ニューキノロン剤誘導体
【課題】腫瘍集積性を高めたニューキノロン剤誘導体を提供する。
【解決手段】ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体。
【解決手段】ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なニューキノロン剤誘導体に関する。詳細には、音響癌化学療法において使用する音響感受性物質として作用する、新規な構造のニューキノロン剤誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波を使用した癌の治療方法としては、超音波の生体組織に対する加熱作用と非加熱作用の二種類を利用するものに大別される。加熱作用を利用するものとしては、理学療法、温熱療法、加熱凝固療法がある。理学療法は、強度０．１〜３Ｗ／ｃｍ３の超音波を用いて、疼痛を緩和させる治療法である。温熱療法は、腫瘍を局所的に加温して悪性腫瘍を治療する方法である。また、加熱凝固療法は、患部に大きな超音波エネルギーを集束させ、蛋白質凝固点以上に加熱して、凝固壊死させる治療法である。
【０００３】
超音波の非加熱作用としては、機械的作用と化学作用がある。機械的作用は、超音波振動によるもので、この作用を主として用いた治療法に、対外衝撃波砕石術、超音波振動メス、歯石除去術などがある。化学作用とは、微小気泡が超音波の照射を受けて急速に圧壊するときに、物質が化学的に活性化されることにより生じる作用をいう。この超音波の化学作用を利用した癌の治療法として、音響癌化学療法（超音波力学的療法、ソノダイナミックセラピー（ＳＤＴ））がある。音響癌化学療法とは、悪性腫瘍に対して、音響感受性物質の存在下で、微弱な超音波を照射し、超音波と薬物の相乗効果により治療する方法である。音響癌化学療法における超音波の強度は、超音波診断装置における強度（０．０５〜０．３Ｗ／ｃｍ２）と同程度である。本発明のニューキロン剤誘導体は、該音響感受性物質として作用するものである。以下、音響癌化学療法について説明する。
【０００４】
音響癌化学療法の推定メカニズムを図１に示す。体外より超音波を照射すると、腫瘍組織の液体中に微小気泡が生成する。該微小気泡は、断熱膨張・圧縮を繰り返し、やがて圧壊する。この時、数千度・数百気圧の高温・高圧が生じ、ここで生じたエネルギーによって腫瘍組織に取り込まれた音響感受性物質が基底状態から励起状態に活性化される。該音響感受性物質が、励起状態から基底状態に戻るときに溶存酸素から活性酸素を発生させる。生じた活性酸素が腫瘍細胞に障害を与え、腫瘍組織の壊死を引き起こすと考えられている。
【０００５】
音響癌化学療法の利点としては、（１）超音波を用いることから低侵襲性であること、（２）超音波を局所的に照射することが可能で、さらに腫瘍集積性の高い音響感受性物質を用いることで、腫瘍選択的に治療できること、（３）超音波や音響感受性物質による副作用が少ないこと、（４）超音波の透過性が高いことから体深部の腫瘍に効果が期待できること、が挙げられる。
【０００６】
音響癌化学療法を実現するには、最適な音響感受性物質を開発することが重要である。臨床応用の可能性が高い理想的な音響感受性物質の特性としては、（１）低濃度で高い音響化学効果を示すこと、（２）人体に投与可能であること、（３）腫瘍集積性（腫瘍選択性）が高いこと、が挙げられる。音響感受性物質についてのこれまでの研究としては、梅村らにより、ヘマトポリフィリンが音響感受性物質として用いることができることが報告されている（非特許文献１）。ヘマトポリフィリンは、強い音響化学効果を示し、腫瘍集積性が高い化合物であるが、光毒性という重篤な副作用がある。
【０００７】
また、本発明者らは、抗炎症剤として既に臨床使用されているピロキシカムが音響化学的効果を示すことを報告している（非特許文献２）。しかしながら、ピロキシカムは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、通常量の４倍以上が局所で必要となる欠点があった。
【０００８】
また、本発明者らは、広く臨床に使用されている抗生物質であり、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤に着目した。そのうち、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）の４種類を用いて検討を行い、ＬＦＬＸ、ＧＦＬＸ、ＳＰＦＸの３種類のニューキノロン剤がｉｎ ｖｉｖｏにおいて、音響化学的効果を示すことを明らかにした（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yumita N, Nishigaki R, Umemura K and Umemura S: Hematoporphyrin as a sensitizer of cell-damaging effect of ultrasound. Jpn J Cancer Res, 80, 219-222,1989.
【００１０】
【非特許文献２】Sakusabe N, Okada K, Sato K, Kamada S, Yoshida Y and Suzuki T: Enhanced sonodynamic antitumor effect of ultrasound in the presence of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Jpn J Cancer Res, 90, 1146-1151, 1999.
【００１１】
【非特許文献３】Huang D, Okada K, Komori C, Itoi E and Suzuki T: Enhanced antitumor activity of ultrasonic irradiation in the presence of new quinolone antibiotics in vivo. Cancer Sci, 95, 845-849, 2004.
【００１２】
【非特許文献４】Huang D, Okada K, Komori C, Itoi E, Kawamura K and Suzuki T: Ultrastructure of sarcoma 180 cells after ultrasound irradiation in the presence of sparfloxacin. Anticancer Res, 24, 1553-1559, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記のニューキノロン剤は腫瘍集積性が乏しいという欠点があった。
そこで、本発明は、腫瘍集積性を高めたニューキノロン剤誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ニューキノロン剤の腫瘍集積性を高めることを検討した。腫瘍組織の特徴として、毛細血管透過性が亢進していること、リンパ管からの排出が不十分であることが挙げられる。したがって、血中半減期の長い化合物は、正常組織と腫瘍組織に取り込まれた後に、リンパ管からの排泄が不十分な腫瘍組織に次第に集積していくことが予想される。血中半減期を長くする手段の一つとして、化合物の分子量を大きくすることが挙げられる。この目的で汎用される高分子化合物の一つとして、ポリエチレングリコールがある。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、無毒性で、非免疫原性で、生物分解性の水溶性ポリマーである。該ＰＥＧの医薬品への応用例としては、ペグイントロンがある。この薬剤は、ＩＦＮα−２ｂを分子量１２０００のＰＥＧと共有結合したＣ型慢性肝炎治療薬である。ＰＥＧ化することで、生体内での滞留時間が延長し、週３回投与を週１回投与とすることが可能となった。
【００１５】
本発明者らは、以上の知見を基に、ニューキロン剤をＰＥＧ化することにより、その分子量を増大させ、得られるＬＦＬＸ誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高めることについて鋭意研究し、以下の発明を完成させた。
【００１６】
第１の本発明は、ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体である。
【００１７】
第１の本発明において、高分子化合物の分子量は、１０００以上１５０００以下であることが好ましい。
【００１８】
第１の本発明において、高分子化合物は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。また、ポリエチレングリコールは、末端にアミノ基を有するメトキシポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００１９】
第１の本発明において、ニューキノロン剤のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。
【００２０】
第１の本発明において、ニューキノロン剤は、ロメフロキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンからなる群から選ばれる一種であることが好ましい。
【００２１】
第１の本発明において、ニューキノロン剤は、ロメフロキサシンであることが好ましい。
【００２２】
第２の本発明は、下記式（１）の構造を備えてなる、ニューキノロン剤誘導体である。
【００２３】
【化１】
（式（１）中、Ｒは、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基から選ばれる保護基である。ｎは、２０〜３４０の整数である。）
【００２４】
第２の本発明において、保護基はアセチル基であることが好ましい。
【００２５】
第３の本発明は、第１および第２の本発明のニューキノロン剤誘導体を含有してなる、超音波治療用薬剤である。
【００２６】
第４の本発明は、第３の本発明の超音波治療用薬剤を患者に投与する工程、腫瘍部に超音波を照射する工程を備えてなる、腫瘍の治療方法である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のニューキノロン剤誘導体は、低濃度で高い音響化学効果を示すものであり、また、臨床に広く使用され、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤をベースとしているため、同様に人体への副作用が少ないことが予想され、さらに、Ｃ型肝炎治療薬を高分子化して血中半減期を延長したという実績のあるポリエチレングリコールを用いて高分子化していることから、同様に血中半減期を延長することができ、腫瘍選択性が高いことが予想される。これより、本発明のニューキノロン剤誘導体は、音響癌化学療法において用いる音響感受性物質として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】音響癌化学療法の推定メカニズムを示す概念図である。
【図２】実施例における腫瘍細胞−薬物混合溶液の調整方法を示す概念図である。
【図３】実施例で使用した超音波装置の概要を示す概念図である。
【図４】混合溶液（２００μＭ）における細胞生存率を比較したグラフである。
【図５】細胞生存率の薬物濃度依存性を示したグラフである。
【図６】（Ａ）はコントロールにおける超音波照射前の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｂ）はＬＰ２０００（実施例１）における超音波照射前の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｃ）はコントロールにおける超音波照射後の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｄ）はＬＰ２０００（実施例１）における超音波照射後の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
＜ニューキノロン剤誘導体＞
本発明の新規な構造のニューキノロン剤誘導体は、ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合した構造を有している。本発明のニューキノロン剤誘導体は、高分子化されることにより、血中半減期が長くなり、これにより、腫瘍集積性が高められている。
【００３０】
（ニューキノロン剤）
ニューキノロン剤は、重篤な副作用が少ない抗生物質として、広く臨床に使用されている化合物である。該ニューキノロン剤のうち、音響化学的効果を示すものであれば、特に限定なく、本発明のニューキノロン剤誘導体の前駆体として用いることができる。ニューキロン剤としては、例えば、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、シプロフロキサシン（ＣＰＬＸ）が挙げられる。中でも、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）は、本発明者らによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて音響化学的効果を示すことが確かめられているので、これらの化合物から選ばれるものを本願発明のニューキノロン剤誘導体の前駆体として用いることが好ましい。また、ニューキノロン剤のカルボキシル基を高分子化する際の合成の容易さの点から、中でも、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）を前駆体とすることが、特に好ましい。
【００３１】
（高分子化合物）
上記したニューキノロン剤のカルボキシル基と結合して、高分子化させる高分子化合物としては、無毒性、非免疫原性、生分解性、水溶性等の性質を備えた高分子化合物であれば、特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸が挙げられる。中でも、ＩＦＮα−２ｂを高分子化してペグイントロンとして、生体内での滞留時間を延長させた実績のある、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
【００３２】
ポリエチレングリコールとしては、所定の分子量を有し、ニューキノロン剤のカルボキシル基と結合して高分子化させることができるものであれば、特に限定されない。ポリエチレングリコールにおける、カルボキシル基と結合する側の末端としては、例えば、水酸基、アミノ基を挙げることができる。水酸基の場合は、エステル結合によりニューキノロン剤と結合し、また、アミノ基の場合は、アミド結合によりニューキノロン剤と結合する。該末端の種類は、ニューキノロン剤の種類により、結合をさせやすいものを選択すればよい。例えば、ニューキノロン剤としてＬＦＬＸを用いた場合は、合成上の点から、アミノ基を末端に有する高分子化合物を用いた方が好ましい。
【００３３】
また、ポリエチレングリコールにおける、カルボキシル基と結合する側の末端と反対の末端は、ニューキノロン剤との反応において副反応を防ぐ観点から、および、目的物の精製を容易にする観点から、アルコキシ化されていることが好ましい。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基が挙げられる。
【００３４】
高分子化合物の分子量は、１０００以上１５０００以下であることが好ましく、１３００以上１００００以下であることがより好ましく、１５００以上８０００以下であることがさらに好ましく、１８００以上７０００以下であることが特に好ましく、１９００以上６０００以下であることが最も好ましい。高分子化合物の分子量が小さすぎると、ニューキノロン剤誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高める効果が劣る虞があり、逆に、高分子化合物の分子量が大きすぎると、ニューキノロン剤誘導体の音響化学効果が劣る虞がある。
【００３５】
本発明における、高分子化合物の好ましい形態の一つとして、以下の式（２）で示される末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００３６】
【化２】
【００３７】
式（２）中、ｎは、２０〜３４０の整数であり、ｎは好ましくは２８〜２２５の整数であり、より好ましくは３２〜１８０の整数であり、さらに好ましくは３９〜１５７の整数であり、特に好ましくは４１〜１３５の整数である。ｎが小さすぎると、ニューキノロン剤誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高める効果が劣る虞があり、逆に、ｎが大きすぎると、ニューキノロン剤誘導体の音響化学効果が劣る虞がある。
【００３８】
（アミノ基の保護）
ニューキノロン剤のカルボキシル基を高分子化化合物と結合させるに際して、ニューキノロン剤中のアミノ基は、保護しておくことが好ましい。ニューキノロン剤中のアミノ基を保護しておくことによって、有機溶媒への可溶性を増すことができ、副反応を抑えることができる。このような目的を達成できるのであれば、保護基は特に限定されないが、例えば、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を挙げることができる。中でも、保護基としては、合成の容易さ、および、生体適合性の点から、アセチル基を用いることが好ましい。
【００３９】
＜ニューキノロン剤誘導体の製造方法＞
本発明のニューキノロン剤誘導体は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と、高分子化合物とを結合させて、高分子化することにより製造することができる。例えば、高分子化合物がアミノ基を有している場合は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と反応させアミド結合を形成することにより高分子化することができ、また、高分子化合物が水酸基を有している場合は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と反応させエステル結合を形成することにより高分子化することができる。なお、高分子化に先立って、ニューキノロン剤中のアミド基は、保護基により保護しておくことが好ましい。
【００４０】
高分子化合物の好ましい形態の一つとして、上記の式（２）で示される末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを用い、ニューキノロン剤としてＬＦＬＸを用いた場合における、両者の結合反応について、以下、詳細に説明する。ポリエチレングリコール化ＬＦＬＸ誘導体の製造方法の概要を式（３）に示す。
【００４１】
【化３】
【００４２】
まず、ＬＦＬＸ塩酸塩のアミノ基を、アセチルクロライドによりアセチル化して保護する。得られた化合物にクロロギ酸メチルを反応させて、その後、末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを反応させて、ポリエチレングリコール化ＬＦＬＸ誘導体が得られる。
【００４３】
＜音響感受性物質としての用途＞
本発明のニューキノロン剤誘導体は、低濃度で高い音響化学効果を示すものであり、また、臨床に広く使用され、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤をベースとしているため、同様に人体への副作用が少ないことが予想され、さらに、Ｃ型肝炎治療薬を高分子化して血中半減期を延長したという実績のあるポリエチレングリコールを用いて高分子化していることから、同様に血中半減期を延長することができ、腫瘍選択性が高いことが予想できる。これより、本発明のニューキノロン剤誘導体は、音響癌化学療法において用いる音響感受性物質として使用することができる。
【実施例】
【００４４】
＜ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体の合成＞
（実施例１）
撹拌したロメフロキサシン塩酸塩（塩野義製薬社製）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に、トリエチルアミン（和光純薬社製）０．５９ｍＬ（４．１２ｍｍｏｌ）、および、アセチルクロライド（和光純薬社製）０．１５ｍＬ（２．０６ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、室温にて４時間撹拌した。
得られた溶液から、減圧化にて溶媒を除去し、残渣をクロロホルムに溶解させた。このクロロホルム容器を水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去して粗生成物を得た。該粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９７：３）により精製した（粗生成物：５２５ｍｇ）。これを、クロロホルム−メタノール混合溶媒から再結晶させ、目的物であるアセチル化ＬＦＬＸを黄色粉末（２５６ｍｇ、６３％）として得た。
【００４５】
【化４】
【００４６】
アセチル化ＬＦＬＸ：
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３０５２，１７１９，１６２５．
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１４．５８（１Ｈ，ｓ），８．６０（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．０Ｈｚ），４．４８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，３．０Ｈｚ），３．６２−３．７０（１Ｈ，ｍ），３．３８−３．４４（２Ｈ，ｍ），３．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．６４（３Ｈ，ｓ），１．５８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．４１（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７６．５，１６９．６，１６６．８，１５３．９，１５７．５，１５０．５，１３４．７，１２７．５，１２２．５，１０９．０，１０８．６，５５．９，５４．９，５１．４，４５．１，４２．４，２２．２，１６．７，１５．５．
【００４７】
得られたアセチル化ＬＦＬＸ（１００ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（５．０ｍＬ）を撹拌し、これにトリエチルアミン（和光純薬社製）１４０μＬ（１．０ｍｍｏｌ）、および、クロロギ酸メチル（和光純薬社製）３９μＬ（０．５ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、室温にて３時間撹拌した。
【００４８】
【化５】
【００４９】
上記で得られた反応溶液に、末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−２０Ｈ）、分子量２０００）５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）を加え、混合溶液を室温にて２．５時間撹拌した。得られた混合溶液を水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去して粗生成物を得た。この粗生成物を、クロロホルム−メタノール混合溶媒から再結晶させ、目的物であるＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を白色固体（４５１ｍｇ、７６％）として得た。以下、実施例１で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ２０００という。
【００５０】
【化６】
【００５１】
ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体（ＬＰ２０００）：
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６６０，１５４２，１１１３．
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６４（１Ｈ，ｓ），７．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．０Ｈｚ），４．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，３．０Ｈｚ），３．８８−３．９２（１Ｈ，ｍ），３．６０−３．７０（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−，ｍ），３．６５（３Ｈ，ｓ），３．３８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．２０−３．２２（２Ｈ，ｍ），２．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．７４（３Ｈ，ｓ），１．７２−１．７５，（２Ｈ，ｍ），１．５２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．３７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７４．２，１７１．９，１６４．５，１５６．９，１４９．５，１４８．６，１３０．７，１２４．４，１２２．８，１１１．４，１０８．６，７１．０−６９．１（ＰＥＧ），５９．１，５５．６，５３．７，５１．１，５０．２，４４．７，４２．２，２９．７，２５．４，２１．８，１６．４，１６．２．
【００５２】
（実施例２）
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールとして、分子量５０００（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−５０Ｈ））のものを用いた以外は、実施例１と同様にしてＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を得た（９２％）。以下、実施例２で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ５０００という。
【００５３】
（参考例１）
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールとして、分子量２００００（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−２０Ｔ））のものを用いた以外は、実施例１と同様にしてＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を得た（５８％）。以下、参考例１で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ２００００という。
【００５４】
（比較例１）
ＬＦＬＸ（塩野義製薬社製）を、ＰＥＧ化しないで、そのまま用いた。
【００５５】
上記実施例等において、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＦＴ ＮＭＲシステム（ＥＸ−２７０）を用いて、重クロロホルムを溶媒として測定したものである。化学シフトの内部基準物質としては、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。
ＩＲスペクトルは、ＦＴ−ＩＲ４１０分光光度計を用いて測定した。
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールの各分子量は、ＰＥＧを基準物質としたＨＰＬＣにより求めた。
【００５６】
＜評価方法＞
上記実施例１、２および参考例１で合成したＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体および比較例１のＬＦＬＸを、音響感受性物質として、腫瘍細胞に対する音響化学効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。
腫瘍細胞としては、マウス肉腫細胞のＳａｒｃｏｍａ１８０（東北大学加齢医学研究所医用細胞センターより提供）を用いた。この細胞を、マウスの腹腔内に投与して１週間ほどかけて増殖させた。その後、腹水を採取し、ＰＢＳで希釈し、腫瘍細胞液（１．０×１０６／ｍＬ）を調製した。この腫瘍細胞液をそれぞれ０．７ｍＬずつビーカーに取り分けた。実施例１のＬＰ２０００を三種類の濃度（２０μＭ、２００μＭ、４００μＭ）のＰＢＳ溶液として調整し、それぞれ０．７ｍＬを先の腫瘍細胞液が入ったビーカーに加え、腫瘍細胞−薬物混合溶液を得た。得られた混合溶液の最終的な薬物濃度は、それぞれ、１０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなっている。
【００５７】
また、比較対照（コントロール）として、腫瘍細胞液が０．７ｍＬ入ったビーカーに、ＰＢＳを０．７ｍＬ入れたものを用意した。同様の手順で、実施例２および参考例１のＬＰ５０００およびＬＰ２００００について、比較例１のＬＰＬＸについても、それぞれ三種類の濃度の腫瘍細胞−薬物混合溶液（１０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）を調整した。実験手順を図２に示す。
【００５８】
上記で調整した溶液を用いて、超音波照射装置（信号発生器（ＦＧ−３５０、岩通計測社製）、増幅用アンプ（ＰＡ４０−２８０１、サムウェイ社製）、出力計（ＳＸ−２００、第一電波工業社製））を用いて、音響化学的効果を評価した。使用した超音波装置の概要を図３に示す。上記で調製した溶液をガラスセルの中に入れ、超音波伝達ゲルを用いて、ガラスセルをヒートシンク上に固定し、セルの下から超音波を照射した。照射により発熱し溶液の温度が上昇するため、流水してクーリングした。
【００５９】
腫瘍細胞の生死の判定方法として、トリパンブルー色素排除法を用いた。音響化学的効果の判定方法は、下記の生存率を用いて行った。
生存率＝超音波照射後の腫瘍細胞の生存数／超音波照射前の腫瘍細胞の生存数×１００（％）
【００６０】
（混合溶液（２００μＭ）における細胞生存率の比較）
照射強度２Ｗ、照射時間３０秒で、各溶液（２００μＭ）に超音波を照射し、細胞生存率の比較を行った。結果を図４に示す。各測定は、サンプル数１０の平均値として求めた（以下の生存率の測定において同様。）。縦軸が腫瘍細胞の生存率を示す。アスタリスクは、コントロール群と比較して有意差があることを示している。ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）では、コントロール群に比較して有意な生存率の低下が認められた。これに対し、ＬＰ２００００（参考例１）は、まったく生存率の低下を示さず、コントロールと比較しても生存率が高いことから、超音波単独での抗腫瘍効果を打ち消す結果となった。
【００６１】
シャープは、ＬＦＬＸ（比較例１）と比較して有意差があることを示す。ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）では、ＬＦＬＸ（比較例１）と比較して有意な生存率の低下が認められた。これより、ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体の音響化学的効果は、ＰＥＧの分子量に依存することが示された。
【００６２】
（細胞生存率の薬物濃度依存性）
次に、効果の認められたＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）に対して、照射強度２Ｗ、照射時間３０秒で、超音波を照射し、音響化学効果の薬物濃度依存性を評価した。結果を図５に示す。ＬＰ２０００（実施例１）、ＬＰ５０００（実施例２）ともに、１００μＭおよび１０μＭにおいても、コントロールと比較して有意な生存率の低下が認められた。この結果から、ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）は、低濃度においても十分な音響化学的効果を有することが示された。
【００６３】
（電子顕微鏡による腫瘍細胞の観察）
走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−５２０、日本電子社製）を用いた腫瘍細胞の観察を行った。図６（Ａ）は、コントロールにおける超音波照射前の腫瘍細胞の写真である。細胞の大きさはほぼ一定で丸く、表面には微絨毛が見られた。図６（Ｃ）は、コントロールに対して２．０Ｗで３０秒間超音波を照射した後の写真である。形がやや不規則で、微絨毛が消失した細胞が見られた。図６（Ｂ）は、ＬＰ２０００（実施例１）の混合溶液中の超音波照射前の細胞の写真である。コントロールとほぼ同様の形状が観察され、ＬＰ２０００を混合したのみでは、腫瘍細胞に影響を与えないことが分かった。
【００６４】
図６（Ｄ）は、ＬＰ２０００（実施例１）の存在下で、同様の条件にて超音波を照射した後の写真である。ほとんどの細胞は形が不規則で、微絨毛は消失し、縮小して固まっていた。この結果より、超音波のみを照射した場合（コントロール）に比べて、音響感受性物質（ＬＰ２０００）存在下で、超音波を照射した場合は、音響化学的効果により、腫瘍細胞に大きなダメージを与えることができることが示された。
【００６５】
以上、現時点において、もっとも、実践的であり、かつ、好ましいと思われる実施形態に関連して本発明を説明したが、本発明は、本願明細書中に開示された実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲および明細書全体から読み取れる発明の要旨或いは思想に反しない範囲で適宜変更可能であり、そのような変更を伴うニューキノロン剤誘導体もまた本発明の技術的範囲に包含されるものとして理解されなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なニューキノロン剤誘導体に関する。詳細には、音響癌化学療法において使用する音響感受性物質として作用する、新規な構造のニューキノロン剤誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波を使用した癌の治療方法としては、超音波の生体組織に対する加熱作用と非加熱作用の二種類を利用するものに大別される。加熱作用を利用するものとしては、理学療法、温熱療法、加熱凝固療法がある。理学療法は、強度０．１〜３Ｗ／ｃｍ３の超音波を用いて、疼痛を緩和させる治療法である。温熱療法は、腫瘍を局所的に加温して悪性腫瘍を治療する方法である。また、加熱凝固療法は、患部に大きな超音波エネルギーを集束させ、蛋白質凝固点以上に加熱して、凝固壊死させる治療法である。
【０００３】
超音波の非加熱作用としては、機械的作用と化学作用がある。機械的作用は、超音波振動によるもので、この作用を主として用いた治療法に、対外衝撃波砕石術、超音波振動メス、歯石除去術などがある。化学作用とは、微小気泡が超音波の照射を受けて急速に圧壊するときに、物質が化学的に活性化されることにより生じる作用をいう。この超音波の化学作用を利用した癌の治療法として、音響癌化学療法（超音波力学的療法、ソノダイナミックセラピー（ＳＤＴ））がある。音響癌化学療法とは、悪性腫瘍に対して、音響感受性物質の存在下で、微弱な超音波を照射し、超音波と薬物の相乗効果により治療する方法である。音響癌化学療法における超音波の強度は、超音波診断装置における強度（０．０５〜０．３Ｗ／ｃｍ２）と同程度である。本発明のニューキロン剤誘導体は、該音響感受性物質として作用するものである。以下、音響癌化学療法について説明する。
【０００４】
音響癌化学療法の推定メカニズムを図１に示す。体外より超音波を照射すると、腫瘍組織の液体中に微小気泡が生成する。該微小気泡は、断熱膨張・圧縮を繰り返し、やがて圧壊する。この時、数千度・数百気圧の高温・高圧が生じ、ここで生じたエネルギーによって腫瘍組織に取り込まれた音響感受性物質が基底状態から励起状態に活性化される。該音響感受性物質が、励起状態から基底状態に戻るときに溶存酸素から活性酸素を発生させる。生じた活性酸素が腫瘍細胞に障害を与え、腫瘍組織の壊死を引き起こすと考えられている。
【０００５】
音響癌化学療法の利点としては、（１）超音波を用いることから低侵襲性であること、（２）超音波を局所的に照射することが可能で、さらに腫瘍集積性の高い音響感受性物質を用いることで、腫瘍選択的に治療できること、（３）超音波や音響感受性物質による副作用が少ないこと、（４）超音波の透過性が高いことから体深部の腫瘍に効果が期待できること、が挙げられる。
【０００６】
音響癌化学療法を実現するには、最適な音響感受性物質を開発することが重要である。臨床応用の可能性が高い理想的な音響感受性物質の特性としては、（１）低濃度で高い音響化学効果を示すこと、（２）人体に投与可能であること、（３）腫瘍集積性（腫瘍選択性）が高いこと、が挙げられる。音響感受性物質についてのこれまでの研究としては、梅村らにより、ヘマトポリフィリンが音響感受性物質として用いることができることが報告されている（非特許文献１）。ヘマトポリフィリンは、強い音響化学効果を示し、腫瘍集積性が高い化合物であるが、光毒性という重篤な副作用がある。
【０００７】
また、本発明者らは、抗炎症剤として既に臨床使用されているピロキシカムが音響化学的効果を示すことを報告している（非特許文献２）。しかしながら、ピロキシカムは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、通常量の４倍以上が局所で必要となる欠点があった。
【０００８】
また、本発明者らは、広く臨床に使用されている抗生物質であり、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤に着目した。そのうち、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）の４種類を用いて検討を行い、ＬＦＬＸ、ＧＦＬＸ、ＳＰＦＸの３種類のニューキノロン剤がｉｎ ｖｉｖｏにおいて、音響化学的効果を示すことを明らかにした（非特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yumita N, Nishigaki R, Umemura K and Umemura S: Hematoporphyrin as a sensitizer of cell-damaging effect of ultrasound. Jpn J Cancer Res, 80, 219-222,1989.
【００１０】
【非特許文献２】Sakusabe N, Okada K, Sato K, Kamada S, Yoshida Y and Suzuki T: Enhanced sonodynamic antitumor effect of ultrasound in the presence of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Jpn J Cancer Res, 90, 1146-1151, 1999.
【００１１】
【非特許文献３】Huang D, Okada K, Komori C, Itoi E and Suzuki T: Enhanced antitumor activity of ultrasonic irradiation in the presence of new quinolone antibiotics in vivo. Cancer Sci, 95, 845-849, 2004.
【００１２】
【非特許文献４】Huang D, Okada K, Komori C, Itoi E, Kawamura K and Suzuki T: Ultrastructure of sarcoma 180 cells after ultrasound irradiation in the presence of sparfloxacin. Anticancer Res, 24, 1553-1559, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記のニューキノロン剤は腫瘍集積性が乏しいという欠点があった。
そこで、本発明は、腫瘍集積性を高めたニューキノロン剤誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ニューキノロン剤の腫瘍集積性を高めることを検討した。腫瘍組織の特徴として、毛細血管透過性が亢進していること、リンパ管からの排出が不十分であることが挙げられる。したがって、血中半減期の長い化合物は、正常組織と腫瘍組織に取り込まれた後に、リンパ管からの排泄が不十分な腫瘍組織に次第に集積していくことが予想される。血中半減期を長くする手段の一つとして、化合物の分子量を大きくすることが挙げられる。この目的で汎用される高分子化合物の一つとして、ポリエチレングリコールがある。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、無毒性で、非免疫原性で、生物分解性の水溶性ポリマーである。該ＰＥＧの医薬品への応用例としては、ペグイントロンがある。この薬剤は、ＩＦＮα−２ｂを分子量１２０００のＰＥＧと共有結合したＣ型慢性肝炎治療薬である。ＰＥＧ化することで、生体内での滞留時間が延長し、週３回投与を週１回投与とすることが可能となった。
【００１５】
本発明者らは、以上の知見を基に、ニューキロン剤をＰＥＧ化することにより、その分子量を増大させ、得られるＬＦＬＸ誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高めることについて鋭意研究し、以下の発明を完成させた。
【００１６】
第１の本発明は、ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体である。
【００１７】
第１の本発明において、高分子化合物の分子量は、１０００以上１５０００以下であることが好ましい。
【００１８】
第１の本発明において、高分子化合物は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。また、ポリエチレングリコールは、末端にアミノ基を有するメトキシポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００１９】
第１の本発明において、ニューキノロン剤のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。
【００２０】
第１の本発明において、ニューキノロン剤は、ロメフロキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンからなる群から選ばれる一種であることが好ましい。
【００２１】
第１の本発明において、ニューキノロン剤は、ロメフロキサシンであることが好ましい。
【００２２】
第２の本発明は、下記式（１）の構造を備えてなる、ニューキノロン剤誘導体である。
【００２３】
【化１】
（式（１）中、Ｒは、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基から選ばれる保護基である。ｎは、２０〜３４０の整数である。）
【００２４】
第２の本発明において、保護基はアセチル基であることが好ましい。
【００２５】
第３の本発明は、第１および第２の本発明のニューキノロン剤誘導体を含有してなる、超音波治療用薬剤である。
【００２６】
第４の本発明は、第３の本発明の超音波治療用薬剤を患者に投与する工程、腫瘍部に超音波を照射する工程を備えてなる、腫瘍の治療方法である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のニューキノロン剤誘導体は、低濃度で高い音響化学効果を示すものであり、また、臨床に広く使用され、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤をベースとしているため、同様に人体への副作用が少ないことが予想され、さらに、Ｃ型肝炎治療薬を高分子化して血中半減期を延長したという実績のあるポリエチレングリコールを用いて高分子化していることから、同様に血中半減期を延長することができ、腫瘍選択性が高いことが予想される。これより、本発明のニューキノロン剤誘導体は、音響癌化学療法において用いる音響感受性物質として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】音響癌化学療法の推定メカニズムを示す概念図である。
【図２】実施例における腫瘍細胞−薬物混合溶液の調整方法を示す概念図である。
【図３】実施例で使用した超音波装置の概要を示す概念図である。
【図４】混合溶液（２００μＭ）における細胞生存率を比較したグラフである。
【図５】細胞生存率の薬物濃度依存性を示したグラフである。
【図６】（Ａ）はコントロールにおける超音波照射前の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｂ）はＬＰ２０００（実施例１）における超音波照射前の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｃ）はコントロールにおける超音波照射後の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真であり、（Ｄ）はＬＰ２０００（実施例１）における超音波照射後の腫瘍細胞の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
＜ニューキノロン剤誘導体＞
本発明の新規な構造のニューキノロン剤誘導体は、ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合した構造を有している。本発明のニューキノロン剤誘導体は、高分子化されることにより、血中半減期が長くなり、これにより、腫瘍集積性が高められている。
【００３０】
（ニューキノロン剤）
ニューキノロン剤は、重篤な副作用が少ない抗生物質として、広く臨床に使用されている化合物である。該ニューキノロン剤のうち、音響化学的効果を示すものであれば、特に限定なく、本発明のニューキノロン剤誘導体の前駆体として用いることができる。ニューキロン剤としては、例えば、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、シプロフロキサシン（ＣＰＬＸ）が挙げられる。中でも、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）は、本発明者らによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて音響化学的効果を示すことが確かめられているので、これらの化合物から選ばれるものを本願発明のニューキノロン剤誘導体の前駆体として用いることが好ましい。また、ニューキノロン剤のカルボキシル基を高分子化する際の合成の容易さの点から、中でも、ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）を前駆体とすることが、特に好ましい。
【００３１】
（高分子化合物）
上記したニューキノロン剤のカルボキシル基と結合して、高分子化させる高分子化合物としては、無毒性、非免疫原性、生分解性、水溶性等の性質を備えた高分子化合物であれば、特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸が挙げられる。中でも、ＩＦＮα−２ｂを高分子化してペグイントロンとして、生体内での滞留時間を延長させた実績のある、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
【００３２】
ポリエチレングリコールとしては、所定の分子量を有し、ニューキノロン剤のカルボキシル基と結合して高分子化させることができるものであれば、特に限定されない。ポリエチレングリコールにおける、カルボキシル基と結合する側の末端としては、例えば、水酸基、アミノ基を挙げることができる。水酸基の場合は、エステル結合によりニューキノロン剤と結合し、また、アミノ基の場合は、アミド結合によりニューキノロン剤と結合する。該末端の種類は、ニューキノロン剤の種類により、結合をさせやすいものを選択すればよい。例えば、ニューキノロン剤としてＬＦＬＸを用いた場合は、合成上の点から、アミノ基を末端に有する高分子化合物を用いた方が好ましい。
【００３３】
また、ポリエチレングリコールにおける、カルボキシル基と結合する側の末端と反対の末端は、ニューキノロン剤との反応において副反応を防ぐ観点から、および、目的物の精製を容易にする観点から、アルコキシ化されていることが好ましい。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基が挙げられる。
【００３４】
高分子化合物の分子量は、１０００以上１５０００以下であることが好ましく、１３００以上１００００以下であることがより好ましく、１５００以上８０００以下であることがさらに好ましく、１８００以上７０００以下であることが特に好ましく、１９００以上６０００以下であることが最も好ましい。高分子化合物の分子量が小さすぎると、ニューキノロン剤誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高める効果が劣る虞があり、逆に、高分子化合物の分子量が大きすぎると、ニューキノロン剤誘導体の音響化学効果が劣る虞がある。
【００３５】
本発明における、高分子化合物の好ましい形態の一つとして、以下の式（２）で示される末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００３６】
【化２】
【００３７】
式（２）中、ｎは、２０〜３４０の整数であり、ｎは好ましくは２８〜２２５の整数であり、より好ましくは３２〜１８０の整数であり、さらに好ましくは３９〜１５７の整数であり、特に好ましくは４１〜１３５の整数である。ｎが小さすぎると、ニューキノロン剤誘導体の血中半減期を延長させ、腫瘍集積性を高める効果が劣る虞があり、逆に、ｎが大きすぎると、ニューキノロン剤誘導体の音響化学効果が劣る虞がある。
【００３８】
（アミノ基の保護）
ニューキノロン剤のカルボキシル基を高分子化化合物と結合させるに際して、ニューキノロン剤中のアミノ基は、保護しておくことが好ましい。ニューキノロン剤中のアミノ基を保護しておくことによって、有機溶媒への可溶性を増すことができ、副反応を抑えることができる。このような目的を達成できるのであれば、保護基は特に限定されないが、例えば、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を挙げることができる。中でも、保護基としては、合成の容易さ、および、生体適合性の点から、アセチル基を用いることが好ましい。
【００３９】
＜ニューキノロン剤誘導体の製造方法＞
本発明のニューキノロン剤誘導体は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と、高分子化合物とを結合させて、高分子化することにより製造することができる。例えば、高分子化合物がアミノ基を有している場合は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と反応させアミド結合を形成することにより高分子化することができ、また、高分子化合物が水酸基を有している場合は、ニューキノロン剤中のカルボキシル基と反応させエステル結合を形成することにより高分子化することができる。なお、高分子化に先立って、ニューキノロン剤中のアミド基は、保護基により保護しておくことが好ましい。
【００４０】
高分子化合物の好ましい形態の一つとして、上記の式（２）で示される末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを用い、ニューキノロン剤としてＬＦＬＸを用いた場合における、両者の結合反応について、以下、詳細に説明する。ポリエチレングリコール化ＬＦＬＸ誘導体の製造方法の概要を式（３）に示す。
【００４１】
【化３】
【００４２】
まず、ＬＦＬＸ塩酸塩のアミノ基を、アセチルクロライドによりアセチル化して保護する。得られた化合物にクロロギ酸メチルを反応させて、その後、末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールを反応させて、ポリエチレングリコール化ＬＦＬＸ誘導体が得られる。
【００４３】
＜音響感受性物質としての用途＞
本発明のニューキノロン剤誘導体は、低濃度で高い音響化学効果を示すものであり、また、臨床に広く使用され、重篤な副作用が少ないニューキノロン剤をベースとしているため、同様に人体への副作用が少ないことが予想され、さらに、Ｃ型肝炎治療薬を高分子化して血中半減期を延長したという実績のあるポリエチレングリコールを用いて高分子化していることから、同様に血中半減期を延長することができ、腫瘍選択性が高いことが予想できる。これより、本発明のニューキノロン剤誘導体は、音響癌化学療法において用いる音響感受性物質として使用することができる。
【実施例】
【００４４】
＜ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体の合成＞
（実施例１）
撹拌したロメフロキサシン塩酸塩（塩野義製薬社製）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に、トリエチルアミン（和光純薬社製）０．５９ｍＬ（４．１２ｍｍｏｌ）、および、アセチルクロライド（和光純薬社製）０．１５ｍＬ（２．０６ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、室温にて４時間撹拌した。
得られた溶液から、減圧化にて溶媒を除去し、残渣をクロロホルムに溶解させた。このクロロホルム容器を水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去して粗生成物を得た。該粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９７：３）により精製した（粗生成物：５２５ｍｇ）。これを、クロロホルム−メタノール混合溶媒から再結晶させ、目的物であるアセチル化ＬＦＬＸを黄色粉末（２５６ｍｇ、６３％）として得た。
【００４５】
【化４】
【００４６】
アセチル化ＬＦＬＸ：
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３０５２，１７１９，１６２５．
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１４．５８（１Ｈ，ｓ），８．６０（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．０Ｈｚ），４．４８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，３．０Ｈｚ），３．６２−３．７０（１Ｈ，ｍ），３．３８−３．４４（２Ｈ，ｍ），３．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．６４（３Ｈ，ｓ），１．５８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．４１（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７６．５，１６９．６，１６６．８，１５３．９，１５７．５，１５０．５，１３４．７，１２７．５，１２２．５，１０９．０，１０８．６，５５．９，５４．９，５１．４，４５．１，４２．４，２２．２，１６．７，１５．５．
【００４７】
得られたアセチル化ＬＦＬＸ（１００ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（５．０ｍＬ）を撹拌し、これにトリエチルアミン（和光純薬社製）１４０μＬ（１．０ｍｍｏｌ）、および、クロロギ酸メチル（和光純薬社製）３９μＬ（０．５ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、室温にて３時間撹拌した。
【００４８】
【化５】
【００４９】
上記で得られた反応溶液に、末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコール（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−２０Ｈ）、分子量２０００）５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）を加え、混合溶液を室温にて２．５時間撹拌した。得られた混合溶液を水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去して粗生成物を得た。この粗生成物を、クロロホルム−メタノール混合溶媒から再結晶させ、目的物であるＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を白色固体（４５１ｍｇ、７６％）として得た。以下、実施例１で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ２０００という。
【００５０】
【化６】
【００５１】
ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体（ＬＰ２０００）：
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１６６０，１５４２，１１１３．
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６４（１Ｈ，ｓ），７．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．０Ｈｚ），４．４２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．０，３．０Ｈｚ），３．８８−３．９２（１Ｈ，ｍ），３．６０−３．７０（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−，ｍ），３．６５（３Ｈ，ｓ），３．３８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．２０−３．２２（２Ｈ，ｍ），２．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．７４（３Ｈ，ｓ），１．７２−１．７５，（２Ｈ，ｍ），１．５２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．３７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７４．２，１７１．９，１６４．５，１５６．９，１４９．５，１４８．６，１３０．７，１２４．４，１２２．８，１１１．４，１０８．６，７１．０−６９．１（ＰＥＧ），５９．１，５５．６，５３．７，５１．１，５０．２，４４．７，４２．２，２９．７，２５．４，２１．８，１６．４，１６．２．
【００５２】
（実施例２）
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールとして、分子量５０００（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−５０Ｈ））のものを用いた以外は、実施例１と同様にしてＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を得た（９２％）。以下、実施例２で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ５０００という。
【００５３】
（参考例１）
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールとして、分子量２００００（日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（ＭＥＰＡ−２０Ｔ））のものを用いた以外は、実施例１と同様にしてＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体を得た（５８％）。以下、参考例１で得られたＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体をＬＰ２００００という。
【００５４】
（比較例１）
ＬＦＬＸ（塩野義製薬社製）を、ＰＥＧ化しないで、そのまま用いた。
【００５５】
上記実施例等において、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＦＴ ＮＭＲシステム（ＥＸ−２７０）を用いて、重クロロホルムを溶媒として測定したものである。化学シフトの内部基準物質としては、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いた。
ＩＲスペクトルは、ＦＴ−ＩＲ４１０分光光度計を用いて測定した。
末端にアミノ基を持つメトキシポリエチレングリコールの各分子量は、ＰＥＧを基準物質としたＨＰＬＣにより求めた。
【００５６】
＜評価方法＞
上記実施例１、２および参考例１で合成したＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体および比較例１のＬＦＬＸを、音響感受性物質として、腫瘍細胞に対する音響化学効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。
腫瘍細胞としては、マウス肉腫細胞のＳａｒｃｏｍａ１８０（東北大学加齢医学研究所医用細胞センターより提供）を用いた。この細胞を、マウスの腹腔内に投与して１週間ほどかけて増殖させた。その後、腹水を採取し、ＰＢＳで希釈し、腫瘍細胞液（１．０×１０６／ｍＬ）を調製した。この腫瘍細胞液をそれぞれ０．７ｍＬずつビーカーに取り分けた。実施例１のＬＰ２０００を三種類の濃度（２０μＭ、２００μＭ、４００μＭ）のＰＢＳ溶液として調整し、それぞれ０．７ｍＬを先の腫瘍細胞液が入ったビーカーに加え、腫瘍細胞−薬物混合溶液を得た。得られた混合溶液の最終的な薬物濃度は、それぞれ、１０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなっている。
【００５７】
また、比較対照（コントロール）として、腫瘍細胞液が０．７ｍＬ入ったビーカーに、ＰＢＳを０．７ｍＬ入れたものを用意した。同様の手順で、実施例２および参考例１のＬＰ５０００およびＬＰ２００００について、比較例１のＬＰＬＸについても、それぞれ三種類の濃度の腫瘍細胞−薬物混合溶液（１０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）を調整した。実験手順を図２に示す。
【００５８】
上記で調整した溶液を用いて、超音波照射装置（信号発生器（ＦＧ−３５０、岩通計測社製）、増幅用アンプ（ＰＡ４０−２８０１、サムウェイ社製）、出力計（ＳＸ−２００、第一電波工業社製））を用いて、音響化学的効果を評価した。使用した超音波装置の概要を図３に示す。上記で調製した溶液をガラスセルの中に入れ、超音波伝達ゲルを用いて、ガラスセルをヒートシンク上に固定し、セルの下から超音波を照射した。照射により発熱し溶液の温度が上昇するため、流水してクーリングした。
【００５９】
腫瘍細胞の生死の判定方法として、トリパンブルー色素排除法を用いた。音響化学的効果の判定方法は、下記の生存率を用いて行った。
生存率＝超音波照射後の腫瘍細胞の生存数／超音波照射前の腫瘍細胞の生存数×１００（％）
【００６０】
（混合溶液（２００μＭ）における細胞生存率の比較）
照射強度２Ｗ、照射時間３０秒で、各溶液（２００μＭ）に超音波を照射し、細胞生存率の比較を行った。結果を図４に示す。各測定は、サンプル数１０の平均値として求めた（以下の生存率の測定において同様。）。縦軸が腫瘍細胞の生存率を示す。アスタリスクは、コントロール群と比較して有意差があることを示している。ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）では、コントロール群に比較して有意な生存率の低下が認められた。これに対し、ＬＰ２００００（参考例１）は、まったく生存率の低下を示さず、コントロールと比較しても生存率が高いことから、超音波単独での抗腫瘍効果を打ち消す結果となった。
【００６１】
シャープは、ＬＦＬＸ（比較例１）と比較して有意差があることを示す。ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）では、ＬＦＬＸ（比較例１）と比較して有意な生存率の低下が認められた。これより、ＰＥＧ化ＬＦＬＸ誘導体の音響化学的効果は、ＰＥＧの分子量に依存することが示された。
【００６２】
（細胞生存率の薬物濃度依存性）
次に、効果の認められたＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）に対して、照射強度２Ｗ、照射時間３０秒で、超音波を照射し、音響化学効果の薬物濃度依存性を評価した。結果を図５に示す。ＬＰ２０００（実施例１）、ＬＰ５０００（実施例２）ともに、１００μＭおよび１０μＭにおいても、コントロールと比較して有意な生存率の低下が認められた。この結果から、ＬＰ２０００（実施例１）とＬＰ５０００（実施例２）は、低濃度においても十分な音響化学的効果を有することが示された。
【００６３】
（電子顕微鏡による腫瘍細胞の観察）
走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−５２０、日本電子社製）を用いた腫瘍細胞の観察を行った。図６（Ａ）は、コントロールにおける超音波照射前の腫瘍細胞の写真である。細胞の大きさはほぼ一定で丸く、表面には微絨毛が見られた。図６（Ｃ）は、コントロールに対して２．０Ｗで３０秒間超音波を照射した後の写真である。形がやや不規則で、微絨毛が消失した細胞が見られた。図６（Ｂ）は、ＬＰ２０００（実施例１）の混合溶液中の超音波照射前の細胞の写真である。コントロールとほぼ同様の形状が観察され、ＬＰ２０００を混合したのみでは、腫瘍細胞に影響を与えないことが分かった。
【００６４】
図６（Ｄ）は、ＬＰ２０００（実施例１）の存在下で、同様の条件にて超音波を照射した後の写真である。ほとんどの細胞は形が不規則で、微絨毛は消失し、縮小して固まっていた。この結果より、超音波のみを照射した場合（コントロール）に比べて、音響感受性物質（ＬＰ２０００）存在下で、超音波を照射した場合は、音響化学的効果により、腫瘍細胞に大きなダメージを与えることができることが示された。
【００６５】
以上、現時点において、もっとも、実践的であり、かつ、好ましいと思われる実施形態に関連して本発明を説明したが、本発明は、本願明細書中に開示された実施形態に限定されるものではなく、請求の範囲および明細書全体から読み取れる発明の要旨或いは思想に反しない範囲で適宜変更可能であり、そのような変更を伴うニューキノロン剤誘導体もまた本発明の技術的範囲に包含されるものとして理解されなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体。
【請求項２】
高分子化合物の分子量が、１０００以上１５０００以下である、請求項１に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項３】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールである、請求項１または２に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールが、末端にアミノ基を有するメトキシポリエチレングリコールである、請求項３に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項５】
ニューキノロン剤のアミノ基が、保護基で保護されている、請求項１〜４のいずれかに記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項６】
前記ニューキノロン剤が、ロメフロキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンからなる群から選ばれる一種である、請求項１〜５のいずれかの記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項７】
前記ニューキノロン剤が、ロメフロキサシンである、請求項１〜５のいずれかの記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項８】
下記式（１）の構造を備えてなる、ニューキノロン剤誘導体。
【化１】
（式（１）中、Ｒは、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基から選ばれる保護基である。ｎは、２０〜３４０の整数である。）
【請求項９】
前記保護基がアセチル基である、請求項８に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のニューキノロン剤誘導体を含有してなる、超音波治療用薬剤。
【請求項１１】
請求項１０の超音波治療用薬剤を患者に投与する工程、腫瘍部に超音波を照射する工程を備えてなる、腫瘍の治療方法。
【請求項１】
ニューキノロン剤のカルボキシル基が、高分子化合物と結合してなる、ニューキノロン剤誘導体。
【請求項２】
高分子化合物の分子量が、１０００以上１５０００以下である、請求項１に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項３】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールである、請求項１または２に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールが、末端にアミノ基を有するメトキシポリエチレングリコールである、請求項３に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項５】
ニューキノロン剤のアミノ基が、保護基で保護されている、請求項１〜４のいずれかに記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項６】
前記ニューキノロン剤が、ロメフロキサシン、ガチフロキサシン、スパルフロキサシンからなる群から選ばれる一種である、請求項１〜５のいずれかの記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項７】
前記ニューキノロン剤が、ロメフロキサシンである、請求項１〜５のいずれかの記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項８】
下記式（１）の構造を備えてなる、ニューキノロン剤誘導体。
【化１】
（式（１）中、Ｒは、アセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基から選ばれる保護基である。ｎは、２０〜３４０の整数である。）
【請求項９】
前記保護基がアセチル基である、請求項８に記載のニューキノロン剤誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のニューキノロン剤誘導体を含有してなる、超音波治療用薬剤。
【請求項１１】
請求項１０の超音波治療用薬剤を患者に投与する工程、腫瘍部に超音波を照射する工程を備えてなる、腫瘍の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−６３４４（Ｐ２０１１−６３４４Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５０３０３（Ｐ２００９−１５０３０３）
【出願日】平成２１年６月２４日（２００９．６．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年１月 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ発行の「ＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｖｏｌｕｍｅ ２９，Ｎｕｍｂｅｒ １）」に発表
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２４日（２００９．６．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年１月 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ発行の「ＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｖｏｌｕｍｅ ２９，Ｎｕｍｂｅｒ １）」に発表
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]