成熟ＴＬＲ１４に対して産生され；精製ヒトＴＬＲ１４に対して産生され；免疫選択されており；ポリクローナル抗体であり；変性ＴＬＲ１４に結合し；少なくとも３０μＭの抗原に対するＫｄを示し；ビーズ又はプラスチック膜を含む固体基質に結合されており；滅菌組成物中にあるか又は放射性又は蛍光ラベルを含む検出可能なようにラベルされている。結合組成物キットは多くの場合、結合化合物及び前記結合化合物を含むコンパートメント；及び／又は試薬の使用又は廃棄のための説明書をキット中に含む。多くの場合、キットは定性的又は定量的分析を行うことが可能である。
【００４４】
例えば、免疫原性量の霊長類ＴＬＲ１４で免疫系を免疫化することを含む抗体を作製する方法、又はこうした抗体と哺乳類ＴＬＲ１４タンパク質又はペプチドを接触させ、それにより抗原／抗体複合体を形成させることを含む抗原／抗体複合体を産生する方法が提供される。
【００４５】
当該技術分野で普通に実践される免疫化法を使用することができ、それは文献に詳しく記載されている。
他の組成物には、滅菌結合化合物又は結合化合物及び担体を含む組成物が含まれ、該担体は水、塩水及び／又は緩衝液を含んでいる水性であり、及び／又は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与のために製剤されている。
【００４６】
核酸態様には、ＴＬＲ１４又はペプチド又は融合タンパク質をコードする、単離された又は組換え核酸が含まれ、該ＴＬＲは哺乳類からのものであり；又は配列番号３又は４の抗原性ペプチド配列をコードし；複数の配列番号３又は４の抗原性ペプチド配列をコードし；配列番号３又は４からの少なくとも１７連続するヌクレオチドを含んでなり、前記セグメントをコードする天然ｃＤＮＡと少なくとも８０％の同一性を示し；発現ベクターであり；さらに複製の起点を含んでなり；天然起源であり；放射性ラベル、蛍光ラベル又は免疫原性ラベルのような検出可能なラベルを含んでなり；合成ヌクレオチド配列を含んでなり；６ｋＢ未満、好ましくは３ｋＢ未満であり；霊長類を含む哺乳類からであり；天然完全長コード配列を含んでなり；前記ＴＬＲをコードする遺伝子のためのハイブリダイゼーションプローブであり；又はＰＣＲプライマー、ＰＣＲ生成物又は変異誘発性プライマーである。こうした組換え核酸を含む細胞、組織又は器官も提供される。好ましくは、細胞は原核細胞；真核細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；マウス細胞；哺乳類細胞；霊長類細胞又はヒト細胞である。こうした核酸、及び前記核酸を含むコンパートメント；さらに霊長類ＴＬＲ１４タンパク質又はポリペプチドを含むコンパートメント；及び／又はキットの試薬の使用又は廃棄についての説明書；を含むキットが提供される。多くの場合、キットは定性的又は定量的分析を行うことが可能である。
【００４７】
リガンド／レセプター複合体を生成させる方法も提供され、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含む実質的に純粋なＴＬＲ１４と候補ＴＬＲリガンドを接触させることを含んでなり、それにより前記複合体が形成されることを可能にする。
【００４８】
ＴＬＲリガンドとは、ＴＬＲポリペプチド、この場合ＴＬＲ１４ポリペプチドに特異的に結合する分子を指している。ほとんどの場合、ＴＬＲリガンドは、適した条件下でＴＬＲと接触させた場合、ＴＬＲシグナル伝達も誘導するであろう。
【００４９】
本発明は、細胞又は組織培養細胞の生理学的機能又は発育を変調する方法も提供し、該細胞と哺乳類ＴＬＲ１４のアゴニスト又はアンタゴニスト接触させることを含む。
本発明はマーカーとして以下のマーカーの少なくとも一つを使用し、ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価する方法に関する：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン。
【００５０】
本発明は、（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの細胞又は組織における発現、量、活性又はリン酸化を改変する試薬の使用にも関する。
【００５１】
本発明は新規ＴＬＲ１４タンパク質の発見、及びＴＬＲ１４の阻害及び活性化が（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの活性化を導くことが可能なシグナル分子の量、発現、活性又はリン酸化を決定することにより検出することが可能であることに基づいている。
【００５２】
本発明の一つの態様は、（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの、試験サンプルに対するレベルの相違を決定することにより、ＴＬＲ１４活性化又は阻害の効果をモニタリングするための方法を提供する。
【００５３】
本明細書で使用される「レベル」には、限定されるわけではないが、タンパク質の量、ｍＲＮＡの発現量、遺伝子活性、タンパク質活性及びリン酸化の量が含まれる。
試験サンプルは、限定されるわけではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ホルモン及び小分子を含むことができる。試験化合物は、基準免疫賦活性核酸の変異体も含むことができる。これらは天然核酸源、ゲノム核又はミトコンドリアＤＮＡ又はｃＤＮＡから得られても、又は合成物（例えば、オリゴヌクレオチド合成により生成される）であってもよい。
【００５４】
それ故、一つの側面において、本発明はＴＬＲ１４活性を活性化する又は阻害する試薬を同定する又は評価するための方法に関し、以下のマーカー：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン；の少なくとも一つの、試験サンプルに対する量、発現、活性又はリン酸化の相違を決定することを含む。
【００５５】
別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
本発明の一つの態様において、ｍＲＮＡの試験サンプルに対する量の相違が決定され、及び、例えば、核酸マイクロアレイの使用により決定することが可能である。
【００５６】
本発明の一つの態様において、タンパク質の試験サンプルに対する量の相違が決定される。
本発明の別の側面は、ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価するための方法に関し、前記方法は：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン、を含む。別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
【００５７】
ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価するための方法の好ましい態様において、前記方法は：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン、を含む。別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
【００５８】
配列相同性
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２に示したヒト配列である。配列番号３のＤＮＡによりコードされているアミノ酸の配列は配列番号１に示されている。配列番号４のＤＮＡによりコードされているアミノ酸の配列は配列番号２に示されている。
【００５９】
一つより多くのコドンが同一のアミノ酸をコードすることが可能である遺伝子コードの既知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号３に示されたものから変化することが可能であり、そしてそれでもなお配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。こうした変異体ＤＮＡ配列はサイレント変異を生じることができるか（ＰＣＲ増幅の間に生じる）、又は天然配列の計画的な変異誘発の生成物であることが可能である。
【００６０】
本発明はそれ故、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ（ｂ）配列番号３のポリペプチドをコードするＤＮＡ（ｃ）中ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に定義したＤＮＡに対する遺伝子コードの結果として縮重している及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、から選択される、本発明のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドは本発明に包含される。
【００６１】
本発明はそれ故、（ａ）天然哺乳類インターフェロンアルファ１４アレルｃ遺伝子のコード領域から誘導されたＤＮＡ；（ｂ）配列番号３のＤＮＡ；（ｃ）中ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び生物学的に活性なインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡ；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に定義したＤＮＡに対する遺伝子コードの結果として縮重している及び生物学的に活性なインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡ；から選択される、生物学的に活性なヒトインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードする均等で単離されたＤＮＡを提供する。
【００６２】
本明細書で使用される中ストリンジェントの条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて当業者は容易に決定することが可能である。基本的条件は、Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) に示されている。高ストリンジェントの条件も、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて当業者は容易に決定することが可能である。
【００６３】
本発明の態様としてまた含まれるものは、不活性化Ｎ−グリコシル化部位（単数又は複数）、不活性化プロテアーゼプロセシング部位（単数又は複数）又は保存的アミノ酸置換（単数又は複数）を含むポリペプチド断片及びポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００６４】
別の態様において、本発明の核酸分子は、天然の配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列も含む。核酸分子が、天然の配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一である配列を含む態様も企図される。
【００６５】
パーセント同一性は、目視検査及び数学的計算により決定することができる。もしくは、二つの核酸配列のパーセント同一性は、Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) により記載され、及びUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定することが可能である。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性に対して１及び非同一性に対して０の値を含んでいる）、及びSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979 に記載されているＧｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ、Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986 、の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー及び各ギャップ中の各シンボルについての追加の０．０１ペナルティー；及び（３）末端ギャップについてはペナルティー無し、が含まれる。配列比較の技術分野で当業者により使用されている他のプログラムも使用することができる。
【００６６】
本発明は、ポリペプチドの生成において有用な単離された核酸も提供する。こうしたポリペプチドは多数の慣用技術のいずれかにより調製することができる。インターフェロンアルファ１４ポリペプチド又はそれらの望まれる断片をコードするＤＮＡ配列を、ポリペプチド又は断片の生成のための発現ベクター内にサブクローン化することができる。ＤＮＡ配列を、適したリーダー又はシグナルペプチドをコードする配列内に都合よく融合する。もしくは、所望の断片を既知の技術を使用して化学的に合成することができる。ＤＮＡ断片は、完全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によっても生成することができ、アガロースゲル上での電気泳動により単離される。必要なら、所望のポイントに５’又は３’末端を再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化により発生したＤＮＡ断片に結合させることができる。こうしたオリゴヌクレオチドは、所望のコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有し、及びコード配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を位置させることができる。
【００６７】
公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離する、又は増幅するために使用することができる。該ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを５’及び３’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドは、発現ベクター内への増幅されたＤＮＡ断片の挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を追加的に含有することができる。ＰＣＲ技術は、Saiki et al, Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989),pp. 189-196; 及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990) 、に記載されている。
【００６８】
本発明は、天然に存在する又は組換えＤＮＡ技術を含む方法のような多様な技術を介して生成されるものを含む多様な形態のポリペプチド及びそれらの断片を包含する。例えば、インターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発を含むインビトロ変異誘発及びインビトロ核酸合成により配列番号３から誘導することが可能である。こうした形態には、限定されるわけではないが、誘導体、変異体及びオリゴマー、ならびに融合タンパク質又はそれらの断片が含まれる。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、配列番号１の核酸配列によりコードされる完全長タンパク質を含む。特に好ましいポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドは膜に結合されていてもよいし、又は分泌されていても、それ故可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌されていることができる。一般に、可溶性ポリペプチドは、培養培地から所望のポリペプチドを発現する無傷の細胞を分離すること（例えば、遠心分離により）、及び所望のポリペプチドの存在について培地（上清）をアッセイすることにより同定すること（及び非可溶性膜結合対応物と区別すること）ができる。培地中のポリペプチドの存在は、該ポリペプチドが細胞から分泌され、及びそれ故タンパク質の可溶性形であることを示している。
【００７０】
異なる長さのポリペプチド断片も本明細書において提供される。天然に存在する変異体ならびにポリペプチド及び断片の誘導された変異体も本明細書において提供される。
本発明はさらに医薬組成物に関する。該組成物は：（ａ）ＴＬＲ１４ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を変調する試薬及び（ｂ）薬学的に許容できる坦体を含む。該試薬はＴＬＲ１４アゴニスト又はアンタゴニストであることができる。該組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系疾患、腫瘍性疾患及び感染性疾患のような疾患を治療するために使用することができる。
【００７１】
当業者は、医薬担体の選択には生理学的に適した化合物が含まれること、及び化合物の選択が投与経路及び意図された投与計画に依存することを理解するであろう。
治療／療法
本明細書において使用される用語「治療」とは、ヒト又は非ヒト動物に利益となることが可能であるいずれかの治療法を指す。該治療は、存在している状態に関していてもよいし、又は予防的であってもよい（予防的治療）。治療は、治療的、軽減的又は予防的効果を含むことができる。
【００７２】
より具体的には、「療法的」及び「予防的」治療への本明細書での言及は、その最も広い前後関係で考えられるべきである。用語「療法的」は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味するわけではない。同様に、「予防的」は、対象が最終的に疾患状態にはならないであろうことを必ずしも意味するわけではない。
【００７３】
従って、療法的及び予防的治療には、特定状態の徴候の寛解、又は特定状態を発生する危険性を防止する又はさもなくば軽減することが含まれる。用語「予防的」は、特定状態の重度又は発症を軽減することと考えることができる。「療法的」は、存在している状態の重度を軽減することもできる。
【００７４】
本発明は、特に示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の一般に使用される技術を含む方法を記載しており、それらのすべては当該分野で十分に記述されている。
【００７５】
本発明はさらに、哺乳類細胞から調製された細胞及び組織抽出物で同定された又は精製された、ＴＬＲ１４の内在性リガンド（単数又は複数）に関する。
本発明はさらに、ＴＬＲ４シグナル伝達の変調に関し、ＴＬＲ１４はＴＬＲ４シグナル伝達を促進する又は阻害する。
【００７６】
本発明に従ったペプチドは、該ペプチドの活性又は機能に影響する又は変調する分子のスクリーニングに使用することができる。こうした分子とペプチドの相互作用は、療法的及び予防的状況で有用であることができる。
【００７７】
新規薬剤の同定を導く医薬品研究は、先導化合物が発見される前又はさらには後の両方で、非常に多数の候補物質のスクリーニングを含むことがよく知られている。こうした手段は、癌を治療すること及び予防することに有用な可能性を有する物質のスクリーニングに有用である。ポリペプチドの変調剤として同定された物質は、インビボ使用のための療法剤の設計及び研究のための基礎を提供するので、これらの領域の療法における進歩を意味する。
【００７８】
多様なさらなる側面において、本発明はスクリーニング及びアッセイ方法、及びそれらにより同定された物質に関する。
それ故、本発明のさらなる側面は、本発明のペプチドと相互作用する又は結合する、及び／又はその生物学的機能又は活性又は別の物質のそれらを妨害するペプチド又は化学化合物のような物質を、スクリーニングする又は探索する及び／又は入手する又は同定することにおける、本発明のペプチド（それらの断片及び誘導体を含む）の使用を提供する。例えば、本発明の一つの側面に従った方法は、本発明のペプチドを提供し、それと物質を接触させると、その接触は該ペプチドと該物質間の結合を生じることができる。結合は、定性的及び定量的の両方で、当業者には公知であろうさまざまな技術により決定することができる。
【００７９】
ペプチド機能の変調剤として同定された物質は、天然のペプチド又は非ペプチドであることができる。非ペプチド「小分子」がしばしば多くのインビボ医薬使用に好ましい。従って、物質のミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）又は模倣体（ｍｉｍｉｃ）を医薬使用のために設計することができる。既知の医薬として活性な化合物について模倣体を設計することは、「先導」化合物に基づいた医薬の開発への既知のアプローチである。このことは、活性化合物を合成するのが困難である又は費用がかかる場合、又は投与の特定の方法に対して適切ではない場合（例えば、ペプチドは消化管中でプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるので、経口組成物の活性剤として適切ではない）に望ましい。模倣剤設計、合成及び試験は、目標とする特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用することができる。
【００８０】
所与の目標特性を有する化合物からの模倣体の設計においては、一般にいくつかの工程がとられる。第一に、目標特性の決定において決定的及び／又は重要である化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、このことはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることにより、例えば、各残基を順に置換することにより行うことが可能である。化合物の活性領域を構成するこれらの部分又は残基はその「ファルマコフォア」として知られている。
【００８１】
ファルマコフォアが決定されたら、起源範囲からのデータ、例えば、分光学的技術、Ｘ線回析データ及びＮＭＲを使用して、その物理学的特性、例えば、立体化学、結合、サイズ及び／又は電荷に従ってその構造をモデル化する。コンピューター分析、類似性マッピング（原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷及び／又は容量をモデル化する）及び他の技術も、このモデル化プロセスに使用することが可能である。
【００８２】
このアプローチの変法においては、リガンドの三次元構造及びその結合パラメーターをモデル化する。このことは、リガンド及び／又は結合相手が結合によりコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、モデルが模倣体の設計を考慮することを可能にしている。
【００８３】
次に鋳型分子が選択され、その上にファルマコフォアを模倣する化学基を接ぎ合わせることが可能である。該鋳型分子及び接ぎ合わされた該化学基は、模倣体を合成するのが容易であるように、薬学的に許容できそうであるように、及びインビボで分解されないように、一方、先導化合物の生物学的活性が残るように都合よく選択することが可能である。このアプローチで見出されたミメティック及び模倣体は、それらが目標特性を有しているか、又それらがどの程度それを示すかどうかを見るためにスクリーニングすることが可能である。インビボ又は臨床試験のための一つ又はそれより多くの最終模倣体に達するため、さらなる最適化又は修飾を実施することが可能である。
【００８４】
それ故、本発明のさらなる側面は、本発明の少なくとも一つのペプチドと推定結合分子又は他の試験物質間の結合活性を評価するためのアッセイを提供し、それは、少なくとも一つのペプチドと推定結合分子又は他の試験物質を接触させること、及び少なくとも一つのペプチドと結合分子又は試験物質間の相互作用又は結合を決定すること、の工程を含み、少なくとも一つのペプチドと結合分子間の結合は、少なくとも一つのペプチドの有用性の指標である。
【００８５】
本発明のペプチドと相互作用する物質は、その活性を変調させるために、単離する及び／又は精製する、製造する及び／又は使用することができる。
二つの分子間の結合について試験する本発明のアッセイのため、本発明の全ペプチドを使用する必要はない。当業者には既知のいずれか適した方法で、断片を発生させ及び使用することができる。
【００８６】
さらに、本発明のアッセイの詳細なフォーマットは、日常の技術及び知識を使用し、当業者が変更することもできる。
詳細な説明
我々は、トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーと顕著な相同性を示す新規遺伝子を同定した。細胞に基づいたアッセイにおいて、この新規レセプターは転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３を活性化し、抗ウイルスサイトカイン、ＲＡＮＴＥＳの産生を駆動する。該タンパク質はＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び普遍的ＴＬＲアダプター、ＭｙＤ８８と相互作用する。我々はレセプターＴＬＲ１４と名付けた。
【００８７】
この推定レセプターの発現は、微生物産物、例えば、ＬＰＳにより増強され、それが免疫変調剤として機能することができることを示唆している。このことの裏付けとして、細胞がＴＬＲ１４を発現するベクターでトランスフェクトされた場合、転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３が活性化された。ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の両方が、細菌及びウイルス病原体の除去における中核であるので、ＴＬＲ１４を阻害する又は活性化することは、炎症性疾患の治療について見込みのある新規アプローチである。加えて、高レベルのＴＬＲ１４を血清中に見出した。主としてこのレセプターの外部ドメインを含むＴＬＲ２の可溶型も、血清及び母乳中で見出された。ＴＬＲ２のこの形態は、ＴＬＲ２リガンドに対する活性免疫応答を抑えることにおいて保護的である。完全長ＴＬＲ１４ポリペプチド又はそれ自身の外部ドメインは類似の生物学的特性を有することができ、それ故、潜在的生物療法剤と考えることができる。
【００８８】
ＬＰＳ及びＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素により調節される遺伝子を同定するため、マイクロアレイアプローチを使用した。上記のように、レセプター刺激後、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４からシグナルを伝達するためにはアダプター分子、Ｍａｌが必要とされる。胚性幹細胞中のＭａｌをコードする遺伝子を破壊するため、遺伝子標的化ベクターを使用した。これらの細胞を次ぎにＬＰＳで処理し、ノックアウト及び野生型細胞間の遺伝子発現の相違を測定した。この方法において、トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーと顕著な相同性を示す遺伝子を同定した。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
本発明は、付随する図面に関連して、ほんの一例として与えられたそれらの以下の説明からより明瞭に理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＬＲ１４の染色体位置の略図である。ＴＬＲ１４は線により示されている染色体７上の７ｐｌ５に位置している。それは４．７ｋｂの長さであり、遺伝子ＣＲＥＢ５及びＣＰＶＬが隣接している。転写の方向は矢印により示されている。ＴＬＲ１４は逆平行方向に転写される。この情報はwww.ncbi.nlm.nih.gov のＮＣＢＩウェブサイトから入手可能なヒトゲノムマップビュアーツールを使用して得られた；
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＴＬＲ１４（配列番号１）についてのヌクレオチド配列を示している；
【図１Ｃ】図１Ｃは、マウスＴＬＲ１４（配列番号２）についてのヌクレオチド配列を示している；
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒト（配列番号３）及びマウス（配列番号４）ＴＬＲ１４の予測タンパク質配列を示している。ヒトＴＬＲ１４遺伝子の推定ＯＲＦは、８１１アミノ酸タンパク質をコードし、一方、マウスタンパク質は８０９アミノ酸の長さである。予測Ｎ末端シグナル配列及び膜貫通ドメインには下線が付されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＴＬＲ４及びＴＬＲ１４外側ドメインのアラインメントが示されている。推定ＴＬＲとヒトＴＬＲ４のアラインメントは、二つのレセプター間の高度な配列類似性を明らかにした。少なくとも六つのロイシンリッチリピートを同定することができ、ｂｏｘにより強調されている。
【図２Ａ】図２Ａは、いくつかの組織において発現されたヒトＴＬＲ１４のｍＲＮＡ発現プロフィールである。新規ＴＬＲのヒト及びマウス形についての発現プロフィールはＨＵＧＥタンパク質データベースから入手可能である。該タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’非翻訳領域を標的とするプライマーでＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。発現は試験されたすべての組織で検出され、腎臓；脳及び卵巣において最も高いレベルが生じた。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト組織サンプルにおけるＴＬＲ１４のタンパク質発現プロフィールである。高い発現レベルが脳及び肺で検出された。
【図３】図３は、ＴＬＲ１４とＴＬＲファミリーの他のメンバーの細胞質領域のアラインメントを示している。ＴＬＲ１４と他のＴＬＲファミリーメンバーの細胞質領域のアラインメントは、推定レセプターがＴＬＲに特徴的である類似の領域を共有していることを明らかにしている。特に二つの領域は相同的であり（Ｂｏｘ１及び２）、タンパク質を含有するすべてのＴｌＲドメインのシグナチャー配列と考えられる。ＴＬＲ１４のＢｏｘ２はＴＬＲ３のものと同一である。
【図４】図４は、ヒトＴＬＲ１４の推定プロモーター領域の略図である。ＴＬＲ１４の推定プロモーター領域は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ及びＭａｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して同定した。上記のすべての転写因子は０．８より大きなマトリックススコア＊を有している。＊マトリックススコアは、転写因子マトリックス内の保存ヌクレオチドに相当するプロモーター内の配列がどれほど近いかを測定している。有意な一致は＞０．８である。
【図５】図５は、Ｕ３７３及び初代マウス胚性線維芽細胞においてＬＰＳにより、及びまたＬＰＳで処理したマウスにおいて誘導されたＴＬＲ１４の発現を示している。（Ａ）Ｕ３７３及びＭＥＦは１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで示された時間処理した。ｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを本文中に記載したように実施した。（Ｂ）マウスにＬＰＳを腹腔内注射し、３時間放置した後に屠殺した。ＲＴ−ＰＣＲは対照未処理及びＬＰＳ処理マウスに対して行った。
【図６】図６は、ＴＬＲリガンドでの処理後の細胞におけるＴＬＲ１４タンパク質の発現を示している。（Ａ）ヒトグリオーマ細胞株、Ａ１７２を種々の時間、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（１μｇ／ｍｌ）で処理し、ＴＬＲ１４の発現について探索した。（Ｂ）ＴＬＲ４で安定的にトランスフェクトしたヒトＨＥＫ−２９３細胞を種々の時間ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処理し、ＴＬＲ１４の発現について探索した。（Ｃ）タンパク質抽出物を、対照未処理マウス及びＬＰＳを注射してあるマウスの脳から調製した。抽出物はＴＬＲ１４の発現について探索した。
【図７】図７は、ＴＬＲ１４活性が、ＨＥＫ２９３及びＵ３７３星状細胞腫細胞においてＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥレセプター遺伝子発現を誘導することを示しているグラフである。ＴＬＲ１４活性はＨＥＫ２９３及びＵ３７３星状細胞腫細胞においてＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥルシフェラーゼ活性を駆動する。ＨＥＫ２９３細胞をＮＦ−κＢレセプター構築物ならびに１、５及び１０ｎｇのＴＬＲ１４でトランスフェクトした（Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｓ（Ｂ）及びＵ３７３Ｓ（Ｃ）は、ＩＳＲＥレセプター構築物及び用量を増加させたＴＬＲ１４（１、１０及び１００ｎｇ）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を採取し、相対ルシフェラーゼ活性を決定した。
【図８】図８は、ＴＬＲ１４がＵ３７３星状細胞腫細胞においてＲａｎｔｅｓ産生を駆動することを示しているグラフである。ＲＡＮＴＥＳ産生は、増加させた用量のＴＬＲ１４で２４時間トランスフェクトされたＵ３７３細胞において、酵素結合免疫吸着アッセイにより測定した。データは空ベクターでトランスフェクトした細胞に対しての誘導倍数で表現されている。
【図９】図９は、ＴＬＲ１４とＴＩＲ−ドメイン含有タンパク質ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８との相互作用を示している。（Ａ）ＴＬＲ１４をＦｌａｇ−タグ付けＴＬＲ４、ＴＬＲ２又はレセプターの突然変異形とＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトした。複合体を抗ｆｌａｇビーズで免疫沈降し、抗ＴＬＲ１４抗体で探索した。（Ｂ）ＴＬＲ１４をＭｙｃ−タグ付けＭｙＤ８８とＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトした。複合体をプロテインＡセファロースビーズに結合させた抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、抗ＴＬＲ１４抗体で探索した。
【図１０】図１０は、ＴＬＲ２と内因性ＴＬＲ１４との相互作用を示している。Ｆｌａｇ−タグ付けＴＬＲ２をＨＥＫ−２９３細胞から免疫沈降し、ウエスタンブロットを抗ＴＬＲ１４抗体で探索して、ＴＬＲ２と複合体形成した該内因性タンパク質の存在を検出した。
【図１１】図１１は、ＴＬＲ１４が細胞質中に存在し、血清中にも高レベルで見いだされることを示している。（Ａ）細胞をＬＰＳで刺激した後、細胞質及び膜分画に分離した。分画をＴＬＲ１４の存在について探索した。（Ｂ）１０％ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地をウエスタンブロッティングにかけ、ＴＬＲ１４の存在について探索した。
【図１２】図１２は、示された時点についてＬＰＳの（ｌμｇ／ｍｌ）での細胞刺激に続く、Ｕ３７３培養培地内へのＴＬＲ１４の分泌を示している。分泌されたタンパク質はＴＬＲ１４の完全長形態であるようであり、最大分泌は６時間で生じている。
【実施例】
【００９０】
示された実施例は例示のためのみであり、本発明の範囲内の多様な変更及び修飾が当業者には明らかになるであろう。
材料及び方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３及びＵ３７３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補給したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【００９１】
発現プラスミド
キメラＴＬＲレセプターＣＤ４−ＴＬＲ４はR. Medzhitov (Yale University,New Haven, CT) から贈与された。ＴＬＲ１４ ｃＤＮＡ(KIAA0644)を含有するベクターはKazusa DNA Research Institute から供給され、続いてのＰＣＲクローニングの標的として使用された。使用されたプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶのための制限部位を含んでおり、以下のものであった：5'-GCAAGCTTATGGAGGCTGCCCGCGCCTTG （センス）（配列番号５）；及び5'−GCGATATCGGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGGCAAATCGC （アンチセンス）（配列番号６）。アンチセンスプライマーはトランスフェクト細胞中の翻訳されたタンパク質産物の発現を検出するため、９アミノ酸ヘマグルチニンエピトープタグをコードする配列を含んでいる。生じたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen ）の多クローニング部位内にライゲートした。
【００９２】
Ｍａｌ欠損胚性幹細胞の発生及びマイクロアレイ解析
Ｍａｌをコードする遺伝子を欠く胚性幹細胞は相同的組換えにより発生させた。簡単には、マウス胚性幹細胞に、ネオマイシン耐性カセットでＭａｌ遺伝子が置き換えられたコード配列のほとんどを７００ｂｐエクソンがコードする標的化ベクターを電気穿孔した。標的化細胞をサザンブロッティングにより同定した後、Ｍａｌ欠失についてホモ接合性クローンを発生させるために２回目の標的化にかける。変異体及び野生型細胞を種々の時間、ＬＰＳで刺激し、マイクロアレイ解析のためにＲＮＡを抽出した。
【００９３】
プロモーター分析
ヒトRikenクローンKIAA0644及び隣接領域の完全ヌクレオチド配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov. のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) ウェブサイトから得られた。転写されたヌクレオチド配列及びゲノム配列中のリピート配列の同定は、ＮＩＸアプリケーション（http://menu.hgmp.mrc.ac.uk ）及びプログラムＲｅｐｅａｔ−ｍａｓｋｅｒ（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu ）を使用して実施した（２０）。転写因子結合部位予想はＭａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（www.genomatix.de/cgi- bin/matinspector/matinspector.pl ）を使用して実施した（２１）。
【００９４】
培養細胞からのｍＲＮＡ単離
ｍＲＮＡは、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で種々の時間処理した後、細胞から抽出した。簡単には、処理した細胞をペレット化し、１ｍｌのＴＲＩ試薬（Sigma ）で溶解した。クロロホルム（０．２ｍｌ）をサンプルに加え、混合物を１２，００Ｏｇで１５分遠心分離した。ＲＮＡを含有する水相を除き、等量のイソプロパノールの添加により、混合物から全ＲＮＡを沈澱させた。１２，０００ｇで１０分遠心分離した後、ＲＮＡ含有ペレットを５００μｌの７５％エタノールで洗浄した。エタノールのいずれの痕跡も除去し、ペレットを室温で１０分放置して乾燥させた。ペレットを３０μｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁し、−８Ｏ℃で保存した。
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲをＰｒｏｍｅｇａ ＩｍｐｒｏｍｐｔＩＩ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して実施した。逆転写反応は２工程で実施し、次ぎにＰＣＲ反応を合成されたｃＤＮＡに対して実施した。
【００９５】
工程１：薄壁５００μｌＰＣＲマイクロ遠心チューブ中で、１μｌのランダムプライマーを４μｌのＲＮＡに加えた。遠心チューブを７０℃で５分及び４℃で５分のサーマルサイクラーに置いた。
【００９６】
工程２：成分の第二の組を加えた；１μｌのデオキシヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ混合）（各ｄＮＴＰを５００μＭ）、５．５μｌのＰＣＲ試薬用水、４．０μｌの１０Ｘ緩衝液、３．０μｌの塩化マグネシウム、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（１単位／μｌ）、１μｌのＲＴ（１単位／μｌ）。これでＰＣＲチューブの総容量が２０μｌとなる。チューブを以下の時間及び温度、２５℃で５分、４２℃で６０分、７０℃で１５分、のサーマルサイクラーに置いた。
【００９７】
以下のものを薄壁５００μｌＰＣＲマイクロ遠心チューブに加えた：５μｌの１０Ｘ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰを２００μＭ）、１μｌのＰＣＲプライマー（各々０．４μｌ）、２〜５μｌの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（０．０５単位／μｌ）及びＰＣＲチューブ中の総容量を５０μｌとなすのに十分な量のＰＣＲ試薬用水。増幅温度は以下の通りであった、変性／ＲＴ不活性化（工程１）９４℃で２分、変性（工程２）９４℃で１５秒、アニーリング（工程３）５５℃で３０秒、伸長６８℃で１分（工程２、３及び４を３５回繰り返した）、最終伸長（工程５）６８℃で５分。ＰＣＲ産物を次ぎに１％アガロースゲルで電気泳動し、ＵＶトランスルミナーターで可視化した。
【００９８】
タンパク質発現の検出
推定タンパク質のＣ末端に方向付けられたペプチド抗体は、Eurogentec, Liege Science Park, Belgium で合成された。免疫化に使用されたペプチドは以下のアミノ酸から構成されていた−CGSLRREDRLLQRFAD（配列番号７）。細胞株を、示されたように種々の時間、ＴＬＲリガンドで処理した。冷ＰＢＳの添加により刺激を停止し、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶解した。ウエスタンブロッティングのため、ＴＬＲ１４抗体を、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝化塩水中で１：１０００に希釈した。
【００９９】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞又はＵ３７３細胞を９６ウェルプレートに蒔き（ウェル当たり２ｘ１０４細胞）、次の日、発現ベクター及びレポータープラスミドでトランスフェクトした。「Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（商標）」（Novagen）を、製造元の説明書に従って一過性トランスフェクションに使用した。ＮＦ−κＢ又はＩＲＦ３を含んでいる実験については、８０ｎｇのＮＦ−κＢ−又はＩＳＲ３−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Stratagene ）を、４０ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部対照プラスミド（Promega ）と共に細胞内にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を受動溶解緩衝液（Promega ）に採取し、レポーター遺伝子活性をルミノメーターで測定した。細胞が刺激される場合、ＬＰＳ（Sigma ）を採取に先立った６時間前に、１μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加えた。データは対照レベルに対して平均誘導倍数±ｓ．ｄ．で表現されている（代表的実験については３回の別々の実験から、各々３重に実施した）。
【０１００】
酵素結合免疫吸着アッセイ
Ｕ３７３細胞を、ＴＬＲＨ発現プラスミドの増加させた用量（１、１０及び１００ｎｇ）でトランスフェクトした。細胞は３７℃で２４時間インキュベートした。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の捕獲抗体（マウス抗ヒトＲＡＮＴＥＳ）で被覆した。２４時間後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した。プレートを次ぎに１％ＢＳＡ及び５％スクロース含有ＰＢＳ中、室温で１時間ブロックした。細胞上清（１００μｌ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次ぎに検出抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＲＡＮＴＥＳ）を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でウェルに加えた。プレートを再び室温で２時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを各ウェルに加え、プレートを覆い、室温で２０分インキュベートした。最後に、１００μｌの基質溶液（R&D Systems 、カタログ番号ＤＹ９９９）を加え、続いて５０μｌの停止溶液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）をウェルに加えた。各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１０１】
共免疫沈降アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍのプレートに、１ｘ１０５細胞／ｍｌで蒔いた。次の日、細胞を３μｇのｆｌａｇタグ付けＴＬＲ２、ＴＬＲ４又はＭｙｃ−タグ付けＭｙＤ８８でトランスフェクトした。２４時間後、１％ＮＰ４０を含有するヘペス緩衝液中で細胞を溶解した。細胞溶解物は次ぎにＭ２抗ｆｌａｇアガロースビーズ（Sigma ）とインキュベートした。３時間後、ビーズをヘペス緩衝液で３回洗浄し、２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。タンパク質サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、ウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースに移した。生じたブロットを抗ＴＬＲ１４及び抗ｆｌａｇ抗体で探索した。
【０１０２】
局在化研究
ＬＰＳでの刺激に先立った２４時間前、細胞を１０ｃｍディッシュに１ｘ１０５細胞／ｍｌで蒔いた。膜及び細胞質分画を超遠心により調製し、ＴＬＲ１４の局在化を決定するためＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。１０％ＦＣＳを含有する培地（ＤＭＥＭ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてＴＬＲ１４の存在についてブロットした。
【０１０３】
ＴＬＲ１４をコードする遺伝子の特徴付け
予備的マイクロアレイ解析は、ＭａＩノックアウト細胞において低発現レベルを示す６つの遺伝子を同定した。該遺伝子の５つはある程度特徴付けられていたが、残りの遺伝子は新規であり、そして本明細書において特徴付けられた。この遺伝子の配列は、Kazusa DNA Research Institute (www.Kazusa.or.jp) でのヒトｃＤＮＡプロジェクトの一部として、ＨＵＧＥ（Human Unidentified Gene-Encoded Large Proteins ）タンパク質データベースから入手可能である。以下に概説する理由から、この新規遺伝子をＴＬＲ１４と名付けた。
【０１０４】
我々は、ＮＣＢＩから入手可能なＭａｐ Ｖｉｅｗｅｒツールを使用して、該遺伝子をヒト７番染色体に位置付けした（図１Ａ）。該遺伝子は４．７ｋｂの長さであり、ＣＲＥＢ５及びＣＰＶＬカルボキシペプチダーゼが隣接していた。ヒト及びマウスＴＬＲ１４についてのヌクレオチド配列は、それぞれ図１Ｂ及び１Ｃに示されている。予測されたタンパク質は８１１アミノ酸長であり（図１Ｄ）、すべての膜局在化タンパク質に共通する特色である、Ｎ末端シグナル配列を含有する。推定タンパク質のＮ末端も少なくとも６つのロイシンリッチリピートを含有し、いくつかのＴＬＲの細胞外領域と高度に相同的である（ＴＬＲ４が例として図１Ｅに与えられている）。
【０１０５】
発現プロフィールは、図２Ａに示されているように、脳、腎臓及び卵巣における遺伝子産物の高い存在量を明らかにした（情報はKazusa DNA Research Institute から得られた）。ＴＬＲ１４のＣ末端に対するポリクローナル抗体を発生させた。免疫化に使用したペプチドはアミノ酸CGSLRREDDRLLQRFAD （配列番号７）を含む。抗体は、ヒト脳及び肺組織においておよそ８１ｋＤａのタンパク質を検出した（図２Ｂ）。
【０１０６】
上記のように、ＴＬＲファミリーのメンバーのすべてが細胞質ＴＩＲドメインを含有する。このドメインは約２００アミノ酸に広がり、ファミリーメンバー間で、さまざまな程度の配列類似性を有している。３つの特定のｂｏｘを同定することが可能であり、それはファミリーメンバー間で高度に保存的である。ｂｏｘ１はファミリーのシグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列と考えられ、一方、ｂｏｘ２及び３はシグナル伝達について決定的なアミノ酸を含有する。ＴＬＲｌ及びＴＬＲ２のＴＩＲドメインの結晶構造は、ｂｏｘ２の周囲を中心とするコア構造要素を明らかにした（２２）。ＢＢループと名付けられたこの領域は、暴露された表面パッチ（ｐａｔｃｈ）を形成し、中心的なプロリン又はアルギニン残基を含有する。これらのアミノ酸はループの先端に位置し、下流シグナル伝達成分との接触点を形成する。ＴＬＲ１４の詳細な検査は、それが高度に保存されたｂｏｘ２及び同一視することができるｂｏｘ１及び３（図３）を含有することも明らかにし、この新規タンパク質がＴＬＲスーパーファミリーに属することを示唆している。
【０１０７】
ＴＬＲ１４の発現は、細胞をＴＬＲ２及びＴＬＲ４リガンドで処理した後に誘導される
上記のように、ＬＰＳへの暴露後、Ｍａｌを欠く細胞においてはＴＬＲ１４発現が無効にされる。このことは、問題とする遺伝子がＬＳＰ及びおそらく他のＴＬＲリガンドにより調節されていることを示している。この問題をさらに追求するため、我々はＮＩＸアプリケーション（http://menu.hgmp.mrc.ac.uk ）及びＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（www.genomatix.de/cgi-bin/matinspector/ matinspector.pl）を使用して、ＴＬＲ１４のプロモーター領域及び可能な転写因子結合部位を同定した。機能性ＴＬＲ１４プロモーターはエクソン１近位の４ｋｂ領域内に含まれているようである。この領域のさらなる分析は、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ７及びＥｔｓ−１のようないくつかの転写因子のための推定結合部位を明らかにした（図４）。ＴＬＲ１４ ｍＲＮＡ発現の誘導は、炎症性刺激による細胞の処理に続いてのＲＴ−ＰＣＲにより分析した。図５Ａに示されたように、ＴＬＲ１４ ｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳへの暴露後の時間と共に、脳星状細胞腫細胞（Ｕ３７３）及び初代マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）で誘導された。著しい増加もＬＰＳで処理したマウスの脳から調製されたＴＬＲ１４ ｍＲＮＡのレベルで検出された（図５Ｂ）。発現の誘導は、図６Ａに示されたように、ＴＬＲ２リガンドＰａｍ３Ｃｙｓでの処理後、ヒトグリオーマ細胞株、Ａ１７２中のタンパク質レベルでも検出された。類似の効果が、ＴＬＰ４で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞で、ＬＰＳでの処理後に見られた（図６Ｂ）。加えて、図６Ｃに示されたように、ＴＬＲ１４タンパク質発現の増加が、ＬＰＳを注射したマウスの脳で観察された。
【０１０８】
ＴＬＲ１４は転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３を活性化する
上記のように、ＮＦ−κＢはＴＬＲスーパーファミリーのほとんどのメンバーにより活性化されるが、一方、ＩＲＦ３活性化はＴＬＲ３及びＴＬＲ４に限定されている。ＴＬＲ１４がこれらの因子も活性化し、及び免疫応答を変調することができるかどうかを追求するため、該タンパク質をコードするｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１内にクローン化し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３が結合するＤＮＡの要素を含有するルシフェラーゼレポーター構築物を使用して機能性アッセイを実施した。該タンパク質はヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするタグを含有し、発現は抗ＨＡ抗体を使用して多様な細胞株で発現を検出した（データは示されていない）。ＴＬＲ１４発現プラスミドがκＢ及びＩＳＲＥレポーター構築物とともに細胞内にトランスフェクトされた場合、ルシフェラーゼ活性が増強され（図７）、ＴＬＲ４同様、ＴＬＲ１４がＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の両方を活性化することを示唆している。予備的ＥＬＩＳＡも、ＴＬＲ１４でトランスフェクトした細胞においてＲＡＮＴＥＳ産生（ＩＲＦ３誘導可能サイトカイン）の増加を示した（図８）。
【０１０９】
ＴＬＲ１４はＴＬＲファミリーの他のメンバーと相互作用する
ＴＩＲドメイン含有タンパク質の共通の特色は、他のＴＩＲドメイン含有タンパク質とホモ又はヘテロ二量体形成するそれらの能力である。ＴＬＲ１４が一方又は両方のレセプターと相互作用できるかどうかを決定するため、ＴＬＲ１４及びＴＩＲドメイン含有レセプターＴＬＲ２及びＴＬＲ４で共免疫沈降実験を実施した。図９Ａに示したように、ＴＬＲ１４は過剰発現されたＴＬＲ２及びＴＬＲ４と強く相互作用することを見出した。ＴＬＲのＴＩＲドメイン中の保存的プロリン残基のヒスチジンへの変異はＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用を消滅させることが知られている（２２）。従って、レセプターの変異体（Ｐ／Ｈ）形がＴＬＲ１４と同時発現されると、ＴＬＲ１４とＴＬＲ２か又はＴＬＲ４との相互作用が著しく減少した。図９Ｂに示したように、ＴＬＲ１４は普遍的ＴＩＲドメイン含有アダプターＭｙＤ８８とも相互作用することが見出された。このことは、ＴＬＲ１４がＴＩＲドメイン含有タンパク質であるという考えを支持している。最後に、図１０に示したように、ＴＬＲ２及び内在性ＴＬＲ１４間の相互作用を検出することができた。このことを試験するため、ＨＥＫ２９３細胞をｆｌａｇタグ付けＴＬＲ２でトランスフェクトした。細胞を次ぎに溶解し、ＴＬＲ２及びいずれかの相互作用するタンパク質と免疫沈降させるため、抗ｆｌａｇビーズとインキュベートした。ウエスタンブロッティング後、抗ＴＬＲ１４抗体を使用して、ＴＬＲ１４に相当するバンドを検出することができた。
【０１１０】
ＴＬＲ１４は血清中に高レベルで見出され、可溶性タンパク質として産生することができる
ＴＬＲ１４が原形質膜に局在化されているかどうかを決定するため、細胞分画を調製した。驚いたことに、ＴＬＲ１４は細胞の細胞質分画に見出された（図１１Ａ）。加えて、高レベルの該タンパク質がウシ胎児血清中に見出され（図１１Ｂ）、該タンパク質は可溶性分泌タンパク質であることができることを示唆している。質量分光法的分析は、ＦＣＳ中に存在するバンドは、ヒトＴＬＲ１４のウシ相同体であったことを明らかにした（データは示されていない）。予備的実験も、ＬＰＳでの刺激後、該タンパク質がＵ３７３細胞から分泌されることを示した。分子量が完全長タンパク質の分子量に相当するので、該タンパク質は切断されていないようである。最大分泌は６時間で生じる。
【０１１１】
本発明は、細部にわたって変更することができる、本明細書で上に記載された態様に制限されない。
【背景技術】
【０００１】
序論
トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、炎症及び細菌感染への宿主応答に中心的役割を果たしている。ＴＬＲファミリーのメンバーは、トール−ＩＬ−ＩＲ（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる細胞質ドメイン及び一連のロイシンリッチリピートから成る細胞外領域により特徴付けられる。多様な微生物成分によるトール様レセプターの占拠は、誘導可能シクロオキシゲナーゼ、接着分子及びケモカインのような多数の炎症誘発性タンパク質の発現を導く。ヒトＴＬＲは現在同定されている。最初に発見されたＴＬＲ、ＴＬＲ４は細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）への応答のためには必須である（１、２）。ＴＬＲ２はＴＬＲ１及び６とカップルして、各々ジアシル−及びトリアシル−リポペプチドを認識する。ＴＬＲ５は細菌フラゲリンを認識し及び応答し（３）、そしてＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡ中に存在するメチル化されていないＣｐＧモチーフの認識に必要とされる（４）。ＴＬＲ１１、１２及び１３は最近マウスにおいて記述されてきたが、ヒトオルソログは見いだされていない（５、６）。適切なリガンドによるＴＬＲの刺激は、転写因子ＮＦ−κＢの活性化、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／ｐ４４の活性化も導く。
【０００２】
ＮＦ−κＢの活性化は、細胞質ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質、ＭｙＤ８８に依存する（７、８、９）。ＭｙＤ８８は、アダプタータンパク質ＴＲＩＦを動員するＴＬＲ３を除く全ＴＬＲファミリーに対してアダプタータンパク質として働く（１０）。ＮＦ−κＢを活性化することに加えて、ＴＲＩＦは転写因子インターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）に依存する遺伝子の誘導にも必要とされる（１１）。この経路は、ＭｙＤ８８依存経路と称され、ウイルス起源の病原体を避けるために重要であることが示されている（１２）。別のＴＩＲアダプタータンパク質、ＭｙＤ８８アダプター様（ＭａＩ、ＴＩＲＡＰとしても知られている）は、ＭｙＤ８８依存経路に含まれており（１３、１４）、そしてＴＬＲ２及びＴＬＲ４仲介シグナル伝達に特異的に必要とされている（１５、１６）。
【０００３】
感染の間、多様なリガンドによるＴＬＲの占拠は、サイトカイン及びケモカインのような炎症性メディエーターの産生及び免疫エフェクター細胞の活性化を導く。この協調化された応答は侵入している病原体を取り除くために計画されているが、多くの例において、細菌産物は宿主由来のメディエーターの制御されていないネットワークを活性化し、それは多器官不全、心血管虚脱及び最終的に死を導くことができる。敗血症と称されるこの状態は、病院の集中治療室における死亡の主原因であり、世界中で増加し続けている。それ故、ＴＬＲタンパク質に対するアンタゴニストは、過敏性免疫応答の有害な効果を相殺するために有用な手段であろう。ＴＬＲ４シグナル伝達の妨害は、ＬＰＳの毒性効果を相殺する手段として綿密に試験されている。現在の療法には、ＴＬＲ４及びその共働レセプターＣＤ１４に対する抗体、及び該レセプターへの結合についてＬＰＳと競合する合成リピドＡ類似体を中和することが含まれる（１７、１８）。
【０００４】
敗血症に加え、療法は、ウイルス感染と戦う手段として他のＴＬＲも目標にしている。例えば、ＴＬＲ７アゴニスト、イミキモドがヒトパピローマウイルスにより引き起こされる性器ヘルペスの治療に成功裡に使用されてきた（１９）。自己免疫疾患の場合において、ＴＬＲアゴニストは、適応Ｔｈ２応答を、アレルギーの発生を防止するであろうＴｈ１免疫応答にシフトさせる手段と考えられている。より長期の目標には、ＴＬＲシグナル伝達経路の下流構成要素での薬物療法学の開発が含まれるであろう。それ故、ＴＬＲシグナル伝達のすべての側面を完全に理解することが重要である。
【０００５】
ＴＬＲファミリーのさらなるメンバー、及びＴＬＲシグナル伝達経路の側面の同定は、有益な薬学的可能性を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【非特許文献１６】Horng, T. et al. Nature 420, 329-33(2002).
【非特許文献１７】Axtelle, T. & Pribble, J. J. Endotoxin Res. 7, 310-314 (2001).
【非特許文献１８】Lynn, M. et al. J Infect Dis. 187, 631-639 (2003).
【非特許文献１９】Berman, B. Int. J. Dermatol. 29, 7-11 (2002).
【非特許文献２０】Smith, R. et al. Genome Res. 6, 454-462 (1996).
【非特許文献２１】Quandt, K. et al. Nucleic Acids Res. 23, 4878-4884 (1995).
【非特許文献２２】Xu, Y. et al. Nature 408, 111-5 (2000).
【発明の概要】
【０００７】
本発明に従うと、配列番号１のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む単離されたポリペプチドが提供される。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む単離されたポリペプチドも提供する。
【０００８】
本発明の一つの態様において、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、変異体は、配列番号１又は２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の一つの態様において、変異体は欠失又は挿入修飾を含む。該変異体は、翻訳後修飾も含むことができる。
本発明の一つの態様において、該断片は、配列番号１又は２の少なくとも１２の連続したアミノ酸を含むペプチドである。
【００１０】
本発明の一つの態様において、本明細書で前に記載したポリペプチドは、トール様レセプター活性を示す。該トール様レセプターはＴＬＲ１４活性であることができる。
本発明の一つの態様において、該ポリペプチドは免疫調節活性を示す。
【００１１】
本発明は、本明細書で前に記載したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
本発明はさらに、配列番号３の核酸配列又はその変異体又は断片、又はそれらと相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号４の核酸配列又はその変異体又は断片、又はそれらと相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、配列番号３又は４の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含む。
本発明の別の態様において、該断片は配列番号３又は４の少なくとも１７の連続した核酸を含む。
【００１３】
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、前記セグメントをコードする天然ｃＤＮＡと少なくとも８０％の同一性を示す。
本発明の一つの態様において、該ポリヌクレオチドは、トール様レセプター又はペプチド又はそれらの融合タンパク質をコードする。
【００１４】
本発明は、配列番号３、配列番号４の核酸配列又は変異体又はそれらの断片、又はそれらと相補的な配列を含む組換え核酸も提供する。
本発明はさらに、配列番号１又は２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含む精製されたタンパク質又はペプチドを提供する。好ましくは、該タンパク質又はペプチドの断片は、配列番号１又は２の少なくとも１２の連続するアミノ酸を含む。
【００１５】
本発明の一つの態様において、該タンパク質又はペプチドは哺乳類起源である。該タンパク質はヒト起源であることができる。
本発明の一つの態様において、該タンパク質又はペプチドは、少なくとも１００ｋＤａの分子量を有する。該タンパク質又はペプチドはグリコシル化形態であることができる。
【００１６】
本発明の一つの態様は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質又はペプチドを提供する。
本発明のタンパク質又はペプチドは、トール様レセプター官能性／活性を示すことができる。
【００１７】
本発明は、配列番号１又は２又は変異体又はそれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質も提供する。該タンパク質はトール様レセプタータンパク質、特にＴＬＲ１４であることができる。
【００１８】
本発明は、本発明のタンパク質又はペプチドの抗原性断片も提供する。
本発明は、本明細書において前に記載したポリヌクレオチドを含む組換えベクターも提供する。本発明は、該組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明はさらに、活性成分として該組換えベクターを含む遺伝子療法剤を提供する。
【００１９】
本発明の一つの側面は、本明細書において前に記載したポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。
本発明は：
配列番号１又は２のアミノ酸配列又はそれらの断片又は変異体を含むタンパク質；及び
検出又は精製タグ；
のいずれか一つ又はそれより多くを含む融合化合物又はキメラ分子も提供する。
【００２０】
本発明の一つの態様において、該検出又は精製タグは、ＦＬＡＧ配列、Ｈｉｓ６配列、Ｉｇ配列及び別のレセプタータンパク質の異種ポリペプチドのいずれか一つ又はそれより多くから選択される。
【００２１】
本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列及びＴＬＲリガンドを含む、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含むリガンド／レセプターも提供する。好ましくは、ＴＬＲリガンドはＣｐＧ核酸である。
【００２２】
本発明は、本明細書において前に記載したタンパク質の抗原決定基を含む免疫原も提供する。
本発明はさらに、本明細書において前に記載したポリペプチド又はタンパク質又はペプチドのエピトープに特異的に結合する、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそれらの断片を提供する。該抗体は、固定化された形態で調製することができる。該抗体は、ビーズ、磁性ビーズ、スライド又は容器へのコンジュゲーション又は付着により固定することができる。該抗体は、臭化シアン活性化セファロースへ固定化させる、又はグルタルアルデヒド架橋有り又は無しでポリオレフィン表面へ吸着させることができる。
【００２３】
本発明は、トール様レセプター活性を変調する化合物を同定するための方法も提供し、それは：
配列番号１又は２のアミノ酸配列又は変異体又はそれらの断片を含むポリペプチドと試験サンプルを接触させること；
トール様レセプター活性のマーカーについてモニターすること；及び
トール様レセプター活性を変調する化合物を同定すること；
の工程を含む。
【００２４】
本発明の一つの態様において、該トール様レセプター活性のマーカーは：
（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化
（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は
（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン
のいずれか一つ以上を含む。
【００２５】
一つの態様において、該方法は、各（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも２つの、試験サンプルと比べた量の相違を決定する工程を含む。
別の態様において、該方法は、各（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも３つの、試験サンプルと比べた量の相違を決定する工程を含む。
【００２６】
一つの場合において、試験サンプルのタンパク質と比べた量が決定される。もしくは、核酸マイクロアレイを使用して試験サンプルのｍＲＮＡと比べた量が決定される。トール様レセプター活性はＴＬＲ１４活性であることができる。
【００２７】
本発明の一つの態様において、ＴＬＲ活性を活性化する、又は阻害する化合物は：
（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化
（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド
（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は
（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン
の少なくとも一つ以上の、試験サンプルと比較した量、発現、活性又はリン酸化を決定することにより同定される。
【００２８】
別の態様において、ＴＬＲ活性を変調することが可能な化合物は、本明細書において前に記載した方法により同定される。
本発明は、本発明の化合物及び薬学的に許容できる坦体を含む医薬組成物も提供する。
【００２９】
本発明は：配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むＴＬＲ１４ポリペプチド又は配列番号３又は４の核酸を含むポリヌクレオチドの活性を変調する試薬又は化合物；及び
薬学的に許容できる坦体；
を含む医薬組成物も提供する。
【００３０】
本発明の一つの態様において、試薬はＴＬＲ１４アゴニスト又はアンタゴニストである。
好ましくは、坦体化合物は、水、塩水及び緩衝液のいずれか一つ以上から選択される水性化合物である。該組成物は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与の形態であることができる。
【００３１】
本発明の一つの態様において、該化合物又は組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、ＣＮＳ疾患、腫瘍性疾患及び感染性疾患及び／又は免疫仲介障害のいずれか一つ以上の治療のための医薬の製造において使用される。
【００３２】
本発明の一つの態様において、障害は、感染、外傷又は損傷、慢性炎症性疾患、移植片拒絶又は移植片対宿主疾患、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、タイプ１糖尿病又は関節リウマチ、喘息又はアトピー疾患及びアレルギー性脳脊髄炎により誘発された敗血症又は急性炎症のいずれか一つ以上から選択される。
【００３３】
他の免疫仲介障害には、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、アテローム性動脈硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群に二次的な乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬合反応によるアレルギー応答、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー喘息、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮症、鞘膜炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、突発性両側性進行性感音性難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイド症、原発性胆汁性肝硬変、後部葡萄膜炎、間質性肺線維症、アルツハイマー病又は小児脂肪便症のいずれか一つ以上が含まれる。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するＴＬＲ１４ポリペプチド又は変異体に対するアゴニスト又はアンタゴニストを提供する。
本発明は、細胞と哺乳類ＴＬＲ１４のアゴニスト又はアンタゴニストを接触させることを含む、細胞又は組織培養細胞の生理機能又は発育を変調する方法も提供する。
【００３５】
本発明はさらに、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する又は促進することが可能な化合物をスクリーニングする方法を提供し：
本明細書において前に記載したタンパク質をコードする遺伝子、及びＮＦ−κＢの活性化に付随する検出可能なシグナルを提供する成分を有する細胞を提供すること；
形質転換細胞中の遺伝子の発現を提供する条件下で形質転換細胞を培養すること；
形質転換細胞とスクリーニングのための一つ又はそれより多くの化合物を接触させること；
検出可能なシグナルを測定すること；及び
検出可能なシグナルを測定することにより活性化剤化合物又は阻害剤化合物を単離すること又は同定すること；
の工程を含む。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、医薬化合物として単離された又は同定された化合物を最適化することの工程を含む。
本発明は、トール様レセプター活性を変調することが可能な化合物をスクリーニングするためのキットも提供し：
本発明のタンパク質をコードする遺伝子、及びＮＦ−κＢの活性化により検出可能なシグナルを提供する成分を有する細胞；
検出可能なシグナルを測定するための試薬；
を含む。
【００３７】
本発明の一つの態様において、遺伝子はトール様レセプターＴＬＲ１４をコードする。
本発明は、免疫性又は炎症性障害の治療のための医薬の製造における、配列番号１又は２のアミノ酸配列を有するＴＬＲ１４の活性を阻害することができる配列番号１又は２のアミノ酸配列の断片又は変異体を含むポリペプチドの使用を提供する。
【００３８】
本発明は、アジュバント又はワクチン製剤の製造における、本明細書において前に記載したポリペプチド、ポリヌクレオチド又は化合物の使用も提供する。
本発明は哺乳類レセプター、トール様レセプター１４（ＴＬＲ１４）及びその生物学的活性に関する。それは該ポリペプチドをコードする核酸、及びその生産及び使用のための方法を含む。本発明の核酸は、本明細書に含まれているクローン化相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列とのそれらの類似性により一部特徴付けられる。
【００３９】
特定の態様において、本発明は、配列番号１又は２と少なくとも１２アミノ酸にわたって同一性を示す実質的に純粋な又は組換えＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド、配列番号１又は２のＴＬＲ１４の天然配列、ＴＬＲ１４配列組成物を含む融合タンパク質：新規ＴＬＲ（ＴＬＲ１４）の群より選択される組成物を含む。具体的態様において、組成物は、配列番号１又は２の成熟配列を含むか、又は翻訳後修飾を欠いており、又は組成物は、ヒトのような霊長類を含む哺乳類から選択される温血動物からのものであり、配列番号１又は２の少なくとも一つのポリペプチドを含んでなり；グリコシル化されており、天然のグリコシル化で少なくとも１００ｋＤａの分子量を有し、合成ポリペプチドであり；別の化学部分にコンジュゲートされており；天然配列よりも５分の１の置換しかなく又は天然配列からの欠失又は挿入変異体である、タンパク質又はペプチドであることができる。具体的態様において、ＴＬＲ、ＴＬＲの抗原性断片、ＴＬＲに対する抗体、ＴＬＲに対する抗体断片、ＴＬＲリガンドに対する抗体が固定化された形態を含む。固定化は、ビーズ、磁性ビーズ、スライド又は容器へのコンジュゲーション又は付着によるものであることができる。固定化は、当該技術分野では公知の方法による臭化シアン活性化セファロースへの固定化、又はグルタルアルデヒド架橋有り又は無しでのポリオレフィン表面への吸着であることができる。
【００４０】
他の態様は、滅菌ＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド又はＴＬＲ１４タンパク質又はペプチド及び担体を含んでなり、担体は水、塩水及び／又は緩衝液を含む水性化合物であり、及び／又は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与のために製剤されている。
【００４１】
特定の融合タンパク質態様において、本発明は、配列番号１又は２の成熟タンパク質配列、ＦＬＡＧ又はＨｉｓ６又はＩｇ配列を含む検出又は精製タグ；又は別のレセプタータンパク質配列を含む融合タンパク質を提供する。
【００４２】
多様なキット態様は、ＴＬＲ１４タンパク質又はポリペプチド、及び：タンパク質又はポリペプチドを含むコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）；及び／又はキット中の試薬の使用又は廃棄のための説明書、を含むキットを含む。
【００４３】
結合化合物態様は、ＴＬＲ１４タンパク質に特異的に結合する抗体からの抗原結合部位を含むものを含み、該タンパク質は霊長類タンパク質であり；結合化合物はＦｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ２断片であり；結合化合物は別の化学部分又は抗体にコンジュゲートされており；配列番号１又は２の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して産生され；成熟ＴＬＲ１４に対して産生され；精製ヒトＴＬＲ１４に対して産生され；免疫選択されており；ポリクローナル抗体であり；変性ＴＬＲ１４に結合し；少なくとも３０μＭの抗原に対するＫｄを示し；ビーズ又はプラスチック膜を含む固体基質に結合されており；滅菌組成物中にあるか又は放射性又は蛍光ラベルを含む検出可能なようにラベルされている。結合組成物キットは多くの場合、結合化合物及び前記結合化合物を含むコンパートメント；及び／又は試薬の使用又は廃棄のための説明書をキット中に含む。多くの場合、キットは定性的又は定量的分析を行うことが可能である。
【００４４】
例えば、免疫原性量の霊長類ＴＬＲ１４で免疫系を免疫化することを含む抗体を作製する方法、又はこうした抗体と哺乳類ＴＬＲ１４タンパク質又はペプチドを接触させ、それにより抗原／抗体複合体を形成させることを含む抗原／抗体複合体を産生する方法が提供される。
【００４５】
当該技術分野で普通に実践される免疫化法を使用することができ、それは文献に詳しく記載されている。
他の組成物には、滅菌結合化合物又は結合化合物及び担体を含む組成物が含まれ、該担体は水、塩水及び／又は緩衝液を含んでいる水性であり、及び／又は経口、経直腸、経鼻、局所又は非経口投与のために製剤されている。
【００４６】
核酸態様には、ＴＬＲ１４又はペプチド又は融合タンパク質をコードする、単離された又は組換え核酸が含まれ、該ＴＬＲは哺乳類からのものであり；又は配列番号３又は４の抗原性ペプチド配列をコードし；複数の配列番号３又は４の抗原性ペプチド配列をコードし；配列番号３又は４からの少なくとも１７連続するヌクレオチドを含んでなり、前記セグメントをコードする天然ｃＤＮＡと少なくとも８０％の同一性を示し；発現ベクターであり；さらに複製の起点を含んでなり；天然起源であり；放射性ラベル、蛍光ラベル又は免疫原性ラベルのような検出可能なラベルを含んでなり；合成ヌクレオチド配列を含んでなり；６ｋＢ未満、好ましくは３ｋＢ未満であり；霊長類を含む哺乳類からであり；天然完全長コード配列を含んでなり；前記ＴＬＲをコードする遺伝子のためのハイブリダイゼーションプローブであり；又はＰＣＲプライマー、ＰＣＲ生成物又は変異誘発性プライマーである。こうした組換え核酸を含む細胞、組織又は器官も提供される。好ましくは、細胞は原核細胞；真核細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；マウス細胞；哺乳類細胞；霊長類細胞又はヒト細胞である。こうした核酸、及び前記核酸を含むコンパートメント；さらに霊長類ＴＬＲ１４タンパク質又はポリペプチドを含むコンパートメント；及び／又はキットの試薬の使用又は廃棄についての説明書；を含むキットが提供される。多くの場合、キットは定性的又は定量的分析を行うことが可能である。
【００４７】
リガンド／レセプター複合体を生成させる方法も提供され、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含む実質的に純粋なＴＬＲ１４と候補ＴＬＲリガンドを接触させることを含んでなり、それにより前記複合体が形成されることを可能にする。
【００４８】
ＴＬＲリガンドとは、ＴＬＲポリペプチド、この場合ＴＬＲ１４ポリペプチドに特異的に結合する分子を指している。ほとんどの場合、ＴＬＲリガンドは、適した条件下でＴＬＲと接触させた場合、ＴＬＲシグナル伝達も誘導するであろう。
【００４９】
本発明は、細胞又は組織培養細胞の生理学的機能又は発育を変調する方法も提供し、該細胞と哺乳類ＴＬＲ１４のアゴニスト又はアンタゴニスト接触させることを含む。
本発明はマーカーとして以下のマーカーの少なくとも一つを使用し、ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価する方法に関する：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン。
【００５０】
本発明は、（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの細胞又は組織における発現、量、活性又はリン酸化を改変する試薬の使用にも関する。
【００５１】
本発明は新規ＴＬＲ１４タンパク質の発見、及びＴＬＲ１４の阻害及び活性化が（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの活性化を導くことが可能なシグナル分子の量、発現、活性又はリン酸化を決定することにより検出することが可能であることに基づいている。
【００５２】
本発明の一つの態様は、（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカインの、試験サンプルに対するレベルの相違を決定することにより、ＴＬＲ１４活性化又は阻害の効果をモニタリングするための方法を提供する。
【００５３】
本明細書で使用される「レベル」には、限定されるわけではないが、タンパク質の量、ｍＲＮＡの発現量、遺伝子活性、タンパク質活性及びリン酸化の量が含まれる。
試験サンプルは、限定されるわけではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ホルモン及び小分子を含むことができる。試験化合物は、基準免疫賦活性核酸の変異体も含むことができる。これらは天然核酸源、ゲノム核又はミトコンドリアＤＮＡ又はｃＤＮＡから得られても、又は合成物（例えば、オリゴヌクレオチド合成により生成される）であってもよい。
【００５４】
それ故、一つの側面において、本発明はＴＬＲ１４活性を活性化する又は阻害する試薬を同定する又は評価するための方法に関し、以下のマーカー：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン；の少なくとも一つの、試験サンプルに対する量、発現、活性又はリン酸化の相違を決定することを含む。
【００５５】
別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
本発明の一つの態様において、ｍＲＮＡの試験サンプルに対する量の相違が決定され、及び、例えば、核酸マイクロアレイの使用により決定することが可能である。
【００５６】
本発明の一つの態様において、タンパク質の試験サンプルに対する量の相違が決定される。
本発明の別の側面は、ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価するための方法に関し、前記方法は：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン、を含む。別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
【００５７】
ＴＬＲ１４の活性を変調する試薬を同定する又は評価するための方法の好ましい態様において、前記方法は：（ｉ）ＮＦカッパＢ活性化（ｉｉ）ＮＦカッパＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｉｉ）ＩＲＦ３タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｉｖ）ｐ３８タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖ）ＩＫＫタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉ）ＲＡＮＴＥＳタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド（ｖｉｉ）ＴＬＲ４タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド又は（ｖｉｉｉ）いずれかの炎症誘発性又は抑制性サイトカイン、を含む。別の態様において、こうした方法は、上に定義した（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の各々の少なくとも二つ、少なくとも三つの、試験サンプルに対する量の相違を決定することを含む。
【００５８】
配列相同性
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２に示したヒト配列である。配列番号３のＤＮＡによりコードされているアミノ酸の配列は配列番号１に示されている。配列番号４のＤＮＡによりコードされているアミノ酸の配列は配列番号２に示されている。
【００５９】
一つより多くのコドンが同一のアミノ酸をコードすることが可能である遺伝子コードの既知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号３に示されたものから変化することが可能であり、そしてそれでもなお配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。こうした変異体ＤＮＡ配列はサイレント変異を生じることができるか（ＰＣＲ増幅の間に生じる）、又は天然配列の計画的な変異誘発の生成物であることが可能である。
【００６０】
本発明はそれ故、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ（ｂ）配列番号３のポリペプチドをコードするＤＮＡ（ｃ）中ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に定義したＤＮＡに対する遺伝子コードの結果として縮重している及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、から選択される、本発明のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドは本発明に包含される。
【００６１】
本発明はそれ故、（ａ）天然哺乳類インターフェロンアルファ１４アレルｃ遺伝子のコード領域から誘導されたＤＮＡ；（ｂ）配列番号３のＤＮＡ；（ｃ）中ストリンジェンシー条件下で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーション可能な、及び生物学的に活性なインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡ；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に定義したＤＮＡに対する遺伝子コードの結果として縮重している及び生物学的に活性なインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡ；から選択される、生物学的に活性なヒトインターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードする均等で単離されたＤＮＡを提供する。
【００６２】
本明細書で使用される中ストリンジェントの条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて当業者は容易に決定することが可能である。基本的条件は、Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) に示されている。高ストリンジェントの条件も、例えば、ＤＮＡの長さに基づいて当業者は容易に決定することが可能である。
【００６３】
本発明の態様としてまた含まれるものは、不活性化Ｎ−グリコシル化部位（単数又は複数）、不活性化プロテアーゼプロセシング部位（単数又は複数）又は保存的アミノ酸置換（単数又は複数）を含むポリペプチド断片及びポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００６４】
別の態様において、本発明の核酸分子は、天然の配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列も含む。核酸分子が、天然の配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一である配列を含む態様も企図される。
【００６５】
パーセント同一性は、目視検査及び数学的計算により決定することができる。もしくは、二つの核酸配列のパーセント同一性は、Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) により記載され、及びUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定することが可能である。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性に対して１及び非同一性に対して０の値を含んでいる）、及びSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979 に記載されているＧｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ、Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986 、の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティー及び各ギャップ中の各シンボルについての追加の０．０１ペナルティー；及び（３）末端ギャップについてはペナルティー無し、が含まれる。配列比較の技術分野で当業者により使用されている他のプログラムも使用することができる。
【００６６】
本発明は、ポリペプチドの生成において有用な単離された核酸も提供する。こうしたポリペプチドは多数の慣用技術のいずれかにより調製することができる。インターフェロンアルファ１４ポリペプチド又はそれらの望まれる断片をコードするＤＮＡ配列を、ポリペプチド又は断片の生成のための発現ベクター内にサブクローン化することができる。ＤＮＡ配列を、適したリーダー又はシグナルペプチドをコードする配列内に都合よく融合する。もしくは、所望の断片を既知の技術を使用して化学的に合成することができる。ＤＮＡ断片は、完全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によっても生成することができ、アガロースゲル上での電気泳動により単離される。必要なら、所望のポイントに５’又は３’末端を再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化により発生したＤＮＡ断片に結合させることができる。こうしたオリゴヌクレオチドは、所望のコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含有し、及びコード配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を位置させることができる。
【００６７】
公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離する、又は増幅するために使用することができる。該ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを５’及び３’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドは、発現ベクター内への増幅されたＤＮＡ断片の挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を追加的に含有することができる。ＰＣＲ技術は、Saiki et al, Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989),pp. 189-196; 及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990) 、に記載されている。
【００６８】
本発明は、天然に存在する又は組換えＤＮＡ技術を含む方法のような多様な技術を介して生成されるものを含む多様な形態のポリペプチド及びそれらの断片を包含する。例えば、インターフェロンアルファ１４ポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発を含むインビトロ変異誘発及びインビトロ核酸合成により配列番号３から誘導することが可能である。こうした形態には、限定されるわけではないが、誘導体、変異体及びオリゴマー、ならびに融合タンパク質又はそれらの断片が含まれる。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、配列番号１の核酸配列によりコードされる完全長タンパク質を含む。特に好ましいポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドは膜に結合されていてもよいし、又は分泌されていても、それ故可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌されていることができる。一般に、可溶性ポリペプチドは、培養培地から所望のポリペプチドを発現する無傷の細胞を分離すること（例えば、遠心分離により）、及び所望のポリペプチドの存在について培地（上清）をアッセイすることにより同定すること（及び非可溶性膜結合対応物と区別すること）ができる。培地中のポリペプチドの存在は、該ポリペプチドが細胞から分泌され、及びそれ故タンパク質の可溶性形であることを示している。
【００７０】
異なる長さのポリペプチド断片も本明細書において提供される。天然に存在する変異体ならびにポリペプチド及び断片の誘導された変異体も本明細書において提供される。
本発明はさらに医薬組成物に関する。該組成物は：（ａ）ＴＬＲ１４ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を変調する試薬及び（ｂ）薬学的に許容できる坦体を含む。該試薬はＴＬＲ１４アゴニスト又はアンタゴニストであることができる。該組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、中枢神経系疾患、腫瘍性疾患及び感染性疾患のような疾患を治療するために使用することができる。
【００７１】
当業者は、医薬担体の選択には生理学的に適した化合物が含まれること、及び化合物の選択が投与経路及び意図された投与計画に依存することを理解するであろう。
治療／療法
本明細書において使用される用語「治療」とは、ヒト又は非ヒト動物に利益となることが可能であるいずれかの治療法を指す。該治療は、存在している状態に関していてもよいし、又は予防的であってもよい（予防的治療）。治療は、治療的、軽減的又は予防的効果を含むことができる。
【００７２】
より具体的には、「療法的」及び「予防的」治療への本明細書での言及は、その最も広い前後関係で考えられるべきである。用語「療法的」は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味するわけではない。同様に、「予防的」は、対象が最終的に疾患状態にはならないであろうことを必ずしも意味するわけではない。
【００７３】
従って、療法的及び予防的治療には、特定状態の徴候の寛解、又は特定状態を発生する危険性を防止する又はさもなくば軽減することが含まれる。用語「予防的」は、特定状態の重度又は発症を軽減することと考えることができる。「療法的」は、存在している状態の重度を軽減することもできる。
【００７４】
本発明は、特に示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の一般に使用される技術を含む方法を記載しており、それらのすべては当該分野で十分に記述されている。
【００７５】
本発明はさらに、哺乳類細胞から調製された細胞及び組織抽出物で同定された又は精製された、ＴＬＲ１４の内在性リガンド（単数又は複数）に関する。
本発明はさらに、ＴＬＲ４シグナル伝達の変調に関し、ＴＬＲ１４はＴＬＲ４シグナル伝達を促進する又は阻害する。
【００７６】
本発明に従ったペプチドは、該ペプチドの活性又は機能に影響する又は変調する分子のスクリーニングに使用することができる。こうした分子とペプチドの相互作用は、療法的及び予防的状況で有用であることができる。
【００７７】
新規薬剤の同定を導く医薬品研究は、先導化合物が発見される前又はさらには後の両方で、非常に多数の候補物質のスクリーニングを含むことがよく知られている。こうした手段は、癌を治療すること及び予防することに有用な可能性を有する物質のスクリーニングに有用である。ポリペプチドの変調剤として同定された物質は、インビボ使用のための療法剤の設計及び研究のための基礎を提供するので、これらの領域の療法における進歩を意味する。
【００７８】
多様なさらなる側面において、本発明はスクリーニング及びアッセイ方法、及びそれらにより同定された物質に関する。
それ故、本発明のさらなる側面は、本発明のペプチドと相互作用する又は結合する、及び／又はその生物学的機能又は活性又は別の物質のそれらを妨害するペプチド又は化学化合物のような物質を、スクリーニングする又は探索する及び／又は入手する又は同定することにおける、本発明のペプチド（それらの断片及び誘導体を含む）の使用を提供する。例えば、本発明の一つの側面に従った方法は、本発明のペプチドを提供し、それと物質を接触させると、その接触は該ペプチドと該物質間の結合を生じることができる。結合は、定性的及び定量的の両方で、当業者には公知であろうさまざまな技術により決定することができる。
【００７９】
ペプチド機能の変調剤として同定された物質は、天然のペプチド又は非ペプチドであることができる。非ペプチド「小分子」がしばしば多くのインビボ医薬使用に好ましい。従って、物質のミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）又は模倣体（ｍｉｍｉｃ）を医薬使用のために設計することができる。既知の医薬として活性な化合物について模倣体を設計することは、「先導」化合物に基づいた医薬の開発への既知のアプローチである。このことは、活性化合物を合成するのが困難である又は費用がかかる場合、又は投与の特定の方法に対して適切ではない場合（例えば、ペプチドは消化管中でプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるので、経口組成物の活性剤として適切ではない）に望ましい。模倣剤設計、合成及び試験は、目標とする特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用することができる。
【００８０】
所与の目標特性を有する化合物からの模倣体の設計においては、一般にいくつかの工程がとられる。第一に、目標特性の決定において決定的及び／又は重要である化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、このことはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることにより、例えば、各残基を順に置換することにより行うことが可能である。化合物の活性領域を構成するこれらの部分又は残基はその「ファルマコフォア」として知られている。
【００８１】
ファルマコフォアが決定されたら、起源範囲からのデータ、例えば、分光学的技術、Ｘ線回析データ及びＮＭＲを使用して、その物理学的特性、例えば、立体化学、結合、サイズ及び／又は電荷に従ってその構造をモデル化する。コンピューター分析、類似性マッピング（原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷及び／又は容量をモデル化する）及び他の技術も、このモデル化プロセスに使用することが可能である。
【００８２】
このアプローチの変法においては、リガンドの三次元構造及びその結合パラメーターをモデル化する。このことは、リガンド及び／又は結合相手が結合によりコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、モデルが模倣体の設計を考慮することを可能にしている。
【００８３】
次に鋳型分子が選択され、その上にファルマコフォアを模倣する化学基を接ぎ合わせることが可能である。該鋳型分子及び接ぎ合わされた該化学基は、模倣体を合成するのが容易であるように、薬学的に許容できそうであるように、及びインビボで分解されないように、一方、先導化合物の生物学的活性が残るように都合よく選択することが可能である。このアプローチで見出されたミメティック及び模倣体は、それらが目標特性を有しているか、又それらがどの程度それを示すかどうかを見るためにスクリーニングすることが可能である。インビボ又は臨床試験のための一つ又はそれより多くの最終模倣体に達するため、さらなる最適化又は修飾を実施することが可能である。
【００８４】
それ故、本発明のさらなる側面は、本発明の少なくとも一つのペプチドと推定結合分子又は他の試験物質間の結合活性を評価するためのアッセイを提供し、それは、少なくとも一つのペプチドと推定結合分子又は他の試験物質を接触させること、及び少なくとも一つのペプチドと結合分子又は試験物質間の相互作用又は結合を決定すること、の工程を含み、少なくとも一つのペプチドと結合分子間の結合は、少なくとも一つのペプチドの有用性の指標である。
【００８５】
本発明のペプチドと相互作用する物質は、その活性を変調させるために、単離する及び／又は精製する、製造する及び／又は使用することができる。
二つの分子間の結合について試験する本発明のアッセイのため、本発明の全ペプチドを使用する必要はない。当業者には既知のいずれか適した方法で、断片を発生させ及び使用することができる。
【００８６】
さらに、本発明のアッセイの詳細なフォーマットは、日常の技術及び知識を使用し、当業者が変更することもできる。
詳細な説明
我々は、トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーと顕著な相同性を示す新規遺伝子を同定した。細胞に基づいたアッセイにおいて、この新規レセプターは転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３を活性化し、抗ウイルスサイトカイン、ＲＡＮＴＥＳの産生を駆動する。該タンパク質はＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び普遍的ＴＬＲアダプター、ＭｙＤ８８と相互作用する。我々はレセプターＴＬＲ１４と名付けた。
【００８７】
この推定レセプターの発現は、微生物産物、例えば、ＬＰＳにより増強され、それが免疫変調剤として機能することができることを示唆している。このことの裏付けとして、細胞がＴＬＲ１４を発現するベクターでトランスフェクトされた場合、転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３が活性化された。ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の両方が、細菌及びウイルス病原体の除去における中核であるので、ＴＬＲ１４を阻害する又は活性化することは、炎症性疾患の治療について見込みのある新規アプローチである。加えて、高レベルのＴＬＲ１４を血清中に見出した。主としてこのレセプターの外部ドメインを含むＴＬＲ２の可溶型も、血清及び母乳中で見出された。ＴＬＲ２のこの形態は、ＴＬＲ２リガンドに対する活性免疫応答を抑えることにおいて保護的である。完全長ＴＬＲ１４ポリペプチド又はそれ自身の外部ドメインは類似の生物学的特性を有することができ、それ故、潜在的生物療法剤と考えることができる。
【００８８】
ＬＰＳ及びＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素により調節される遺伝子を同定するため、マイクロアレイアプローチを使用した。上記のように、レセプター刺激後、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４からシグナルを伝達するためにはアダプター分子、Ｍａｌが必要とされる。胚性幹細胞中のＭａｌをコードする遺伝子を破壊するため、遺伝子標的化ベクターを使用した。これらの細胞を次ぎにＬＰＳで処理し、ノックアウト及び野生型細胞間の遺伝子発現の相違を測定した。この方法において、トール様レセプター／インターロイキン−１レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーと顕著な相同性を示す遺伝子を同定した。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
本発明は、付随する図面に関連して、ほんの一例として与えられたそれらの以下の説明からより明瞭に理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＬＲ１４の染色体位置の略図である。ＴＬＲ１４は線により示されている染色体７上の７ｐｌ５に位置している。それは４．７ｋｂの長さであり、遺伝子ＣＲＥＢ５及びＣＰＶＬが隣接している。転写の方向は矢印により示されている。ＴＬＲ１４は逆平行方向に転写される。この情報はwww.ncbi.nlm.nih.gov のＮＣＢＩウェブサイトから入手可能なヒトゲノムマップビュアーツールを使用して得られた；
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＴＬＲ１４（配列番号１）についてのヌクレオチド配列を示している；
【図１Ｃ】図１Ｃは、マウスＴＬＲ１４（配列番号２）についてのヌクレオチド配列を示している；
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒト（配列番号３）及びマウス（配列番号４）ＴＬＲ１４の予測タンパク質配列を示している。ヒトＴＬＲ１４遺伝子の推定ＯＲＦは、８１１アミノ酸タンパク質をコードし、一方、マウスタンパク質は８０９アミノ酸の長さである。予測Ｎ末端シグナル配列及び膜貫通ドメインには下線が付されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＴＬＲ４及びＴＬＲ１４外側ドメインのアラインメントが示されている。推定ＴＬＲとヒトＴＬＲ４のアラインメントは、二つのレセプター間の高度な配列類似性を明らかにした。少なくとも六つのロイシンリッチリピートを同定することができ、ｂｏｘにより強調されている。
【図２Ａ】図２Ａは、いくつかの組織において発現されたヒトＴＬＲ１４のｍＲＮＡ発現プロフィールである。新規ＴＬＲのヒト及びマウス形についての発現プロフィールはＨＵＧＥタンパク質データベースから入手可能である。該タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’非翻訳領域を標的とするプライマーでＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。発現は試験されたすべての組織で検出され、腎臓；脳及び卵巣において最も高いレベルが生じた。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト組織サンプルにおけるＴＬＲ１４のタンパク質発現プロフィールである。高い発現レベルが脳及び肺で検出された。
【図３】図３は、ＴＬＲ１４とＴＬＲファミリーの他のメンバーの細胞質領域のアラインメントを示している。ＴＬＲ１４と他のＴＬＲファミリーメンバーの細胞質領域のアラインメントは、推定レセプターがＴＬＲに特徴的である類似の領域を共有していることを明らかにしている。特に二つの領域は相同的であり（Ｂｏｘ１及び２）、タンパク質を含有するすべてのＴｌＲドメインのシグナチャー配列と考えられる。ＴＬＲ１４のＢｏｘ２はＴＬＲ３のものと同一である。
【図４】図４は、ヒトＴＬＲ１４の推定プロモーター領域の略図である。ＴＬＲ１４の推定プロモーター領域は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ及びＭａｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒを使用して同定した。上記のすべての転写因子は０．８より大きなマトリックススコア＊を有している。＊マトリックススコアは、転写因子マトリックス内の保存ヌクレオチドに相当するプロモーター内の配列がどれほど近いかを測定している。有意な一致は＞０．８である。
【図５】図５は、Ｕ３７３及び初代マウス胚性線維芽細胞においてＬＰＳにより、及びまたＬＰＳで処理したマウスにおいて誘導されたＴＬＲ１４の発現を示している。（Ａ）Ｕ３７３及びＭＥＦは１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで示された時間処理した。ｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを本文中に記載したように実施した。（Ｂ）マウスにＬＰＳを腹腔内注射し、３時間放置した後に屠殺した。ＲＴ−ＰＣＲは対照未処理及びＬＰＳ処理マウスに対して行った。
【図６】図６は、ＴＬＲリガンドでの処理後の細胞におけるＴＬＲ１４タンパク質の発現を示している。（Ａ）ヒトグリオーマ細胞株、Ａ１７２を種々の時間、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（１μｇ／ｍｌ）で処理し、ＴＬＲ１４の発現について探索した。（Ｂ）ＴＬＲ４で安定的にトランスフェクトしたヒトＨＥＫ−２９３細胞を種々の時間ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処理し、ＴＬＲ１４の発現について探索した。（Ｃ）タンパク質抽出物を、対照未処理マウス及びＬＰＳを注射してあるマウスの脳から調製した。抽出物はＴＬＲ１４の発現について探索した。
【図７】図７は、ＴＬＲ１４活性が、ＨＥＫ２９３及びＵ３７３星状細胞腫細胞においてＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥレセプター遺伝子発現を誘導することを示しているグラフである。ＴＬＲ１４活性はＨＥＫ２９３及びＵ３７３星状細胞腫細胞においてＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥルシフェラーゼ活性を駆動する。ＨＥＫ２９３細胞をＮＦ−κＢレセプター構築物ならびに１、５及び１０ｎｇのＴＬＲ１４でトランスフェクトした（Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｓ（Ｂ）及びＵ３７３Ｓ（Ｃ）は、ＩＳＲＥレセプター構築物及び用量を増加させたＴＬＲ１４（１、１０及び１００ｎｇ）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を採取し、相対ルシフェラーゼ活性を決定した。
【図８】図８は、ＴＬＲ１４がＵ３７３星状細胞腫細胞においてＲａｎｔｅｓ産生を駆動することを示しているグラフである。ＲＡＮＴＥＳ産生は、増加させた用量のＴＬＲ１４で２４時間トランスフェクトされたＵ３７３細胞において、酵素結合免疫吸着アッセイにより測定した。データは空ベクターでトランスフェクトした細胞に対しての誘導倍数で表現されている。
【図９】図９は、ＴＬＲ１４とＴＩＲ−ドメイン含有タンパク質ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８との相互作用を示している。（Ａ）ＴＬＲ１４をＦｌａｇ−タグ付けＴＬＲ４、ＴＬＲ２又はレセプターの突然変異形とＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトした。複合体を抗ｆｌａｇビーズで免疫沈降し、抗ＴＬＲ１４抗体で探索した。（Ｂ）ＴＬＲ１４をＭｙｃ−タグ付けＭｙＤ８８とＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトした。複合体をプロテインＡセファロースビーズに結合させた抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、抗ＴＬＲ１４抗体で探索した。
【図１０】図１０は、ＴＬＲ２と内因性ＴＬＲ１４との相互作用を示している。Ｆｌａｇ−タグ付けＴＬＲ２をＨＥＫ−２９３細胞から免疫沈降し、ウエスタンブロットを抗ＴＬＲ１４抗体で探索して、ＴＬＲ２と複合体形成した該内因性タンパク質の存在を検出した。
【図１１】図１１は、ＴＬＲ１４が細胞質中に存在し、血清中にも高レベルで見いだされることを示している。（Ａ）細胞をＬＰＳで刺激した後、細胞質及び膜分画に分離した。分画をＴＬＲ１４の存在について探索した。（Ｂ）１０％ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地をウエスタンブロッティングにかけ、ＴＬＲ１４の存在について探索した。
【図１２】図１２は、示された時点についてＬＰＳの（ｌμｇ／ｍｌ）での細胞刺激に続く、Ｕ３７３培養培地内へのＴＬＲ１４の分泌を示している。分泌されたタンパク質はＴＬＲ１４の完全長形態であるようであり、最大分泌は６時間で生じている。
【実施例】
【００９０】
示された実施例は例示のためのみであり、本発明の範囲内の多様な変更及び修飾が当業者には明らかになるであろう。
材料及び方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３及びＵ３７３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補給したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【００９１】
発現プラスミド
キメラＴＬＲレセプターＣＤ４−ＴＬＲ４はR. Medzhitov (Yale University,New Haven, CT) から贈与された。ＴＬＲ１４ ｃＤＮＡ(KIAA0644)を含有するベクターはKazusa DNA Research Institute から供給され、続いてのＰＣＲクローニングの標的として使用された。使用されたプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶのための制限部位を含んでおり、以下のものであった：5'-GCAAGCTTATGGAGGCTGCCCGCGCCTTG （センス）（配列番号５）；及び5'−GCGATATCGGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCGGCAAATCGC （アンチセンス）（配列番号６）。アンチセンスプライマーはトランスフェクト細胞中の翻訳されたタンパク質産物の発現を検出するため、９アミノ酸ヘマグルチニンエピトープタグをコードする配列を含んでいる。生じたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen ）の多クローニング部位内にライゲートした。
【００９２】
Ｍａｌ欠損胚性幹細胞の発生及びマイクロアレイ解析
Ｍａｌをコードする遺伝子を欠く胚性幹細胞は相同的組換えにより発生させた。簡単には、マウス胚性幹細胞に、ネオマイシン耐性カセットでＭａｌ遺伝子が置き換えられたコード配列のほとんどを７００ｂｐエクソンがコードする標的化ベクターを電気穿孔した。標的化細胞をサザンブロッティングにより同定した後、Ｍａｌ欠失についてホモ接合性クローンを発生させるために２回目の標的化にかける。変異体及び野生型細胞を種々の時間、ＬＰＳで刺激し、マイクロアレイ解析のためにＲＮＡを抽出した。
【００９３】
プロモーター分析
ヒトRikenクローンKIAA0644及び隣接領域の完全ヌクレオチド配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov. のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) ウェブサイトから得られた。転写されたヌクレオチド配列及びゲノム配列中のリピート配列の同定は、ＮＩＸアプリケーション（http://menu.hgmp.mrc.ac.uk ）及びプログラムＲｅｐｅａｔ−ｍａｓｋｅｒ（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu ）を使用して実施した（２０）。転写因子結合部位予想はＭａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（www.genomatix.de/cgi- bin/matinspector/matinspector.pl ）を使用して実施した（２１）。
【００９４】
培養細胞からのｍＲＮＡ単離
ｍＲＮＡは、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で種々の時間処理した後、細胞から抽出した。簡単には、処理した細胞をペレット化し、１ｍｌのＴＲＩ試薬（Sigma ）で溶解した。クロロホルム（０．２ｍｌ）をサンプルに加え、混合物を１２，００Ｏｇで１５分遠心分離した。ＲＮＡを含有する水相を除き、等量のイソプロパノールの添加により、混合物から全ＲＮＡを沈澱させた。１２，０００ｇで１０分遠心分離した後、ＲＮＡ含有ペレットを５００μｌの７５％エタノールで洗浄した。エタノールのいずれの痕跡も除去し、ペレットを室温で１０分放置して乾燥させた。ペレットを３０μｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁し、−８Ｏ℃で保存した。
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲをＰｒｏｍｅｇａ ＩｍｐｒｏｍｐｔＩＩ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して実施した。逆転写反応は２工程で実施し、次ぎにＰＣＲ反応を合成されたｃＤＮＡに対して実施した。
【００９５】
工程１：薄壁５００μｌＰＣＲマイクロ遠心チューブ中で、１μｌのランダムプライマーを４μｌのＲＮＡに加えた。遠心チューブを７０℃で５分及び４℃で５分のサーマルサイクラーに置いた。
【００９６】
工程２：成分の第二の組を加えた；１μｌのデオキシヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ混合）（各ｄＮＴＰを５００μＭ）、５．５μｌのＰＣＲ試薬用水、４．０μｌの１０Ｘ緩衝液、３．０μｌの塩化マグネシウム、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（１単位／μｌ）、１μｌのＲＴ（１単位／μｌ）。これでＰＣＲチューブの総容量が２０μｌとなる。チューブを以下の時間及び温度、２５℃で５分、４２℃で６０分、７０℃で１５分、のサーマルサイクラーに置いた。
【００９７】
以下のものを薄壁５００μｌＰＣＲマイクロ遠心チューブに加えた：５μｌの１０Ｘ緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰを２００μＭ）、１μｌのＰＣＲプライマー（各々０．４μｌ）、２〜５μｌの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（０．０５単位／μｌ）及びＰＣＲチューブ中の総容量を５０μｌとなすのに十分な量のＰＣＲ試薬用水。増幅温度は以下の通りであった、変性／ＲＴ不活性化（工程１）９４℃で２分、変性（工程２）９４℃で１５秒、アニーリング（工程３）５５℃で３０秒、伸長６８℃で１分（工程２、３及び４を３５回繰り返した）、最終伸長（工程５）６８℃で５分。ＰＣＲ産物を次ぎに１％アガロースゲルで電気泳動し、ＵＶトランスルミナーターで可視化した。
【００９８】
タンパク質発現の検出
推定タンパク質のＣ末端に方向付けられたペプチド抗体は、Eurogentec, Liege Science Park, Belgium で合成された。免疫化に使用されたペプチドは以下のアミノ酸から構成されていた−CGSLRREDRLLQRFAD（配列番号７）。細胞株を、示されたように種々の時間、ＴＬＲリガンドで処理した。冷ＰＢＳの添加により刺激を停止し、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶解した。ウエスタンブロッティングのため、ＴＬＲ１４抗体を、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝化塩水中で１：１０００に希釈した。
【００９９】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞又はＵ３７３細胞を９６ウェルプレートに蒔き（ウェル当たり２ｘ１０４細胞）、次の日、発現ベクター及びレポータープラスミドでトランスフェクトした。「Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（商標）」（Novagen）を、製造元の説明書に従って一過性トランスフェクションに使用した。ＮＦ−κＢ又はＩＲＦ３を含んでいる実験については、８０ｎｇのＮＦ−κＢ−又はＩＳＲ３−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Stratagene ）を、４０ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部対照プラスミド（Promega ）と共に細胞内にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を受動溶解緩衝液（Promega ）に採取し、レポーター遺伝子活性をルミノメーターで測定した。細胞が刺激される場合、ＬＰＳ（Sigma ）を採取に先立った６時間前に、１μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加えた。データは対照レベルに対して平均誘導倍数±ｓ．ｄ．で表現されている（代表的実験については３回の別々の実験から、各々３重に実施した）。
【０１００】
酵素結合免疫吸着アッセイ
Ｕ３７３細胞を、ＴＬＲＨ発現プラスミドの増加させた用量（１、１０及び１００ｎｇ）でトランスフェクトした。細胞は３７℃で２４時間インキュベートした。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の捕獲抗体（マウス抗ヒトＲＡＮＴＥＳ）で被覆した。２４時間後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した。プレートを次ぎに１％ＢＳＡ及び５％スクロース含有ＰＢＳ中、室温で１時間ブロックした。細胞上清（１００μｌ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次ぎに検出抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＲＡＮＴＥＳ）を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でウェルに加えた。プレートを再び室温で２時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを各ウェルに加え、プレートを覆い、室温で２０分インキュベートした。最後に、１００μｌの基質溶液（R&D Systems 、カタログ番号ＤＹ９９９）を加え、続いて５０μｌの停止溶液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）をウェルに加えた。各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１０１】
共免疫沈降アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍのプレートに、１ｘ１０５細胞／ｍｌで蒔いた。次の日、細胞を３μｇのｆｌａｇタグ付けＴＬＲ２、ＴＬＲ４又はＭｙｃ−タグ付けＭｙＤ８８でトランスフェクトした。２４時間後、１％ＮＰ４０を含有するヘペス緩衝液中で細胞を溶解した。細胞溶解物は次ぎにＭ２抗ｆｌａｇアガロースビーズ（Sigma ）とインキュベートした。３時間後、ビーズをヘペス緩衝液で３回洗浄し、２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。タンパク質サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、ウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースに移した。生じたブロットを抗ＴＬＲ１４及び抗ｆｌａｇ抗体で探索した。
【０１０２】
局在化研究
ＬＰＳでの刺激に先立った２４時間前、細胞を１０ｃｍディッシュに１ｘ１０５細胞／ｍｌで蒔いた。膜及び細胞質分画を超遠心により調製し、ＴＬＲ１４の局在化を決定するためＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。１０％ＦＣＳを含有する培地（ＤＭＥＭ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてＴＬＲ１４の存在についてブロットした。
【０１０３】
ＴＬＲ１４をコードする遺伝子の特徴付け
予備的マイクロアレイ解析は、ＭａＩノックアウト細胞において低発現レベルを示す６つの遺伝子を同定した。該遺伝子の５つはある程度特徴付けられていたが、残りの遺伝子は新規であり、そして本明細書において特徴付けられた。この遺伝子の配列は、Kazusa DNA Research Institute (www.Kazusa.or.jp) でのヒトｃＤＮＡプロジェクトの一部として、ＨＵＧＥ（Human Unidentified Gene-Encoded Large Proteins ）タンパク質データベースから入手可能である。以下に概説する理由から、この新規遺伝子をＴＬＲ１４と名付けた。
【０１０４】
我々は、ＮＣＢＩから入手可能なＭａｐ Ｖｉｅｗｅｒツールを使用して、該遺伝子をヒト７番染色体に位置付けした（図１Ａ）。該遺伝子は４．７ｋｂの長さであり、ＣＲＥＢ５及びＣＰＶＬカルボキシペプチダーゼが隣接していた。ヒト及びマウスＴＬＲ１４についてのヌクレオチド配列は、それぞれ図１Ｂ及び１Ｃに示されている。予測されたタンパク質は８１１アミノ酸長であり（図１Ｄ）、すべての膜局在化タンパク質に共通する特色である、Ｎ末端シグナル配列を含有する。推定タンパク質のＮ末端も少なくとも６つのロイシンリッチリピートを含有し、いくつかのＴＬＲの細胞外領域と高度に相同的である（ＴＬＲ４が例として図１Ｅに与えられている）。
【０１０５】
発現プロフィールは、図２Ａに示されているように、脳、腎臓及び卵巣における遺伝子産物の高い存在量を明らかにした（情報はKazusa DNA Research Institute から得られた）。ＴＬＲ１４のＣ末端に対するポリクローナル抗体を発生させた。免疫化に使用したペプチドはアミノ酸CGSLRREDDRLLQRFAD （配列番号７）を含む。抗体は、ヒト脳及び肺組織においておよそ８１ｋＤａのタンパク質を検出した（図２Ｂ）。
【０１０６】
上記のように、ＴＬＲファミリーのメンバーのすべてが細胞質ＴＩＲドメインを含有する。このドメインは約２００アミノ酸に広がり、ファミリーメンバー間で、さまざまな程度の配列類似性を有している。３つの特定のｂｏｘを同定することが可能であり、それはファミリーメンバー間で高度に保存的である。ｂｏｘ１はファミリーのシグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列と考えられ、一方、ｂｏｘ２及び３はシグナル伝達について決定的なアミノ酸を含有する。ＴＬＲｌ及びＴＬＲ２のＴＩＲドメインの結晶構造は、ｂｏｘ２の周囲を中心とするコア構造要素を明らかにした（２２）。ＢＢループと名付けられたこの領域は、暴露された表面パッチ（ｐａｔｃｈ）を形成し、中心的なプロリン又はアルギニン残基を含有する。これらのアミノ酸はループの先端に位置し、下流シグナル伝達成分との接触点を形成する。ＴＬＲ１４の詳細な検査は、それが高度に保存されたｂｏｘ２及び同一視することができるｂｏｘ１及び３（図３）を含有することも明らかにし、この新規タンパク質がＴＬＲスーパーファミリーに属することを示唆している。
【０１０７】
ＴＬＲ１４の発現は、細胞をＴＬＲ２及びＴＬＲ４リガンドで処理した後に誘導される
上記のように、ＬＰＳへの暴露後、Ｍａｌを欠く細胞においてはＴＬＲ１４発現が無効にされる。このことは、問題とする遺伝子がＬＳＰ及びおそらく他のＴＬＲリガンドにより調節されていることを示している。この問題をさらに追求するため、我々はＮＩＸアプリケーション（http://menu.hgmp.mrc.ac.uk ）及びＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（www.genomatix.de/cgi-bin/matinspector/ matinspector.pl）を使用して、ＴＬＲ１４のプロモーター領域及び可能な転写因子結合部位を同定した。機能性ＴＬＲ１４プロモーターはエクソン１近位の４ｋｂ領域内に含まれているようである。この領域のさらなる分析は、ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ７及びＥｔｓ−１のようないくつかの転写因子のための推定結合部位を明らかにした（図４）。ＴＬＲ１４ ｍＲＮＡ発現の誘導は、炎症性刺激による細胞の処理に続いてのＲＴ−ＰＣＲにより分析した。図５Ａに示されたように、ＴＬＲ１４ ｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳへの暴露後の時間と共に、脳星状細胞腫細胞（Ｕ３７３）及び初代マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）で誘導された。著しい増加もＬＰＳで処理したマウスの脳から調製されたＴＬＲ１４ ｍＲＮＡのレベルで検出された（図５Ｂ）。発現の誘導は、図６Ａに示されたように、ＴＬＲ２リガンドＰａｍ３Ｃｙｓでの処理後、ヒトグリオーマ細胞株、Ａ１７２中のタンパク質レベルでも検出された。類似の効果が、ＴＬＰ４で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞で、ＬＰＳでの処理後に見られた（図６Ｂ）。加えて、図６Ｃに示されたように、ＴＬＲ１４タンパク質発現の増加が、ＬＰＳを注射したマウスの脳で観察された。
【０１０８】
ＴＬＲ１４は転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３を活性化する
上記のように、ＮＦ−κＢはＴＬＲスーパーファミリーのほとんどのメンバーにより活性化されるが、一方、ＩＲＦ３活性化はＴＬＲ３及びＴＬＲ４に限定されている。ＴＬＲ１４がこれらの因子も活性化し、及び免疫応答を変調することができるかどうかを追求するため、該タンパク質をコードするｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１内にクローン化し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３が結合するＤＮＡの要素を含有するルシフェラーゼレポーター構築物を使用して機能性アッセイを実施した。該タンパク質はヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするタグを含有し、発現は抗ＨＡ抗体を使用して多様な細胞株で発現を検出した（データは示されていない）。ＴＬＲ１４発現プラスミドがκＢ及びＩＳＲＥレポーター構築物とともに細胞内にトランスフェクトされた場合、ルシフェラーゼ活性が増強され（図７）、ＴＬＲ４同様、ＴＬＲ１４がＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の両方を活性化することを示唆している。予備的ＥＬＩＳＡも、ＴＬＲ１４でトランスフェクトした細胞においてＲＡＮＴＥＳ産生（ＩＲＦ３誘導可能サイトカイン）の増加を示した（図８）。
【０１０９】
ＴＬＲ１４はＴＬＲファミリーの他のメンバーと相互作用する
ＴＩＲドメイン含有タンパク質の共通の特色は、他のＴＩＲドメイン含有タンパク質とホモ又はヘテロ二量体形成するそれらの能力である。ＴＬＲ１４が一方又は両方のレセプターと相互作用できるかどうかを決定するため、ＴＬＲ１４及びＴＩＲドメイン含有レセプターＴＬＲ２及びＴＬＲ４で共免疫沈降実験を実施した。図９Ａに示したように、ＴＬＲ１４は過剰発現されたＴＬＲ２及びＴＬＲ４と強く相互作用することを見出した。ＴＬＲのＴＩＲドメイン中の保存的プロリン残基のヒスチジンへの変異はＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用を消滅させることが知られている（２２）。従って、レセプターの変異体（Ｐ／Ｈ）形がＴＬＲ１４と同時発現されると、ＴＬＲ１４とＴＬＲ２か又はＴＬＲ４との相互作用が著しく減少した。図９Ｂに示したように、ＴＬＲ１４は普遍的ＴＩＲドメイン含有アダプターＭｙＤ８８とも相互作用することが見出された。このことは、ＴＬＲ１４がＴＩＲドメイン含有タンパク質であるという考えを支持している。最後に、図１０に示したように、ＴＬＲ２及び内在性ＴＬＲ１４間の相互作用を検出することができた。このことを試験するため、ＨＥＫ２９３細胞をｆｌａｇタグ付けＴＬＲ２でトランスフェクトした。細胞を次ぎに溶解し、ＴＬＲ２及びいずれかの相互作用するタンパク質と免疫沈降させるため、抗ｆｌａｇビーズとインキュベートした。ウエスタンブロッティング後、抗ＴＬＲ１４抗体を使用して、ＴＬＲ１４に相当するバンドを検出することができた。
【０１１０】
ＴＬＲ１４は血清中に高レベルで見出され、可溶性タンパク質として産生することができる
ＴＬＲ１４が原形質膜に局在化されているかどうかを決定するため、細胞分画を調製した。驚いたことに、ＴＬＲ１４は細胞の細胞質分画に見出された（図１１Ａ）。加えて、高レベルの該タンパク質がウシ胎児血清中に見出され（図１１Ｂ）、該タンパク質は可溶性分泌タンパク質であることができることを示唆している。質量分光法的分析は、ＦＣＳ中に存在するバンドは、ヒトＴＬＲ１４のウシ相同体であったことを明らかにした（データは示されていない）。予備的実験も、ＬＰＳでの刺激後、該タンパク質がＵ３７３細胞から分泌されることを示した。分子量が完全長タンパク質の分子量に相当するので、該タンパク質は切断されていないようである。最大分泌は６時間で生じる。
【０１１１】
本発明は、細部にわたって変更することができる、本明細書で上に記載された態様に制限されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列及びＴＬＲリガンドを含む、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含む、リガンド／レセプター複合体。
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列及びＴＬＲリガンドを含む、組換え又は合成的に生成されたタンパク質を含む、リガンド／レセプター複合体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−１２１８８８（Ｐ２０１２−１２１８８８Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−６６０８（Ｐ２０１２−６６０８）
【出願日】平成２４年１月１６日（２０１２．１．１６）
【分割の表示】特願２００８−５０７２６１（Ｐ２００８−５０７２６１）の分割
【原出願日】平成１８年４月１８日（２００６．４．１８）
【出願人】（５０７３４５０００）ザ・プロヴォスト，フェローズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホーリー・アンド・アンディヴァイデッド・トリニティー・オブ・クイーン・エリザベス，ニア・ダブリン (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１月１６日（２０１２．１．１６）
【分割の表示】特願２００８−５０７２６１（Ｐ２００８−５０７２６１）の分割
【原出願日】平成１８年４月１８日（２００６．４．１８）
【出願人】（５０７３４５０００）ザ・プロヴォスト，フェローズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホーリー・アンド・アンディヴァイデッド・トリニティー・オブ・クイーン・エリザベス，ニア・ダブリン (7)
【Ｆターム（参考）】
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