ニトリラーゼ、それらをコードする核酸及びそれらの作製と使用
【課題】新規なニトリラーゼおよびそのニトリラーゼをコードする核酸およびそれらを使用する方法を提供する。
【解決手段】特定の配列と少なくとも50%の配列同一性を有する配列、または、特定の配列若しくはその変種配列を有する単離核酸または組換え核酸、又はそれらの断片であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸又は断片、またはそれらの相補物。ニトリラーゼの鏡像選択制加水分解反応を利用したシアンヒドリン、アミノニトリルからの光学活性カルボン酸の製造方法。
【解決手段】特定の配列と少なくとも50%の配列同一性を有する配列、または、特定の配列若しくはその変種配列を有する単離核酸または組換え核酸、又はそれらの断片であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸又は断片、またはそれらの相補物。ニトリラーゼの鏡像選択制加水分解反応を利用したシアンヒドリン、アミノニトリルからの光学活性カルボン酸の製造方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)一以上の変異を有する配列番号209の変種配列と少なくとも95%同一の配列を有する核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号209の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号209の部位178-180がGAA又はGAGで置換されている;
配列番号209の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号209の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG又はACGで置換されている;
配列番号209の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号209の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号209の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずかの組合せである、前記核酸、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号210の変種と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基191がロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記核酸、
または、
(c)(a)または(b)に相補的な核酸、
を含む、単離、合成または組換え核酸。
【請求項2】
一以上の変異を有する配列番号209の変種と同一の配列を有する核酸を含む、単離、合成または組換え核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号209の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号209の部位178-180がGAA 又はGAGで置換されている;
配列番号209の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号209の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACGで置換されている;
配列番号209の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号209の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号209の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、
前記単離、合成または組換え核酸。
【請求項3】
請求項1記載の核酸を含む、宿主細胞での複製が可能な核酸ベクター。
【請求項4】
請求項1記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項5】
請求項3記載の宿主細胞を含む宿主生物。
【請求項6】
固相支持体に固定化された、請求項1記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項7】
固相支持体が、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項5記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項8】
(a)一以上の変異を有する配列番号210の変種と少なくとも95%同一の配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号210記載の配列を有するポリペプチドであって、ニトリラーゼ活性を有し、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(c)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが水素結合性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号210記載の配列を有するポリペプチド、
または、
(d)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが疎水性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号210記載の配列を有するポリペプチド、
を含む、単離、合成又は組換えポリペプチド。
【請求項9】
請求項8記載のポリペプチドに特異的に結合する精製抗体。
【請求項10】
(a)請求項8記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む酵素の、液体又は乾燥品である酵素調製物、または、
(b)固相支持体に固定化された、(a)記載の酵素調製物。
【請求項11】
ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体をニトリルと接触させることを含む、ニトリルのカルボン酸への加水分解方法。
【請求項12】
分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分のカルボン酸への加水分解方法であって、ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体を前記分子と接触させることを含む、分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分の加水分解方法。
【請求項13】
シアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を有する分子と、請求項8記載のアミノ酸配列の少なくとも一つを有するポリペプチド、又は、鏡像選択性ニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と前記分子とを混合することを含む、キラルアルファヒドロキシ酸分子、又はキラルアミノ酸分子の作製方法。
【請求項14】
組成物又は前記組成物の中間体の製造方法であって、前記組成物または中間体のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を含む前駆体を、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも1つ又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と混合すること、および、前駆体中のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を加水分解することを含む、前記製造方法。
【請求項15】
(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
選択的に(R)- 光学異性体または(S)-光学異性体を生成して(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸を生成する、請求項1記載の核酸によりコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、または請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つまたはこれらのいずれかの組合せとヒドロキシグルタリルニトリルとを接触させることを含む、
前記方法。
【請求項16】
(R)-マンデル酸または(S)-マンデル酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
マンデルニトリルと請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、これらのいずれかの組合せ、または、ニトリラーゼ活性を有するペプチド疑似体、とを混合することを含む、
前記方法。
【請求項17】
(S)-フェニル乳酸誘導体又は(R)-フェニル乳酸誘導体の製造方法であって、フェニルラクトシアノニトリルと請求項8記載のポリペプチド少なくとも1つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つとを混合すること、を含む前記方法。
【請求項18】
以下を含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドの作製方法:
a) 宿主細胞によりポリペプチドが生合成される条件下で請求項1記載の核酸を宿主細胞へ導入すること;および、
b)生合成されたポリペプチドを回収すること。
【請求項19】
請求項1記載の核酸を改変することを含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸変種であって、天然に存在するものとは異なる、改変された生物学的な活性を有する前記変種の製造方法:
i.1つ以上のヌクレオチドを、天然又は非天然ヌクレオチドを含む、異なるヌクレオチドで置換する;
ii.1つ以上のヌクレオチドを削除する;
iii.1つ以上のヌクレオチドを挿入する;または、
iv. i〜iiiの組み合わせ。
【請求項20】
請求項1記載の核酸および緩衝液を含むキット。
【請求項1】
(a)一以上の変異を有する配列番号209の変種配列と少なくとも95%同一の配列を有する核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号209の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号209の部位178-180がGAA又はGAGで置換されている;
配列番号209の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号209の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG又はACGで置換されている;
配列番号209の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号209の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号209の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずかの組合せである、前記核酸、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号210の変種と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基191がロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記核酸、
または、
(c)(a)または(b)に相補的な核酸、
を含む、単離、合成または組換え核酸。
【請求項2】
一以上の変異を有する配列番号209の変種と同一の配列を有する核酸を含む、単離、合成または組換え核酸であって、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
配列番号209の部位163-165がAAA、AAG、GGT、GGC、GGA、GGG、CAA、又はCAGで置換されている;
配列番号209の部位178-180がGAA 又はGAGで置換されている;
配列番号209の部位331-333がTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCで置換されている;
配列番号209の部位568-570がCAT、CAC、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC、ACT、ACC、ACA、TCA、TAT、TAC、ATG 又はACGで置換されている;
配列番号209の部位571-573がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、GTT、GTC、GTA、GTG、ATG、ACT、ACC、ACA、GAT、GAC、GGT、GGC、GGA、GGG、GAA、GAG、TAT、TAC、又はACGで置換されている;
配列番号209の部位595-597がGAA、GAG、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;
配列番号209の部位664-666がTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、
前記単離、合成または組換え核酸。
【請求項3】
請求項1記載の核酸を含む、宿主細胞での複製が可能な核酸ベクター。
【請求項4】
請求項1記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項5】
請求項3記載の宿主細胞を含む宿主生物。
【請求項6】
固相支持体に固定化された、請求項1記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項7】
固相支持体が、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項5記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項8】
(a)一以上の変異を有する配列番号210の変種と少なくとも95%同一の配列を有する、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(b)一以上の変異を有する配列番号210記載の配列を有するポリペプチドであって、ニトリラーゼ活性を有し、
配列番号210の残基55がリジン、グリシン、又はグルタミンで置換されている;
配列番号210の残基60がグルタミン酸で置換されている;
配列番号210の残基111がセリンで置換されている;
配列番号210の残基190がセリン、ヒスチジン、チロシン、又はスレオニン、残基191のロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、チロシン、又はスレオニンで置換されている;
配列番号210の残基199がグルタミン酸、又はロイシンで置換されている;
配列番号210の残基222がロイシンで置換されている;または、
前記変異が前記置換のいずれかの組合せである、前記ポリペプチド、
または、
(c)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが水素結合性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号210記載の配列を有するポリペプチド、
または、
(d)ニトリラーゼ活性を有し、残基190における変異を含み、アラニンが疎水性アミノ酸またはペプチド擬似体残基で置換された、配列番号210記載の配列を有するポリペプチド、
を含む、単離、合成又は組換えポリペプチド。
【請求項9】
請求項8記載のポリペプチドに特異的に結合する精製抗体。
【請求項10】
(a)請求項8記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む酵素の、液体又は乾燥品である酵素調製物、または、
(b)固相支持体に固定化された、(a)記載の酵素調製物。
【請求項11】
ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体をニトリルと接触させることを含む、ニトリルのカルボン酸への加水分解方法。
【請求項12】
分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分のカルボン酸への加水分解方法であって、ニトリラーゼ活性に適した条件の下で、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体を前記分子と接触させることを含む、分子のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分の加水分解方法。
【請求項13】
シアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を有する分子と、請求項8記載のアミノ酸配列の少なくとも一つを有するポリペプチド、又は、鏡像選択性ニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と前記分子とを混合することを含む、キラルアルファヒドロキシ酸分子、又はキラルアミノ酸分子の作製方法。
【請求項14】
組成物又は前記組成物の中間体の製造方法であって、前記組成物または中間体のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を含む前駆体を、請求項8記載のポリペプチドの少なくとも1つ又はニトリラーゼ活性を有するそれらのペプチド疑似体と混合すること、および、前駆体中のシアノヒドリン部分又はアミノニトリル部分を加水分解することを含む、前記製造方法。
【請求項15】
(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
選択的に(R)- 光学異性体または(S)-光学異性体を生成して(R)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸または(S)-エチル-4-シアノ-3-ヒドロキシ酪酸を生成する、請求項1記載の核酸によりコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、または請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つまたはこれらのいずれかの組合せとヒドロキシグルタリルニトリルとを接触させることを含む、
前記方法。
【請求項16】
(R)-マンデル酸または(S)-マンデル酸またはそれらの組合せの製造方法であって、
マンデルニトリルと請求項8記載のポリペプチドの少なくとも一つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つ、これらのいずれかの組合せ、または、ニトリラーゼ活性を有するペプチド疑似体、とを混合することを含む、
前記方法。
【請求項17】
(S)-フェニル乳酸誘導体又は(R)-フェニル乳酸誘導体の製造方法であって、フェニルラクトシアノニトリルと請求項8記載のポリペプチド少なくとも1つ、請求項1記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも一つとを混合すること、を含む前記方法。
【請求項18】
以下を含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドの作製方法:
a) 宿主細胞によりポリペプチドが生合成される条件下で請求項1記載の核酸を宿主細胞へ導入すること;および、
b)生合成されたポリペプチドを回収すること。
【請求項19】
請求項1記載の核酸を改変することを含む、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸変種であって、天然に存在するものとは異なる、改変された生物学的な活性を有する前記変種の製造方法:
i.1つ以上のヌクレオチドを、天然又は非天然ヌクレオチドを含む、異なるヌクレオチドで置換する;
ii.1つ以上のヌクレオチドを削除する;
iii.1つ以上のヌクレオチドを挿入する;または、
iv. i〜iiiの組み合わせ。
【請求項20】
請求項1記載の核酸および緩衝液を含むキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図15I】
【図15J】
【図15K】
【図15L】
【図15M】
【図15N】
【図15O】
【図15P】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図17】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図15I】
【図15J】
【図15K】
【図15L】
【図15M】
【図15N】
【図15O】
【図15P】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図17】
【公開番号】特開2009−279005(P2009−279005A)
【公開日】平成21年12月3日(2009.12.3)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−177263(P2009−177263)
【出願日】平成21年7月30日(2009.7.30)
【分割の表示】特願2004−506469(P2004−506469)の分割
【原出願日】平成15年5月15日(2003.5.15)
【出願人】(503089489)ヴェレニウム コーポレイション (31)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成21年12月3日(2009.12.3)
【国際特許分類】
【出願日】平成21年7月30日(2009.7.30)
【分割の表示】特願2004−506469(P2004−506469)の分割
【原出願日】平成15年5月15日(2003.5.15)
【出願人】(503089489)ヴェレニウム コーポレイション (31)
【Fターム(参考)】
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