ニトロサミン類に選択的なモレキュラーインプリントポリマーおよびその使用方法
ニトロサミン類の分析および生体流体からのニトロサミン類の分離に有用なニトロサミン類を特異的に認識し、結合する一群のモレキュラーインプリントポリマー。またこれらモレキュラーインプリントポリマーは、タバコ製品およびタバコ材料の処理および製造方法にも有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一連のモレキュラーインプリントポリマーおよびニコチン代謝体の生体分析および分離にこのポリマーを使用することに関する。さらに本発明は、処理タバコ、タバコ代替え品およびそれらの誘導体中の目的化合物の量を減少させるためにこのモレキュラーインプリントポリマーを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、栄養学、環境科学および化学の分野では同族物質の複合的な混合物から特定の物質を選択的に分離する必要性が増大している。その目的は、特定の化合物の量的抽出、それら化合物の濃度の測定または多成分混合物からの目的化合物の選択的除去などがある。
【０００３】
より厳しい健康管理によって、日々広く使用されている特定の物質から有害な生成物および代謝物の綿密且つ選択的に定量できる方法の要求が高まっている。特に注目されているのはタバコ系の生成物の使用に関連した化合物であり、これら化合物は、未処理のタバコ葉に元来存在する、または喫煙時に発生する化合物である。ニトロサミン類などのニトロソ含有化合物は、この点に関して特別な意義のあるものと考えられている。
【０００４】
喫煙に関連する有毒物の発生を減少させる目的で、喫煙材の依存性の原因であるとされている化学物質である神経刺激性物質のニコチンのみを含む医薬品が製造されている。
【０００５】
禁煙セラピーのためのニコチン処方において、ニコチンチューインガムが最も広く利用されている。このような医薬品の製造時の品質管理としては、ニコチン量（ガム１つ当たり２または４ｍｇ）の監視およびコチニン、ミオスミン、ニコチン−シス−N−オキシド、ニコチン−トランス−N−オキシドおよびベータ−ニコチリンなどの主要なニコチン酸化生成物の監視などがある。またノルニコチン、アナタビンおよびアナバシンの定量も望まれている。アメリカ薬局方（the United States Pharmacopeia (U.S.P)）によると、ガムの処方は、ラベルに表示されているニコチンの量の９５％乃至１１０％を含まなければならず、各酸化生成物の量はニコチン量の０．１％を超えてはならないとされている。
【０００６】
このような紙巻タバコの代替え品を使用しても、ニトロサミンニコチン代謝物がニコチンが体内組織に存在する間に自然な代謝工程によって体内で生成される場合がある。これらの代謝物の量は、殆どの定量的な分析操作法が行われる濃度未満のレベルのままである。従ってこれら代謝物の量と同様に他のニコチン代謝物の量を監視できる方法の必要性は、重要になっている。通常、このような監視は、人間の尿サンプルで行われるが、その中の発ガンの疑いのある物質の量は、極めて低い。
【０００７】
タバコまたはタバコ煙から定量、減少または除去される標的化合物は、知られており、タバコ特有のニトロサミン類（ＴＳＮＡｓ）およびそれらのアルカロイド前駆体などがあり、具体的にはＮＮＫ、４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン、ＮＮＡ、４−（メチルニトロサミノ）−４−（３−ピリジル）ブタナール、ＮＮＮ、N-ニトロソノルニコチン、ＮＡＢ、N-ニトロソアナバシン、ＮＡＴ、N-ニトロソアナタビン、ＮＮＡＬ、４−（メチルニトロスアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール、イソ−ＮＮＡＬ、４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）−１−ブタノール、イソ−ＮＮＡＣ、４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）ブタン酸などがある。
【０００８】
どの程度これら標的化合物が人体の生体流体中に存在するかを適切に定量化するためにタバコに含まれるアルカロイド類、特にニトロシル化された分解生成物および代謝物を分析するための方法が開発されている。このような分析に使用される既存のクロマトグラフ分離または抽出は、一般的な個体群をスクリーニングする際に発生する多数のサンプルを処理するのに要求される強度、厳密さおよび速度に欠ける。これら既存の方法では、通常１ミリリットル当たりピコグラム単位で存在するニトロサミン類の濃度が低いので、分析の前に検体の多段階抽出による多数のサンプル調製および場合によっては化学的誘導体化（例えば質量分析の前の重水素化）を必要とする。このような複雑さの要因の１つとして、既存の分離材料が、例えば抗体または生体受容体が問題の代謝物のためのものであっても分離性状として代謝体の電荷または疎水性のような物理化学的特性に依存しているので選択的ではないということが挙げられる。これらの物理化学的特性は、サンプル中の多くの他の無関係な分子と共有されている場合がある。
【０００９】
通常の方法は、遠心分離、ｐＨ調整、酵素処理などの最大でで７つの作業工程を必要とし、これによりサンプル１つの調製時間に数時間または時には数日かかる場合がある。このような面倒な工程により、これらの工程の間に材料が失われ、元のサンプル濃度の概算に誤差が生じ、よってサンプルの元来の濃度を得るために直接的な測定によるのではなく、最終的な測定値から外挿する必要がある。従って、タバコ特有のニトロサミン類の分析を素早く、かつ、簡単に行える方法は、医学的な分析のニーズに充分答えるものはない（Byrd & Ogden, Journal of Mass Spectrometry, 2003, 38, 98-107およびWu et al. Anal. Chem. 2003, 75,4827-4832参照）。
【００１０】
近年、モレキュラーインプリンティングによって調製された材料（モレキュラーインプリントポリマーまたはMIP）で小さな分子を選択的に認識することについて多くの報告がされている。例えば、Wulff, G. Andrew, Chemie. Int. Ed. Engl. 1995 (34) 1812参照。MIPは、標的化合物に選択的に結合するように適合した反応部位を有するポリマーである。非共有的に調整されたモレキュラーインプリント材料は、治療薬、糖類、ヌクレオチド塩基およびプレスチシド並びにステロイドおよびペプチドホルモンなどの種々の小型分子の不斉認識に使用されている。このようなモレキュラーインプリント材料は、例えばSellergren, B. Trends Anal. Chem. 1997 (16) 310に説明されている。いくつかのインプリント材が示す標的検体に対する高度な親和性および選択性は、対応する免疫親和（immuno-affinity、(IA)）相との比較によって証明されている。しかしながら免疫親和相とは対照的にＭＩＰ材は、調整が簡単で、殆どの媒体に対して安定しており、長期間に亘って再利用可能である。
【００１１】
従ってクロマトグラフィー、分離（連続式またはバッチ式）、化学的増感または特定の評価分析などのＭＩＰ材の用途が研究されている。
【００１２】
また別の用途として生体サンプルまたは複合マトリックスに低濃度で存在する検体の固相抽出（ＳＰＥ、Mayes, A.G..; Mosbach, K. Trends Anal. Chem. 1997, 16, 321参照）がある。ＳＰＥは、既存の方法では達成し得ないレベルに検体を選択的濃縮および浄化することができる。またモレキュラーインプリント固相抽出（MIPSE）が生物学的分析、食品分析および環境分析に使用されている。これらの例では検体が選択的に濃縮および浄化され、その後のクロマトグラフ（例えば、高性能液体クロマトグラフ、ＨＧＬＣ）または質量分析定量化の正確性が増し、検出限界が小さくなる（ＬＯＤ）。
【００１３】
標的分子または一群の標的分子に対する良好な親和性と高度な選択性により、ＭＩＰは食品業界から食品の品質を向上させる手段としてかなり注目されている。この場合、食品母体から望ましくない成分を選択的に除去するためにＭＩＰを必要とする。これらの成分は、低濃度で存在する場合があるので、ＭＩＰの飽和容量は、通常限定的要因とはならない。
【００１４】
本発明で特別に設計された好ましいＭＩＰは、尿素などの複合マトリックスから最も一般的なニトロシル化されたニコチン誘導体を選択的に吸収することができ、定量的に回収することができるので、このような有害な化学物質の濃度の測定において誤差が小さくなる。
【００１５】
定量化の他に標的化合物の量を減少させることによってタバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を消費する際の悪影響を減少させる試みも知られている。このように悪影響を減少させることは、材料の抽出物などの材料そのものまたはその誘導体中で行うことができる。また材料の熱分解生成物、即ち燃焼によって得られる主流煙および副流煙または材料をその燃焼温度未満の温度に加熱することによって生じるエアロゾル中で減少させることも可能である。
【００１６】
このように減少させるためのよく知られている方法の１つとして、材料の熱分解性生物をフィルターと接触させて分解生成物から望ましくない成分を吸着することが挙げられる。またこれとは別に例えば米国特許明細書第５６０１０９７号に開示されているように材料を溶剤抽出する方法もある。この米国特許明細書によれば、タバコ材の蛋白質含有量をポリペプチドを抽出するために界面活性材を含む溶液でタバコを処理し、溶液を分離し、この溶液から界面活性剤とポリペプチドを取り除き、溶液をタバコ材に再結合させることによって減少させている。国際特許明細書ＷＯ０１／６５９５４号は、タバコを超臨界二酸化炭素などの超臨界抽出流体と接触させてニトロサミンを選択的に減少または除去する方法が開示されている。
【００１７】
これらの方法は、タバコおよびタバコ代替え品、即ちタバコと同様に喫煙、噛む、吸入などに関係なく、消費される天然タバコに類似の特性を有する天然または合成材料に等しく利用可能である。
【００１８】
ＭＩＰを使用してタバコ煙からニコチンを除去することがLiu, Y等によるMolecularly imprinted Solid-Phase Extraction Sorbent for Removal of Nicotine from Tobacco Smoke, Analytical Letters, Vol. 36, No. 8, pp1631-1645 (2003)に報告されているように試みられている。この文献に記載されているＭＩＰは、ニコチンに結合するように構成されており、ニトロサミン類のようなより有毒なニコチン代謝物とは結合しない。またＭＩＰが実際にニコチンに選択的であるかどうかは、データを供する科学的方法にキーとなる対照−観察要素（control-checking elements）に欠けるので定かではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って依然として当業界において新規のＭＩＰおよびこれを使用する方法が特にニコチンおよびニコチン代謝物の分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
広義には本発明は、ニトロサミン含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー（ＭＩＰ）を提供する。
【００２１】
本発明の好ましいＭＩＰは、ニトロサミン類、特にＴＳＮＡ類または喫煙材の熱分解生成物の蒸気相に見られる揮発性のニトロサミン類に選択的である。本発明の好ましい別のＭＩＰは、ニコチンのニトロシル化された誘導体またはタバコに見られるアルカロイド類、即ちノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンの１つ以上に選択的である。
【００２２】
本発明のＭＩＰは、例えば１つ以上の機能性モノマーと架橋剤をニトロサミンの構造的類似物の存在下で遊離基開始剤を含む重合媒体中で共重合し、ＭＩＰからテンプレートを除去することによって得られる。
【００２３】
本発明は、本発明のモレキュラーインプリントポリマーを分析サンプル予備処理のクロマトグラフィー、化学センサーでの分析および予備抽出のためにまたはニコチン含有物質または装置からニコチンニトロサミンを抽出するための固相フィルターとして使用することも含む。
【００２４】
さらに本発明は、タバコ製品の標的成分の量を減少させる方法を含み、この方法ではタバコ製品は、少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なＭＩＰで処理される。さらに本発明は、ニトロソ含有化合物に選択的なＭＩＰの使用を含む喫煙材の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明は、タバコ製品に含まれるニトロソ含有化合物の量を減少させるためにタバコ製品をＭＩＰで処理することも含む。
【００２６】
本明細書中、「タバコ生成物」とはタバコ（タバコ葉またはタバコ茎を含む）、タバコ代替え品またはタバコとタバコ代替え品とのブレンドを含む材料、この材料の抽出物、この材料の熱分解によって発生する煙生成物およびこの材料をその燃焼温度未満に加熱して発生するエアロゾルなどの派生物を意味する。
【００２７】
このタバコ生成物がタバコまたはタバコ代替え品を含む材料の燃分解によって発生する派生物である場合、分解は、従来の紙巻きタバコのように材料の燃焼によって、または喫煙者によって吸引されるエアロゾルを発生するためにいくつかの別のタバコ製品に使用される方法に従って材料をその燃焼温度未満に加熱することによって行ってもよい。
【００２８】
これとは別にタバコ生成物は、タバコまたはタバコ代替え品を含む材料を溶媒と接触させて製せられる派生物であってもよい。特に本発明は、喫煙材を溶媒によって抽出する工程と、少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーでこの抽出物を処理してそれに含まれるニトロソ含有化合物の量を減少させる工程と、この処理された抽出物と喫煙材を組み合わせる工程とを含む喫煙材の製造法を提供する。
【００２９】
この方法では喫煙材は、例えば微粉、ステム、くず、裁断された葉身、刻まれたステムまたはこれらいずれかの組み合わせなどの形状であってもよい。溶媒は、メタノール、エタノールまたは超臨界二酸化炭素液などの超臨界流体抽出媒体のような水溶性または非水溶性のものであってもよい。抽出は、タバコから窒素含有化合物の抽出に都合のよい条件下で行ってもよい。
【００３０】
また本発明は、タバコまたはタバコ代替え品および少なくとも１つのニトロソ含有化合物の熱分解生成物からそのニトロソ含有化合物の除去に選択的なモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙品も含む。
【００３１】
本発明の喫煙品は、例えば紙巻きタバコ、葉巻またはシガリロなどのあらゆる従来の形態のものであってもよい。特に本発明の喫煙品は、フィルター付きまたはフィルターなしの任意にラッパーに包まれるタバコ材ロッドを含んでもよい。このラッパーは、紙、タバコ葉、再生タバコまたはタバコ代替え品であってもよい。これとは別に例えば喫煙品が副流煙の発生を低下させることを意図するものである場合または主流煙の熱分解生成物の量を低下させることを意図するものである場合、そのラッパーは、セラミック材などの非燃焼性無機材から構成されてもよい。フィルターは、繊維性セルロースアセテート、ポリプロピレンもしくはポリエチレンまたは紙などのあらゆる好適な材料から構成される。
【００３２】
喫煙材は、好ましくはタバコであるが、非タバコ喫煙材などのタバコ代替え品であってもよい。非タバコ材としては、果実材などの乾燥および硬化された植物材、アルギネートから製せられる合成喫煙材およびグリセロールなどのエアロゾル発生物質などが挙げられる。喫煙品は、タバコと非タバコ材とのブレンドであってもよい。喫煙品がタバコから構成される場合、空気、火、煙または日光で硬化された葉柄またはステムなどのあらゆる種類のものまたはこれらのブレンドであってもよく、あらゆる好適な方法で処理されていてもよい。例えばタバコは、裁断、刻み、膨張または再生処理されたものであってもよい。また喫煙材は、改良剤、着色料、湿潤剤（グリセロールおよびプロピレングリコール）、不活性充填剤（チョークなど）および風味剤（砂糖、甘草およびココア）などの従来の添加剤を含んでもよい。
【００３３】
本発明は、喫煙以外の吸引、噛むまたは鼻からの摂取による経口または経鼻消費されることを意図したタバコにも利用してもよい。このようなタバコ製品としては嗅ぎタバコ、スヌース（snus）および紙タバコなどがある。
【００３４】
モレキュラーインプリント材は、本発明の喫煙材に組み込んでもよい。また本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙材を含む。
【００３５】
これとは別に喫煙品がラッパーに包まれた喫煙材ロッドを含む場合、モレキュラーインプリント材をラッパーに組み込んでもよい。従って本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙品用ラッパーを含む。このラッパーは、紙などのセルロース系材料または再生タバコなどのタバコ系材料であってもよい。
【００３６】
本発明の好ましい喫煙品は、タバコのロッドと、ラッパーと喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含むフィルターとを含む紙巻きタバコである。
【００３７】
また本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む煙用フィルターを含む。この煙フィルターは、例えば紙巻きタバコまたはシガーホルダーの形状で喫煙品と別個に製してもよく、フィルターチップ付き紙巻タバコの形状で喫煙品に組み込んでもよい。
【００３８】
フィルターチップ状の煙フィルターは、あらゆる従来の構造のものであってもよい。例えば、セルロースアセテートなどの繊維性フィルター材からなるセクションを含む「ダルメシアン」型フィルター形状であってもよく、粒子状のモレキュラーインプリントポリマーをそのセクション全体に配してもよい。またフィルターは、「キャビティー」型フィルターであってもよく、このフィルターは、モレキュラーインプリントポリマーを２つの隣接する繊維フィルター材のセクションの間に配される複数のセクションを含む。この煙フィルターは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアンバーライトなどの他の吸着材を含んでもよい。
【００３９】
使用の際、煙はフィルターを通過し、モレキュラーインプリントポリマーが煙から標的化合物を選択的に吸着保持し、ろ過された煙は、喫煙者に送られる。
【００４０】
本発明による煙フィルター及び喫煙品は、使用時にモレキュラーインプリントポリマーを煙から保護するまたは煙に晒されないようにするための手段を含む。これは複数の異なる方法で行ってもよい。例えば煙フィルターを煙の蒸気相または粒状相から物質を吸着するフィルターエレメントで構成してもよい。このようなフィルターエレメントは、糸状、粒状、顆粒状、布状または紙などのあらゆる従来の形状の活性炭などの一般的な吸着材で構成されてもよい。またフィルターエレメントは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアマーライト（amerlite）などの選択的吸着材であってもよい。触媒を保護する手段は、例えばセルロースアセテートからなる第１フィルターエレメントと活性炭からなる第２フィルターエレメントのように異なる組成の２つ以上のフィルターエレメントを含んでもよい。煙フィルターに複数のフィルターエレメントの設けることはよく知られており、あらゆる従来の形状のフィルターおよびその製造方法を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
図中、類似の特徴のものには同じ符号を付してある。
【００４２】
通常、モレキュラーインプリントは、次の工程からなる、（１）標的分子またはそれと構造的に類似したものであるテンプレート化合物を溶液中で選択された1つ以上のモノマーと相互作用させてテンプレート−モノマーコンプレックスを形成する、（２）テンプレート−モノマーコンプレックスを架橋モノマーと共重合させてテンプレート化合物を組み込んだ高分子マトリックスを得る、（３）テンプレート化合物を高分子マトリックスから抽出し、標的分子を選択的に結合するために使用可能なＭＩＰを形成する。工程（３）の前にＭＩＰが固体ポリマー（またはモノリス（monolith））として調製された場合、それは所望の大きさの粒状材のフラクションを形成するために通常粉砕され、篩にかけられる。ＭＩＰが懸濁重合またはエマルジョン重合のいずれかで調製された場合、この重合工程中に粒径を所望の範囲内に調整することができるので、このような粉砕および篩い分けをする必要がない。上述の方法で調整された粒状材は、クロマトグラフカラムまたは固相抽出カラム内に詰め込むことができ、類似の構造または機能性を有する分子を含む混合物の他の成分からテンプレートをクロマトグラフ分離するために用いられる。
【００４３】
テンプレート化合物の除去によって晒されるモレキュラーインプリントポリマー上の反応部位は、標的分子の新鮮な分子との反応に適した立体化学構造をとる。その結果ポリマーは、標的分子の選択的結合に使用することができる。
【００４４】
モレキュラーインプリント結合部位を発生させる現在最も広く利用されている方法は、「非共有」ルートを介している。これはテンプレート化合物と機能性モノマーの非共有自己組織化を利用してテンプレート−モノマーコンプレックスを形成し、その後架橋モノマーの存在下でフリーラジカル重合を行い、最終的にテンプレート化合物が抽出される。テンプレート分子および好適な１つ以上のモノマーが重合前に互いに共有結合する共有インプリントは、公知の方法で実施することができる。上記いずれかの方法で形成されたＭＩＰの結合特性は、テンプレート分子を再結合させることによって調べることができる。
【００４５】
重合は、ポロゲン（porogen）と呼ばれる孔形成溶媒の存在下で行われる。機能性モノマーとテンプレート化合物との静電的相互作用を安定化させるためにポロゲンが低から中極性の非プロトン性溶媒の中からしばしば選択される。理想的にはテンプレート化合物は、重合媒体に中または高溶解度を示し、従ってこれらテンプレート化合物またはその構造類似物は、この標準的な方法を利用して直接使用することができる。
【００４６】
標的分子それ自体をテンプレートとして使用することが可能であるが、標的分子の構造的類似物の方が好ましい、なぜなら（ａ）標的分子は、重合条件下で不安定になりやすい、または重合を阻害する可能性がある、（ｂ）標的分子は、その合成の複雑さもしくははコストまたはその両方のために充分な量を入手できない場合がある、（ｃ）テンプレートは、予備重合混合物に不溶性または溶けにくい場合がある、（ｄ）ＭＩＰは、使用中にＭＩＰから流れ出るポリマーマトリックスの採取しにくい領域に残存する少量の標的分子によて汚染された状態で残る場合がある、および／または（ｅ）標的検体が顕著な健康上のリスクを示し、テンプレートとして使用できないからである。
【００４７】
ニトロソ化合物の場合、特に後述するＴＳＮＡとして知られている化合物の場合、その機能的類似物質をテンプレート化合物として使用するほうがより都合がよい。例えばＴＳＮＡのグルコース誘導体は、図２に示すようにテンプレート化合物として特に有用である。
【００４８】
ＭＩＰが標的化合物の機能的類似物質から得られる場合、その類似物質は、等配性（isosteric）でなければならず、好ましくは標的化合物と等電性でなければならず、またはその類似物質は、強い相互作用が起こりやすい場合、標的化合物の基礎構造（substructure）を含んでいてもよい。
【００４９】
ニトロソ含有化合物、特に一般式Ｏ＝Ｎ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）で表されるニトロサミン類は、喫煙者に悪影響を与えると示唆されているタバコおよびタバコ煙の多くの構成要素のうちのいくつかである。
【００５０】
本発明を適用できるある特定の類のニトロソ化合物は、「タバコ特有ニトロサミン（ＴＳＮＡ）」として知られているタバコに自然発生するニトロサミン類であり、これらニトロサミン類は、タバコに自然発生するアルカロイド、即ちニコチン、ノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンから誘導される。ＴＳＮＡとしては、以下のものが挙げられる。
【００５１】
４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）
【化１】
【００５２】
Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）
【化２】
【００５３】
Ｎ’−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）
【化３】
【００５４】
Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）
【化４】
【００５５】
４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）ブタノール（ＮＮＡ）
【化５】
【００５６】
さらに揮発性ニトロサミンとして知られている一群の化合物もタバコ煙の蒸気相に見られる。これらの化合物のとしては次の化合物が挙げられる。
【００５７】
Ｎ’−ニトロソジメチルアミン（ＮＤＭＡ）
【化６】
【００５８】
Ｎ’−ニトロソジエチルアミン（ＮＤＥＡ）
【化７】
【００５９】
Ｎ’−ニトロソエチルメチルアミン（ＮＰ）
【化８】
【００６０】
Ｎ−ニトロソジエタノールアミン
【化９】
【００６１】
その他のニトロソ含有化合物もまたタバコまたはタバコ煙の化学的研究によって特定されており、その例としては、以下のものが挙げられる。
【００６２】
Ｎ−ニトロソピロリジン（ＮＹＲＰ）
【化１０】
【００６３】
Ｎ’−ニトロソメチルブチルニトロスアミン（ＢＭＮＡ）
Ｎ’−ニトロソ−ｎ−ブチルアミン（ＮＢＡ）
【００６４】
Ｎ’−ニトロソピペリジン（ＮＩＰＩ）
【化１１】
【００６５】
ニトロサミンの標的化のための可能な等配性類似物質を図３に示す。図３に示した分子は、親アミンの全ての誘導体であり、第２級アミンおよび対応するアルデヒドまたは酸塩化物から１つのの工程で合成することができる。エナミンの分子モデル（図４Ａ参照）は、当該ニトロサミンの１つであるＮＮＡＬと良好な立体相補性を示す。
【００６６】
標的検体ＮＮＡＬのための好適なテンプレート化合物の設計の際、ある１つの興味深いテンプレートを特定した。このテンプレートは、ピリジンカルビノール構造に対応するが驚くことにニトロサミン残基（moiety）に欠けるものであった（図４Ｂ参照）。このような基礎構造的テンプレートに充分な結合親和性（binding affinity）および選択性を得ることができれば、これは好ましい方法となる。実際、このピリジンカルボニルＭＩＰで得られる結合親和性、選択性および回収率は、より複雑なエナミンテンプレートで得られるＭＩＰより優れている。したがって、本発明は、標的の特定の重要な特徴に欠けるが、ピリジン−メタノール残基を含む標的ニトロサミンと効果的に結合する単純なテンプレートを含む驚異的に効果的なＭＩＰを提供する。
【００６７】
ＮＮＡＬ ＭＩＰの調製
【００６８】
機能性モノマーメタクリル酸（ＭＡＡ）と、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）またはトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）の２つの架橋剤のいずれか１つと、テンプレートとして４−（メチルプロペニル−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オル（４ＭＰＡＰＢ、図４Ａ）またはピリジンカルビノール（図４Ｂ）の２つのＮＮＡＬ類似物質のいずれか１つを使用して、有機水溶性溶媒環境でＮＮＡＬに対して強い親和性と選択性を示す２つの異なるポリマーを得る。
【００６９】
本発明は、ニコチン類似物であるＮＮＡＬの定量的回収のための抽出方法を含み、この方法は、ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰをクロマトグラフィー材料フォーマットで調製する工程と、カラムの前処理（conditioning）と、尿サンプルを使用する工程と、阻害化合物を除去する工程と、ＮＮＡＬ検体を最終的に選択的に溶出する工程とを伴う。
【００７０】
本発明をいくつかの実施例を参照してさらに詳述するが、これはあくまで例示を目的としており、本発明を限定するものではない。ここでは本発明は、テンプレート分子、ニコチン由来であり有機または水溶性系に存在するニトロサミンを結合するように構成されたポリマー材料、そして最後にこのポリマー材料を例えば分析サンプルの予備処理のためのクロマトグラフィーおよび化学センサーでの分析的または予備的分離に使用することを参照している。
【００７１】
特に記載がない場合、実施例で使用される材料は市販されているか、または従来の方法で合成することができる。例えば、「B. Sellergren (Ed.) Molecularly-imprinted Polymers: Man made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, part of the series Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Elsevier Science, Amsterdam, Netherlands, 2001」を参照されたい。
【実施例１】
【００７２】
エナミンテンプレートの合成（ＭＰＡＰＢ）
【００７３】
無水トルエン（ナトリウムで乾燥したての）２ｍｌを４−メチルアミン−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（１００ｍｇ）を含むガラス瓶に加えた。この混合物を窒素雰囲気下で１時間、撹拌した。この混合物に１００μｌのプロピオンアルデヒドを加えた。そして５５℃で４時間撹拌した。１時間半後、高性能液体クロマトグラフィーで反応を観察した。生成物の色は、トルエンの中でオレンジ系の黄色であった。トルエン中の粗生成物は、精製せずにろ過した後、ＭＩＰの合成にそのまま使用することができた。テンプレートＭＰＡＰＢの収率は、約９０％であった。
【実施例２】
【００７４】
テンプレートとしてピリジンカルボニルを使用したＭＩＰの合成
【００７５】
ピリジンメタノール（９７μｌ）に３．７４ｍｌのＴＲＩＭ（塩基性アルミナで精製された）、機能性モノマーＭＡＡ（１０２０μｌ）、ポロゲントルエン溶媒（７．１ｍｌ）および最後に開始剤ＡＢＤＶ（６３ｍｇ）を加え、透明な溶液が得られるまで撹拌した。その溶液をガラス瓶に移し、５分間窒素でパージし、火炎密閉（flame sealed）した。熱重合を４５℃で２４時間行った。そのポリマー混合物をさらに２４時間、７０℃で硬化させた。
【００７６】
粗ＭＩＰ材の処理を次のように行った。まずＭＩＰを粗く粉砕し、ソクスレトシンブル（Soxhlet thimble）に移した。このＭＩＰを最初にメタノールで１２時間、それから酢酸で１２時間洗浄して、残存したテンプレートおよび他の未反応のモノマーを除去した。これら最初の抽出工程の後、ポリマーを真空乾燥させ、粉砕し、篩い分けして２０乃至９０μｍのサイズの微粉を得た。最終的な抽出工程として、このように微粉化されたＭＩＰを抽出溶液として蟻酸を使用して溶媒抽出しながら、４０分間、マイクロ波に晒した。乾燥後、ＭＩＰを使用する準備が整った。
【実施例３】
【００７７】
固相抽出（ＳＰＥ）において選択的吸着剤としてのＭＩＰの使用
【００７８】
本発明の１つの態様において、生物マトリックスからＮＮＡＬを選択的に抽出するためにＭＩＰを固相抽出カラムに詰め込むことができる。最初にポリプロピレンフリット（frit）を好適な固相抽出カラム（通常、分析に使用する場合１０ｍｌ容量である）に入れ、２５ｍｇのＭＩＰをその上から加えてＭＩＰ床を形成し、第２のフリットをＭＩＰ床の表面上に強く押し込んだ。カラムの前処理を１ｍｌのＤＣＭ、１ｍｌのＭｅＯＨおよび最後に１ｍｌの蒸留水をこの順番で使用して行った。
【００７９】
サンプル、即ち少量の検体を含む人間の尿（５ｍｌ）を上記で調整したＭＩＰの固相抽出カラムに通過させた。その後カラムを真空状態にし、その中の物質が乾燥するまで水を除去した。ＭＩＰに非特異的に関連する可能性のある極性妨害物質（polar interfering substances）を１ｍｌの蒸留水による洗浄で溶出させた。再度、数分間の真空を利用した乾燥を行い、いわゆる「フェーズ−スイッチ（phase-switch）」（環境を水溶性から有機的環境に変える）させた。この時点で非極性妨害物質をそれぞれ１ｍｌのトルエン、トルエン：ＤＣＭ（９：１）およびトルエン：ＤＣＭ（４：１）で洗浄して除去した。ＮＮＡＬの最終的な選択的溶出を３回の溶出工程においてそれぞれ１ｍｌのＤＣＭを使用して行った。
【００８０】
溶媒を蒸発させた後、サンプルを移動相で再構成し、ベータ−ベーシックＣ１８カラム、５μｍ、１５０ｘ２．１ｍｍ＋プレカラム１０ｘ２．１ｍｍを用いたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｌ−７０００システム）のＨＰＬＣシステムで分析した。流量は０．２５ｍＬ／分、注入量は１００μＬ、温度は３０℃、２６２ｎｍの紫外線で検出した。移動相は、５０ｍＭのｐＨ３のＮＨ４ＰＯ４、５ｍＭのオクタンスルホン酸および２０％のメタノールからなる。
【００８１】
これらの条件下で、ＮＮＡＬは、８から１０分で溶出する明確に識別可能な２つのピークとして得られた（０．２５μｇのＮＮＡＬが混ざった人間の尿の１ｍｌのサンプルをＮＮＡＬを含まない尿と比較した図６を参照されたい）。この２つのピークは、２つの回転異性体に対応するようにＮＮＡＬの特徴である。ＮＮＡＬの構造からピリジンリングの側鎖が異なる立体配座状態を持ち得ることを立証することができる。好ましい立体配座は、回転異性体と呼ばれ、ＮＮＡＬの場合、２つの主要な立体配座がある。ＨＰＬＣカラム上でのこれら２つの立体配座の保持は、異なる。図６に示すようにＮＮＡＬのピークは、妨害物質からきれいに離れている。したがって容易かつ正確に定量化することができる。ＮＮＡＬの回収率（回収された量／充填された量ｘ１００で表される）は、生体サンプル中のＮＮＡＬの初期の量によるが、通常最大で９０％である。ＮＮＡＬをそれぞれ５０ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ含むサンプルでは１００％の近い回収率を示した（図５参照）。
【実施例４】
【００８２】
ニコチンの存在下で固相抽出における選択的吸着剤としてのＭＩＰの使用
【００８３】
本発明の別の用途は、多量のニコチンが存在するＮＮＡＬに選択的に吸着する吸着剤としての使用がある。この実施例は、ＭＩＰ材の広い範囲の用途およびＭＩＰの選択性が特定のサンプルに対してどのように微調整されるかを例示している。
【００８４】
固相抽出カラムを実施例３と同じように調製した。この固相抽出カラムは、１ｍｌのＤＣＭ、１ｍｌのＭｅＯＨ、１ｍｌのｐＨ４．５の５０ｍＭ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４をこの順番で使用して前処理した。少量の検体を含む５ｍＬの人間の尿であるこの実施例のサンプルを前処理されたＭＩＰ固相抽出カラムに通過させた。その後、カラムを中度の真空状態（例えば１０から８０ｋＰａ）にし、その中の物質が乾燥するまで水を取り除いた。ＭＩＰに非特異的に関連する可能性のある極性妨害物質を１ｍｌのｐＨ４．５の５０ｍＭ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４による洗浄で溶出させた。さらに数分間の真空を利用した乾燥を行った。さらに１ｍｌのトルエン、１ｍｌのトルエン：ＤＣＭ（９：１）および１ｍｌのトルエン：ＤＣＭ（４：１）の順で洗浄を行った。ＮＮＡＬの最終的な選択的溶出を３回の溶出工程においてそれぞれ１ｍｌのＤＣＭを使用して行った。
【００８５】
溶媒を蒸発させた後、サンプルを移動相で再構成し、実施例３で使用したＨＰＬＣシステムで分析した。クロマトグラムの一例を図７に示す。この図は、ニコチンを緩衝液（buffer）洗浄で除去しても、どのようにＮＮＡＬがＭＩＰに選択的に保持されているかを例示している。
【実施例５】
【００８６】
ＭＩＰを組み込んだ喫煙品
【００８７】
図８および９は、ラッパー２で包まれたタバコロッド１とこれにチッピング紙４によって装着される煙フィルター３を有する紙巻きタバコ形状の喫煙品を例示する。明確にするためにチッピング紙４をラッパー２から離して示しているが、実際はチッピング紙とラッパーは接触する。
【００８８】
図８に示した紙巻タバコのフィルター３は、３つの円筒状のフィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃを含む。フィルターの吸い口端に位置する第１のフィルターエレメント３ａは、長さが７ｍｍで、７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸され、全長に亘って２５ｍｍＷＧの圧力降下を有するセルロースアセテートトウで構成されている。フィルターの中央に位置する第２フィルターエレメントは、長さ５ｍｍのキャビティーであり、１５０ｍｇの活性炭粒子を含む。ロッド１に隣接する第３フィルターは、長さが１５ｍｍで、その長さに亘って９０ｍｍＷＧの圧力降下を有し、８０ｍｇのセルロースアセテートトウを含む。このセルロースアセテートトウは、４重量％のトリアセチンで含浸され、下記実施例６で製せられる揮発性ニトロサミンに特有のＭＩＰを８０ｍｇ含み、このＭＩＰは、「ダルメシアン」方式で均一に分配されている。
【００８９】
図９に示した紙巻タバコは、図８の紙巻きタバコと類似しているが、フィルター３が４つの同軸の円筒状フィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄを有するという点で異なる。紙巻タバコの吸い口端に位置する第１フィルターエレメント３ａは、５ｍｍの長さを有し、７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸されたセルロースアセテートトウから構成されている。第１フィルターエレメント３ａに隣接して位置する第２フィルターエレメント３ｂは、下記実施例６で製せられる揮発性ニトロサミンに特有のＭＩＰを２００ｍｇ含む長さ５ｍｍのキャビティーである。第２フィルターエレメント３ｂに隣接する第３フィルターエレメント３ｃは、１０ｍｍの長さを有し、７重量％のトリアセチンで含浸されたセルロースアセテートトウで構成されている。フィルターエレメント３ｃとロッドとの間に位置する第４フィルターエレメント３ｄは、７ｍｍの長さを有し、８０ｍｇの活性炭粒子を含む。換気孔５がリング状にチッピング紙のラジアル平面Ａ−Ａに形成されており、これらの換気孔は、煙が紙巻きタバコを介して吸入される際に第４フィルターエレメント３ｄと第３フィルターエレメントとの接合部から約３ｍｍ下流のフィルターエレメント３ｃ内に空気を送る。
【００９０】
次の実施例は、本発明の紙巻きタバコについてさらに例示する。
【実施例６】
【００９１】
揮発性ニトロサミン類のテンプレート類似物質
【００９２】
【化１２】
【００９３】
２当量の好適な第２級アミン、例えばジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジンまたはモルホリンを無水エーテルに溶解し、新鮮な乾燥したモレキュラーシーブ（５０ｇ／モルアミン）を加えた。この混合物を−５℃に冷却し、撹拌した。１当量のプロピオンアルデヒドをこの冷却した混合物に滴下し、０±５℃に保持した。さらにこの混合物を一晩、冷却槽内で放置した後、ろ過した。生成物がその沸点にもよるが減圧下でろ液を蒸留することによって約５０％の収率で得られた。一例として構造と沸点を図１０に示す（Brannock, et. Al., J. Org. Chem., 1964, 29, 801-812参照）。
【００９４】
強酸機能性モノマーを使用してエナミンに陽子を付加し、インプリント工程中に必要な非共有相互作用を生じさせる。窒素に結合したカーボン原子に正電荷が留まり、イミニウムイオンを供する非局在化により構造が安定する。これにより以後の揮発性ニトロサミンの認識のために強酸機能性モノマーが正しく位置せしめられる。正電荷を非局在化する機会が存在しないので、エナミン窒素の陽子付加は疎外される（Cook, et al., J. Org. Chem., 1995, 60, 3169-3171参照）。
【００９５】
ＭＡＡ（メタクリル酸）より強い酸性の機能性モノマーを使用したほうが好ましい場合もある。さらなる態様は、機能性モノマーとして４−ビニル安息香酸または４−ビニルベンゼンスルホン酸を含む。
【実施例７】
【００９６】
エナミンをテンプレートとして使用したＭＩＰの合成
【００９７】
所望のエナミン（１ｍｍｏｌ）、酸性機能性モノマー（４ｍｍｏｌ）、架橋モノマー（２０ｍｍｏｌ）および遊離基開始剤（全モノマーの１％ｗ／ｗ）を好適なポロゲン溶媒に溶かして予備重合溶液を調製する。機能性モノマーは、ＭＡＡまたはトリフルオロメタクリル酸（ＴＦＭＡＡ）のいずれかであり、架橋剤は、ＥＤＭＡまたはＴＲＩＭのいずれかであり、ポロゲン溶媒は、クロロホルム、トルエン、アセトニトリルまたはアセトニトリル／トルエン（１／１ｖ／ｖ）のいずれか１つである。得られた溶液を重合容器へ移し、０℃に冷却し、５分間窒素でパージし、その後容器を火炎密閉する。重合を４５℃で開始し、この温度で２４時間続ける。得られたポリマーを７０℃で２４時間、硬化させた。
【００９８】
得られた粗ＭＩＰ材を処理する。ＭＩＰ材を粗く粉砕し、ソクスレトシンブル（Soxhlet thimble）に移した。このＭＩＰを（i）メタノールで１２時間、そして（ii）酢酸で１２時間洗浄し、残存したテンプレートおよび他の未反応のモノマーを除去する。これら最初の抽出工程の後、ポリマーを真空乾燥させ、粉砕し、篩い分けして２５乃至３６μｍのサイズの微粉を得た。最終的な抽出工程として、このように微粉化されたＭＩＰを抽出溶液として蟻酸を使用して溶媒抽出しながら、４０分間、マイクロ波に晒した。さらにＭＩＰを２４時間、真空乾燥する。
【００９９】
これとは別に標的ＴＳＮＡをエナミンの代わりに使用してもよい。標準大気圧での選択された揮発性ニトロサミンの沸点を図１１に示す。
【実施例８】
【０１００】
タバコ抽出物の処理における実施例２および／または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０１】
実施例２または実施例３の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、このカラムをジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび最後に蒸留水に通過させて前処理する。
【０１０２】
刻まれたバーリータバコ葉を６０℃の温度の水で１５分間、抽出する。タバコ葉をろ過によって溶液から分離し、乾燥させる。溶液をカラムに通過させ、抽出物からＴＳＮＡを吸着させる。カラムから溶液を流し、溶液をフィルム蒸発によって濃縮し、この濃縮物を抽出されたタバコと再結合させ、空気乾燥させる。
【０１０３】
ポリマーによって吸着されたＴＳＮＡは、ＤＣＭを用いてカラムから溶出させることができる。
【実施例９】
【０１０４】
タバコ抽出物の処理における実施例２または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０５】
フルー硬化された（flue-cured）タバコ葉を水で１５分間、６０℃の温度で抽出する。タバコ葉をろ過によって溶液から分離し、乾燥させる。この溶液を実施例２または実施例７のＭＩＰと混合し、その間ポリマーが溶液から選択的にＴＳＮＡを吸着する。それからＭＩＰをろ過または遠心分離によって抽出物から機械的に分離させる。溶液を蒸発により濃縮し、得られた濃縮物を抽出されたタバコに再結合させ、空気乾燥させる。
【０１０６】
ＭＩＰは、ＤＣＭ、メタノールそして最後に脱イオン水またはｐＨ４のバッファで溶出させることによって再利用可能になる。
【実施例１０】
【０１０７】
タバコ抽出物の処理における実施例２または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０８】
連続抽出法を用いてＵＳブレンドの刻みタバコ葉を第１抽出チャンバーに充填し、超臨界二酸化炭素をその中に供給する。タバコと接触した後、二酸化炭素を実施例２または実施例７で説明したように製せられたＭＩＰを含む第２抽出チャンバー内に供給する。ポリマーと接触した後、二酸化炭素を第１抽出チャンバーに戻し、再度タバコと接触させる。このサイクルをタバコのＴＳＮＡ含有量が所望のレベルになるまで続け、その後二酸化炭素がシステムから排出され、タバコは第１チャンバーから取り除かれる。第２チャンバー内のＭＩＰは、ＤＣＭ、メタノールおよび酢酸を用いて再生される。
【実施例１１】
【０１０９】
４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）用に開発されたモレキュラーインプリントポリマーのＮＮＡＬおよびニコチン含有溶液処理における使用
【０１１０】
実施例２の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、そのカラムをリン酸緩衝液に通過させて前処理した。
【０１１１】
ＮＮＡＬおよびニコチンの水溶性標準溶液をｐＨ３．０から７．５の範囲のリン酸緩衝液中で調製した。緩衝標準溶液をカラムに通過させ、その吸収物を集め、ＮＮＡＬおよびニコチン含有量を分析した。緩衝洗浄溶液をカラムに通過させ、その収集物のＮＮＡＬおよびニコチン含有量も分析した。
【０１１２】
溶液をＵＶ検出でＨＰＬＣによって分析した。ＮＮＡＬを保持し、ニコチンを回収するＭＩＰの最適条件は、４．０から４．５の範囲のｐＨで観察される。低いｐＨ値ではニコチンは陽子化され、ポリマーと殆ど相互せず、水溶性緩衝液と共に運ばれる。
【実施例１２】
【０１１３】
４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）用に開発されたＭＩＰ材のＮＮＡＬおよびニコチン含有溶液処理における使用
【０１１４】
実施例２の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、そのカラムをジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび最後に蒸留水に通過させて前処理した。
【０１１５】
ＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ（ＮＡＢ、ＮＡＴ、ＮＮＫおよびＮＮＮ）の水溶性標準溶液を氷酢酸でｐＨ３に酸化させた。この標準溶液をカラムに通過させ、氷酢酸溶液で３回洗浄し、その収集物のＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ含有量をＧＣ−ＴＥＡによって分析した。カラムをジクロロメタン洗浄液で３回洗浄し、この収集物のＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ含有量を分析した。
【０１１６】
ＭＩＰは、９１％のＮＮＡＬ、６５％のＮＮＫを保持し、他のＴＳＮＡ（構造的に類似していない）については約２０から３０％の効率を保持した。
【０１１７】
上記の開示は、本発明を単に例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。本発明の要旨を組み込んだ開示した態様の変更は、当業者によってなしえるので、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれと同等のものの範囲内の全てを包含するものと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】インプリントポリマーの合成方法の概要を示す図。
【図２】ニトロサミン官能基およびニコチンに関連するニトロサミン標的を示す。
【図３】ニトロサミンの等配性（isosteric）類似物を示す。
【図４Ａ】アミドおよびスルホンアミド系標的類似物を示す。
【図４Ｂ】ＮＮＡＬの抽出のためのＭＩＰを調整するためにテンプレートとして使用されるエナミン標的類似物（ＭＰＡＰＢ）を示す。
【図４Ｃ】ＮＮＡＬの抽出のためのＭＩＰを調整するためにテンプレートとして使用されるピリジンカルビノールを示す。
【図５Ａ】ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰを使用した際のＮＮＡＬの回収率を示す。
【図５Ｂ】ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰを使用した際のＮＮＡＬの回収率を示す。
【図６】０．２５μｇのＮＮＡＬを含む１ｍＬの人間の尿（実線で示した）となにも混ざっていない１ｍＬの人間の尿（太線で示した）を分析した後に得られたクロマトグラムを示す。
【図７】ニコチンの存在下でサンプル分析した後得られたクロマトグラムのオーバーレイを示し、実線は、ＮＮＡＬおよびニコチンが混ざったサンプルを表し、破線は、１ｍＬのＮＮＡＬおよびニコチンが混ざったサンプルの充填から集められた溶出液を表し、長破線は、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ４．５の洗浄液を表す。
【図８】本発明による煙フィルターを有する喫煙品の側面図であり、一部を長手方向の断面図であり、一部切り欠き図である。
【図９】本発明による別の煙フィルターを有する喫煙品の図８の類似の図。
【図１０】実施例６で説明した３つの生成物の化学構造および沸点を示す。
【図１１】選択した揮発性ニトロサミンの化学構造および沸点を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一連のモレキュラーインプリントポリマーおよびニコチン代謝体の生体分析および分離にこのポリマーを使用することに関する。さらに本発明は、処理タバコ、タバコ代替え品およびそれらの誘導体中の目的化合物の量を減少させるためにこのモレキュラーインプリントポリマーを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、栄養学、環境科学および化学の分野では同族物質の複合的な混合物から特定の物質を選択的に分離する必要性が増大している。その目的は、特定の化合物の量的抽出、それら化合物の濃度の測定または多成分混合物からの目的化合物の選択的除去などがある。
【０００３】
より厳しい健康管理によって、日々広く使用されている特定の物質から有害な生成物および代謝物の綿密且つ選択的に定量できる方法の要求が高まっている。特に注目されているのはタバコ系の生成物の使用に関連した化合物であり、これら化合物は、未処理のタバコ葉に元来存在する、または喫煙時に発生する化合物である。ニトロサミン類などのニトロソ含有化合物は、この点に関して特別な意義のあるものと考えられている。
【０００４】
喫煙に関連する有毒物の発生を減少させる目的で、喫煙材の依存性の原因であるとされている化学物質である神経刺激性物質のニコチンのみを含む医薬品が製造されている。
【０００５】
禁煙セラピーのためのニコチン処方において、ニコチンチューインガムが最も広く利用されている。このような医薬品の製造時の品質管理としては、ニコチン量（ガム１つ当たり２または４ｍｇ）の監視およびコチニン、ミオスミン、ニコチン−シス−N−オキシド、ニコチン−トランス−N−オキシドおよびベータ−ニコチリンなどの主要なニコチン酸化生成物の監視などがある。またノルニコチン、アナタビンおよびアナバシンの定量も望まれている。アメリカ薬局方（the United States Pharmacopeia (U.S.P)）によると、ガムの処方は、ラベルに表示されているニコチンの量の９５％乃至１１０％を含まなければならず、各酸化生成物の量はニコチン量の０．１％を超えてはならないとされている。
【０００６】
このような紙巻タバコの代替え品を使用しても、ニトロサミンニコチン代謝物がニコチンが体内組織に存在する間に自然な代謝工程によって体内で生成される場合がある。これらの代謝物の量は、殆どの定量的な分析操作法が行われる濃度未満のレベルのままである。従ってこれら代謝物の量と同様に他のニコチン代謝物の量を監視できる方法の必要性は、重要になっている。通常、このような監視は、人間の尿サンプルで行われるが、その中の発ガンの疑いのある物質の量は、極めて低い。
【０００７】
タバコまたはタバコ煙から定量、減少または除去される標的化合物は、知られており、タバコ特有のニトロサミン類（ＴＳＮＡｓ）およびそれらのアルカロイド前駆体などがあり、具体的にはＮＮＫ、４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン、ＮＮＡ、４−（メチルニトロサミノ）−４−（３−ピリジル）ブタナール、ＮＮＮ、N-ニトロソノルニコチン、ＮＡＢ、N-ニトロソアナバシン、ＮＡＴ、N-ニトロソアナタビン、ＮＮＡＬ、４−（メチルニトロスアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール、イソ−ＮＮＡＬ、４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）−１−ブタノール、イソ−ＮＮＡＣ、４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）ブタン酸などがある。
【０００８】
どの程度これら標的化合物が人体の生体流体中に存在するかを適切に定量化するためにタバコに含まれるアルカロイド類、特にニトロシル化された分解生成物および代謝物を分析するための方法が開発されている。このような分析に使用される既存のクロマトグラフ分離または抽出は、一般的な個体群をスクリーニングする際に発生する多数のサンプルを処理するのに要求される強度、厳密さおよび速度に欠ける。これら既存の方法では、通常１ミリリットル当たりピコグラム単位で存在するニトロサミン類の濃度が低いので、分析の前に検体の多段階抽出による多数のサンプル調製および場合によっては化学的誘導体化（例えば質量分析の前の重水素化）を必要とする。このような複雑さの要因の１つとして、既存の分離材料が、例えば抗体または生体受容体が問題の代謝物のためのものであっても分離性状として代謝体の電荷または疎水性のような物理化学的特性に依存しているので選択的ではないということが挙げられる。これらの物理化学的特性は、サンプル中の多くの他の無関係な分子と共有されている場合がある。
【０００９】
通常の方法は、遠心分離、ｐＨ調整、酵素処理などの最大でで７つの作業工程を必要とし、これによりサンプル１つの調製時間に数時間または時には数日かかる場合がある。このような面倒な工程により、これらの工程の間に材料が失われ、元のサンプル濃度の概算に誤差が生じ、よってサンプルの元来の濃度を得るために直接的な測定によるのではなく、最終的な測定値から外挿する必要がある。従って、タバコ特有のニトロサミン類の分析を素早く、かつ、簡単に行える方法は、医学的な分析のニーズに充分答えるものはない（Byrd & Ogden, Journal of Mass Spectrometry, 2003, 38, 98-107およびWu et al. Anal. Chem. 2003, 75,4827-4832参照）。
【００１０】
近年、モレキュラーインプリンティングによって調製された材料（モレキュラーインプリントポリマーまたはMIP）で小さな分子を選択的に認識することについて多くの報告がされている。例えば、Wulff, G. Andrew, Chemie. Int. Ed. Engl. 1995 (34) 1812参照。MIPは、標的化合物に選択的に結合するように適合した反応部位を有するポリマーである。非共有的に調整されたモレキュラーインプリント材料は、治療薬、糖類、ヌクレオチド塩基およびプレスチシド並びにステロイドおよびペプチドホルモンなどの種々の小型分子の不斉認識に使用されている。このようなモレキュラーインプリント材料は、例えばSellergren, B. Trends Anal. Chem. 1997 (16) 310に説明されている。いくつかのインプリント材が示す標的検体に対する高度な親和性および選択性は、対応する免疫親和（immuno-affinity、(IA)）相との比較によって証明されている。しかしながら免疫親和相とは対照的にＭＩＰ材は、調整が簡単で、殆どの媒体に対して安定しており、長期間に亘って再利用可能である。
【００１１】
従ってクロマトグラフィー、分離（連続式またはバッチ式）、化学的増感または特定の評価分析などのＭＩＰ材の用途が研究されている。
【００１２】
また別の用途として生体サンプルまたは複合マトリックスに低濃度で存在する検体の固相抽出（ＳＰＥ、Mayes, A.G..; Mosbach, K. Trends Anal. Chem. 1997, 16, 321参照）がある。ＳＰＥは、既存の方法では達成し得ないレベルに検体を選択的濃縮および浄化することができる。またモレキュラーインプリント固相抽出（MIPSE）が生物学的分析、食品分析および環境分析に使用されている。これらの例では検体が選択的に濃縮および浄化され、その後のクロマトグラフ（例えば、高性能液体クロマトグラフ、ＨＧＬＣ）または質量分析定量化の正確性が増し、検出限界が小さくなる（ＬＯＤ）。
【００１３】
標的分子または一群の標的分子に対する良好な親和性と高度な選択性により、ＭＩＰは食品業界から食品の品質を向上させる手段としてかなり注目されている。この場合、食品母体から望ましくない成分を選択的に除去するためにＭＩＰを必要とする。これらの成分は、低濃度で存在する場合があるので、ＭＩＰの飽和容量は、通常限定的要因とはならない。
【００１４】
本発明で特別に設計された好ましいＭＩＰは、尿素などの複合マトリックスから最も一般的なニトロシル化されたニコチン誘導体を選択的に吸収することができ、定量的に回収することができるので、このような有害な化学物質の濃度の測定において誤差が小さくなる。
【００１５】
定量化の他に標的化合物の量を減少させることによってタバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を消費する際の悪影響を減少させる試みも知られている。このように悪影響を減少させることは、材料の抽出物などの材料そのものまたはその誘導体中で行うことができる。また材料の熱分解生成物、即ち燃焼によって得られる主流煙および副流煙または材料をその燃焼温度未満の温度に加熱することによって生じるエアロゾル中で減少させることも可能である。
【００１６】
このように減少させるためのよく知られている方法の１つとして、材料の熱分解性生物をフィルターと接触させて分解生成物から望ましくない成分を吸着することが挙げられる。またこれとは別に例えば米国特許明細書第５６０１０９７号に開示されているように材料を溶剤抽出する方法もある。この米国特許明細書によれば、タバコ材の蛋白質含有量をポリペプチドを抽出するために界面活性材を含む溶液でタバコを処理し、溶液を分離し、この溶液から界面活性剤とポリペプチドを取り除き、溶液をタバコ材に再結合させることによって減少させている。国際特許明細書ＷＯ０１／６５９５４号は、タバコを超臨界二酸化炭素などの超臨界抽出流体と接触させてニトロサミンを選択的に減少または除去する方法が開示されている。
【００１７】
これらの方法は、タバコおよびタバコ代替え品、即ちタバコと同様に喫煙、噛む、吸入などに関係なく、消費される天然タバコに類似の特性を有する天然または合成材料に等しく利用可能である。
【００１８】
ＭＩＰを使用してタバコ煙からニコチンを除去することがLiu, Y等によるMolecularly imprinted Solid-Phase Extraction Sorbent for Removal of Nicotine from Tobacco Smoke, Analytical Letters, Vol. 36, No. 8, pp1631-1645 (2003)に報告されているように試みられている。この文献に記載されているＭＩＰは、ニコチンに結合するように構成されており、ニトロサミン類のようなより有毒なニコチン代謝物とは結合しない。またＭＩＰが実際にニコチンに選択的であるかどうかは、データを供する科学的方法にキーとなる対照−観察要素（control-checking elements）に欠けるので定かではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って依然として当業界において新規のＭＩＰおよびこれを使用する方法が特にニコチンおよびニコチン代謝物の分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
広義には本発明は、ニトロサミン含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー（ＭＩＰ）を提供する。
【００２１】
本発明の好ましいＭＩＰは、ニトロサミン類、特にＴＳＮＡ類または喫煙材の熱分解生成物の蒸気相に見られる揮発性のニトロサミン類に選択的である。本発明の好ましい別のＭＩＰは、ニコチンのニトロシル化された誘導体またはタバコに見られるアルカロイド類、即ちノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンの１つ以上に選択的である。
【００２２】
本発明のＭＩＰは、例えば１つ以上の機能性モノマーと架橋剤をニトロサミンの構造的類似物の存在下で遊離基開始剤を含む重合媒体中で共重合し、ＭＩＰからテンプレートを除去することによって得られる。
【００２３】
本発明は、本発明のモレキュラーインプリントポリマーを分析サンプル予備処理のクロマトグラフィー、化学センサーでの分析および予備抽出のためにまたはニコチン含有物質または装置からニコチンニトロサミンを抽出するための固相フィルターとして使用することも含む。
【００２４】
さらに本発明は、タバコ製品の標的成分の量を減少させる方法を含み、この方法ではタバコ製品は、少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なＭＩＰで処理される。さらに本発明は、ニトロソ含有化合物に選択的なＭＩＰの使用を含む喫煙材の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明は、タバコ製品に含まれるニトロソ含有化合物の量を減少させるためにタバコ製品をＭＩＰで処理することも含む。
【００２６】
本明細書中、「タバコ生成物」とはタバコ（タバコ葉またはタバコ茎を含む）、タバコ代替え品またはタバコとタバコ代替え品とのブレンドを含む材料、この材料の抽出物、この材料の熱分解によって発生する煙生成物およびこの材料をその燃焼温度未満に加熱して発生するエアロゾルなどの派生物を意味する。
【００２７】
このタバコ生成物がタバコまたはタバコ代替え品を含む材料の燃分解によって発生する派生物である場合、分解は、従来の紙巻きタバコのように材料の燃焼によって、または喫煙者によって吸引されるエアロゾルを発生するためにいくつかの別のタバコ製品に使用される方法に従って材料をその燃焼温度未満に加熱することによって行ってもよい。
【００２８】
これとは別にタバコ生成物は、タバコまたはタバコ代替え品を含む材料を溶媒と接触させて製せられる派生物であってもよい。特に本発明は、喫煙材を溶媒によって抽出する工程と、少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーでこの抽出物を処理してそれに含まれるニトロソ含有化合物の量を減少させる工程と、この処理された抽出物と喫煙材を組み合わせる工程とを含む喫煙材の製造法を提供する。
【００２９】
この方法では喫煙材は、例えば微粉、ステム、くず、裁断された葉身、刻まれたステムまたはこれらいずれかの組み合わせなどの形状であってもよい。溶媒は、メタノール、エタノールまたは超臨界二酸化炭素液などの超臨界流体抽出媒体のような水溶性または非水溶性のものであってもよい。抽出は、タバコから窒素含有化合物の抽出に都合のよい条件下で行ってもよい。
【００３０】
また本発明は、タバコまたはタバコ代替え品および少なくとも１つのニトロソ含有化合物の熱分解生成物からそのニトロソ含有化合物の除去に選択的なモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙品も含む。
【００３１】
本発明の喫煙品は、例えば紙巻きタバコ、葉巻またはシガリロなどのあらゆる従来の形態のものであってもよい。特に本発明の喫煙品は、フィルター付きまたはフィルターなしの任意にラッパーに包まれるタバコ材ロッドを含んでもよい。このラッパーは、紙、タバコ葉、再生タバコまたはタバコ代替え品であってもよい。これとは別に例えば喫煙品が副流煙の発生を低下させることを意図するものである場合または主流煙の熱分解生成物の量を低下させることを意図するものである場合、そのラッパーは、セラミック材などの非燃焼性無機材から構成されてもよい。フィルターは、繊維性セルロースアセテート、ポリプロピレンもしくはポリエチレンまたは紙などのあらゆる好適な材料から構成される。
【００３２】
喫煙材は、好ましくはタバコであるが、非タバコ喫煙材などのタバコ代替え品であってもよい。非タバコ材としては、果実材などの乾燥および硬化された植物材、アルギネートから製せられる合成喫煙材およびグリセロールなどのエアロゾル発生物質などが挙げられる。喫煙品は、タバコと非タバコ材とのブレンドであってもよい。喫煙品がタバコから構成される場合、空気、火、煙または日光で硬化された葉柄またはステムなどのあらゆる種類のものまたはこれらのブレンドであってもよく、あらゆる好適な方法で処理されていてもよい。例えばタバコは、裁断、刻み、膨張または再生処理されたものであってもよい。また喫煙材は、改良剤、着色料、湿潤剤（グリセロールおよびプロピレングリコール）、不活性充填剤（チョークなど）および風味剤（砂糖、甘草およびココア）などの従来の添加剤を含んでもよい。
【００３３】
本発明は、喫煙以外の吸引、噛むまたは鼻からの摂取による経口または経鼻消費されることを意図したタバコにも利用してもよい。このようなタバコ製品としては嗅ぎタバコ、スヌース（snus）および紙タバコなどがある。
【００３４】
モレキュラーインプリント材は、本発明の喫煙材に組み込んでもよい。また本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙材を含む。
【００３５】
これとは別に喫煙品がラッパーに包まれた喫煙材ロッドを含む場合、モレキュラーインプリント材をラッパーに組み込んでもよい。従って本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む喫煙品用ラッパーを含む。このラッパーは、紙などのセルロース系材料または再生タバコなどのタバコ系材料であってもよい。
【００３６】
本発明の好ましい喫煙品は、タバコのロッドと、ラッパーと喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含むフィルターとを含む紙巻きタバコである。
【００３７】
また本発明は、喫煙材の熱分解生成物からの少なくとも１つのニトロソ含有化合物を選択的に除去するモレキュラーインプリントポリマーを含む煙用フィルターを含む。この煙フィルターは、例えば紙巻きタバコまたはシガーホルダーの形状で喫煙品と別個に製してもよく、フィルターチップ付き紙巻タバコの形状で喫煙品に組み込んでもよい。
【００３８】
フィルターチップ状の煙フィルターは、あらゆる従来の構造のものであってもよい。例えば、セルロースアセテートなどの繊維性フィルター材からなるセクションを含む「ダルメシアン」型フィルター形状であってもよく、粒子状のモレキュラーインプリントポリマーをそのセクション全体に配してもよい。またフィルターは、「キャビティー」型フィルターであってもよく、このフィルターは、モレキュラーインプリントポリマーを２つの隣接する繊維フィルター材のセクションの間に配される複数のセクションを含む。この煙フィルターは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアンバーライトなどの他の吸着材を含んでもよい。
【００３９】
使用の際、煙はフィルターを通過し、モレキュラーインプリントポリマーが煙から標的化合物を選択的に吸着保持し、ろ過された煙は、喫煙者に送られる。
【００４０】
本発明による煙フィルター及び喫煙品は、使用時にモレキュラーインプリントポリマーを煙から保護するまたは煙に晒されないようにするための手段を含む。これは複数の異なる方法で行ってもよい。例えば煙フィルターを煙の蒸気相または粒状相から物質を吸着するフィルターエレメントで構成してもよい。このようなフィルターエレメントは、糸状、粒状、顆粒状、布状または紙などのあらゆる従来の形状の活性炭などの一般的な吸着材で構成されてもよい。またフィルターエレメントは、イオン交換樹脂、ゼオライト、シリカ、アルミナまたはアマーライト（amerlite）などの選択的吸着材であってもよい。触媒を保護する手段は、例えばセルロースアセテートからなる第１フィルターエレメントと活性炭からなる第２フィルターエレメントのように異なる組成の２つ以上のフィルターエレメントを含んでもよい。煙フィルターに複数のフィルターエレメントの設けることはよく知られており、あらゆる従来の形状のフィルターおよびその製造方法を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
図中、類似の特徴のものには同じ符号を付してある。
【００４２】
通常、モレキュラーインプリントは、次の工程からなる、（１）標的分子またはそれと構造的に類似したものであるテンプレート化合物を溶液中で選択された1つ以上のモノマーと相互作用させてテンプレート−モノマーコンプレックスを形成する、（２）テンプレート−モノマーコンプレックスを架橋モノマーと共重合させてテンプレート化合物を組み込んだ高分子マトリックスを得る、（３）テンプレート化合物を高分子マトリックスから抽出し、標的分子を選択的に結合するために使用可能なＭＩＰを形成する。工程（３）の前にＭＩＰが固体ポリマー（またはモノリス（monolith））として調製された場合、それは所望の大きさの粒状材のフラクションを形成するために通常粉砕され、篩にかけられる。ＭＩＰが懸濁重合またはエマルジョン重合のいずれかで調製された場合、この重合工程中に粒径を所望の範囲内に調整することができるので、このような粉砕および篩い分けをする必要がない。上述の方法で調整された粒状材は、クロマトグラフカラムまたは固相抽出カラム内に詰め込むことができ、類似の構造または機能性を有する分子を含む混合物の他の成分からテンプレートをクロマトグラフ分離するために用いられる。
【００４３】
テンプレート化合物の除去によって晒されるモレキュラーインプリントポリマー上の反応部位は、標的分子の新鮮な分子との反応に適した立体化学構造をとる。その結果ポリマーは、標的分子の選択的結合に使用することができる。
【００４４】
モレキュラーインプリント結合部位を発生させる現在最も広く利用されている方法は、「非共有」ルートを介している。これはテンプレート化合物と機能性モノマーの非共有自己組織化を利用してテンプレート−モノマーコンプレックスを形成し、その後架橋モノマーの存在下でフリーラジカル重合を行い、最終的にテンプレート化合物が抽出される。テンプレート分子および好適な１つ以上のモノマーが重合前に互いに共有結合する共有インプリントは、公知の方法で実施することができる。上記いずれかの方法で形成されたＭＩＰの結合特性は、テンプレート分子を再結合させることによって調べることができる。
【００４５】
重合は、ポロゲン（porogen）と呼ばれる孔形成溶媒の存在下で行われる。機能性モノマーとテンプレート化合物との静電的相互作用を安定化させるためにポロゲンが低から中極性の非プロトン性溶媒の中からしばしば選択される。理想的にはテンプレート化合物は、重合媒体に中または高溶解度を示し、従ってこれらテンプレート化合物またはその構造類似物は、この標準的な方法を利用して直接使用することができる。
【００４６】
標的分子それ自体をテンプレートとして使用することが可能であるが、標的分子の構造的類似物の方が好ましい、なぜなら（ａ）標的分子は、重合条件下で不安定になりやすい、または重合を阻害する可能性がある、（ｂ）標的分子は、その合成の複雑さもしくははコストまたはその両方のために充分な量を入手できない場合がある、（ｃ）テンプレートは、予備重合混合物に不溶性または溶けにくい場合がある、（ｄ）ＭＩＰは、使用中にＭＩＰから流れ出るポリマーマトリックスの採取しにくい領域に残存する少量の標的分子によて汚染された状態で残る場合がある、および／または（ｅ）標的検体が顕著な健康上のリスクを示し、テンプレートとして使用できないからである。
【００４７】
ニトロソ化合物の場合、特に後述するＴＳＮＡとして知られている化合物の場合、その機能的類似物質をテンプレート化合物として使用するほうがより都合がよい。例えばＴＳＮＡのグルコース誘導体は、図２に示すようにテンプレート化合物として特に有用である。
【００４８】
ＭＩＰが標的化合物の機能的類似物質から得られる場合、その類似物質は、等配性（isosteric）でなければならず、好ましくは標的化合物と等電性でなければならず、またはその類似物質は、強い相互作用が起こりやすい場合、標的化合物の基礎構造（substructure）を含んでいてもよい。
【００４９】
ニトロソ含有化合物、特に一般式Ｏ＝Ｎ−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）で表されるニトロサミン類は、喫煙者に悪影響を与えると示唆されているタバコおよびタバコ煙の多くの構成要素のうちのいくつかである。
【００５０】
本発明を適用できるある特定の類のニトロソ化合物は、「タバコ特有ニトロサミン（ＴＳＮＡ）」として知られているタバコに自然発生するニトロサミン類であり、これらニトロサミン類は、タバコに自然発生するアルカロイド、即ちニコチン、ノルニコチン、アナバシンおよびアナタビンから誘導される。ＴＳＮＡとしては、以下のものが挙げられる。
【００５１】
４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）
【化１】
【００５２】
Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）
【化２】
【００５３】
Ｎ’−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）
【化３】
【００５４】
Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）
【化４】
【００５５】
４−（メチルニトロスアミノ）−４−（３−ピリジル）ブタノール（ＮＮＡ）
【化５】
【００５６】
さらに揮発性ニトロサミンとして知られている一群の化合物もタバコ煙の蒸気相に見られる。これらの化合物のとしては次の化合物が挙げられる。
【００５７】
Ｎ’−ニトロソジメチルアミン（ＮＤＭＡ）
【化６】
【００５８】
Ｎ’−ニトロソジエチルアミン（ＮＤＥＡ）
【化７】
【００５９】
Ｎ’−ニトロソエチルメチルアミン（ＮＰ）
【化８】
【００６０】
Ｎ−ニトロソジエタノールアミン
【化９】
【００６１】
その他のニトロソ含有化合物もまたタバコまたはタバコ煙の化学的研究によって特定されており、その例としては、以下のものが挙げられる。
【００６２】
Ｎ−ニトロソピロリジン（ＮＹＲＰ）
【化１０】
【００６３】
Ｎ’−ニトロソメチルブチルニトロスアミン（ＢＭＮＡ）
Ｎ’−ニトロソ−ｎ−ブチルアミン（ＮＢＡ）
【００６４】
Ｎ’−ニトロソピペリジン（ＮＩＰＩ）
【化１１】
【００６５】
ニトロサミンの標的化のための可能な等配性類似物質を図３に示す。図３に示した分子は、親アミンの全ての誘導体であり、第２級アミンおよび対応するアルデヒドまたは酸塩化物から１つのの工程で合成することができる。エナミンの分子モデル（図４Ａ参照）は、当該ニトロサミンの１つであるＮＮＡＬと良好な立体相補性を示す。
【００６６】
標的検体ＮＮＡＬのための好適なテンプレート化合物の設計の際、ある１つの興味深いテンプレートを特定した。このテンプレートは、ピリジンカルビノール構造に対応するが驚くことにニトロサミン残基（moiety）に欠けるものであった（図４Ｂ参照）。このような基礎構造的テンプレートに充分な結合親和性（binding affinity）および選択性を得ることができれば、これは好ましい方法となる。実際、このピリジンカルボニルＭＩＰで得られる結合親和性、選択性および回収率は、より複雑なエナミンテンプレートで得られるＭＩＰより優れている。したがって、本発明は、標的の特定の重要な特徴に欠けるが、ピリジン−メタノール残基を含む標的ニトロサミンと効果的に結合する単純なテンプレートを含む驚異的に効果的なＭＩＰを提供する。
【００６７】
ＮＮＡＬ ＭＩＰの調製
【００６８】
機能性モノマーメタクリル酸（ＭＡＡ）と、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）またはトリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）の２つの架橋剤のいずれか１つと、テンプレートとして４−（メチルプロペニル−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オル（４ＭＰＡＰＢ、図４Ａ）またはピリジンカルビノール（図４Ｂ）の２つのＮＮＡＬ類似物質のいずれか１つを使用して、有機水溶性溶媒環境でＮＮＡＬに対して強い親和性と選択性を示す２つの異なるポリマーを得る。
【００６９】
本発明は、ニコチン類似物であるＮＮＡＬの定量的回収のための抽出方法を含み、この方法は、ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰをクロマトグラフィー材料フォーマットで調製する工程と、カラムの前処理（conditioning）と、尿サンプルを使用する工程と、阻害化合物を除去する工程と、ＮＮＡＬ検体を最終的に選択的に溶出する工程とを伴う。
【００７０】
本発明をいくつかの実施例を参照してさらに詳述するが、これはあくまで例示を目的としており、本発明を限定するものではない。ここでは本発明は、テンプレート分子、ニコチン由来であり有機または水溶性系に存在するニトロサミンを結合するように構成されたポリマー材料、そして最後にこのポリマー材料を例えば分析サンプルの予備処理のためのクロマトグラフィーおよび化学センサーでの分析的または予備的分離に使用することを参照している。
【００７１】
特に記載がない場合、実施例で使用される材料は市販されているか、または従来の方法で合成することができる。例えば、「B. Sellergren (Ed.) Molecularly-imprinted Polymers: Man made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, part of the series Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Elsevier Science, Amsterdam, Netherlands, 2001」を参照されたい。
【実施例１】
【００７２】
エナミンテンプレートの合成（ＭＰＡＰＢ）
【００７３】
無水トルエン（ナトリウムで乾燥したての）２ｍｌを４−メチルアミン−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（１００ｍｇ）を含むガラス瓶に加えた。この混合物を窒素雰囲気下で１時間、撹拌した。この混合物に１００μｌのプロピオンアルデヒドを加えた。そして５５℃で４時間撹拌した。１時間半後、高性能液体クロマトグラフィーで反応を観察した。生成物の色は、トルエンの中でオレンジ系の黄色であった。トルエン中の粗生成物は、精製せずにろ過した後、ＭＩＰの合成にそのまま使用することができた。テンプレートＭＰＡＰＢの収率は、約９０％であった。
【実施例２】
【００７４】
テンプレートとしてピリジンカルボニルを使用したＭＩＰの合成
【００７５】
ピリジンメタノール（９７μｌ）に３．７４ｍｌのＴＲＩＭ（塩基性アルミナで精製された）、機能性モノマーＭＡＡ（１０２０μｌ）、ポロゲントルエン溶媒（７．１ｍｌ）および最後に開始剤ＡＢＤＶ（６３ｍｇ）を加え、透明な溶液が得られるまで撹拌した。その溶液をガラス瓶に移し、５分間窒素でパージし、火炎密閉（flame sealed）した。熱重合を４５℃で２４時間行った。そのポリマー混合物をさらに２４時間、７０℃で硬化させた。
【００７６】
粗ＭＩＰ材の処理を次のように行った。まずＭＩＰを粗く粉砕し、ソクスレトシンブル（Soxhlet thimble）に移した。このＭＩＰを最初にメタノールで１２時間、それから酢酸で１２時間洗浄して、残存したテンプレートおよび他の未反応のモノマーを除去した。これら最初の抽出工程の後、ポリマーを真空乾燥させ、粉砕し、篩い分けして２０乃至９０μｍのサイズの微粉を得た。最終的な抽出工程として、このように微粉化されたＭＩＰを抽出溶液として蟻酸を使用して溶媒抽出しながら、４０分間、マイクロ波に晒した。乾燥後、ＭＩＰを使用する準備が整った。
【実施例３】
【００７７】
固相抽出（ＳＰＥ）において選択的吸着剤としてのＭＩＰの使用
【００７８】
本発明の１つの態様において、生物マトリックスからＮＮＡＬを選択的に抽出するためにＭＩＰを固相抽出カラムに詰め込むことができる。最初にポリプロピレンフリット（frit）を好適な固相抽出カラム（通常、分析に使用する場合１０ｍｌ容量である）に入れ、２５ｍｇのＭＩＰをその上から加えてＭＩＰ床を形成し、第２のフリットをＭＩＰ床の表面上に強く押し込んだ。カラムの前処理を１ｍｌのＤＣＭ、１ｍｌのＭｅＯＨおよび最後に１ｍｌの蒸留水をこの順番で使用して行った。
【００７９】
サンプル、即ち少量の検体を含む人間の尿（５ｍｌ）を上記で調整したＭＩＰの固相抽出カラムに通過させた。その後カラムを真空状態にし、その中の物質が乾燥するまで水を除去した。ＭＩＰに非特異的に関連する可能性のある極性妨害物質（polar interfering substances）を１ｍｌの蒸留水による洗浄で溶出させた。再度、数分間の真空を利用した乾燥を行い、いわゆる「フェーズ−スイッチ（phase-switch）」（環境を水溶性から有機的環境に変える）させた。この時点で非極性妨害物質をそれぞれ１ｍｌのトルエン、トルエン：ＤＣＭ（９：１）およびトルエン：ＤＣＭ（４：１）で洗浄して除去した。ＮＮＡＬの最終的な選択的溶出を３回の溶出工程においてそれぞれ１ｍｌのＤＣＭを使用して行った。
【００８０】
溶媒を蒸発させた後、サンプルを移動相で再構成し、ベータ−ベーシックＣ１８カラム、５μｍ、１５０ｘ２．１ｍｍ＋プレカラム１０ｘ２．１ｍｍを用いたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ（Ｌ−７０００システム）のＨＰＬＣシステムで分析した。流量は０．２５ｍＬ／分、注入量は１００μＬ、温度は３０℃、２６２ｎｍの紫外線で検出した。移動相は、５０ｍＭのｐＨ３のＮＨ４ＰＯ４、５ｍＭのオクタンスルホン酸および２０％のメタノールからなる。
【００８１】
これらの条件下で、ＮＮＡＬは、８から１０分で溶出する明確に識別可能な２つのピークとして得られた（０．２５μｇのＮＮＡＬが混ざった人間の尿の１ｍｌのサンプルをＮＮＡＬを含まない尿と比較した図６を参照されたい）。この２つのピークは、２つの回転異性体に対応するようにＮＮＡＬの特徴である。ＮＮＡＬの構造からピリジンリングの側鎖が異なる立体配座状態を持ち得ることを立証することができる。好ましい立体配座は、回転異性体と呼ばれ、ＮＮＡＬの場合、２つの主要な立体配座がある。ＨＰＬＣカラム上でのこれら２つの立体配座の保持は、異なる。図６に示すようにＮＮＡＬのピークは、妨害物質からきれいに離れている。したがって容易かつ正確に定量化することができる。ＮＮＡＬの回収率（回収された量／充填された量ｘ１００で表される）は、生体サンプル中のＮＮＡＬの初期の量によるが、通常最大で９０％である。ＮＮＡＬをそれぞれ５０ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ含むサンプルでは１００％の近い回収率を示した（図５参照）。
【実施例４】
【００８２】
ニコチンの存在下で固相抽出における選択的吸着剤としてのＭＩＰの使用
【００８３】
本発明の別の用途は、多量のニコチンが存在するＮＮＡＬに選択的に吸着する吸着剤としての使用がある。この実施例は、ＭＩＰ材の広い範囲の用途およびＭＩＰの選択性が特定のサンプルに対してどのように微調整されるかを例示している。
【００８４】
固相抽出カラムを実施例３と同じように調製した。この固相抽出カラムは、１ｍｌのＤＣＭ、１ｍｌのＭｅＯＨ、１ｍｌのｐＨ４．５の５０ｍＭ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４をこの順番で使用して前処理した。少量の検体を含む５ｍＬの人間の尿であるこの実施例のサンプルを前処理されたＭＩＰ固相抽出カラムに通過させた。その後、カラムを中度の真空状態（例えば１０から８０ｋＰａ）にし、その中の物質が乾燥するまで水を取り除いた。ＭＩＰに非特異的に関連する可能性のある極性妨害物質を１ｍｌのｐＨ４．５の５０ｍＭ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４による洗浄で溶出させた。さらに数分間の真空を利用した乾燥を行った。さらに１ｍｌのトルエン、１ｍｌのトルエン：ＤＣＭ（９：１）および１ｍｌのトルエン：ＤＣＭ（４：１）の順で洗浄を行った。ＮＮＡＬの最終的な選択的溶出を３回の溶出工程においてそれぞれ１ｍｌのＤＣＭを使用して行った。
【００８５】
溶媒を蒸発させた後、サンプルを移動相で再構成し、実施例３で使用したＨＰＬＣシステムで分析した。クロマトグラムの一例を図７に示す。この図は、ニコチンを緩衝液（buffer）洗浄で除去しても、どのようにＮＮＡＬがＭＩＰに選択的に保持されているかを例示している。
【実施例５】
【００８６】
ＭＩＰを組み込んだ喫煙品
【００８７】
図８および９は、ラッパー２で包まれたタバコロッド１とこれにチッピング紙４によって装着される煙フィルター３を有する紙巻きタバコ形状の喫煙品を例示する。明確にするためにチッピング紙４をラッパー２から離して示しているが、実際はチッピング紙とラッパーは接触する。
【００８８】
図８に示した紙巻タバコのフィルター３は、３つの円筒状のフィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃを含む。フィルターの吸い口端に位置する第１のフィルターエレメント３ａは、長さが７ｍｍで、７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸され、全長に亘って２５ｍｍＷＧの圧力降下を有するセルロースアセテートトウで構成されている。フィルターの中央に位置する第２フィルターエレメントは、長さ５ｍｍのキャビティーであり、１５０ｍｇの活性炭粒子を含む。ロッド１に隣接する第３フィルターは、長さが１５ｍｍで、その長さに亘って９０ｍｍＷＧの圧力降下を有し、８０ｍｇのセルロースアセテートトウを含む。このセルロースアセテートトウは、４重量％のトリアセチンで含浸され、下記実施例６で製せられる揮発性ニトロサミンに特有のＭＩＰを８０ｍｇ含み、このＭＩＰは、「ダルメシアン」方式で均一に分配されている。
【００８９】
図９に示した紙巻タバコは、図８の紙巻きタバコと類似しているが、フィルター３が４つの同軸の円筒状フィルターエレメント３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄを有するという点で異なる。紙巻タバコの吸い口端に位置する第１フィルターエレメント３ａは、５ｍｍの長さを有し、７重量％のトリアセチン可塑剤で含浸されたセルロースアセテートトウから構成されている。第１フィルターエレメント３ａに隣接して位置する第２フィルターエレメント３ｂは、下記実施例６で製せられる揮発性ニトロサミンに特有のＭＩＰを２００ｍｇ含む長さ５ｍｍのキャビティーである。第２フィルターエレメント３ｂに隣接する第３フィルターエレメント３ｃは、１０ｍｍの長さを有し、７重量％のトリアセチンで含浸されたセルロースアセテートトウで構成されている。フィルターエレメント３ｃとロッドとの間に位置する第４フィルターエレメント３ｄは、７ｍｍの長さを有し、８０ｍｇの活性炭粒子を含む。換気孔５がリング状にチッピング紙のラジアル平面Ａ−Ａに形成されており、これらの換気孔は、煙が紙巻きタバコを介して吸入される際に第４フィルターエレメント３ｄと第３フィルターエレメントとの接合部から約３ｍｍ下流のフィルターエレメント３ｃ内に空気を送る。
【００９０】
次の実施例は、本発明の紙巻きタバコについてさらに例示する。
【実施例６】
【００９１】
揮発性ニトロサミン類のテンプレート類似物質
【００９２】
【化１２】
【００９３】
２当量の好適な第２級アミン、例えばジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジンまたはモルホリンを無水エーテルに溶解し、新鮮な乾燥したモレキュラーシーブ（５０ｇ／モルアミン）を加えた。この混合物を−５℃に冷却し、撹拌した。１当量のプロピオンアルデヒドをこの冷却した混合物に滴下し、０±５℃に保持した。さらにこの混合物を一晩、冷却槽内で放置した後、ろ過した。生成物がその沸点にもよるが減圧下でろ液を蒸留することによって約５０％の収率で得られた。一例として構造と沸点を図１０に示す（Brannock, et. Al., J. Org. Chem., 1964, 29, 801-812参照）。
【００９４】
強酸機能性モノマーを使用してエナミンに陽子を付加し、インプリント工程中に必要な非共有相互作用を生じさせる。窒素に結合したカーボン原子に正電荷が留まり、イミニウムイオンを供する非局在化により構造が安定する。これにより以後の揮発性ニトロサミンの認識のために強酸機能性モノマーが正しく位置せしめられる。正電荷を非局在化する機会が存在しないので、エナミン窒素の陽子付加は疎外される（Cook, et al., J. Org. Chem., 1995, 60, 3169-3171参照）。
【００９５】
ＭＡＡ（メタクリル酸）より強い酸性の機能性モノマーを使用したほうが好ましい場合もある。さらなる態様は、機能性モノマーとして４−ビニル安息香酸または４−ビニルベンゼンスルホン酸を含む。
【実施例７】
【００９６】
エナミンをテンプレートとして使用したＭＩＰの合成
【００９７】
所望のエナミン（１ｍｍｏｌ）、酸性機能性モノマー（４ｍｍｏｌ）、架橋モノマー（２０ｍｍｏｌ）および遊離基開始剤（全モノマーの１％ｗ／ｗ）を好適なポロゲン溶媒に溶かして予備重合溶液を調製する。機能性モノマーは、ＭＡＡまたはトリフルオロメタクリル酸（ＴＦＭＡＡ）のいずれかであり、架橋剤は、ＥＤＭＡまたはＴＲＩＭのいずれかであり、ポロゲン溶媒は、クロロホルム、トルエン、アセトニトリルまたはアセトニトリル／トルエン（１／１ｖ／ｖ）のいずれか１つである。得られた溶液を重合容器へ移し、０℃に冷却し、５分間窒素でパージし、その後容器を火炎密閉する。重合を４５℃で開始し、この温度で２４時間続ける。得られたポリマーを７０℃で２４時間、硬化させた。
【００９８】
得られた粗ＭＩＰ材を処理する。ＭＩＰ材を粗く粉砕し、ソクスレトシンブル（Soxhlet thimble）に移した。このＭＩＰを（i）メタノールで１２時間、そして（ii）酢酸で１２時間洗浄し、残存したテンプレートおよび他の未反応のモノマーを除去する。これら最初の抽出工程の後、ポリマーを真空乾燥させ、粉砕し、篩い分けして２５乃至３６μｍのサイズの微粉を得た。最終的な抽出工程として、このように微粉化されたＭＩＰを抽出溶液として蟻酸を使用して溶媒抽出しながら、４０分間、マイクロ波に晒した。さらにＭＩＰを２４時間、真空乾燥する。
【００９９】
これとは別に標的ＴＳＮＡをエナミンの代わりに使用してもよい。標準大気圧での選択された揮発性ニトロサミンの沸点を図１１に示す。
【実施例８】
【０１００】
タバコ抽出物の処理における実施例２および／または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０１】
実施例２または実施例３の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、このカラムをジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび最後に蒸留水に通過させて前処理する。
【０１０２】
刻まれたバーリータバコ葉を６０℃の温度の水で１５分間、抽出する。タバコ葉をろ過によって溶液から分離し、乾燥させる。溶液をカラムに通過させ、抽出物からＴＳＮＡを吸着させる。カラムから溶液を流し、溶液をフィルム蒸発によって濃縮し、この濃縮物を抽出されたタバコと再結合させ、空気乾燥させる。
【０１０３】
ポリマーによって吸着されたＴＳＮＡは、ＤＣＭを用いてカラムから溶出させることができる。
【実施例９】
【０１０４】
タバコ抽出物の処理における実施例２または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０５】
フルー硬化された（flue-cured）タバコ葉を水で１５分間、６０℃の温度で抽出する。タバコ葉をろ過によって溶液から分離し、乾燥させる。この溶液を実施例２または実施例７のＭＩＰと混合し、その間ポリマーが溶液から選択的にＴＳＮＡを吸着する。それからＭＩＰをろ過または遠心分離によって抽出物から機械的に分離させる。溶液を蒸発により濃縮し、得られた濃縮物を抽出されたタバコに再結合させ、空気乾燥させる。
【０１０６】
ＭＩＰは、ＤＣＭ、メタノールそして最後に脱イオン水またはｐＨ４のバッファで溶出させることによって再利用可能になる。
【実施例１０】
【０１０７】
タバコ抽出物の処理における実施例２または実施例７のＭＩＰ材の使用
【０１０８】
連続抽出法を用いてＵＳブレンドの刻みタバコ葉を第１抽出チャンバーに充填し、超臨界二酸化炭素をその中に供給する。タバコと接触した後、二酸化炭素を実施例２または実施例７で説明したように製せられたＭＩＰを含む第２抽出チャンバー内に供給する。ポリマーと接触した後、二酸化炭素を第１抽出チャンバーに戻し、再度タバコと接触させる。このサイクルをタバコのＴＳＮＡ含有量が所望のレベルになるまで続け、その後二酸化炭素がシステムから排出され、タバコは第１チャンバーから取り除かれる。第２チャンバー内のＭＩＰは、ＤＣＭ、メタノールおよび酢酸を用いて再生される。
【実施例１１】
【０１０９】
４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）用に開発されたモレキュラーインプリントポリマーのＮＮＡＬおよびニコチン含有溶液処理における使用
【０１１０】
実施例２の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、そのカラムをリン酸緩衝液に通過させて前処理した。
【０１１１】
ＮＮＡＬおよびニコチンの水溶性標準溶液をｐＨ３．０から７．５の範囲のリン酸緩衝液中で調製した。緩衝標準溶液をカラムに通過させ、その吸収物を集め、ＮＮＡＬおよびニコチン含有量を分析した。緩衝洗浄溶液をカラムに通過させ、その収集物のＮＮＡＬおよびニコチン含有量も分析した。
【０１１２】
溶液をＵＶ検出でＨＰＬＣによって分析した。ＮＮＡＬを保持し、ニコチンを回収するＭＩＰの最適条件は、４．０から４．５の範囲のｐＨで観察される。低いｐＨ値ではニコチンは陽子化され、ポリマーと殆ど相互せず、水溶性緩衝液と共に運ばれる。
【実施例１２】
【０１１３】
４−メチルニトロソアミノ−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）用に開発されたＭＩＰ材のＮＮＡＬおよびニコチン含有溶液処理における使用
【０１１４】
実施例２の方法に従って製せられたポリマーを固相抽出カラムに組み込み、そのカラムをジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノールおよび最後に蒸留水に通過させて前処理した。
【０１１５】
ＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ（ＮＡＢ、ＮＡＴ、ＮＮＫおよびＮＮＮ）の水溶性標準溶液を氷酢酸でｐＨ３に酸化させた。この標準溶液をカラムに通過させ、氷酢酸溶液で３回洗浄し、その収集物のＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ含有量をＧＣ−ＴＥＡによって分析した。カラムをジクロロメタン洗浄液で３回洗浄し、この収集物のＮＮＡＬおよびＴＳＮＡ含有量を分析した。
【０１１６】
ＭＩＰは、９１％のＮＮＡＬ、６５％のＮＮＫを保持し、他のＴＳＮＡ（構造的に類似していない）については約２０から３０％の効率を保持した。
【０１１７】
上記の開示は、本発明を単に例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。本発明の要旨を組み込んだ開示した態様の変更は、当業者によってなしえるので、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれと同等のものの範囲内の全てを包含するものと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】インプリントポリマーの合成方法の概要を示す図。
【図２】ニトロサミン官能基およびニコチンに関連するニトロサミン標的を示す。
【図３】ニトロサミンの等配性（isosteric）類似物を示す。
【図４Ａ】アミドおよびスルホンアミド系標的類似物を示す。
【図４Ｂ】ＮＮＡＬの抽出のためのＭＩＰを調整するためにテンプレートとして使用されるエナミン標的類似物（ＭＰＡＰＢ）を示す。
【図４Ｃ】ＮＮＡＬの抽出のためのＭＩＰを調整するためにテンプレートとして使用されるピリジンカルビノールを示す。
【図５Ａ】ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰを使用した際のＮＮＡＬの回収率を示す。
【図５Ｂ】ＮＮＡＬに選択的なＭＩＰを使用した際のＮＮＡＬの回収率を示す。
【図６】０．２５μｇのＮＮＡＬを含む１ｍＬの人間の尿（実線で示した）となにも混ざっていない１ｍＬの人間の尿（太線で示した）を分析した後に得られたクロマトグラムを示す。
【図７】ニコチンの存在下でサンプル分析した後得られたクロマトグラムのオーバーレイを示し、実線は、ＮＮＡＬおよびニコチンが混ざったサンプルを表し、破線は、１ｍＬのＮＮＡＬおよびニコチンが混ざったサンプルの充填から集められた溶出液を表し、長破線は、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ４．５の洗浄液を表す。
【図８】本発明による煙フィルターを有する喫煙品の側面図であり、一部を長手方向の断面図であり、一部切り欠き図である。
【図９】本発明による別の煙フィルターを有する喫煙品の図８の類似の図。
【図１０】実施例６で説明した３つの生成物の化学構造および沸点を示す。
【図１１】選択した揮発性ニトロサミンの化学構造および沸点を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項２】
ニコチン、ノルニコチン、アナバシンまたはアナタビン由来のニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項３】
ニコチン由来のニトロサミン、ＮＮＡＬに選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項４】
等配性テンプレート類似物質を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項５】
テンプレートとしてニコチンニトロサミンの等配性類似物質を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項６】
テンプレートとして４−（メチルプロペニル−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オールを使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項７】
テンプレートとしてピリジンカルビノールを使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項８】
ニトロソ含有化合物の基礎構造を含む化合物を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれか１項記載のモレキュラーインプリントポリマーとサンプル中のニトロサミンを検出、定量化および分離する内の少なくとも１つを行うように前記モレキュラーインプリントポリマーを使用するためのインストラクションとを含むキット。
【請求項１０】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
ニトロサミンの構造的類似物質に結合したモレキュラーインプリントポリマーを製するために少なくとも１つの遊離基開始剤を含む重合媒体中で少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質の存在下で少なくとも１つの機能性モノマーと少なくとも１つの架橋剤とを共重合する工程と、
前記モレキュラーインプリントポリマーから前記ニトロサミンの構造的類似物質を除去する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記機能性モノマーが酸性の機能性を示すことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記機能性モノマーがメタクリル酸（ＭＡＡ）、ＴＦＭＡＡ、ビニル安息香酸およびイタコン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋剤がエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、ペンタエリスリトールテトラアクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記構造的類似物質が４−（メチルプロピレン−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オール（４ＭＰＡＰＢ）およびピリジンカルビノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
均一な反応媒体中で重合混合物と少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質を共重合する工程と、
前記反応媒体から懸濁した粒子を回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
不均一反応媒体中で重合混合物と少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質を共重合する工程と、
前記不均一反応媒体から重合した材料を回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１６いずれか１項記載の方法で調製されたモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項１８】
サンプルがニトロサミンを含有するかどうかを判断する方法であって、
サンプル中に存在するニトロサミン類をニトロサミン類に選択的なモレキュラーインプリントポリマーに結合させる条件下でサンプルをモレキュラーインプリントポリマーと反応させる工程と、
ニトロサミン類に結合したモレキュラーインプリントポリマーが観察されたという評価は、サンプルがニトロサミン類を含むことを示す前記モレキュラーインプリントポリマーがニトロサミン類のいずれかに結合したか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
サンプル中のニトロサミン類の量を定量化する方法であって、
サンプル中に存在するニトロサミン類をニトロサミン類に選択的なモレキュラーインプリントポリマーに結合させる条件下でサンプルをモレキュラーインプリントポリマーと反応させる工程と、
モレキュラーインプリントポリマーに結合したニトロサミンの量を測定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーでタバコ生成物を処理することを含むタバコ生成物中の標的化合物の量を減少させるためにタバコ生成物を処理する方法。
【請求項２１】
前記タバコ生成物が、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料の熱分解によって製せられることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記タバコ生成物が前記材料をその燃焼温度より低い温度に加熱して製せられることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記タバコ生成物が前記材料の燃焼によって製せられることを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】
前記タバコ生成物が、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒と接触させることによって製せられることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
タバコ材を製する方法であって、
タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒で抽出する工程と、
その抽出物を少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーと接触させて抽出物中のニトロソ含有化合物の量を減少させる工程と、
抽出されたタバコ材と処理された抽出物を組み合わせる工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記モレキュラーインプリントポリマーが少なくとも１つのニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２０乃至２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記モレキュラーインプリントポリマーが少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２０乃至２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
喫煙材と、
喫煙材の熱分解生成物中に見られる少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーとを含む喫煙品。
【請求項２９】
前記モレキュラーインプリントポリマーが喫煙材の熱分解生成物中の蒸気相に見られる少なくとも１つの揮発性ニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２８記載の喫煙品。
【請求項３０】
少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーを含む煙用フィルター。
【請求項３１】
前記モレキュラーインプリントポリマーがタバコまたはタバコ代替え品の熱分解生成物中の蒸気相に見られる少なくとも１つの揮発性ニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項３０記載のフィルター。
【請求項１】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項２】
ニコチン、ノルニコチン、アナバシンまたはアナタビン由来のニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項３】
ニコチン由来のニトロサミン、ＮＮＡＬに選択的なモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項４】
等配性テンプレート類似物質を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項５】
テンプレートとしてニコチンニトロサミンの等配性類似物質を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項６】
テンプレートとして４−（メチルプロペニル−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オールを使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項７】
テンプレートとしてピリジンカルビノールを使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項８】
ニトロソ含有化合物の基礎構造を含む化合物を使用して調整された請求項１記載のポリマー。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれか１項記載のモレキュラーインプリントポリマーとサンプル中のニトロサミンを検出、定量化および分離する内の少なくとも１つを行うように前記モレキュラーインプリントポリマーを使用するためのインストラクションとを含むキット。
【請求項１０】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
ニトロサミンの構造的類似物質に結合したモレキュラーインプリントポリマーを製するために少なくとも１つの遊離基開始剤を含む重合媒体中で少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質の存在下で少なくとも１つの機能性モノマーと少なくとも１つの架橋剤とを共重合する工程と、
前記モレキュラーインプリントポリマーから前記ニトロサミンの構造的類似物質を除去する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記機能性モノマーが酸性の機能性を示すことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記機能性モノマーがメタクリル酸（ＭＡＡ）、ＴＦＭＡＡ、ビニル安息香酸およびイタコン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋剤がエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、ペンタエリスリトールテトラアクリレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記構造的類似物質が４−（メチルプロピレン−アミノ）−１−ピリジン−３−イル−ブタン−１−オール（４ＭＰＡＰＢ）およびピリジンカルビノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
均一な反応媒体中で重合混合物と少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質を共重合する工程と、
前記反応媒体から懸濁した粒子を回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーの調製方法であって、
不均一反応媒体中で重合混合物と少なくとも１つのニトロサミンの構造的類似物質を共重合する工程と、
前記不均一反応媒体から重合した材料を回収する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１６いずれか１項記載の方法で調製されたモレキュラーインプリントポリマー。
【請求項１８】
サンプルがニトロサミンを含有するかどうかを判断する方法であって、
サンプル中に存在するニトロサミン類をニトロサミン類に選択的なモレキュラーインプリントポリマーに結合させる条件下でサンプルをモレキュラーインプリントポリマーと反応させる工程と、
ニトロサミン類に結合したモレキュラーインプリントポリマーが観察されたという評価は、サンプルがニトロサミン類を含むことを示す前記モレキュラーインプリントポリマーがニトロサミン類のいずれかに結合したか否かを評価する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
サンプル中のニトロサミン類の量を定量化する方法であって、
サンプル中に存在するニトロサミン類をニトロサミン類に選択的なモレキュラーインプリントポリマーに結合させる条件下でサンプルをモレキュラーインプリントポリマーと反応させる工程と、
モレキュラーインプリントポリマーに結合したニトロサミンの量を測定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーでタバコ生成物を処理することを含むタバコ生成物中の標的化合物の量を減少させるためにタバコ生成物を処理する方法。
【請求項２１】
前記タバコ生成物が、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料の熱分解によって製せられることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記タバコ生成物が前記材料をその燃焼温度より低い温度に加熱して製せられることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記タバコ生成物が前記材料の燃焼によって製せられることを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】
前記タバコ生成物が、タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒と接触させることによって製せられることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
タバコ材を製する方法であって、
タバコ、タバコ代替え品またはこれらの混合物を含む材料を溶媒で抽出する工程と、
その抽出物を少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーと接触させて抽出物中のニトロソ含有化合物の量を減少させる工程と、
抽出されたタバコ材と処理された抽出物を組み合わせる工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記モレキュラーインプリントポリマーが少なくとも１つのニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２０乃至２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記モレキュラーインプリントポリマーが少なくとも１つのタバコ特有のニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２０乃至２５いずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
喫煙材と、
喫煙材の熱分解生成物中に見られる少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーとを含む喫煙品。
【請求項２９】
前記モレキュラーインプリントポリマーが喫煙材の熱分解生成物中の蒸気相に見られる少なくとも１つの揮発性ニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項２８記載の喫煙品。
【請求項３０】
少なくとも１つのニトロソ含有化合物に選択的なモレキュラーインプリントポリマーを含む煙用フィルター。
【請求項３１】
前記モレキュラーインプリントポリマーがタバコまたはタバコ代替え品の熱分解生成物中の蒸気相に見られる少なくとも１つの揮発性ニトロサミンに選択的であることを特徴とする請求項３０記載のフィルター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５００４４２（Ｐ２００８−５００４４２Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７１２６（Ｐ２００７−５２７１２６）
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００５／０００７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１２６７０
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（５０５２７１９７６）エムアイピー テクノロジーズ アーベー (2)
【出願人】（５００２５２８４４）ブリティッシュ アメリカン タバコ （インヴェストメンツ） リミテッド (111)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＴＩＳＨ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＯＢＡＣＣＯ （ＩＮＶＥＳＴＭＥＮＴＳ） ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００５／０００７７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１２６７０
【国際公開日】平成１７年１２月１日（２００５．１２．１）
【出願人】（５０５２７１９７６）エムアイピー テクノロジーズ アーベー (2)
【出願人】（５００２５２８４４）ブリティッシュ アメリカン タバコ （インヴェストメンツ） リミテッド (111)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＴＩＳＨ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＯＢＡＣＣＯ （ＩＮＶＥＳＴＭＥＮＴＳ） ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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