ナノポアを用いたバイオポリマー決定方法、システム、及びキット
【課題】ナノポアを用いたバイオポリマーの計測方法は，非常に高速，安価分析であるが，バイオポリマーを構成するモノポリマ一つずつを判別する精度が低かった。
【解決手段】バイオポリマーのナノポアを介した両端にナノポアよりも大きな分子を結合し，外力によって前記バイオポリマーを往復運動させ，繰返し計測を行う。
【解決手段】バイオポリマーのナノポアを介した両端にナノポアよりも大きな分子を結合し，外力によって前記バイオポリマーを往復運動させ，繰返し計測を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ナノポア構造を用いた，ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はタンパク質等のバイオポリマーの高精度な計測，分析を行うための構造，方法に関する技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
病気の診断や創薬に対して，核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）やタンパク質等のバイオポリマーを分析することは重要である。特にＤＮＡは，生命の最も基本の構成体であるため，その分析，つまり塩基配列の決定は，上記目的に対して非常に重要となる。ＤＮＡの塩基配列を分析する主な方法としては，まず，化学もしくは酵素反応を利用して，配列決定したい鋳型ＤＮＡに対して，決まった末端塩基種をもつ様々な長さのＤＮＡ断片群を生成する。前記ＤＮＡ断片群を４種の塩基種に対してそれぞれ生成する。次いで，ゲル電気泳動を用いて，これらのＤＮＡ断片群を分子量の順に分離する。前記ＤＮＡ断片群を分離媒体に導入し電圧を印加する。ＤＮＡ断片は全体としてマイナスの電荷をもつ高分子電解質であるため，マイナスからプラスの方向に電気泳動する。ゲル中では長いＤＮＡ断片ほど小さな易動度を持つので，１塩基長の違いしか持たないＤＮＡ断片同士をも分離することができる。分離後に，ＤＮＡ断片の末端塩基種に応じた長さを計測することで，鋳型ＤＮＡにおける塩基種の位置が分かる。前記操作により鋳型ＤＮＡの塩基配列が決定される。上記方法において，ＤＮＡ断片群の生成や電気泳動の作業は，非常に煩雑で分析時間も長く，ランニングコストも高価である。
【０００３】
特許文献１および非特許文献１には，絶縁膜である脂質二重層の薄膜上にα−ヘモリジンを用いて形成した直径数ナノメートルの微細な開口，つまりナノポアを用いたバイオポリマーの分析方法が記載されている。２つの溶液槽の間にナノポアを設けた薄膜設置し，両溶液槽間で電圧勾配を設け，電流を計測する。バイオポリマーであるＤＮＡ分子を片方の溶液槽に設置すると，電圧勾配によりナノポアを通過し，別の溶液槽に移動する。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際に，ナノポア内のイオンの流れを塞ぐため，電流の減少（封鎖電流）が生じる。この封鎖電流の大きさとその封鎖電流の継続時間を計測することにより，ナノポアを通過する個々のＤＮＡ分子の長さを検出可能となる。また，理論的にはＤＮＡ分子を構成する個々の塩基の種類の判別も可能となる。
【０００４】
特許文献２および非特許文献２には，脂質二重層におけるα−ヘモリジンを用いたナノポアに代わり，絶縁膜であるシリコンナイトライド（Ｓｉ３Ｎ４）膜に”ｉｏｎ−ｂｅａｍ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ“と言う技術を用いてナノポアを作製し， 1本鎖ＤＮＡ分子の封鎖電流の計測を行っている。
【０００５】
非特許文献３では，ナノポアを通過するＤＮＡ分子の計測方法として，前述した封鎖電流とは異なる手段が提案されている。ナノポアの内表面に一対の金属電極を設け，この金属電極間をＤＮＡ鎖が通過する際のトンネル電流を計測する。この方法でも電極サイズなどが適切に制御されていれば，理論的には，ナノポアを通過するＤＮＡ分子を構成する個々の塩基の種類の判別も可能となる。
【０００６】
特許文献３では，既知配列プローブのターゲット１本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと，ナノポアを用いた前記既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出により，ターゲットＤＮＡの塩基配列を決定する方法が示されている。既知配列のプローブを決定したいターゲット１本鎖ＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションさせ，前記ハイブリダイゼーションしたＤＮＡ分子をナノポアに通過させる。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際にＤＮＡ分子の１本鎖部位と２本鎖部位で封鎖電流が異なるため，電流を計測することにより，既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置を特定できる。複数種の異なる配列を持つ既知配列プローブで前記操作を行い，それぞれのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーション位置データを取得し，得られたデータをコンピュータアルゴリズム使って配列データに変換することで，ターゲットＤＮＡ分子の配列決定が可能となる。
【０００７】
非特許文献４では，ＤＮＡ分子がナノポア通過直後に印加電圧の正負を逆転することにより，同一ＤＮＡ分子が再び同一のナノポアを通過する結果が示されている。
【０００８】
非特許文献５では，ナノポア上でＤＮＡ分子の伸長反応を行い，封鎖電流計測により伸長反応の有無を確認している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,795,782
【特許文献２】米国特許第6,627,076
【特許文献３】米国特許公報第2007/0190542
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】PNAS 1996, Vol.93, pp.13770-13773
【非特許文献２】NATURE 2001, Vol.412, pp.166-169
【非特許文献３】NANO LETTERS 2005, Vol.5, pp.421-424
【非特許文献４】nature nanotechnology 2007, Vol.2, pp.775-779
【非特許文献５】JACS 2008, Vol.130, pp.818-820
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
電気泳動を用いたバイオポリマー，特にＤＮＡ分子の配列決定は分析時間も長く，ランニングコストも高価である。一方，特許文献１や非特許文献３に記載されたナノポアを用いたＤＮＡ分子の配列決定は，高速・安価な分析の可能性を持つが，それぞれ以下の問題がある。
【００１２】
特許文献１では，ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時の各塩基種による封鎖電流の違いは僅かであるため，その判別をすることは困難であり，その精度は非常に低い。また，判別精度を向上するためには，ナノポア近傍の膜厚を１塩基分程度，つまりサブナノメートルにする必要があるが，現状の技術でその膜厚を達成するのは困難である。
【００１３】
非特許文献３において，ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時のトンネル電流の大きさは，ナノポアを通過する塩基の種類の他に，その塩基のトンネル電流を計測する電極近傍での配向にも依存する。現状，通過する核酸の配向制御が困難であるため，塩基種分離の精度を上げるためには，繰返し計測が必要となる。
【００１４】
一方，特許文献３で示される方法では，既知配列プローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションした位置を検出するため，塩基１種類ずつを判別する必要は無い。しかしながら，１塩基レベルでの高精度なハイブリダイゼーション位置の検出が必要になる。また，同一ターゲットＤＮＡ分子に対して，複数種の異なる既知配列プローブを，それぞれ異なる場もしくは異なるタイミングでターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションして，その位置を検出する必要がある。つまり，ターゲットＤＮＡ分子を増幅し，それらをそれぞれ異なる既知配列プローブが存在する異なる溶液に導入し，ターゲットＤＮＡ分子と既知配列プローブをハイブリダイゼーションさせて，それぞれ異なるナノポアもしくは異なるタイミングで同一ナノポアを用いて計測を行う必要がある。もしくは，ある既知配列プローブとハイブリダイゼーションしたターゲットＤＮＡ分子をナノポア計測した後に，抽出し，変性させて１本鎖に戻し，異なる既知配列プローブとハイブリさせて，再度ナノポア計測を行う事を繰返す必要がある。いずれの場合も，非常に煩雑な作業を要する。
【００１５】
非特許文献４で示されるように，ＤＮＡ分子がナノポアを通過した後に，逆電圧を印加することを繰返すことで，同一ＤＮＡ分子を複数回同一ナノポアで計測できる。そのため，繰返し計測による計測精度の向上を図れる可能性はあるが，高精度なフィードバックによる電圧印加が必要になる。また，複数種のＤＮＡ分子が混在していた場合には，コンタミの恐れもある。さらに，ＤＮＡ分子の方向もランダムとなる。
【００１６】
非特許文献５では，ターゲットＤＮＡ分子の５’末端にｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）−ビオチンを介したストレプトアビジンを結合させ，３’末端側には数塩基からなるＤＮＡプライマーをハイブリダイゼーションさせ，ターゲットＤＮＡ分子の３’末端を２本鎖にすることにより，ナノポアを介したターゲットＤＮＡ分子の往復運動を行っている。前記往復運動を用いた繰返し計測により，高精度なナノポア計測ができる可能性がある。しかしながら，ＤＮＡプローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションする位置をコントロールすることは難しく，ターゲットＤＮＡ分子の様々な位置にＤＮＡプローブが結合し，往復運動ができないことがある。また，２本鎖ＤＮＡの直径は２ｎｍ程度であるため，ナノポア直径が２ｎｍ以上では，２本鎖部分がナノポアを通過してしまい，前記往復運動が困難となる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は，核酸やタンパク質のようなバイオポリマー分子のナノポア計測において，計測精度向上のための繰返し計測を安定してできる方法，システム、及びキットを提供する。
【００１８】
第一の溶液槽と第二の溶液槽を具備しており，両溶液槽間は薄膜で区切られており，薄膜にはナノメートルサイズの穴，つまりナノポアが設けられている。バイオポリマー分子の片端にナノポアの開口直径よりも大きなサイズの分子（第一ストッパ分子）を結合し，それを第一の溶液槽に導入する。外力を加えてバイオポリマーを駆動させてナノポアを通過させ，第二の溶液槽に移動させる。第一ストッパ分子により，ナノポアを通過するバイオポリマー分子は途中で移動を停止する。バイオポリマー分子の移動停止後に，第二の溶液槽に存在するナノポアの開口直径よりも大きな分子（第二ストッパ分子）をバイオポリマー分子のもう一方の片端に結合させる。次いで，外力を加えてバイオポリマー分子を，両溶液槽間を往復運動させながら計測を行い，バイオポリマー分子の同定を行う。
【００１９】
第二ストッパ分子のバイオポリマー分子への結合は，バイオポリマー分子がナノポアを移動している間であっても良い。また，第二ストッパ分子をバイオポリマー分子に結合する際に，バイオポリマー分子を駆動させる外力を停止させても良いし，外力を与え続けても良い。第二ストッパ分子は，予め第二溶液槽に入れていても，バイオポリマー分子の片端が第二溶液槽に移動後に導入しても良い。両ストッパ分子は同じ分子であっても良いし，異なる分子であっても良い。バイオポリマーを駆動させる手段としては，バイオポリマー分子が電荷を持っているのであれば両溶液槽間に電圧勾配を生じさせても良いし，両溶液槽間でイオン組成を変えることによる電気化学的勾配を生じさせても良いし，溶液の流れを生じさて駆動させても良い。計測の手段としては，両溶液槽間を，ナノポアを介して流れる電流（封鎖電流）値であっても良いし，ナノポア内部に具備された電極間を流れる電流（トンネル電流）値であっても良い。また，バイオポリマー分子に蛍光体を標識し，ナノポア近傍で励起させ，その発光蛍光を検出しても良い。バイオポリマー分子の両端に両ストッパ分子が結合した状態で，バイオポリマー分子に，ある物質を結合させたり，分離させたりしても良い。例えば，非特許文献３のようにハイブリダイゼーションベースでのＤＮＡ分子配列決定の場合には，前記方法を用いて簡便かつ高精度に計測できる。ＤＮＡ分子の両端にストッパ分子を結合させ，溶液槽に既知配列プローブを導入し，それをターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションさせ，ターゲットＤＮＡ分子を，両溶液槽間を往復運動させてハイブリダイゼーションの位置を封鎖電流計測により検出する。次いで，変性操作により前記既知配列プローブをターゲットＤＮＡ分子から分離させ，別の既知配列プローブを用いて前記と同様の操作を繰返す。前記手段により，同一ターゲットＤＮＡ分子に対して異なる既知配列プローブを簡便に何回でもハイブリダイゼーションできる。また繰返し計測ができるため，ハイブリダイゼーションの位置を高精度に計測できる。
【００２０】
本発明のバイオポリマー決定方法は，第１の溶液槽と，第２の溶液槽と，前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切りナノポアを備えた薄膜とを有する装置を用い，測定対象のバイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する方法であって，前記ナノポアよりも大きな第１の分子を一端に結合した前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する工程と， 前記バイオポリマーを前記ナノポアを通して前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽に移動させる工程と，前記第２の溶液槽に，前記ナノポアよりも大きな第２の分子を導入し，前記バイオポリマーの他端に結合させる工程と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通して移動させる工程と，前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定することを特徴とする。
【００２１】
本発明のバイオポリマー決定システムは，ナノポアを有する薄膜を備えた装置を用い，前記ナノポアの大きさよりも大きく，測定対象のバイオポリマーに結合させる分子を導入するシステムであって，前記装置は，前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と，前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と，前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と，前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と，前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とする。
【００２２】
本発明のバイオポリマー決定キットは，ナノポアを有する薄膜を備えた装置と，前記ナノポアの大きさよりも大きく，測定対象のバイオポリマーに結合させる分子とを有するキットであって，前記装置は，前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と，前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と，前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と，前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と，前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とする。前記分子は，ストレプトアビジン，又は，ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により，バイオポリマー分子のナノポアを用いた安定した繰返し計測が可能になり，安価，高速，高精度な計測が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】サンプル前処理時のサンプル溶液中の模式図
【図２】ベクターを利用したサンプル前処理法の模式図
【図３】実施例１におけるナノポア装置の概略図
【図４】実施例１におけるナノポア近傍の拡大図
【図５】ＤＮＡ断片の３’末端にストレプトアビジンを結合するフローチャート
【図６】ＤＮＡ断片の３’末端にストレプトアビジンを結合する様子の模式図
【図７】ＤＮＡ分子ナノポア通過時のトンネル電流値の経時変化のグラフ
【図８】実施例２におけるナノポア装置の概略図
【図９】実施例２における各ナノポアからの発光のＣＣＤ上でイメージ図
【図１０】ＤＮＡ分子ナノポア通過時の各波長での信号強度の経時変化のグラフ
【図１１】ＤＮＡ分子ナノポア通過時の各塩基種における信号強度の経時変化のグラフ
【図１２】実施例３におけるナノポア装置の概略図
【図１３】実施例４におけるナノポア装置の概略図
【図１４】各既知配列プローブをハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ分子のナノポア通過時の封鎖電流の経時変化グラフ
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下，図面に従って本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００２６】
本発明を用いたナノポアのトンネル電流計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。図１（Ａ）および（Ｂ）は，計測前のサンプル前処理時のサンプル溶液中の状態を模式的に示したものである。溶液中には，２本鎖になっているターゲットＤＮＡ分子１０１，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１０３が混在している。２本鎖合成プローブ１０３のビオチンが標識されていない端面１０４は平滑末端処理されている。ターゲットＤＮＡ分子１０１の両末端に対して，Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅなどを用いて平滑末端処理を行う。ターゲットＤＮＡ分子１０１の平滑末端処理後に，リガーゼを用いて，ターゲットＤＮＡ分子１０１の両端に合成プローブ１０３をライゲーションさせる。前記ライゲーション反応終了後に，サンプルをアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分離する。ターゲットＤＮＡ分子１０１の両端に合成プローブ１０３が結合したもののみを，アクリルアミドゲルより切出して蒸留水に溶出する。前記操作により，合成プローブ１０３同士がライゲーションしたもの，ターゲットＤＮＡ分子１０１同士がライゲーションしたものを除去できる。次いで，ストレプトアビジン１０５が入ったバッファ溶液を，両端に合成プローブが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が溶出された溶液に混入し，５’末端に標識されたビオチン１０２とストレプトアビジン１０５を結合させ，熱を加えてＤＮＡを変性させ，図１（Ｂ）に示す５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。図２（Ａ）および（Ｂ）は，ＤＮＡ断片１０６の別の生成方法を模式的に示したものである。ターゲットＤＮＡ分子１０１をベクター１０７のマルチクローニングサイトの一部に導入する。次いで，ターゲットＤＮＡ分子１０１を挟みこむ状態で，ベクターのそれぞれ異なる制限酵素サイト１０８と１０９で制限酵素処理による切断を行う。そして、制限酵素サイト１０８の切断末端を有し，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１１０と制限酵素サイト１０９の切断末端を有し，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１１１を前記ベクターより切断処理した切断断片１１２に導入し，ライゲーション操作を行う。その後，５’末端に標識されたビオチン１０２とストレプトアビジン１０５を結合させ，熱を加えてＤＮＡを変性させ，図１（Ｂ）に示す５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。
【００２７】
図３は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２０４で構成される。両溶液槽には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２０４を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽２０２，２０３には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２および電流計２１３に接続されている。ナノポア薄膜２０４は，直径１ｎｍのナノポア２０５が形成された絶縁体の薄膜で構成されている。ここでは，絶縁体薄膜の材料としてＳｉ３Ｎ４を用いているが，他にＳｉＯ２やアスファルテンなどのプラスチック材料でもよい。さらに，Ａｌなどの金属膜の表面に絶縁材量をコートした薄膜でも良い。ナノポア２０５の径としては，ここでは１ｎｍとしているが，０．５ｎｍから５０ｎｍ程度あればよい。尚，ストッパ分子として用いたストレプトアビジンの大きさは５ｎｍ程度であり，ナノポアの大きさよりも十分大きい。ナノポアの径に対するストッパ分子の大きさとしては，ＤＮＡ断片の進行を止めることが出来る大きさであればよいが，精度向上のためには，１．２〜５０倍程度あることが望ましい。
【００２８】
図４（Ａ）は，ナノポア２０５近傍の拡大図である。また，図４（Ｂ）は図４（Ａ）のa-a’での断面図である。ナノポア２０５内表面には一対の電極２１６と２１７が具備されており，前記電極２１６，２１７は電圧源２１５と電流計２１４に接続されている。
【００２９】
以下，図５のフローチャートに沿ってＤＮＡ断片１０６の３’末端にストレプトアビジンを結合する方法を説明する。なお，図６に，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にストレプトアビジンを結合する様子を模式的に示す。
【００３０】
まず、前記方法で得られたＤＮＡ断片１０６をバッファ溶液に混合し，導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する（４０１）（図６（Ａ））。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，ＤＮＡ断片１０６を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる（４０２）（図６（Ｂ））。前記電圧印加と同時に電流計２１３によってナノポア２０５を介して流れるイオンの流れを計測する。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径１ｎｍのナノポアは通過できず，ＤＮＡ断片１０６は３’末端（ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端）よりナノポア２０５に導入される。ＤＮＡ断片１０６がナノポア２０５に導入されると電流値は減少する。先述したように，ストレプトアビジン１０５の大きさはナノポア２０５の直径よりも大きいため，ストレプトアビジン１０５がナノポア２０５を通過する直前で，ＤＮＡ断片１０６の第二溶液槽２０３への移動が止まる。前記電流の減少を確認した後に，導入口２０７よりＢｉｏｔｉｎ ３’Ｅｎｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを第二溶液槽２０３に導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にビオチン１１３を標識する（４０３）（図６（Ｃ））。
【００３１】
ビオチン標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のビオチンを第二溶液槽２０３より除去する（４０４）。次いで，ストレプトアビジンを含んだ溶液を導入口２０７より導入し，前記ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたビオチン１１３にストレプトアビジン１１４を結合させ，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成する（４０５）（図６（Ｄ））。導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のストレプトアビジンを第二溶液槽２０３より除去する（４０６）。
【００３２】
上記では，第一，第二ストッパ分子として同じ物質であるストレプトアビジンを使用したが，異なる物質を使用しても良い。例えば，第一，第二ストッパ分子に異なる物質を使用したアレイ型ＤＮＡ断片１１５の別な生成方法として以下の方法がある。図２で示した方法において，合成プローブ１１０および１１１の切断末端とは異なる末端側の３’末端にＤｉｇｏｘｉｇｅｉｎ（ＤＩＧ）を標識しておく。それ以外は，前述した方法でＤＮＡ断片１０６を生成する。この時，ＤＮＡ断片１０６の３’末端はＤＩＧ標識されている。次いで，前記３’末端がＤＩＧ標識されたＤＮＡ断片１０６を前述と同等の方法で，第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３へ泳動させる。ＤＩＧ自身の大きさは，ナノポア２０５の直径１ｎｍよりも十分小さいため，ＤＮＡ断片１０６は３’末端よりナノポア２０５に導入される。ストレプトアビジン１０５によってＤＮＡ断片１０６の移動が停止した状態で，第二溶液槽２０３に直径が１ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体を導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたＤＩＧと結合させる。これにより，第一ストッパ分子としてストレプトアビジン，第二ストッパ分子としてＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体結合を介したビーズから構成されるアレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成できる。ここでは，ビオチン・ストレプトアジビン以外としてＤＩＧ・抗ＤＩＧ結合ビーズを用いた例を記載したが，他にもＤＮＡの末端をチオール化して金粒子を結合させる方法や，ＤＮＡの末端をアミノ基修飾してカルボキシルキ修飾のビーズと脱水反応により結合させる方法等を用いてもよい。
【００３３】
アレイ型ＤＮＡ断片１１５生成後に，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間に電極２１６，２１７によりトンネル電流を計測し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を構成する塩基種を特定する。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に電極２１６，２１７によりトンネル電流を計測する。前記両溶液槽間の泳動ならびにトンネル電流の計測を繰返す事により，同一ターゲットＤＮＡ分子のトンネル電流の計測が複数回でき，高精度な塩基種決定が可能となる。
【００３４】
ここで，塩基種決定の方法を説明する。塩基にはＡＴＧＣの４種類があるが，これらの塩基の種類ごとに固有の電流値が観測され，データ処理手段４００に送られる。一例を図７に示す。予め，各塩基１種類のみが連なったポリマのナノポア通過時のトンネル電流を計測し，各塩基種に対応した電流値を求め，データ処理手段中のメモリに格納しておく。そして、データ処理手段４００により，ターゲットＤＮＡのトンネル電流計測時に得られた電流値と前記予め計測した各塩基種に対応した電流値を比較する事により，ターゲットＤＮＡの塩基種決定を行う。
【００３５】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。前記一定時間の設定は可変である。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００３６】
本実施例では，１個のナノポアを使ったトンネル電流の計測を行っているが，多数のナノポアを使用して多数の異なるターゲットＤＮＡ分子のトンネル電流の同時計測により，スループットの向上も図れる。
【００３７】
また、本実施例では説明用に、５’末端にストッパ分子が結合したＤＮＡを第一溶液槽に導入してナノポアを通過させた後に３’末端にストッパ分子を結合させる例を記載しているが、同様の方法にて、３’末端にストッパ分子が結合したDNA断片を用い、ナノポアに導入した後５’末端にストッパ分子を結合させるのでもよい。
【実施例２】
【００３８】
ナノポアの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した蛍光検出計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。受容体としての蛍光体Ｃｙ５が標識されたターゲットＤＮＡ分子を以下の方法で生成した。実施例１の図２（Ｂ）を用いて説明したように，ターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれ，５’末端にビオチンを介したストレプトアビジンが標識され，３’末端にＤＩＧが標識されたＤＮＡ断片１０６を生成する。次いで，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，Ｃｙ５が標識されたｄＡＴＰ，ＤＮＡポリメラーゼ，および前記ＤＮＡ断片１０６の合成プローブ部分（１１０，１１１のどちらでも良い）と相補配列を持つプライマーを含む反応溶液と前記３’末端にＤＩＧが標識されたＤＮＡ断片１０６を混合し，伸長反応を行う。前記伸長反応時には熱変性は行わない。同様の操作を，Ｃｙ５がｄＣＴＰのみに標識された反応溶液，ｄＧＴＰのみに標識された反応溶液，ｄＴＴＰのみに標識された反応溶液で，それぞれ異なる反応チューブで行い，ターゲットＤＮＡ断片１０１を含んだＣｙ５蛍光体１１６が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成する。
【００３９】
図８は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２１８で構成される。両溶液槽２０２，２０３には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２１８を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽２０２，２０３には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２に接続されている。第一溶液槽２０２には，光透過性の照射窓３０５と検出窓３０６が具備されている。ナノポア薄膜２１８は，直径３ｎｍのナノポア２０５が形成されたＳｉ３Ｎ４薄膜で構成されている。ナノポア２０５は１μｍの間隔で格子状に複数個形成されている。ナノポア２０５近傍には供与体として青色光で励起され６０５ｎｍの発光蛍光するＱｄｏｔ（６０５）２１９が固定されている。
【００４０】
レーザ光源（波長４８８ｎｍ）３０１より発振したレーザ光３０２は，ミラー３０３により角度を調整され，集光レンズ３０４により集光され，照射窓３０５を介してすべてのＱｄｏｔ２１９に照射される。ナノポア２０５近傍で発光した発光蛍光は，検出窓３０６を介して対物レンズ３０７によって集光され，フィルタ３０８により波長５５０ｎｍから７００ｎｍ以外の波長の光がカットされ，プリズム３０９により分光され，結像レンズ３１０によって図９に示すようにＣＣＤ３１１上に結像される。ＣＣＤ３１１のデータは，データ処理手段４００に格納される。図９にデータ処理手段４００に格納されたＣＣＤ３１１上で結像されたイメージ図を示す。各スポットは各ナノポアからの輝点に対応しており，また，横軸は波長方向に対応している。
【００４１】
前記方法で得られた２本鎖ＤＮＡ断片１１７をバッファ溶液に混合し，導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径３ｎｍのナノポアは通過できず，２本鎖ＤＮＡ断片１１７は，ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端よりナノポア２０５に導入される。ストレプトアビジン１０５によって２本鎖ＤＮＡ断片１１７の移動が停止した状態で，第二溶液槽２０３に直径が３ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体１１８を導入し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の蛍光体１１６が標識されていない鎖の３’末端に標識されたＤＩＧと結合させる。抗ＤＩＧ抗体１１８標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応の抗ＤＩＧ抗体を第二溶液槽２０３より除去する。この間，電圧を印加し続ける。なお，各ナノポアに導入される２本鎖ＤＮＡ断片１１７を構成するターゲットＤＮＡ分子は，同じものであってもよいし，異なるＤＮＡ分子であってもよい。検出された発光を統計的に処理することにより，それぞれの塩基種の特定ができる。同じＤＮＡの分子の場合には，ＤＮＡ分子の往復回数を減らして時間を短縮しつつ塩基種特定の精度が向上することができる。一方、異なる分子の場合には、同時に多くの分子を測定してスループットを向上することができる。
【００４２】
２本鎖ＤＮＡ断片１１７に抗ＤＩＧ抗体１１８を標識した後に，レーザ光源３０１よりレーザ光３０２を発振し，Ｑｄｏｔ２１９を励起する。次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，抗ＤＩＧ抗体１１８標識２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間にＱｄｏｔ２１９近傍を２本鎖ＤＮＡ断片１１７に標識されている蛍光体１１８が通過すると共鳴による励起エネルギーの移動が起こり，蛍光体１１８が発光するため，これら発光をＣＣＤ３１１で検出する。図１０に，前記発光に対応するＣＣＤ３１１上でのスポットの内，波長６０５ｎｍと波長６７０ｎｍに対応するピクセルの強度の時間的変動を示す。波長６０５ｎｍはＱｄｏｔ２１９の発光に対応し，波長６７０ｎｍは蛍光体１１８の発光に対応する。検出された波長６７０ｎｍに対応する信号強度の時間的変動から，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を算出できる。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に前記と同様にＣＣＤ３１１によって蛍光検出する。前記泳動ならびに蛍光検出を繰返す事により，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を複数回計測でき，高精度な位置算出が可能となる。４種類の異なるｄＮＴＰに蛍光体が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７に対して前記と同様の泳動と蛍光検出の繰返し作業を行い，各波長に対して得られた信号強度の時間的変動を図１１に示す。波長６７０ｎｍに対応する信号強度の時間的変動により，各塩基種のターゲットＤＮＡ分子１０１上での位置が判別でき，各塩基種のデータを合わせることにより，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定する。
【００４３】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００４４】
本実施例では１種類の蛍光体のみを使用したが，４種のｄＮＴＰに異なる蛍光体を標識し，それらｄＮＴＰすべてが標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成し，それを前記と同様操作で蛍光検出することで，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定することも可能である。また，高い粘性のバッファ溶液の使用や泳動時の印加電圧を小さくすることにより，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の泳動速度を遅くする事ができ，高感度に蛍光検出することが可能となる。本実施例ではＦＲＥＴの供与体としてＱｄｏｔを使用したが蛍光体であっても良い。また，図８では２つのＤＮＡ断片を同時に計測する例を示しているが，１つであってもよいし，また３以上のＤＮＡ断片を同時に計測しても良い。
【実施例３】
【００４５】
ナノポアの蛍光検出計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。
図１２は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。レーザ光源３０１，フィルタ３０８，レーザ光のナノポア装置への照射位置およびナノポア薄膜の構成以外はすべて実施例２と同等である。ナノポア薄膜２１８を石英ガラスで作製し，表面を石英よりも低い屈折率の樹脂（例えばフロリナート）でコーティングする。この時，ナノポア近傍の鋭利な先端部２２０の樹脂を剥離しておく。レーザ光源（波長６３３ｎｍ）３０１より射出したレーザ光３０２は，集光レンズ３０４で集光され，ナノポア薄膜側面３１２に照射される。この時，レーザ光３０２はナノポア薄膜２１８内を全反射しながら伝播するが，先端部２２０は樹脂コーティングされていないため，両溶液槽内を満たすバッファ溶液に，近接場光として僅かに染み出す。レーザ光３０２はナノポア薄膜２１８内全体を全反射しながら伝播するため，すべての先端部２２０で近接場が生じる。ナノポア２０５近傍で発光した発光蛍光は，検出窓３０６を介して対物レンズ３０７によって集光され，フィルタ３０８により波長６６０ｎｍから７００ｎｍ以外の波長の光がカットされ，プリズム３０９により分光され，結像レンズ３１０によってＣＣＤ３１１上に結像される。ＣＣＤ３１１のデータは，データ処理手段４００に格納される。図１２では２つのＤＮＡ断片を同時に計測する例を示しているが，１つであってもよいし，また３以上のＤＮＡ断片を同時に計測しても良い。
【００４６】
実施例２と同等の方法で，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成および蛍光体１１６が標識されていない鎖の３’末端に標識されたＤＩＧに直径が３ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体１１８を結合させる操作を行う。
【００４７】
２本鎖ＤＮＡ断片１１７に抗ＤＩＧ抗体１１８を標識した後に，レーザ光源３０１よりレーザ光３０２を発振し，先端部２２０に近接場光を生成する。次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，抗ＤＩＧ抗体１１８標識２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間に先端部２２０近傍の近接場光内を２本鎖ＤＮＡ断片１１７に標識されている蛍光体１１８が通過すると蛍光体１１８が発光する。この発光をＣＣＤ３１１で検出し，検出された信号強度の時間的変動から，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を算出できる。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に前記発光をＣＣＤ３１１で検出する。前記泳動ならびに蛍光検出を繰返す事により，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を複数回計測でき，高精度な位置算出が可能となる。４種類の異なるｄＮＴＰに蛍光体が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７に対して前記蛍光体標識位置検出の操作を行い，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定する。
【００４８】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００４９】
本実施例では１種類の蛍光体のみを使用したが，４種のｄＮＴＰに異なる蛍光体を標識し，それらｄＮＴＰすべてが標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成し，それを前記と同様操作で蛍光検出することで，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定することも可能である。また，高い粘性のバッファ溶液の使用や泳動時の印加電圧を小さくすることにより，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の泳動速度を遅くする事ができ，高感度に蛍光検出することが可能となる。
【実施例４】
【００５０】
つづいて，ハイブリダイゼーションベースのＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。実施例１と同等の方法で５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。
【００５１】
図１３に本実施例で使用するナノポア装置の概略図を示す。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２２１で構成される。両溶液槽には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２２１を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２におよび電流計２１３に接続されている。ナノポア薄膜２２１は，直径３ｎｍのナノポア２０５が形成されたＳｉ３Ｎ４薄膜で構成されている。温調ユニット３１３によって第一溶液槽２０２および第二溶液槽２０３内の溶液の温度を２０℃から１００℃まで調節できる。電圧源２１２の制御，温調ユニット３１３の制御，電流計２１３の電流値の取得，得られたデータの処理は，データ処理手段４００によって行われる。
【００５２】
前記方法で得られたＤＮＡ断片１０６をバッファ溶液に混合し導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，ＤＮＡ断片１０６を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる。前記電圧印加と同時に電流計２１３によって電流を計測する。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径３ｎｍのナノポアは通過できず，ＤＮＡ断片１０６は３’末端（ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端）よりナノポア２０５に導入される。ＤＮＡ断片１０６がナノポア２０５に導入されると電流値は減少する。先述したように，ストレプトアビジン１０５の大きさはナノポア２０５の直径よりも大きいため，ストレプトアビジン１０５がナノポア２０５を通過する直前で，ＤＮＡ断片１０６の第二溶液槽２０３への移動が止まる。前記電流の減少を確認した後に，導入口２０７よりＢｉｏｔｉｎ ３’Ｅｎｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを第二溶液槽２０３に導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にビオチン１１３を標識する。ビオチン標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のビオチンを第二溶液槽２０３より除去する。ストレプトアビジンを含んだ溶液を導入口２０７より導入し，前記ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたビオチン１１３にストレプトアビジン１１４を結合させ，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成する。導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のストレプトアビジンを第二溶液槽２０３より除去する。
【００５３】
アレイ型ＤＮＡ断片１１５生成後に，導入口２０６および２０７より６塩基から構成される既知配列プローブ１１９を両溶液槽に導入し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション反応後に，導入口２０６および２０７よりバッファのみを導入し，未反応の既知配列プローブ１１９を両溶液槽２０３より除去する。電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させ，次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。前記電圧極性の切替えのタイミングは，ある一定時間で自動切替できるように電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５の泳動間に電流計２１３より封鎖電流を計測する。計測された封鎖電流の時間的変動から，既知配列プローブ１１９のアレイ型ＤＮＡ断片１１５へのハイブリダイゼーションした位置を算出できる。
【００５４】
次いで，電圧印加を停止し，温調ユニット３１３を用いて第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３内の溶液の温度を９５℃に一定時間加温し，熱変性により前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５から既知配列プローブ１１９を分離する。導入口２０６および２０７からバッファのみを導入し，既知配列プローブ１１９を両溶液槽より除去する。両溶液槽の温度を４０℃に冷やし，導入口２０６および２０７から前記既知配列プローブ１１９とは異なる配列を持つ既知配列プローブを両溶液槽に導入し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション反応後に，導入口２０６および２０７よりバッファのみを導入し，未反応の前記既知配列プローブを両溶液槽より除去する。電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させ，次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に電流計２１３より封鎖電流を計測する。
【００５５】
既知配列プローブのアレイ型ＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーション，アレイ型ＤＮＡ断片の泳動，封鎖電流計測，熱変性による既知配列プローブのアレイ型ＤＮＡ断片から分離を，異なる配列の既知配列プローブで４ｎ回（ｎは既知配列プローブの塩基長であり，本実施例では６となる）繰返し操作し，得られた各既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置のデータをコンピュータアルゴリズムを使ってターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列データに変換することが可能となる。具体的な方法を，図１４を用いて説明する。ターゲットＤＮＡ１０１に対して，既知配列プローブ１１９をハイブリダイゼーションさせ，ナノポアを通過させて封鎖電流を計測すると，封鎖電流値の波形１２３が観測される。これを前述したような方法で繰返し計測を行い，既知配列プローブ１１９がターゲットＤＮＡ１０１どの位置にハイブリダイゼーションしたのかを予測する。前記操作を既知配列プローブ１２０，１２１，１２０で行い，得られた各既知配列プローブのターゲットＤＮＡ１０１へのハイブリダイゼーション位置を重ねる事で，ターゲットＤＮＡ１０１と相補的な配列を導き出すことができ，最終的にターゲットＤＮＡ１０１の配列データを得られる。
【００５６】
本発明を利用することにより，ターゲットＤＮＡ分子の増幅無く，また，複数のナノポアを用いること無く，ハイブリダイゼーションベースのターゲットＤＮＡ分子塩基配列決定が可能となる。
【００５７】
本実施例では，既知配列のプローブの長さは６塩基としている。既知配列プローブの長さが長いと，プローブ製作のコストの上昇やミスハイブリダイゼーションの増加が起こる。また，既知配列プローブの長さが短いと，計測分解能を上げないと，正確なプローブのハイブリダイゼーションの位置を計測できない。そのため，既知配列プローブの長さは３〜１０塩基程度が望ましい。
【００５８】
既知配列プローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーション位置を高精度に検出するために，封鎖電流計測の際に，電極２１０と２１１の極性を繰返し変化させて，複数回封鎖電流を計測しても良い。
【００５９】
計測終了後にヌクレアーゼや酸などを用いてアレイ型ＤＮＡ断片１１５を切断し，両溶液槽から前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５を除去する事により，ナノポア薄膜を再利用しても良い。
【００６０】
既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出を，既知配列プローブの一部に蛍光体を標識し，実施例２や実施例３で示した蛍光検出を用いても良い。
【００６１】
既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出を封鎖電流では無く，トンネル電流や蛍光検出することにより複数種のターゲット分子の同時計測が簡便に行え，スループットの向上が図ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
ＤＮＡシーケンサ
【符号の説明】
【００６３】
１０１：ターゲットＤＮＡ分子，１０２：ビオチン，１０３：合成プローブ，１０４：端面，１０５：ストレプトアビジン，１０６：ＤＮＡ断片，１０７：ベクター，１０８：制限酵素サイト，１０９：制限酵素サイト，１１０：合成プローブ，１１１：合成プローブ，１１２：切断断片，１１３：ビオチン，１１４：ストレプトアビジン，１１５：アレイ型ＤＮＡ断片，１１６：蛍光体，１１７：２本鎖ＤＮＡ断片，１１８：ビーズ標識抗ＤＩＧ抗体，１１９：既知配列プローブ，１２０：既知配列プローブ，１２１：既知配列プローブ，１２２：既知配列プローブ，１２３：封鎖電流値の波形，１２４：封鎖電流値の波形，１２５：封鎖電流値の波形，１２６：封鎖電流値の波形，２０２：第一溶液槽，２０３：第二溶液槽，２０４：ナノポア薄膜，２０５：ナノポア，２０６：導入口，２０７：導入口，２０８：排出口，２０９：排出口，２１０：電極，２１１：電極，２１２：電圧源，２１３：電流計，２１４：電流計，２１５：電圧源，２１６：電極，２１７：電極，２１８：ナノポア薄膜，２１９：Ｑｄｏｔ，２２０：先端部，２２１：ナノポア薄膜，３０１：レーザ光源，３０２：レーザ光，３０３：ミラー，３０４：集光レンズ，３０５：照射窓，３０６：検出窓，３０７：対物レンズ，３０８：フィルタ，３０９：プリズム，３１０：結像レンズ，３１１：ＣＣＤ，３１２：ナノポア薄膜側面，３１３：温調ユニット，４００：データ処理装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ナノポア構造を用いた，ＤＮＡ，ＲＮＡ，又はタンパク質等のバイオポリマーの高精度な計測，分析を行うための構造，方法に関する技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
病気の診断や創薬に対して，核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）やタンパク質等のバイオポリマーを分析することは重要である。特にＤＮＡは，生命の最も基本の構成体であるため，その分析，つまり塩基配列の決定は，上記目的に対して非常に重要となる。ＤＮＡの塩基配列を分析する主な方法としては，まず，化学もしくは酵素反応を利用して，配列決定したい鋳型ＤＮＡに対して，決まった末端塩基種をもつ様々な長さのＤＮＡ断片群を生成する。前記ＤＮＡ断片群を４種の塩基種に対してそれぞれ生成する。次いで，ゲル電気泳動を用いて，これらのＤＮＡ断片群を分子量の順に分離する。前記ＤＮＡ断片群を分離媒体に導入し電圧を印加する。ＤＮＡ断片は全体としてマイナスの電荷をもつ高分子電解質であるため，マイナスからプラスの方向に電気泳動する。ゲル中では長いＤＮＡ断片ほど小さな易動度を持つので，１塩基長の違いしか持たないＤＮＡ断片同士をも分離することができる。分離後に，ＤＮＡ断片の末端塩基種に応じた長さを計測することで，鋳型ＤＮＡにおける塩基種の位置が分かる。前記操作により鋳型ＤＮＡの塩基配列が決定される。上記方法において，ＤＮＡ断片群の生成や電気泳動の作業は，非常に煩雑で分析時間も長く，ランニングコストも高価である。
【０００３】
特許文献１および非特許文献１には，絶縁膜である脂質二重層の薄膜上にα−ヘモリジンを用いて形成した直径数ナノメートルの微細な開口，つまりナノポアを用いたバイオポリマーの分析方法が記載されている。２つの溶液槽の間にナノポアを設けた薄膜設置し，両溶液槽間で電圧勾配を設け，電流を計測する。バイオポリマーであるＤＮＡ分子を片方の溶液槽に設置すると，電圧勾配によりナノポアを通過し，別の溶液槽に移動する。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際に，ナノポア内のイオンの流れを塞ぐため，電流の減少（封鎖電流）が生じる。この封鎖電流の大きさとその封鎖電流の継続時間を計測することにより，ナノポアを通過する個々のＤＮＡ分子の長さを検出可能となる。また，理論的にはＤＮＡ分子を構成する個々の塩基の種類の判別も可能となる。
【０００４】
特許文献２および非特許文献２には，脂質二重層におけるα−ヘモリジンを用いたナノポアに代わり，絶縁膜であるシリコンナイトライド（Ｓｉ３Ｎ４）膜に”ｉｏｎ−ｂｅａｍ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ“と言う技術を用いてナノポアを作製し， 1本鎖ＤＮＡ分子の封鎖電流の計測を行っている。
【０００５】
非特許文献３では，ナノポアを通過するＤＮＡ分子の計測方法として，前述した封鎖電流とは異なる手段が提案されている。ナノポアの内表面に一対の金属電極を設け，この金属電極間をＤＮＡ鎖が通過する際のトンネル電流を計測する。この方法でも電極サイズなどが適切に制御されていれば，理論的には，ナノポアを通過するＤＮＡ分子を構成する個々の塩基の種類の判別も可能となる。
【０００６】
特許文献３では，既知配列プローブのターゲット１本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと，ナノポアを用いた前記既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出により，ターゲットＤＮＡの塩基配列を決定する方法が示されている。既知配列のプローブを決定したいターゲット１本鎖ＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションさせ，前記ハイブリダイゼーションしたＤＮＡ分子をナノポアに通過させる。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際にＤＮＡ分子の１本鎖部位と２本鎖部位で封鎖電流が異なるため，電流を計測することにより，既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置を特定できる。複数種の異なる配列を持つ既知配列プローブで前記操作を行い，それぞれのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーション位置データを取得し，得られたデータをコンピュータアルゴリズム使って配列データに変換することで，ターゲットＤＮＡ分子の配列決定が可能となる。
【０００７】
非特許文献４では，ＤＮＡ分子がナノポア通過直後に印加電圧の正負を逆転することにより，同一ＤＮＡ分子が再び同一のナノポアを通過する結果が示されている。
【０００８】
非特許文献５では，ナノポア上でＤＮＡ分子の伸長反応を行い，封鎖電流計測により伸長反応の有無を確認している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,795,782
【特許文献２】米国特許第6,627,076
【特許文献３】米国特許公報第2007/0190542
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】PNAS 1996, Vol.93, pp.13770-13773
【非特許文献２】NATURE 2001, Vol.412, pp.166-169
【非特許文献３】NANO LETTERS 2005, Vol.5, pp.421-424
【非特許文献４】nature nanotechnology 2007, Vol.2, pp.775-779
【非特許文献５】JACS 2008, Vol.130, pp.818-820
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
電気泳動を用いたバイオポリマー，特にＤＮＡ分子の配列決定は分析時間も長く，ランニングコストも高価である。一方，特許文献１や非特許文献３に記載されたナノポアを用いたＤＮＡ分子の配列決定は，高速・安価な分析の可能性を持つが，それぞれ以下の問題がある。
【００１２】
特許文献１では，ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時の各塩基種による封鎖電流の違いは僅かであるため，その判別をすることは困難であり，その精度は非常に低い。また，判別精度を向上するためには，ナノポア近傍の膜厚を１塩基分程度，つまりサブナノメートルにする必要があるが，現状の技術でその膜厚を達成するのは困難である。
【００１３】
非特許文献３において，ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時のトンネル電流の大きさは，ナノポアを通過する塩基の種類の他に，その塩基のトンネル電流を計測する電極近傍での配向にも依存する。現状，通過する核酸の配向制御が困難であるため，塩基種分離の精度を上げるためには，繰返し計測が必要となる。
【００１４】
一方，特許文献３で示される方法では，既知配列プローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションした位置を検出するため，塩基１種類ずつを判別する必要は無い。しかしながら，１塩基レベルでの高精度なハイブリダイゼーション位置の検出が必要になる。また，同一ターゲットＤＮＡ分子に対して，複数種の異なる既知配列プローブを，それぞれ異なる場もしくは異なるタイミングでターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションして，その位置を検出する必要がある。つまり，ターゲットＤＮＡ分子を増幅し，それらをそれぞれ異なる既知配列プローブが存在する異なる溶液に導入し，ターゲットＤＮＡ分子と既知配列プローブをハイブリダイゼーションさせて，それぞれ異なるナノポアもしくは異なるタイミングで同一ナノポアを用いて計測を行う必要がある。もしくは，ある既知配列プローブとハイブリダイゼーションしたターゲットＤＮＡ分子をナノポア計測した後に，抽出し，変性させて１本鎖に戻し，異なる既知配列プローブとハイブリさせて，再度ナノポア計測を行う事を繰返す必要がある。いずれの場合も，非常に煩雑な作業を要する。
【００１５】
非特許文献４で示されるように，ＤＮＡ分子がナノポアを通過した後に，逆電圧を印加することを繰返すことで，同一ＤＮＡ分子を複数回同一ナノポアで計測できる。そのため，繰返し計測による計測精度の向上を図れる可能性はあるが，高精度なフィードバックによる電圧印加が必要になる。また，複数種のＤＮＡ分子が混在していた場合には，コンタミの恐れもある。さらに，ＤＮＡ分子の方向もランダムとなる。
【００１６】
非特許文献５では，ターゲットＤＮＡ分子の５’末端にｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）−ビオチンを介したストレプトアビジンを結合させ，３’末端側には数塩基からなるＤＮＡプライマーをハイブリダイゼーションさせ，ターゲットＤＮＡ分子の３’末端を２本鎖にすることにより，ナノポアを介したターゲットＤＮＡ分子の往復運動を行っている。前記往復運動を用いた繰返し計測により，高精度なナノポア計測ができる可能性がある。しかしながら，ＤＮＡプローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションする位置をコントロールすることは難しく，ターゲットＤＮＡ分子の様々な位置にＤＮＡプローブが結合し，往復運動ができないことがある。また，２本鎖ＤＮＡの直径は２ｎｍ程度であるため，ナノポア直径が２ｎｍ以上では，２本鎖部分がナノポアを通過してしまい，前記往復運動が困難となる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は，核酸やタンパク質のようなバイオポリマー分子のナノポア計測において，計測精度向上のための繰返し計測を安定してできる方法，システム、及びキットを提供する。
【００１８】
第一の溶液槽と第二の溶液槽を具備しており，両溶液槽間は薄膜で区切られており，薄膜にはナノメートルサイズの穴，つまりナノポアが設けられている。バイオポリマー分子の片端にナノポアの開口直径よりも大きなサイズの分子（第一ストッパ分子）を結合し，それを第一の溶液槽に導入する。外力を加えてバイオポリマーを駆動させてナノポアを通過させ，第二の溶液槽に移動させる。第一ストッパ分子により，ナノポアを通過するバイオポリマー分子は途中で移動を停止する。バイオポリマー分子の移動停止後に，第二の溶液槽に存在するナノポアの開口直径よりも大きな分子（第二ストッパ分子）をバイオポリマー分子のもう一方の片端に結合させる。次いで，外力を加えてバイオポリマー分子を，両溶液槽間を往復運動させながら計測を行い，バイオポリマー分子の同定を行う。
【００１９】
第二ストッパ分子のバイオポリマー分子への結合は，バイオポリマー分子がナノポアを移動している間であっても良い。また，第二ストッパ分子をバイオポリマー分子に結合する際に，バイオポリマー分子を駆動させる外力を停止させても良いし，外力を与え続けても良い。第二ストッパ分子は，予め第二溶液槽に入れていても，バイオポリマー分子の片端が第二溶液槽に移動後に導入しても良い。両ストッパ分子は同じ分子であっても良いし，異なる分子であっても良い。バイオポリマーを駆動させる手段としては，バイオポリマー分子が電荷を持っているのであれば両溶液槽間に電圧勾配を生じさせても良いし，両溶液槽間でイオン組成を変えることによる電気化学的勾配を生じさせても良いし，溶液の流れを生じさて駆動させても良い。計測の手段としては，両溶液槽間を，ナノポアを介して流れる電流（封鎖電流）値であっても良いし，ナノポア内部に具備された電極間を流れる電流（トンネル電流）値であっても良い。また，バイオポリマー分子に蛍光体を標識し，ナノポア近傍で励起させ，その発光蛍光を検出しても良い。バイオポリマー分子の両端に両ストッパ分子が結合した状態で，バイオポリマー分子に，ある物質を結合させたり，分離させたりしても良い。例えば，非特許文献３のようにハイブリダイゼーションベースでのＤＮＡ分子配列決定の場合には，前記方法を用いて簡便かつ高精度に計測できる。ＤＮＡ分子の両端にストッパ分子を結合させ，溶液槽に既知配列プローブを導入し，それをターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションさせ，ターゲットＤＮＡ分子を，両溶液槽間を往復運動させてハイブリダイゼーションの位置を封鎖電流計測により検出する。次いで，変性操作により前記既知配列プローブをターゲットＤＮＡ分子から分離させ，別の既知配列プローブを用いて前記と同様の操作を繰返す。前記手段により，同一ターゲットＤＮＡ分子に対して異なる既知配列プローブを簡便に何回でもハイブリダイゼーションできる。また繰返し計測ができるため，ハイブリダイゼーションの位置を高精度に計測できる。
【００２０】
本発明のバイオポリマー決定方法は，第１の溶液槽と，第２の溶液槽と，前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切りナノポアを備えた薄膜とを有する装置を用い，測定対象のバイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する方法であって，前記ナノポアよりも大きな第１の分子を一端に結合した前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する工程と， 前記バイオポリマーを前記ナノポアを通して前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽に移動させる工程と，前記第２の溶液槽に，前記ナノポアよりも大きな第２の分子を導入し，前記バイオポリマーの他端に結合させる工程と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通して移動させる工程と，前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定することを特徴とする。
【００２１】
本発明のバイオポリマー決定システムは，ナノポアを有する薄膜を備えた装置を用い，前記ナノポアの大きさよりも大きく，測定対象のバイオポリマーに結合させる分子を導入するシステムであって，前記装置は，前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と，前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と，前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と，前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と，前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とする。
【００２２】
本発明のバイオポリマー決定キットは，ナノポアを有する薄膜を備えた装置と，前記ナノポアの大きさよりも大きく，測定対象のバイオポリマーに結合させる分子とを有するキットであって，前記装置は，前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と，前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と，前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と，前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と，前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と，前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し，前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し，前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とする。前記分子は，ストレプトアビジン，又は，ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により，バイオポリマー分子のナノポアを用いた安定した繰返し計測が可能になり，安価，高速，高精度な計測が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】サンプル前処理時のサンプル溶液中の模式図
【図２】ベクターを利用したサンプル前処理法の模式図
【図３】実施例１におけるナノポア装置の概略図
【図４】実施例１におけるナノポア近傍の拡大図
【図５】ＤＮＡ断片の３’末端にストレプトアビジンを結合するフローチャート
【図６】ＤＮＡ断片の３’末端にストレプトアビジンを結合する様子の模式図
【図７】ＤＮＡ分子ナノポア通過時のトンネル電流値の経時変化のグラフ
【図８】実施例２におけるナノポア装置の概略図
【図９】実施例２における各ナノポアからの発光のＣＣＤ上でイメージ図
【図１０】ＤＮＡ分子ナノポア通過時の各波長での信号強度の経時変化のグラフ
【図１１】ＤＮＡ分子ナノポア通過時の各塩基種における信号強度の経時変化のグラフ
【図１２】実施例３におけるナノポア装置の概略図
【図１３】実施例４におけるナノポア装置の概略図
【図１４】各既知配列プローブをハイブリダイゼーションさせたＤＮＡ分子のナノポア通過時の封鎖電流の経時変化グラフ
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下，図面に従って本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００２６】
本発明を用いたナノポアのトンネル電流計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。図１（Ａ）および（Ｂ）は，計測前のサンプル前処理時のサンプル溶液中の状態を模式的に示したものである。溶液中には，２本鎖になっているターゲットＤＮＡ分子１０１，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１０３が混在している。２本鎖合成プローブ１０３のビオチンが標識されていない端面１０４は平滑末端処理されている。ターゲットＤＮＡ分子１０１の両末端に対して，Ｓ１ Ｎｕｃｌｅａｓｅなどを用いて平滑末端処理を行う。ターゲットＤＮＡ分子１０１の平滑末端処理後に，リガーゼを用いて，ターゲットＤＮＡ分子１０１の両端に合成プローブ１０３をライゲーションさせる。前記ライゲーション反応終了後に，サンプルをアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分離する。ターゲットＤＮＡ分子１０１の両端に合成プローブ１０３が結合したもののみを，アクリルアミドゲルより切出して蒸留水に溶出する。前記操作により，合成プローブ１０３同士がライゲーションしたもの，ターゲットＤＮＡ分子１０１同士がライゲーションしたものを除去できる。次いで，ストレプトアビジン１０５が入ったバッファ溶液を，両端に合成プローブが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が溶出された溶液に混入し，５’末端に標識されたビオチン１０２とストレプトアビジン１０５を結合させ，熱を加えてＤＮＡを変性させ，図１（Ｂ）に示す５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。図２（Ａ）および（Ｂ）は，ＤＮＡ断片１０６の別の生成方法を模式的に示したものである。ターゲットＤＮＡ分子１０１をベクター１０７のマルチクローニングサイトの一部に導入する。次いで，ターゲットＤＮＡ分子１０１を挟みこむ状態で，ベクターのそれぞれ異なる制限酵素サイト１０８と１０９で制限酵素処理による切断を行う。そして、制限酵素サイト１０８の切断末端を有し，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１１０と制限酵素サイト１０９の切断末端を有し，５’末端にビオチン１０２が標識された２本鎖の合成プローブ１１１を前記ベクターより切断処理した切断断片１１２に導入し，ライゲーション操作を行う。その後，５’末端に標識されたビオチン１０２とストレプトアビジン１０５を結合させ，熱を加えてＤＮＡを変性させ，図１（Ｂ）に示す５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。
【００２７】
図３は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２０４で構成される。両溶液槽には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２０４を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽２０２，２０３には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２および電流計２１３に接続されている。ナノポア薄膜２０４は，直径１ｎｍのナノポア２０５が形成された絶縁体の薄膜で構成されている。ここでは，絶縁体薄膜の材料としてＳｉ３Ｎ４を用いているが，他にＳｉＯ２やアスファルテンなどのプラスチック材料でもよい。さらに，Ａｌなどの金属膜の表面に絶縁材量をコートした薄膜でも良い。ナノポア２０５の径としては，ここでは１ｎｍとしているが，０．５ｎｍから５０ｎｍ程度あればよい。尚，ストッパ分子として用いたストレプトアビジンの大きさは５ｎｍ程度であり，ナノポアの大きさよりも十分大きい。ナノポアの径に対するストッパ分子の大きさとしては，ＤＮＡ断片の進行を止めることが出来る大きさであればよいが，精度向上のためには，１．２〜５０倍程度あることが望ましい。
【００２８】
図４（Ａ）は，ナノポア２０５近傍の拡大図である。また，図４（Ｂ）は図４（Ａ）のa-a’での断面図である。ナノポア２０５内表面には一対の電極２１６と２１７が具備されており，前記電極２１６，２１７は電圧源２１５と電流計２１４に接続されている。
【００２９】
以下，図５のフローチャートに沿ってＤＮＡ断片１０６の３’末端にストレプトアビジンを結合する方法を説明する。なお，図６に，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にストレプトアビジンを結合する様子を模式的に示す。
【００３０】
まず、前記方法で得られたＤＮＡ断片１０６をバッファ溶液に混合し，導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する（４０１）（図６（Ａ））。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，ＤＮＡ断片１０６を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる（４０２）（図６（Ｂ））。前記電圧印加と同時に電流計２１３によってナノポア２０５を介して流れるイオンの流れを計測する。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径１ｎｍのナノポアは通過できず，ＤＮＡ断片１０６は３’末端（ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端）よりナノポア２０５に導入される。ＤＮＡ断片１０６がナノポア２０５に導入されると電流値は減少する。先述したように，ストレプトアビジン１０５の大きさはナノポア２０５の直径よりも大きいため，ストレプトアビジン１０５がナノポア２０５を通過する直前で，ＤＮＡ断片１０６の第二溶液槽２０３への移動が止まる。前記電流の減少を確認した後に，導入口２０７よりＢｉｏｔｉｎ ３’Ｅｎｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを第二溶液槽２０３に導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にビオチン１１３を標識する（４０３）（図６（Ｃ））。
【００３１】
ビオチン標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のビオチンを第二溶液槽２０３より除去する（４０４）。次いで，ストレプトアビジンを含んだ溶液を導入口２０７より導入し，前記ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたビオチン１１３にストレプトアビジン１１４を結合させ，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成する（４０５）（図６（Ｄ））。導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のストレプトアビジンを第二溶液槽２０３より除去する（４０６）。
【００３２】
上記では，第一，第二ストッパ分子として同じ物質であるストレプトアビジンを使用したが，異なる物質を使用しても良い。例えば，第一，第二ストッパ分子に異なる物質を使用したアレイ型ＤＮＡ断片１１５の別な生成方法として以下の方法がある。図２で示した方法において，合成プローブ１１０および１１１の切断末端とは異なる末端側の３’末端にＤｉｇｏｘｉｇｅｉｎ（ＤＩＧ）を標識しておく。それ以外は，前述した方法でＤＮＡ断片１０６を生成する。この時，ＤＮＡ断片１０６の３’末端はＤＩＧ標識されている。次いで，前記３’末端がＤＩＧ標識されたＤＮＡ断片１０６を前述と同等の方法で，第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３へ泳動させる。ＤＩＧ自身の大きさは，ナノポア２０５の直径１ｎｍよりも十分小さいため，ＤＮＡ断片１０６は３’末端よりナノポア２０５に導入される。ストレプトアビジン１０５によってＤＮＡ断片１０６の移動が停止した状態で，第二溶液槽２０３に直径が１ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体を導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたＤＩＧと結合させる。これにより，第一ストッパ分子としてストレプトアビジン，第二ストッパ分子としてＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体結合を介したビーズから構成されるアレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成できる。ここでは，ビオチン・ストレプトアジビン以外としてＤＩＧ・抗ＤＩＧ結合ビーズを用いた例を記載したが，他にもＤＮＡの末端をチオール化して金粒子を結合させる方法や，ＤＮＡの末端をアミノ基修飾してカルボキシルキ修飾のビーズと脱水反応により結合させる方法等を用いてもよい。
【００３３】
アレイ型ＤＮＡ断片１１５生成後に，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間に電極２１６，２１７によりトンネル電流を計測し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を構成する塩基種を特定する。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に電極２１６，２１７によりトンネル電流を計測する。前記両溶液槽間の泳動ならびにトンネル電流の計測を繰返す事により，同一ターゲットＤＮＡ分子のトンネル電流の計測が複数回でき，高精度な塩基種決定が可能となる。
【００３４】
ここで，塩基種決定の方法を説明する。塩基にはＡＴＧＣの４種類があるが，これらの塩基の種類ごとに固有の電流値が観測され，データ処理手段４００に送られる。一例を図７に示す。予め，各塩基１種類のみが連なったポリマのナノポア通過時のトンネル電流を計測し，各塩基種に対応した電流値を求め，データ処理手段中のメモリに格納しておく。そして、データ処理手段４００により，ターゲットＤＮＡのトンネル電流計測時に得られた電流値と前記予め計測した各塩基種に対応した電流値を比較する事により，ターゲットＤＮＡの塩基種決定を行う。
【００３５】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。前記一定時間の設定は可変である。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００３６】
本実施例では，１個のナノポアを使ったトンネル電流の計測を行っているが，多数のナノポアを使用して多数の異なるターゲットＤＮＡ分子のトンネル電流の同時計測により，スループットの向上も図れる。
【００３７】
また、本実施例では説明用に、５’末端にストッパ分子が結合したＤＮＡを第一溶液槽に導入してナノポアを通過させた後に３’末端にストッパ分子を結合させる例を記載しているが、同様の方法にて、３’末端にストッパ分子が結合したDNA断片を用い、ナノポアに導入した後５’末端にストッパ分子を結合させるのでもよい。
【実施例２】
【００３８】
ナノポアの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した蛍光検出計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。受容体としての蛍光体Ｃｙ５が標識されたターゲットＤＮＡ分子を以下の方法で生成した。実施例１の図２（Ｂ）を用いて説明したように，ターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれ，５’末端にビオチンを介したストレプトアビジンが標識され，３’末端にＤＩＧが標識されたＤＮＡ断片１０６を生成する。次いで，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，Ｃｙ５が標識されたｄＡＴＰ，ＤＮＡポリメラーゼ，および前記ＤＮＡ断片１０６の合成プローブ部分（１１０，１１１のどちらでも良い）と相補配列を持つプライマーを含む反応溶液と前記３’末端にＤＩＧが標識されたＤＮＡ断片１０６を混合し，伸長反応を行う。前記伸長反応時には熱変性は行わない。同様の操作を，Ｃｙ５がｄＣＴＰのみに標識された反応溶液，ｄＧＴＰのみに標識された反応溶液，ｄＴＴＰのみに標識された反応溶液で，それぞれ異なる反応チューブで行い，ターゲットＤＮＡ断片１０１を含んだＣｙ５蛍光体１１６が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成する。
【００３９】
図８は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２１８で構成される。両溶液槽２０２，２０３には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２１８を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽２０２，２０３には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２に接続されている。第一溶液槽２０２には，光透過性の照射窓３０５と検出窓３０６が具備されている。ナノポア薄膜２１８は，直径３ｎｍのナノポア２０５が形成されたＳｉ３Ｎ４薄膜で構成されている。ナノポア２０５は１μｍの間隔で格子状に複数個形成されている。ナノポア２０５近傍には供与体として青色光で励起され６０５ｎｍの発光蛍光するＱｄｏｔ（６０５）２１９が固定されている。
【００４０】
レーザ光源（波長４８８ｎｍ）３０１より発振したレーザ光３０２は，ミラー３０３により角度を調整され，集光レンズ３０４により集光され，照射窓３０５を介してすべてのＱｄｏｔ２１９に照射される。ナノポア２０５近傍で発光した発光蛍光は，検出窓３０６を介して対物レンズ３０７によって集光され，フィルタ３０８により波長５５０ｎｍから７００ｎｍ以外の波長の光がカットされ，プリズム３０９により分光され，結像レンズ３１０によって図９に示すようにＣＣＤ３１１上に結像される。ＣＣＤ３１１のデータは，データ処理手段４００に格納される。図９にデータ処理手段４００に格納されたＣＣＤ３１１上で結像されたイメージ図を示す。各スポットは各ナノポアからの輝点に対応しており，また，横軸は波長方向に対応している。
【００４１】
前記方法で得られた２本鎖ＤＮＡ断片１１７をバッファ溶液に混合し，導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径３ｎｍのナノポアは通過できず，２本鎖ＤＮＡ断片１１７は，ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端よりナノポア２０５に導入される。ストレプトアビジン１０５によって２本鎖ＤＮＡ断片１１７の移動が停止した状態で，第二溶液槽２０３に直径が３ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体１１８を導入し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の蛍光体１１６が標識されていない鎖の３’末端に標識されたＤＩＧと結合させる。抗ＤＩＧ抗体１１８標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応の抗ＤＩＧ抗体を第二溶液槽２０３より除去する。この間，電圧を印加し続ける。なお，各ナノポアに導入される２本鎖ＤＮＡ断片１１７を構成するターゲットＤＮＡ分子は，同じものであってもよいし，異なるＤＮＡ分子であってもよい。検出された発光を統計的に処理することにより，それぞれの塩基種の特定ができる。同じＤＮＡの分子の場合には，ＤＮＡ分子の往復回数を減らして時間を短縮しつつ塩基種特定の精度が向上することができる。一方、異なる分子の場合には、同時に多くの分子を測定してスループットを向上することができる。
【００４２】
２本鎖ＤＮＡ断片１１７に抗ＤＩＧ抗体１１８を標識した後に，レーザ光源３０１よりレーザ光３０２を発振し，Ｑｄｏｔ２１９を励起する。次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，抗ＤＩＧ抗体１１８標識２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間にＱｄｏｔ２１９近傍を２本鎖ＤＮＡ断片１１７に標識されている蛍光体１１８が通過すると共鳴による励起エネルギーの移動が起こり，蛍光体１１８が発光するため，これら発光をＣＣＤ３１１で検出する。図１０に，前記発光に対応するＣＣＤ３１１上でのスポットの内，波長６０５ｎｍと波長６７０ｎｍに対応するピクセルの強度の時間的変動を示す。波長６０５ｎｍはＱｄｏｔ２１９の発光に対応し，波長６７０ｎｍは蛍光体１１８の発光に対応する。検出された波長６７０ｎｍに対応する信号強度の時間的変動から，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を算出できる。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に前記と同様にＣＣＤ３１１によって蛍光検出する。前記泳動ならびに蛍光検出を繰返す事により，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を複数回計測でき，高精度な位置算出が可能となる。４種類の異なるｄＮＴＰに蛍光体が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７に対して前記と同様の泳動と蛍光検出の繰返し作業を行い，各波長に対して得られた信号強度の時間的変動を図１１に示す。波長６７０ｎｍに対応する信号強度の時間的変動により，各塩基種のターゲットＤＮＡ分子１０１上での位置が判別でき，各塩基種のデータを合わせることにより，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定する。
【００４３】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００４４】
本実施例では１種類の蛍光体のみを使用したが，４種のｄＮＴＰに異なる蛍光体を標識し，それらｄＮＴＰすべてが標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成し，それを前記と同様操作で蛍光検出することで，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定することも可能である。また，高い粘性のバッファ溶液の使用や泳動時の印加電圧を小さくすることにより，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の泳動速度を遅くする事ができ，高感度に蛍光検出することが可能となる。本実施例ではＦＲＥＴの供与体としてＱｄｏｔを使用したが蛍光体であっても良い。また，図８では２つのＤＮＡ断片を同時に計測する例を示しているが，１つであってもよいし，また３以上のＤＮＡ断片を同時に計測しても良い。
【実施例３】
【００４５】
ナノポアの蛍光検出計測によるＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。
図１２は，本実施例で使用するナノポア装置の概略図である。レーザ光源３０１，フィルタ３０８，レーザ光のナノポア装置への照射位置およびナノポア薄膜の構成以外はすべて実施例２と同等である。ナノポア薄膜２１８を石英ガラスで作製し，表面を石英よりも低い屈折率の樹脂（例えばフロリナート）でコーティングする。この時，ナノポア近傍の鋭利な先端部２２０の樹脂を剥離しておく。レーザ光源（波長６３３ｎｍ）３０１より射出したレーザ光３０２は，集光レンズ３０４で集光され，ナノポア薄膜側面３１２に照射される。この時，レーザ光３０２はナノポア薄膜２１８内を全反射しながら伝播するが，先端部２２０は樹脂コーティングされていないため，両溶液槽内を満たすバッファ溶液に，近接場光として僅かに染み出す。レーザ光３０２はナノポア薄膜２１８内全体を全反射しながら伝播するため，すべての先端部２２０で近接場が生じる。ナノポア２０５近傍で発光した発光蛍光は，検出窓３０６を介して対物レンズ３０７によって集光され，フィルタ３０８により波長６６０ｎｍから７００ｎｍ以外の波長の光がカットされ，プリズム３０９により分光され，結像レンズ３１０によってＣＣＤ３１１上に結像される。ＣＣＤ３１１のデータは，データ処理手段４００に格納される。図１２では２つのＤＮＡ断片を同時に計測する例を示しているが，１つであってもよいし，また３以上のＤＮＡ断片を同時に計測しても良い。
【００４６】
実施例２と同等の方法で，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成および蛍光体１１６が標識されていない鎖の３’末端に標識されたＤＩＧに直径が３ｎｍよりも大きなビーズが標識された抗ＤＩＧ抗体１１８を結合させる操作を行う。
【００４７】
２本鎖ＤＮＡ断片１１７に抗ＤＩＧ抗体１１８を標識した後に，レーザ光源３０１よりレーザ光３０２を発振し，先端部２２０に近接場光を生成する。次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，抗ＤＩＧ抗体１１８標識２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させる。この泳動間に先端部２２０近傍の近接場光内を２本鎖ＤＮＡ断片１１７に標識されている蛍光体１１８が通過すると蛍光体１１８が発光する。この発光をＣＣＤ３１１で検出し，検出された信号強度の時間的変動から，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を算出できる。次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，２本鎖ＤＮＡ断片１１７を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に前記発光をＣＣＤ３１１で検出する。前記泳動ならびに蛍光検出を繰返す事により，蛍光体１１８の２本鎖ＤＮＡ断片１１７の標識位置を複数回計測でき，高精度な位置算出が可能となる。４種類の異なるｄＮＴＰに蛍光体が標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７に対して前記蛍光体標識位置検出の操作を行い，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定する。
【００４８】
前記往復運動計測における電圧極性の切替えは，ある一定時間で自動切替できるよう電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。制御部は，データ処理手段中４００に設けておけばよい。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。
【００４９】
本実施例では１種類の蛍光体のみを使用したが，４種のｄＮＴＰに異なる蛍光体を標識し，それらｄＮＴＰすべてが標識された２本鎖ＤＮＡ断片１１７を生成し，それを前記と同様操作で蛍光検出することで，ターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列を決定することも可能である。また，高い粘性のバッファ溶液の使用や泳動時の印加電圧を小さくすることにより，２本鎖ＤＮＡ断片１１７の泳動速度を遅くする事ができ，高感度に蛍光検出することが可能となる。
【実施例４】
【００５０】
つづいて，ハイブリダイゼーションベースのＤＮＡ分子の塩基配列決定方法を説明する。実施例１と同等の方法で５’末端にストレプトアビジンが結合したターゲットＤＮＡ分子１０１が含まれたＤＮＡ断片１０６を生成する。
【００５１】
図１３に本実施例で使用するナノポア装置の概略図を示す。ナノポア装置は，第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３，両溶液槽を分割するナノポア薄膜２２１で構成される。両溶液槽には，溶液を導入する導入口２０６，２０７および溶液を排出する排出口２０８，２０９がそれぞれ具備されている。ナノポア薄膜２２１を介して両溶液槽間で電圧勾配を設けるために，両溶液槽には電極２１０，２１１が具備されており，前記電極２１０と２１１は極性可変の電圧源２１２におよび電流計２１３に接続されている。ナノポア薄膜２２１は，直径３ｎｍのナノポア２０５が形成されたＳｉ３Ｎ４薄膜で構成されている。温調ユニット３１３によって第一溶液槽２０２および第二溶液槽２０３内の溶液の温度を２０℃から１００℃まで調節できる。電圧源２１２の制御，温調ユニット３１３の制御，電流計２１３の電流値の取得，得られたデータの処理は，データ処理手段４００によって行われる。
【００５２】
前記方法で得られたＤＮＡ断片１０６をバッファ溶液に混合し導入口２０６より第一溶液槽２０２に，バッファ溶液のみを導入口２０７より第二溶液槽２０３に導入する。電極２１０が陰極，電極２１１が陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，ＤＮＡ断片１０６を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に泳動させる。前記電圧印加と同時に電流計２１３によって電流を計測する。ストレプトアビジン１０５の大きさは５ｎｍ程度であるため直径３ｎｍのナノポアは通過できず，ＤＮＡ断片１０６は３’末端（ストレプトアビジン１０５が標識されていない末端）よりナノポア２０５に導入される。ＤＮＡ断片１０６がナノポア２０５に導入されると電流値は減少する。先述したように，ストレプトアビジン１０５の大きさはナノポア２０５の直径よりも大きいため，ストレプトアビジン１０５がナノポア２０５を通過する直前で，ＤＮＡ断片１０６の第二溶液槽２０３への移動が止まる。前記電流の減少を確認した後に，導入口２０７よりＢｉｏｔｉｎ ３’Ｅｎｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを第二溶液槽２０３に導入し，ＤＮＡ断片１０６の３’末端にビオチン１１３を標識する。ビオチン標識後に，導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のビオチンを第二溶液槽２０３より除去する。ストレプトアビジンを含んだ溶液を導入口２０７より導入し，前記ＤＮＡ断片１０６の３’末端に標識されたビオチン１１３にストレプトアビジン１１４を結合させ，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を生成する。導入口２０７よりバッファのみを導入し，未反応のストレプトアビジンを第二溶液槽２０３より除去する。
【００５３】
アレイ型ＤＮＡ断片１１５生成後に，導入口２０６および２０７より６塩基から構成される既知配列プローブ１１９を両溶液槽に導入し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション反応後に，導入口２０６および２０７よりバッファのみを導入し，未反応の既知配列プローブ１１９を両溶液槽２０３より除去する。電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させ，次いで，電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。前記電圧極性の切替えのタイミングは，ある一定時間で自動切替できるように電圧源２１２を制御する。前記一定時間の設定は可変である。ストッパ分子がナノポアに近接するとナノポアを通過する電流の減少が計測できるため，前記電流の減少を引き金に電圧極性の切替えを行っても良い。前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５の泳動間に電流計２１３より封鎖電流を計測する。計測された封鎖電流の時間的変動から，既知配列プローブ１１９のアレイ型ＤＮＡ断片１１５へのハイブリダイゼーションした位置を算出できる。
【００５４】
次いで，電圧印加を停止し，温調ユニット３１３を用いて第一溶液槽２０２，第二溶液槽２０３内の溶液の温度を９５℃に一定時間加温し，熱変性により前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５から既知配列プローブ１１９を分離する。導入口２０６および２０７からバッファのみを導入し，既知配列プローブ１１９を両溶液槽より除去する。両溶液槽の温度を４０℃に冷やし，導入口２０６および２０７から前記既知配列プローブ１１９とは異なる配列を持つ既知配列プローブを両溶液槽に導入し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション反応後に，導入口２０６および２０７よりバッファのみを導入し，未反応の前記既知配列プローブを両溶液槽より除去する。電極２１０を陽極に，電極２１１を陰極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第二溶液槽２０３から第一溶液槽２０２に一定時間泳動させ，次いで，電極２１０を陰極に，電極２１１を陽極になるように電圧源２１２により電圧を印加し，アレイ型ＤＮＡ断片１１５を第一溶液槽２０２から第二溶液槽２０３に一定時間泳動させる。この泳動間に電流計２１３より封鎖電流を計測する。
【００５５】
既知配列プローブのアレイ型ＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーション，アレイ型ＤＮＡ断片の泳動，封鎖電流計測，熱変性による既知配列プローブのアレイ型ＤＮＡ断片から分離を，異なる配列の既知配列プローブで４ｎ回（ｎは既知配列プローブの塩基長であり，本実施例では６となる）繰返し操作し，得られた各既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置のデータをコンピュータアルゴリズムを使ってターゲットＤＮＡ分子１０１の塩基配列データに変換することが可能となる。具体的な方法を，図１４を用いて説明する。ターゲットＤＮＡ１０１に対して，既知配列プローブ１１９をハイブリダイゼーションさせ，ナノポアを通過させて封鎖電流を計測すると，封鎖電流値の波形１２３が観測される。これを前述したような方法で繰返し計測を行い，既知配列プローブ１１９がターゲットＤＮＡ１０１どの位置にハイブリダイゼーションしたのかを予測する。前記操作を既知配列プローブ１２０，１２１，１２０で行い，得られた各既知配列プローブのターゲットＤＮＡ１０１へのハイブリダイゼーション位置を重ねる事で，ターゲットＤＮＡ１０１と相補的な配列を導き出すことができ，最終的にターゲットＤＮＡ１０１の配列データを得られる。
【００５６】
本発明を利用することにより，ターゲットＤＮＡ分子の増幅無く，また，複数のナノポアを用いること無く，ハイブリダイゼーションベースのターゲットＤＮＡ分子塩基配列決定が可能となる。
【００５７】
本実施例では，既知配列のプローブの長さは６塩基としている。既知配列プローブの長さが長いと，プローブ製作のコストの上昇やミスハイブリダイゼーションの増加が起こる。また，既知配列プローブの長さが短いと，計測分解能を上げないと，正確なプローブのハイブリダイゼーションの位置を計測できない。そのため，既知配列プローブの長さは３〜１０塩基程度が望ましい。
【００５８】
既知配列プローブのターゲットＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーション位置を高精度に検出するために，封鎖電流計測の際に，電極２１０と２１１の極性を繰返し変化させて，複数回封鎖電流を計測しても良い。
【００５９】
計測終了後にヌクレアーゼや酸などを用いてアレイ型ＤＮＡ断片１１５を切断し，両溶液槽から前記アレイ型ＤＮＡ断片１１５を除去する事により，ナノポア薄膜を再利用しても良い。
【００６０】
既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出を，既知配列プローブの一部に蛍光体を標識し，実施例２や実施例３で示した蛍光検出を用いても良い。
【００６１】
既知配列プローブのハイブリダイゼーション位置の検出を封鎖電流では無く，トンネル電流や蛍光検出することにより複数種のターゲット分子の同時計測が簡便に行え，スループットの向上が図ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
ＤＮＡシーケンサ
【符号の説明】
【００６３】
１０１：ターゲットＤＮＡ分子，１０２：ビオチン，１０３：合成プローブ，１０４：端面，１０５：ストレプトアビジン，１０６：ＤＮＡ断片，１０７：ベクター，１０８：制限酵素サイト，１０９：制限酵素サイト，１１０：合成プローブ，１１１：合成プローブ，１１２：切断断片，１１３：ビオチン，１１４：ストレプトアビジン，１１５：アレイ型ＤＮＡ断片，１１６：蛍光体，１１７：２本鎖ＤＮＡ断片，１１８：ビーズ標識抗ＤＩＧ抗体，１１９：既知配列プローブ，１２０：既知配列プローブ，１２１：既知配列プローブ，１２２：既知配列プローブ，１２３：封鎖電流値の波形，１２４：封鎖電流値の波形，１２５：封鎖電流値の波形，１２６：封鎖電流値の波形，２０２：第一溶液槽，２０３：第二溶液槽，２０４：ナノポア薄膜，２０５：ナノポア，２０６：導入口，２０７：導入口，２０８：排出口，２０９：排出口，２１０：電極，２１１：電極，２１２：電圧源，２１３：電流計，２１４：電流計，２１５：電圧源，２１６：電極，２１７：電極，２１８：ナノポア薄膜，２１９：Ｑｄｏｔ，２２０：先端部，２２１：ナノポア薄膜，３０１：レーザ光源，３０２：レーザ光，３０３：ミラー，３０４：集光レンズ，３０５：照射窓，３０６：検出窓，３０７：対物レンズ，３０８：フィルタ，３０９：プリズム，３１０：結像レンズ，３１１：ＣＣＤ，３１２：ナノポア薄膜側面，３１３：温調ユニット，４００：データ処理装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の溶液槽と、第２の溶液槽と、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切りナノポアを備えた薄膜とを有する装置を用い、測定対象のバイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する方法であって、
前記ナノポアよりも大きな第１の分子を一端に結合した前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する工程と、
前記バイオポリマーを前記ナノポアを通して前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽に移動させる工程と、
前記第２の溶液槽に、前記ナノポアよりも大きな第２の分子を導入し、前記バイオポリマーの他端に結合させる工程と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通して移動させる工程と、
前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは核酸であり、核酸を構成する塩基配列を決定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間の電流変化を、前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号として測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記ナノポアを通過する前記バイオポリマーを挟むように設けられた電極に流れる電流変化を、前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号として測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは特定の塩基を標識した核酸であって、前記バイオポリマーを移動させながら光を照射し、標識からの発光の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは一本鎖核酸であって、前記第１，２の溶液槽のうち少なくとも一方に既知配列プローブを導入する工程を有し、前記１本鎖核酸の移動に伴い前記１本鎖核酸に結合した前記既知配列プローブの有無の信号の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項７】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽間で電気的な勾配をつけることにより、前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽間で移動させることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１又は/及び第２の分子はストレプトアビジンであることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１又は/及び第２の分子はDIG−抗DIG抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項１０】
ナノポアを有する薄膜を備えた装置を用い、前記ナノポアの大きさよりも大きく、測定対象のバイオポリマーに結合させる分子を導入するバイオポリマー決定システムであって、
前記装置は、前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と、
前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と、
前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と、
前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定システムであって、前記検出手段は、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に設けられた電極であって、電流の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１２】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記バイオポリマーは特定のモノマーが蛍光標識され、前記装置は、前記ナノポアを通過する前記バイオポリマーに対して光を照射する光源を有し、前記前記検出手段は、光の照射による発光を検出することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１３】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定システムであって、前記バイオポリマーは一本鎖核酸であって、既知プローブのセットを備え、前記装置は、前記第１，２の溶液槽のうち少なくとも一方に前記既知配列プローブを導入する手段を有し、前記検出手段は、前記１本鎖核酸の移動に伴い前記１本鎖核酸に結合した前記既知配列プローブの有無の信号の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１４】
ナノポアを有する薄膜を備えた装置と、
前記ナノポアの大きさよりも大きく、測定対象のバイオポリマーに結合させる分子とを有するバイオポリマー決定キットであって、
前記装置は、
前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と、
前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と、
前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と、
前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記分子は、ストレプトアビジンであることを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記分子は、DIG−抗DIG抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【請求項１】
第１の溶液槽と、第２の溶液槽と、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切りナノポアを備えた薄膜とを有する装置を用い、測定対象のバイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する方法であって、
前記ナノポアよりも大きな第１の分子を一端に結合した前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する工程と、
前記バイオポリマーを前記ナノポアを通して前記第１の溶液槽から前記第２の溶液槽に移動させる工程と、
前記第２の溶液槽に、前記ナノポアよりも大きな第２の分子を導入し、前記バイオポリマーの他端に結合させる工程と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通して移動させる工程と、
前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは核酸であり、核酸を構成する塩基配列を決定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項３】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間の電流変化を、前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号として測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記ナノポアを通過する前記バイオポリマーを挟むように設けられた電極に流れる電流変化を、前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号として測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは特定の塩基を標識した核酸であって、前記バイオポリマーを移動させながら光を照射し、標識からの発光の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記バイオポリマーは一本鎖核酸であって、前記第１，２の溶液槽のうち少なくとも一方に既知配列プローブを導入する工程を有し、前記１本鎖核酸の移動に伴い前記１本鎖核酸に結合した前記既知配列プローブの有無の信号の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項７】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽間で電気的な勾配をつけることにより、前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽間で移動させることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１又は/及び第２の分子はストレプトアビジンであることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオポリマー決定方法において、前記第１又は/及び第２の分子はDIG−抗DIG抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とするバイオポリマー決定方法。
【請求項１０】
ナノポアを有する薄膜を備えた装置を用い、前記ナノポアの大きさよりも大きく、測定対象のバイオポリマーに結合させる分子を導入するバイオポリマー決定システムであって、
前記装置は、前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と、
前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と、
前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と、
前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定システムであって、前記検出手段は、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間に設けられた電極であって、電流の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１２】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記バイオポリマーは特定のモノマーが蛍光標識され、前記装置は、前記ナノポアを通過する前記バイオポリマーに対して光を照射する光源を有し、前記前記検出手段は、光の照射による発光を検出することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１３】
請求項１０に記載のバイオポリマー決定システムであって、前記バイオポリマーは一本鎖核酸であって、既知プローブのセットを備え、前記装置は、前記第１，２の溶液槽のうち少なくとも一方に前記既知配列プローブを導入する手段を有し、前記検出手段は、前記１本鎖核酸の移動に伴い前記１本鎖核酸に結合した前記既知配列プローブの有無の信号の時間変化を測定することを特徴とするバイオポリマー決定システム。
【請求項１４】
ナノポアを有する薄膜を備えた装置と、
前記ナノポアの大きさよりも大きく、測定対象のバイオポリマーに結合させる分子とを有するバイオポリマー決定キットであって、
前記装置は、
前記薄膜によって区切られた第１及び第２の溶液槽と、
前記バイオポリマーを前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との間で前記ナノポアを通じて移動させる駆動手段と、
前記分子が前記測定対象のバイオポリマーの一方に結合されたバイオポリマーを前記第１の溶液槽に導入する手段と、
前記ナノポアを通過した前記バイオポリマーの他端に結合させる前記分子を前記第２の溶液槽に導入する手段と、
前記駆動手段による前記バイオポリマーの移動に伴い発生する信号を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出した信号の時間変化を測定し、前記信号をバイオポリマーを構成するモノマーの種類に応じたデータとして算出する算出し、前記バイオポリマーを構成するモノマーの並びを決定する算出手段とを有することを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記分子は、ストレプトアビジンであることを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のバイオポリマー決定キットであって、前記分子は、DIG−抗DIG抗体結合により前記バイオポリマーに結合されるビーズであることを特徴とするバイオポリマー決定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１０−２３０６１４（Ｐ２０１０−２３０６１４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８０８６７（Ｐ２００９−８０８６７）
【出願日】平成２１年３月３０日（２００９．３．３０）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３０日（２００９．３．３０）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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