ナノ型乳酸菌
【課題】Ｔｈ１誘導に好ましい粒子径を有し、ＩＮＦ−αの産生能に優れるとともに、水への分散性に優れた乳酸菌を提供すること。
【解決手段】乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
【解決手段】乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示細胞からのインターフェロンα産生能を増強する作用を有するナノ型乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究では、ナイーブＴ細胞（以下、Ｔｈ０と略す）は、機能的にＩ型Ｔ細胞（以下、Ｔｈ１と略す）とＩＩ型Ｔ細胞（以下、Ｔｈ２と略す）に分化することが知られている。
Ｔｈ１細胞による免疫応答は、細胞性免疫を誘導し、マクロファージやリンパ球など単核細胞中心の食菌処理が起こる。一方、Ｔｈ２細胞による免疫応答は、液性免疫を誘導し、抗体による殺菌処理が起こる。Ｔｈ１型サイトカインはＴｈ２を抑制し、逆にＴｈ２型サイトカインはＴｈ１を抑制し、この２つは免疫全体のバランスを保つために互いに関係し合っている。
【０００３】
インターフェロンα（ＩＦＮ−α）は、ウイルスや、結核菌、サルモネラ菌、リステリア菌、らい菌といった細胞内寄生性細菌、クリプトコッカスのような細胞内寄生性真菌による感染時に、樹状細胞（抗原提示細胞）から分泌されるサイトカインである。
また、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞から分泌されるサイトカインで、ガン細胞を直接攻撃するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）や、ラック細胞（ＬＡＫ細胞）、キラーＴ細胞（ＣＴＬ細胞）を活性化したり、ＩＦＮ−γの産生を増強したりする非常に強力な免疫活性物質として知られている。
【０００４】
これらのＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２は、ともにＴｈ１細胞を誘導するサイトカインであるが、抗原提示細胞に発現している受容体（ＴＲＬ：Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の違い（ＩＬ−１２の場合：ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９；ＩＦＮ−αの場合：ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）が見られる。
【０００５】
ところで、抗原提示細胞からのＩＦＮ−α産生を増強する乳酸菌またはその構成物については、ラクトバチルス・ブレビス菌粉末（特許文献１：特開平６−２０６８２６号公報参照）、エンテロコッカス属に属する乳酸菌またはその処理物（特許文献２：特開平８−２５９４５０号公報参照）、ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３の構成抽出物（特許文献３：特開平９−１８８６２７号公報参照）等が報告されている。
【０００６】
通常であれば、ＩＦＮ−α産生能が高い菌株を選択するのが自然であり、活性が低い菌株をあえて活性が高い菌株に変える必要はなく、またそれを試みようとも思わない。
しかし、長年、ラクトバチルス・ブレビス菌を市場に提供してきた事業者にとっては、乳酸菌のＩＦＮ−α産生能を増強することは切実な願いである。
【０００７】
これまで乳酸菌は、発酵乳あるいはヨーグルトの形態で摂取するのが常態である。口から摂取される抗原は、パイエル板でＭ細胞の貪食によって取り込まれる。
そこで、どれくらいまでの大きさであればパイエル板から取り込まれるのかといった関心から、粒子の大きさ（粒子径）とパイエル板への取り込みの関係についてこれまで多くの研究がなされてきた。
【０００８】
その結果、粒子の大きさが１０μｍを超えるとＭ細胞による貪食は著しく低くなり（非特許文献１参照）、パイエル板を通過する粒子の最大径は、粒子の材質がポリラクタイドの場合には１０μｍ（非特許文献２参照）、ポリスチレンの場合には１５μｍ（非特許文献３参照）、生分解性ポリ乳酸の場合には２１μｍ（非特許文献４参照）ということが明らかとなっている。
これらの結果から、パイエル板を通過できる粒子の大きさは高々２０μｍ程度ということがわかる。
【０００９】
また、抗原を感作させた生分解性ポリ乳酸ビーズをラットに経口投与した実験によれば、Ｔｈ２誘導によって抗原特異抗体が産生される率が最も高くなる粒子径は、ＩｇＧの場合４μｍ、ＩｇＡの場合は７μｍであり、Ｔｈ２誘導に好ましい粒子径は３〜７μｍ程度であることがわかる（非特許文献４参照）。
しかしながら、Ｔｈ１誘導に好ましい粒子径は現在までのところ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２０６８２６号公報
【特許文献２】特開平８−２５９４５０号公報
【特許文献３】特開平９−１８８６２７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tabata Y、Ikada Y. Adv Polym Sci 94：107-141， 1990.
【非特許文献２】Eldridge JH. et al. J Controlled Rel 11：205-214， 1990.
【非特許文献３】Eldridge JH. et al. Molec Immun 28：187-194， 1991.
【非特許文献４】Tabata Y. et al. Vaccine 14：1677-1685， 1996.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、Ｔｈ１誘導に好ましい粒子径を有し、ＩＮＦ−αの産生能に優れるとともに、水への分散性に優れた乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、長寿と関係のある乳酸菌を、京都の酸茎漬、長野のすんき漬、グルジア地方のマリアーミとマッツォーニライク、モンゴルの馬乳酒、および各種発酵乳製品より分離し、乳酸菌の大きさと抗原提示細胞からのＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能の関係を解析した。
その結果、図１Ａに示されるように、乳酸菌刺激による抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生能は、乳酸菌の大きさが１μｍ以下まで小さくなると高くなった（参考例１参照）。
一方、ＩＦＮ−α産生能の場合においても、図１Ｂに示すように、乳酸菌の大きさが１μｍ以下まで小さくなると高くなった（参考例１参照）。
【００１４】
しかし、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能には負の相関を示す菌株も認められた（図２参照）。例えば、ＥＦ、ＫＨ１、ＫＨ３といった菌株ではＩＬ−１２産生能が高くＩＦＮ−α産生能が低い、逆にＬＬ１２、ＭＬ４といった菌株ではＩＬ−１２産生能が低くＩＦＮ−α産生能が高い。
一方、ＳＮＫはＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能が相対的にともに高いといった特徴が認められた。
これは、先行技術（特願２００７−３０３２４号明細書）からは想到し得ない知見で、おそらく、抗原提示細胞に発現する受容体の乳酸菌に対する認識の違いによると推察される。
【００１５】
その結果、ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３（表１および図１−２中、ＬＢＲで表示）のように、粒子径が９μｍ近くもある乳酸菌においては、それが１μｍ程度のものに比べて、ＩＦＮ−α産生能が著しく劣るということが明らかとなった。
【００１６】
そこで、さらに本発明者は、上記課題を解決すべく、乳酸菌体の粒度分布における最頻値を小さくし、しかも菌体同士の再凝集を防止するための条件を鋭意検討した。
その過程で、乳酸菌の表面が正（プラス）に荷電していることに着眼し、培養工程および加工工程におけるｐＨを中性域に調整することで、乳酸菌体の粒度分布における最頻値（以下、単に粒度という場合もある）が１．０μｍ以下にまで小さくなることを見出した。
一般的に、乳酸菌が培養時における諸条件によってその形態が変化することは知られているが、培養工程および加工工程におけるｐＨを制御することでその大きさを１．０μｍ以下に調整できるという知見は、当業者のあいだではこれまで知られていない。
【００１７】
また、本発明者は、当該菌体をもって抗原提示細胞からのＩＦＮ−α産生能を著しく増強させることができることも見出した。
以上のように、本発明者は、通常の粒度が１．０μｍより大きな乳酸菌に対しても、中性域のｐＨでの培養および加工処理を通して、乳酸菌体の粒度を１．０μｍ以下にまで調整し得ること、およびこの乳酸菌が抗原提示細胞からのＩＦＮ-α産生能を増強させ、免疫賦活作用を向上し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
なお、最近乳酸菌の死菌体を濃縮した乾燥粉末を市場で見受けるようになった。これは、少量で多数量の乳酸菌を摂取可能とすることを目的とするものである。
しかし、このような乾燥粉末における乳酸菌本来の粒度が１．０μｍ以下であったとしても、濃縮した菌体を乾燥しただけの粉末であっては、これを水に入れた場合に粒子同士が吸着・凝集し、かたまり（塊）となってしまう（参考例２参照）。
そもそも、通常の培養条件では、粒度が１．０μｍ以下の乳酸菌は、存在する可能性が低い（表１参照）。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下のナノ型乳酸菌を提供する。
１． 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、
前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
２． 前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる１のナノ型乳酸菌の菌体。
３． 前記培養工程における培地がエネルギー源としてブドウ糖を含有し、前記ブドウ糖が消費された時点を培養終点として得られる１または２のナノ型乳酸菌の菌体。
４． 前記加工工程において、分散剤または賦形剤を乳酸菌に添加した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる１のナノ型乳酸菌の菌体。
５． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
６． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体、または５の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
７． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有するインターフェロンα産生能増強剤。
また、本発明は、以下のナノ型乳酸菌が関連する。
［１］ 粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
［２］ 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる［１］のナノ型乳酸菌の菌体。
［３］ 前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる［２］のナノ型乳酸菌の菌体。
［４］ 前記乳酸菌の培養工程における培地にブドウ糖を含有させる［２］または［３］のナノ型乳酸菌の菌体。
［５］ ｐＨを中性域に調整した培地と、菌とを含む培養液に分散剤または賦形剤を添加して分散した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる［１］のナノ型乳酸菌の菌体。
［６］ ラクトバチルス属乳酸菌である［１］〜［５］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体。
［７］ 前記ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビスである［６］のナノ型乳酸菌の菌体。
［８］ 前記ラクトバチルス・ブレビスの菌株が、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３である［７］のナノ型乳酸菌の菌体。
［９］ ［１］〜［８］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
［１０］ ［１］〜［８］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体、または［９］の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
［１１］ 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整することを特徴とする［１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
［１２］ 前記培地のｐＨを５〜８に調整する［１１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
［１３］ ｐＨを中性域に調整した培地と、菌とを含む培養液に分散剤または賦形剤を添加して分散した後、凍結乾燥または噴霧乾燥する［１１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、通常の粒度が１μｍより大きな乳酸菌に対しても、中性域のｐＨでの培養および加工処理を通して、乳酸菌体の粒度を１．０μｍ以下にまで調整することができる。
このようにして得られたナノ型乳酸菌の菌体は、抗原提示細胞からのＩＦＮ-α産生能を増強させ、免疫賦活作用を向上し得るため、非常に有用な菌体であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】乳酸菌の菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能の関係を示した図である。
【図２】乳酸菌刺激によるＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能の相関を示した図である。
【図３】菌体粒度を比較した図である。
【図４】乳酸菌粉末の粒子径分布（Ａ：頻度％，Ｂ：積算％）を示した図である。
【図５】ナノ型乳酸菌ラブレの菌体粒度とＩＦＮ−α産生能を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係るナノ型乳酸菌の菌体は、粒度分布における最頻値（粒度）が１．０μｍ以下のものである。
本発明において、「粒度分布における最頻値」は、菌の大きさを表す指標となる値であって、菌体の粒子径を測定したときの粒度分布における相対頻度が最大となる粒子径をいう。
【００２３】
本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」の原料となる乳酸菌の具体例としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌ．ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）等のビフィドバクテリウム属細菌などが挙げられる。
【００２４】
本発明のナノ型乳酸菌の菌体の形態は、生菌でも死菌でもよいが、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるため、それ以上形態変化を起こさない死菌が好ましい。
【００２５】
乳酸菌は、培養時の生育環境が劣悪になると、そのストレスで形態が変化することが知られている。
そこで本発明では、培養および加工条件を制御することで、乳酸菌の形態が一定になるように維持しながら乳酸菌を増殖させて、上述した粒度分布における最頻値を有するナノ型乳酸菌を製造する。
具体的には、先に述べたとおり、乳酸菌の表面が正（陽、プラス）に荷電していることに着眼し、培養工程および加工工程におけるｐＨを中性域に調整して膜を安定化することで、分裂菌が接合したままの双菌状態および菌同士の再吸着を防止するものである。
【００２６】
ここで、「ｐＨを中性域に調整」する方法としては、乳酸等の酸や水酸化ナトリウム等のアルカリでの中和が挙げられる。
なお、本発明における「培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整」するとは、培養工程のｐＨを中性域に調整しておくことのみならず、培養終了後の菌体滅菌、洗浄、濃縮といった工程（加工工程）におけるｐＨも中性域に調整することを意味している。
培養工程および加工工程におけるｐＨは、５〜８が好ましく、５．５〜７．５がより好ましい。
【００２７】
また、培地の栄養組成におけるエネルギー源としては、エネルギー利用性が最も高いブドウ糖が好ましく、その添加量は培地中に５〜１０質量％程度とすることが好ましい。
なお、ブドウ糖が消費された時点を培養終点とすることで、栄養枯渇から来るストレスによる菌形態の変化を防止することができる。
【００２８】
さらに、本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」は分散処理されたものであることが好ましい。
分散処理の手法としては、特に限定されるものではないが、例えば、菌の培養液を湿式で１５０ｋｇｆ／ｃｍ2（１．５ＭＰａ）程度の高圧ホモゲナイザーで分散する方法が挙げられる。
この場合、予め公知の分散剤または賦形剤を培養液に添加しておくことが好ましく、これにより、菌体の再凝集を効率的に防止することができる。
使用する分散剤および賦形剤の添加量は、菌体の性状によって変化するが、質量換算で菌体に対して１〜１００倍量が好ましく、２〜２０倍量がより好ましい。
好適な分散剤および賦形剤としては、トレハロース、デキストリン、スキムミルク等が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」を最終的に粉末として得る場合には、公知の分散剤・賦形剤等で菌体が再凝集しないような処理を施してから、凍結乾燥や噴霧乾燥することが好ましい。これにより、水への分散性に優れた菌体粉末を得ることができる。
【００３０】
以上説明した本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、粒度が１．０μｍ以下のナノメータ（ｎｍ）サイズにまで微細化されたものである。
また、この菌体は、上記手法によって乾燥粉末とし、当該粉末を生理的消化液に再懸濁した場合の菌体粒度がやはり１．０μｍ以下を保つ。なお、生理的消化液とは、公知の方法で調製された人工胃液あるいは腸液を意味する。
【００３１】
本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、そのまま製品とすることもできるが、一般には、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合したり、更にフレーバーを添加したりして最終製品される。
この添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。
【００３２】
より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類；ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤などが挙げられる。その他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味のＴｈ１誘導剤を得ることができる。
【００３３】
また、フレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から菌体中に０．０５〜０．５質量％、特に０．１〜０．３質量％程度が好ましい。
【００３４】
以上説明した本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることもできる。具体的には、医薬的に受容な塩、賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤等とともに、医薬品あるいは食品の製造分野における公知の方法によって、飲料、顆粒、錠剤、カプセル剤等の種々の形態として製品化することができる。
【００３５】
また、本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、健康食品に利用することができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味する。その形態は、液体、半固形、固形のいずれでもよく、具体的には、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類；清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。
【００３６】
さらに、本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、ローション（化粧水）、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等種々の製品形態で皮膚外用剤に利用することもできる。
【００３７】
なお、本発明のナノ型乳酸菌の菌体には、下記に例示されるような化粧品、医薬部外品、医薬品において通常用いられる各種成分や、添加剤を必要に応じて適宜配合することができる。
すなわち、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７（アイエスピー・ジャパン（株））等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ（ＤＳＭニュートリション ジャパン（株））、サンガードＢ（（株）資生堂）等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ（（有）湘南ケミカルサービス）等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ（ＤＳＭニュートリション ジャパン（株）等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸およびその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｂ１５）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ２、Ｄ３）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸およびその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素などを適宜配合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、参考例および実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。なお、乳酸菌の粒子径は粒度分布測定装置（（株）島津製作所、ＳＡＬＤ−３１００）で測定した。また、マクロファージから乳酸菌刺激によって産生されるＩＬ−１２およびＩＦＮ−αは市販されているＥＬＩＳＡキットで測定した。
【００３９】
［参考例１］
〔死菌体の調製〕
表１に示されるように、長寿と関係のある乳酸菌を、京都の酸茎漬、長野のすんき漬、グルジア地方のマリアーミとマッツォーニライク、モンゴルの馬乳酒、各種発酵乳製品より分離し、ＭＲＳ培地を用いて培養時のｐＨを調整することなく３６．５℃で４８時間培養した。培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理し、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
なお、表中のＬＢＲとはラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３を指す。ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターより入手することができる。
【００４０】
〔菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能との関係〕
乳酸菌の菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能との関係を図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。
乳酸菌の大きさ（粒子径）が１μｍ程度にまで小さくなった方が、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのいずれのサイトカインも著しく産生能が増強されることが明らかとなった（表１と図１参照）。
ただし、図２に示されるように、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αとの産生能には負の相関を示す菌株が認められ、たとえばＥＦ、ＫＨ１、ＫＨ３といった菌株ではＩＬ−１２産生能が高くＩＦＮ−α産生能が低い、逆にＬＬ１２、ＭＬ４といった菌株ではＩＬ−１２産生能が低くＩＦＮ−α産生能が高い、一方でＳＮＫはＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能が相対的にともに高いといった特徴が認められた。
【００４１】
【表１】
【００４２】
［実施例１］
〔ナノ型乳酸菌ＥＦの調製〕
乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス菌株ＥＦを、５質量％ブドウ糖添加の公知の栄養培地で、２０質量％水酸化ナトリウム水溶液で培養時におけるｐＨを６．５に調整しながら３６．５℃で培養し、ブドウ糖が消費された時点を培養終点とした（培養工程）。
培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理した後、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるように調整した（加工工程）。なお、加工工程時のｐＨは６．５に保持した。
〔菌体粒度の比較〕
参考例１および実施例１で調製した乳酸菌ＥＦの菌体粒度を測定した。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、非中和培養による菌体粒度が１．２１５と１μｍより大きかったのに対し、中和培養による菌体粒度は０．７０１と１．０μｍ以下になっていることがわかる。
【００４３】
［参考例２］
〔死菌乾燥粉末の調製〕
乳酸菌本来の大きさが０．６μｍ（図４Ａ）で、選択的にサイトカインを誘導し得る２μｍ以下の粒子の積算分布が９９％（図４Ｂ）の乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス菌株ＥＦを実施例１の方法で培養し、その培養液から菌体を濃縮し、賦形剤を添加せずに噴霧乾燥して粉末とした。
〔菌体粒度の比較〕
上記で調製した粉末を、再び水に分散させた。その結果、図４Ａに示されるように、粒子径が１００μｍまでなだらかな粒度分布を示した。その内訳は、図４Ｂの積算分布に示されるように、パイエル板を通過する２０μｍまでの粒子は約５０％、Ｔｈ２細胞を誘導する３〜７μｍの粒子は約１４％、さらにＴｈ１細胞を誘導する２μｍ以下の粒子は高々１％に過ぎなかった。これではＴｈ１／Ｔｈ２応答をともに誘導する粒子が混在することになり、生理的には決して好ましい状況とは言えない。
【００４４】
さらに生体内での消化作用を想定し、これを公知の方法で調製された人工胃液または腸液で処理した場合でも、Ｔｈ１細胞を誘導する２μｍ以下の粒子の積算分布は高々１０％までしか上がらなかった（図４Ｂ）。
これではせっかくの乳酸菌本来の機能も十分に発揮されない（高々１０％程度）という結果を招くことが懸念される。
【００４５】
［実施例２］
〔ナノ型乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスの調製〕
乳酸菌ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３を、５質量％ブドウ糖添加の公知の栄養培地で、２０質量％水酸化ナトリウム水溶液で培養時におけるｐＨを６．５に調整しながら３６．５℃で培養し、グルコース消費が完了した時点を培養終点とした（培養工程）。
培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理し、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体に対して重量換算で４倍量のデキストリンを賦形剤として添加し、ミキサーで分散してから凍結乾燥して試料を調製し、これを再び菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した（加工工程）。なお、加工工程時のｐＨは６．５に保持した。
【００４６】
〔菌体粒度およびＩＦＮ−α産生能の比較〕
参考例１および実施例２で調製したラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３の菌体粒度およびＩＦＮ−α産生能を測定した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、非中和培養の場合（ＬＢＲと表示）は、菌体粒度が８．８μｍ、ＩＦＮ−α産生能が１６．８ｐｇ／ｍｌであったのに対し、中和培養の場合（ＮＡＮＯ−ＬＢＲと表示）は、菌体粒度が０．７μｍと１．０μｍ以下になり、そしてＩＦＮ−α産生能は９２．９ｐｇ／ｍｌと非中和培養の場合に比べて５．５倍に増強されていることがわかる。
【００４７】
以上の結果より、培養および加工工程におけるｐＨを中性域に調整することで、菌体粒度を１．０μｍ以下にまで微細化でき、さらに菌体に質量換算で４倍量程度の賦形剤を添加してから分散処理を施し、凍結乾燥することによって分散性に優れた菌体粉末を得ることができ、この粉体をもってマクロファージから効率よくインターフェロンαを産生させることができることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示細胞からのインターフェロンα産生能を増強する作用を有するナノ型乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究では、ナイーブＴ細胞（以下、Ｔｈ０と略す）は、機能的にＩ型Ｔ細胞（以下、Ｔｈ１と略す）とＩＩ型Ｔ細胞（以下、Ｔｈ２と略す）に分化することが知られている。
Ｔｈ１細胞による免疫応答は、細胞性免疫を誘導し、マクロファージやリンパ球など単核細胞中心の食菌処理が起こる。一方、Ｔｈ２細胞による免疫応答は、液性免疫を誘導し、抗体による殺菌処理が起こる。Ｔｈ１型サイトカインはＴｈ２を抑制し、逆にＴｈ２型サイトカインはＴｈ１を抑制し、この２つは免疫全体のバランスを保つために互いに関係し合っている。
【０００３】
インターフェロンα（ＩＦＮ−α）は、ウイルスや、結核菌、サルモネラ菌、リステリア菌、らい菌といった細胞内寄生性細菌、クリプトコッカスのような細胞内寄生性真菌による感染時に、樹状細胞（抗原提示細胞）から分泌されるサイトカインである。
また、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞から分泌されるサイトカインで、ガン細胞を直接攻撃するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）や、ラック細胞（ＬＡＫ細胞）、キラーＴ細胞（ＣＴＬ細胞）を活性化したり、ＩＦＮ−γの産生を増強したりする非常に強力な免疫活性物質として知られている。
【０００４】
これらのＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２は、ともにＴｈ１細胞を誘導するサイトカインであるが、抗原提示細胞に発現している受容体（ＴＲＬ：Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の違い（ＩＬ−１２の場合：ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９；ＩＦＮ−αの場合：ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）が見られる。
【０００５】
ところで、抗原提示細胞からのＩＦＮ−α産生を増強する乳酸菌またはその構成物については、ラクトバチルス・ブレビス菌粉末（特許文献１：特開平６−２０６８２６号公報参照）、エンテロコッカス属に属する乳酸菌またはその処理物（特許文献２：特開平８−２５９４５０号公報参照）、ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３の構成抽出物（特許文献３：特開平９−１８８６２７号公報参照）等が報告されている。
【０００６】
通常であれば、ＩＦＮ−α産生能が高い菌株を選択するのが自然であり、活性が低い菌株をあえて活性が高い菌株に変える必要はなく、またそれを試みようとも思わない。
しかし、長年、ラクトバチルス・ブレビス菌を市場に提供してきた事業者にとっては、乳酸菌のＩＦＮ−α産生能を増強することは切実な願いである。
【０００７】
これまで乳酸菌は、発酵乳あるいはヨーグルトの形態で摂取するのが常態である。口から摂取される抗原は、パイエル板でＭ細胞の貪食によって取り込まれる。
そこで、どれくらいまでの大きさであればパイエル板から取り込まれるのかといった関心から、粒子の大きさ（粒子径）とパイエル板への取り込みの関係についてこれまで多くの研究がなされてきた。
【０００８】
その結果、粒子の大きさが１０μｍを超えるとＭ細胞による貪食は著しく低くなり（非特許文献１参照）、パイエル板を通過する粒子の最大径は、粒子の材質がポリラクタイドの場合には１０μｍ（非特許文献２参照）、ポリスチレンの場合には１５μｍ（非特許文献３参照）、生分解性ポリ乳酸の場合には２１μｍ（非特許文献４参照）ということが明らかとなっている。
これらの結果から、パイエル板を通過できる粒子の大きさは高々２０μｍ程度ということがわかる。
【０００９】
また、抗原を感作させた生分解性ポリ乳酸ビーズをラットに経口投与した実験によれば、Ｔｈ２誘導によって抗原特異抗体が産生される率が最も高くなる粒子径は、ＩｇＧの場合４μｍ、ＩｇＡの場合は７μｍであり、Ｔｈ２誘導に好ましい粒子径は３〜７μｍ程度であることがわかる（非特許文献４参照）。
しかしながら、Ｔｈ１誘導に好ましい粒子径は現在までのところ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２０６８２６号公報
【特許文献２】特開平８−２５９４５０号公報
【特許文献３】特開平９−１８８６２７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tabata Y、Ikada Y. Adv Polym Sci 94：107-141， 1990.
【非特許文献２】Eldridge JH. et al. J Controlled Rel 11：205-214， 1990.
【非特許文献３】Eldridge JH. et al. Molec Immun 28：187-194， 1991.
【非特許文献４】Tabata Y. et al. Vaccine 14：1677-1685， 1996.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、Ｔｈ１誘導に好ましい粒子径を有し、ＩＮＦ−αの産生能に優れるとともに、水への分散性に優れた乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、長寿と関係のある乳酸菌を、京都の酸茎漬、長野のすんき漬、グルジア地方のマリアーミとマッツォーニライク、モンゴルの馬乳酒、および各種発酵乳製品より分離し、乳酸菌の大きさと抗原提示細胞からのＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能の関係を解析した。
その結果、図１Ａに示されるように、乳酸菌刺激による抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生能は、乳酸菌の大きさが１μｍ以下まで小さくなると高くなった（参考例１参照）。
一方、ＩＦＮ−α産生能の場合においても、図１Ｂに示すように、乳酸菌の大きさが１μｍ以下まで小さくなると高くなった（参考例１参照）。
【００１４】
しかし、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能には負の相関を示す菌株も認められた（図２参照）。例えば、ＥＦ、ＫＨ１、ＫＨ３といった菌株ではＩＬ−１２産生能が高くＩＦＮ−α産生能が低い、逆にＬＬ１２、ＭＬ４といった菌株ではＩＬ−１２産生能が低くＩＦＮ−α産生能が高い。
一方、ＳＮＫはＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能が相対的にともに高いといった特徴が認められた。
これは、先行技術（特願２００７−３０３２４号明細書）からは想到し得ない知見で、おそらく、抗原提示細胞に発現する受容体の乳酸菌に対する認識の違いによると推察される。
【００１５】
その結果、ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３（表１および図１−２中、ＬＢＲで表示）のように、粒子径が９μｍ近くもある乳酸菌においては、それが１μｍ程度のものに比べて、ＩＦＮ−α産生能が著しく劣るということが明らかとなった。
【００１６】
そこで、さらに本発明者は、上記課題を解決すべく、乳酸菌体の粒度分布における最頻値を小さくし、しかも菌体同士の再凝集を防止するための条件を鋭意検討した。
その過程で、乳酸菌の表面が正（プラス）に荷電していることに着眼し、培養工程および加工工程におけるｐＨを中性域に調整することで、乳酸菌体の粒度分布における最頻値（以下、単に粒度という場合もある）が１．０μｍ以下にまで小さくなることを見出した。
一般的に、乳酸菌が培養時における諸条件によってその形態が変化することは知られているが、培養工程および加工工程におけるｐＨを制御することでその大きさを１．０μｍ以下に調整できるという知見は、当業者のあいだではこれまで知られていない。
【００１７】
また、本発明者は、当該菌体をもって抗原提示細胞からのＩＦＮ−α産生能を著しく増強させることができることも見出した。
以上のように、本発明者は、通常の粒度が１．０μｍより大きな乳酸菌に対しても、中性域のｐＨでの培養および加工処理を通して、乳酸菌体の粒度を１．０μｍ以下にまで調整し得ること、およびこの乳酸菌が抗原提示細胞からのＩＦＮ-α産生能を増強させ、免疫賦活作用を向上し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
なお、最近乳酸菌の死菌体を濃縮した乾燥粉末を市場で見受けるようになった。これは、少量で多数量の乳酸菌を摂取可能とすることを目的とするものである。
しかし、このような乾燥粉末における乳酸菌本来の粒度が１．０μｍ以下であったとしても、濃縮した菌体を乾燥しただけの粉末であっては、これを水に入れた場合に粒子同士が吸着・凝集し、かたまり（塊）となってしまう（参考例２参照）。
そもそも、通常の培養条件では、粒度が１．０μｍ以下の乳酸菌は、存在する可能性が低い（表１参照）。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下のナノ型乳酸菌を提供する。
１． 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、
前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
２． 前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる１のナノ型乳酸菌の菌体。
３． 前記培養工程における培地がエネルギー源としてブドウ糖を含有し、前記ブドウ糖が消費された時点を培養終点として得られる１または２のナノ型乳酸菌の菌体。
４． 前記加工工程において、分散剤または賦形剤を乳酸菌に添加した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる１のナノ型乳酸菌の菌体。
５． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
６． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体、または５の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
７． １〜４のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有するインターフェロンα産生能増強剤。
また、本発明は、以下のナノ型乳酸菌が関連する。
［１］ 粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
［２］ 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる［１］のナノ型乳酸菌の菌体。
［３］ 前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる［２］のナノ型乳酸菌の菌体。
［４］ 前記乳酸菌の培養工程における培地にブドウ糖を含有させる［２］または［３］のナノ型乳酸菌の菌体。
［５］ ｐＨを中性域に調整した培地と、菌とを含む培養液に分散剤または賦形剤を添加して分散した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる［１］のナノ型乳酸菌の菌体。
［６］ ラクトバチルス属乳酸菌である［１］〜［５］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体。
［７］ 前記ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビスである［６］のナノ型乳酸菌の菌体。
［８］ 前記ラクトバチルス・ブレビスの菌株が、ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３である［７］のナノ型乳酸菌の菌体。
［９］ ［１］〜［８］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
［１０］ ［１］〜［８］のいずれかのナノ型乳酸菌の菌体、または［９］の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
［１１］ 乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整することを特徴とする［１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
［１２］ 前記培地のｐＨを５〜８に調整する［１１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
［１３］ ｐＨを中性域に調整した培地と、菌とを含む培養液に分散剤または賦形剤を添加して分散した後、凍結乾燥または噴霧乾燥する［１１］のナノ型乳酸菌の菌体の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、通常の粒度が１μｍより大きな乳酸菌に対しても、中性域のｐＨでの培養および加工処理を通して、乳酸菌体の粒度を１．０μｍ以下にまで調整することができる。
このようにして得られたナノ型乳酸菌の菌体は、抗原提示細胞からのＩＦＮ-α産生能を増強させ、免疫賦活作用を向上し得るため、非常に有用な菌体であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】乳酸菌の菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能の関係を示した図である。
【図２】乳酸菌刺激によるＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能の相関を示した図である。
【図３】菌体粒度を比較した図である。
【図４】乳酸菌粉末の粒子径分布（Ａ：頻度％，Ｂ：積算％）を示した図である。
【図５】ナノ型乳酸菌ラブレの菌体粒度とＩＦＮ−α産生能を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係るナノ型乳酸菌の菌体は、粒度分布における最頻値（粒度）が１．０μｍ以下のものである。
本発明において、「粒度分布における最頻値」は、菌の大きさを表す指標となる値であって、菌体の粒子径を測定したときの粒度分布における相対頻度が最大となる粒子径をいう。
【００２３】
本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」の原料となる乳酸菌の具体例としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌ．ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）等のビフィドバクテリウム属細菌などが挙げられる。
【００２４】
本発明のナノ型乳酸菌の菌体の形態は、生菌でも死菌でもよいが、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるため、それ以上形態変化を起こさない死菌が好ましい。
【００２５】
乳酸菌は、培養時の生育環境が劣悪になると、そのストレスで形態が変化することが知られている。
そこで本発明では、培養および加工条件を制御することで、乳酸菌の形態が一定になるように維持しながら乳酸菌を増殖させて、上述した粒度分布における最頻値を有するナノ型乳酸菌を製造する。
具体的には、先に述べたとおり、乳酸菌の表面が正（陽、プラス）に荷電していることに着眼し、培養工程および加工工程におけるｐＨを中性域に調整して膜を安定化することで、分裂菌が接合したままの双菌状態および菌同士の再吸着を防止するものである。
【００２６】
ここで、「ｐＨを中性域に調整」する方法としては、乳酸等の酸や水酸化ナトリウム等のアルカリでの中和が挙げられる。
なお、本発明における「培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整」するとは、培養工程のｐＨを中性域に調整しておくことのみならず、培養終了後の菌体滅菌、洗浄、濃縮といった工程（加工工程）におけるｐＨも中性域に調整することを意味している。
培養工程および加工工程におけるｐＨは、５〜８が好ましく、５．５〜７．５がより好ましい。
【００２７】
また、培地の栄養組成におけるエネルギー源としては、エネルギー利用性が最も高いブドウ糖が好ましく、その添加量は培地中に５〜１０質量％程度とすることが好ましい。
なお、ブドウ糖が消費された時点を培養終点とすることで、栄養枯渇から来るストレスによる菌形態の変化を防止することができる。
【００２８】
さらに、本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」は分散処理されたものであることが好ましい。
分散処理の手法としては、特に限定されるものではないが、例えば、菌の培養液を湿式で１５０ｋｇｆ／ｃｍ2（１．５ＭＰａ）程度の高圧ホモゲナイザーで分散する方法が挙げられる。
この場合、予め公知の分散剤または賦形剤を培養液に添加しておくことが好ましく、これにより、菌体の再凝集を効率的に防止することができる。
使用する分散剤および賦形剤の添加量は、菌体の性状によって変化するが、質量換算で菌体に対して１〜１００倍量が好ましく、２〜２０倍量がより好ましい。
好適な分散剤および賦形剤としては、トレハロース、デキストリン、スキムミルク等が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明の「ナノ型乳酸菌の菌体」を最終的に粉末として得る場合には、公知の分散剤・賦形剤等で菌体が再凝集しないような処理を施してから、凍結乾燥や噴霧乾燥することが好ましい。これにより、水への分散性に優れた菌体粉末を得ることができる。
【００３０】
以上説明した本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、粒度が１．０μｍ以下のナノメータ（ｎｍ）サイズにまで微細化されたものである。
また、この菌体は、上記手法によって乾燥粉末とし、当該粉末を生理的消化液に再懸濁した場合の菌体粒度がやはり１．０μｍ以下を保つ。なお、生理的消化液とは、公知の方法で調製された人工胃液あるいは腸液を意味する。
【００３１】
本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、そのまま製品とすることもできるが、一般には、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合したり、更にフレーバーを添加したりして最終製品される。
この添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。
【００３２】
より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類；ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤などが挙げられる。その他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味のＴｈ１誘導剤を得ることができる。
【００３３】
また、フレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から菌体中に０．０５〜０．５質量％、特に０．１〜０．３質量％程度が好ましい。
【００３４】
以上説明した本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることもできる。具体的には、医薬的に受容な塩、賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤等とともに、医薬品あるいは食品の製造分野における公知の方法によって、飲料、顆粒、錠剤、カプセル剤等の種々の形態として製品化することができる。
【００３５】
また、本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、健康食品に利用することができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味する。その形態は、液体、半固形、固形のいずれでもよく、具体的には、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類；清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。
【００３６】
さらに、本発明のナノ型乳酸菌の菌体は、ローション（化粧水）、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等種々の製品形態で皮膚外用剤に利用することもできる。
【００３７】
なお、本発明のナノ型乳酸菌の菌体には、下記に例示されるような化粧品、医薬部外品、医薬品において通常用いられる各種成分や、添加剤を必要に応じて適宜配合することができる。
すなわち、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７（アイエスピー・ジャパン（株））等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ（ＤＳＭニュートリション ジャパン（株））、サンガードＢ（（株）資生堂）等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ（（有）湘南ケミカルサービス）等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ（ＤＳＭニュートリション ジャパン（株）等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸およびその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｂ１５）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ２、Ｄ３）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸およびその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素などを適宜配合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、参考例および実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。なお、乳酸菌の粒子径は粒度分布測定装置（（株）島津製作所、ＳＡＬＤ−３１００）で測定した。また、マクロファージから乳酸菌刺激によって産生されるＩＬ−１２およびＩＦＮ−αは市販されているＥＬＩＳＡキットで測定した。
【００３９】
［参考例１］
〔死菌体の調製〕
表１に示されるように、長寿と関係のある乳酸菌を、京都の酸茎漬、長野のすんき漬、グルジア地方のマリアーミとマッツォーニライク、モンゴルの馬乳酒、各種発酵乳製品より分離し、ＭＲＳ培地を用いて培養時のｐＨを調整することなく３６．５℃で４８時間培養した。培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理し、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
なお、表中のＬＢＲとはラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３を指す。ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターより入手することができる。
【００４０】
〔菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能との関係〕
乳酸菌の菌体粒度とＩＬ−１２およびＩＦＮ−α産生能との関係を図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。
乳酸菌の大きさ（粒子径）が１μｍ程度にまで小さくなった方が、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αのいずれのサイトカインも著しく産生能が増強されることが明らかとなった（表１と図１参照）。
ただし、図２に示されるように、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−αとの産生能には負の相関を示す菌株が認められ、たとえばＥＦ、ＫＨ１、ＫＨ３といった菌株ではＩＬ−１２産生能が高くＩＦＮ−α産生能が低い、逆にＬＬ１２、ＭＬ４といった菌株ではＩＬ−１２産生能が低くＩＦＮ−α産生能が高い、一方でＳＮＫはＩＬ−１２およびＩＦＮ−αの産生能が相対的にともに高いといった特徴が認められた。
【００４１】
【表１】
【００４２】
［実施例１］
〔ナノ型乳酸菌ＥＦの調製〕
乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス菌株ＥＦを、５質量％ブドウ糖添加の公知の栄養培地で、２０質量％水酸化ナトリウム水溶液で培養時におけるｐＨを６．５に調整しながら３６．５℃で培養し、ブドウ糖が消費された時点を培養終点とした（培養工程）。
培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理した後、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるように調整した（加工工程）。なお、加工工程時のｐＨは６．５に保持した。
〔菌体粒度の比較〕
参考例１および実施例１で調製した乳酸菌ＥＦの菌体粒度を測定した。その結果を図３に示す。
図３に示されるように、非中和培養による菌体粒度が１．２１５と１μｍより大きかったのに対し、中和培養による菌体粒度は０．７０１と１．０μｍ以下になっていることがわかる。
【００４３】
［参考例２］
〔死菌乾燥粉末の調製〕
乳酸菌本来の大きさが０．６μｍ（図４Ａ）で、選択的にサイトカインを誘導し得る２μｍ以下の粒子の積算分布が９９％（図４Ｂ）の乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス菌株ＥＦを実施例１の方法で培養し、その培養液から菌体を濃縮し、賦形剤を添加せずに噴霧乾燥して粉末とした。
〔菌体粒度の比較〕
上記で調製した粉末を、再び水に分散させた。その結果、図４Ａに示されるように、粒子径が１００μｍまでなだらかな粒度分布を示した。その内訳は、図４Ｂの積算分布に示されるように、パイエル板を通過する２０μｍまでの粒子は約５０％、Ｔｈ２細胞を誘導する３〜７μｍの粒子は約１４％、さらにＴｈ１細胞を誘導する２μｍ以下の粒子は高々１％に過ぎなかった。これではＴｈ１／Ｔｈ２応答をともに誘導する粒子が混在することになり、生理的には決して好ましい状況とは言えない。
【００４４】
さらに生体内での消化作用を想定し、これを公知の方法で調製された人工胃液または腸液で処理した場合でも、Ｔｈ１細胞を誘導する２μｍ以下の粒子の積算分布は高々１０％までしか上がらなかった（図４Ｂ）。
これではせっかくの乳酸菌本来の機能も十分に発揮されない（高々１０％程度）という結果を招くことが懸念される。
【００４５】
［実施例２］
〔ナノ型乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスの調製〕
乳酸菌ラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３を、５質量％ブドウ糖添加の公知の栄養培地で、２０質量％水酸化ナトリウム水溶液で培養時におけるｐＨを６．５に調整しながら３６．５℃で培養し、グルコース消費が完了した時点を培養終点とした（培養工程）。
培養終了後、培養液を８０℃で１０分間加熱滅菌処理し、菌体をＰＢＳで洗浄し、菌体に対して重量換算で４倍量のデキストリンを賦形剤として添加し、ミキサーで分散してから凍結乾燥して試料を調製し、これを再び菌体濃度で１０ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した（加工工程）。なお、加工工程時のｐＨは６．５に保持した。
【００４６】
〔菌体粒度およびＩＦＮ−α産生能の比較〕
参考例１および実施例２で調製したラクトバチルス・ブレビス菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−４６９３の菌体粒度およびＩＦＮ−α産生能を測定した。その結果を図５に示す。
図５に示されるように、非中和培養の場合（ＬＢＲと表示）は、菌体粒度が８．８μｍ、ＩＦＮ−α産生能が１６．８ｐｇ／ｍｌであったのに対し、中和培養の場合（ＮＡＮＯ−ＬＢＲと表示）は、菌体粒度が０．７μｍと１．０μｍ以下になり、そしてＩＦＮ−α産生能は９２．９ｐｇ／ｍｌと非中和培養の場合に比べて５．５倍に増強されていることがわかる。
【００４７】
以上の結果より、培養および加工工程におけるｐＨを中性域に調整することで、菌体粒度を１．０μｍ以下にまで微細化でき、さらに菌体に質量換算で４倍量程度の賦形剤を添加してから分散処理を施し、凍結乾燥することによって分散性に優れた菌体粉末を得ることができ、この粉体をもってマクロファージから効率よくインターフェロンαを産生させることができることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、
前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項２】
前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる請求項１記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項３】
前記培養工程における培地がエネルギー源としてブドウ糖を含有し、前記ブドウ糖が消費された時点を培養終点として得られる請求項１または２記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項４】
前記加工工程において、分散剤または賦形剤を乳酸菌に添加した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる請求項１記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体、または請求項５記載の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体を含有するインターフェロンα産生能増強剤。
【請求項１】
乳酸菌の培養工程および加工工程における培地のｐＨを中性域に調整して得られる、粒度分布における最頻値が１．０μｍ以下であるナノ型乳酸菌の菌体であって、
前記乳酸菌がラクトバチルス・ブレビスであることを特徴とするナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項２】
前記培地のｐＨを５〜８に調整して得られる請求項１記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項３】
前記培養工程における培地がエネルギー源としてブドウ糖を含有し、前記ブドウ糖が消費された時点を培養終点として得られる請求項１または２記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項４】
前記加工工程において、分散剤または賦形剤を乳酸菌に添加した後、凍結乾燥または噴霧乾燥して得られる請求項１記載のナノ型乳酸菌の菌体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体を含有する免疫賦活作用を有する組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体、または請求項５記載の組成物を含有する飲食物、飼料、化粧品または医薬品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のナノ型乳酸菌の菌体を含有するインターフェロンα産生能増強剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２２９２５８（Ｐ２０１２−２２９２５８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６０３７２（Ｐ２０１２−１６０３７２）
【出願日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【分割の表示】特願２００９−５３４７８７（Ｐ２００９−５３４７８７）の分割
【原出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５９２２４２４１９）信和薬品株式会社 (1)
【出願人】（５０５１６４６９０）有限会社バイオ研 (4)
【出願人】（３０６０００９３５）特定非営利活動法人日本サプリメント臨床研究会 (3)
【出願人】（３９３０１７５３５）コスモ食品株式会社 (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【分割の表示】特願２００９−５３４７８７（Ｐ２００９−５３４７８７）の分割
【原出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５９２２４２４１９）信和薬品株式会社 (1)
【出願人】（５０５１６４６９０）有限会社バイオ研 (4)
【出願人】（３０６０００９３５）特定非営利活動法人日本サプリメント臨床研究会 (3)
【出願人】（３９３０１７５３５）コスモ食品株式会社 (18)
【Ｆターム（参考）】
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