ドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤
【課題】ドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤を提供する。
【解決手段】セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤。
【解決手段】セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから生合成される。このメラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（非特許文献１参照）。
メラニン生合成におけるチロシナーゼの重要度の高さから、チロシナーゼは美白素材のターゲットとしても古くから注目されてきた。チロシナーゼはチロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、チロシンを前駆体としたメラニン合成反応を触媒する。チロシナーゼ酵素活性はドーパオキシダーゼ活性を指標とすることができ、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている（非特許文献２参照）。よってメラノサイト内ドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制することができる。
従来から、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させる物質の使用が検討され、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
しかし、これらの物質には、メラニン産生抑制効果が十分でない等の問題がある場合もあり、未だ十分に満足できるものは得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】King RA．Oetting WS．Hearing VJ．In Metabolic bases of inherited disease（Scriver CR．Beaudet AL．Sly WS．Valle D.，eds.)，McGraw-Hill，New York，4353-4392，1995
【非特許文献２】Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57:406-423
【非特許文献３】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができるドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制する美白剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ある種の植物の抽出物がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することを見い出した。さらに、この抽出物を用いることで、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤を提供することができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤およびドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【０００７】
本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができる。また、本発明の美白剤は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤は、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する。
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制効果を有する。そのため、前記植物の抽出物を含有することで本発明の美白剤は、皮膚におけるメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を奏する。
【００１０】
本発明におけるセイヨウトウキ（Angelica archangelica：ヨーロッパトウキともいう。）は、セリ科（Apiaceae）に属する植物である。
【００１１】
本発明におけるハナミズキ（Benthamidia florida）は、ミズキ科（Cornaceae）に属する植物である。
【００１２】
本発明におけるカンスイ（Euphorbia kansui Liou）は、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）に属する植物である。
【００１３】
本発明におけるヌルデ（Rhus chinensis Mill.）は、ウルシ科（Anacardiaceae）に属する植物である。
【００１４】
本発明におけるオカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）は、セリ科（Apiaceae）に属する植物である。別名、蛇床ともいう。
【００１５】
本発明におけるキンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）は、バラ科（Rosaceae）に属する植物である。別名、龍芽草ともいう。
【００１６】
本発明におけるロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）は、ユリ科（Liliaceae）に属する植物である。
【００１７】
本発明におけるセイヨウメギ（Berberis aristata）は、メギ科（Berberidaceae）に属する植物である。
【００１８】
本発明において、前記植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、または任意の部位（根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子等）、およびそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数を使用することができる。
【００１９】
本発明において、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましく、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）を基原植物として得られた生薬（当帰（トウキ））を用いることもできる。
【００２０】
本発明において、ハナミズキ（Benthamidia florida）の抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明において、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）の抽出物を得るためには、前記植物の種子を用いるのが好ましく、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）を基原植物として得られた生薬（甘遂（カンツイ））を用いることもできる。
【００２２】
本発明において、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）の抽出物を得るためには、前記植物の虫嚢体を用いるのが好ましく、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）を基原植物として得られた生薬（五倍子（ゴバイシ））を用いることもできる。
【００２３】
本発明において、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）を基原植物として得られた生薬（蛇床子（ジャショウシ））を用いることもできる。
【００２４】
本発明において、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）の抽出物を得るためには、前記植物の全草を用いるのが好ましく、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）を基原植物として得られた生薬（仙鶴草（センカクソウ））を用いることもできる。
【００２５】
本発明において、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましく、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）を基原植物として得られた生薬（漏蘆（ロウロ））を用いることもできる。
【００２６】
本発明において、セイヨウメギ（Berberis aristata）の抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。
【００２７】
本発明において用いる、前記植物の抽出物は、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
【００２８】
本発明において、前記植物の抽出物の調製に、上記植物をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等、より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。上記植物又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等が挙げられ、特に水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を５〜８０℃で２時間〜６０日間浸漬又は加熱還流すればよい。上記植物の抽出物は、そのまま使用できるが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留、活性炭処理等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。
【００３０】
本発明において、前記植物の抽出物はそのまま用いてもよい。または、当該抽出物を希釈、濃縮または凍結乾燥した後、粉末またはペースト状に調製して用いることもできる。
【００３１】
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。これら植物の抽出物を有効成分として含有させることで、本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤が得られる。
本発明において、前記植物の抽出物はそのままドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤として用いてもよい。または、上記抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、これら植物の抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５重量％含まれるのが好ましく、０．０００１〜０．５重量％含まれるのが特に好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（製造例１）セイヨウトウキの抽出物の調製
セイヨウトウキを基原植物とする生薬トウキ（当帰）（新和物産社製）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で１７日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２８３ｍＬ、蒸発残分２．３４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、セイヨウトウキ抽出物を調製した。
【００３４】
（製造例２）ハナミズキの抽出物の調製
ハナミズキの樹皮（American botanicals社製）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で２２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３０５ｍＬ、蒸発残分１．０８ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ハナミズキ抽出物を調製した。
【００３５】
（製造例３）カンスイの抽出物の調製
カンスイを基原植物とする生薬カンツイ（甘遂）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２２４ｍＬ、蒸発残分１．５６ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、カンスイ抽出物を調製した。
【００３６】
（製造例４）ヌルデの抽出物の調製
ヌルデを基原植物とする生薬ゴバイシ（五倍子）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３０日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３３５ｍＬ、蒸発残分１３．５９ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ヌルデ抽出物を調製した。
【００３７】
（製造例５）オカゼリの抽出物の調製
オカゼリを基原植物とする生薬ジャショウシ（蛇床子）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量１１７ｍＬ、蒸発残分１．５４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、オカゼリ抽出物を調製した。
【００３８】
（製造例６）キンミズヒキの抽出物の調製
キンミズヒキを基原植物とする生薬センカクソウ（仙鶴草）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で４日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２７５ｍＬ、蒸発残分１．７３ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、キンミズヒキ抽出物を調製した。
【００３９】
（製造例７）ロウロの抽出物の調製
ロウロを基原植物とする生薬ロウロ（漏蘆）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２９８ｍＬ、蒸発残分２．０１ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ロウロ抽出物を調製した。
【００４０】
（製造例８）セイヨウメギの抽出物の調製
セイヨウメギの樹皮（商品名：BARBERRYS，新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で１９日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３２３ｍＬ、蒸発残分０．２５ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう濃縮し、セイヨウメギ抽出物を調製した。
【００４１】
（実施例１）ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００４２】
また、前記製造例１〜製造例８で調製した植物の抽出物を０．１０％となるように添加した。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００４３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
【００４４】
培養終了後、各ウェルにアラマーブルー（Alamar Blue、商品名、インビトロジェン社製）試薬２０μｌを添加し、２〜３時間培養後、培地の蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定して細胞増殖活性を測定した。その結果を表１に示す。
細胞増殖活性を測定したメラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００４５】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表１に示す。なお、表１の細胞増殖活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の蛍光強度に対する相対値で示している。また、ドーパオキシダーゼ活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１に示したとおり、前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することが認められた。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関与するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがって、表１の結果から、本発明の前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。
また、前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物のうち、セイヨウトウキおよびヌルデについては、わずかに細胞増殖活性が低下していた。一方、それ以外の抽出物については、細胞増殖活性に上昇がみられた。したがって、本発明の前記植物抽出物は、細胞増殖活性を大きく低下させる作用（すなわち、細胞増殖能を大幅に低下させる作用）がないことがわかった。
さらに、実施例１で得られた結果との比較から、本発明の前記植物抽出物は細胞増殖活性をほとんど抑制することなく、ドーパオキシダーゼ活性を抑制できることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから生合成される。このメラニン生合成に関わる酵素であるチロシナーゼに変異が生じると、皮膚、毛髪のメラニン色素の形成が異常となることが報告されている（非特許文献１参照）。
メラニン生合成におけるチロシナーゼの重要度の高さから、チロシナーゼは美白素材のターゲットとしても古くから注目されてきた。チロシナーゼはチロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、チロシンを前駆体としたメラニン合成反応を触媒する。チロシナーゼ酵素活性はドーパオキシダーゼ活性を指標とすることができ、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている（非特許文献２参照）。よってメラノサイト内ドーパオキシダーゼ活性を抑制することで、最終的な生合成産物であるメラニンの産出を抑制することができる。
従来から、チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させる物質の使用が検討され、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
しかし、これらの物質には、メラニン産生抑制効果が十分でない等の問題がある場合もあり、未だ十分に満足できるものは得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】King RA．Oetting WS．Hearing VJ．In Metabolic bases of inherited disease（Scriver CR．Beaudet AL．Sly WS．Valle D.，eds.)，McGraw-Hill，New York，4353-4392，1995
【非特許文献２】Wrathall JR．et al.，JCB 1973 57:406-423
【非特許文献３】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，ｐ９５−１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができるドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制する美白剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ある種の植物の抽出物がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することを見い出した。さらに、この抽出物を用いることで、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤を提供することができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
本発明は、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤およびドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【０００７】
本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤は、ドーパオキシダーゼ活性を効果的に抑制することができる。また、本発明の美白剤は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤は、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する。
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制効果を有する。そのため、前記植物の抽出物を含有することで本発明の美白剤は、皮膚におけるメラニンの産生を抑制することができ、美白効果を奏する。
【００１０】
本発明におけるセイヨウトウキ（Angelica archangelica：ヨーロッパトウキともいう。）は、セリ科（Apiaceae）に属する植物である。
【００１１】
本発明におけるハナミズキ（Benthamidia florida）は、ミズキ科（Cornaceae）に属する植物である。
【００１２】
本発明におけるカンスイ（Euphorbia kansui Liou）は、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）に属する植物である。
【００１３】
本発明におけるヌルデ（Rhus chinensis Mill.）は、ウルシ科（Anacardiaceae）に属する植物である。
【００１４】
本発明におけるオカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）は、セリ科（Apiaceae）に属する植物である。別名、蛇床ともいう。
【００１５】
本発明におけるキンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）は、バラ科（Rosaceae）に属する植物である。別名、龍芽草ともいう。
【００１６】
本発明におけるロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）は、ユリ科（Liliaceae）に属する植物である。
【００１７】
本発明におけるセイヨウメギ（Berberis aristata）は、メギ科（Berberidaceae）に属する植物である。
【００１８】
本発明において、前記植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、または任意の部位（根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子等）、およびそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数を使用することができる。
【００１９】
本発明において、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましく、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）を基原植物として得られた生薬（当帰（トウキ））を用いることもできる。
【００２０】
本発明において、ハナミズキ（Benthamidia florida）の抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明において、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）の抽出物を得るためには、前記植物の種子を用いるのが好ましく、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）を基原植物として得られた生薬（甘遂（カンツイ））を用いることもできる。
【００２２】
本発明において、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）の抽出物を得るためには、前記植物の虫嚢体を用いるのが好ましく、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）を基原植物として得られた生薬（五倍子（ゴバイシ））を用いることもできる。
【００２３】
本発明において、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）の抽出物を得るためには、前記植物の果実を用いるのが好ましく、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）を基原植物として得られた生薬（蛇床子（ジャショウシ））を用いることもできる。
【００２４】
本発明において、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）の抽出物を得るためには、前記植物の全草を用いるのが好ましく、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）を基原植物として得られた生薬（仙鶴草（センカクソウ））を用いることもできる。
【００２５】
本発明において、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）の抽出物を得るためには、前記植物の根を用いるのが好ましく、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）を基原植物として得られた生薬（漏蘆（ロウロ））を用いることもできる。
【００２６】
本発明において、セイヨウメギ（Berberis aristata）の抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。
【００２７】
本発明において用いる、前記植物の抽出物は、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
【００２８】
本発明において、前記植物の抽出物の調製に、上記植物をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等、より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。上記植物又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等が挙げられ、特に水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を５〜８０℃で２時間〜６０日間浸漬又は加熱還流すればよい。上記植物の抽出物は、そのまま使用できるが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留、活性炭処理等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。
【００３０】
本発明において、前記植物の抽出物はそのまま用いてもよい。または、当該抽出物を希釈、濃縮または凍結乾燥した後、粉末またはペースト状に調製して用いることもできる。
【００３１】
前記植物の抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。これら植物の抽出物を有効成分として含有させることで、本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤が得られる。
本発明において、前記植物の抽出物はそのままドーパオキシダーゼ活性抑制剤および美白剤として用いてもよい。または、上記抽出物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、これら植物の抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５重量％含まれるのが好ましく、０．０００１〜０．５重量％含まれるのが特に好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（製造例１）セイヨウトウキの抽出物の調製
セイヨウトウキを基原植物とする生薬トウキ（当帰）（新和物産社製）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で１７日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２８３ｍＬ、蒸発残分２．３４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、セイヨウトウキ抽出物を調製した。
【００３４】
（製造例２）ハナミズキの抽出物の調製
ハナミズキの樹皮（American botanicals社製）４０ｇを細切し、５０％エタノール４００ｍＬを加え、室温で２２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３０５ｍＬ、蒸発残分１．０８ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ハナミズキ抽出物を調製した。
【００３５】
（製造例３）カンスイの抽出物の調製
カンスイを基原植物とする生薬カンツイ（甘遂）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２２４ｍＬ、蒸発残分１．５６ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、カンスイ抽出物を調製した。
【００３６】
（製造例４）ヌルデの抽出物の調製
ヌルデを基原植物とする生薬ゴバイシ（五倍子）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で３０日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３３５ｍＬ、蒸発残分１３．５９ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ヌルデ抽出物を調製した。
【００３７】
（製造例５）オカゼリの抽出物の調製
オカゼリを基原植物とする生薬ジャショウシ（蛇床子）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量１１７ｍＬ、蒸発残分１．５４ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、オカゼリ抽出物を調製した。
【００３８】
（製造例６）キンミズヒキの抽出物の調製
キンミズヒキを基原植物とする生薬センカクソウ（仙鶴草）（新和物産社製）１００ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で４日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２７５ｍＬ、蒸発残分１．７３ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、キンミズヒキ抽出物を調製した。
【００３９】
（製造例７）ロウロの抽出物の調製
ロウロを基原植物とする生薬ロウロ（漏蘆）（新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で２日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量２９８ｍＬ、蒸発残分２．０１ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう希釈し、ロウロ抽出物を調製した。
【００４０】
（製造例８）セイヨウメギの抽出物の調製
セイヨウメギの樹皮（商品名：BARBERRYS，新和物産社製）５０ｇを細切し、５０％エタノール５００ｍＬを加え、室温で１９日間抽出後、濾過して粗抽出液を得た（収量３２３ｍＬ、蒸発残分０．２５ｗ／ｖ％）。粗抽出液を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう濃縮し、セイヨウメギ抽出物を調製した。
【００４１】
（実施例１）ドーパオキシダーゼ活性の測定
９６穴プレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト１００μｌを１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように各穴に播種した。培地はＭｅｄｉｕｍ２５４にＰＭＡを除くＨＭＧＳ（Human Melanocyte Growth Supplement）（いずれもCascade Biologics社製）を添加したものを用いた。
２４時間の培養後、メラノサイト活性化因子エンドセリン−１（ＥＴ−１）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、ヒスタミンおよびプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を、それぞれ培地中終濃度で１０×１０-7ｍｏｌ/ｍ3になるように添加した。
【００４２】
また、前記製造例１〜製造例８で調製した植物の抽出物を０．１０％となるように添加した。最終的に培地量は２００μｌ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。
【００４３】
なお、培地には、以下の添加物も添加されている。
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子） ３ｎｇ／ｍｌ
ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液） ０．２体積％
ＦＢＳ（ウシ胎児血清） ０．５体積％
ハイドロコーチゾン ５×１０-4ｍｏｌ／ｍ3
インスリン ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン ５μｇ／ｍｌ
ヘパリン ５μｇ／ｍｌ
【００４４】
培養終了後、各ウェルにアラマーブルー（Alamar Blue、商品名、インビトロジェン社製）試薬２０μｌを添加し、２〜３時間培養後、培地の蛍光強度（励起波長；５４４ｎｍ、蛍光波長；５９０ｎｍ）を測定して細胞増殖活性を測定した。その結果を表１に示す。
細胞増殖活性を測定したメラノサイトをＣａ2+およびＭｇ2+を除去したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を２０μｌ／ｗｅｌｌ、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミドを含有する１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシターゼ活性の測定を行った。ドーパオキシターゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（例えば、Winder A．J.，Harris H.，Eur．J．Biochem.，198，317-326，1991参照）を参考に、以下のように行った。
【００４５】
可溶化した細胞溶液の各ｗｅｌｌに、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μｌ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。
その結果を表１に示す。なお、表１の細胞増殖活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の蛍光強度に対する相対値で示している。また、ドーパオキシダーゼ活性の値は、各種植物の抽出物を添加しなかった場合の吸光度に対する相対値で示している。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１に示したとおり、前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することが認められた。前述のように、ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生合成に関与するチロシナーゼの酵素活性の指標として用いられている。したがって、表１の結果から、本発明の前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することでメラニン産生を抑制し、その結果、美白作用を有することがわかる。
また、前記製造例１〜製造例８で調製した抽出物のうち、セイヨウトウキおよびヌルデについては、わずかに細胞増殖活性が低下していた。一方、それ以外の抽出物については、細胞増殖活性に上昇がみられた。したがって、本発明の前記植物抽出物は、細胞増殖活性を大きく低下させる作用（すなわち、細胞増殖能を大幅に低下させる作用）がないことがわかった。
さらに、実施例１で得られた結果との比較から、本発明の前記植物抽出物は細胞増殖活性をほとんど抑制することなく、ドーパオキシダーゼ活性を抑制できることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤。
【請求項１】
セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）からなる群より選ばれる少なくとも１種の植物の抽出物を有効成分として含有する美白剤。
【公開番号】特開２０１０−１９５７３１（Ｐ２０１０−１９５７３１Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４４１９１（Ｐ２００９−４４１９１）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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