ナイシンの殺菌上有効な使用方法
【課題】グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に作用することが可能な、微生物に対して幅広い殺菌活性を有する組成物および微生物の殺菌方法を提供する。
【解決手段】たとえばナイシンＡまたはナイシンＺであるナイシンを、２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含み、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されていて、さらに界面活性剤を含んでいてもよい、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【解決手段】たとえばナイシンＡまたはナイシンＺであるナイシンを、２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含み、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されていて、さらに界面活性剤を含んでいてもよい、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナイシンの殺菌上有効な使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ナイシンを殺菌上有効なｐＨ条件で使用すること、およびそのための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイシンは、乳酸菌が生産する抗菌性のペプチドであるが、アメリカでは一般的に安全（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ：ＧＲＡＳ）と認定され、チーズ等の保存料として実際に用いられているほか、世界５０カ国以上で食品添加物として認可されている。したがって、ナイシンを抗菌剤に使用すれば、安全性の高い抗菌剤を提供することができる。
【０００３】
ナイシンは、グラム陽性菌に対して幅広い抗菌活性を示すが、グラム陰性菌に対しては抗菌活性が弱いことが知られている。この点に関し、ナイシンをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤や有機酸と組み合わせて用いることによって、グラム陰性菌に対する抗菌活性が高まるとの報告（非特許文献１、非特許文献２）や、金属イオンの存在により、グラム陰性菌に対する抗菌活性が低下するという報告がある（非特許文献３）。
【０００４】
他方、ナイシンが十分な抗菌活性を発揮するためには、ナイシンが物理的に安定に存在することが前提となる。ナイシンの安定性に関しては、メチオニンを安定剤として配合すること（特許文献１）、洗浄剤組成物に用いるに際しては適切な界面活性剤を選択すること（特許文献２）などが検討されてきた。ナイシンはまた、ｐＨ３で最も安定であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平８−５１０７１６号公報
【特許文献２】特開２００７−９９８０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology , 58 (5), p.1786-88, 1992
【非特許文献２】International Journal of Food Microbiology, 21, p.305-314, 1994
【非特許文献３】International Journal of Antimicrobial Agents, 26, p.396-402, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの検討によると、ナイシンへＥＤＴＡを添加した場合には、ナトリウムイオンの存在によってグラム陰性菌に対する抗菌効果が期待したほどには得られず、また有機酸を添加した場合には、グラム陰性菌に対する抗菌効果は高くなるが、ｐＨが非常に低くなり実用性に乏しくなるという問題があった。さらに界面活性剤とナイシンの混合液においてＥＤＴＡや有機酸を添加し、ｐＨを弱酸性にしたものについては、抗菌効果はほとんど確認できなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の事情に鑑み、鋭意検討を行った結果、ｐＨ４．０〜１０．５において、ナイシンの殺菌活性が向上することを見出した。このような抗菌活性の向上は、従来から知られているナイシンのグラム陽性菌に対する殺菌活性が向上することに加えて、ナイシン単独では作用しないと考えられてきた、グラム陰性菌に対する殺菌活性が向上することにも基づく。また、ｐＨ５．０〜６．５において、グラム陽性菌に対する殺菌活性がさらに向上すること、ｐＨ４．０〜６．５において、グラム陰性菌に対する殺菌活性がさらに向上することを見出した。上記の結果から、ナイシンは、ｐＨ５．０〜６．５においてグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する殺菌活性をより一層向上させることが導き出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成された。
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
１）ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含む、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されている、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【００１０】
２）ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、１）に記載の組成物、またはキット。
３）ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨが５．０〜６．５に調整されている、グラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用であり、かつグラム陰性である微生物の少なくとも一種の殺菌用である、１）に記載の組成物、またはキット。
【００１１】
４）グラム陽性菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)、またはプロピオニバクテリウム・アクネス（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ)から選択され、グラム陰性菌が、エッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)から選択される、１）に記載の組成物、またはキット。
【００１２】
５）さらに界面活性剤を含む、１）に記載の組成物、またはキット。
６）ｐＨ４．０〜１０．５において、グラム陽性またはグラム陰性である微生物の少なくとも一種を、ナイシン１ＩＵあたり１０〜１０，０００ｃｆｕの割合で１０〜１８０秒間接触させて殺菌する工程を含む、微生物の殺菌方法。
【００１３】
７）ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、６）に記載の殺菌方法。
８）ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨ５．０〜６．５において、グラム陽性菌（好ましくは、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ラクトバチルス属、プロピオニバクテリウム属から選択される菌、より好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス、スタフィロコッカス・オーレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ラクトバチルス・プランタルム、プロピオニバクテリウム・アクネスから選択される菌）の少なくとも一種を殺菌するための、かつグラム陰性菌（好ましくは、エッシェリヒア属から選択される菌、より好ましくはエッシェリヒア・コリから選択される菌）の少なくとも一種以上を殺菌するための、７）に記載の殺菌方法。
【００１４】
９）ｐＨ４．０〜１０．５において、ナイシン１ＩＵと微生物１０〜１０，０００ｃｆｕを１０〜１８０秒間接触させて、グラム陽性菌を殺菌し；ｐＨ４．０〜８．０において、ナイシンと微生物を１０〜１８０秒間接触させて、グラム陰性菌を殺菌する；
微生物の殺菌方法。
【００１５】
１０）さらに界面活性剤で処理する工程を含む、８）または９）に記載の殺菌方法。
１１）ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法。
【００１６】
本明細書でいう「組成物」とは、ナイシンを含む限り、特に限定されない。当該組成物は、組成物の用途に適した形態とすることができる。例えば、液状、粉状、顆粒状、ゲル状、固形状、または適切な担体に固定化させた形態とすることがあげられる。さらに、本発明の技術分野において知られている成分を本発明の組成物に配合することができる。例えば、界面活性剤、乳化剤、湿潤剤、着香剤、芳香剤、研磨剤、潤滑剤、キレート剤、分散剤（再付着防止剤）、溶剤、保湿剤、殺菌剤（抗菌剤）、安定化剤、洗浄用酵素、粘度調整剤、防腐剤、防黴剤、着色料、香料を適宜選択し、本発明の組成物に配合することができる。一態様として、上記の成分を配合して、本発明の組成物が殺菌作用に加えて洗浄作用を発揮できるようにしてもよい。なお、当該組成物に含まれるナイシンは、単独でグラム陰性菌を殺菌できるため、組成物がキレート剤を含有しなくても幅広い殺菌活性を発揮することができる。ここで、キレート剤とは、金属イオンに配位し、キレート化合物を与えるような多座配位子を意味する。例えば、ＥＤＴＡのようなポリアミノカルボン酸類およびクエン酸のようなオキシカルボン酸などがあげられる。
【００１７】
本発明の組成物は、微生物の殺菌を必要とする様々な分野に広く利用することができる。例えば、食品分野での利用があげられる。一態様として、本発明の組成物は、家庭用・業務用の厨房、調理器具、食品加工工場、食品素材製造工場などにおいて、食中毒微生物および食品危害微生物の殺菌に使用できる。特に、高度な衛生管理が求められる食品関連産業においては、食中毒微生物および食品危害微生物の殺菌は必須事項であるため、効果的かつ安全な殺菌方法が強く要請されている。ここで、食中毒微生物として、下痢原性大腸菌（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７など）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・オーレウス）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウエルッシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｅｌｃｈｉｉ）、エルシニア エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ナグビブリオ（ｎｏｎａｇｇｌｕｔｉｎａｂｌｅ ｖｉｂｒｉｏｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、プレシオモナス シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）などがあげられる。また、食品危害微生物として、食中毒微生物に加え、乳酸菌、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ属、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などがあげられる。
【００１８】
別の例として、本発明の組成物は、家屋、ホテル、レストランなどの室内、家具備品、床などに存在する微生物を殺菌することに使用できる。
別の例として、本発明の組成物の医療分野での利用があげられる。医療分野では、ヒトに対する治療行為が行われることから、高度な衛生管理が要求されているが、近年、抗生物質耐性菌、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による院内感染が大きな問題になっている。このような観点から、本発明の組成物を医療施設の殺菌に広く使用することができる。
【００１９】
本発明の組成物は、皮膚疾患の予防や治療用に適している。通常、ヒトの皮膚上には、表皮ブドウ球菌（スタフィロコッカス エピデルミディス）やアクネ菌等の多種多様な微生物が常在し、これらの微生物が過度に増殖すること等が原因となって皮膚疾患が発症する。皮膚に存在するこれらの微生物を殺菌する目的で従来から使用されている殺菌剤は、皮膚刺激性であり、かつ標的とする細菌のみならず皮膚組織の修復に寄与する細胞、例えば免疫細胞、線維芽細胞、及び表皮細胞に対しても毒性を示す等の問題がある。例えば、一般的な皮膚疾患であるニキビ（尋常性座瘡）は、皮脂分泌の増加、毛嚢皮脂線の閉塞、及びアクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネス）の異常増殖が原因で起こることが知られている。ニキビの予防や治療においては、抗生物質や角質の剥離剤が従来から使用されてきたが、抗生物質の使用は、副作用や耐性菌が発生するという問題があり、イオウやサルファ剤等の角質の剥離剤の使用は、皮膚刺激性およびニキビの予防または治療効果が不十分という問題がある。
【００２０】
これらのことから、皮膚への刺激性が低く、標的微生物に対する特異性が高く、かつ安全性の高い、皮膚疾患の予防や治療用の組成物が求められている。本発明は、そのような組成物を提供することができる。例えば、本発明の組成物は、皮膚への刺激性が極めて低く、アクネ菌を効率的に殺菌できるので、ニキビの予防や治療用の組成物を提供することができる。
【００２１】
さらに、本発明の組成物は、口腔内微生物の殺菌用にも適している。本明細書でいう「殺菌」とは、微生物を死滅させることのみでなく、微生物の成長を停止、阻害または遅延させることも含む。したがって、本明細書でいう「殺菌用の組成物」とは、微生物の殺菌に適した組成物を意味する。ここで、組成物が殺菌に適しているか否かは、例えば、抗菌性評価（ＭＢＣ変法）による評価結果に基づいて判断することができる。ＭＢＣ法とは最小殺菌濃度を測定する方法であり、ＭＢＣ変法とは、ＭＢＣ法を基本としつつ培養条件、殺菌剤濃度、接触時間、接触温度、供試菌濃度等の諸条件を任意に設定し、その条件下での生残菌数を測定する方法である。例えば、供試菌（例えば、大腸菌）をＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養後、培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整する（１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、試験液（ナイシン含有組成物、５ｍＬ）に添加し、混合させることにより、試験液と供試菌を室温で接触（３０秒）させた後、該液（１００μＬ）を分取し、不活化剤を含む培地（ＳＣＤＬＰ培地、５ｍＬ）で希釈する。当該不活化剤を含む培地中に生残する菌数を混釈板法により培養（３７℃、２４時間）し、出現したコロニーを計数し、以下の計算式：
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
により、殺菌率を算出する。
【００２２】
ＭＢＣ変法は、殺菌剤濃度、接触時間、接触温度、供試菌濃度などの諸条件を、試験目的により適宜変更することができ、培地、培養条件を、供試菌の種類により適宜変更することができる。また、試験液と供試菌を接触させた後、不活化剤を含む液体培地を用いて培養し、培養後の培地の濁度に基づいて、当該培地中に生残する菌の有無および生育の程度を定性的に判定することも可能である。ここで、不活化剤とは、殺菌剤を不活性化する化合物や組成物であって、例えば、ミセルを形成し、殺菌成分を取り込む界面活性剤が汎用される。その他、殺菌剤の種類によっては中和剤、例えばアニオン界面活性剤やチオ硫酸ナトリウムなどを使用してもよい。例えば、界面活性剤ポリソルベートをナイシンの不活性化剤として使用することができる。
【００２３】
上記ＭＢＣ変法において、微生物の殺菌率が９０％以上であれば、組成物は殺菌効果があると判断することができる。求められる殺菌効果の程度は、使用分野・用途・使用方法により異なるが、組成物による殺菌率は、例えば、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９９〜１００％、さらに好ましくは９９．９〜１００％である。一般的な殺菌剤としての用途および環境殺菌用途であれば、９９．９％の殺菌率で十分であるが、食品が接触する無菌設備の殺菌用途では、９９．９９９％以上の殺菌率が要求されることもある。
【００２４】
また、本発明の組成物が殺菌に適しているかは、微生物の菌体内から菌体外に流出するＡＴＰの量を指標にして判断することができる。ナイシンは、微生物の細胞膜（リピッドII）に作用し、細胞膜に孔を形成することによって殺菌効果を発揮するため、形成された孔から菌体外に流出するＡＴＰの量が多いほど殺菌活性が高いと判断できる。ＡＴＰ量の測定は、例えば、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰとルシフェリンの反応で生じる発光を相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ: ＲＬＵ）として測定することによって行うことができる。相対発光量は、前記反応により生じる発光を、例えば光電子増倍管を検出器とした測定装置を用いて測定することができる。このような測定は、市販の測定キットを用いて行ってもよい。また試料中のＡＴＰ濃度と相対発光量の関係を両対数グラフにプロットすると、両測定値の間には例えばＡＴＰ濃度で２×１０−１２〜２×１０−８Ｍの範囲において良好な直線関係が得られるため、必要に応じてＡＴＰ標準試薬を使用して検量線を作成し、相対発光量をＡＴＰ濃度に換算することも可能である。
【００２５】
菌体外に流出するＡＴＰの量を指標にする判断方法の例を示す。プロピオニバクテリウム属の微生物を、適切な培地で前培養し、当該培養液を新たな培地に接種し、嫌気的環境下で旋回培養を行い、この培養液を供試菌液とする。ナイシン溶液に供試菌液を添加することにより、ナイシンと微生物を３分間接触させ、当該液を試験液とする。一方、ナイシンを含まない溶液に供試菌液を添加し、同様に処理したものを対照試験液とする。試験液および対照試験液を測定に用いる緩衝液で適宜希釈し、市販のキットを用いて菌体外に存在するＡＴＰの量を相対発光量として測定する。試験液の相対発光量から、対照試験液の相対発光量を差し引いた値を、微生物の菌体内から菌体外に流出したＡＴＰの量とする。この例に示した条件でＡＴＰの量を測定した場合、相対発光量が２０，０００ＲＬＵ以上、好ましくは５０，０００ＲＬＵ以上、より好ましくは１００，０００ＲＬＵ以上であれば、組成物に殺菌効果があると判断することができる。
【００２６】
本明細書における微生物は、グラム陽性菌とグラム陰性菌に分類できる。グラム陽性菌とグラム陰性菌に属する微生物は、例えば、Bergey's Manual Of Systematic Bacteriology: The Proteobacteria; The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Springer-Verlag)) George Garrity、Don J. Brenner、Noel R. Krieg、 James T. Staleyに収載されている。本発明の組成物は、グラム陽性菌、例えば、バチルス属、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属、リステリア属、マイクロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、好ましくは、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびプロピオニバクテリウム・アクネスに属する微生物に対して殺菌活性を発揮する。本発明の組成物は、グラム陰性菌、例えば、エッシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア属、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、好ましくは、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物に対して殺菌活性を発揮する。
【００２７】
本明細書でいう「口腔内微生物」とは、上記で定義された微生物のうち、特に口腔内に存在し、または存在し得る微生物を意味する。口腔内微生物の種類は多種多様であるが、例えば、ストレプトコッカス属、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｉａ）、ミクロコッカス属（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）などがあげられる。
【００２８】
口腔内ストレプトコッカス属としては、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ）などがあげられる。ナイセリア属としては、ナイセリア・フラバ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｆｌａｖａ）、ナイセリア・サブフラバ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｓｕｂｆｌａｖａ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ）などがあげられる。
【００２９】
口腔内ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）などがあげられる。スピロヘータ属としては、トレポネマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ・マクレデンチアム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍａｃｒｅｄｅｎｔｉｕｍ）トレポネマ・オラリス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｏｒａｌｉｓ）などがあげられる。
【００３０】
口腔内微生物のうち、グラム陽性菌に属するものとしては、例えば、ストレプトコッカス属、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属、（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバチルス属、バクテリオネマ属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｎｅｍａ）、アラクニア属（Ａｒａｃｈｎｉａ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物が含まれる。例えば、ストレプトコッカス属に属する微生物として、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリナスをあげることができる。これらは、う蝕原因菌として知られている。
【００３１】
一方、口腔内微生物のうち、グラム陰性菌に属するものとしては、例えば、ナイセリア属、ブランハメラ属（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スピロヘータ属、およびセレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）に属する微生物が含まれる。
【００３２】
本明細書でいう「ナイシン」とは、特に示した場合を除き、ナイシンＡおよびナイシンＺをその範囲に含む。ナイシンＡとナイシンＺの構造は類似している。ナイシンＡでは、そのポリペプチド鎖のＮ末端から２７番目のアミノ酸がヒスチジンであるが、ナイシンＺではアスパラギンであるという点でのみ異なる。組成物中のナイシン活性は、微生物に対する殺菌活性を示す限り、限定されないが、例えば、２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。
【００３３】
本発明の組成物は、特定のｐＨ範囲での使用に特に適している。すなわち、当該組成物を特定のｐＨ範囲で微生物と接触させた場合、当該微生物に対して高い殺菌活性を示す。ここで、殺菌活性とは、上記ＭＢＣ法またはＭＢＣ変法による殺菌率で表現することができる。高い殺菌活性とは、例えば、殺菌率が好ましくは、９０〜１００％、より好ましくは９９〜１００％、さらに好ましくは９９．９〜１００％である。上記特定のｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５とすることができる。一態様として、本発明の組成物をｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５で微生物と接触させた場合、当該微生物に対して高い殺菌活性を示すことができる。
【００３４】
また、本発明の組成物は、微生物と接触させる際のｐＨを変動させることによって、特定の微生物群、例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に対する殺菌活性を高めることができる。一態様として、本発明の組成物とグラム陽性菌を、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくは５．０〜７．５、本発明の組成物とグラム陰性菌を、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくは４．５〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５で接触させることができる。
【００３５】
限定されないが、個別の微生物に対するナイシンの接触ｐＨの一例を以下に示す：
スタフィロコッカス・オーレウスに対しては、ｐＨ４．５〜１０．５、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０；
ストレプトコッカス・ミュータンスに対しては、ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．５〜６．５、より好ましくはｐＨ４．５〜６．０（ナイシンＡの場合、ｐＨ４．５〜５．５としてもよく、ナイシンＺの場合、ｐＨ５．０〜６．０としてもよい。）；
エッシェリヒア・コリに対しては、ｐＨ４．５〜７．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．６、より好ましくはｐＨ６．０〜６．５；
プロピオニバクテリウム・アクネスに対しては、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．０。
【００３６】
本発明は、微生物の殺菌方法にも適用することもできる。ここで、当該殺菌方法において、「ｐＨ４．０〜１０．５において」という場合は、ナイシンと微生物が接触している際のｐＨを意味する。当該ｐＨは、微生物と接触させる前のナイシンを含有する組成物自体のｐＨと同じであってもよいし、異なっていてもよいことを意味する。すなわち、ｐＨが２．０〜４．０に調整された本発明の組成物を、微生物と接触させる前または接触させた後に、接触時のｐＨが４．０〜１０．５になるように組成物のｐＨを調整しておくことができる。ｐＨの調整は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ剤などにより行うことができる。
【００３７】
本発明の殺菌方法において、ナイシンと微生物を特定の割合で接触させることができる。例えば、ナイシン１ＩＵあたりの微生物数を１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕとすることができる。
【００３８】
ナイシンと微生物の接触時間は、ナイシンが殺菌活性を発揮するために必要な時間であればよく、例えば、上記ＭＢＣ法またはＭＢＣ変法によって算出される殺菌率に基づいて設定することができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒に設定することができる。即効性が要求されない用途では、特に接触時間を設定しなくてもよいが、例えば、３分〜２４時間、好ましくは１〜１２時間に設定してもよい。また、抗菌作用の持続性が要求される用途では、ナイシンを交換または追加することにより、微生物に継続的に作用させてもよい。
【００３９】
ここで、ｃｆｕとは、コロニー形成ユニット（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を意味し、寒天培地上で形成されたコロニー数と希釈倍数に基づいて算出する。
本発明の殺菌方法においては、さらに、グラム陽性菌およびグラム陰性菌それぞれの殺菌に適した条件を段階的に適用することができる。例えば、微生物をグラム陽性菌の殺菌に適した条件で本発明の組成物と接触させた後、さらにグラム陰性菌の殺菌に適した条件で本発明の組成物と接触させる。この方法により、微生物の殺菌率をさらに高めることができる。なお、この２つの処理の順序を入れ替えても同様の効果が得られることは容易に理解できる。
【００４０】
本発明の殺菌方法は、ナイシンと微生物を接触させる工程に加えて、界面活性剤で処理する工程を含んでもよい。当該工程は、例えば、ナイシンと微生物を接触させる工程の前、後、または同時に行うことができる。
【００４１】
本発明の殺菌方法はまた、ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｇで含有するｐＨ４．０〜８．０に調整された組成物を、皮膚に塗布する工程含む、皮膚の殺菌方法とすることができる。
【００４２】
本発明の殺菌方法はまた、ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含有するｐＨ４．０〜７．０に調整された液で、殺菌上有効な時間、口腔内をすすがせる工程を含む、口腔内の殺菌方法とすることができる。
【００４３】
本発明により、ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ナイシンＡのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性。棒グラフはｃｆｕを表し、折れ線グラフはｐＨを表す。
【図２】ナイシンＡのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性における、ｐＨの影響。●：ナイシン活性２ＩＵ／ｍＬ；○：ナイシン活性１０ＩＵ／ｍＬ；▲：ナイシン活性５０ＩＵ／ｍＬ；□：ナイシン活性１００ＩＵ／ｍＬ。
【図３】ナイシンＡとナイシンＺのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性における、ｐＨの影響。●：ナイシンＡ ５０ＩＵ／ｍＬ；□：ナイシンＺ ５０ＩＵ／ｍＬ。
【図４】ナイシンＡのスタフィロコッカス・オーレウスＩＦＯ１３２７６に対する殺菌活性における、ｐＨの影響。△：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；▲：ナイシンＡ ５００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；■：ナイシンＡ ４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；○：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；●：ナイシンＡ ５００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；□：ナイシンＡ ４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分。
【図５】ナイシンＡのエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２に対する殺菌活性における、ｐＨの影響。△：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；▲：ナイシンＡ ５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；■：ナイシンＡ ２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；○：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；●：ナイシンＡ ５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；□：ナイシンＡ ２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分。
【図６】ナイシンＡのスタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５に対する殺菌活性における、ナイシン濃度の影響。□：接触ｐＨ未調整、接触時間３０秒；▲：接触ｐＨ未調整、接触時間６０分；●：接触ｐＨ５．０、接触時間３０秒；■：接触ｐＨ５．０、接触時間６０分。
【図７】ナイシンＡのエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２に対する殺菌活性における、ナイシン濃度の影響。■：接触ｐＨ未調整、接触時間３０秒；□：接触ｐＨ未調整、接触時間１５分；▲：接触ｐＨ５．０、接触時間３０秒；●：接触ｐＨ５．０、接触時間１５分。
【図８】ナイシンＡとスタフィロコッカス・オーレウスの接触時間の検討。●：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；■：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；▲：ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；○：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；□：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；△：ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整。
【図９】ナイシンＡとエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２の接触時間の検討。●：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；■：ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；▲：ナイシン活性２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；○：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；□：ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；△：ナイシン活性２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整。
【図１０】ナイシンＡを含有するマウスウォッシュのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋに対する殺菌活性。白抜きの棒グラフ：コントロール；斜線模様の棒グラフ：ｐＨ３．０に調整したマウスウォッシュによる処理；黒塗りの棒グラフ：ｐＨ５．０に調整したマウスウォッシュによる処理。ＳＭ−Ｘｃ：ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ＳＭ−ＪＣＭ：ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７；ＳＢ−ＡＨＴ：ストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋ。
【図１１】ナイシンＡと標的細胞（プロピオニバクテリウム・アクネス）の反応におけるｐＨおよびナイシン活性の影響。○：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍL；□：ナイシン活性５００ＩＵ／ｍL。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、微生物に対して殺菌活性を示す、ナイシンを含む微生物の殺菌用の組成物を提供する。ナイシンとは、バクテリオシンの一種であって、ランチオニンを含む３４アミノ酸残基からなる低分子タンパク質である。本発明におけるナイシンとは、例えば、ナイシンＡおよびナイシンＺを含む。ナイシンは、乳酸菌を公知の方法により培養し、精製することによって得ることができる。例えば、乳酸菌をエムアールエス培地（ＭＲＳ培地、Ｏｘｏｉｄ社製）で培養後、培養上清をアンバーライトＸＡＤ−１６（シグマ社製）で処理してナイシンを吸着させる。アンバーライトを蒸留水および４０％エタノールで洗浄後、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む７０％イソプロパノールでナイシンを溶出させ、溶出画分を陽イオン交換カラム（ＳＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に供することによって、ナイシンの精製品を得ることができる。必要な場合、逆相クロマトグラフィーに供することによって、さらに精製度を高めてもよい（Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.,６７(７),ｐ１６１６−１６１９，２００３を参照）。また、市販品、例えば、ナイサプリン（Ｎｉｓａｐｌｉｎ、商標、ダニスコ株式会社製）を購入してもよい。ナイサプリンは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）由来のナイシンと塩化ナトリウムとの混合物であり、無脂肪乳または糖培地由来の成分を含む。必要な場合、上記精製方法により精製度を高めてもよい。
【００４６】
組成物中のナイシン活性は、微生物に対する殺菌活性を示す限り限定されないが、例えば２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。ナイシンの活性は、特開２００２−３６９６７２に記載されている方法にしたがって、ナイシン（１μｇ＝４０ＩＵ、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ製）を標準品として、ＨＰＬＣのピーク面積の比較によって算出することができる。ＨＰＬＣの条件を以下に示す：
ＨＰＬＣ： 日立ＥＺ Ｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ ＨＰＬＣ Ｌ−２０００；
カラム： Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ６Ｅ；
ガードカラム： Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０Ｇ ６Ａ；
カラム温度： ２５℃；
溶離液： ０.０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル；
流速： １.０ ｍＬ/ｍｉｎ。
【００４７】
本明細書においてナイシンの殺菌活性を表すときは、特に示した場合を除き、上記のＭＢＣ法またはＭＢＣ変法で算出した値である。また、ナイシンの量または活性は、最小阻止円濃度検定法によっても測定することができる。
【００４８】
本発明における組成物には、ナイシン以外の成分を配合してもよい。例えば、界面活性剤（乳化剤、分散剤（再付着防止剤））、湿潤剤、着香剤、芳香剤、研磨剤、潤滑剤、キレート剤、溶剤、保湿剤、殺菌剤（抗菌剤）、安定化剤、洗浄用酵素、粘度調整剤、防腐剤、防黴剤、着色料、香料などを配合してもよい。
【００４９】
界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤：例えば、ポリエトキシル化ソルビトールエステル、酸化エチレンと酸化プロピレンとのポリ縮合物（ポロキサマー）、プロピレングリコール縮合物、ポリエトキシル化水素添加ヒマシ油、ソルビタン脂肪族エステル；両性界面活性剤：例えば、長鎖イミダゾリン誘導体、長鎖アルキルベタイン、長鎖アルキルアミドアルキルベタイン；カチオン界面活性剤：例えば、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギン酸エチルのＤ,Ｌ−２−ピロリドン−５−カルボン酸塩、コカミドプロピルＰＧジモニウムクロライドホスフェート、ラウラミドプロピルＰＧジモニウムクロライドホスフェート；があげられる。
【００５０】
界面活性剤を配合する場合、有効成分の殺菌効力を低下させないものがよい。また、医療または食品衛生上許容されるものが好ましく、例えば食品添加物として許可されている界面活性剤をあげることができる。具体的には、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンエステル（ジグリセリンモノカプレート、ジグリセリンモノラウレート、ジグリセリンモノステアレート、ジグリセリンモノオレート、デカグリセリンモノラウレート、デカグリセリンモノステアレート、ヘキサグリセリン縮合リシノレート）、有機酸モノグリセライド（酢酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、ジアセチル酒石酸モノグリセライド、コハク酸モノグリセライド）、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン（レシチン、酵素分解レシチン）、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ベヘニン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖混合脂肪酸（オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸）エステルなどである。
【００５１】
界面活性剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、１〜５０重量％、好ましくは、１〜３０重量％、より好ましくは、５〜２５重量％である。
【００５２】
キレート剤としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、クエン酸水素二ナトリウムなどがあげられる。キレート剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜５重量％、より好ましくは、０．５〜２重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５３】
湿潤剤としては、例えば、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールがあげられる。湿潤剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．５〜５０重量％、好ましくは、１〜１０重量％、より好ましくは、２〜５重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５４】
研磨剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、アルミナ、水素化アルミナ、オルトリン酸亜鉛、プラスチック粒子、シリカがあげられる。研磨剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．１〜７０重量％、好ましくは、１０〜５０重量％、より好ましくは、２０〜５０重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５５】
殺菌剤としては、カチオン抗微生物剤：第４級アンモニウム化合物、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩ベンゼトニウム、塩化メチルベンゼトニウム；抗微生物剤：クロルヘキシジン、アレキシジン、クロルヘキシジン・二グルコン酸塩、クロルヘキシジン・酢酸塩、塩化セチルピリジニウム、ヘキセチジン・クエン酸塩、トリクロサン、サリチル酸フェニル、グラミジシン、チロスリシン、塩化セチルピリジニウム；抗真菌剤：ミコナゾール、トリコナゾール；などがあげられる。殺菌剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、１〜１５重量％、好ましくは、５〜１５重量％、より好ましくは、５〜１０重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５６】
粘度調整剤としては、例えば、増粘剤：メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースがあげられる。粘度調整剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．０５〜５重量％、好ましくは、０．１〜２重量％、より好ましくは、０．５〜２重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５７】
本発明の組成物は、微生物の殺菌が必要な、あらゆる用途に使用することができる。例えば、家庭用・業務用の厨房、調理器具、食品加工工場、食品素材製造工場、家屋、ホテル、レストランなどの室内、家具備品、床などに存在する微生物の殺菌に使用できる。
【００５８】
別の例として、医療施設、例えば、病室、医療機器などの殺菌に使用できる。具体的には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター、クロストリジウム・ディフィシルなどの抗生物質耐性菌の殺菌に使用することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、皮膚の殺菌用に使用することができる。当該用途に用いる組成物は、ナイシンに加えて、例えば、界面活性剤、乳化剤、油性成分、保湿剤、抗炎症剤、収斂剤、溶剤、エタノール、皮膚軟化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、キレート剤、色剤、香料、紫外線吸収剤、緩衝剤、保存料等を配合することができる。
【００６０】
本発明の組成物をニキビの予防・治療用に使用する場合、種々の形態、例えば洗顔料、化粧水、乳液、美容液とすることができる。その一態様として、ニキビの予防・治療用の化粧水は、次のように調製することができる。精製水に精製ナイシン（１，０００IＵ／ｍＬ）、グリセリン（３．０重量％）、１，３−ブチレングリコール（１．０重量％）を溶解する。さらにパラオキシ安息香酸メチル（０．０５重量％）を溶解したエタノール（５．０重量％）を添加し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で目的のｐＨ、例えばｐＨ５．５に調整する。塩酸または水酸化ナトリウムによるｐＨ調整の代わりに、緩衝剤、例えばクエン酸およびクエン酸ナトリウムを化粧水が目的のｐＨとなるように予め精製水に添加してもよい。さらに別の態様としては、ナイシンを含有する酸性溶液と他の成分を含有するアルカリ性溶液を予め調製し、使用時に両者を混合することにより目的のｐＨを有する化粧水を調製してもよい。
【００６１】
さらに、本発明の組成物は、口腔内微生物の殺菌用に使用することができる。当該用途に用いる組成物は、ナイシンに加えて、例えば、抗菌剤、酵素、抗炎症剤、フッ化物、研磨剤、湿潤剤、発泡剤、増結剤、香味剤（甘味剤、香料、フレーバー）、着色剤、保存料を配合することができる。その一態様として：精製ナイシンを滅菌精製水で希釈し、ナイシン活性を１０，０００ＩＵ／ｍＬに調製した溶液に、ソルビトールまたはキシリトール（５重量％）およびローズマリーエキス（０．１重量％）を配合し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）でｐＨ３〜５に調整する。
【００６２】
本発明の組成物は、特定のｐＨ範囲で、微生物に対する優れた殺菌活性を示す。特定のｐＨ範囲としては、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５である。このｐＨ範囲において、本発明の組成物を微生物に接触させると、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を殺菌することができる。
【００６３】
本発明の別の側面として、本発明の殺菌用組成物を、グラム陽性を殺菌するためにより適したｐＨ範囲において、微生物と接触させることができる。グラム陽性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．５〜８．０、より好ましくはｐＨ５．０〜７．５である。このようなｐＨ範囲で本発明の組成物と微生物を接触させれば、グラム陽性菌に対する殺菌活性をより高めることができる。
【００６４】
本発明の別の側面として、本発明の殺菌用組成物を、グラム陰性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲において、微生物と接触させることができる。グラム陰性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．５〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５を含む。このようなｐＨ範囲で本発明の組成物と微生物を接触させれば、グラム陰性菌に対する殺菌活性をより高めることができる。
【００６５】
本発明において、ｐＨの測定は、例えば、ｐＨメーター（堀場製作所Ｆ−５２、電極型式９６１１−１０Ｄ、測定温度２５℃）を用いて行うことができる。また、ｐＨ調整剤としては、例えば、酸性側のｐＨ調整剤として、塩酸、リンゴ酸やクエン酸などの有機酸、アルカリ側のｐＨ調整剤として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを使用することができる。ｐＨ調整剤の濃度は、例えば、０．００１〜１Ｎ、好ましくは０．０１〜０．５Ｎ、さらに好ましくは０．１〜０．２Ｎとすることができる。
【００６６】
上記グラム陽性菌としては、例えば、ストレプトコッカス属の微生物：ストレプトコッカス・ミュータンス、およびストレプトコッカス・ソブリナス、スタフィロコッカス属の微生物：スタフィロコッカス・オーレウス、そしてプロピオニバクテリウム属の微生物：プロピオニバクテリウム・アクネスがあげられる。この中で、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリナスは、う蝕原因菌として知られ、そしてスタフィロコッカス・オーレウスは、黄色ブドウ球菌として知られている。プロピオニバクテリウム・アクネスは、ヒトや動物の皮膚などに存在する菌であり、皮膚疾患、例えばニキビの起因菌として知られている。
【００６７】
上記グラム陰性菌としては、例えば、エッシェリヒア属：エッシェリヒア・コリがあげられる。エッシェリヒア・コリは、様々な環境において広く存在する菌であり、その中には毒性の強いものも存在する。
【００６８】
以上のことから、本発明の組成物は、微生物の殺菌が必要な、あらゆる対象に使用することができる。例えば、ヒトを含む動物の身体の一部（口腔、歯および歯周、皮膚、鼻腔、手指、顔、足等）、器具・機械（医療器具、調理器具、衛生器具、介護用品、ベビー用品、おもちゃ、食品製造機、医療機器、食卓、机、椅子、家具備品等）、場所（家庭用・業務用の厨房、食品加工工場、食品素材製造工場、家屋、ホテル、レストランなどの室内、医療施設、病室、床、作業台、等）を微生物学的に清浄にするために使用することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、微生物の殺菌方法において使用することができる。例えば、特定のｐＨ範囲において、ナイシンと微生物を一定の割合で所定時間接触させることを含む、微生物の殺菌方法に使用できる。特定のｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５とすることができる。個別の微生物に対するｐＨ範囲は、上記に記載の通りである。ナイシンと微生物の接触は、例えば、ナイシン１ＩＵあたり微生物１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕの割合で接触させることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７０】
別の側面において、本発明の組成物はまた、第１段階：グラム陽性菌の殺菌に適したｐＨ範囲でナイシンと微生物を一定の割合で所定時間接触させた後、第２段階：グラム陰性菌の殺菌に適したｐＨ範囲でナイシンと微生物を所定時間接触させることによる微生物の殺菌方法に使用することができる。
【００７１】
前記第１段階において、ナイシンと微生物の割合は、例えば、ナイシン１ＩＵあたりグラム陽性菌を１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕで接触させることができる。ｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくは５．０〜７．５とすることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７２】
前記第２段階において、ｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくは４．５〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５とすることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７３】
このように、グラム陽性菌の殺菌に適した第１段階に係る方法、およびグラム陰性菌の殺菌に適した第２段階に係る方法を組み合わせることにより、微生物をさらに効率的に殺菌することができる。第１段階と第２段階の順序を入れ替えても、同様の効果を得ることができる。
【００７４】
本発明の組成物は、あらかじめ殺菌に適した成分濃度およびｐＨ範囲に調整しておくことができる。さらに、運搬保管等の取り扱いまたは保存安定性の観点から都合がよいと考えられる場合は、使用時に殺菌に適した成分濃度およびｐＨ範囲に調整してもよい。後者の形態の例としては、キットがあげられる。当該キットは、各成分が独立して存在していてもよいし、混合状態で存在してもよいし、粉末、固体、液体など任意の形態にすることができる。例えば、保存上有効な形態で各成分を独立してまたは組み合わせて含む一または複数のプレミックス、溶剤等を含んでもよい。プレミックスとは、用途に則した各成分が特定の量または配合比であらかじめ調合されており、使用時に適切な溶媒で溶解、希釈、および／または混合して用いるための組成物を意味する。
【００７５】
本発明の別の側面は、ｐＨが２．０〜５．０、より好ましくはｐＨが３．０〜４．０である組成物が提供される。ナイシンは酸性ｐＨにおいて安定かつ溶解度が高いことが知られている。このため、未使用時にはこのｐＨ範囲で保存し、使用直前に微生物の殺菌に適したｐＨに調整することがナイシンの保存安定性の観点から好ましいといえる。したがって、ｐＨ２．０〜５．０に調整された組成物は、微生物の殺菌用組成物のプレミックスとして使用することができる。別の態様として、ナイシンを高濃度で含む組成物をプレミックスとし、使用時にこれを希釈した場合、殺菌に適したｐＨに調整された希釈液が得られるようにすることも可能である。このよう使用態様は、利用の簡便性の観点から、実用的な使用において好ましい。
【００７６】
以下の実施例において、本発明の具体例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
［実施例１］ ナイシンＡによる殺菌活性の検討
（１−１）試験液の調製
精製ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシン水溶液（２，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、該水溶液のｐＨを０．１Ｎ塩酸でｐＨ３．４に調整した。該水溶液を滅菌精製水で２倍ずつ５段階希釈し、以下の表に示すナイシン活性を有する試験液を調製した。併せて、該希釈液のｐＨを測定した（表１）。
【００７８】
【表１】
【００７９】
（１−２）殺菌活性試験
う蝕原因菌ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃをＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養した。培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整した（１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、上記各試験液１〜６（５ｍＬ）に添加した。室温で３０秒間接触させた後、該液（１００μＬ）をＳＣＤブイヨン培地（５ｍＬ）に添加・混合し、直ちに該混合液（１００μＬ）をＳＣＤ寒天培地（日水製薬株式会社製）上にプレーティングして、３７℃で培養した。４８時間培養後の生菌数を計測し（図１）、以下の式に基づいて殺菌率（％）を算出した。
【００８０】
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
（１−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する各試験液の殺菌率は、試験液３（ナイシン活性５００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ４．７）で９９．６％であった（図１）。試験液３よりナイシン活性が高い試験液１（ナイシン活性２，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．４）および試験液２（ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．８）の殺菌率は、それぞれ２０％および４３％であった。一方、試験液３よりナイシン活性が低い試験液４（２５０ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）、試験液５（１２５ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）および試験液６（６３ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）は、殺菌活性をほとんど示さなかった。
【００８１】
この結果から、ナイシンＡの殺菌活性はｐＨの影響を受けることが示された。このことは、ナイシンの殺菌活性は、ｐＨによって調節、例えば増強、できることを示唆する。
［実施例２］ ナイシンの殺菌活性におけるｐＨの影響
（２−１）試験液の調製
精製ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシンＡ水溶液（活性４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、該水溶液のｐＨを塩酸（０．１Ｎ）でｐＨ３．５に調整した。該水溶液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整し（１００、５０、１０、２ＩＵ／ｍＬ）、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で各希釈液のｐＨを調整し（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）、これを試験液とした。
【００８２】
（２−２）殺菌活性試験
上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った（図２）。
（２−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対するナイシンの活性のｐＨ依存性は、ナイシンＡを５０ＩＵ／ｍＬ含む試験液で最も顕著であった。また、殺菌活性はｐＨ５．０で最大を示した。さらに、ナイシン活性が５０ＩＵ／ｍＬ以上であれば、ｐＨ４．５〜７．０の範囲において十分な殺菌活性を発揮することが示された。
【００８３】
［実施例３］ ナイシンＡまたはナイシンＺの殺菌活性におけるｐＨの影響
（３−１）試験液の調製
上記実施例２（２−１）にしたがって、ナイシンＡおよびナイシンＺ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｉｃｅｃｈｅｍ社製）、の水溶液（４，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．５）を調製した。該水溶液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整（５０ＩＵ／ｍＬ）し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で希釈液のｐＨを調整し（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）、これを試験液とした。
【００８４】
（３−２）殺菌活性試験
上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
（３−３）結果
結果を図３に示す。ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対するナイシンＡの殺菌活性は、ｐＨ５．０付近で最大になることが示唆された。一方、ナイシンＺの殺菌活性は、ｐＨ５．５付近で最大になることが示された。これらの結果から、ナイシンＡとナイシンＺは、共に至適ｐＨでストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する高い殺菌活性を有することが示された。
【００８５】
［実施例４］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるｐＨの影響
（４−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨが２．８〜１０．５に調整された、ナイシン水溶液（ナイシン活性０、５００、４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製した。前記ｐＨの調整は、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００８６】
（４−２）殺菌活性試験
スタフィロコッカス・オーレウスＩＦＯ１３２７６をＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養した。培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整した（１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、上記試験液（１０ｍＬ）に添加した。室温で３０秒または６０分間接触させた後、該液（１００μＬ）を、不活性化剤としてポリソルベート８０を含むＳＣＤＬＰ培地（１０ｍＬ）に添加・混合し、該混合液の希釈系列を作成し、これをＳＣＤ寒天培地（日水製薬株式会社製）と混釈し、３７℃で培養した。４８時間培養後の生菌数を計測し、以下の式に基づいて殺菌率（％）を算出した。
【００８７】
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
（４−３）結果
ナイシンＡは、黄色ブドウ球菌スタフィロコッカス・オーレウスに対しても殺菌活性を示した（図４）。試験液は、少なくとも６０分の接触時間で十分な殺菌効果を示した。更に、６０分の接触時間において、ナイシン活性５００ＩＵ／ｍＬの試験液ではｐＨ５．５以上、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬの試験液ではｐＨ５．０以上、のｐＨで高い殺菌活性を示した。このｐＨより低いｐＨでは、殺菌活性は著しく低下した。一方、接触時間３０秒において、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬの試験液は、ｐＨ７．５付近で最大の殺菌活性を示し、ｐＨ６．０〜１０．５で抗菌活性が認められた。このｐＨ範囲を外れると、殺菌活性は著しく低下した。
【００８８】
上記の結果から、ナイシンが安定である酸性領域よりｐＨを高くすることにより、ナイシンの殺菌活性を向上できることが明らかになった。
［実施例５］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるｐＨの影響
（５−１）試験液の調製
試験液の調製は、上記実施例４（４−１）に記載の方法に従った。
【００８９】
（５−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用した以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９０】
（５−３）結果
ナイシンＡは、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリに対しても殺菌効果を示した（図５）。ｐＨ５．１〜６．６の範囲を外れると、殺菌活性は急激に低下した。一方、ナイシンが安定である酸性領域の試験液では、殺菌活性はほとんど確認できなかった。
【００９１】
ナイシンはグラム陰性菌に対しては作用しないという従来の知見を鑑みれば、この効果は全くの予想外であった。
［実施例６］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるナイシン活性の影響
（６−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、１０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００、４，０００、５，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９２】
（６−２）殺菌活性試験
試験菌として、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５を使用した以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９３】
（６−３）結果
殺菌活性は、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５とナイシンの接触ｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図６）。少なくとも、ナイシン２，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間６０分の条件において、９０％以上の殺菌率を達成できた。一方、ナイシン（２，０００ＩＵ／ｍＬ以上）が存在していても、ｐＨ未調整（ｐＨ２．８〜３．１）の試験液では、殺菌活性をほとんど確認できなかった。
【００９４】
［実施例７］ ナイシンのグラム陰性微生物に対する殺菌活性におけるナイシン活性の影響
（７−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、５００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９５】
（７−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用し、接触時間を３０秒または１５分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９６】
（７−３）結果
殺菌活性は、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２とナイシンの接触時のｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図７）。少なくとも、ナイシン活性１０，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間３０秒以上の条件で９０％以上の殺菌率が達成された。一方、ナイシン（１０，０００ＩＵ／ｍＬ以上）が存在していても、ｐＨ未調整（ｐＨ２．６〜２．８）の試験液では、殺菌活性をほとんど確認できなかった。
【００９７】
［実施例８］ ナイシンとグラム陽性微生物の接触時間の検討
（８−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整（ｐＨ２．６〜３．０）またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性０、１，０００、４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９８】
（８−２）殺菌活性試験
試験菌として、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５を使用し、接触時間を０．５、１、２、５、１０、１５、３０、６０分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９９】
（８−３）結果
殺菌活性は、スタフィロコッカス・オーレウスとナイシンとの接触時のｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図８）。少なくとも、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間３０分以上の条件で、９０％以上の殺菌率が達成された。
【０１００】
［実施例９］ ナイシンとグラム陰性微生物の接触時間の検討
（９−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整（ｐＨ３．０〜３．２）またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、５，０００、２０，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【０１０１】
（９−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用し、接触時間を０．５、１、５、１０、１５、３０、６０分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【０１０２】
（９−３）結果
殺菌活性は、エッシェリヒア・コリとナイシンとの接触ｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図９）。少なくとも、ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間０．５分以上の条件で、９０％以上の殺菌率が達成された。
【０１０３】
［実施例１０］ ナイシン含有マウスウォッシュ
（１０−１）ナイシン含有マウスウォッシュの調製
精製ナイシン（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシン水溶液を調製（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）した。該ナイシン水溶液にソルビトール（５重量％、花王株式会社製）およびローズマリーエキス（０．１重量％、香栄工業株式会社製）を配合し、塩酸（０．１Ｎ）でｐＨを３．５に調整し、マウスウォッシュの原液を調製した。
【０１０４】
上記原液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整（５００ＩＵ／ｍＬ）し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）でｐＨを３．０または５．０に調整した。前記ｐＨ３．０に調整された組成物を対照のマウスウォッシュ、そして、前記ｐＨ５．０に調整された組成物を本発明のマウスウォッシュとして、以下の試験に供した。
【０１０５】
（１０−２）殺菌活性試験
試験菌として３種類のう蝕原因菌：ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋを使用した以外は、上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った（図１０）。
【０１０６】
（１０−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋに対する殺菌率は、ｐＨ３．０の対照のマウスウォッシュによる処理では、それぞれ２９％、６３％、２４％であった。一方、ｐＨ５．０の本発明のマウスウォッシュによる処理では、それぞれ１００％、９９．８％、９８．９％と極めて優れた殺菌効果が示された。
【０１０７】
今回の結果から、本発明の組成物は、う蝕予防用のマウスウォッシュに適していることが明らかになった。
［実施例１１］ナイシンと標的細胞の反応におけるｐＨおよびナイシン活性の影響
（１１−１）供試菌液およびナイシン溶液の調製
供試菌液を以下の手順で調製した。プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ６９１９を、強化クロストリジア培地（OXOID社製）で前培養し、当該培養液（１０μＬ）を強化クロストリジア培地（１０ｍＬ）に接種し、３７℃で４日間、嫌気的環境下で旋回培養（１６０ｒｐｍ）を行った。嫌気的環境は、アネロパック（三菱ガス化学株式会社製）を使用することによって調整した。この培養液を供試菌液として以下の抗菌活性試験に使用した。
【０１０８】
ナイシン溶液を以下の手順で調製した。ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を、ｐＨ３．０〜８．０に調整したＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液に溶解し、菌体接触時のナイシン活性が１，０００、または５００（ＩＵ／ｍＬ）になるよう調製した。
【０１０９】
（１１−２）抗菌活性試験
ナイシン溶液（４５０μＬ）に供試菌液（５０μＬ）を添加することにより、ナイシンと供試菌を室温（２５℃）で接触させた。当該液を試験液とした。一方、ナイシンを含まない溶液（４５０μＬ）に供試菌液（５０μＬ）を添加したものを対照試験液とした。３分後、試験液および対照試験液の菌体外に存在するＡＴＰの量を、ＡＴＰとルシフェリンの反応に由来する相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。試験液および対照試験液を測定に用いる緩衝液で１００倍に希釈し、測定に使用した。ＡＴＰ測定用試薬キット（ルシフェール２５０、キッコーマン株式会社製）、およびルミテスターＣ−１００（キッコーマン株式会社製）を用い、製品に添付の使用説明書の記載にしたがって、相対発光量を測定した。試験液の相対発光量から対照試験液の相対発光量を差し引いた値を、微生物の菌体内から菌体外へ流出したＡＴＰの量とした（図１１）。
【０１１０】
（１１−３）結果
ナイシンは微生物の細胞膜（リピッドII）を標的として作用し、細胞膜に孔を形成し、殺菌的に作用する。ナイシンが形成する孔は、イオンのみならずＡＴＰも流出させる。標的細胞からのＡＴＰ流出量（菌体外ＡＴＰ濃度）をナイシンによる殺菌活性の指標として、ナイシンの殺菌活性におけるｐＨおよびナイシン活性（ナイシン作用濃度）の影響を評価した。
【０１１１】
アクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネス）からのＡＴＰ流出量は、ナイシンが安定な酸性域（ｐＨ３．０〜４．０付近）および弱アルカリ域（ｐＨ８．０付近）に比べ、ｐＨ５．０〜６．０で著しく増加しｐＨ６．０付近で最大値を示した。この結果からナイシンと標的細胞との反応（細胞膜の孔形成）がナイシン作用時のｐＨに著しく影響され、アクネ菌に対してはｐＨ５．０〜６．０で作用させることが効果的であることが明らかとなった。またＡＴＰ流出量は、ナイシン活性（ナイシン作用濃度）依存的に増加するが、増加の程度はｐＨ５．０〜６．０で顕著に高くなった。
【０１１２】
この結果から本発明の組成物は、ニキビ起因菌であるアクネ菌に対しても効果的に作用するため、ニキビ予防及び治療用としても有効であることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナイシンの殺菌上有効な使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ナイシンを殺菌上有効なｐＨ条件で使用すること、およびそのための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイシンは、乳酸菌が生産する抗菌性のペプチドであるが、アメリカでは一般的に安全（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ：ＧＲＡＳ）と認定され、チーズ等の保存料として実際に用いられているほか、世界５０カ国以上で食品添加物として認可されている。したがって、ナイシンを抗菌剤に使用すれば、安全性の高い抗菌剤を提供することができる。
【０００３】
ナイシンは、グラム陽性菌に対して幅広い抗菌活性を示すが、グラム陰性菌に対しては抗菌活性が弱いことが知られている。この点に関し、ナイシンをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤や有機酸と組み合わせて用いることによって、グラム陰性菌に対する抗菌活性が高まるとの報告（非特許文献１、非特許文献２）や、金属イオンの存在により、グラム陰性菌に対する抗菌活性が低下するという報告がある（非特許文献３）。
【０００４】
他方、ナイシンが十分な抗菌活性を発揮するためには、ナイシンが物理的に安定に存在することが前提となる。ナイシンの安定性に関しては、メチオニンを安定剤として配合すること（特許文献１）、洗浄剤組成物に用いるに際しては適切な界面活性剤を選択すること（特許文献２）などが検討されてきた。ナイシンはまた、ｐＨ３で最も安定であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平８−５１０７１６号公報
【特許文献２】特開２００７−９９８０９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology , 58 (5), p.1786-88, 1992
【非特許文献２】International Journal of Food Microbiology, 21, p.305-314, 1994
【非特許文献３】International Journal of Antimicrobial Agents, 26, p.396-402, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの検討によると、ナイシンへＥＤＴＡを添加した場合には、ナトリウムイオンの存在によってグラム陰性菌に対する抗菌効果が期待したほどには得られず、また有機酸を添加した場合には、グラム陰性菌に対する抗菌効果は高くなるが、ｐＨが非常に低くなり実用性に乏しくなるという問題があった。さらに界面活性剤とナイシンの混合液においてＥＤＴＡや有機酸を添加し、ｐＨを弱酸性にしたものについては、抗菌効果はほとんど確認できなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の事情に鑑み、鋭意検討を行った結果、ｐＨ４．０〜１０．５において、ナイシンの殺菌活性が向上することを見出した。このような抗菌活性の向上は、従来から知られているナイシンのグラム陽性菌に対する殺菌活性が向上することに加えて、ナイシン単独では作用しないと考えられてきた、グラム陰性菌に対する殺菌活性が向上することにも基づく。また、ｐＨ５．０〜６．５において、グラム陽性菌に対する殺菌活性がさらに向上すること、ｐＨ４．０〜６．５において、グラム陰性菌に対する殺菌活性がさらに向上することを見出した。上記の結果から、ナイシンは、ｐＨ５．０〜６．５においてグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する殺菌活性をより一層向上させることが導き出された。本発明は、かかる知見に基づいて完成された。
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
１）ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含む、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されている、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【００１０】
２）ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、１）に記載の組成物、またはキット。
３）ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨが５．０〜６．５に調整されている、グラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用であり、かつグラム陰性である微生物の少なくとも一種の殺菌用である、１）に記載の組成物、またはキット。
【００１１】
４）グラム陽性菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)、またはプロピオニバクテリウム・アクネス（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ)から選択され、グラム陰性菌が、エッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)から選択される、１）に記載の組成物、またはキット。
【００１２】
５）さらに界面活性剤を含む、１）に記載の組成物、またはキット。
６）ｐＨ４．０〜１０．５において、グラム陽性またはグラム陰性である微生物の少なくとも一種を、ナイシン１ＩＵあたり１０〜１０，０００ｃｆｕの割合で１０〜１８０秒間接触させて殺菌する工程を含む、微生物の殺菌方法。
【００１３】
７）ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、６）に記載の殺菌方法。
８）ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨ５．０〜６．５において、グラム陽性菌（好ましくは、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ラクトバチルス属、プロピオニバクテリウム属から選択される菌、より好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス、スタフィロコッカス・オーレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ラクトバチルス・プランタルム、プロピオニバクテリウム・アクネスから選択される菌）の少なくとも一種を殺菌するための、かつグラム陰性菌（好ましくは、エッシェリヒア属から選択される菌、より好ましくはエッシェリヒア・コリから選択される菌）の少なくとも一種以上を殺菌するための、７）に記載の殺菌方法。
【００１４】
９）ｐＨ４．０〜１０．５において、ナイシン１ＩＵと微生物１０〜１０，０００ｃｆｕを１０〜１８０秒間接触させて、グラム陽性菌を殺菌し；ｐＨ４．０〜８．０において、ナイシンと微生物を１０〜１８０秒間接触させて、グラム陰性菌を殺菌する；
微生物の殺菌方法。
【００１５】
１０）さらに界面活性剤で処理する工程を含む、８）または９）に記載の殺菌方法。
１１）ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法。
【００１６】
本明細書でいう「組成物」とは、ナイシンを含む限り、特に限定されない。当該組成物は、組成物の用途に適した形態とすることができる。例えば、液状、粉状、顆粒状、ゲル状、固形状、または適切な担体に固定化させた形態とすることがあげられる。さらに、本発明の技術分野において知られている成分を本発明の組成物に配合することができる。例えば、界面活性剤、乳化剤、湿潤剤、着香剤、芳香剤、研磨剤、潤滑剤、キレート剤、分散剤（再付着防止剤）、溶剤、保湿剤、殺菌剤（抗菌剤）、安定化剤、洗浄用酵素、粘度調整剤、防腐剤、防黴剤、着色料、香料を適宜選択し、本発明の組成物に配合することができる。一態様として、上記の成分を配合して、本発明の組成物が殺菌作用に加えて洗浄作用を発揮できるようにしてもよい。なお、当該組成物に含まれるナイシンは、単独でグラム陰性菌を殺菌できるため、組成物がキレート剤を含有しなくても幅広い殺菌活性を発揮することができる。ここで、キレート剤とは、金属イオンに配位し、キレート化合物を与えるような多座配位子を意味する。例えば、ＥＤＴＡのようなポリアミノカルボン酸類およびクエン酸のようなオキシカルボン酸などがあげられる。
【００１７】
本発明の組成物は、微生物の殺菌を必要とする様々な分野に広く利用することができる。例えば、食品分野での利用があげられる。一態様として、本発明の組成物は、家庭用・業務用の厨房、調理器具、食品加工工場、食品素材製造工場などにおいて、食中毒微生物および食品危害微生物の殺菌に使用できる。特に、高度な衛生管理が求められる食品関連産業においては、食中毒微生物および食品危害微生物の殺菌は必須事項であるため、効果的かつ安全な殺菌方法が強く要請されている。ここで、食中毒微生物として、下痢原性大腸菌（腸管出血性大腸菌Ｏ１５７など）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・オーレウス）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウエルッシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｅｌｃｈｉｉ）、エルシニア エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ナグビブリオ（ｎｏｎａｇｇｌｕｔｉｎａｂｌｅ ｖｉｂｒｉｏｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、プレシオモナス シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）などがあげられる。また、食品危害微生物として、食中毒微生物に加え、乳酸菌、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ属、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）などがあげられる。
【００１８】
別の例として、本発明の組成物は、家屋、ホテル、レストランなどの室内、家具備品、床などに存在する微生物を殺菌することに使用できる。
別の例として、本発明の組成物の医療分野での利用があげられる。医療分野では、ヒトに対する治療行為が行われることから、高度な衛生管理が要求されているが、近年、抗生物質耐性菌、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による院内感染が大きな問題になっている。このような観点から、本発明の組成物を医療施設の殺菌に広く使用することができる。
【００１９】
本発明の組成物は、皮膚疾患の予防や治療用に適している。通常、ヒトの皮膚上には、表皮ブドウ球菌（スタフィロコッカス エピデルミディス）やアクネ菌等の多種多様な微生物が常在し、これらの微生物が過度に増殖すること等が原因となって皮膚疾患が発症する。皮膚に存在するこれらの微生物を殺菌する目的で従来から使用されている殺菌剤は、皮膚刺激性であり、かつ標的とする細菌のみならず皮膚組織の修復に寄与する細胞、例えば免疫細胞、線維芽細胞、及び表皮細胞に対しても毒性を示す等の問題がある。例えば、一般的な皮膚疾患であるニキビ（尋常性座瘡）は、皮脂分泌の増加、毛嚢皮脂線の閉塞、及びアクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネス）の異常増殖が原因で起こることが知られている。ニキビの予防や治療においては、抗生物質や角質の剥離剤が従来から使用されてきたが、抗生物質の使用は、副作用や耐性菌が発生するという問題があり、イオウやサルファ剤等の角質の剥離剤の使用は、皮膚刺激性およびニキビの予防または治療効果が不十分という問題がある。
【００２０】
これらのことから、皮膚への刺激性が低く、標的微生物に対する特異性が高く、かつ安全性の高い、皮膚疾患の予防や治療用の組成物が求められている。本発明は、そのような組成物を提供することができる。例えば、本発明の組成物は、皮膚への刺激性が極めて低く、アクネ菌を効率的に殺菌できるので、ニキビの予防や治療用の組成物を提供することができる。
【００２１】
さらに、本発明の組成物は、口腔内微生物の殺菌用にも適している。本明細書でいう「殺菌」とは、微生物を死滅させることのみでなく、微生物の成長を停止、阻害または遅延させることも含む。したがって、本明細書でいう「殺菌用の組成物」とは、微生物の殺菌に適した組成物を意味する。ここで、組成物が殺菌に適しているか否かは、例えば、抗菌性評価（ＭＢＣ変法）による評価結果に基づいて判断することができる。ＭＢＣ法とは最小殺菌濃度を測定する方法であり、ＭＢＣ変法とは、ＭＢＣ法を基本としつつ培養条件、殺菌剤濃度、接触時間、接触温度、供試菌濃度等の諸条件を任意に設定し、その条件下での生残菌数を測定する方法である。例えば、供試菌（例えば、大腸菌）をＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養後、培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整する（１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、試験液（ナイシン含有組成物、５ｍＬ）に添加し、混合させることにより、試験液と供試菌を室温で接触（３０秒）させた後、該液（１００μＬ）を分取し、不活化剤を含む培地（ＳＣＤＬＰ培地、５ｍＬ）で希釈する。当該不活化剤を含む培地中に生残する菌数を混釈板法により培養（３７℃、２４時間）し、出現したコロニーを計数し、以下の計算式：
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
により、殺菌率を算出する。
【００２２】
ＭＢＣ変法は、殺菌剤濃度、接触時間、接触温度、供試菌濃度などの諸条件を、試験目的により適宜変更することができ、培地、培養条件を、供試菌の種類により適宜変更することができる。また、試験液と供試菌を接触させた後、不活化剤を含む液体培地を用いて培養し、培養後の培地の濁度に基づいて、当該培地中に生残する菌の有無および生育の程度を定性的に判定することも可能である。ここで、不活化剤とは、殺菌剤を不活性化する化合物や組成物であって、例えば、ミセルを形成し、殺菌成分を取り込む界面活性剤が汎用される。その他、殺菌剤の種類によっては中和剤、例えばアニオン界面活性剤やチオ硫酸ナトリウムなどを使用してもよい。例えば、界面活性剤ポリソルベートをナイシンの不活性化剤として使用することができる。
【００２３】
上記ＭＢＣ変法において、微生物の殺菌率が９０％以上であれば、組成物は殺菌効果があると判断することができる。求められる殺菌効果の程度は、使用分野・用途・使用方法により異なるが、組成物による殺菌率は、例えば、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９９〜１００％、さらに好ましくは９９．９〜１００％である。一般的な殺菌剤としての用途および環境殺菌用途であれば、９９．９％の殺菌率で十分であるが、食品が接触する無菌設備の殺菌用途では、９９．９９９％以上の殺菌率が要求されることもある。
【００２４】
また、本発明の組成物が殺菌に適しているかは、微生物の菌体内から菌体外に流出するＡＴＰの量を指標にして判断することができる。ナイシンは、微生物の細胞膜（リピッドII）に作用し、細胞膜に孔を形成することによって殺菌効果を発揮するため、形成された孔から菌体外に流出するＡＴＰの量が多いほど殺菌活性が高いと判断できる。ＡＴＰ量の測定は、例えば、ルシフェラーゼによって触媒されるＡＴＰとルシフェリンの反応で生じる発光を相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ: ＲＬＵ）として測定することによって行うことができる。相対発光量は、前記反応により生じる発光を、例えば光電子増倍管を検出器とした測定装置を用いて測定することができる。このような測定は、市販の測定キットを用いて行ってもよい。また試料中のＡＴＰ濃度と相対発光量の関係を両対数グラフにプロットすると、両測定値の間には例えばＡＴＰ濃度で２×１０−１２〜２×１０−８Ｍの範囲において良好な直線関係が得られるため、必要に応じてＡＴＰ標準試薬を使用して検量線を作成し、相対発光量をＡＴＰ濃度に換算することも可能である。
【００２５】
菌体外に流出するＡＴＰの量を指標にする判断方法の例を示す。プロピオニバクテリウム属の微生物を、適切な培地で前培養し、当該培養液を新たな培地に接種し、嫌気的環境下で旋回培養を行い、この培養液を供試菌液とする。ナイシン溶液に供試菌液を添加することにより、ナイシンと微生物を３分間接触させ、当該液を試験液とする。一方、ナイシンを含まない溶液に供試菌液を添加し、同様に処理したものを対照試験液とする。試験液および対照試験液を測定に用いる緩衝液で適宜希釈し、市販のキットを用いて菌体外に存在するＡＴＰの量を相対発光量として測定する。試験液の相対発光量から、対照試験液の相対発光量を差し引いた値を、微生物の菌体内から菌体外に流出したＡＴＰの量とする。この例に示した条件でＡＴＰの量を測定した場合、相対発光量が２０，０００ＲＬＵ以上、好ましくは５０，０００ＲＬＵ以上、より好ましくは１００，０００ＲＬＵ以上であれば、組成物に殺菌効果があると判断することができる。
【００２６】
本明細書における微生物は、グラム陽性菌とグラム陰性菌に分類できる。グラム陽性菌とグラム陰性菌に属する微生物は、例えば、Bergey's Manual Of Systematic Bacteriology: The Proteobacteria; The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Springer-Verlag)) George Garrity、Don J. Brenner、Noel R. Krieg、 James T. Staleyに収載されている。本発明の組成物は、グラム陽性菌、例えば、バチルス属、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属、リステリア属、マイクロコッカス属、プロピオニバクテリウム属、好ましくは、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびプロピオニバクテリウム・アクネスに属する微生物に対して殺菌活性を発揮する。本発明の組成物は、グラム陰性菌、例えば、エッシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア属、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、好ましくは、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物に対して殺菌活性を発揮する。
【００２７】
本明細書でいう「口腔内微生物」とは、上記で定義された微生物のうち、特に口腔内に存在し、または存在し得る微生物を意味する。口腔内微生物の種類は多種多様であるが、例えば、ストレプトコッカス属、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｉａ）、ミクロコッカス属（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）などがあげられる。
【００２８】
口腔内ストレプトコッカス属としては、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ）などがあげられる。ナイセリア属としては、ナイセリア・フラバ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｆｌａｖａ）、ナイセリア・サブフラバ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｓｕｂｆｌａｖａ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ）などがあげられる。
【００２９】
口腔内ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）などがあげられる。スピロヘータ属としては、トレポネマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ・マクレデンチアム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍａｃｒｅｄｅｎｔｉｕｍ）トレポネマ・オラリス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｏｒａｌｉｓ）などがあげられる。
【００３０】
口腔内微生物のうち、グラム陽性菌に属するものとしては、例えば、ストレプトコッカス属、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属、（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバチルス属、バクテリオネマ属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｎｅｍａ）、アラクニア属（Ａｒａｃｈｎｉａ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物が含まれる。例えば、ストレプトコッカス属に属する微生物として、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリナスをあげることができる。これらは、う蝕原因菌として知られている。
【００３１】
一方、口腔内微生物のうち、グラム陰性菌に属するものとしては、例えば、ナイセリア属、ブランハメラ属（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スピロヘータ属、およびセレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）に属する微生物が含まれる。
【００３２】
本明細書でいう「ナイシン」とは、特に示した場合を除き、ナイシンＡおよびナイシンＺをその範囲に含む。ナイシンＡとナイシンＺの構造は類似している。ナイシンＡでは、そのポリペプチド鎖のＮ末端から２７番目のアミノ酸がヒスチジンであるが、ナイシンＺではアスパラギンであるという点でのみ異なる。組成物中のナイシン活性は、微生物に対する殺菌活性を示す限り、限定されないが、例えば、２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。
【００３３】
本発明の組成物は、特定のｐＨ範囲での使用に特に適している。すなわち、当該組成物を特定のｐＨ範囲で微生物と接触させた場合、当該微生物に対して高い殺菌活性を示す。ここで、殺菌活性とは、上記ＭＢＣ法またはＭＢＣ変法による殺菌率で表現することができる。高い殺菌活性とは、例えば、殺菌率が好ましくは、９０〜１００％、より好ましくは９９〜１００％、さらに好ましくは９９．９〜１００％である。上記特定のｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５とすることができる。一態様として、本発明の組成物をｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ４．５〜６．５で微生物と接触させた場合、当該微生物に対して高い殺菌活性を示すことができる。
【００３４】
また、本発明の組成物は、微生物と接触させる際のｐＨを変動させることによって、特定の微生物群、例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に対する殺菌活性を高めることができる。一態様として、本発明の組成物とグラム陽性菌を、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくは５．０〜７．５、本発明の組成物とグラム陰性菌を、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくは４．５〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５で接触させることができる。
【００３５】
限定されないが、個別の微生物に対するナイシンの接触ｐＨの一例を以下に示す：
スタフィロコッカス・オーレウスに対しては、ｐＨ４．５〜１０．５、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０；
ストレプトコッカス・ミュータンスに対しては、ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．５〜６．５、より好ましくはｐＨ４．５〜６．０（ナイシンＡの場合、ｐＨ４．５〜５．５としてもよく、ナイシンＺの場合、ｐＨ５．０〜６．０としてもよい。）；
エッシェリヒア・コリに対しては、ｐＨ４．５〜７．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．６、より好ましくはｐＨ６．０〜６．５；
プロピオニバクテリウム・アクネスに対しては、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．０。
【００３６】
本発明は、微生物の殺菌方法にも適用することもできる。ここで、当該殺菌方法において、「ｐＨ４．０〜１０．５において」という場合は、ナイシンと微生物が接触している際のｐＨを意味する。当該ｐＨは、微生物と接触させる前のナイシンを含有する組成物自体のｐＨと同じであってもよいし、異なっていてもよいことを意味する。すなわち、ｐＨが２．０〜４．０に調整された本発明の組成物を、微生物と接触させる前または接触させた後に、接触時のｐＨが４．０〜１０．５になるように組成物のｐＨを調整しておくことができる。ｐＨの調整は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ剤などにより行うことができる。
【００３７】
本発明の殺菌方法において、ナイシンと微生物を特定の割合で接触させることができる。例えば、ナイシン１ＩＵあたりの微生物数を１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕとすることができる。
【００３８】
ナイシンと微生物の接触時間は、ナイシンが殺菌活性を発揮するために必要な時間であればよく、例えば、上記ＭＢＣ法またはＭＢＣ変法によって算出される殺菌率に基づいて設定することができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒に設定することができる。即効性が要求されない用途では、特に接触時間を設定しなくてもよいが、例えば、３分〜２４時間、好ましくは１〜１２時間に設定してもよい。また、抗菌作用の持続性が要求される用途では、ナイシンを交換または追加することにより、微生物に継続的に作用させてもよい。
【００３９】
ここで、ｃｆｕとは、コロニー形成ユニット（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を意味し、寒天培地上で形成されたコロニー数と希釈倍数に基づいて算出する。
本発明の殺菌方法においては、さらに、グラム陽性菌およびグラム陰性菌それぞれの殺菌に適した条件を段階的に適用することができる。例えば、微生物をグラム陽性菌の殺菌に適した条件で本発明の組成物と接触させた後、さらにグラム陰性菌の殺菌に適した条件で本発明の組成物と接触させる。この方法により、微生物の殺菌率をさらに高めることができる。なお、この２つの処理の順序を入れ替えても同様の効果が得られることは容易に理解できる。
【００４０】
本発明の殺菌方法は、ナイシンと微生物を接触させる工程に加えて、界面活性剤で処理する工程を含んでもよい。当該工程は、例えば、ナイシンと微生物を接触させる工程の前、後、または同時に行うことができる。
【００４１】
本発明の殺菌方法はまた、ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｇで含有するｐＨ４．０〜８．０に調整された組成物を、皮膚に塗布する工程含む、皮膚の殺菌方法とすることができる。
【００４２】
本発明の殺菌方法はまた、ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含有するｐＨ４．０〜７．０に調整された液で、殺菌上有効な時間、口腔内をすすがせる工程を含む、口腔内の殺菌方法とすることができる。
【００４３】
本発明により、ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ナイシンＡのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性。棒グラフはｃｆｕを表し、折れ線グラフはｐＨを表す。
【図２】ナイシンＡのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性における、ｐＨの影響。●：ナイシン活性２ＩＵ／ｍＬ；○：ナイシン活性１０ＩＵ／ｍＬ；▲：ナイシン活性５０ＩＵ／ｍＬ；□：ナイシン活性１００ＩＵ／ｍＬ。
【図３】ナイシンＡとナイシンＺのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する殺菌活性における、ｐＨの影響。●：ナイシンＡ ５０ＩＵ／ｍＬ；□：ナイシンＺ ５０ＩＵ／ｍＬ。
【図４】ナイシンＡのスタフィロコッカス・オーレウスＩＦＯ１３２７６に対する殺菌活性における、ｐＨの影響。△：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；▲：ナイシンＡ ５００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；■：ナイシンＡ ４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；○：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；●：ナイシンＡ ５００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；□：ナイシンＡ ４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分。
【図５】ナイシンＡのエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２に対する殺菌活性における、ｐＨの影響。△：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；▲：ナイシンＡ ５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；■：ナイシンＡ ２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間３０秒；○：ナイシンＡ ０ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；●：ナイシンＡ ５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分；□：ナイシンＡ ２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触時間６０分。
【図６】ナイシンＡのスタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５に対する殺菌活性における、ナイシン濃度の影響。□：接触ｐＨ未調整、接触時間３０秒；▲：接触ｐＨ未調整、接触時間６０分；●：接触ｐＨ５．０、接触時間３０秒；■：接触ｐＨ５．０、接触時間６０分。
【図７】ナイシンＡのエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２に対する殺菌活性における、ナイシン濃度の影響。■：接触ｐＨ未調整、接触時間３０秒；□：接触ｐＨ未調整、接触時間１５分；▲：接触ｐＨ５．０、接触時間３０秒；●：接触ｐＨ５．０、接触時間１５分。
【図８】ナイシンＡとスタフィロコッカス・オーレウスの接触時間の検討。●：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；■：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；▲：ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；○：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；□：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；△：ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整。
【図９】ナイシンＡとエッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２の接触時間の検討。●：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；■：ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；▲：ナイシン活性２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ５．０；○：ナイシン活性０ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；□：ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整；△：ナイシン活性２０，０００ＩＵ／ｍＬ、接触ｐＨ未調整。
【図１０】ナイシンＡを含有するマウスウォッシュのストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋに対する殺菌活性。白抜きの棒グラフ：コントロール；斜線模様の棒グラフ：ｐＨ３．０に調整したマウスウォッシュによる処理；黒塗りの棒グラフ：ｐＨ５．０に調整したマウスウォッシュによる処理。ＳＭ−Ｘｃ：ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ＳＭ−ＪＣＭ：ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７；ＳＢ−ＡＨＴ：ストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋ。
【図１１】ナイシンＡと標的細胞（プロピオニバクテリウム・アクネス）の反応におけるｐＨおよびナイシン活性の影響。○：ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍL；□：ナイシン活性５００ＩＵ／ｍL。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、微生物に対して殺菌活性を示す、ナイシンを含む微生物の殺菌用の組成物を提供する。ナイシンとは、バクテリオシンの一種であって、ランチオニンを含む３４アミノ酸残基からなる低分子タンパク質である。本発明におけるナイシンとは、例えば、ナイシンＡおよびナイシンＺを含む。ナイシンは、乳酸菌を公知の方法により培養し、精製することによって得ることができる。例えば、乳酸菌をエムアールエス培地（ＭＲＳ培地、Ｏｘｏｉｄ社製）で培養後、培養上清をアンバーライトＸＡＤ−１６（シグマ社製）で処理してナイシンを吸着させる。アンバーライトを蒸留水および４０％エタノールで洗浄後、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む７０％イソプロパノールでナイシンを溶出させ、溶出画分を陽イオン交換カラム（ＳＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に供することによって、ナイシンの精製品を得ることができる。必要な場合、逆相クロマトグラフィーに供することによって、さらに精製度を高めてもよい（Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.,６７(７),ｐ１６１６−１６１９，２００３を参照）。また、市販品、例えば、ナイサプリン（Ｎｉｓａｐｌｉｎ、商標、ダニスコ株式会社製）を購入してもよい。ナイサプリンは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）由来のナイシンと塩化ナトリウムとの混合物であり、無脂肪乳または糖培地由来の成分を含む。必要な場合、上記精製方法により精製度を高めてもよい。
【００４６】
組成物中のナイシン活性は、微生物に対する殺菌活性を示す限り限定されないが、例えば２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。ナイシンの活性は、特開２００２−３６９６７２に記載されている方法にしたがって、ナイシン（１μｇ＝４０ＩＵ、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ製）を標準品として、ＨＰＬＣのピーク面積の比較によって算出することができる。ＨＰＬＣの条件を以下に示す：
ＨＰＬＣ： 日立ＥＺ Ｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ ＨＰＬＣ Ｌ−２０００；
カラム： Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ６Ｅ；
ガードカラム： Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０Ｇ ６Ａ；
カラム温度： ２５℃；
溶離液： ０.０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル；
流速： １.０ ｍＬ/ｍｉｎ。
【００４７】
本明細書においてナイシンの殺菌活性を表すときは、特に示した場合を除き、上記のＭＢＣ法またはＭＢＣ変法で算出した値である。また、ナイシンの量または活性は、最小阻止円濃度検定法によっても測定することができる。
【００４８】
本発明における組成物には、ナイシン以外の成分を配合してもよい。例えば、界面活性剤（乳化剤、分散剤（再付着防止剤））、湿潤剤、着香剤、芳香剤、研磨剤、潤滑剤、キレート剤、溶剤、保湿剤、殺菌剤（抗菌剤）、安定化剤、洗浄用酵素、粘度調整剤、防腐剤、防黴剤、着色料、香料などを配合してもよい。
【００４９】
界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤：例えば、ポリエトキシル化ソルビトールエステル、酸化エチレンと酸化プロピレンとのポリ縮合物（ポロキサマー）、プロピレングリコール縮合物、ポリエトキシル化水素添加ヒマシ油、ソルビタン脂肪族エステル；両性界面活性剤：例えば、長鎖イミダゾリン誘導体、長鎖アルキルベタイン、長鎖アルキルアミドアルキルベタイン；カチオン界面活性剤：例えば、Ｎ−ココイル−Ｌ−アルギン酸エチルのＤ,Ｌ−２−ピロリドン−５−カルボン酸塩、コカミドプロピルＰＧジモニウムクロライドホスフェート、ラウラミドプロピルＰＧジモニウムクロライドホスフェート；があげられる。
【００５０】
界面活性剤を配合する場合、有効成分の殺菌効力を低下させないものがよい。また、医療または食品衛生上許容されるものが好ましく、例えば食品添加物として許可されている界面活性剤をあげることができる。具体的には、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリンエステル（ジグリセリンモノカプレート、ジグリセリンモノラウレート、ジグリセリンモノステアレート、ジグリセリンモノオレート、デカグリセリンモノラウレート、デカグリセリンモノステアレート、ヘキサグリセリン縮合リシノレート）、有機酸モノグリセライド（酢酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、ジアセチル酒石酸モノグリセライド、コハク酸モノグリセライド）、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン（レシチン、酵素分解レシチン）、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ベヘニン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖混合脂肪酸（オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸）エステルなどである。
【００５１】
界面活性剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、１〜５０重量％、好ましくは、１〜３０重量％、より好ましくは、５〜２５重量％である。
【００５２】
キレート剤としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、クエン酸水素二ナトリウムなどがあげられる。キレート剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜５重量％、より好ましくは、０．５〜２重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５３】
湿潤剤としては、例えば、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールがあげられる。湿潤剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．５〜５０重量％、好ましくは、１〜１０重量％、より好ましくは、２〜５重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５４】
研磨剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、アルミナ、水素化アルミナ、オルトリン酸亜鉛、プラスチック粒子、シリカがあげられる。研磨剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．１〜７０重量％、好ましくは、１０〜５０重量％、より好ましくは、２０〜５０重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５５】
殺菌剤としては、カチオン抗微生物剤：第４級アンモニウム化合物、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩ベンゼトニウム、塩化メチルベンゼトニウム；抗微生物剤：クロルヘキシジン、アレキシジン、クロルヘキシジン・二グルコン酸塩、クロルヘキシジン・酢酸塩、塩化セチルピリジニウム、ヘキセチジン・クエン酸塩、トリクロサン、サリチル酸フェニル、グラミジシン、チロスリシン、塩化セチルピリジニウム；抗真菌剤：ミコナゾール、トリコナゾール；などがあげられる。殺菌剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、１〜１５重量％、好ましくは、５〜１５重量％、より好ましくは、５〜１０重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５６】
粘度調整剤としては、例えば、増粘剤：メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースがあげられる。粘度調整剤の配合量は、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば、本発明の組成物が液状または半固形状組成物である場合、０．０５〜５重量％、好ましくは、０．１〜２重量％、より好ましくは、０．５〜２重量％で本発明の組成物に配合してもよい。
【００５７】
本発明の組成物は、微生物の殺菌が必要な、あらゆる用途に使用することができる。例えば、家庭用・業務用の厨房、調理器具、食品加工工場、食品素材製造工場、家屋、ホテル、レストランなどの室内、家具備品、床などに存在する微生物の殺菌に使用できる。
【００５８】
別の例として、医療施設、例えば、病室、医療機器などの殺菌に使用できる。具体的には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター、クロストリジウム・ディフィシルなどの抗生物質耐性菌の殺菌に使用することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、皮膚の殺菌用に使用することができる。当該用途に用いる組成物は、ナイシンに加えて、例えば、界面活性剤、乳化剤、油性成分、保湿剤、抗炎症剤、収斂剤、溶剤、エタノール、皮膚軟化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、キレート剤、色剤、香料、紫外線吸収剤、緩衝剤、保存料等を配合することができる。
【００６０】
本発明の組成物をニキビの予防・治療用に使用する場合、種々の形態、例えば洗顔料、化粧水、乳液、美容液とすることができる。その一態様として、ニキビの予防・治療用の化粧水は、次のように調製することができる。精製水に精製ナイシン（１，０００IＵ／ｍＬ）、グリセリン（３．０重量％）、１，３−ブチレングリコール（１．０重量％）を溶解する。さらにパラオキシ安息香酸メチル（０．０５重量％）を溶解したエタノール（５．０重量％）を添加し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で目的のｐＨ、例えばｐＨ５．５に調整する。塩酸または水酸化ナトリウムによるｐＨ調整の代わりに、緩衝剤、例えばクエン酸およびクエン酸ナトリウムを化粧水が目的のｐＨとなるように予め精製水に添加してもよい。さらに別の態様としては、ナイシンを含有する酸性溶液と他の成分を含有するアルカリ性溶液を予め調製し、使用時に両者を混合することにより目的のｐＨを有する化粧水を調製してもよい。
【００６１】
さらに、本発明の組成物は、口腔内微生物の殺菌用に使用することができる。当該用途に用いる組成物は、ナイシンに加えて、例えば、抗菌剤、酵素、抗炎症剤、フッ化物、研磨剤、湿潤剤、発泡剤、増結剤、香味剤（甘味剤、香料、フレーバー）、着色剤、保存料を配合することができる。その一態様として：精製ナイシンを滅菌精製水で希釈し、ナイシン活性を１０，０００ＩＵ／ｍＬに調製した溶液に、ソルビトールまたはキシリトール（５重量％）およびローズマリーエキス（０．１重量％）を配合し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）でｐＨ３〜５に調整する。
【００６２】
本発明の組成物は、特定のｐＨ範囲で、微生物に対する優れた殺菌活性を示す。特定のｐＨ範囲としては、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５である。このｐＨ範囲において、本発明の組成物を微生物に接触させると、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を殺菌することができる。
【００６３】
本発明の別の側面として、本発明の殺菌用組成物を、グラム陽性を殺菌するためにより適したｐＨ範囲において、微生物と接触させることができる。グラム陽性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．５〜８．０、より好ましくはｐＨ５．０〜７．５である。このようなｐＨ範囲で本発明の組成物と微生物を接触させれば、グラム陽性菌に対する殺菌活性をより高めることができる。
【００６４】
本発明の別の側面として、本発明の殺菌用組成物を、グラム陰性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲において、微生物と接触させることができる。グラム陰性菌を殺菌するためにより適したｐＨ範囲とは、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ４．５〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５を含む。このようなｐＨ範囲で本発明の組成物と微生物を接触させれば、グラム陰性菌に対する殺菌活性をより高めることができる。
【００６５】
本発明において、ｐＨの測定は、例えば、ｐＨメーター（堀場製作所Ｆ−５２、電極型式９６１１−１０Ｄ、測定温度２５℃）を用いて行うことができる。また、ｐＨ調整剤としては、例えば、酸性側のｐＨ調整剤として、塩酸、リンゴ酸やクエン酸などの有機酸、アルカリ側のｐＨ調整剤として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを使用することができる。ｐＨ調整剤の濃度は、例えば、０．００１〜１Ｎ、好ましくは０．０１〜０．５Ｎ、さらに好ましくは０．１〜０．２Ｎとすることができる。
【００６６】
上記グラム陽性菌としては、例えば、ストレプトコッカス属の微生物：ストレプトコッカス・ミュータンス、およびストレプトコッカス・ソブリナス、スタフィロコッカス属の微生物：スタフィロコッカス・オーレウス、そしてプロピオニバクテリウム属の微生物：プロピオニバクテリウム・アクネスがあげられる。この中で、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリナスは、う蝕原因菌として知られ、そしてスタフィロコッカス・オーレウスは、黄色ブドウ球菌として知られている。プロピオニバクテリウム・アクネスは、ヒトや動物の皮膚などに存在する菌であり、皮膚疾患、例えばニキビの起因菌として知られている。
【００６７】
上記グラム陰性菌としては、例えば、エッシェリヒア属：エッシェリヒア・コリがあげられる。エッシェリヒア・コリは、様々な環境において広く存在する菌であり、その中には毒性の強いものも存在する。
【００６８】
以上のことから、本発明の組成物は、微生物の殺菌が必要な、あらゆる対象に使用することができる。例えば、ヒトを含む動物の身体の一部（口腔、歯および歯周、皮膚、鼻腔、手指、顔、足等）、器具・機械（医療器具、調理器具、衛生器具、介護用品、ベビー用品、おもちゃ、食品製造機、医療機器、食卓、机、椅子、家具備品等）、場所（家庭用・業務用の厨房、食品加工工場、食品素材製造工場、家屋、ホテル、レストランなどの室内、医療施設、病室、床、作業台、等）を微生物学的に清浄にするために使用することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、微生物の殺菌方法において使用することができる。例えば、特定のｐＨ範囲において、ナイシンと微生物を一定の割合で所定時間接触させることを含む、微生物の殺菌方法に使用できる。特定のｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくはｐＨ４．０〜７．０、より好ましくはｐＨ５．０〜６．５とすることができる。個別の微生物に対するｐＨ範囲は、上記に記載の通りである。ナイシンと微生物の接触は、例えば、ナイシン１ＩＵあたり微生物１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕの割合で接触させることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７０】
別の側面において、本発明の組成物はまた、第１段階：グラム陽性菌の殺菌に適したｐＨ範囲でナイシンと微生物を一定の割合で所定時間接触させた後、第２段階：グラム陰性菌の殺菌に適したｐＨ範囲でナイシンと微生物を所定時間接触させることによる微生物の殺菌方法に使用することができる。
【００７１】
前記第１段階において、ナイシンと微生物の割合は、例えば、ナイシン１ＩＵあたりグラム陽性菌を１０〜１０，０００ｃｆｕ、好ましくは１０〜５，０００ｃｆｕ、より好ましくは１０〜１，０００ｃｆｕで接触させることができる。ｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜１０．５、好ましくは４．５〜８．０、より好ましくは５．０〜７．５とすることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７２】
前記第２段階において、ｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜８．０、好ましくは４．５〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５とすることができる。接触時間は、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１０〜６０秒、より好ましくは２０〜３０秒とすることができる。
【００７３】
このように、グラム陽性菌の殺菌に適した第１段階に係る方法、およびグラム陰性菌の殺菌に適した第２段階に係る方法を組み合わせることにより、微生物をさらに効率的に殺菌することができる。第１段階と第２段階の順序を入れ替えても、同様の効果を得ることができる。
【００７４】
本発明の組成物は、あらかじめ殺菌に適した成分濃度およびｐＨ範囲に調整しておくことができる。さらに、運搬保管等の取り扱いまたは保存安定性の観点から都合がよいと考えられる場合は、使用時に殺菌に適した成分濃度およびｐＨ範囲に調整してもよい。後者の形態の例としては、キットがあげられる。当該キットは、各成分が独立して存在していてもよいし、混合状態で存在してもよいし、粉末、固体、液体など任意の形態にすることができる。例えば、保存上有効な形態で各成分を独立してまたは組み合わせて含む一または複数のプレミックス、溶剤等を含んでもよい。プレミックスとは、用途に則した各成分が特定の量または配合比であらかじめ調合されており、使用時に適切な溶媒で溶解、希釈、および／または混合して用いるための組成物を意味する。
【００７５】
本発明の別の側面は、ｐＨが２．０〜５．０、より好ましくはｐＨが３．０〜４．０である組成物が提供される。ナイシンは酸性ｐＨにおいて安定かつ溶解度が高いことが知られている。このため、未使用時にはこのｐＨ範囲で保存し、使用直前に微生物の殺菌に適したｐＨに調整することがナイシンの保存安定性の観点から好ましいといえる。したがって、ｐＨ２．０〜５．０に調整された組成物は、微生物の殺菌用組成物のプレミックスとして使用することができる。別の態様として、ナイシンを高濃度で含む組成物をプレミックスとし、使用時にこれを希釈した場合、殺菌に適したｐＨに調整された希釈液が得られるようにすることも可能である。このよう使用態様は、利用の簡便性の観点から、実用的な使用において好ましい。
【００７６】
以下の実施例において、本発明の具体例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
［実施例１］ ナイシンＡによる殺菌活性の検討
（１−１）試験液の調製
精製ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシン水溶液（２，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、該水溶液のｐＨを０．１Ｎ塩酸でｐＨ３．４に調整した。該水溶液を滅菌精製水で２倍ずつ５段階希釈し、以下の表に示すナイシン活性を有する試験液を調製した。併せて、該希釈液のｐＨを測定した（表１）。
【００７８】
【表１】
【００７９】
（１−２）殺菌活性試験
う蝕原因菌ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃをＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養した。培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整した（１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、上記各試験液１〜６（５ｍＬ）に添加した。室温で３０秒間接触させた後、該液（１００μＬ）をＳＣＤブイヨン培地（５ｍＬ）に添加・混合し、直ちに該混合液（１００μＬ）をＳＣＤ寒天培地（日水製薬株式会社製）上にプレーティングして、３７℃で培養した。４８時間培養後の生菌数を計測し（図１）、以下の式に基づいて殺菌率（％）を算出した。
【００８０】
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
（１−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する各試験液の殺菌率は、試験液３（ナイシン活性５００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ４．７）で９９．６％であった（図１）。試験液３よりナイシン活性が高い試験液１（ナイシン活性２，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．４）および試験液２（ナイシン活性１，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．８）の殺菌率は、それぞれ２０％および４３％であった。一方、試験液３よりナイシン活性が低い試験液４（２５０ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）、試験液５（１２５ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）および試験液６（６３ＩＵ／ｍＬ、≧ｐＨ６．９）は、殺菌活性をほとんど示さなかった。
【００８１】
この結果から、ナイシンＡの殺菌活性はｐＨの影響を受けることが示された。このことは、ナイシンの殺菌活性は、ｐＨによって調節、例えば増強、できることを示唆する。
［実施例２］ ナイシンの殺菌活性におけるｐＨの影響
（２−１）試験液の調製
精製ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシンＡ水溶液（活性４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、該水溶液のｐＨを塩酸（０．１Ｎ）でｐＨ３．５に調整した。該水溶液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整し（１００、５０、１０、２ＩＵ／ｍＬ）、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で各希釈液のｐＨを調整し（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）、これを試験液とした。
【００８２】
（２−２）殺菌活性試験
上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った（図２）。
（２−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対するナイシンの活性のｐＨ依存性は、ナイシンＡを５０ＩＵ／ｍＬ含む試験液で最も顕著であった。また、殺菌活性はｐＨ５．０で最大を示した。さらに、ナイシン活性が５０ＩＵ／ｍＬ以上であれば、ｐＨ４．５〜７．０の範囲において十分な殺菌活性を発揮することが示された。
【００８３】
［実施例３］ ナイシンＡまたはナイシンＺの殺菌活性におけるｐＨの影響
（３−１）試験液の調製
上記実施例２（２−１）にしたがって、ナイシンＡおよびナイシンＺ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｉｃｅｃｈｅｍ社製）、の水溶液（４，０００ＩＵ／ｍＬ、ｐＨ３．５）を調製した。該水溶液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整（５０ＩＵ／ｍＬ）し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で希釈液のｐＨを調整し（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）、これを試験液とした。
【００８４】
（３−２）殺菌活性試験
上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
（３−３）結果
結果を図３に示す。ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対するナイシンＡの殺菌活性は、ｐＨ５．０付近で最大になることが示唆された。一方、ナイシンＺの殺菌活性は、ｐＨ５．５付近で最大になることが示された。これらの結果から、ナイシンＡとナイシンＺは、共に至適ｐＨでストレプトコッカス・ミュータンスＸｃに対する高い殺菌活性を有することが示された。
【００８５】
［実施例４］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるｐＨの影響
（４−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨが２．８〜１０．５に調整された、ナイシン水溶液（ナイシン活性０、５００、４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製した。前記ｐＨの調整は、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００８６】
（４−２）殺菌活性試験
スタフィロコッカス・オーレウスＩＦＯ１３２７６をＳＣＤブイヨン培地（日水製薬株式会社製）中、３７℃で２４時間培養した。培養液を滅菌精製水で希釈し、菌数を調整した（１０７ｃｆｕ／ｍＬ）。該希釈した培養液（１００μＬ）を、上記試験液（１０ｍＬ）に添加した。室温で３０秒または６０分間接触させた後、該液（１００μＬ）を、不活性化剤としてポリソルベート８０を含むＳＣＤＬＰ培地（１０ｍＬ）に添加・混合し、該混合液の希釈系列を作成し、これをＳＣＤ寒天培地（日水製薬株式会社製）と混釈し、３７℃で培養した。４８時間培養後の生菌数を計測し、以下の式に基づいて殺菌率（％）を算出した。
【００８７】
殺菌率（％）＝［１−（試験液中での生残菌数／供試菌数）］×１００
（４−３）結果
ナイシンＡは、黄色ブドウ球菌スタフィロコッカス・オーレウスに対しても殺菌活性を示した（図４）。試験液は、少なくとも６０分の接触時間で十分な殺菌効果を示した。更に、６０分の接触時間において、ナイシン活性５００ＩＵ／ｍＬの試験液ではｐＨ５．５以上、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬの試験液ではｐＨ５．０以上、のｐＨで高い殺菌活性を示した。このｐＨより低いｐＨでは、殺菌活性は著しく低下した。一方、接触時間３０秒において、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬの試験液は、ｐＨ７．５付近で最大の殺菌活性を示し、ｐＨ６．０〜１０．５で抗菌活性が認められた。このｐＨ範囲を外れると、殺菌活性は著しく低下した。
【００８８】
上記の結果から、ナイシンが安定である酸性領域よりｐＨを高くすることにより、ナイシンの殺菌活性を向上できることが明らかになった。
［実施例５］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるｐＨの影響
（５−１）試験液の調製
試験液の調製は、上記実施例４（４−１）に記載の方法に従った。
【００８９】
（５−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用した以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９０】
（５−３）結果
ナイシンＡは、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリに対しても殺菌効果を示した（図５）。ｐＨ５．１〜６．６の範囲を外れると、殺菌活性は急激に低下した。一方、ナイシンが安定である酸性領域の試験液では、殺菌活性はほとんど確認できなかった。
【００９１】
ナイシンはグラム陰性菌に対しては作用しないという従来の知見を鑑みれば、この効果は全くの予想外であった。
［実施例６］ ナイシンのグラム陽性微生物に対する殺菌活性におけるナイシン活性の影響
（６−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、１０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００、４，０００、５，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９２】
（６−２）殺菌活性試験
試験菌として、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５を使用した以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９３】
（６−３）結果
殺菌活性は、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５とナイシンの接触ｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図６）。少なくとも、ナイシン２，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間６０分の条件において、９０％以上の殺菌率を達成できた。一方、ナイシン（２，０００ＩＵ／ｍＬ以上）が存在していても、ｐＨ未調整（ｐＨ２．８〜３．１）の試験液では、殺菌活性をほとんど確認できなかった。
【００９４】
［実施例７］ ナイシンのグラム陰性微生物に対する殺菌活性におけるナイシン活性の影響
（７−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、５００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９５】
（７−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用し、接触時間を３０秒または１５分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９６】
（７−３）結果
殺菌活性は、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２とナイシンの接触時のｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図７）。少なくとも、ナイシン活性１０，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間３０秒以上の条件で９０％以上の殺菌率が達成された。一方、ナイシン（１０，０００ＩＵ／ｍＬ以上）が存在していても、ｐＨ未調整（ｐＨ２．６〜２．８）の試験液では、殺菌活性をほとんど確認できなかった。
【００９７】
［実施例８］ ナイシンとグラム陽性微生物の接触時間の検討
（８−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整（ｐＨ２．６〜３．０）またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性０、１，０００、４，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【００９８】
（８−２）殺菌活性試験
試験菌として、スタフィロコッカス・オーレウスＡＴＣＣ３１８８５を使用し、接触時間を０．５、１、２、５、１０、１５、３０、６０分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【００９９】
（８−３）結果
殺菌活性は、スタフィロコッカス・オーレウスとナイシンとの接触時のｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図８）。少なくとも、ナイシン活性４，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間３０分以上の条件で、９０％以上の殺菌率が達成された。
【０１００】
［実施例９］ ナイシンとグラム陰性微生物の接触時間の検討
（９−１）試験液の調製
ナイシンＡを滅菌精製水で溶解して、ｐＨ未調整（ｐＨ３．０〜３．２）またはｐＨ５．０に調整されたナイシン水溶液（ナイシン活性：０、５，０００、２０，０００ＩＵ／ｍＬ）を調製し、これを試験液とした。前記ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）で行った。
【０１０１】
（９−２）殺菌活性試験
試験菌として、エッシェリヒア・コリＮＢＲＣ３９７２を使用し、接触時間を０．５、１、５、１０、１５、３０、６０分とした以外は、上記実施例４（４−２）で示した方法にしたがって試験を行った。
【０１０２】
（９−３）結果
殺菌活性は、エッシェリヒア・コリとナイシンとの接触ｐＨを５．０に調整した場合にのみ認められた（図９）。少なくとも、ナイシン活性５，０００ＩＵ／ｍＬ以上、接触時間０．５分以上の条件で、９０％以上の殺菌率が達成された。
【０１０３】
［実施例１０］ ナイシン含有マウスウォッシュ
（１０−１）ナイシン含有マウスウォッシュの調製
精製ナイシン（オーム乳業株式会社製）を滅菌精製水で溶解してナイシン水溶液を調製（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）した。該ナイシン水溶液にソルビトール（５重量％、花王株式会社製）およびローズマリーエキス（０．１重量％、香栄工業株式会社製）を配合し、塩酸（０．１Ｎ）でｐＨを３．５に調整し、マウスウォッシュの原液を調製した。
【０１０４】
上記原液を滅菌精製水で希釈してナイシン活性を調整（５００ＩＵ／ｍＬ）し、塩酸（０．１Ｎ）または水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）でｐＨを３．０または５．０に調整した。前記ｐＨ３．０に調整された組成物を対照のマウスウォッシュ、そして、前記ｐＨ５．０に調整された組成物を本発明のマウスウォッシュとして、以下の試験に供した。
【０１０５】
（１０−２）殺菌活性試験
試験菌として３種類のう蝕原因菌：ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋを使用した以外は、上記実施例１（１−２）で示した方法にしたがって試験を行った（図１０）。
【０１０６】
（１０−３）結果
ストレプトコッカス・ミュータンスＸｃ、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣＭ５７０７およびストレプトコッカス・ソブリナスＡＨＴ−Ｋに対する殺菌率は、ｐＨ３．０の対照のマウスウォッシュによる処理では、それぞれ２９％、６３％、２４％であった。一方、ｐＨ５．０の本発明のマウスウォッシュによる処理では、それぞれ１００％、９９．８％、９８．９％と極めて優れた殺菌効果が示された。
【０１０７】
今回の結果から、本発明の組成物は、う蝕予防用のマウスウォッシュに適していることが明らかになった。
［実施例１１］ナイシンと標的細胞の反応におけるｐＨおよびナイシン活性の影響
（１１−１）供試菌液およびナイシン溶液の調製
供試菌液を以下の手順で調製した。プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ６９１９を、強化クロストリジア培地（OXOID社製）で前培養し、当該培養液（１０μＬ）を強化クロストリジア培地（１０ｍＬ）に接種し、３７℃で４日間、嫌気的環境下で旋回培養（１６０ｒｐｍ）を行った。嫌気的環境は、アネロパック（三菱ガス化学株式会社製）を使用することによって調整した。この培養液を供試菌液として以下の抗菌活性試験に使用した。
【０１０８】
ナイシン溶液を以下の手順で調製した。ナイシンＡ（オーム乳業株式会社製）を、ｐＨ３．０〜８．０に調整したＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液に溶解し、菌体接触時のナイシン活性が１，０００、または５００（ＩＵ／ｍＬ）になるよう調製した。
【０１０９】
（１１−２）抗菌活性試験
ナイシン溶液（４５０μＬ）に供試菌液（５０μＬ）を添加することにより、ナイシンと供試菌を室温（２５℃）で接触させた。当該液を試験液とした。一方、ナイシンを含まない溶液（４５０μＬ）に供試菌液（５０μＬ）を添加したものを対照試験液とした。３分後、試験液および対照試験液の菌体外に存在するＡＴＰの量を、ＡＴＰとルシフェリンの反応に由来する相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。試験液および対照試験液を測定に用いる緩衝液で１００倍に希釈し、測定に使用した。ＡＴＰ測定用試薬キット（ルシフェール２５０、キッコーマン株式会社製）、およびルミテスターＣ−１００（キッコーマン株式会社製）を用い、製品に添付の使用説明書の記載にしたがって、相対発光量を測定した。試験液の相対発光量から対照試験液の相対発光量を差し引いた値を、微生物の菌体内から菌体外へ流出したＡＴＰの量とした（図１１）。
【０１１０】
（１１−３）結果
ナイシンは微生物の細胞膜（リピッドII）を標的として作用し、細胞膜に孔を形成し、殺菌的に作用する。ナイシンが形成する孔は、イオンのみならずＡＴＰも流出させる。標的細胞からのＡＴＰ流出量（菌体外ＡＴＰ濃度）をナイシンによる殺菌活性の指標として、ナイシンの殺菌活性におけるｐＨおよびナイシン活性（ナイシン作用濃度）の影響を評価した。
【０１１１】
アクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネス）からのＡＴＰ流出量は、ナイシンが安定な酸性域（ｐＨ３．０〜４．０付近）および弱アルカリ域（ｐＨ８．０付近）に比べ、ｐＨ５．０〜６．０で著しく増加しｐＨ６．０付近で最大値を示した。この結果からナイシンと標的細胞との反応（細胞膜の孔形成）がナイシン作用時のｐＨに著しく影響され、アクネ菌に対してはｐＨ５．０〜６．０で作用させることが効果的であることが明らかとなった。またＡＴＰ流出量は、ナイシン活性（ナイシン作用濃度）依存的に増加するが、増加の程度はｐＨ５．０〜６．０で顕著に高くなった。
【０１１２】
この結果から本発明の組成物は、ニキビ起因菌であるアクネ菌に対しても効果的に作用するため、ニキビ予防及び治療用としても有効であることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含む、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されている、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【請求項２】
ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、請求項１に記載の組成物、またはキット。
【請求項３】
ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨが５．０〜６．５に調整されている、グラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用であり、かつグラム陰性である微生物の少なくとも一種の殺菌用である、請求項２に記載の組成物、またはキット。
【請求項４】
グラム陽性菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、またはラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)、またはプロピオニバクテリウム・アクネス（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）から選択され、グラム陰性菌が、エッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)から選択される、請求項３に記載の組成物、またはキット。
【請求項５】
さらに界面活性剤を含む、請求項１に記載の組成物、またはキット。
【請求項６】
ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法。
【請求項１】
ナイシンを２〜５０，０００ＩＵ／ｍＬで含む、ｐＨ４．０〜１０．５に調整されている、グラム陰性またはグラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用の組成物、またはその調製のためのキット。
【請求項２】
ナイシンが、ナイシンＡまたはナイシンＺである、請求項１に記載の組成物、またはキット。
【請求項３】
ナイシンが、ナイシンＡであり、ｐＨが５．０〜６．５に調整されている、グラム陽性である微生物の少なくとも一種の殺菌用であり、かつグラム陰性である微生物の少なくとも一種の殺菌用である、請求項２に記載の組成物、またはキット。
【請求項４】
グラム陽性菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、またはラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)、またはプロピオニバクテリウム・アクネス（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）から選択され、グラム陰性菌が、エッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)から選択される、請求項３に記載の組成物、またはキット。
【請求項５】
さらに界面活性剤を含む、請求項１に記載の組成物、またはキット。
【請求項６】
ｐＨを５．０〜７．０に調整することを特徴とする、ナイシンの殺菌力の向上方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−１３５２（Ｐ２０１１−１３５２Ａ）
【公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４２５０（Ｐ２０１０−１１４２５０）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人 日本農芸化学会発行、日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会講演要旨集、平成２１年３月５日発行 平成２１年３月２９日開催、社団法人 日本農芸化学会主催、平成２１年度日本農芸化学会大会［福岡］において発表
【出願人】（５９３０８５８０８）ＡＤＥＫＡクリーンエイド株式会社 (25)
【出願人】（５０９１４０５５９）
【出願人】（５０２３４７９０６）
【出願人】（５０９１４０５６０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人 日本農芸化学会発行、日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会講演要旨集、平成２１年３月５日発行 平成２１年３月２９日開催、社団法人 日本農芸化学会主催、平成２１年度日本農芸化学会大会［福岡］において発表
【出願人】（５９３０８５８０８）ＡＤＥＫＡクリーンエイド株式会社 (25)
【出願人】（５０９１４０５５９）
【出願人】（５０２３４７９０６）
【出願人】（５０９１４０５６０）
【Ｆターム（参考）】
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