ドコサヘキサエン酸およびドコサヘキサエン酸を含む化合物
【課題】ＤＨＡ含有食用単細胞オイルを提供する。
【解決手段】渦鞭毛虫、好ましくはクリプテコディニウムコニーを供給源とすることにより、トリグリセリドを含む食用単細胞オイルであって、ＤＨＡがオイルの少なくとも２０％を占める食用単細胞オイル、より好ましくは、少なくとも７０％のトリグリセリドを含み、ＤＨＡがトリグリセリドの少なくとも３０％を占める、食用単細胞オイルが提供される。
【解決手段】渦鞭毛虫、好ましくはクリプテコディニウムコニーを供給源とすることにより、トリグリセリドを含む食用単細胞オイルであって、ＤＨＡがオイルの少なくとも２０％を占める食用単細胞オイル、より好ましくは、少なくとも７０％のトリグリセリドを含み、ＤＨＡがトリグリセリドの少なくとも３０％を占める、食用単細胞オイルが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する食用単細胞オイルに関する。本発明は、また、本オイルを含有する製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＡはオメガ−３−脂肪酸で脳灰白質中の最も多量の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）である。オメガ−３−脂肪酸は一般に冠状動脈心疾患の発現低下に有益であることが知られている（非特許文献１）。しかし、オメガ−３−脂肪酸の代謝はよく知られていない。従って、正確な臨床用量と有効性は未知である。
【０００３】
冷水海魚はＤＨＡを含むオメガ−３−脂肪酸の供給源であることが知られている。特許文献１はＣ22オメガ−３−脂肪酸供給源として大型ニシン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）やニシン（ｈｅｒｒｉｎｎｇ）等から採れる魚油の利用を開示している。実際、魚油はオメガ−３−脂肪酸の主な商品化用供給源である。しかし、魚油はＰＣＢ等の環境汚染物質の混入により人間の消費には使用できないことが多い。
【０００４】
食品用にＤＨＡ含有魚油を回収することに関しては問題もある。このようなオイルには脂肪酸の酸化生成物に関連する魚臭といやな味があることが多い。この過酸化物の味と毒性が本オイルのベビーフードや乳幼児用調合乳等の食用組成物への使用を満足できないものにしている。
【０００５】
海中微生物もＤＨＡを含有することが知られている。特に、種々の渦（双）鞭毛虫類がＤＨＡを含有することが知られている。Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎらは、８つの光合成、および１つの有機栄養海中渦鞭毛虫の脂肪酸含有量を特性づけ、渦鞭毛虫がドコサヘキサエン酸の一次生産者群であり、この化合物の海中食物運鎖にかなりの量で寄与していると結論づけている（非特許文献２）。
【０００６】
ＤＨＡ含有の食用オイルを産生する渦鞭毛虫類の培養は成功していない。渦鞭毛虫類は概して非常に成長が遅く剪断力感受性が高い（非特許文献３）。従来技術は培養槽のごくわずかな振動でさえ培養物の成長を減じると開示している。しかし、商品化用産生では増殖を最大化するための適当な酸素添加反応を達成するためにはこのような振動が必要である。
【０００７】
ＤＨＡは上述したように脳と網膜中の最も多量の長鎖ＰＵＦＡであるので、乳幼児の脳と視覚の適正な発達に不可欠であると考えられている。哺乳類では食物中のリノール酸からＤＨＡを生合成する代謝経路があるが、この経路は生物エネルギー学的に不利であり（非特許文献４）、哺乳類は魚類同様ＤＨＡのほとんどを食物から得ていると考えられている。乳幼児の場合、最も適当な供給源は母乳である。実際、ＤＨＡは母乳中最も多量のＣ20オメガ−３−ＰＵＦＡである。しかし、一般にＤＨＡは乳幼児用調合乳には含まれていない。特許文献１はオメガ−３−脂肪酸含有の乳幼児用調合乳を開示している。しかし、そこで利用されている脂肪酸は卵あるいは魚（Ｔａｌａｐｉａ）油から得たもので、前述した好ましくない特性がある。さらに、魚油は一般に他のオメガ−３−脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、これは持続性抗凝血作用と乳幼児のアラキドン酸濃度抑制のため乳幼児用調合乳に望ましくない成分である。これは乳幼児の体重増加率の減少と関連がある（非特許文献５）。実際、母乳中ＥＰＡ濃度は非常に低い（ＤＨＡの４分の１以下）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】合衆国特許第 ４，６７０，２８５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌａｎｄｓ，Ｆｉｓｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ（１９８６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（海中渦鞭毛虫類の多不飽和脂肪酸）、Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ，１７：２１３−２１９（１９７０）
【非特許文献３】Ｇｕｉｌｌａｒｄら、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ，（１９８４），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献４】Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｐ．Ａ０ＣＳ．Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｐｏｌｙ−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ，ｐｐ．２７０−２９５（１９８７）
【非特許文献５】Ｃａｒｌｅｓｏｎら、ＩＮＦＯＲＭ １：３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の１つの目的はＤＨＡ含有単細胞食用オイルを提供することである。本オイルは他の多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有意量、すなわち全脂肪酸量の約２％以上含まないことが好ましい。概して、本発明の目的は単細胞オイルを商品化可能な収率で産生することである。本オイルはここで「デザイナー」オイルとして特徴づけるが、抽出後に、乳幼児用調合乳、ベビーフード、栄養補助食品および医薬品に使用できる。
【００１１】
加えて、オメガ−３−脂肪酸の代謝経路をさらによく理解することが望ましい。これについては同位体標識ＤＨＡが非常に有用と考えられる。しかし、今日まで十分量の同位体標識ＤＨＡを産生する方法は知られていない。従って、このような研究を行うに十分な量の同位体標識ＤＨＡを提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は微生物、特に渦鞭毛虫類の発酵槽での培養と、この微生物がＤＨＡを高率で含有する単細胞オイルを有意量産生するよう誘導することを含む、前記オイルの回収に関する。ここで用いる「単細胞オイル」は単細胞有機体の脂質産生物をさす。本発明は、少なくとも約２０重量％のＤＨＡを含有する単細胞オイルを多量に産生できる変異有機体も含み、またＤＨＡ含有単細胞オイルも含む。
【００１３】
本発明はＤＨＡ含有食用オイルを高水準で得る経済的な方法を提供する。加えて、本法は高細胞濃度の渦鞭毛虫の商品化用培養も可能にする。
本発明による方法で産生した食用オイルにはいやな味や魚臭がなく従来の供給源から得たＤＨＡ含有オイルによくみられる環境汚染物質も含まない。従って、本発明はさらに本発明のオイルを含有する食品も含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【図２】図２は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【図３】図３は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に従い、ＤＨＡ含有単細胞オイル産生能のある微生物をこのような微生物の増殖を支持できる栄養液に入れ発酵槽で培養する。単細胞オイルはＤＨＡを少なくとも約２０重量パーセント含むことが望ましい。
【００１６】
ＤＨＡ含有食用単細胞オイル産生能のある微生物はすべて本発明に用いることができる。たとえば、光合成珪藻類を用いることができる。好ましい微生物はＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．を含む海中渦鞭毛虫類である。特に好ましいしものは Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉであり、これは増殖に還元炭素源を要する偏性有機栄養生物である。Ｃ．ｃｏｈｎｉｉが好ましい理由は、十分量（全ＰＵＦＡ量の約１％以上）存在するＰＵＦＡがＤＨＡのみであるという脂肪酸プロフィールを有するからである。この有機体の標本は、ＭＫ８８４０と称し、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ の Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ に寄託されており、受け入れ番号４０７５０号である。ここで用いられる微生物、あるいは微生物の特異型には、野生株、変異株あるいは組換え型を含む。ＤＨＡ含有オイルを高水準で産生する微生物はすべて本発明の範囲内と考えられる。本発明の特徴の１つは渦鞭毛虫類等の微生物の食用オイル産生能力の認識と、それに伴うこのようなオイルの信頼できる経済的な供給源の維持の問題の解決である。従って、野性型微生物とＤＨＡ含有単細胞オイルを産生するよう設計された組換え微生物は本発明の一面である。このような組換え微生物には、同じ基質で、同じ野性型微生物が産生する量と比べて、単細胞オイル中のＤＨＡ量が多くなるように、あるいは総オイル量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。また、さらに費用効果のすぐれた基質を効率よく用いて匹適する野性型と同量のＤＨＡ含有単細胞オイルを産生するよう設計された微生物も含まれる。
【００１７】
一般に、当該技術分野の専門家は Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ が発酵槽内培養に適する有機体であると考えようとしなかった。従前の研究者は Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ を首尾よく培養するには極めて複雑な栄養混合物が必要であると説明してきた。Ｇｏｌｄら、Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ，１３：２５５−２５７（１９６６）；Ｇｕｉｌｌａｒｄ ら、ｉｎ"Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１６７９−１６８３（１９８８）。これに対して、本発明はグルコースと酵母エキスを含む簡単な培地でＤＨＡ産生微生物の培養をなしとげる。これらの成分を海水等の溶液に用いて経済的に有意な増殖速度と細胞濃度が得られる。たとえば、３〜５日の発酵期間で、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ細胞濃度は少なくとも溶液１ｌあたりバイオマス１０ｇで、一般には２０から約４０ｇ／ｌに達しうる。このような濃度はこれまで到達されえなかった。
【００１８】
培養はすべての適当な発酵槽で行えるが、撹拌槽発酵槽（Ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ；ＳＴＦ）かエアリフト発酵槽（ＡＬＦ）で有機体と増殖することが好ましく、いずれのタイプも当該技術分野専門家既知である。ＳＴＦを選んだ場合は、Ｒｕｓｈｔｏｎ型高効率タービンかピッチドブレードあるいはマリンインペラーを用いて撹拌する。撹拌と散布が微生物への酸素供給をくり返す。バイオマスの増加につれて、酸素要求量が増えるので、通常撹拌速度を上げる。翅端速度は約５００ｃｍ／秒以下に、好ましくは約３００ｃｍ／秒以下に保つことが望ましい。大きな翅端速度にも剪断をうけることなく耐えうる微生物株の選択は当該技術分野の範囲内である。このような株の使用は本発明に明らかに含まれる。
【００１９】
上述したように、海水は栄養溶液として認容できる培養基である。海水は自然のものでも、濾過したものでも、人工的に混合したものでもよく、いずれも水道水で希釈して塩度を通常の１／２から１／４に減じたり、２倍に濃縮してもよい。好ましい例は、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標）（ＩＯ）ブランドの人工海水である。Ｃ．Ｃｏｈｎｉｉは海水微生物であるが、塩度０でもいくらかの増殖が観察されている。低塩度でもよく増殖する変異体の使用は本発明に特に包含されている。微量元素を添加してもよく、これは低塩度で必要となることがある。しかし、このような微量元素は当該技術専門家既知であり概して海水や水道水中に存在する。選択した微生物が、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ等の有機栄養生物である場合は炭素源を添加する。海水培養基を発酵槽に入れた後、栄養分と微生物の種を加える前に培養基入り発酵槽を滅菌し冷却する。（栄養分を海水と一緒に滅菌してもよいが、この滅菌方法では有効グルコースの減損をきたすことがある。）栄養分と微生物は同時に加えても順々に加えてもよい。
【００２０】
有効種濃度は当該技術専門家により決定される。ＳＴＦを用いる場合、発酵開始時に１ｌあたり約０．０５〜１．０ｇ乾燥重量当量の添加が好ましい。これは約１０6細胞／ｍｌである。従って３０ｌの発酵槽では、生存能力のある細胞を１ｌあたり２０ｇ乾燥重量の濃度で含む種付け培養基１〜３ｌを添加する。
【００２１】
酸素濃度は少なくとも空気飽和濃度の約１０％のＤ.０.に維持することが好ましい。ＤＨＡ生合成には酸素が必要であるので、ＤＨＡの収率を上げるには空気飽和濃度の約１０〜５０％のＤ.０.濃度が必要である。翅端撹拌速度１５０〜２００ｃｍ／秒と給気速度１ＶＶＭ（１分あたりの空気体積／発酵槽体積）の組み合わせによりバイオマス濃度約２５ｇ乾燥重量／培養物１ｌで約２０〜３０％のＤ.０.濃度が提供できる。細胞濃度が高ければより高いＤ.０.濃度が必要となるが、これは０2散布による給気速度の増加が発酵槽の空気圧の上昇で達成できる。
【００２２】
認容できる炭素源は当該技術分野専門家既知である。たとえば、炭素はグルコースの形で Ｃ．ｃｏｈｎｉｉに供給できる。他の有機栄養生物は他の還元炭素源を用いることができるが、これは当該技術専門家により容易に決定され、独立栄養生物は二酸化炭素を利用する。Ｃ．ｃｏｈｎｉｉは他のもっと複雑な還元炭素源でも増殖する。一般には、グルコース約１０〜５０ｇ／ｌで発酵を開始する。発酵中必要に応じてグルコースを追加する。あるいは、グルコース約５０〜１５０ｇ／ｌ、好ましくは５０〜１００ｇを最初に加えて、以降の追加回数を少なくすることもできる。他の有機体に供給する炭素源の量は当該技術分野専門家により容易に決定される。
【００２３】
還元炭素源に加えて、酵母エキス（ＹＥ）等の窒素源を培養基に供給する。市販の酵母エキスが認容される。たとえば、ＤＩＦＣＯやＭＡＲＣＯＲブランドの酵母エキスを使用できる。酵母エキスは微量元素も含む有機窒素源である。他の有機窒素源は当該技術専門家により容易に決定できる。しかし、このような化合物は概して酵母エキスより高価である。尿素や硝酸塩で増殖可能な変異体の使用は本発明の範囲内である。一般にＹＥ約６〜１２ｇ／ｌで発酵を開始する。必要に応じてさらにＹＥを追加してもよい。一般的な発酵は全工程でＹＥ約８〜１５ｇ／ｌを要する。従って、その量のＹＥを最初に加えて以降の追加の必要を減らすことができる。正確な量は当該技術専門家により決定できる。一般に、グルコースとＹＥの比は約２：１から約１５：１である。
【００２４】
培養はどのような生命維持温度でも行える。一般にＣ．ｃｏｈｎｉｉは約１５℃から３４℃の範囲で増殖する。温度を約２０〜３０℃に保つことが好ましい。高温で増殖する株は倍増時間が短く発酵時間を減じられるので好ましい。他の微生物の適正温度範囲は当該技術専門家によって容易に決定される。
【００２５】
培養は広いｐＨ範囲、一般にはｐＨ約５．０ から９．０で遂行される。増殖期には約６．０から約７．０のｐＨ範囲を用いることが好ましい。接種前にはＫＯＨやＮａＯＨ等の塩基を用いて培養基ｐＨを調整する。発酵の後期には、培養基はアルカリ性になる傾向がある。必要であれば、増殖期中のアルカリ性を修正するために無機酸のｐＨ調節剤を用いてもよい。渦鞭毛虫での単細胞オイルの産生は定常期の賦課（たとえば窒素枯渇やｐＨ上昇）によって誘発される。ＹＥ欠乏は、利用できるグルコースが残存しているのに培養基がＹＥを使い果すようにＹＥ供給量を制限することに起因する。本発明は、単細胞オイルの効率のよい産生を促進するものが、炭素源の窒素源に対する比であることを認めている。例としてグルコースとＹＥを用いると、好ましい炭素源と窒素源の比は、ＹＥ１に対してグルコース約１０〜１５である。他の炭素源と窒素源における同様の比は当該技術専門家により算出できる。
【００２６】
オイル産生誘発後、培養物をさらに２４時間増殖させる。この油合成期間中、ＤＨＡ含有単細胞オイルが合成され可視のオイル滴が現れる。当該技術専門家は、加えたＹＥ量に基づく細胞バイオマスの期待値に達するに要する発酵時間を容易に算出できる。その時間が経過したら、培養物をさらに２４時間増殖させてから採収する。一般に、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉを単細胞オイルを産生するに足る時間、通常約６０分から約９０分、培養するが、この時間は変動する。
【００２７】
野生型 Ｃ．ｃｏｈｎｉｉを用いて、結果として生じるバイオマスの約１５〜３０％が抽出可能なオイルから成る。株の選択によりこの比率を上げることができ、このような選択は本発明の範囲内である。本オイルは、一般に次の脂肪酸組成を有するトリグリセリドを約７０％以上含むことが好ましい。
１５〜２０％ミリスチン酸（Ｃ14：0）
２０〜２５％パルミチン酸（Ｃ16：0）
１０〜１５％オレイン酸（Ｃ18：0）
３０〜４０％ＤＨＡ（Ｃ22：6）
０〜１０％その他（ホスファチジルコリン等の極性脂質を含む他のオイル成分もＤＨＡに含まれることがある）
粗オイルの特性は黄澄色で室温で液体である。本オイルはＤＨＡを少なくとも約２０重量％含むことが望ましく、約３５重量％以上含むことが最も望ましい。
【００２８】
有機体は当該技術分野専門家既知の従来法である遠心分離，凝集，濾過等で採収し、すぐに加工処理するが、後の加工処理用に乾燥させる。いずれの場合も、オイルは有効量の溶媒で容易に抽出できる。適当な溶媒は当該技術専門家により決定される。しかし、好ましい溶媒には精製へキサンと臨界超過ＣＯ２等の臨界超過液体が含まれる。
【００２９】
臨界超過液体を用いた抽出法は当該技術分野専門家既知で、ＭｃＨｕｇｌらの Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆ１ｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，１９８６．に記載されている。抽出溶媒がへキサンである場合は、乾燥バイオマスに対するへキサンの適当な割合は、乾燥バイオマス１ｋｇあたりへキサン約４ｌである。へキサンとバイオマスを撹拌反応槽に入れ約２０〜５０℃の温度で約２時間混合することが好ましい。混合後、バイオマスを濾過しオイルを含むへキサンから分離する。あるいは、湿性バイオマスペースト（固形分３０〜３５％）をエタノール、イソプロパノールあるいはへキサン／イソプロパノール混合物等のより極性の高い溶媒で直接抽出できる。残澄バイオマス、すなわち Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ等の微生物の単細胞食用オイル抽出後のバイオマスは動物の飼料として使用できるがこれは約３５〜４０％のタンパク質、８〜１０％の灰分、４５〜５０％の炭水化物を含む。タンパク質含有率が高くＤＨＡ濃度も高いことから、バイオマスペースト全体を水産養殖（例、エビ，カキ，魚）飼料として使用できる。
【００３０】
その後、当該技術分野専門家既知の蒸留方法でオイルから溶媒を除去する。従来の油料種子加工装置が濾過、分離および蒸留の遂行に適している。個々の適用において、当該技術分野専門家既知の追加加工行程が必要であれば行ってよい。この行程も従来の植物性オイル加工に含まれるものと類似しており、ＤＨＡに富む極性脂質分画の分離を可能にする。
【００３１】
本発明の方法により、ＤＨＡの代謝経路の研究を可能にする量の標識ＤＨＡを含む同位体標識単細胞オイルを簡単に得ることができる。還元炭素基質として１３Ｃ−グルコースか１４Ｃ−グルコースを供給すると標識ＤＨＡが得られる。
【００３２】
本発明は、本発明のＤＨＡ含有単細胞オイルを含む乳幼児用調合乳、ベビーフード、栄養補助食品等の食品も含む。当該技術専門家はＤＨＡ含有乳幼児用調合乳が望ましいと認めてはきたが、従来技術の乳幼児用調合乳は魚油からとったＤＨＡを含んでおり、それに付随するいやな味と特殊感覚器に印象を与える特性があった。さらに、乳幼児用調合乳に魚油を添加すると、抗凝血作用がありアラキドン酸生合成の減少におそらく関与しているオメガ−３−脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）も添加される。このような作用は乳幼児用調合乳やベビーフードに望ましくなく、ここで記述した単細胞オイルには有意な量のＥＰＡは含まれていない。本発明の単細胞オイルを含有する乳幼児用調合乳等の食品には魚油の持つ不快な特殊感覚器に印象を与える特性がない。従って食品は乳幼児にも成人にもより容易に認容される。本発明の乳幼児用調合乳は０．０５重量％のＤＨＡ含有単細胞オイルを含むことが好ましい。さらに固形分の多い本発明のベビーフードは、約０．５重量％のＤＨＡ含有単細胞オイルを含むことが好ましい。いずれの場合でも、オイルが少なくとも約３５％のＤＨＡを含むことが最も好ましい。
【００３３】
本発明はＤＨＡ含有単細胞オイルを含む医薬品を含む。本製品は少なくとも約３５％のＤＨＡを含むことが好ましい。このような医薬品の例としては乳幼児や成人への完全非経口栄養（ＴＰＮ）の供給に適したものがある。さらに、単細胞オイルを含有する栄養補助食品も含まれる。このような栄養補助食品は前記オイルをカプセルに入れたゼラチンカプセル形態で妊婦や授乳中の婦人に適することが好ましい。これは特に菜食主義者で食事から十分量のＤＨＡを摂れないような女性に適する。
【００３４】
本発明はＤＨＡ含有単細胞オイルも含む。本単細胞オイルは少なくとも約２０重量％のＤＨＡを含むことが好ましい。本オイルは少なくとも約３５重量％のＤＨＡを含むことが最も好ましい。
本発明を全般的に記述してきたが、次に特定実施例を引用するがこれに限られるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
作業容量３０ｌのＳＴＦに濃度２分の１の人工海水を入れた。ＩＯ６ｌを水道水１８ｌと化合した。培養基の入った発酵槽を滅菌し２８℃まで冷却した。濃縮ＹＥ（４５５ｇ／ｌ）４００ｍｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）９００ｍｌおよび約２×１０7細胞／ｍｌあるいはバイオマス２０ｇ／ｌ（最終濃度は約７×１０6細胞／ｍｌあるいはバイオマス約７００ｍｇ／ｌになる）含有する種発酵槽からの接種物１ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度１２０ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（３０ｌ／分）に設定した。３０時間後にグルコースシロップ（９００ｍｌ）を追加し、さらに次の４２時間の間に４．２ｌを追加した。従って計６ｌのグルコースシロップを加えた。６時間後に濃縮ＹＥ溶液（４００ｍｌ）を加え次の４８時間の間にさらに１．２ｌ追加し、計２．０ｌ加えた。Ｄ.０.２０％以上に維持するため２４時間後に翅端速度を１５０ｃｍ／秒に、４８時間後には１６０ｃｍ／秒に上げた。７２時間後には翅端速度を２００ｃｍ／秒に上げ、最後投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。培養条件を図１にグラフで示す。その後細胞球粒を保持して遠心分離により培養物を採収した。採収した細胞球粒を凍結乾燥して水分含有量約４％とした。へキサン（２．８ｌ）を乾燥バイオマスに加えガラスケトルに入れ５０℃で１．５時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約１７５ｇを産生した。
【００３６】
実施例２
作業容量３５０ｌのＳＴＦにＩ.Ｏ.（登録商標）４．３ｋｇと水道水２３０ｌを化合して作った濃度２分の１の人工海水培養基を入れた。培養基を入れた発酵槽を滅菌し２８℃まで冷却した。濃縮ＹＥ（４００ｇ／ｌ）６．８ｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）１２．５ｌおよび種発酵槽（１０6 細胞／ｍｌあるいはバイオマス濃度約１．３ｇ／ｌ）からの Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ接種物３０ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度７３ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（２８０ｌ／分）に設定した。約４４時間後にグルコースシロップ（１２ｌ）を追加し次の３２時間の間にさらに４３ｌを加えた。従って、計６７．５ｌのグルコースシロップを加えた。グルコース添加と細胞増殖を図２にグラフで表す。
Ｄ.０.を２０％以上に維持するため、４４時間後に指枠麹端速度を１７５ｃｍ／秒に上げ、５５時間後には２２５ｃｍ／秒に上げた。７６時間後には翅端速度を１５０ｃｍ／秒に下げて、最終投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。その後培養物を採収した。採収した細胞を乾燥し水分含有量約４％とした。へキサンを乾燥バイオマスに加えてガラスケトルに入れ２５℃で２時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約７００ｇを産生した。
【００３７】
実施例３
作業容量３０ｌのＳＴＦにＩ.Ｏ.（登録商標）５６５ｇと水道水１５ｌを化合して作った正規濃度の人工海水を入れた。培養基を入れた発酵槽を滅菌し２８℃に冷却した。濃縮ＹＥ（４００ｇ／ｌ）４００ｍｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）１．９ｌ、および種発酵槽（１０６細胞／ｌあるいはバイオマス約２０ｇ／ｌ）からの Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ接種物１ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度８０ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（２０ｌ／分）に設定した。９４時間後にグルコースシロップ（１．５ｌ）を追加し１１６時間後にさらに１．１ｌ追加した。従って、計４．５ｌのグルコースシロップを加えた。
Ｄ.０.を ２０％以上に維持するため、５２時間後に撹拌翅端速度を１６０ｃｍ／秒に上げた。６６時間後に、定常期を導入したがこれを成しとげるために４Ｎ ＫＯＨでＰＨを７．０にスパイクし撹拌翅端速度は行程中さらには上げなかった。図３に示すように、最終投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。その後培養物を採収した。採収した細胞を乾燥し水分含有量約４％とした。乾燥バイオマスにへキサンを加えガラスケトルに入れ５０℃で１．５時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約６５ｇ産生した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はドコサへキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する食用単細胞オイルに関する。本発明は、また、本オイルを含有する製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＡはオメガ−３−脂肪酸で脳灰白質中の最も多量の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）である。オメガ−３−脂肪酸は一般に冠状動脈心疾患の発現低下に有益であることが知られている（非特許文献１）。しかし、オメガ−３−脂肪酸の代謝はよく知られていない。従って、正確な臨床用量と有効性は未知である。
【０００３】
冷水海魚はＤＨＡを含むオメガ−３−脂肪酸の供給源であることが知られている。特許文献１はＣ22オメガ−３−脂肪酸供給源として大型ニシン（ｍｅｎｈａｄｅｎ）やニシン（ｈｅｒｒｉｎｎｇ）等から採れる魚油の利用を開示している。実際、魚油はオメガ−３−脂肪酸の主な商品化用供給源である。しかし、魚油はＰＣＢ等の環境汚染物質の混入により人間の消費には使用できないことが多い。
【０００４】
食品用にＤＨＡ含有魚油を回収することに関しては問題もある。このようなオイルには脂肪酸の酸化生成物に関連する魚臭といやな味があることが多い。この過酸化物の味と毒性が本オイルのベビーフードや乳幼児用調合乳等の食用組成物への使用を満足できないものにしている。
【０００５】
海中微生物もＤＨＡを含有することが知られている。特に、種々の渦（双）鞭毛虫類がＤＨＡを含有することが知られている。Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎらは、８つの光合成、および１つの有機栄養海中渦鞭毛虫の脂肪酸含有量を特性づけ、渦鞭毛虫がドコサヘキサエン酸の一次生産者群であり、この化合物の海中食物運鎖にかなりの量で寄与していると結論づけている（非特許文献２）。
【０００６】
ＤＨＡ含有の食用オイルを産生する渦鞭毛虫類の培養は成功していない。渦鞭毛虫類は概して非常に成長が遅く剪断力感受性が高い（非特許文献３）。従来技術は培養槽のごくわずかな振動でさえ培養物の成長を減じると開示している。しかし、商品化用産生では増殖を最大化するための適当な酸素添加反応を達成するためにはこのような振動が必要である。
【０００７】
ＤＨＡは上述したように脳と網膜中の最も多量の長鎖ＰＵＦＡであるので、乳幼児の脳と視覚の適正な発達に不可欠であると考えられている。哺乳類では食物中のリノール酸からＤＨＡを生合成する代謝経路があるが、この経路は生物エネルギー学的に不利であり（非特許文献４）、哺乳類は魚類同様ＤＨＡのほとんどを食物から得ていると考えられている。乳幼児の場合、最も適当な供給源は母乳である。実際、ＤＨＡは母乳中最も多量のＣ20オメガ−３−ＰＵＦＡである。しかし、一般にＤＨＡは乳幼児用調合乳には含まれていない。特許文献１はオメガ−３−脂肪酸含有の乳幼児用調合乳を開示している。しかし、そこで利用されている脂肪酸は卵あるいは魚（Ｔａｌａｐｉａ）油から得たもので、前述した好ましくない特性がある。さらに、魚油は一般に他のオメガ−３−脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含み、これは持続性抗凝血作用と乳幼児のアラキドン酸濃度抑制のため乳幼児用調合乳に望ましくない成分である。これは乳幼児の体重増加率の減少と関連がある（非特許文献５）。実際、母乳中ＥＰＡ濃度は非常に低い（ＤＨＡの４分の１以下）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】合衆国特許第 ４，６７０，２８５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌａｎｄｓ，Ｆｉｓｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ（１９８６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（海中渦鞭毛虫類の多不飽和脂肪酸）、Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ，１７：２１３−２１９（１９７０）
【非特許文献３】Ｇｕｉｌｌａｒｄら、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ，（１９８４），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献４】Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｐ．Ａ０ＣＳ．Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｐｏｌｙ−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ，ｐｐ．２７０−２９５（１９８７）
【非特許文献５】Ｃａｒｌｅｓｏｎら、ＩＮＦＯＲＭ １：３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の１つの目的はＤＨＡ含有単細胞食用オイルを提供することである。本オイルは他の多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有意量、すなわち全脂肪酸量の約２％以上含まないことが好ましい。概して、本発明の目的は単細胞オイルを商品化可能な収率で産生することである。本オイルはここで「デザイナー」オイルとして特徴づけるが、抽出後に、乳幼児用調合乳、ベビーフード、栄養補助食品および医薬品に使用できる。
【００１１】
加えて、オメガ−３−脂肪酸の代謝経路をさらによく理解することが望ましい。これについては同位体標識ＤＨＡが非常に有用と考えられる。しかし、今日まで十分量の同位体標識ＤＨＡを産生する方法は知られていない。従って、このような研究を行うに十分な量の同位体標識ＤＨＡを提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は微生物、特に渦鞭毛虫類の発酵槽での培養と、この微生物がＤＨＡを高率で含有する単細胞オイルを有意量産生するよう誘導することを含む、前記オイルの回収に関する。ここで用いる「単細胞オイル」は単細胞有機体の脂質産生物をさす。本発明は、少なくとも約２０重量％のＤＨＡを含有する単細胞オイルを多量に産生できる変異有機体も含み、またＤＨＡ含有単細胞オイルも含む。
【００１３】
本発明はＤＨＡ含有食用オイルを高水準で得る経済的な方法を提供する。加えて、本法は高細胞濃度の渦鞭毛虫の商品化用培養も可能にする。
本発明による方法で産生した食用オイルにはいやな味や魚臭がなく従来の供給源から得たＤＨＡ含有オイルによくみられる環境汚染物質も含まない。従って、本発明はさらに本発明のオイルを含有する食品も含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【図２】図２は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【図３】図３は、種々の栄養物を添加したＣ．ｃｏｈｎｉｉの経時的バイオマス累積のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に従い、ＤＨＡ含有単細胞オイル産生能のある微生物をこのような微生物の増殖を支持できる栄養液に入れ発酵槽で培養する。単細胞オイルはＤＨＡを少なくとも約２０重量パーセント含むことが望ましい。
【００１６】
ＤＨＡ含有食用単細胞オイル産生能のある微生物はすべて本発明に用いることができる。たとえば、光合成珪藻類を用いることができる。好ましい微生物はＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．を含む海中渦鞭毛虫類である。特に好ましいしものは Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉであり、これは増殖に還元炭素源を要する偏性有機栄養生物である。Ｃ．ｃｏｈｎｉｉが好ましい理由は、十分量（全ＰＵＦＡ量の約１％以上）存在するＰＵＦＡがＤＨＡのみであるという脂肪酸プロフィールを有するからである。この有機体の標本は、ＭＫ８８４０と称し、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ の Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ に寄託されており、受け入れ番号４０７５０号である。ここで用いられる微生物、あるいは微生物の特異型には、野生株、変異株あるいは組換え型を含む。ＤＨＡ含有オイルを高水準で産生する微生物はすべて本発明の範囲内と考えられる。本発明の特徴の１つは渦鞭毛虫類等の微生物の食用オイル産生能力の認識と、それに伴うこのようなオイルの信頼できる経済的な供給源の維持の問題の解決である。従って、野性型微生物とＤＨＡ含有単細胞オイルを産生するよう設計された組換え微生物は本発明の一面である。このような組換え微生物には、同じ基質で、同じ野性型微生物が産生する量と比べて、単細胞オイル中のＤＨＡ量が多くなるように、あるいは総オイル量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。また、さらに費用効果のすぐれた基質を効率よく用いて匹適する野性型と同量のＤＨＡ含有単細胞オイルを産生するよう設計された微生物も含まれる。
【００１７】
一般に、当該技術分野の専門家は Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ が発酵槽内培養に適する有機体であると考えようとしなかった。従前の研究者は Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ を首尾よく培養するには極めて複雑な栄養混合物が必要であると説明してきた。Ｇｏｌｄら、Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ，１３：２５５−２５７（１９６６）；Ｇｕｉｌｌａｒｄ ら、ｉｎ"Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１６７９−１６８３（１９８８）。これに対して、本発明はグルコースと酵母エキスを含む簡単な培地でＤＨＡ産生微生物の培養をなしとげる。これらの成分を海水等の溶液に用いて経済的に有意な増殖速度と細胞濃度が得られる。たとえば、３〜５日の発酵期間で、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ細胞濃度は少なくとも溶液１ｌあたりバイオマス１０ｇで、一般には２０から約４０ｇ／ｌに達しうる。このような濃度はこれまで到達されえなかった。
【００１８】
培養はすべての適当な発酵槽で行えるが、撹拌槽発酵槽（Ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ；ＳＴＦ）かエアリフト発酵槽（ＡＬＦ）で有機体と増殖することが好ましく、いずれのタイプも当該技術分野専門家既知である。ＳＴＦを選んだ場合は、Ｒｕｓｈｔｏｎ型高効率タービンかピッチドブレードあるいはマリンインペラーを用いて撹拌する。撹拌と散布が微生物への酸素供給をくり返す。バイオマスの増加につれて、酸素要求量が増えるので、通常撹拌速度を上げる。翅端速度は約５００ｃｍ／秒以下に、好ましくは約３００ｃｍ／秒以下に保つことが望ましい。大きな翅端速度にも剪断をうけることなく耐えうる微生物株の選択は当該技術分野の範囲内である。このような株の使用は本発明に明らかに含まれる。
【００１９】
上述したように、海水は栄養溶液として認容できる培養基である。海水は自然のものでも、濾過したものでも、人工的に混合したものでもよく、いずれも水道水で希釈して塩度を通常の１／２から１／４に減じたり、２倍に濃縮してもよい。好ましい例は、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標）（ＩＯ）ブランドの人工海水である。Ｃ．Ｃｏｈｎｉｉは海水微生物であるが、塩度０でもいくらかの増殖が観察されている。低塩度でもよく増殖する変異体の使用は本発明に特に包含されている。微量元素を添加してもよく、これは低塩度で必要となることがある。しかし、このような微量元素は当該技術専門家既知であり概して海水や水道水中に存在する。選択した微生物が、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ等の有機栄養生物である場合は炭素源を添加する。海水培養基を発酵槽に入れた後、栄養分と微生物の種を加える前に培養基入り発酵槽を滅菌し冷却する。（栄養分を海水と一緒に滅菌してもよいが、この滅菌方法では有効グルコースの減損をきたすことがある。）栄養分と微生物は同時に加えても順々に加えてもよい。
【００２０】
有効種濃度は当該技術専門家により決定される。ＳＴＦを用いる場合、発酵開始時に１ｌあたり約０．０５〜１．０ｇ乾燥重量当量の添加が好ましい。これは約１０6細胞／ｍｌである。従って３０ｌの発酵槽では、生存能力のある細胞を１ｌあたり２０ｇ乾燥重量の濃度で含む種付け培養基１〜３ｌを添加する。
【００２１】
酸素濃度は少なくとも空気飽和濃度の約１０％のＤ.０.に維持することが好ましい。ＤＨＡ生合成には酸素が必要であるので、ＤＨＡの収率を上げるには空気飽和濃度の約１０〜５０％のＤ.０.濃度が必要である。翅端撹拌速度１５０〜２００ｃｍ／秒と給気速度１ＶＶＭ（１分あたりの空気体積／発酵槽体積）の組み合わせによりバイオマス濃度約２５ｇ乾燥重量／培養物１ｌで約２０〜３０％のＤ.０.濃度が提供できる。細胞濃度が高ければより高いＤ.０.濃度が必要となるが、これは０2散布による給気速度の増加が発酵槽の空気圧の上昇で達成できる。
【００２２】
認容できる炭素源は当該技術分野専門家既知である。たとえば、炭素はグルコースの形で Ｃ．ｃｏｈｎｉｉに供給できる。他の有機栄養生物は他の還元炭素源を用いることができるが、これは当該技術専門家により容易に決定され、独立栄養生物は二酸化炭素を利用する。Ｃ．ｃｏｈｎｉｉは他のもっと複雑な還元炭素源でも増殖する。一般には、グルコース約１０〜５０ｇ／ｌで発酵を開始する。発酵中必要に応じてグルコースを追加する。あるいは、グルコース約５０〜１５０ｇ／ｌ、好ましくは５０〜１００ｇを最初に加えて、以降の追加回数を少なくすることもできる。他の有機体に供給する炭素源の量は当該技術分野専門家により容易に決定される。
【００２３】
還元炭素源に加えて、酵母エキス（ＹＥ）等の窒素源を培養基に供給する。市販の酵母エキスが認容される。たとえば、ＤＩＦＣＯやＭＡＲＣＯＲブランドの酵母エキスを使用できる。酵母エキスは微量元素も含む有機窒素源である。他の有機窒素源は当該技術専門家により容易に決定できる。しかし、このような化合物は概して酵母エキスより高価である。尿素や硝酸塩で増殖可能な変異体の使用は本発明の範囲内である。一般にＹＥ約６〜１２ｇ／ｌで発酵を開始する。必要に応じてさらにＹＥを追加してもよい。一般的な発酵は全工程でＹＥ約８〜１５ｇ／ｌを要する。従って、その量のＹＥを最初に加えて以降の追加の必要を減らすことができる。正確な量は当該技術専門家により決定できる。一般に、グルコースとＹＥの比は約２：１から約１５：１である。
【００２４】
培養はどのような生命維持温度でも行える。一般にＣ．ｃｏｈｎｉｉは約１５℃から３４℃の範囲で増殖する。温度を約２０〜３０℃に保つことが好ましい。高温で増殖する株は倍増時間が短く発酵時間を減じられるので好ましい。他の微生物の適正温度範囲は当該技術専門家によって容易に決定される。
【００２５】
培養は広いｐＨ範囲、一般にはｐＨ約５．０ から９．０で遂行される。増殖期には約６．０から約７．０のｐＨ範囲を用いることが好ましい。接種前にはＫＯＨやＮａＯＨ等の塩基を用いて培養基ｐＨを調整する。発酵の後期には、培養基はアルカリ性になる傾向がある。必要であれば、増殖期中のアルカリ性を修正するために無機酸のｐＨ調節剤を用いてもよい。渦鞭毛虫での単細胞オイルの産生は定常期の賦課（たとえば窒素枯渇やｐＨ上昇）によって誘発される。ＹＥ欠乏は、利用できるグルコースが残存しているのに培養基がＹＥを使い果すようにＹＥ供給量を制限することに起因する。本発明は、単細胞オイルの効率のよい産生を促進するものが、炭素源の窒素源に対する比であることを認めている。例としてグルコースとＹＥを用いると、好ましい炭素源と窒素源の比は、ＹＥ１に対してグルコース約１０〜１５である。他の炭素源と窒素源における同様の比は当該技術専門家により算出できる。
【００２６】
オイル産生誘発後、培養物をさらに２４時間増殖させる。この油合成期間中、ＤＨＡ含有単細胞オイルが合成され可視のオイル滴が現れる。当該技術専門家は、加えたＹＥ量に基づく細胞バイオマスの期待値に達するに要する発酵時間を容易に算出できる。その時間が経過したら、培養物をさらに２４時間増殖させてから採収する。一般に、Ｃ．ｃｏｈｎｉｉを単細胞オイルを産生するに足る時間、通常約６０分から約９０分、培養するが、この時間は変動する。
【００２７】
野生型 Ｃ．ｃｏｈｎｉｉを用いて、結果として生じるバイオマスの約１５〜３０％が抽出可能なオイルから成る。株の選択によりこの比率を上げることができ、このような選択は本発明の範囲内である。本オイルは、一般に次の脂肪酸組成を有するトリグリセリドを約７０％以上含むことが好ましい。
１５〜２０％ミリスチン酸（Ｃ14：0）
２０〜２５％パルミチン酸（Ｃ16：0）
１０〜１５％オレイン酸（Ｃ18：0）
３０〜４０％ＤＨＡ（Ｃ22：6）
０〜１０％その他（ホスファチジルコリン等の極性脂質を含む他のオイル成分もＤＨＡに含まれることがある）
粗オイルの特性は黄澄色で室温で液体である。本オイルはＤＨＡを少なくとも約２０重量％含むことが望ましく、約３５重量％以上含むことが最も望ましい。
【００２８】
有機体は当該技術分野専門家既知の従来法である遠心分離，凝集，濾過等で採収し、すぐに加工処理するが、後の加工処理用に乾燥させる。いずれの場合も、オイルは有効量の溶媒で容易に抽出できる。適当な溶媒は当該技術専門家により決定される。しかし、好ましい溶媒には精製へキサンと臨界超過ＣＯ２等の臨界超過液体が含まれる。
【００２９】
臨界超過液体を用いた抽出法は当該技術分野専門家既知で、ＭｃＨｕｇｌらの Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆ１ｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，１９８６．に記載されている。抽出溶媒がへキサンである場合は、乾燥バイオマスに対するへキサンの適当な割合は、乾燥バイオマス１ｋｇあたりへキサン約４ｌである。へキサンとバイオマスを撹拌反応槽に入れ約２０〜５０℃の温度で約２時間混合することが好ましい。混合後、バイオマスを濾過しオイルを含むへキサンから分離する。あるいは、湿性バイオマスペースト（固形分３０〜３５％）をエタノール、イソプロパノールあるいはへキサン／イソプロパノール混合物等のより極性の高い溶媒で直接抽出できる。残澄バイオマス、すなわち Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ等の微生物の単細胞食用オイル抽出後のバイオマスは動物の飼料として使用できるがこれは約３５〜４０％のタンパク質、８〜１０％の灰分、４５〜５０％の炭水化物を含む。タンパク質含有率が高くＤＨＡ濃度も高いことから、バイオマスペースト全体を水産養殖（例、エビ，カキ，魚）飼料として使用できる。
【００３０】
その後、当該技術分野専門家既知の蒸留方法でオイルから溶媒を除去する。従来の油料種子加工装置が濾過、分離および蒸留の遂行に適している。個々の適用において、当該技術分野専門家既知の追加加工行程が必要であれば行ってよい。この行程も従来の植物性オイル加工に含まれるものと類似しており、ＤＨＡに富む極性脂質分画の分離を可能にする。
【００３１】
本発明の方法により、ＤＨＡの代謝経路の研究を可能にする量の標識ＤＨＡを含む同位体標識単細胞オイルを簡単に得ることができる。還元炭素基質として１３Ｃ−グルコースか１４Ｃ−グルコースを供給すると標識ＤＨＡが得られる。
【００３２】
本発明は、本発明のＤＨＡ含有単細胞オイルを含む乳幼児用調合乳、ベビーフード、栄養補助食品等の食品も含む。当該技術専門家はＤＨＡ含有乳幼児用調合乳が望ましいと認めてはきたが、従来技術の乳幼児用調合乳は魚油からとったＤＨＡを含んでおり、それに付随するいやな味と特殊感覚器に印象を与える特性があった。さらに、乳幼児用調合乳に魚油を添加すると、抗凝血作用がありアラキドン酸生合成の減少におそらく関与しているオメガ−３−脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）も添加される。このような作用は乳幼児用調合乳やベビーフードに望ましくなく、ここで記述した単細胞オイルには有意な量のＥＰＡは含まれていない。本発明の単細胞オイルを含有する乳幼児用調合乳等の食品には魚油の持つ不快な特殊感覚器に印象を与える特性がない。従って食品は乳幼児にも成人にもより容易に認容される。本発明の乳幼児用調合乳は０．０５重量％のＤＨＡ含有単細胞オイルを含むことが好ましい。さらに固形分の多い本発明のベビーフードは、約０．５重量％のＤＨＡ含有単細胞オイルを含むことが好ましい。いずれの場合でも、オイルが少なくとも約３５％のＤＨＡを含むことが最も好ましい。
【００３３】
本発明はＤＨＡ含有単細胞オイルを含む医薬品を含む。本製品は少なくとも約３５％のＤＨＡを含むことが好ましい。このような医薬品の例としては乳幼児や成人への完全非経口栄養（ＴＰＮ）の供給に適したものがある。さらに、単細胞オイルを含有する栄養補助食品も含まれる。このような栄養補助食品は前記オイルをカプセルに入れたゼラチンカプセル形態で妊婦や授乳中の婦人に適することが好ましい。これは特に菜食主義者で食事から十分量のＤＨＡを摂れないような女性に適する。
【００３４】
本発明はＤＨＡ含有単細胞オイルも含む。本単細胞オイルは少なくとも約２０重量％のＤＨＡを含むことが好ましい。本オイルは少なくとも約３５重量％のＤＨＡを含むことが最も好ましい。
本発明を全般的に記述してきたが、次に特定実施例を引用するがこれに限られるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
作業容量３０ｌのＳＴＦに濃度２分の１の人工海水を入れた。ＩＯ６ｌを水道水１８ｌと化合した。培養基の入った発酵槽を滅菌し２８℃まで冷却した。濃縮ＹＥ（４５５ｇ／ｌ）４００ｍｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）９００ｍｌおよび約２×１０7細胞／ｍｌあるいはバイオマス２０ｇ／ｌ（最終濃度は約７×１０6細胞／ｍｌあるいはバイオマス約７００ｍｇ／ｌになる）含有する種発酵槽からの接種物１ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度１２０ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（３０ｌ／分）に設定した。３０時間後にグルコースシロップ（９００ｍｌ）を追加し、さらに次の４２時間の間に４．２ｌを追加した。従って計６ｌのグルコースシロップを加えた。６時間後に濃縮ＹＥ溶液（４００ｍｌ）を加え次の４８時間の間にさらに１．２ｌ追加し、計２．０ｌ加えた。Ｄ.０.２０％以上に維持するため２４時間後に翅端速度を１５０ｃｍ／秒に、４８時間後には１６０ｃｍ／秒に上げた。７２時間後には翅端速度を２００ｃｍ／秒に上げ、最後投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。培養条件を図１にグラフで示す。その後細胞球粒を保持して遠心分離により培養物を採収した。採収した細胞球粒を凍結乾燥して水分含有量約４％とした。へキサン（２．８ｌ）を乾燥バイオマスに加えガラスケトルに入れ５０℃で１．５時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約１７５ｇを産生した。
【００３６】
実施例２
作業容量３５０ｌのＳＴＦにＩ.Ｏ.（登録商標）４．３ｋｇと水道水２３０ｌを化合して作った濃度２分の１の人工海水培養基を入れた。培養基を入れた発酵槽を滅菌し２８℃まで冷却した。濃縮ＹＥ（４００ｇ／ｌ）６．８ｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）１２．５ｌおよび種発酵槽（１０6 細胞／ｍｌあるいはバイオマス濃度約１．３ｇ／ｌ）からの Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ接種物３０ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度７３ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（２８０ｌ／分）に設定した。約４４時間後にグルコースシロップ（１２ｌ）を追加し次の３２時間の間にさらに４３ｌを加えた。従って、計６７．５ｌのグルコースシロップを加えた。グルコース添加と細胞増殖を図２にグラフで表す。
Ｄ.０.を２０％以上に維持するため、４４時間後に指枠麹端速度を１７５ｃｍ／秒に上げ、５５時間後には２２５ｃｍ／秒に上げた。７６時間後には翅端速度を１５０ｃｍ／秒に下げて、最終投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。その後培養物を採収した。採収した細胞を乾燥し水分含有量約４％とした。へキサンを乾燥バイオマスに加えてガラスケトルに入れ２５℃で２時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約７００ｇを産生した。
【００３７】
実施例３
作業容量３０ｌのＳＴＦにＩ.Ｏ.（登録商標）５６５ｇと水道水１５ｌを化合して作った正規濃度の人工海水を入れた。培養基を入れた発酵槽を滅菌し２８℃に冷却した。濃縮ＹＥ（４００ｇ／ｌ）４００ｍｌ、グルコースシロップ（４００ｇ／ｌ）１．９ｌ、および種発酵槽（１０６細胞／ｌあるいはバイオマス約２０ｇ／ｌ）からの Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ接種物１ｌを培養基に加えた。撹拌は翅端速度８０ｃｍ／秒に設定し給気は１ＶＶＭ（２０ｌ／分）に設定した。９４時間後にグルコースシロップ（１．５ｌ）を追加し１１６時間後にさらに１．１ｌ追加した。従って、計４．５ｌのグルコースシロップを加えた。
Ｄ.０.を ２０％以上に維持するため、５２時間後に撹拌翅端速度を１６０ｃｍ／秒に上げた。６６時間後に、定常期を導入したがこれを成しとげるために４Ｎ ＫＯＨでＰＨを７．０にスパイクし撹拌翅端速度は行程中さらには上げなかった。図３に示すように、最終投入グルコースが細胞オイルに転化するに十分な時間をおいて培養物を増殖させた。その後培養物を採収した。採収した細胞を乾燥し水分含有量約４％とした。乾燥バイオマスにへキサンを加えガラスケトルに入れ５０℃で１．５時間撹拌した。回転蒸発装置を用いてへキサンを除去し、粗ＤＨＡ含有オイル約６５ｇ産生した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が少なくとも２０重量％を占め、そしてトリグリセリドを７０％より多く含む、C. cohniiのバイオマスから抽出された粗食用単細胞オイル。
【請求項２】
ヘキサン抽出によりC. cohniiのバイオマスから得ることができる、請求項１項記載の粗オイル。
【請求項３】
ＤＨＡがオイルの少なくとも３５重量％を占める、請求項１または２記載の粗オイル。
【請求項４】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有意な量含まない、請求項１または２記載の粗オイル。
【請求項５】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む幼児用製剤。
【請求項６】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む幼児用食品。
【請求項７】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む食品。
【請求項８】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む医薬品。
【請求項９】
完全非経口栄養（ＴＰＮ）を供給するように適合された、請求項２１記載の医薬品。
【請求項１０】
請求項１または２項記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む栄養補助剤。
【請求項１１】
栄養補助剤がオイルを封入したゼラチンカプセルの形態である、請求項１０記載の栄養補助剤。
【請求項１２】
請求項１記載の粗食用単細胞オイルを含む渦鞭毛虫バイオマスを生産するための方法であって、上記オイルを生産することができる微生物を通気性発酵槽中の栄養溶液中において培養することにより、栄養溶液のリットルあたり少なくとも約１０グラムのバイオマスの細胞密度を達成し、そして上記バイオマスを回収することによるが、但し、微生物が渦鞭毛虫であり、そして定常期の賦課により該微生物を誘発して栄養溶液リットルあたり少なくとも約１．５グラムの濃度の単細胞オイルを生産する、方法。
【請求項１３】
（ａ）約１０６細胞／ｍｌ（０.５−１.０ｇ乾燥重量／リットル）のC．cohniiを、約１／４から１／２の塩度の人工海水、１−８％グルコースおよび０.４−０.８％酵母エキスを含む栄養溶液を初期に含む発酵槽に添加し；
（ｂ）C．cohniiを１５℃から３４℃の温度および５.０から９.０のｐＨで培養し；
（ｃ）グルコースと酵母エキスを約５６時間かけて漸次栄養溶液に添加し；
（ｄ）さらにグルコースを約１６時間かけて栄養溶液に添加して、C．cohniiがオイルを生産するのを誘発し；
（ｅ）培養中を通して溶解酸素含有量を空気飽和レベルの少なくとも約２０％に維持するように、発酵槽を撹拌および通気し；そして
（ｆ）約６０時間から約９０時間後にC．cohniiを回収する
ことからなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に従い生産されたバイオマスを含む動物用飼料。
【請求項１５】
請求項１２または１３に従い生産されたバイオマスを含む水産養殖用飼料。
【請求項１６】
請求項１ないし４の何れか１項記載の食用単細胞オイルを含む動物用飼料。
【請求項１７】
請求項１ないし４の何れか１項記載の食用単細胞オイルを含む水産養殖用飼料。
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が少なくとも２０重量％を占め、そしてトリグリセリドを７０％より多く含む、C. cohniiのバイオマスから抽出された粗食用単細胞オイル。
【請求項２】
ヘキサン抽出によりC. cohniiのバイオマスから得ることができる、請求項１項記載の粗オイル。
【請求項３】
ＤＨＡがオイルの少なくとも３５重量％を占める、請求項１または２記載の粗オイル。
【請求項４】
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を有意な量含まない、請求項１または２記載の粗オイル。
【請求項５】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む幼児用製剤。
【請求項６】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む幼児用食品。
【請求項７】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む食品。
【請求項８】
請求項１または２記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む医薬品。
【請求項９】
完全非経口栄養（ＴＰＮ）を供給するように適合された、請求項２１記載の医薬品。
【請求項１０】
請求項１または２項記載の粗オイルを追加の加工工程に供することにより得られた食用単細胞オイルを含む栄養補助剤。
【請求項１１】
栄養補助剤がオイルを封入したゼラチンカプセルの形態である、請求項１０記載の栄養補助剤。
【請求項１２】
請求項１記載の粗食用単細胞オイルを含む渦鞭毛虫バイオマスを生産するための方法であって、上記オイルを生産することができる微生物を通気性発酵槽中の栄養溶液中において培養することにより、栄養溶液のリットルあたり少なくとも約１０グラムのバイオマスの細胞密度を達成し、そして上記バイオマスを回収することによるが、但し、微生物が渦鞭毛虫であり、そして定常期の賦課により該微生物を誘発して栄養溶液リットルあたり少なくとも約１．５グラムの濃度の単細胞オイルを生産する、方法。
【請求項１３】
（ａ）約１０６細胞／ｍｌ（０.５−１.０ｇ乾燥重量／リットル）のC．cohniiを、約１／４から１／２の塩度の人工海水、１−８％グルコースおよび０.４−０.８％酵母エキスを含む栄養溶液を初期に含む発酵槽に添加し；
（ｂ）C．cohniiを１５℃から３４℃の温度および５.０から９.０のｐＨで培養し；
（ｃ）グルコースと酵母エキスを約５６時間かけて漸次栄養溶液に添加し；
（ｄ）さらにグルコースを約１６時間かけて栄養溶液に添加して、C．cohniiがオイルを生産するのを誘発し；
（ｅ）培養中を通して溶解酸素含有量を空気飽和レベルの少なくとも約２０％に維持するように、発酵槽を撹拌および通気し；そして
（ｆ）約６０時間から約９０時間後にC．cohniiを回収する
ことからなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に従い生産されたバイオマスを含む動物用飼料。
【請求項１５】
請求項１２または１３に従い生産されたバイオマスを含む水産養殖用飼料。
【請求項１６】
請求項１ないし４の何れか１項記載の食用単細胞オイルを含む動物用飼料。
【請求項１７】
請求項１ないし４の何れか１項記載の食用単細胞オイルを含む水産養殖用飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２２０６２７（Ｐ２０１０−２２０６２７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３４９３９（Ｐ２０１０−１３４９３９）
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【分割の表示】特願２００９−２３２８６（Ｐ２００９−２３２８６）の分割
【原出願日】平成３年２月４日（１９９１．２．４）
【出願人】（５０８００４４１０）マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【分割の表示】特願２００９−２３２８６（Ｐ２００９−２３２８６）の分割
【原出願日】平成３年２月４日（１９９１．２．４）
【出願人】（５０８００４４１０）マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション (26)
【Ｆターム（参考）】
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