ドナー収獲工程の間に島細胞がアポトーシスすることを防止する新規方法
本発明は、この後に実施される移植のためのドナー臓器から分泌される島の生存活性及び回収を改善する方法に、そしてより特に、島の生存活性を高めるためのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００７年３月２０日に出願された米国特許出願第６０／７８３，４１４号に基づく優先権を主張し、当該出願の全体を本明細書中に援出する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ランゲルハンス島は、膵臓内でインスリンを生産する細胞を含む多細胞体である。平均的なヒトは、約百万個の島を有し、そしてそれらは、膵臓内の細胞の全数の約２〜３パーセントを含む。膵臓は、インスリンを生産するベータ細胞を宿すランゲルハンス島を含む。ベータ細胞は、血中グルコースレベルをモニターし、そしてグルコールのピークと釣り合うように細かく計測された量のインスリンを放出する。Ｉ型及びII型糖尿病は、これらのベータ細胞の９０パーセント超が損傷を受けたときに発症する。
【０００３】
結合マトリックス及び残りの外分泌組織からの島の分離又は単離は、実験室での実験及び移植目的のために有利であり、かつ、有益である。島移植は、Ｉ型真性糖尿病の治療のためには最も有望で、最小に生理学的に侵襲性の手順である。完全な膵臓組織よりむしろ島を移植することは、移植が容易であるという別個の利点を有するだけではなく、消化酵素の分泌を含むドナー組織の膵臓外分泌機能の除去という利点をも有する。膵臓外分泌組織からの島の解放は、島移植に影響を及ぼす最初の、かつ、決定的なステップである。
【０００４】
「エドモントン・プロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」は、健康な島を糖尿病患者内に移植する。エドモントン・プロトコールを用いる島移植は、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒｙａｎ，ａｎｄ Ｌａｋｅｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３３，ｐｐ．３５０２−３５０３（２００１）；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ， Ｖｏｌ．５０，Ａｐｒｉｌ ２００１，ｐｐ．７１０−７１９；及びＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｇｌｙｃｅｍｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｖｏｌ．５１，Ｊｕｌｙ ２００２，ｐｐ．２１４８−２１５７中に記載されている。一旦、肝臓内に置かれると、細胞は血液供給に発展し、そしてインスリンを生産し始める。エドモントン・プロトコールは、使用される方法に依存して７〜１０ステップを含みうる。第１のステップは、ドナー膵臓への特定酵素（リベラーゼ（ｌｉｂｅｒａｓｅ））のデリバリーを含み、これは、膵臓組織を消化するが、島を消化しない。この消化ステップの後、膵臓内の他の細胞から島を分離するためのいくつかの連続したステップが存在する。分離された島は、門脈として知られる、肝臓の主要血管内に移植される。肝臓は、損傷を受けたとき自ら再生することができ、新しい血管及び支持組織を構築する。それゆえ、島が肝臓内に移植されたとき、新しい血管が形成され島を支持すると信じられる。上記細胞が生産するインスリンは、これらの周囲の血管を通して血流中に吸収され、そして体中に分配され、血中のグルコースレベルがコントロールされる。
【０００５】
概して、エドモントン・プロトコールのステップは、こわれやすい３次元構造を有し、そして成長及び生存のために多量の酵素を要求する、島の生存活性に害を及ぼす激しいプロセスを創り出す。このプロセスの間に、島は損傷を受け、又は酵素デリバリーの最適でない条件に因り破壊され、与えられたドナーの膵臓から得られる健康な島の収率に影響を及ぼすことになる。さらに、島移植は、ドナーの利用可能性によりきわめて制限されているので、しばしば、１人の患者におけるインスリンの独立性を獲得するために２つの膵臓が要求される。
【０００６】
島移植は、ステロイド・フリー、非糖尿病原性免疫抑制療法と一緒になって、Ｉ型糖尿病患者を治療するために使用されてきた。しかしながら、このような治療は、高脂血症及び高血圧の高められたリスクを導くことができ、そして長期間の研究は、島の生存活性が弱められることを証明している。
したがって、収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスから保護する方法が必要である。本発明は、この必要性に応えるものである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の要約
本発明は、ドナーの収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスを経験することを阻害する方法であって、島単離に先立って、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを島細胞ドナーの島細胞に投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記方法を提供する。ｓｉＲＮＡ又はアンチャンス構築物は、当該構築物がｅＩＦ５Ａの発現を阻害する限り、使用されうる。好ましいｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化１】
を含む。
【０００８】
ｓｉＲＮＡの投与は、好適な経路のいずれによってもよい。例示的な投与方法は、島細胞ドナーの門脈を通しての灌流、及び島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を含む。
【０００９】
本発明は、島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを当該島細胞に投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する前記方法をも提供する。
【００１０】
本発明の他の態様は、収獲された島細胞におけるアポトーシスを阻害するための方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する前記方法を提供する。
【００１１】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記組成物をも提供する。好ましい組成物は、以下のヌクレオチド配列：
【化２】
を含むｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
島内へのｓｉＲＮＡの取り込みが、逆行門脈接種を介した膵臓灌流により達成されうることは先に示されている。Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７，２３３−２３６，２００５を参照のこと。簡単に言えば、Ｃｙ−３標識ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｓｉＲＮＡ ＧＬ２ ２本鎖がＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でパッケージされて、又はパッケージされなくて、使用され、そして尾静脈（インビボ、５０μｇ／マウス）を通してか又は、逆行門脈接種（インサイチュー、２μｇ／マウス）により膵臓内に直接、注射された。膵臓を調達し、そしてインサイチュー・デリバリーの後２４時間、又はインビボ・デリバリーの後４時間、４℃で保存し、そして島を単離し、そして検査前さらに１６時間培養した。ｓｉＲＮＡ分布を可視化するために、膵臓をインスリンについて染色し、そして蛍光顕微鏡下で検査した。単離された島を蛍光顕微鏡下で直接調べた。パッケージされていないｓｉＲＮＡは、リポソームでパッケージされたｓｉＲＮＡを用いて観察されたときと同程度で島に到達し、これはインビボにおける、いわゆる“ｎａｋｅｄ”−ｓｉＲＮＡデリバリーの報告と呼応する。Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：１０７−１０８，Ｅｐｕｂ ２００２ Ｊｕｌ ２０２９，２００２、及びＭｃＣａｆｆｒｅｙ Ａｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２を参照のこと。
【００１３】
本発明は、島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する前記方法を提供する。図１は、島細胞への灌流が、当該島細胞への好適なデリバリー・メカニズムを提供することを示し、そして図３は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞が、より低いｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを実際に発現させることを示す。ｅＩＦ５Ａ発現を阻害することにより、アポトーシスも阻害される。図４と５は、単離に先立ってｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡで島細胞を処理することにより（サブＧ１相における細胞数の低下により証明されるように）細胞がアポトーシスすることを阻害したことを示す。したがって、本発明は、収獲された島細胞においてアポトーシスを粗対する方法であって、島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する前記方法をも提供する。
【００１４】
ｅＩＦ５Ａの発現を阻害するいずれのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを使ってもよい。用語「阻害」とは低下をも意味する。ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡのＩ例は、以下の配列：
【化３】
を含む。２００５年１１月２８日に出願された同時係属中の出願第１１／２９３，３９１号（その全体を本明細書中に援用する）は、追加の例示的ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓを提供し、そして他の細胞型においてｅＩＦ５Ａの発現を阻害するために使用されてきた、そしてまたアポトーシスを阻害することが示されていた他のアンチャンスを提供する。当業者は、上記ｅＩＦ５Ａ配列が与えられれば、他のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓを設計し、そして過度な実験を実施せずに発現を阻害するｓｉＲＮＡの能力について容易に試験することができるであろう。図６〜１１は、ｅＩＦ５Ａ、例示的ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓ、及びアンチャンス構築物の配列を提供する。本発明の他の態様においては、ｅＩＦ５Ａのアンチャンス構築物は、ｅＩＦ５Ａの発現を阻害するために使用され、そしてそれゆえ島細胞のアポトーシスを阻害することができる。
【００１５】
好ましい態様においては、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化４】
を含む。
【００１６】
本発明は、ドナー収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスを経験することを阻害する方法をも提供する。前記したように、多くの島細胞は、それらが収獲されるとき、アポトーシスを経験する。本発明者らは、収獲に先立って島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを提供することにより、アポトーシスに対する保護的有益性が与えられることを示した。ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、島の単離に先立って島細胞ドナーの島細胞に投与される。ドナー（これゆえ島細胞）は、ヒトを含む動物の島細胞であることができる。いずれの投与方法も使用されうる。例えば、ｓｉＲＮＡは、島細胞ドナーの門脈を通しての灌流を介して、又は島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を介して投与されうる。
【００１７】
門脈を通しての灌流は、胆管のカニューレ挿入に類似するが、針は、反対方向を指す。門脈は、肝臓の引っ込め、及びマウスの左側への内臓の寄せにより晒される。予備的な結び目をその周りに作り、そして胆管を含ませる。血管を刺した後、短い太針を膵臓に向って進め、そして上記結び目をその周りで絞める。マウスモデルにおいては、１ｍｌの生理食塩水又はｓｉＲＮＡ（５μｇ）をゆっくりと放出し、上記針を動かし、そして液体が漏れないように針の後ろで結び目を閉じる。この時点で、マウスを回転させ、そして胆管を膵臓消化にアクセスさせる。膵臓は、ｓｉＲＮＡで長く保持されうる。あるいは、それは除去されうるが、コラゲナーゼで、長時間冷却保存されうる。通常の島単離方法が続行され、そして島（５０）が１６時間インキュベートされうる。
【００１８】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより、当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記組成物をも提供する。本組成物は、前記したように他の又は追加のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含むことができる。好ましいｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化５】
を含む。
【実施例】
【００１９】
マウス島はｅＩＦ５Ａを発現する
全ＲＮＡを、単離されたマウス島から抽出し、そしてβ−アクチン及びｅＩＦ５ＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１）。休止した刺激されていない島は、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡの陽性レベルを示した。
【００２０】
ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡデリバリー：門脈の遅い灌流後に、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡレベルは低下した
マウスに、遅い逆行門脈灌流（図２）により、１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ（対照）配列又はｅＩＦ５Ａ，５μｇ）又は生理食塩水を、群当りｎ＝２で導入した。膵臓を、膵管のコラゲナーゼ灌注により消化し、そして島を、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１２１５３−１２１５８ Ｅｐｕｂ １２００５ Ａｕｇ．１２１００，２００５により記載されたように単離した。（マウス当り５０個の）島を１６時間インキュベートした。次いで全ＲＮＡを抽出し、そしてβ−アクチン及びｅＩＦ５ＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図３）。ｅＩＦ５Ａ／β−アクチンに関するｍＲＮＡ比は、５．２４（ＣＴ−ｓｉＲＮＡ）と３．０１（ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡ）であった。図３は、ｅＩＦ５ＡのｍＲＮＡレベルが、ｓｉＲＮＡで処理された細胞において低下していたことを示す。この実験をｎ＝３マウスで繰り返し、そして島をＲＮＡ抽出のために３連でインキュベートした；結果は、最初の観察と一致していた。
【００２１】
ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡデリバリー：門脈流体力学的灌流の後、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡレベルは低下し、そして島アポトーシス率も低下した
マウスに、５秒以内で完結する流体力学的逆行門脈灌流により、群当りｎ＝２で、１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ又はｅＩＦ５Ａ，５μｇ）又は生理食塩水を導入した。
【００２２】
膵臓を、胆管のコラゲナーゼ灌注により消化し、そして島を単離した。島を１６時間インキュベートし、そしてその後分割した：１の群は、アポトーシスの評価のためにヨウ化プロピジウムで染色し（マウス当り５０島）、そして他の群は、ＲＴ−ＰＣＲのために処理した（マウス当り２５島）。ｅＩＦ５Ａ／β−アクチンについてのｍＲＮＡのレベルは、再び、ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡ群よりもＣＴ−ｓｉＲＮＡ群内でより高かった。アポトーシス率は、２８．１％低下した（図４）。この実験を、ｎ＝３で繰り返し、アポトーシス率は再び低下した（図５）。
【００２３】
ビオチン化ｓｉＲＮＡにより島灌流
ビオチン化ｓｉＲＮＡ（５０μｇ）を、前記したように島内に灌流させた（遅い灌流、ｎ＝１）。膵臓を、染色のためにホルマリン中に固定した。
【００２４】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ分子を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯにより合成した。ｅＩＦ５Ａと対照ｓｉＲＮＡの配列は、それぞれ、以下の：
【化６】
と
【化７】
であった。
【００２５】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮ ｅａｓｙキットを用いて細胞から抽出した。ｅＩＦ５Ａプライマーは、前進：
【化８】
と後退：
【化９】
であった。
【００２６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシス染色
島の１回細胞懸濁を温やかなトリプリン処理により達成した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中、０．３％サポニン、ＥＤＴＡ １ｍＭ，Ｒｎａｓｅ，１％アジド、１％ＦＣＳ、及び５０μｇ／ｍｌ ＰＩを含むサポニン−ＰＩ混合物を添加した。細胞を十分にボルテックスし、そしてＦＡＣＳによりサブ−ＧＩ集団について分析する前６時間暗所４℃でインキュベートした。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡで門脈を通しての灌流後のβ−アクチン、ｍＡＡＴ、及びｅＩＦ５Ａについて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を提供する。この図は、ｅＩＦ５Ａ発現が計測可能であり、そしてそれゆえ、島内に取り込まれたことを示す。
【図２】図２は、遅い逆行門脈灌流を示す。胆管（白）と門脈（赤）は、予備的結び目（暗い縫合）の準備ができている。針は、結び目（矢印で示す方向）の下を侵入し、結び目の下を横切り、そして膵臓、脾臓、腸、及び３番目の遠位結腸に至る血管内にｓｉＲＮＡを放出する。
【図３】図３は、島内へのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡの灌流がｅＩＦ５Ａの発現の低下を引き起こすことを示す（ｅＩＦ５ＡのｍＲＮＡレベルの低下を示す）。
【図４】図４は、対照及び生理食塩水処理された島に比較してのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞のアポトーシスの低下を示す（群当りｎ＝２）。
【図５】図５は、対照及び生理食塩水処理された島に比較してのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞のアポトーシスの低下を示す（群当りｎ＝３）。
【図６】図６は、ｅＩＦ５Ａ２に対してアラインメントされたヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図７】図７は、ｅＩＦ５Ａ２に対してアラインメントされたヒトｅＩＦ５Ａ１のアミノ酸配列を提供する。
【図８】図８は、例示的アンチャンス・オリゴヌクレオチドとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図９】図９は、例示的アンチャンス・オリゴヌクレオチドとともにヒトのｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１１】図１１は、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００７年３月２０日に出願された米国特許出願第６０／７８３，４１４号に基づく優先権を主張し、当該出願の全体を本明細書中に援出する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ランゲルハンス島は、膵臓内でインスリンを生産する細胞を含む多細胞体である。平均的なヒトは、約百万個の島を有し、そしてそれらは、膵臓内の細胞の全数の約２〜３パーセントを含む。膵臓は、インスリンを生産するベータ細胞を宿すランゲルハンス島を含む。ベータ細胞は、血中グルコースレベルをモニターし、そしてグルコールのピークと釣り合うように細かく計測された量のインスリンを放出する。Ｉ型及びII型糖尿病は、これらのベータ細胞の９０パーセント超が損傷を受けたときに発症する。
【０００３】
結合マトリックス及び残りの外分泌組織からの島の分離又は単離は、実験室での実験及び移植目的のために有利であり、かつ、有益である。島移植は、Ｉ型真性糖尿病の治療のためには最も有望で、最小に生理学的に侵襲性の手順である。完全な膵臓組織よりむしろ島を移植することは、移植が容易であるという別個の利点を有するだけではなく、消化酵素の分泌を含むドナー組織の膵臓外分泌機能の除去という利点をも有する。膵臓外分泌組織からの島の解放は、島移植に影響を及ぼす最初の、かつ、決定的なステップである。
【０００４】
「エドモントン・プロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」は、健康な島を糖尿病患者内に移植する。エドモントン・プロトコールを用いる島移植は、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒｙａｎ，ａｎｄ Ｌａｋｅｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ−Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３３，ｐｐ．３５０２−３５０３（２００１）；Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ， Ｖｏｌ．５０，Ａｐｒｉｌ ２００１，ｐｐ．７１０−７１９；及びＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｇｌｙｃｅｍｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｖｏｌ．５１，Ｊｕｌｙ ２００２，ｐｐ．２１４８−２１５７中に記載されている。一旦、肝臓内に置かれると、細胞は血液供給に発展し、そしてインスリンを生産し始める。エドモントン・プロトコールは、使用される方法に依存して７〜１０ステップを含みうる。第１のステップは、ドナー膵臓への特定酵素（リベラーゼ（ｌｉｂｅｒａｓｅ））のデリバリーを含み、これは、膵臓組織を消化するが、島を消化しない。この消化ステップの後、膵臓内の他の細胞から島を分離するためのいくつかの連続したステップが存在する。分離された島は、門脈として知られる、肝臓の主要血管内に移植される。肝臓は、損傷を受けたとき自ら再生することができ、新しい血管及び支持組織を構築する。それゆえ、島が肝臓内に移植されたとき、新しい血管が形成され島を支持すると信じられる。上記細胞が生産するインスリンは、これらの周囲の血管を通して血流中に吸収され、そして体中に分配され、血中のグルコースレベルがコントロールされる。
【０００５】
概して、エドモントン・プロトコールのステップは、こわれやすい３次元構造を有し、そして成長及び生存のために多量の酵素を要求する、島の生存活性に害を及ぼす激しいプロセスを創り出す。このプロセスの間に、島は損傷を受け、又は酵素デリバリーの最適でない条件に因り破壊され、与えられたドナーの膵臓から得られる健康な島の収率に影響を及ぼすことになる。さらに、島移植は、ドナーの利用可能性によりきわめて制限されているので、しばしば、１人の患者におけるインスリンの独立性を獲得するために２つの膵臓が要求される。
【０００６】
島移植は、ステロイド・フリー、非糖尿病原性免疫抑制療法と一緒になって、Ｉ型糖尿病患者を治療するために使用されてきた。しかしながら、このような治療は、高脂血症及び高血圧の高められたリスクを導くことができ、そして長期間の研究は、島の生存活性が弱められることを証明している。
したがって、収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスから保護する方法が必要である。本発明は、この必要性に応えるものである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の要約
本発明は、ドナーの収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスを経験することを阻害する方法であって、島単離に先立って、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを島細胞ドナーの島細胞に投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記方法を提供する。ｓｉＲＮＡ又はアンチャンス構築物は、当該構築物がｅＩＦ５Ａの発現を阻害する限り、使用されうる。好ましいｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化１】
を含む。
【０００８】
ｓｉＲＮＡの投与は、好適な経路のいずれによってもよい。例示的な投与方法は、島細胞ドナーの門脈を通しての灌流、及び島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を含む。
【０００９】
本発明は、島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを当該島細胞に投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する前記方法をも提供する。
【００１０】
本発明の他の態様は、収獲された島細胞におけるアポトーシスを阻害するための方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する前記方法を提供する。
【００１１】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記組成物をも提供する。好ましい組成物は、以下のヌクレオチド配列：
【化２】
を含むｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
島内へのｓｉＲＮＡの取り込みが、逆行門脈接種を介した膵臓灌流により達成されうることは先に示されている。Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７，２３３−２３６，２００５を参照のこと。簡単に言えば、Ｃｙ−３標識ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｓｉＲＮＡ ＧＬ２ ２本鎖がＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でパッケージされて、又はパッケージされなくて、使用され、そして尾静脈（インビボ、５０μｇ／マウス）を通してか又は、逆行門脈接種（インサイチュー、２μｇ／マウス）により膵臓内に直接、注射された。膵臓を調達し、そしてインサイチュー・デリバリーの後２４時間、又はインビボ・デリバリーの後４時間、４℃で保存し、そして島を単離し、そして検査前さらに１６時間培養した。ｓｉＲＮＡ分布を可視化するために、膵臓をインスリンについて染色し、そして蛍光顕微鏡下で検査した。単離された島を蛍光顕微鏡下で直接調べた。パッケージされていないｓｉＲＮＡは、リポソームでパッケージされたｓｉＲＮＡを用いて観察されたときと同程度で島に到達し、これはインビボにおける、いわゆる“ｎａｋｅｄ”−ｓｉＲＮＡデリバリーの報告と呼応する。Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：１０７−１０８，Ｅｐｕｂ ２００２ Ｊｕｌ ２０２９，２００２、及びＭｃＣａｆｆｒｅｙ Ａｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２を参照のこと。
【００１３】
本発明は、島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する前記方法を提供する。図１は、島細胞への灌流が、当該島細胞への好適なデリバリー・メカニズムを提供することを示し、そして図３は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞が、より低いｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを実際に発現させることを示す。ｅＩＦ５Ａ発現を阻害することにより、アポトーシスも阻害される。図４と５は、単離に先立ってｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡで島細胞を処理することにより（サブＧ１相における細胞数の低下により証明されるように）細胞がアポトーシスすることを阻害したことを示す。したがって、本発明は、収獲された島細胞においてアポトーシスを粗対する方法であって、島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する前記方法をも提供する。
【００１４】
ｅＩＦ５Ａの発現を阻害するいずれのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを使ってもよい。用語「阻害」とは低下をも意味する。ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡのＩ例は、以下の配列：
【化３】
を含む。２００５年１１月２８日に出願された同時係属中の出願第１１／２９３，３９１号（その全体を本明細書中に援用する）は、追加の例示的ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓを提供し、そして他の細胞型においてｅＩＦ５Ａの発現を阻害するために使用されてきた、そしてまたアポトーシスを阻害することが示されていた他のアンチャンスを提供する。当業者は、上記ｅＩＦ５Ａ配列が与えられれば、他のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓを設計し、そして過度な実験を実施せずに発現を阻害するｓｉＲＮＡの能力について容易に試験することができるであろう。図６〜１１は、ｅＩＦ５Ａ、例示的ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡｓ、及びアンチャンス構築物の配列を提供する。本発明の他の態様においては、ｅＩＦ５Ａのアンチャンス構築物は、ｅＩＦ５Ａの発現を阻害するために使用され、そしてそれゆえ島細胞のアポトーシスを阻害することができる。
【００１５】
好ましい態様においては、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化４】
を含む。
【００１６】
本発明は、ドナー収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスを経験することを阻害する方法をも提供する。前記したように、多くの島細胞は、それらが収獲されるとき、アポトーシスを経験する。本発明者らは、収獲に先立って島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを提供することにより、アポトーシスに対する保護的有益性が与えられることを示した。ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、島の単離に先立って島細胞ドナーの島細胞に投与される。ドナー（これゆえ島細胞）は、ヒトを含む動物の島細胞であることができる。いずれの投与方法も使用されうる。例えば、ｓｉＲＮＡは、島細胞ドナーの門脈を通しての灌流を介して、又は島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を介して投与されうる。
【００１７】
門脈を通しての灌流は、胆管のカニューレ挿入に類似するが、針は、反対方向を指す。門脈は、肝臓の引っ込め、及びマウスの左側への内臓の寄せにより晒される。予備的な結び目をその周りに作り、そして胆管を含ませる。血管を刺した後、短い太針を膵臓に向って進め、そして上記結び目をその周りで絞める。マウスモデルにおいては、１ｍｌの生理食塩水又はｓｉＲＮＡ（５μｇ）をゆっくりと放出し、上記針を動かし、そして液体が漏れないように針の後ろで結び目を閉じる。この時点で、マウスを回転させ、そして胆管を膵臓消化にアクセスさせる。膵臓は、ｓｉＲＮＡで長く保持されうる。あるいは、それは除去されうるが、コラゲナーゼで、長時間冷却保存されうる。通常の島単離方法が続行され、そして島（５０）が１６時間インキュベートされうる。
【００１８】
本発明は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより、当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記組成物をも提供する。本組成物は、前記したように他の又は追加のｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含むことができる。好ましいｓｉＲＮＡは、以下のヌクレオチド配列：
【化５】
を含む。
【実施例】
【００１９】
マウス島はｅＩＦ５Ａを発現する
全ＲＮＡを、単離されたマウス島から抽出し、そしてβ−アクチン及びｅＩＦ５ＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１）。休止した刺激されていない島は、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡの陽性レベルを示した。
【００２０】
ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡデリバリー：門脈の遅い灌流後に、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡレベルは低下した
マウスに、遅い逆行門脈灌流（図２）により、１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ（対照）配列又はｅＩＦ５Ａ，５μｇ）又は生理食塩水を、群当りｎ＝２で導入した。膵臓を、膵管のコラゲナーゼ灌注により消化し、そして島を、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１２１５３−１２１５８ Ｅｐｕｂ １２００５ Ａｕｇ．１２１００，２００５により記載されたように単離した。（マウス当り５０個の）島を１６時間インキュベートした。次いで全ＲＮＡを抽出し、そしてβ−アクチン及びｅＩＦ５ＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した（図３）。ｅＩＦ５Ａ／β−アクチンに関するｍＲＮＡ比は、５．２４（ＣＴ−ｓｉＲＮＡ）と３．０１（ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡ）であった。図３は、ｅＩＦ５ＡのｍＲＮＡレベルが、ｓｉＲＮＡで処理された細胞において低下していたことを示す。この実験をｎ＝３マウスで繰り返し、そして島をＲＮＡ抽出のために３連でインキュベートした；結果は、最初の観察と一致していた。
【００２１】
ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡデリバリー：門脈流体力学的灌流の後、ｅＩＦ５Ａ−ｍＲＮＡレベルは低下し、そして島アポトーシス率も低下した
マウスに、５秒以内で完結する流体力学的逆行門脈灌流により、群当りｎ＝２で、１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ又はｅＩＦ５Ａ，５μｇ）又は生理食塩水を導入した。
【００２２】
膵臓を、胆管のコラゲナーゼ灌注により消化し、そして島を単離した。島を１６時間インキュベートし、そしてその後分割した：１の群は、アポトーシスの評価のためにヨウ化プロピジウムで染色し（マウス当り５０島）、そして他の群は、ＲＴ−ＰＣＲのために処理した（マウス当り２５島）。ｅＩＦ５Ａ／β−アクチンについてのｍＲＮＡのレベルは、再び、ｅＩＦ５Ａ−ｓｉＲＮＡ群よりもＣＴ−ｓｉＲＮＡ群内でより高かった。アポトーシス率は、２８．１％低下した（図４）。この実験を、ｎ＝３で繰り返し、アポトーシス率は再び低下した（図５）。
【００２３】
ビオチン化ｓｉＲＮＡにより島灌流
ビオチン化ｓｉＲＮＡ（５０μｇ）を、前記したように島内に灌流させた（遅い灌流、ｎ＝１）。膵臓を、染色のためにホルマリン中に固定した。
【００２４】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ分子を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯにより合成した。ｅＩＦ５Ａと対照ｓｉＲＮＡの配列は、それぞれ、以下の：
【化６】
と
【化７】
であった。
【００２５】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮ ｅａｓｙキットを用いて細胞から抽出した。ｅＩＦ５Ａプライマーは、前進：
【化８】
と後退：
【化９】
であった。
【００２６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシス染色
島の１回細胞懸濁を温やかなトリプリン処理により達成した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中、０．３％サポニン、ＥＤＴＡ １ｍＭ，Ｒｎａｓｅ，１％アジド、１％ＦＣＳ、及び５０μｇ／ｍｌ ＰＩを含むサポニン−ＰＩ混合物を添加した。細胞を十分にボルテックスし、そしてＦＡＣＳによりサブ−ＧＩ集団について分析する前６時間暗所４℃でインキュベートした。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡで門脈を通しての灌流後のβ−アクチン、ｍＡＡＴ、及びｅＩＦ５Ａについて実施したＲＴ−ＰＣＲの結果を提供する。この図は、ｅＩＦ５Ａ発現が計測可能であり、そしてそれゆえ、島内に取り込まれたことを示す。
【図２】図２は、遅い逆行門脈灌流を示す。胆管（白）と門脈（赤）は、予備的結び目（暗い縫合）の準備ができている。針は、結び目（矢印で示す方向）の下を侵入し、結び目の下を横切り、そして膵臓、脾臓、腸、及び３番目の遠位結腸に至る血管内にｓｉＲＮＡを放出する。
【図３】図３は、島内へのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡの灌流がｅＩＦ５Ａの発現の低下を引き起こすことを示す（ｅＩＦ５ＡのｍＲＮＡレベルの低下を示す）。
【図４】図４は、対照及び生理食塩水処理された島に比較してのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞のアポトーシスの低下を示す（群当りｎ＝２）。
【図５】図５は、対照及び生理食塩水処理された島に比較してのｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡ処理された島細胞のアポトーシスの低下を示す（群当りｎ＝３）。
【図６】図６は、ｅＩＦ５Ａ２に対してアラインメントされたヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図７】図７は、ｅＩＦ５Ａ２に対してアラインメントされたヒトｅＩＦ５Ａ１のアミノ酸配列を提供する。
【図８】図８は、例示的アンチャンス・オリゴヌクレオチドとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図９】図９は、例示的アンチャンス・オリゴヌクレオチドとともにヒトのｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【図１１】図１１は、例示的ｓｉＲＮＡｓとともにヒトｅＩＦ５Ａのヌクレオチド配列を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー収穫工程の間に島細胞がアポトーシスを経験しないように阻害する方法であって、島単離に先立って島細胞ドナーの島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞内でのアポトーシスを阻害する、前記方法。
【請求項２】
前記ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＡＧＵＣＧＡＣＣＵＵＣＡＧＵＡＡＧＧＣｄＴｄＴを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが、前記島細胞ドナーの門を通しての灌流を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、前記島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、当該島細胞内のｅＩＦ５Ａの発現を阻害する、前記方法。
【請求項６】
収穫された島細胞におけるアポトーシスを阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する、前記方法。
【請求項７】
ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスを阻害する、前記組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、ＡＧＵＣＧＡＣＣＵＵＣＡＧＵＡＡＧＧＣｄＴｄＴを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１】
ドナー収穫工程の間に島細胞がアポトーシスを経験しないように阻害する方法であって、島単離に先立って島細胞ドナーの島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞内でのアポトーシスを阻害する、前記方法。
【請求項２】
前記ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、ヌクレオチド配列ＡＧＵＣＧＡＣＣＵＵＣＡＧＵＡＡＧＧＣｄＴｄＴを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが、前記島細胞ドナーの門を通しての灌流を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、前記島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡが、当該島細胞内のｅＩＦ５Ａの発現を阻害する、前記方法。
【請求項６】
収穫された島細胞におけるアポトーシスを阻害する方法であって、当該島細胞にｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで、当該ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡは、当該島細胞内でのｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてｅＩＦ５Ａ発現の阻害がアポトーシスを阻害する、前記方法。
【請求項７】
ｅＩＦ５Ａ ｓｉＲＮＡを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該ｓｉＲＮＡがｅＩＦ５Ａの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスを阻害する、前記組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、ＡＧＵＣＧＡＣＣＵＵＣＡＧＵＡＡＧＧＣｄＴｄＴを含む、請求項７に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【公表番号】特表２００９−５３０４１８（Ｐ２００９−５３０４１８Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１７０１（Ｐ２００９−５０１７０１）
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４４２４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９６７７
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０２４５８１３２）セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４４２４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０９６７７
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０２４５８１３２）セネスコ テクノロジーズ，インコーポレイティド (16)
【Ｆターム（参考）】
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