ナノ粒子への分子の結合
本明細書では、分子修飾ナノ粒子、ならびに該ナノ粒子の作製および使用方法が開示される。より具体的には、本明細書では、分子がオリゴヌクレオチドを介してナノ粒子の表面に結合している分子修飾ナノ粒子が開示される。また、ナノ粒子表面に結合しているオリゴヌクレオチドおよび分子（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、および／または炭水化物等の生体分子等）を有し、該オリゴヌクレオチドおよび分子が共有結合しているナノ粒子の調製方法も開示される。さらに、これらの開示された分子修飾ナノ粒子を使用した、対象検体の検出方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００７年２月２７日に出願された、米国仮特許出願第６０／９０３，７２８号に対する優先権を主張し、本出願は、その全体を本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利の陳述）
本発明は、Ａｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＦＯＳＲ）奨学金番号ＦＡ９５５０−０５−１−０３４８による政府援助によりなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
近年、生物学的用途に好適なナノ構造の設計および合成に向けて著しい発展が見られる。サイズおよび形態に対し正確な制御を行ってナノ材料を構築する能力は、明確な巨大分子構成単位の利用可能性に大きく依存している。ナノ構造にさらなる部分を結合させる能力は、結合の制御の欠落、得られるナノ構造の限られた安定性、ならびに形成中のナノ構造の望ましくない凝集および沈殿により制限されている。したがって、ナノ構造が制御された様式で修飾され、安定であり、あるとしても多くの凝集をもたらさないように付加された生物学的部分を有するナノ構造を調製する方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（要約）
上記を鑑みて、本発明は、ナノ構造が制御された様式で修飾され、安定であり、あるとしても多くの凝集をもたらさないように付加された生物学的部分を有するナノ粒子を提供する。当業者には、本発明の１つまたは複数の態様が、ある特定の目的を達成することができ、その他の１つまたは複数の態様が、ある特定のその他の目的を達成することができることが理解される。それぞれの目的は、そのあらゆる面で、本発明のすべての態様に等しく当てはまらない場合がある。したがって、以下の目的は、本発明のいずれか１つの態様に関して選択的に考慮され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本明細書では、一態様において、オリゴヌクレオチドに共有結合している分子を含み、該オリゴヌクレオチドはさらにナノ粒子の表面に共有結合している、分子修飾ナノ粒子が開示される。様々な実施形態において、分子はオリゴヌクレオチドの第１の末端で結合しており、ナノ粒子はオリゴヌクレオチドの第２の末端で結合している。いくつかの実施形態において、分子は生体分子であり、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、またはこれらの組合せであってもよい。特定の実施形態において、分子は抗体である。様々な実施形態において、ナノ粒子は金属である。特定の実施形態において、金属は金である。特定の実施形態において、ナノ粒子は金であり、オリゴヌクレオチドは、硫黄原子を含む連結基を介してナノ粒子の表面に結合している。ナノ粒子が金であるいくつかの実施形態において、金ナノ粒子は、約１０ｎｍから約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２０核酸塩基から１５０核酸塩基を有する。
【０００６】
別の態様において、本明細書では、本明細書で開示される分子修飾ナノ粒子の調製方法であって、オリゴヌクレオチドが官能基を介してナノ粒子の表面に結合するように、第１の異なる場所に官能基および第２の異なる場所に脱離基を有するオリゴヌクレオチドにナノ粒子を接触させて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成するステップと、得られるオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、求核基を有する分子に、分子の求核基によるオリゴヌクレオチド上の脱離基の置換を可能とするのに十分な条件下で接触させて、分子修飾ナノ粒子を形成するステップとを含む方法が開示される。
【０００７】
さらに別の態様において、本明細書では、分子修飾ナノ粒子を使用した試料中の検体の検出方法であって、試料を本明細書で開示される分子修飾ナノ粒子に、検体の分子への結合を可能とする条件下で接触させるステップと、得られるナノ粒子結合検体を検出するステップとを含み、検体が分子修飾ナノ粒子に結合すると検出事象が生じる方法が開示される。いくつかの実施形態において、検出事象は、色の変化、分子修飾ナノ粒子の導電性の変化、蛍光性の変化、沈殿物を生成する溶解度の変化、光散乱の変化、または、分子修飾ナノ粒子のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドの融点の変化を含む。他の実施形態において、試料中の検体の濃度を計算することができる。特定の実施形態において、本明細書で開示される検出方法は、約３００ｆＭ（フェムトモル）の濃度の検体を検出するのに十分な感度を有する。
【０００８】
本発明のある特定の制限されない利益および実用性を例示すると、そのようなナノ粒子は、１種または複数種の抗原を発現する癌細胞に接触させることができ、上述の親水性部分のうちの１つまたは複数が、そのような抗原（複数可）に対する１種または複数種の抗体とコンジュゲートしている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】抗体およびオリゴヌクレオチドが別個にナノ粒子表面に結合している、抗体修飾ナノ粒子の従来の調製方法のスキームである。
【図２】分子がオリゴヌクレオチドを介してナノ粒子に結合している、分子修飾ナノ粒子の本明細書に開示される調製方法のスキームである。
【図３】一連の検体（ここでは前立腺特異抗原（ＰＳＡ））濃度にわたるシグナルの較正を示す図である。
【図４】本明細書で開示される方法を使用した、様々な血清試料におけるバックグラウンドノイズとしてのＰＳＡの検出結果を示す図である。
【図５】ＰＳＡの存在に対するプローブあり（左側の棒グラフ）またはなし（右側の棒グラフ）での、様々な濃度のＰＳＡ標準物質を添加した３０％ヒト血清を使用した較正曲線である。
【図６】パネルＡは、分子修飾ナノ粒子およびスライド表面上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブを介した分子修飾ナノ粒子の結合モードを示す、オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出する手段としての様々な濃度の分子修飾ナノ粒子の存在下での、本明細書に開示される検出アッセイの結合アッセイ結果を示す図である。パネルＢは、分子修飾ナノ粒子の分子の標的検体（ここではＰＳＡの抗原）の検出に向けた分子修飾ナノ粒子の特異性を示す、様々な条件の存在下でのスライドの表面上の表面結合抗原（ここではＰＳＡ）を示す図であり、ウェル１は、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗体を有し、ウェル２は、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗原を有し、ウェル３は、バイオバーコードおよびアッセイ緩衝液を有し、ウェル４は、バイオバーコードプローブを有する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
本明細書では、分子修飾ナノ粒子が開示され、ナノ粒子は、少なくともその表面の一部にオリゴヌクレオチドを介して結合した分子を有する。さらに、該ナノ粒子の調製方法も開示される。開示された方法は、ナノ粒子に分子を結合させる既知の従来方法と比較して、ナノ粒子への分子の担持に対するより良好な制御を可能とし、および／またはより安定でより凝集の少ない分子修飾ナノ粒子が得られる。
【００１１】
オリゴヌクレオチドおよび分子の両方が結合したナノ粒子の従来の調製手段では、まず分子（例えば、抗体等の生体分子）をナノ粒子表面にコンジュゲートさせた後、表面の残りの部分にオリゴヌクレオチドを付加し、表面の空隙がオリゴヌクレオチドにより充填されることにより調製されていた。過去に使用されていた手順は、多くの場合制御が困難であり、一般にナノ粒子の単離中に多量の沈殿したナノ粒子が観察された。このようにして調製された修飾ナノ粒子はまた、保存期間が限られているようであり、したがって、長期にわたる使用には、毎日のプローブ調製が必要であった。この従来の方法を、図１に示す。
【００１２】
本明細書に開示された方法は、１つの異なる場所に官能基を有し、第２の異なる場所に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、まず官能基を介してナノ粒子上に担持させてオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成し、得られたオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、単離して、必要となる時まで保存することができる。次いで、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、オリゴヌクレオチド上の脱離基を介してさらに分子（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、または炭水化物等の生体分子）で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、一方の末端の官能基を介して、例えばジスルフィド結合によりナノ粒子の表面と反応することができ、またオリゴヌクレオチドの反対側の末端上の脱離基を介して、分子上の求核基とも反応することができる。開示された方法を図２に概略的に示すが、図中、Ｔｓはトシルである。
【００１３】
分子の前にオリゴヌクレオチドをナノ粒子上に担持させることは、オリゴヌクレオチドの担持を最大化することができる。オリゴヌクレオチドの増加したまたは高密度の担持は、検出アッセイにおける識別シグナルの最大増幅を可能とする。対象検体の存在を検出するように識別シグナルが増幅されるため、増幅が大きい程その検体のより高感度な検出が可能となる。追加的および代替的に、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド数の増加は、より大きなナノ粒子を使用することにより達成することができる。
【００１４】
ナノ粒子
実際には、それに結合したオリゴヌクレオチドを有するように修飾され得る任意の好適なナノ粒子を使用する方法が提供される。ナノ粒子のサイズ、形状、および化学組成は、得られるオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の特性に寄与する。これらの特性は、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学的特性、電子特性、各種溶液中での安定性、磁気特性、ならびに細孔および経路のサイズ変動性等を含む。均一のサイズ、形状、および化学組成を有するナノ粒子の使用だけでなく、異なるサイズ、形状、および／または化学組成を有するナノ粒子の混合物の使用も企図される。好適な粒子の例は、制限することなく、凝集粒子、等方性粒子（例えば球状粒子等）および異方性粒子（例えば非球状のロッド、四面体、角柱等）、ならびにコアシェル粒子、例えば米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開番号ＷＯ２００３／０８５３９（これらの開示は参照によりその全体が組み入れられる）に記載の粒子を含む。
【００１５】
一実施形態において、ナノ粒子は金属であり、様々な態様において、ナノ粒子はコロイド金属である。したがって、様々な実施形態において、本方法の実践において有用なナノ粒子は、金属（例えば、制限することなく、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、または、ナノ粒子を形成し易い他の任意の金属を含む）、半導体（例えば、制限することなく、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、および、ＺｎＳで被覆されたＣｄＳまたはＣｄＳｅを含む）、ならびに磁性（例えばフェロマグネタイト）コロイド材料を含む。本発明の実践において有用なその他のナノ粒子は、これもまた制限することなく、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、スチール、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓを含む。ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子の作製方法もまた当技術分野では既知である。例えば、Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、第３２巻、４１頁（１９９３年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ、Ｔｏｐ． Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ．、第１４３巻、１１３頁（１９８８年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、第８９巻、１８６１頁（１９８９年）；Ｂｒｕｓ、Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． Ａ．、第５３巻、４６５頁（１９９１年）；Ｂａｈｎｃｍａｎｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｓｏｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ（ＰｅｌｉｚｅｔｔｉおよびＳｃｈｉａｖｅｌｌｏ編集、１９９１年）、２５１頁；ＷａｎｇおよびＨｅｒｒｏｎ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５２５頁（１９９１年）；Ｏｌｓｈａｖｓｋｙら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１１２巻、９４３８頁（１９９０年）；およびＵｓｈｉｄａら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５３８２頁（１９９２年）を参照されたい。
【００１６】
金属、半導体、および磁性ナノ粒子の作製方法は、当技術分野では周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ， Ｇ．（編集）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４年）；Ｈａｙａｔ， Ｍ． Ａ．（編集）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９１年）；Ｍａｓｓａｒｔ， Ｒ．、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、１２４７頁（１９８１年）；Ａｈｍａｄｉ， Ｔ． Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７２巻、１９２４頁（１９９６年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ， Ａ．ら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９９巻、１４１２９頁（１９９５年）；Ｃｕｒｔｉｓ， Ａ． Ｃ．ら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、第２７巻、１５３０頁（１９８８年）を参照されたい。Ｆａｔｔａｌら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９８年）第５３巻：１３７〜１４３頁および米国特許第４，４８９，０５５号には、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の調製が記載されている。Ｌｉｕら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（２００４年）第１２６巻：７４２２〜７４２３頁には、ポリ（Ｄ−グルカラミドアミン）を含むナノ粒子の作製方法が記載されている。Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８年）第２６巻：５４２５〜５４３１頁には、重合メチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含むナノ粒子の調製が、また、例えばＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９６年）第９３巻：４８９７〜４９０２頁には、デンドリマーナノ粒子の調製（星型ポリアミドアミンデンドリマー）が記載されている。好適なナノ粒子はまた、例えば、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．（金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）、およびＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（金）等から市販されている。約１４０ｎｍの分散凝集粒子サイズを有する酸化スズナノ粒子は、日本国千葉県の真空冶金株式会社から市販されている。様々な組成およびサイズ範囲のその他の市販のナノ粒子は、例えば、カリフォルニア州ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅのＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００１７】
また、米国特許出願公開第２００３／０１４７９６６号に記載されているように、本明細書に記載の材料を含むナノ粒子は、市販されているか、または、溶液中での連続核生成から（例えばコロイド反応により）、もしくはスパッタ堆積等の様々な物理および化学気相堆積プロセスにより生成することができる。例えば、ＨａＶａｓｈｉ、Ｖａｃ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａ５（４）：１３７５〜８４頁（１９８７年）；Ｈａｙａｓｈｉ、Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ、４４〜６０頁（１９８７年）；ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１９９０年１月、１６〜４７頁を参照されたい。米国特許出願公開第２００３／０１４７９６６号にさらに記載されているように、企図されるナノ粒子は、当技術分野で知られた方法を用いて、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸塩還元剤を使用して生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ．第１１巻：３４〜３７頁（１９９９年）；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ．第１０巻：１２１４〜１９頁（１９９８年）；Ｅｎｕｓｔｕｎ ＆ Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．第８５巻：３３１７頁（１９６３年）を参照されたい。
【００１８】
ナノ粒子は、平均直径約１ｎｍから約２５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２００ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１００ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約３０ｎｍ、または平均直径約１ｎｍから約２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１０ｎｍの範囲のサイズであってよい。他の態様において、ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、約５ｎｍから約５０ｎｍ、約１０ｎｍから約３０ｎｍ、約１０ｎｍから１５０ｎｍ、約１０ｎｍから約１００ｎｍ、または約１０ｎｍから約５０ｎｍである。ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０ｎｍから約１００ｎｍ、約４０ｎｍから約８０ｎｍである。方法に使用されるナノ粒子のサイズは、特定の使用または用途での要件に応じて変動する。サイズの変動性は、例えば、本明細書に記載されるように誘導体化され得る光学特性または表面積の量等の、ナノ粒子のある特定の物理的特性を最適化するために有利に利用される。
【００１９】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および／または非天然ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本開示を通して、ヌクレオチドは、あるいは核酸塩基と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または、ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドの修飾型であってもよい。
【００２０】
天然発生核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を含み、またキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾールピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン等の非天然発生核酸塩基および「非天然」核酸塩基は、米国特許第５，４３２，２７２号およびＦｒｅｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻：４４２９〜４４４３頁（１９９７年）に記載されているものを含む。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。さらなる天然および非天然発生核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｓａｎｇｈｖｉ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＣｒｏｏｋｅおよびＢ． Ｌｅｂｌｅｕ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、第１５章；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、第３０巻：６１３〜７２２頁（１９９１年）；およびＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｊ． Ｉ． Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年、８５８〜８５９頁、Ｃｏｏｋ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、第６巻、５８５〜６０７頁（１９９１年）（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に開示されているものを含む。核酸塩基はまた、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能するある特定の「ユニバーサル塩基」を含む、核酸塩基のように機能することができる複素環化合物等の化合物を含む。ユニバーサル塩基としては、特に、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが挙げられる。その他の望ましいユニバーサル塩基は、当技術分野で知られたユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含む。オリゴヌクレオチドの修飾型もまた企図され、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結基を有するものを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、すべてまたはその一部がペプチド核酸である。その他の修飾ヌクレオシド間連結基は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結基を含む。さらに他の修飾オリゴヌクレオチドは、１種または複数種のユニバーサル塩基を含むものを含む。ユニバーサル塩基類似体に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定におけるプライマーとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例は、５’−ニトロインドール−２’−デオキシリボシド、３−ニトロピロール、イノシンおよびピロキサンチンを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェートであって、通常の３’−５’連結基、それらの２’−５’連結類似体を有するもの、および、１つまたは複数のヌクレオチド間連結基が３’から３’、５’から５’、または２’から２’の連結基である、反転した極性を有するものを含む。また、最も３’側のヌクレオチド間連結において単一の３’から３’の連結基を備えた、反転した極性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、脱塩基部位（ヌクレオチドがないか、またはその代わりにヒドロキシ基を有する）であってもよい一回反転したヌクレオシド残基も企図される。塩、混合塩および遊離酸の形態もまた企図される。上記リン含有連結基の調製を教示している代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号（これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）を含む。
【００２２】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結基、へテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結基の混合、または１種もしくは複数種の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結基により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結基；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに、その他Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の混合部分を有する骨格を有するものを含む。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００２３】
ヌクレオチド単位の１種もしくは複数種の糖および／または１種もしくは複数種のヌクレオチド間連結基の両方が「非天然発生」基で置き換えられた修飾オリゴヌクレオチド。一態様において、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格で置き換えられている。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、第２５４巻、１４９７〜１５００頁（これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００２４】
開示されたオリゴヌクレオチドにおいて企図されるヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドの間の他の連結基は、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号；米国特許出願公開第２００４０２１９５６５号；国際特許公開番号ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ第５巻：３４３〜３５５頁（１９９５年）、ならびにＳｕｓａｎ Ｍ． ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻：４４２９〜４４４３頁（１９９７年）に記載のものを含む。
【００２５】
提供された方法における使用のためのナノ粒子は、約５ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドまたはその修飾型で修飾されている。また、オリゴヌクレオチドが約５ヌクレオチドから約１４０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１３０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１２０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１１０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約９０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約７０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約４５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドの長さ、および、オリゴヌクレオチドが所望の結果を達成し得る範囲内の、具体的に開示されたサイズの中間的長さのすべてのオリゴヌクレオチドである方法もまた企図される。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが企図される。
【００２６】
さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、約８個のヌクレオチドから約８０個のヌクレオチド（すなわち、約８個から約８０個の連結ヌクレオシド）を含む。方法は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの長さの化合物を利用することが、当業者には理解される。
【００２７】
オリゴヌクレオチド配列およびハイブリダイゼーション
提供された方法で利用される各ナノ粒子は、それに結合した複数のオリゴヌクレオチドを有する。その結果、各オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、第２のオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子、および／または、存在する場合には、十分に相補的な配列を有する遊離オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力を有する。一態様において、各ナノ粒子が同一のオリゴヌクレオチドで修飾される、すなわち、ナノ粒子に結合した各オリゴヌクレオチドが同じ長さおよび同じ配列を有する方法が提供される。他の態様において、各ナノ粒子は、同一ではない２種以上のオリゴヌクレオチドで修飾される、すなわち、結合したオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個が、異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点で、少なくとも１個の他の結合オリゴヌクレオチドと異なる。
【００２８】
所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）およびＦ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編集）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方に好ましい（ＤＮＡ合成の周知の方法もまたＲＮＡ合成に有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドはまた、酵素的に調製可能である。非天然発生核酸塩基をオリゴヌクレオチドに組み込むこともできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号；Ｋａｔｚ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第７４巻：２２３８頁（１９５１年）；Ｙａｍａｎｅら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第８３巻：２５９９頁（１９６１年）；Ｋｏｓｔｕｒｋｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１３巻：３９４９頁（１９７４年）；Ｔｈｏｍａｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第７６巻：６０３２頁（１９５４年）；Ｚｈａｎｇら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２７巻：７４〜７５頁（２００５年）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２４巻：１３６８４〜１３６８５頁（２００２年）を参照されたい。
【００２９】
いくつかの態様において、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドと相補的である。様々な態様において、オリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドと１００％相補的、すなわち完全に一致し、一方その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約９５％（つまり９５％以上を意味する）、オリゴヌクレオチドの長さにわたってプローブ化合物と相補的であり、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、オリゴヌクレオチドの長さにわたってプローブ化合物と相補的である。
【００３０】
プローブオリゴヌクレオチドは、対象検体の検出を支援するため検出アッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドである。プローブオリゴヌクレオチドは、後述するバイオバーコードアッセイ等のアッセイにおいて使用することができる。例えば、米国特許第６，３６１，９４４号；第６，４１７，３４０号；第６，４９５，３２４号；第６，５０６，５６４号；第６，５８２，９２１号；第６，６０２，６６９号；第６，６１０，４９１号；第６，６７８，５４８号；第６，６７７，１２２号；第６６８２，８９５号；第６，７０９，８２５号；第６，７２０，１４７号；第６，７２０，４１１号；第６，７５０，０１６号；第６，７５９，１９９号；第６，７６７，７０２号；第６，７７３，８８４号；第６，７７７，１８６号；第６，８１２，３３４号；第６，８１８，７５３号；第６，８２８，４３２号；第６，８２７，９７９号；第６，８６１，２２１号；および第６，８７８，８１４号を参照されたい。
【００３１】
ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合
本明細書に開示されたオリゴヌクレオチドは、１つの異なる場所に脱離基を組み込み、第２の異なる場所に官能基を組み込むように修飾される。いくつかの実施形態において、脱離基はオリゴヌクレオチドの第１の末端に向かい、官能基はオリゴヌクレオチドの反対側の末端にある。特定の実施形態において、脱離基はオリゴヌクレオチドの一方の末端にあり、官能基は反対側の末端にある。脱離基および官能基部分は、脱離基および／または官能基部分を有するように修飾され得るオリゴヌクレオチドの任意の部分で結合し得る。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、官能基部分を介してナノ粒子に結合する。修飾され得るオリゴヌクレオチド上の部位の例は、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアミンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子表面への結合のための脱離基および／または官能基部分を組み込む非天然核酸塩基を有する。様々な態様において、官能基はスペーサである。これらの態様において、スペーサは、有機部分、ポリマー、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、および／またはオリゴ糖である。ナノ粒子の表面に結合するためにオリゴヌクレオチドを官能化する方法は、当技術分野では周知である。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．、１０９〜１２１頁（１９９５年）を参照されたい。また、Ｍｕｃｉｃら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．５５５〜５５７頁（１９９６年）（３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に結合させる方法を記載；この方法はオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために使用することができる）を参照されたい。また、アルカンチオール法を使用してオリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイド、ならびに上に挙げたその他のナノ粒子に結合させることもできる。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるためのその他の官能基は、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面への結合に関して、米国特許第５，４７２，８８１号を参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面への結合に関して、Ｂｕｒｗｅｌｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４巻：３７０〜３７７頁（１９７４年）ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０３巻：３１８５〜３１９１頁（１９８１年）を、またアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの類似の結合に関して、Ｇｒａｂａｒｅｔａｌ．、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、第６７巻：７３５〜７４３頁を参照）を含む。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるために、５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドで終端したオリゴヌクレオチドを使用することもできる。以下の参考文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために使用可能なその他の方法を記載している：Ｎｕｚｚｏら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０９巻：２３５８頁（１９８７年）（金上のジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１巻：４５頁（１９８５年）（アルミニウム上のカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓ、Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、第４９巻：４１０〜４２１頁（１９７４年）（銅上のカルボン酸）；Ｉｌｅｒ、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ、第６章、（Ｗｉｌｅｙ １９７９年）（シリカ上のカルボン酸）；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＺｉｓｍａｎ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第６９巻：９８４〜９９０頁（１９６５年）（白金上のカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０４巻：３９３７頁（１９８２年）（白金上の芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、第１３巻：１７７頁（１９８０年）（白金上のスルホラン、スルホキシドおよびその他の官能化溶媒）；Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１１１巻：７２７１頁（１９８９年）（白金上のイソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：１０４５頁（１９８７年）（シリカ上のシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：１０３４頁（１９８７年）（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第５巻：１０７４頁（１９８９年）（シリカ上のシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：９５１頁（１９８７年）（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；Ｌｅｃら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９２巻：２５９７頁（１９８８年）（金属上の固定ホスフェート）。
【００３３】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つの末端に向かってジスルフィド官能基を有する。この官能基は、例えば、ジチオールホスホラミダイト核酸塩基（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡから販売されているＤＴＰＡ等）を使用して達成することができる。オリゴヌクレオチドの官能基としてのＤＴＰＡの選択は、遊離チオールがオリゴヌクレオチドの脱離基の末端と反応してオリゴヌクレオチドの自己会合体を形成し得るため、好ましい。しかし、開示された条件下で安定であり、分子修飾ナノ粒子を提供することができる、ナノ粒子表面に結合可能な官能基と脱離基部分の任意の組合せが企図される。
【００３４】
オリゴヌクレオチド密度
オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、または５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度でナノ粒子に結合する方法が提供される。
【００３５】
一態様において、オリゴヌクレオチドのナノ粒子表面上での充填密度は、ナノ粒子間、および単一のナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間の協同的な挙動をもたらすのに十分である方法が提供される。別の態様において、ナノ粒子間の共同的な挙動は、オリゴヌクレオチドの分解に対する耐性を増加させる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドへの分子の結合
本明細書に開示されたオリゴヌクレオチドは、異なる場所で脱離基により修飾される。本明細書で使用される場合、脱離基とは、求核基による求核攻撃を容易に受けやすい部分を指す。典型的な脱離基は、トシル、メシル、トリチル、置換トリチル、ニトロフェニル、クロロフェニル、フルオレニルメトキシカルボニル、およびスクシンイミジルを含むが、これらに限定されない。好ましい脱離基は、トシルである。脱離基の機能性を提供するためのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾は、当技術分野では周知である。例えば、オリゴヌクレオチドを脱離基で修飾する方法に関して、ＷＯ９３／０２０２４２を参照されたい。
【００３７】
分子は、オリゴヌクレオチド上の脱離基の求核置換を介してナノ粒子に結合する。分子上の求核基は、例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシレート、チオール、または、脱離基を置換することができるその他の任意の部分であってもよい。求核基による脱離基の置換を可能とするのに十分な条件は、化学分野の当業者により容易に決定される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された分子は、対象検体の標的分子である。標的分子の例は、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等を含む。より具体的な例は、対象抗原に対する抗体、対象酵素の小分子受容体、対象小分子受容体の酵素を含む。
【００３９】
検出アッセイ
開示された分子修飾ナノ粒子は、バイオバーコードアッセイ等の検出アッセイにおいて使用することができる。米国特許第７，３２３，３０９号；第６，９７４，６６９号；第６，７５０，０１６号；第６，２６８，２２２号；第５，５１２，４３９号；第５，１０４，７９１号；第４，６７２，０４０号；および第４，１７７，２５３号；米国特許出願公開第２００１／００３１４６９号；第２００２／０１４６７４５号；および第２００４／０２０９３７６号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ０５／００３３９４（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。固定された分子が使用されるその他の検出アッセイもまた企図される。そのようなアッセイの限定されない例は、イムノＰＣＲアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロッティング、間接蛍光抗体試験、溶解度変化、吸光度変化、伝導度変化、およびラマンまたはＩＲスペクトル変化を含む。（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２１巻（２および３）：１６５〜２０９頁（２０００年）；Ｈｅｒｂｒｉｎｋら、Ｔｅｃｈ． Ｄｉａｇｎ． Ｐａｔｈｏｌ．第２巻：１〜１９頁（１９９２年）；ならびに米国特許第５，６３５，６０２号および第５，６６５，５３９号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。）
検体が分子修飾ナノ粒子に結合すると、「検出事象」と呼ばれる検出可能な変化が生成じる。用いられているアッセイに依存して、その検出事象は、蛍光性の変化（例えば蛍光標識が使用される実施形態の場合）；吸光度の変化、ラマンスペクトルの変化；電気特性の変化（例えば試料もしくは分子修飾ナノ粒子の導電性の増加もしくは減少）；光散乱の変化；溶解度の変化（例えば、分子修飾ナノ粒子に結合する検体が、それをアッセイ溶液から沈殿させる）、または、既知の手段を使用して検出可能な物理的もしくは化学的特性の他のいくつかの変化であり得る。
【００４０】
開示された方法を使用して、検体は、非常に低濃度で検出され得る。いくつかの実施形態において、検体は、３００ｆＭという低い濃度で存在する。様々な実施形態において、検体の濃度は、検出事象、例えば吸光度の変化等を比較し、またその結果を較正曲線と比較することにより決定され得る。
【００４１】
本発明の追加の態様および詳細は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例から明らかとなる。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
トシル化オリゴヌクレオチドの調製
Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｕｌｔｒａｍｉｌｄ試薬を１μモルスケールで使用した標準的なホスホラミダイト合成によりオリゴヌクレオチドを調製した。３’ジチオール官能化および金へのオリゴの結合のために、ＡまたはＧ、ＣＰＧ Ｕｌｔｒａｍｉｌｄサポートを使用して、ＤＴＰＡモノマー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を３’端に導入した。５’トシルＴ−ホスホラミダイトを使用して、５’トシル修飾を導入した（Ｈｅｒｒｌｅｉｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．第１１７巻：１０１５１〜１０１５２頁（１９９５年））。次いで、保護されたオリゴヌクレオチドを、濃縮水酸化アンモニウム中、５５℃で１５分間脱保護した後、室温で１．５時間静置した。水酸化アンモニウムは、窒素気流下で除去した。次いで粗生成物を、逆相カラム上で、１％／分の勾配、３ｍＬ／分の流速を用いて、ＨＰＬＣ（０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）で精製した。
【００４３】
（実施例２）
トシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子の調製
実施例１のトシル化オリゴヌクレオチド１Ｏ．Ｄ．を３０ｎｍ金粒子１ｍＬに添加することにより、トシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子を調製した。混合物を室温で２４時間静置した。この最初のインキュベーション期間の後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を導入して最終濃度を０．１％とした後、１Ｍ塩溶液を使用して塩化ナトリウムを添加し、最終濃度を０．１Ｍとした。次いで混合物を室温で４８時間静置した。次いで、エッペンドルフ卓上遠心分離機を使用して、６８００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によりコンジュゲートを回収し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で２回洗浄し、最後にＮａｎｏｐｕｒｅ水に懸濁させて冷蔵した。
【００４４】
（実施例３）
分子修飾ナノ粒子の調製
実施例２のトシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子３．０ｍＬを、遠心分離および上澄みの除去により６０μＬに濃縮することにより、分子修飾ナノ粒子を調製した。この濃縮物に、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２０μＬ、次いで２０μＬのＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中の所望の分子１０μｇを添加した。
【００４５】
特定の実施例において、ＰＳＡ検出が望ましかったため、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製ポリクローナル抗体、抗ｈ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−３親和性精製ヤギＩｇＧを使用した。この混合物に、ｐＨ９．５の０．２Ｍホウ酸塩緩衝液１００μＬを添加した。混合物を、エッペンドルフＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒで、５５０ｒｐｍで２４時間、３７℃で反応させた。この混合物に、１０％ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、前記条件下でさらに２４時間反応させた。分子修飾ナノ粒子を５８００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により回収した後、０．１％のＢＳＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０（アッセイ緩衝液）を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄し、最後にアッセイ緩衝液３ｍＬ中に再懸濁させ、検出アッセイで使用されるまで冷蔵した。
【００４６】
（実施例４）
分子修飾ナノ粒子を使用した標的分子の検出
材料 ＣｏｄｅＬｉｎｋスライドをＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手し、製造者が推奨する方法を用いてアミノ捕捉オリゴヌクレオチドでプリントした。オリゴヌクレオチド捕捉プローブおよび対照オリゴを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、さらに精製することなく使用した。バーコード捕捉配列５’ＴＣＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＧＴ Ｔ／３ＡｍＭ−３’（配列番号１）（ここで３ＡｍＭはアミノ修飾因子Ｃ６である）；対照捕捉配列５’ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＧ／３ＡｍＭ／３’（配列番号２）バーコード配列：３’−Ｇ−ＤＴＰＡ−Ｔ１９−ＡＣＣ−ＧＡＡ−ＧＴＡ−ＡＣＧ−ＴＧＧ−ＣＡＡ−Ｔ−トシル（配列番号３）Ｗａｓｈ Ａ、Ｂ、Ａ２０シグナルプローブ（配列番号４）、ハイブリダイゼーションチャンバ、Ｓｈａｂｂｏｎａ研究プラットフォーム、および銀増感溶液を、Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．から購入し、製造者が推奨する方法に従い使用した。ヨウ素溶液（０．１Ｎ体積標準）を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した。試験を通して、ＰＳＡ（９０：１０ ＷＨＯ ＰＳＡ標準；９０％結合：１０％遊離）を較正曲線用の標準物質として使用した。
【００４７】
ハイブリダイゼーション。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社で、マイクロアレイ（ＣｏｄｅＬｉｎｋスライド；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、バーコード捕捉オリゴヌクレオチド（特定のバーコード配列と相補的）および対照配列（非相補的配列）でプリントし、それにより各スライドは、スライド毎に、アレイにつき各捕捉配列の６つの繰り返しを有する１０個のアレイが施された。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅハイブリダイゼーションチャンバを各スライドに取り付け、各アレイを物理的に分離した。バーコード５５μＬを載せた後、スライドを、６００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で６０分間インキュベートした。シグナルプローブミックス（５５μＬ、放出緩衝液５０μＬおよび１０ｎＭの１５ｎｍ ｄＡ２０（配列番号４）金ナノ粒子プローブ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．製）５μＬを含有）を添加し、インキュベーションを３０分継続した。ハイブリダイゼーションの後、Ｗａｓｈ Ａ（０．５Ｎ ＮａＮＯ３、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％ＳＤＳ）中で１分間に３回、次いでＷａｓｈ Ｂ（０．５Ｎ ＮａＮＯ３）中で１分間に２回スライドを洗浄した。最後に０．１Ｎ ＮａＮＯ３中で速やかに洗浄（１〜２秒）した後、スライドを脱水した。
【００４８】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が存在するかどうかについて、バイオバーコードアッセイ（例えば米国特許第６，４９５，３２４号を参照）により、実施例３で調製したＰＳＡ抗体ナノ粒子を使用して一連のヒト血清試料をスクリーニングした。本実施例において、適切な場合には、磁気分離および撹拌デバイスを備えたＳｈａｂｂｏｎａ液体処理ステーションを使用した。１％ポリアクリル酸ナトリウム塩（１５，０００ＭＷ）を含有するアッセイ緩衝液３０μＬを試験ウェルに添加することにより、血清中の一連の較正用標準試料および未知試料を含有する試料ブロックを調製した。この溶液に、血清３０μＬを添加し、続いて、製造者が推薦する方法を用いてＰＳＡモノクローナルＡｂ（Ａｂｃａｍ Ａｂ４０３）により事前に官能化された磁性粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＭｙＯｎｅトシル化粒子）４０μＬ（反応ウェル毎に１．５μｇ）を添加した。次いで混合物を室温で１時間撹拌し（１２００ｒｐｍ）、１％アッセイ緩衝液を使用して２回洗浄すると同時に磁気分離を行った。次いで、金ナノ粒子（５０μＬ、１５０ｐＭ）を試験ウェルに投入してから、混合物を室温で１時間撹拌した。この混合物に、アッセイ緩衝液１５０μＬを添加し、続いて磁気分離を行った。続いてアッセイ緩衝液２００μＬで５回洗浄し、アッセイ緩衝液を溶出緩衝液に交換した後（２×ＰＢＳ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０、１９０μＬ）、試料をＰＣＲチューブに移し、０．１Ｎヨウ素水溶液１０μＬを添加した後、ハイブリダイゼーション標準試料１０μＬを最終濃度１０ｆＭまで添加した。次いでこの混合物を１０分間９５℃で加熱し、金を溶解させることにより金ナノ粒子からバーコードを放出させ（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２０巻：１９０６頁（１９９８年）；Ｋｉｍら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２２巻：７６１６頁（２０００年）；Ｐｕｄｄｅｐｈａｔｔ、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｇｏｌｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９７８年）、室温まで冷却して、事前にバーコードと相補的なアミノ捕捉オリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドをプリントしたＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）ガラススライドを備えた、ハイブリダイゼーションチャンバ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）に移した。次いでアセンブリを、６００ｒｐｍで撹拌しながら、４０℃で６０分間インキュベータ内に置いた。次いでガラススライドをＷａｓｈ Ａ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）溶液で２回洗浄し、新たなハイブリダイゼーションチャンバに再び組み付けた。アセンブリの各ウェルに、新鮮な溶出緩衝液およびＡ２０（配列番号４）シグナルプローブ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）を含有するハイブリダイゼーション溶液を、最終濃度１ｎＭまで添加した。アセンブリ全体を、６００ｒｐｍで撹拌しながら４０℃のインキュベータ内に３０分間置いた。次いでアセンブリを解体し、Ｗａｓｈ Ａで２回洗浄した。次いでスライドをＷａｓｈ Ｂ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）溶液で３回洗浄して脱水した。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製銀増感溶液を使用して、銀現像を室温で５分間行った。
【００４９】
バーコードシグナル検出。Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ＡおよびＳｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂ（ともにＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．製）の等容積を混合し、速やかにプラスチックスライドホルダ内のスライド上に注ぎ、室温で５分間インキュベートした。水中で２回洗浄し、水中で完全に濯ぐことにより反応を止めた。スライドを脱水し、スライドの裏側を慎重に拭いて、埃、塩、およびその他の混入物質を除去した。スライドをＶｅｒｉｇｅｎｅ（商標）ＩＤシステム（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社製）で走査した。
【００５０】
バーコード画像分析。走査画像（Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤからの１６ビットＴＩＦＦ）を、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ｖ５．１ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で分析した。平均スポット強度を、まず局所バックグラウンド（各スポットの近傍における同様のサイズの領域の平均ピクセル値）について較正し、生のスポット強度を生成した。図３は、１％ＰＡＡを含有するアッセイ緩衝液における較正曲線を示す。図３に示される結果は、自動化プラットフォーム上でいくつかのアッセイ緩衝液中較正用標準試料とともに測定された代表的試料を示している。代表となる自動測定は、アッセイ緩衝液中ＷＨＯ ＰＳＡ標準試料を使用した。標準試料は、既知の濃度のＰＳＡ抗原を、０、０．１、１．０、５．０、および１０．０ｐｇ／ｍＬでアッセイ緩衝液中に添加することにより調製し、その後自動化システムでバイオバーコードアッセイを行い、ＰＳＡ標的滴定のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムからのグレースケール画像は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用してカラー画像に変換されている。
【００５１】
図４は、１％ＰＡＡを含有する３０％ヒト血清を使用した血清スクリーニングを示す。代表となる自動化測定は３０％ヒト血清を使用した。試料は、自動化システム上でヒト血清をアッセイ緩衝液に添加することにより調製し、ＰＳＡ標的検出のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムからのグレースケール画像は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用してカラー画像に変換されている。７１１血清が最も低いＰＳＡバックグラウンドを有し、ヒト血清における較正曲線に好適であると決定された。この血清を使用して、既知量のＰＳＡ標準試料を血清に添加し、タンパク質バイオバーコードアッセイを行うことにより、較正曲線を作成した。図５に示される結果は、自動化システムから得られたヒト血清におけるＰＳＡ較正曲線を示す。
【００５２】
図５は、１％ＰＡＡを含有する３０％ヒト血清における較正曲線を示す。代表となる自動化較正曲線は３０％ヒト血清を使用した。試料は、ヒト血清に０．１、１．０、５．０、および１０．０ｐｇ／ｍＬのＰＳＡ標準試料を添加し、続いて自動化システム上でヒト血清をアッセイ緩衝液に添加することにより調製し、ＰＳＡ標的検出のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。
【００５３】
バイオバーコードプローブ特性決定。バイオバーコードプローブの二面性を実証するために、２つの別個の方法を開発した。プローブはキメラである（バーコードおよび抗体の両方が同じナノ粒子に結合している）ため、（抗体の活性を決定するための）タンパク質アッセイおよび（オリゴヌクレオチドバーコードの活性を検査するための）オリゴヌクレオチドアッセイを通してプローブの忠実性を実証する必要があった。そのようなアッセイは、抗原またはオリゴヌクレオチドバーコード捕捉配列を、ＣｏｄｅＬｉｎｋガラススライドの表面上に別個にプリントすることにより考案された。これらの分子の化学的結合の後、別個の実験において、プリントされた表面をバイオバーコードプローブで負荷した。これらの新規で高感度のプローブの二重の結合および選択性を、これらのアッセイにおいて実証することに成功した。図６のパネルＡは、バイオバーコードプローブを使用したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの結果を示し、一方パネルＢは、アッセイ緩衝液中の同じバイオバーコードプローブの抗原結合能力を示している。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび抗体抗原結合を介した、バイオバーコードプローブの直接結合アッセイ。図６のパネルＡは、プリントされた捕捉プローブで負荷された１０ｐＭ〜０ｆＭのプローブ希釈シリーズの濃縮用量／応答を示す。図６のパネルＢは、バイオバーコードプローブ（ウェル４）、アッセイ緩衝液（ウェル３）、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗原（ウェル２）、ならびにバイオバーコードプローブおよび過剰の抗体（ウェル１）で負荷した、表面結合抗原の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００７年２月２７日に出願された、米国仮特許出願第６０／９０３，７２８号に対する優先権を主張し、本出願は、その全体を本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利の陳述）
本発明は、Ａｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＦＯＳＲ）奨学金番号ＦＡ９５５０−０５−１−０３４８による政府援助によりなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
近年、生物学的用途に好適なナノ構造の設計および合成に向けて著しい発展が見られる。サイズおよび形態に対し正確な制御を行ってナノ材料を構築する能力は、明確な巨大分子構成単位の利用可能性に大きく依存している。ナノ構造にさらなる部分を結合させる能力は、結合の制御の欠落、得られるナノ構造の限られた安定性、ならびに形成中のナノ構造の望ましくない凝集および沈殿により制限されている。したがって、ナノ構造が制御された様式で修飾され、安定であり、あるとしても多くの凝集をもたらさないように付加された生物学的部分を有するナノ構造を調製する方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（要約）
上記を鑑みて、本発明は、ナノ構造が制御された様式で修飾され、安定であり、あるとしても多くの凝集をもたらさないように付加された生物学的部分を有するナノ粒子を提供する。当業者には、本発明の１つまたは複数の態様が、ある特定の目的を達成することができ、その他の１つまたは複数の態様が、ある特定のその他の目的を達成することができることが理解される。それぞれの目的は、そのあらゆる面で、本発明のすべての態様に等しく当てはまらない場合がある。したがって、以下の目的は、本発明のいずれか１つの態様に関して選択的に考慮され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本明細書では、一態様において、オリゴヌクレオチドに共有結合している分子を含み、該オリゴヌクレオチドはさらにナノ粒子の表面に共有結合している、分子修飾ナノ粒子が開示される。様々な実施形態において、分子はオリゴヌクレオチドの第１の末端で結合しており、ナノ粒子はオリゴヌクレオチドの第２の末端で結合している。いくつかの実施形態において、分子は生体分子であり、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、またはこれらの組合せであってもよい。特定の実施形態において、分子は抗体である。様々な実施形態において、ナノ粒子は金属である。特定の実施形態において、金属は金である。特定の実施形態において、ナノ粒子は金であり、オリゴヌクレオチドは、硫黄原子を含む連結基を介してナノ粒子の表面に結合している。ナノ粒子が金であるいくつかの実施形態において、金ナノ粒子は、約１０ｎｍから約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２０核酸塩基から１５０核酸塩基を有する。
【０００６】
別の態様において、本明細書では、本明細書で開示される分子修飾ナノ粒子の調製方法であって、オリゴヌクレオチドが官能基を介してナノ粒子の表面に結合するように、第１の異なる場所に官能基および第２の異なる場所に脱離基を有するオリゴヌクレオチドにナノ粒子を接触させて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成するステップと、得られるオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、求核基を有する分子に、分子の求核基によるオリゴヌクレオチド上の脱離基の置換を可能とするのに十分な条件下で接触させて、分子修飾ナノ粒子を形成するステップとを含む方法が開示される。
【０００７】
さらに別の態様において、本明細書では、分子修飾ナノ粒子を使用した試料中の検体の検出方法であって、試料を本明細書で開示される分子修飾ナノ粒子に、検体の分子への結合を可能とする条件下で接触させるステップと、得られるナノ粒子結合検体を検出するステップとを含み、検体が分子修飾ナノ粒子に結合すると検出事象が生じる方法が開示される。いくつかの実施形態において、検出事象は、色の変化、分子修飾ナノ粒子の導電性の変化、蛍光性の変化、沈殿物を生成する溶解度の変化、光散乱の変化、または、分子修飾ナノ粒子のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドの融点の変化を含む。他の実施形態において、試料中の検体の濃度を計算することができる。特定の実施形態において、本明細書で開示される検出方法は、約３００ｆＭ（フェムトモル）の濃度の検体を検出するのに十分な感度を有する。
【０００８】
本発明のある特定の制限されない利益および実用性を例示すると、そのようなナノ粒子は、１種または複数種の抗原を発現する癌細胞に接触させることができ、上述の親水性部分のうちの１つまたは複数が、そのような抗原（複数可）に対する１種または複数種の抗体とコンジュゲートしている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】抗体およびオリゴヌクレオチドが別個にナノ粒子表面に結合している、抗体修飾ナノ粒子の従来の調製方法のスキームである。
【図２】分子がオリゴヌクレオチドを介してナノ粒子に結合している、分子修飾ナノ粒子の本明細書に開示される調製方法のスキームである。
【図３】一連の検体（ここでは前立腺特異抗原（ＰＳＡ））濃度にわたるシグナルの較正を示す図である。
【図４】本明細書で開示される方法を使用した、様々な血清試料におけるバックグラウンドノイズとしてのＰＳＡの検出結果を示す図である。
【図５】ＰＳＡの存在に対するプローブあり（左側の棒グラフ）またはなし（右側の棒グラフ）での、様々な濃度のＰＳＡ標準物質を添加した３０％ヒト血清を使用した較正曲線である。
【図６】パネルＡは、分子修飾ナノ粒子およびスライド表面上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブを介した分子修飾ナノ粒子の結合モードを示す、オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出する手段としての様々な濃度の分子修飾ナノ粒子の存在下での、本明細書に開示される検出アッセイの結合アッセイ結果を示す図である。パネルＢは、分子修飾ナノ粒子の分子の標的検体（ここではＰＳＡの抗原）の検出に向けた分子修飾ナノ粒子の特異性を示す、様々な条件の存在下でのスライドの表面上の表面結合抗原（ここではＰＳＡ）を示す図であり、ウェル１は、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗体を有し、ウェル２は、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗原を有し、ウェル３は、バイオバーコードおよびアッセイ緩衝液を有し、ウェル４は、バイオバーコードプローブを有する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
本明細書では、分子修飾ナノ粒子が開示され、ナノ粒子は、少なくともその表面の一部にオリゴヌクレオチドを介して結合した分子を有する。さらに、該ナノ粒子の調製方法も開示される。開示された方法は、ナノ粒子に分子を結合させる既知の従来方法と比較して、ナノ粒子への分子の担持に対するより良好な制御を可能とし、および／またはより安定でより凝集の少ない分子修飾ナノ粒子が得られる。
【００１１】
オリゴヌクレオチドおよび分子の両方が結合したナノ粒子の従来の調製手段では、まず分子（例えば、抗体等の生体分子）をナノ粒子表面にコンジュゲートさせた後、表面の残りの部分にオリゴヌクレオチドを付加し、表面の空隙がオリゴヌクレオチドにより充填されることにより調製されていた。過去に使用されていた手順は、多くの場合制御が困難であり、一般にナノ粒子の単離中に多量の沈殿したナノ粒子が観察された。このようにして調製された修飾ナノ粒子はまた、保存期間が限られているようであり、したがって、長期にわたる使用には、毎日のプローブ調製が必要であった。この従来の方法を、図１に示す。
【００１２】
本明細書に開示された方法は、１つの異なる場所に官能基を有し、第２の異なる場所に脱離基を有するオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、まず官能基を介してナノ粒子上に担持させてオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成し、得られたオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、単離して、必要となる時まで保存することができる。次いで、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、オリゴヌクレオチド上の脱離基を介してさらに分子（例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、または炭水化物等の生体分子）で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、一方の末端の官能基を介して、例えばジスルフィド結合によりナノ粒子の表面と反応することができ、またオリゴヌクレオチドの反対側の末端上の脱離基を介して、分子上の求核基とも反応することができる。開示された方法を図２に概略的に示すが、図中、Ｔｓはトシルである。
【００１３】
分子の前にオリゴヌクレオチドをナノ粒子上に担持させることは、オリゴヌクレオチドの担持を最大化することができる。オリゴヌクレオチドの増加したまたは高密度の担持は、検出アッセイにおける識別シグナルの最大増幅を可能とする。対象検体の存在を検出するように識別シグナルが増幅されるため、増幅が大きい程その検体のより高感度な検出が可能となる。追加的および代替的に、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド数の増加は、より大きなナノ粒子を使用することにより達成することができる。
【００１４】
ナノ粒子
実際には、それに結合したオリゴヌクレオチドを有するように修飾され得る任意の好適なナノ粒子を使用する方法が提供される。ナノ粒子のサイズ、形状、および化学組成は、得られるオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の特性に寄与する。これらの特性は、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学的特性、電子特性、各種溶液中での安定性、磁気特性、ならびに細孔および経路のサイズ変動性等を含む。均一のサイズ、形状、および化学組成を有するナノ粒子の使用だけでなく、異なるサイズ、形状、および／または化学組成を有するナノ粒子の混合物の使用も企図される。好適な粒子の例は、制限することなく、凝集粒子、等方性粒子（例えば球状粒子等）および異方性粒子（例えば非球状のロッド、四面体、角柱等）、ならびにコアシェル粒子、例えば米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開番号ＷＯ２００３／０８５３９（これらの開示は参照によりその全体が組み入れられる）に記載の粒子を含む。
【００１５】
一実施形態において、ナノ粒子は金属であり、様々な態様において、ナノ粒子はコロイド金属である。したがって、様々な実施形態において、本方法の実践において有用なナノ粒子は、金属（例えば、制限することなく、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、または、ナノ粒子を形成し易い他の任意の金属を含む）、半導体（例えば、制限することなく、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、および、ＺｎＳで被覆されたＣｄＳまたはＣｄＳｅを含む）、ならびに磁性（例えばフェロマグネタイト）コロイド材料を含む。本発明の実践において有用なその他のナノ粒子は、これもまた制限することなく、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、スチール、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓを含む。ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子の作製方法もまた当技術分野では既知である。例えば、Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、第３２巻、４１頁（１９９３年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ、Ｔｏｐ． Ｃｕｒｒ． Ｃｈｅｍ．、第１４３巻、１１３頁（１９８８年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、第８９巻、１８６１頁（１９８９年）；Ｂｒｕｓ、Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． Ａ．、第５３巻、４６５頁（１９９１年）；Ｂａｈｎｃｍａｎｎ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｓｏｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ（ＰｅｌｉｚｅｔｔｉおよびＳｃｈｉａｖｅｌｌｏ編集、１９９１年）、２５１頁；ＷａｎｇおよびＨｅｒｒｏｎ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５２５頁（１９９１年）；Ｏｌｓｈａｖｓｋｙら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１１２巻、９４３８頁（１９９０年）；およびＵｓｈｉｄａら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９５巻、５３８２頁（１９９２年）を参照されたい。
【００１６】
金属、半導体、および磁性ナノ粒子の作製方法は、当技術分野では周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ， Ｇ．（編集）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４年）；Ｈａｙａｔ， Ｍ． Ａ．（編集）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９１年）；Ｍａｓｓａｒｔ， Ｒ．、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、第１７巻、１２４７頁（１９８１年）；Ａｈｍａｄｉ， Ｔ． Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７２巻、１９２４頁（１９９６年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ， Ａ．ら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９９巻、１４１２９頁（１９９５年）；Ｃｕｒｔｉｓ， Ａ． Ｃ．ら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、第２７巻、１５３０頁（１９８８年）を参照されたい。Ｆａｔｔａｌら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９８年）第５３巻：１３７〜１４３頁および米国特許第４，４８９，０５５号には、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の調製が記載されている。Ｌｉｕら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（２００４年）第１２６巻：７４２２〜７４２３頁には、ポリ（Ｄ−グルカラミドアミン）を含むナノ粒子の作製方法が記載されている。Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８年）第２６巻：５４２５〜５４３１頁には、重合メチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含むナノ粒子の調製が、また、例えばＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９６年）第９３巻：４８９７〜４９０２頁には、デンドリマーナノ粒子の調製（星型ポリアミドアミンデンドリマー）が記載されている。好適なナノ粒子はまた、例えば、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．（金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）、およびＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（金）等から市販されている。約１４０ｎｍの分散凝集粒子サイズを有する酸化スズナノ粒子は、日本国千葉県の真空冶金株式会社から市販されている。様々な組成およびサイズ範囲のその他の市販のナノ粒子は、例えば、カリフォルニア州ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅのＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００１７】
また、米国特許出願公開第２００３／０１４７９６６号に記載されているように、本明細書に記載の材料を含むナノ粒子は、市販されているか、または、溶液中での連続核生成から（例えばコロイド反応により）、もしくはスパッタ堆積等の様々な物理および化学気相堆積プロセスにより生成することができる。例えば、ＨａＶａｓｈｉ、Ｖａｃ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａ５（４）：１３７５〜８４頁（１９８７年）；Ｈａｙａｓｈｉ、Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ、４４〜６０頁（１９８７年）；ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１９９０年１月、１６〜４７頁を参照されたい。米国特許出願公開第２００３／０１４７９６６号にさらに記載されているように、企図されるナノ粒子は、当技術分野で知られた方法を用いて、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸塩還元剤を使用して生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ．第１１巻：３４〜３７頁（１９９９年）；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ．第１０巻：１２１４〜１９頁（１９９８年）；Ｅｎｕｓｔｕｎ ＆ Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．第８５巻：３３１７頁（１９６３年）を参照されたい。
【００１８】
ナノ粒子は、平均直径約１ｎｍから約２５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約２００ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１００ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約３０ｎｍ、または平均直径約１ｎｍから約２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍから約１０ｎｍの範囲のサイズであってよい。他の態様において、ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、約５ｎｍから約５０ｎｍ、約１０ｎｍから約３０ｎｍ、約１０ｎｍから１５０ｎｍ、約１０ｎｍから約１００ｎｍ、または約１０ｎｍから約５０ｎｍである。ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０ｎｍから約１００ｎｍ、約４０ｎｍから約８０ｎｍである。方法に使用されるナノ粒子のサイズは、特定の使用または用途での要件に応じて変動する。サイズの変動性は、例えば、本明細書に記載されるように誘導体化され得る光学特性または表面積の量等の、ナノ粒子のある特定の物理的特性を最適化するために有利に利用される。
【００１９】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然および／または非天然ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本開示を通して、ヌクレオチドは、あるいは核酸塩基と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または、ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドの修飾型であってもよい。
【００２０】
天然発生核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を含み、またキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾールピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン等の非天然発生核酸塩基および「非天然」核酸塩基は、米国特許第５，４３２，２７２号およびＦｒｅｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻：４４２９〜４４４３頁（１９９７年）に記載されているものを含む。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。さらなる天然および非天然発生核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｓａｎｇｈｖｉ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＣｒｏｏｋｅおよびＢ． Ｌｅｂｌｅｕ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、第１５章；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、第３０巻：６１３〜７２２頁（１９９１年）；およびＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｊ． Ｉ． Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年、８５８〜８５９頁、Ｃｏｏｋ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、第６巻、５８５〜６０７頁（１９９１年）（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に開示されているものを含む。核酸塩基はまた、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能するある特定の「ユニバーサル塩基」を含む、核酸塩基のように機能することができる複素環化合物等の化合物を含む。ユニバーサル塩基としては、特に、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが挙げられる。その他の望ましいユニバーサル塩基は、当技術分野で知られたユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含む。オリゴヌクレオチドの修飾型もまた企図され、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結基を有するものを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、すべてまたはその一部がペプチド核酸である。その他の修飾ヌクレオシド間連結基は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結基を含む。さらに他の修飾オリゴヌクレオチドは、１種または複数種のユニバーサル塩基を含むものを含む。ユニバーサル塩基類似体に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定におけるプライマーとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例は、５’−ニトロインドール−２’−デオキシリボシド、３−ニトロピロール、イノシンおよびピロキサンチンを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェートであって、通常の３’−５’連結基、それらの２’−５’連結類似体を有するもの、および、１つまたは複数のヌクレオチド間連結基が３’から３’、５’から５’、または２’から２’の連結基である、反転した極性を有するものを含む。また、最も３’側のヌクレオチド間連結において単一の３’から３’の連結基を備えた、反転した極性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、脱塩基部位（ヌクレオチドがないか、またはその代わりにヒドロキシ基を有する）であってもよい一回反転したヌクレオシド残基も企図される。塩、混合塩および遊離酸の形態もまた企図される。上記リン含有連結基の調製を教示している代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号（これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）を含む。
【００２２】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結基、へテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結基の混合、または１種もしくは複数種の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結基により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結基；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに、その他Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の混合部分を有する骨格を有するものを含む。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００２３】
ヌクレオチド単位の１種もしくは複数種の糖および／または１種もしくは複数種のヌクレオチド間連結基の両方が「非天然発生」基で置き換えられた修飾オリゴヌクレオチド。一態様において、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格で置き換えられている。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、第２５４巻、１４９７〜１５００頁（これらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００２４】
開示されたオリゴヌクレオチドにおいて企図されるヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドの間の他の連結基は、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号；米国特許出願公開第２００４０２１９５６５号；国際特許公開番号ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ第５巻：３４３〜３５５頁（１９９５年）、ならびにＳｕｓａｎ Ｍ． ＦｒｅｉｅｒおよびＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻：４４２９〜４４４３頁（１９９７年）に記載のものを含む。
【００２５】
提供された方法における使用のためのナノ粒子は、約５ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドまたはその修飾型で修飾されている。また、オリゴヌクレオチドが約５ヌクレオチドから約１４０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１３０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１２０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１１０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約９０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約７０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約４５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドの長さ、約５ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドの長さ、および、オリゴヌクレオチドが所望の結果を達成し得る範囲内の、具体的に開示されたサイズの中間的長さのすべてのオリゴヌクレオチドである方法もまた企図される。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが企図される。
【００２６】
さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、約８個のヌクレオチドから約８０個のヌクレオチド（すなわち、約８個から約８０個の連結ヌクレオシド）を含む。方法は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの長さの化合物を利用することが、当業者には理解される。
【００２７】
オリゴヌクレオチド配列およびハイブリダイゼーション
提供された方法で利用される各ナノ粒子は、それに結合した複数のオリゴヌクレオチドを有する。その結果、各オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、第２のオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子、および／または、存在する場合には、十分に相補的な配列を有する遊離オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力を有する。一態様において、各ナノ粒子が同一のオリゴヌクレオチドで修飾される、すなわち、ナノ粒子に結合した各オリゴヌクレオチドが同じ長さおよび同じ配列を有する方法が提供される。他の態様において、各ナノ粒子は、同一ではない２種以上のオリゴヌクレオチドで修飾される、すなわち、結合したオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１個が、異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点で、少なくとも１個の他の結合オリゴヌクレオチドと異なる。
【００２８】
所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）およびＦ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編集）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方に好ましい（ＤＮＡ合成の周知の方法もまたＲＮＡ合成に有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドはまた、酵素的に調製可能である。非天然発生核酸塩基をオリゴヌクレオチドに組み込むこともできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号；Ｋａｔｚ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第７４巻：２２３８頁（１９５１年）；Ｙａｍａｎｅら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第８３巻：２５９９頁（１９６１年）；Ｋｏｓｔｕｒｋｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１３巻：３９４９頁（１９７４年）；Ｔｈｏｍａｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第７６巻：６０３２頁（１９５４年）；Ｚｈａｎｇら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２７巻：７４〜７５頁（２００５年）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２４巻：１３６８４〜１３６８５頁（２００２年）を参照されたい。
【００２９】
いくつかの態様において、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドと相補的である。様々な態様において、オリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドと１００％相補的、すなわち完全に一致し、一方その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約９５％（つまり９５％以上を意味する）、オリゴヌクレオチドの長さにわたってプローブ化合物と相補的であり、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、オリゴヌクレオチドの長さにわたってプローブ化合物と相補的である。
【００３０】
プローブオリゴヌクレオチドは、対象検体の検出を支援するため検出アッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドである。プローブオリゴヌクレオチドは、後述するバイオバーコードアッセイ等のアッセイにおいて使用することができる。例えば、米国特許第６，３６１，９４４号；第６，４１７，３４０号；第６，４９５，３２４号；第６，５０６，５６４号；第６，５８２，９２１号；第６，６０２，６６９号；第６，６１０，４９１号；第６，６７８，５４８号；第６，６７７，１２２号；第６６８２，８９５号；第６，７０９，８２５号；第６，７２０，１４７号；第６，７２０，４１１号；第６，７５０，０１６号；第６，７５９，１９９号；第６，７６７，７０２号；第６，７７３，８８４号；第６，７７７，１８６号；第６，８１２，３３４号；第６，８１８，７５３号；第６，８２８，４３２号；第６，８２７，９７９号；第６，８６１，２２１号；および第６，８７８，８１４号を参照されたい。
【００３１】
ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合
本明細書に開示されたオリゴヌクレオチドは、１つの異なる場所に脱離基を組み込み、第２の異なる場所に官能基を組み込むように修飾される。いくつかの実施形態において、脱離基はオリゴヌクレオチドの第１の末端に向かい、官能基はオリゴヌクレオチドの反対側の末端にある。特定の実施形態において、脱離基はオリゴヌクレオチドの一方の末端にあり、官能基は反対側の末端にある。脱離基および官能基部分は、脱離基および／または官能基部分を有するように修飾され得るオリゴヌクレオチドの任意の部分で結合し得る。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、官能基部分を介してナノ粒子に結合する。修飾され得るオリゴヌクレオチド上の部位の例は、ヒドロキシ、ホスフェート、またはアミンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子表面への結合のための脱離基および／または官能基部分を組み込む非天然核酸塩基を有する。様々な態様において、官能基はスペーサである。これらの態様において、スペーサは、有機部分、ポリマー、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、および／またはオリゴ糖である。ナノ粒子の表面に結合するためにオリゴヌクレオチドを官能化する方法は、当技術分野では周知である。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ．、１０９〜１２１頁（１９９５年）を参照されたい。また、Ｍｕｃｉｃら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．５５５〜５５７頁（１９９６年）（３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に結合させる方法を記載；この方法はオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために使用することができる）を参照されたい。また、アルカンチオール法を使用してオリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイド、ならびに上に挙げたその他のナノ粒子に結合させることもできる。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるためのその他の官能基は、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面への結合に関して、米国特許第５，４７２，８８１号を参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面への結合に関して、Ｂｕｒｗｅｌｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４巻：３７０〜３７７頁（１９７４年）ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０３巻：３１８５〜３１９１頁（１９８１年）を、またアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの類似の結合に関して、Ｇｒａｂａｒｅｔａｌ．、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、第６７巻：７３５〜７４３頁を参照）を含む。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるために、５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドで終端したオリゴヌクレオチドを使用することもできる。以下の参考文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために使用可能なその他の方法を記載している：Ｎｕｚｚｏら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０９巻：２３５８頁（１９８７年）（金上のジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１巻：４５頁（１９８５年）（アルミニウム上のカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓ、Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、第４９巻：４１０〜４２１頁（１９７４年）（銅上のカルボン酸）；Ｉｌｅｒ、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ、第６章、（Ｗｉｌｅｙ １９７９年）（シリカ上のカルボン酸）；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＺｉｓｍａｎ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第６９巻：９８４〜９９０頁（１９６５年）（白金上のカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１０４巻：３９３７頁（１９８２年）（白金上の芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、第１３巻：１７７頁（１９８０年）（白金上のスルホラン、スルホキシドおよびその他の官能化溶媒）；Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１１１巻：７２７１頁（１９８９年）（白金上のイソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：１０４５頁（１９８７年）（シリカ上のシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：１０３４頁（１９８７年）（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第５巻：１０７４頁（１９８９年）（シリカ上のシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第３巻：９５１頁（１９８７年）（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；Ｌｅｃら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、第９２巻：２５９７頁（１９８８年）（金属上の固定ホスフェート）。
【００３３】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つの末端に向かってジスルフィド官能基を有する。この官能基は、例えば、ジチオールホスホラミダイト核酸塩基（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡから販売されているＤＴＰＡ等）を使用して達成することができる。オリゴヌクレオチドの官能基としてのＤＴＰＡの選択は、遊離チオールがオリゴヌクレオチドの脱離基の末端と反応してオリゴヌクレオチドの自己会合体を形成し得るため、好ましい。しかし、開示された条件下で安定であり、分子修飾ナノ粒子を提供することができる、ナノ粒子表面に結合可能な官能基と脱離基部分の任意の組合せが企図される。
【００３４】
オリゴヌクレオチド密度
オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、または５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度でナノ粒子に結合する方法が提供される。
【００３５】
一態様において、オリゴヌクレオチドのナノ粒子表面上での充填密度は、ナノ粒子間、および単一のナノ粒子上のポリヌクレオチド鎖間の協同的な挙動をもたらすのに十分である方法が提供される。別の態様において、ナノ粒子間の共同的な挙動は、オリゴヌクレオチドの分解に対する耐性を増加させる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドへの分子の結合
本明細書に開示されたオリゴヌクレオチドは、異なる場所で脱離基により修飾される。本明細書で使用される場合、脱離基とは、求核基による求核攻撃を容易に受けやすい部分を指す。典型的な脱離基は、トシル、メシル、トリチル、置換トリチル、ニトロフェニル、クロロフェニル、フルオレニルメトキシカルボニル、およびスクシンイミジルを含むが、これらに限定されない。好ましい脱離基は、トシルである。脱離基の機能性を提供するためのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾は、当技術分野では周知である。例えば、オリゴヌクレオチドを脱離基で修飾する方法に関して、ＷＯ９３／０２０２４２を参照されたい。
【００３７】
分子は、オリゴヌクレオチド上の脱離基の求核置換を介してナノ粒子に結合する。分子上の求核基は、例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシレート、チオール、または、脱離基を置換することができるその他の任意の部分であってもよい。求核基による脱離基の置換を可能とするのに十分な条件は、化学分野の当業者により容易に決定される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された分子は、対象検体の標的分子である。標的分子の例は、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等を含む。より具体的な例は、対象抗原に対する抗体、対象酵素の小分子受容体、対象小分子受容体の酵素を含む。
【００３９】
検出アッセイ
開示された分子修飾ナノ粒子は、バイオバーコードアッセイ等の検出アッセイにおいて使用することができる。米国特許第７，３２３，３０９号；第６，９７４，６６９号；第６，７５０，０１６号；第６，２６８，２２２号；第５，５１２，４３９号；第５，１０４，７９１号；第４，６７２，０４０号；および第４，１７７，２５３号；米国特許出願公開第２００１／００３１４６９号；第２００２／０１４６７４５号；および第２００４／０２０９３７６号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ０５／００３３９４（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。固定された分子が使用されるその他の検出アッセイもまた企図される。そのようなアッセイの限定されない例は、イムノＰＣＲアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロッティング、間接蛍光抗体試験、溶解度変化、吸光度変化、伝導度変化、およびラマンまたはＩＲスペクトル変化を含む。（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２１巻（２および３）：１６５〜２０９頁（２０００年）；Ｈｅｒｂｒｉｎｋら、Ｔｅｃｈ． Ｄｉａｇｎ． Ｐａｔｈｏｌ．第２巻：１〜１９頁（１９９２年）；ならびに米国特許第５，６３５，６０２号および第５，６６５，５３９号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。）
検体が分子修飾ナノ粒子に結合すると、「検出事象」と呼ばれる検出可能な変化が生成じる。用いられているアッセイに依存して、その検出事象は、蛍光性の変化（例えば蛍光標識が使用される実施形態の場合）；吸光度の変化、ラマンスペクトルの変化；電気特性の変化（例えば試料もしくは分子修飾ナノ粒子の導電性の増加もしくは減少）；光散乱の変化；溶解度の変化（例えば、分子修飾ナノ粒子に結合する検体が、それをアッセイ溶液から沈殿させる）、または、既知の手段を使用して検出可能な物理的もしくは化学的特性の他のいくつかの変化であり得る。
【００４０】
開示された方法を使用して、検体は、非常に低濃度で検出され得る。いくつかの実施形態において、検体は、３００ｆＭという低い濃度で存在する。様々な実施形態において、検体の濃度は、検出事象、例えば吸光度の変化等を比較し、またその結果を較正曲線と比較することにより決定され得る。
【００４１】
本発明の追加の態様および詳細は、限定ではなく例示を意図する以下の実施例から明らかとなる。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
トシル化オリゴヌクレオチドの調製
Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製Ｕｌｔｒａｍｉｌｄ試薬を１μモルスケールで使用した標準的なホスホラミダイト合成によりオリゴヌクレオチドを調製した。３’ジチオール官能化および金へのオリゴの結合のために、ＡまたはＧ、ＣＰＧ Ｕｌｔｒａｍｉｌｄサポートを使用して、ＤＴＰＡモノマー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を３’端に導入した。５’トシルＴ−ホスホラミダイトを使用して、５’トシル修飾を導入した（Ｈｅｒｒｌｅｉｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．第１１７巻：１０１５１〜１０１５２頁（１９９５年））。次いで、保護されたオリゴヌクレオチドを、濃縮水酸化アンモニウム中、５５℃で１５分間脱保護した後、室温で１．５時間静置した。水酸化アンモニウムは、窒素気流下で除去した。次いで粗生成物を、逆相カラム上で、１％／分の勾配、３ｍＬ／分の流速を用いて、ＨＰＬＣ（０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）で精製した。
【００４３】
（実施例２）
トシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子の調製
実施例１のトシル化オリゴヌクレオチド１Ｏ．Ｄ．を３０ｎｍ金粒子１ｍＬに添加することにより、トシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子を調製した。混合物を室温で２４時間静置した。この最初のインキュベーション期間の後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を導入して最終濃度を０．１％とした後、１Ｍ塩溶液を使用して塩化ナトリウムを添加し、最終濃度を０．１Ｍとした。次いで混合物を室温で４８時間静置した。次いで、エッペンドルフ卓上遠心分離機を使用して、６８００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によりコンジュゲートを回収し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で２回洗浄し、最後にＮａｎｏｐｕｒｅ水に懸濁させて冷蔵した。
【００４４】
（実施例３）
分子修飾ナノ粒子の調製
実施例２のトシル−オリゴヌクレオチドナノ粒子３．０ｍＬを、遠心分離および上澄みの除去により６０μＬに濃縮することにより、分子修飾ナノ粒子を調製した。この濃縮物に、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２０μＬ、次いで２０μＬのＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中の所望の分子１０μｇを添加した。
【００４５】
特定の実施例において、ＰＳＡ検出が望ましかったため、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製ポリクローナル抗体、抗ｈ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−３親和性精製ヤギＩｇＧを使用した。この混合物に、ｐＨ９．５の０．２Ｍホウ酸塩緩衝液１００μＬを添加した。混合物を、エッペンドルフＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒで、５５０ｒｐｍで２４時間、３７℃で反応させた。この混合物に、１０％ＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、前記条件下でさらに２４時間反応させた。分子修飾ナノ粒子を５８００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により回収した後、０．１％のＢＳＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０（アッセイ緩衝液）を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄し、最後にアッセイ緩衝液３ｍＬ中に再懸濁させ、検出アッセイで使用されるまで冷蔵した。
【００４６】
（実施例４）
分子修飾ナノ粒子を使用した標的分子の検出
材料 ＣｏｄｅＬｉｎｋスライドをＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手し、製造者が推奨する方法を用いてアミノ捕捉オリゴヌクレオチドでプリントした。オリゴヌクレオチド捕捉プローブおよび対照オリゴを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、さらに精製することなく使用した。バーコード捕捉配列５’ＴＣＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＧＴ Ｔ／３ＡｍＭ−３’（配列番号１）（ここで３ＡｍＭはアミノ修飾因子Ｃ６である）；対照捕捉配列５’ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＧ／３ＡｍＭ／３’（配列番号２）バーコード配列：３’−Ｇ−ＤＴＰＡ−Ｔ１９−ＡＣＣ−ＧＡＡ−ＧＴＡ−ＡＣＧ−ＴＧＧ−ＣＡＡ−Ｔ−トシル（配列番号３）Ｗａｓｈ Ａ、Ｂ、Ａ２０シグナルプローブ（配列番号４）、ハイブリダイゼーションチャンバ、Ｓｈａｂｂｏｎａ研究プラットフォーム、および銀増感溶液を、Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．から購入し、製造者が推奨する方法に従い使用した。ヨウ素溶液（０．１Ｎ体積標準）を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した。試験を通して、ＰＳＡ（９０：１０ ＷＨＯ ＰＳＡ標準；９０％結合：１０％遊離）を較正曲線用の標準物質として使用した。
【００４７】
ハイブリダイゼーション。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社で、マイクロアレイ（ＣｏｄｅＬｉｎｋスライド；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、バーコード捕捉オリゴヌクレオチド（特定のバーコード配列と相補的）および対照配列（非相補的配列）でプリントし、それにより各スライドは、スライド毎に、アレイにつき各捕捉配列の６つの繰り返しを有する１０個のアレイが施された。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅハイブリダイゼーションチャンバを各スライドに取り付け、各アレイを物理的に分離した。バーコード５５μＬを載せた後、スライドを、６００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で６０分間インキュベートした。シグナルプローブミックス（５５μＬ、放出緩衝液５０μＬおよび１０ｎＭの１５ｎｍ ｄＡ２０（配列番号４）金ナノ粒子プローブ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．製）５μＬを含有）を添加し、インキュベーションを３０分継続した。ハイブリダイゼーションの後、Ｗａｓｈ Ａ（０．５Ｎ ＮａＮＯ３、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％ＳＤＳ）中で１分間に３回、次いでＷａｓｈ Ｂ（０．５Ｎ ＮａＮＯ３）中で１分間に２回スライドを洗浄した。最後に０．１Ｎ ＮａＮＯ３中で速やかに洗浄（１〜２秒）した後、スライドを脱水した。
【００４８】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が存在するかどうかについて、バイオバーコードアッセイ（例えば米国特許第６，４９５，３２４号を参照）により、実施例３で調製したＰＳＡ抗体ナノ粒子を使用して一連のヒト血清試料をスクリーニングした。本実施例において、適切な場合には、磁気分離および撹拌デバイスを備えたＳｈａｂｂｏｎａ液体処理ステーションを使用した。１％ポリアクリル酸ナトリウム塩（１５，０００ＭＷ）を含有するアッセイ緩衝液３０μＬを試験ウェルに添加することにより、血清中の一連の較正用標準試料および未知試料を含有する試料ブロックを調製した。この溶液に、血清３０μＬを添加し、続いて、製造者が推薦する方法を用いてＰＳＡモノクローナルＡｂ（Ａｂｃａｍ Ａｂ４０３）により事前に官能化された磁性粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＭｙＯｎｅトシル化粒子）４０μＬ（反応ウェル毎に１．５μｇ）を添加した。次いで混合物を室温で１時間撹拌し（１２００ｒｐｍ）、１％アッセイ緩衝液を使用して２回洗浄すると同時に磁気分離を行った。次いで、金ナノ粒子（５０μＬ、１５０ｐＭ）を試験ウェルに投入してから、混合物を室温で１時間撹拌した。この混合物に、アッセイ緩衝液１５０μＬを添加し、続いて磁気分離を行った。続いてアッセイ緩衝液２００μＬで５回洗浄し、アッセイ緩衝液を溶出緩衝液に交換した後（２×ＰＢＳ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０、１９０μＬ）、試料をＰＣＲチューブに移し、０．１Ｎヨウ素水溶液１０μＬを添加した後、ハイブリダイゼーション標準試料１０μＬを最終濃度１０ｆＭまで添加した。次いでこの混合物を１０分間９５℃で加熱し、金を溶解させることにより金ナノ粒子からバーコードを放出させ（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２０巻：１９０６頁（１９９８年）；Ｋｉｍら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、第１２２巻：７６１６頁（２０００年）；Ｐｕｄｄｅｐｈａｔｔ、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｇｏｌｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９７８年）、室温まで冷却して、事前にバーコードと相補的なアミノ捕捉オリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドをプリントしたＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）ガラススライドを備えた、ハイブリダイゼーションチャンバ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）に移した。次いでアセンブリを、６００ｒｐｍで撹拌しながら、４０℃で６０分間インキュベータ内に置いた。次いでガラススライドをＷａｓｈ Ａ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）溶液で２回洗浄し、新たなハイブリダイゼーションチャンバに再び組み付けた。アセンブリの各ウェルに、新鮮な溶出緩衝液およびＡ２０（配列番号４）シグナルプローブ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）を含有するハイブリダイゼーション溶液を、最終濃度１ｎＭまで添加した。アセンブリ全体を、６００ｒｐｍで撹拌しながら４０℃のインキュベータ内に３０分間置いた。次いでアセンブリを解体し、Ｗａｓｈ Ａで２回洗浄した。次いでスライドをＷａｓｈ Ｂ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製）溶液で３回洗浄して脱水した。Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．製銀増感溶液を使用して、銀現像を室温で５分間行った。
【００４９】
バーコードシグナル検出。Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ＡおよびＳｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂ（ともにＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．製）の等容積を混合し、速やかにプラスチックスライドホルダ内のスライド上に注ぎ、室温で５分間インキュベートした。水中で２回洗浄し、水中で完全に濯ぐことにより反応を止めた。スライドを脱水し、スライドの裏側を慎重に拭いて、埃、塩、およびその他の混入物質を除去した。スライドをＶｅｒｉｇｅｎｅ（商標）ＩＤシステム（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ社製）で走査した。
【００５０】
バーコード画像分析。走査画像（Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤからの１６ビットＴＩＦＦ）を、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ｖ５．１ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で分析した。平均スポット強度を、まず局所バックグラウンド（各スポットの近傍における同様のサイズの領域の平均ピクセル値）について較正し、生のスポット強度を生成した。図３は、１％ＰＡＡを含有するアッセイ緩衝液における較正曲線を示す。図３に示される結果は、自動化プラットフォーム上でいくつかのアッセイ緩衝液中較正用標準試料とともに測定された代表的試料を示している。代表となる自動測定は、アッセイ緩衝液中ＷＨＯ ＰＳＡ標準試料を使用した。標準試料は、既知の濃度のＰＳＡ抗原を、０、０．１、１．０、５．０、および１０．０ｐｇ／ｍＬでアッセイ緩衝液中に添加することにより調製し、その後自動化システムでバイオバーコードアッセイを行い、ＰＳＡ標的滴定のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムからのグレースケール画像は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用してカラー画像に変換されている。
【００５１】
図４は、１％ＰＡＡを含有する３０％ヒト血清を使用した血清スクリーニングを示す。代表となる自動化測定は３０％ヒト血清を使用した。試料は、自動化システム上でヒト血清をアッセイ緩衝液に添加することにより調製し、ＰＳＡ標的検出のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムからのグレースケール画像は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用してカラー画像に変換されている。７１１血清が最も低いＰＳＡバックグラウンドを有し、ヒト血清における較正曲線に好適であると決定された。この血清を使用して、既知量のＰＳＡ標準試料を血清に添加し、タンパク質バイオバーコードアッセイを行うことにより、較正曲線を作成した。図５に示される結果は、自動化システムから得られたヒト血清におけるＰＳＡ較正曲線を示す。
【００５２】
図５は、１％ＰＡＡを含有する３０％ヒト血清における較正曲線を示す。代表となる自動化較正曲線は３０％ヒト血清を使用した。試料は、ヒト血清に０．１、１．０、５．０、および１０．０ｐｇ／ｍＬのＰＳＡ標準試料を添加し、続いて自動化システム上でヒト血清をアッセイ緩衝液に添加することにより調製し、ＰＳＡ標的検出のための３０ｎｍ Ａｕ ＮＰプローブから放出されたバーコードＤＮＡ鎖の走査測定検出を行った。
【００５３】
バイオバーコードプローブ特性決定。バイオバーコードプローブの二面性を実証するために、２つの別個の方法を開発した。プローブはキメラである（バーコードおよび抗体の両方が同じナノ粒子に結合している）ため、（抗体の活性を決定するための）タンパク質アッセイおよび（オリゴヌクレオチドバーコードの活性を検査するための）オリゴヌクレオチドアッセイを通してプローブの忠実性を実証する必要があった。そのようなアッセイは、抗原またはオリゴヌクレオチドバーコード捕捉配列を、ＣｏｄｅＬｉｎｋガラススライドの表面上に別個にプリントすることにより考案された。これらの分子の化学的結合の後、別個の実験において、プリントされた表面をバイオバーコードプローブで負荷した。これらの新規で高感度のプローブの二重の結合および選択性を、これらのアッセイにおいて実証することに成功した。図６のパネルＡは、バイオバーコードプローブを使用したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの結果を示し、一方パネルＢは、アッセイ緩衝液中の同じバイオバーコードプローブの抗原結合能力を示している。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび抗体抗原結合を介した、バイオバーコードプローブの直接結合アッセイ。図６のパネルＡは、プリントされた捕捉プローブで負荷された１０ｐＭ〜０ｆＭのプローブ希釈シリーズの濃縮用量／応答を示す。図６のパネルＢは、バイオバーコードプローブ（ウェル４）、アッセイ緩衝液（ウェル３）、バイオバーコードプローブおよび過剰の抗原（ウェル２）、ならびにバイオバーコードプローブおよび過剰の抗体（ウェル１）で負荷した、表面結合抗原の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドに共有結合している分子を含み、前記オリゴヌクレオチドはさらにナノ粒子に共有結合している、分子修飾ナノ粒子。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが第１の末端および第２の末端を有し、前記分子が前記第１の末端で結合しており、前記ナノ粒子が前記第２の末端で結合している、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項３】
前記分子が生体分子である、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項４】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項５】
前記生体分子が抗体である、請求項２に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項６】
前記ナノ粒子が約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子が金属である、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項８】
前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子が金を含む、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが官能基部分を介して前記ナノ粒子に結合しており、前記官能基部分は硫黄原子を含む、請求項９に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、ジチオールホスホラミダイト（ＤＴＰＡ）を使用して調製されたものである、請求項１０に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが２０核酸塩基から１５０核酸塩基の長さである、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１３】
分子修飾ナノ粒子の調製方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドが官能基部分を介してナノ粒子の表面に結合するように、第１の末端に前記官能基部分および第２の末端に脱離基を有する前記オリゴヌクレオチドに前記ナノ粒子を接触させて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成するステップと、
ｂ）（ａ）の前記オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、求核基を有する分子に、前記分子の求核基による前記オリゴヌクレオチド上の前記脱離基の置換を可能とするのに十分な条件下で接触させて、前記分子修飾ナノ粒子を形成するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記分子が生体分子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体分子が抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記求核基が、ヒドロキシル、アミン、またはチオールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記脱離基が、トシル、メシル、トリチル、置換トリチル、ニトロフェニル、クロロフェニル、フルオレニルメトキシカルボニル、およびスクシンイミジルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が金属である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が金を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子が約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが２０核酸塩基から１５０核酸塩基の長さである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の検体の検出方法であって、
ａ）前記試料を請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子に、検体の分子への結合を可能とする条件下で接触させるステップと、
ｂ）前記分子修飾ナノ粒子に結合した前記検体を検出するステップと
を含み、前記検体が前記分子修飾ナノ粒子に結合すると検出事象が生じる方法。
【請求項２５】
前記分子が生体分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドがプローブオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドはハイブリダイズされている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出事象が、前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを融解し、前記プローブオリゴヌクレオチドを検出することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出が、約３００ｆＭまでの低い濃度の検体を検出するような感度を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
オリゴヌクレオチドに共有結合している分子を含み、前記オリゴヌクレオチドはさらにナノ粒子に共有結合している、分子修飾ナノ粒子。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが第１の末端および第２の末端を有し、前記分子が前記第１の末端で結合しており、前記ナノ粒子が前記第２の末端で結合している、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項３】
前記分子が生体分子である、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項４】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項５】
前記生体分子が抗体である、請求項２に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項６】
前記ナノ粒子が約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子が金属である、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項８】
前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項７に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子が金を含む、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが官能基部分を介して前記ナノ粒子に結合しており、前記官能基部分は硫黄原子を含む、請求項９に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、ジチオールホスホラミダイト（ＤＴＰＡ）を使用して調製されたものである、請求項１０に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが２０核酸塩基から１５０核酸塩基の長さである、請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子。
【請求項１３】
分子修飾ナノ粒子の調製方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドが官能基部分を介してナノ粒子の表面に結合するように、第１の末端に前記官能基部分および第２の末端に脱離基を有する前記オリゴヌクレオチドに前記ナノ粒子を接触させて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を形成するステップと、
ｂ）（ａ）の前記オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、求核基を有する分子に、前記分子の求核基による前記オリゴヌクレオチド上の前記脱離基の置換を可能とするのに十分な条件下で接触させて、前記分子修飾ナノ粒子を形成するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記分子が生体分子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体分子が抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記求核基が、ヒドロキシル、アミン、またはチオールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記脱離基が、トシル、メシル、トリチル、置換トリチル、ニトロフェニル、クロロフェニル、フルオレニルメトキシカルボニル、およびスクシンイミジルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が金属である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が金を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子が約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが２０核酸塩基から１５０核酸塩基の長さである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の検体の検出方法であって、
ａ）前記試料を請求項１に記載の分子修飾ナノ粒子に、検体の分子への結合を可能とする条件下で接触させるステップと、
ｂ）前記分子修飾ナノ粒子に結合した前記検体を検出するステップと
を含み、前記検体が前記分子修飾ナノ粒子に結合すると検出事象が生じる方法。
【請求項２５】
前記分子が生体分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、炭水化物、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドがプローブオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドはハイブリダイズされている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出事象が、前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを融解し、前記プローブオリゴヌクレオチドを検出することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出が、約３００ｆＭまでの低い濃度の検体を検出するような感度を有する、請求項２４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２０７４９（Ｐ２０１０−５２０７４９Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１８１７（Ｐ２００９−５５１８１７）
【出願日】平成２０年２月２７日（２００８．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５５１３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２７７８９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０００４１０１９）ノースウェスタン ユニバーシティ (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２７日（２００８．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５５１３３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２７７８９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０００４１０１９）ノースウェスタン ユニバーシティ (24)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]