【課題】病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供すること。
【解決手段】以下の配列に少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子が提供される：（ａ）図１における完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードする配列；（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαをコードする配列；（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインをコードする配列；（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインをコードする配列；（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインをコードする配列；（ｆ）膜貫通ドメインを欠除する溶解性ニュートロカインαポリペプチドをコードする配列；（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）の任意の配列に相補的な配列。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球により発現される新規のサイトカイン（これは、それゆえニュートロカインαタンパク質（「ニュートロカインα」）と称されている）に関する。詳細には、ニュートロカインαタンパク質をコードした、単離された核酸分子が提供される。ニュートロカインαポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびこれを産生する組換え方法として提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）および（ＴＮＦ−β、またはリンホトキシン）は、ポリペプチドメディエーターの幅広いクラスの関連メンバーであり、このクラスはインターフェロン、インターロイキン、および増殖因子を含み、総称してサイトカインと呼ばれる（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ， Ａ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｔ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６２５−６５５（１９８９））。サイトカインレセプターの配列分析は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブファミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーファミリー、（２）ヘマトポエチン（サイトカインレセプタースーパーファミリー）、および（３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦスーパーファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ， Ｂｌｏｏｄ ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ， Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．， ７（２）：９３−１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーは、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。これらのレセプターのリガンドは同定され、そして少なくとも２つのサイトカインスーパーファミリーに属する。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの混合物）は、もともとその抗腫瘍活性の結果として発見されたが、現在は、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞の活性化および細胞増殖の媒介を含む、ならびにまた免疫調節および炎症における重要な役割を果たすような、多数の生物学的活性が可能な多面的なサイトカインとして認識されている。
【０００４】
今日まで、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの既知のメンバーには、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、および４−ＩＢＢＬが含まれる。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのリガンドは、酸性、細胞外ドメインにおいて約２０％の配列相同性（１２％〜３６％の範囲）を有するＴＮＦ様分子であり、そして三量体／多量体複合体である生物学的活性形態を有する膜結合形態として主に存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの溶解性形態は、これまでＴＮＦ、ＬＴ、β、およびＦａｓリガンドについて同定されているのみであり（一般的な概説として、Ｇｒｕｓｓ， Ｈ．およびＤｏｗｅｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｂｌｏｏｄ， ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。これらのタンパク質は、細胞増殖、活性化および分化の調節（細胞生存またはアポトーシスもしくは細胞傷害性による細胞死の制御を含む）に関与関する（Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｒ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：４０７（１９９４）、およびＳｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ．， Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９４））。
【０００５】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される；本明細書中以下「ＴＮＦ」）は、エンドトキシン、または１７ｋＤタンパク質サブユニットの溶解性ホモ三量体のような他の刺激の応答において単球およびマクロファージによって主に分泌される（Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：６９５１−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８））。
【０００６】
蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカインであることを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ合成（「カケクチン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．らＮａｔｕｒｅ ３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ， Ｂら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：７６５（１９８７））、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ， Ｂ． Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：２９１３（１９８７））、特定の形質転換細胞タイプにおける細胞傷害性活性（Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．Ｂ．ら、前出；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｚ．ら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４４：８３（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４５：６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ， Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８１９（１９８６））、骨再吸収刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６））、コラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ， Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（Ｔ細胞（Ｙｏｋｏｔａ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５３１（１９８８））、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ， Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：７８６（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ， Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１４７２（１９８８））の活性化、ならびに腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３０４（１９８７））を含む）。
【０００７】
ＴＮＦは、以下のような組織創傷を生じるそのプロ炎症性作用について示されている：血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の増強した接着（Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ， Ｇ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３９０（１９８７））。
【０００８】
最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば、いくつかの悪性を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ． Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５（１９８７））の病原体、ならびに自己免疫症状および移植片対宿主症状（Ｐｉｇｕｅｔ， Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ． Ｅｃｐ． Ｍｅｄ． １６６：１２８０（１９８７））に関連づける。ガンおよび感染症状とのＴＮＦの関連は、しばしば宿主代謝状態に相関する。ガン患者の主な問題は体重の減少であり、通常摂食障害と関連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」として知られる（Ｋｅｒｎ， Ｋ．Ａ．ら、Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｅｎｔｅｒ． Ｎｕｔｒ． １２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重減少、摂食障害、および悪性増殖の応答における体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態は顕著な死亡率と関連し、そして多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が、ＴＮＦが、ガン、感染症状、および他の代謝性状態における悪液質の重要なメディエーターであることを示唆している。
【０００９】
ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症およびエンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． ７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｅｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ， Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ， ４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｓ． Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ． ５：２７−４７（１９８９））の病理生理学的結果における中心的役割を果たすと考えられている。エンドトキシンは、強力な単球／マクロファージアクチベーターであり、これは、ＴＮＦの産生および分泌（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ， Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：２５８５−２５９１（１９８６））、ならびに他のサイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エンドトキシンの多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床的徴候に応答可能な中心的メディエーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよび他の単球誘導性サイトカインは、エンドトキシンに対する代謝性応答および神経ホルモン性応答を媒介する（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８：１４８１−１４８６（１９８８））。ヒトボランティアへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻脈、代謝速度の上昇、およびストレスホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴う急病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ， Ａ．ら、Ａｒｃｈ． Ｓｕｒｇ． １２３：１６２−１７０（１９８８））。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性敗血症に罹患した患者において見い出されている（Ｗａａｇｅ， Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ １：３５５−３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ， Ａ． Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ
Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁、（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １６１：９８２−９８７（１９９０））。
【００１０】
ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態における増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性敗血症およびエンドトキシンにおける毒性効果を有し得る。カケクチン（後にＴＮＦと同一であることが見い出された）として特徴付けられた「モジュレーター」物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示された（欧州特許公開０，２１２，４８９、１９８７年３月４日）。このような抗体は、診断的免疫アッセイにおいて、および細菌性感染におけるショックの試料において有用であるといわれた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびにＴＮＦの免疫アッセイにおけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（欧州特許公開０，２８８，０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体（ ｍＡｂを含む）および症状の免疫アッセイ診断における（特に川崎病の症状および細菌感染）それらの有用性を開示した。川崎病の症状を有する患者の体液（小児急性熱病粘膜皮膚リンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．， Ａｌｌｅｒｇｙ １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．， Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９８５））は、症状の進行に関連して上昇したＴＮＦレベルを有するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。
【００１１】
他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを記載した（Ｌｉａｎｇ， Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ， Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ， Ｔ Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：４８９−５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９６：５７−６２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒ， Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
２：１６２−１６９（１９９０）））。これらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素免疫アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製において補助する（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの研究は、免疫原性、特異性の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、インビボ診断的使用またはヒトにおける治療的使用のために使用され得る抗体を中和するＴＮＦを産生するための基礎を提供しない。
【００１２】
中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的チャレンジ後の死から予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ歯類致死率アッセイにおいて、および霊長類病理学モデル系において実証されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ， Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ， Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ， Ａ． Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６２：４２１−４２７（１９９０）Ｏｐａｌ， Ｓ． Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ， Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．
Ｓｈｏｃｋ ６０：２７９−２９２（１９９０））。
【００１３】
今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ ｍＡｂ治療の経験は限られているが、有用な治療結果を示している（例えば、関節炎および敗血症）。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍら、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ， Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ ３：１−１２（１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ． Ｍｅｄ． ２１：Ｓ４３６−４０（１９９３）；Ｔｒａｃｅｙ Ｋ． Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２１ Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと。
【００１４】
哺乳動物の発生は、細胞の増殖および分化の両方ならびにアポトーシスの間におこるプログラムされた細胞死に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｃｈｉｅｖ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． １３：１８（１９８８））。アポトーシスは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊に重要な役割を担う。この正常な除去プロセルの欠失は、自己免疫疾患における役割を果たし得る（Ｇａｍｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：１９３（１９９１））。
【００１５】
Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））は、アポトーシスを媒介し、そしてＴ細胞のクローン性欠失に関与する、細胞表面抗原、Ｆａｓ／ＣＤ２３を記載する。Ｆａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球に加えて、成体マウスにおける活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球において、ならびに胸腺、肝臓、心臓、および肺ならびに卵巣において、発現される（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１２７４（１９９２））。モノクローナルＡｂがＦａｓに対して架橋する実験において、アポトーシスは誘導される（Ｙｏｎｅｈａｒａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１７４７（１９８９）；Ｔｒａｕｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１（１９８９））。さらに、ＦａｓへのモノクローナルＡｂの結合は特定の条件下でＴ細胞に対して刺激性である例がある（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：２２３１（１９９３））。
【００１６】
Ｆａｓ抗原は、４５Ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓのヒトおよびマウス両方の遺伝子は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａらによってクローン化されている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１２７４（１９９２）およびＩｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（２つのＴＮＦレセプター、低親和性神経成長因子レセプター、ならびにＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、およびＯＸ４０を含む）に構造的相同性を有する両方の膜貫通タンパク質である。
【００１７】
最近、Ｆａｓリガンドが記載されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１１６９（１９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示す。従って、Ｆａｓリガンドポリペプチドは、３つの主要ドメインを含む：疎水性膜貫通ドメインによって結合された、アミノ末端での短い細胞内ドメインおよびカルボキシ末端での長い細胞外ドメイン。Ｆａｓリガンドは脾臓細胞および胸腺細胞において発現され、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性と一致する。精製Ｆａｓリガンドは４０ｋＤの分子量を有する。
【００１８】
最近では、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化後のアポトーシスに必要とされることが示されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４（１９９５）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５））。Ｔ細胞の活性化は、細胞表面上の両タンパク質を誘導する。リガンドとレセプター間の続く相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは、正常な免疫応答の間の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用によって誘導されるアポトーシスへの可能な調節的役割を支持する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】欧州特許公開第０，２１２，４８９号
【特許文献２】欧州特許公開第０，２１８，８６８号
【特許文献３】欧州特許公開第０，２８８，０８８号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ， Ａ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｔ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６２５−６５５（１９８９）
【非特許文献２】ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ， Ｂｌｏｏｄ ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）
【非特許文献３】ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ， Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．， ７（２）：９３−１２４（１９９６）
【非特許文献４】Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｒ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：４０７（１９９４）
【非特許文献５】Ｓｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ．， Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９４）
【非特許文献６】Ｓｍｉｔｈ， Ｒ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：６９５１−６９５４（１９８７
【非特許文献７】Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８）
【非特許文献８】Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．らＮａｔｕｒｅ ３１６：５５２（１９８５）
【非特許文献９】Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：４２２０（１９８６）
【非特許文献１０】Ｐｅｒｕｓｓｉａ， Ｂら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：７６５（１９８７）
【非特許文献１１】Ｖｉｌｃｅｋ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６３：６３２（１９８６）
【非特許文献１２】Ｓｕｇａｒｍａｎ， Ｂ． Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９４３（１９８５）
【非特許文献１３】Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：２９１３（１９８７）
【非特許文献１４】Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｚ．ら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４４：８３（１９８４）
【非特許文献１５】Ｋｏｈａｓｅ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４５：６５９（１９８６）
【非特許文献１６】Ｗｏｎｇ， Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８１９（１９８６）
【非特許文献１７】Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）
【非特許文献１８】Ｓａｋｌａｔｖａｌａ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６）
【非特許文献１９】Ｄａｙｅｒ， Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６２：２１６３（１９８５）
【非特許文献２０】Ｙｏｋｏｔａ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５３１（１９８８）
【非特許文献２１】Ｋｅｈｒｌ， Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：７８６（１９８７）
【非特許文献２２】Ｐｈｉｌｉｐ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６（１９８６）
【非特許文献２３】Ｒａｎｇｅｓ， Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１４７２（１９８８）
【非特許文献２４】Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：４４６（１９８６）
【非特許文献２５】Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３０４（１９８７）
【非特許文献２６】Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：１６８０（１９８６）
【非特許文献２７】Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：３３１９（１９８７）
【非特許文献２８】Ｃａｍｕｓｓｉ， Ｇ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３９０（１９８７）
【非特許文献２９】Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８）
【非特許文献３０】Ｏｌｉｆｆ． Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５（１９８７）
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【非特許文献６６】Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１２７４（１９９２）
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【非特許文献６９】Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：２２３１（１９９３）
【非特許文献７０】Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１２７４（１９９２）
【非特許文献７１】Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１）
【非特許文献７２】Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１１６９（１９９３）
【非特許文献７３】Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４（１９９５）
【非特許文献７４】Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必要がある。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様サイトカインに関連した障害の治療へのこれらのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の抗体または他のアンタゴニストを作成するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＮＦおよび関連サイトカインに構造的に類似し、そして類似の生物学的効果および活性を有すると考えられるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。このサイトカインは、ニュートロカインαと命名され、そして本発明は、少なくとも図１におけるアミノ酸配列（配列番号２）または１９９６年１０月２２日にＡＴＣＣ寄託として細菌宿主において寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列の一部を有するニュートロカインαポリペプチドを含む。寄託されたニュートロカインαクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列（これは、図１（配列番号１）に示される）は、Ｎ末端メチオニン、約４６アミノ酸残基の推定細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン、約２１３アミノ酸の推定細胞外ドメイン、および約３１ｋＤａの完全タンパク質についての推定分子量を含む２８５アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ型膜貫通タンパク質について、ニュートロカインαの可溶性形態は、膜貫通ドメインから切断された細胞外ドメインのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュートロカインαポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した細胞外ドメイン）を含む。
【００２３】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有するニュートロカインα全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαの細胞内ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸残基約１位〜約４６位）；（ｄ）ニュートロカインαの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸残基約４７〜約７２）；（ｅ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも９０％同一の、およびより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製するための方法および組換え技術によりニュートロカインαポリペプチドまたはペプチドの産生のためにこれらを使用する方法に関する。
【００２６】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたニュートロカインαポリペプチドを提供する：（ａ）図１（配列番号２）に示されるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有するニュートロカインα全長ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｃ）ニュートロカインαの細胞内ドメインのアミノ酸配列（図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸残基約１位〜約４６位）；（ｄ）ニュートロカインαの推定膜貫通ドメインのアミノ酸配列（図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸残基約４７位〜約７２位）；および（ｅ）これらのドメインの各々が上記のように規定される、細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２７】
本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは、少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、およびなおより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００２８】
本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６もしくは７、好ましくは少なくとも９、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記に記載される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体までおよびそれを含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。別の実施態様において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、本明細書中に記載のとおりのアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離する方法を提供する。このような抗体は、以下に記載されるように診断的または治療的に有用である。
【００３０】
本発明はまた、可溶性ニュートロカインαポリペプチド、特にヒトニュートロカインαポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。可溶性ニュートロカインαポリペプチドは、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルス、または他の寄生生物による感染、免疫不全症、炎症性疾患、リンパ腺腫、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患を処置するため、ならびに末梢寛容を刺激し、いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および増殖を媒介するために、使用され得、そして免疫調節および炎症応答の最初の媒介物として機能的に連結している。
【００３１】
本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボで細胞に、または多細胞生物に投与するためのニュートロカインαポリヌクレオチドまたはニュートロカインαポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特定の特に好ましい実施態様において、組成物は、疾患の処置のための宿主生物におけるニュートロカインαポリペプチドの発現のためのニュートロカインαポリヌクレオチドを含む。この点に関して特に好ましいのは、ニュートロカインα遺伝子の異常な内因性活性に関連する機能不全の処置のためのヒト患者における発現である。
【００３２】
本発明はまた、候補化合物とニュートロカインを発現する細胞とを接触させること、細胞応答をアッセイすること、および標準的な細胞応答（ここで、標準は、接触が候補化合物の非存在下でなされる場合にアッセイされる）とこの細胞応答とを比較することを含む、ニュートロカインαにより誘導される細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、この標準は候補化合物の非存在下で接触される場合にアッセイされる。ここで、標準よりも増強された細胞応答は、化合物がアゴニストであることを示し、そして標準よりも減少した細胞応答は、化合物がアンタゴニストであることを示す。
【００３３】
別の局面において、ニュートロカインαレセプターを同定するための方法、ならびにこのようなレセプターを使用するアゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニングアッセイが提供される。このアッセイは、ニュートロカインαレセプターに対する、ニュートロカインαの結合における候補化合物の影響を決定することを含む。特に、本方法は、ニュートロカインαレセプターをニュートロカインαポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、ならびに候補化合物の存在に起因してニュートロカインαレセプターに結合するニュートロカインαポリペプチドが増加するかまたは減少するかを決定する工程を包含する。アンタゴニストは、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸収、関節炎リウマチ、および悪液質（老廃物または貧栄養）を予防するために使用され得る。
【００３４】
本発明者ら、は、ニュートロカインαが好中球のみならず、腎臓、肺、末梢生白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃ガン、平滑筋、マクロファージ、臍帯血液組織にもまた発現されることを見出した。多数のこれらの組織および細胞の障害（例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルス、および他の寄生生物の感染、免疫不全、敗血症生性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片対宿主拒絶、骨再吸収、関節炎リウマチ、および悪液質（老廃物または貧栄養）について、「標準的な」ニュートロカインα遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有していない固体からの組織または体液におけるニュートロカインαの発現レベル）と比較して、有意により高いかまたはより低いレベルのニュートロカインα遺伝子発現が、そのような障害を有する固体から取られた特定の組織（例えば骨髄）または体液（例えば、血清、血漿、尿、関節液、または髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、障害の診断の間に有用である診断方法を提供する。これは、以下を含む：（ａ）個体の細胞または体液のニュートロカインα遺伝子発現レベルをアッセイすること；（ｂ）ニュートロカインα遺伝子発現レベルを、標準的なニュートロカインα遺伝子発現レベルと比較し、それにより標準的な発現レベルと比較した、アッセイされたニュートロカインα遺伝子発現レベルにおける増加または減少を障害の指標とすること。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、体内のニュートロカインα活性レベルの上昇を必要とする個体を処置するための方法であって、治療有効量の、本発明の単離されたニュートロカインαポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。
【００３６】
本発明のなおさらなる局面は、体内のニュートロカインα活性レベルの減少を必要とする個体を処置するための方法であって、治療有効量の、ニュートロカインαアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、ニュートロカインα特異的抗体である。
【００３７】
本発明は、以下を提供する。
【００３８】
（１）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）図１における完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠除する溶解性ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド；
（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００３９】
（２）前記ポリヌクレオチドが図１における完全なヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４０】
（３）前記ポリヌクレオチドが、図１における完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカインαポリペプチドをコードする図１におけるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４１】
（４）前記ポリヌクレオチドが、図１に示される細胞外ドメインを含む溶解性ニュートロカインαをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４２】
（５）以下からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号２の残基ｎ〜２８５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎは２〜１９０の範囲の整数である、配列；
（ｂ）配列番号２の残基１〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｍは２７４〜２８４の範囲の整数である、配列；
（ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎおよびｍはそれぞれ上記の（ａ）および（ｂ）に規定される整数である、配列；
（ｄ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なニュートロカインαアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該一部分が、該完全なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜１９０アミノ酸およびＣ末端から１〜１１アミノ酸を含まない、ヌクレオチド配列。
【００４３】
（６）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４４】
（７）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４５】
（８）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる細胞外ドメインを含む溶解性ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４６】
（９）項目（１）の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここで、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
【００４７】
（１０）項目（１）の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【００４８】
（１１）以下からなる群から選択されるニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする、項目（１０）に記載の単離された核酸分子：約Ｐｈｅ １１５〜約Ｌｅｕ １４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ １５０〜約Ｔｙｒ １６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ １７１〜約Ｐｈｅ １９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ ２２３〜約Ｔｙｒ ２４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；および約Ｓｅｒ ２７１〜約Ｐｈｅ ２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド。
【００４９】
（１２）項目（１）に記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
【００５０】
（１３）項目（１２）に記載の方法によって産生される、組換えベクター。
【００５１】
（１４）項目（１３）に記載の組換えベクターを宿主細胞中に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
【００５２】
（１５）項目（１４）に記載の方法によって産生される組換え宿主細胞。
【００５３】
（１６）ニュートロカインαポリペプチドを産生するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現され、そして該ポリペプチドを回収するような条件下で、項目（１５）に記載の該組換え宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００５４】
（１７）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたニュートロカインαポリペプチド：
（ａ）図１（配列番号２）における完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカインαのアミノ酸配列；
（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカインαのアミノ酸配列；
（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインのアミノ酸配列；
（ｆ）ドメインを含む溶解性ニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
【００５５】
（１８）ニュートロカインαのエピトープ保有部分を含む項目（１７）に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、前記部分は以下からなる群から選択される：約Ｐｈｅ １１５〜約Ｌｅｕ １４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ １５０〜約Ｔｙｒ １６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ １７１〜約Ｐｈｅ １９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ ２２３〜約Ｔｙｒ ２４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；および約Ｓｅｒ ２７１〜約Ｐｈｅ ２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド。
【００５６】
（１９）項目（１７）に記載のニュートロカインαポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【００５７】
（２０）項目（１７）に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【００５８】
（２１）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）クローンＨＳＯＡＤ５５Ｒのヌクレオチド配列（配列番号７）；
（ｂ）クローンＨＳＬＡＨ８４Ｒのヌクレオチド配列（配列番号８）；
（ｃ）クローンＨＬＴＢＭ０８Ｒのヌクレオチド配列（配列番号９）；
（ｄ）図１に示される配列（配列番号１）の部分のヌクレオチド配列であって、ここで、前記部分は、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド８０９の少なくとの３０の連続したヌクレオチドを含む；および
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ニュートロカインαタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は膜貫通ドメイン（下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２８５は細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。
【図２】図２は、「Ｍｅｇａｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡＳｔａｒ」と呼ばれるコンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカインαタンパク質およびＴＮＦ−α（配列番号３）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）（配列番号４）、およびＦＡＳリガンド（配列番号５）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。
【図３】図３は、ニュートロカインαアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原指数および表面確率を示す。「抗原指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフは、ニュートロカインαタンパク質の高度に抗原性の領域の位置、すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
（詳細な説明）
本発明は、クローン化されたｃＤＮＡニュートロカインαを配列決定することによって決定された、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９６年１０月２２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託された、ＨＮＥＤＵ１５クローンの配列決定によって得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に含まれる。
【００６１】
本発明のニュートロカインαタンパク質は、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびＦａｓリガンドのヒトｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有している（図２）。上記のように、ＴＮＦαは、細胞傷害性、壊死、アポトーシス、副刺激、増殖、リンパ節形成、免疫グロブリンクラススイッチ、分化、抗ウイルス活性、接着分子ならびに他のサイトカインおよび増殖因子の調節において役割を果たす重要なサイトカインであると考えられる。
【００６２】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％の同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００６３】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド（Ａ， Ｇ， Ｃ， およびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）が意図される。
【００６４】
本明細書中で提供される情報（例えば、図１のヌクレオチド配列）を用いて、ニュートロカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、図１（配列番号１）において記載される核酸分子は、好中球由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。ニュートロカインα ｃＤＮＡの一部に対応する発現された配列タグもまた、好中球において見出された。
【００６５】
ニュートロカインα遺伝子は、約２８５アミノ酸残基（約４６アミノ酸の細胞内ドメイン（図１（配列番号２）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）のほぼ４７〜ほぼ７２のアミノ酸残基），約２１３アミノ酸の細胞外ドメイン（図１（配列番号２）のほぼ７３〜ほぼ２８５のアミノ酸残基））のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み；そして約３１ｋＤａの推定分子量である。図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号３３９７６４としてアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約２０％類似しそして約１０％同一である。
【００６６】
当業者が理解するように、上記の配列決定の誤りの可能性に起因して、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際の完全なニュートロカインαポリペプチド（約２８５のアミノ酸を含む）は、いくらかより小さいかもしれない。特に、決定されたニュートロカインαコード配列は、図１（配列番号１）のヌクレオチド２１０−２１３位で、オープンリーディングフレームの翻訳のための選択的な開始コドンとして役立ち得る第２のメチオニンコドンを含む。より一般的には、実際のオープンリーディングフレームは、図１（配列番号１）に示されるＮ末端からの第１または第２のメチオニンコドンのいずれかから予測される、±２０アミノ酸の範囲、より可能性が高いのは±１０アミノ酸の範囲のどこかに存在し得る。種々の機能的ドメインを同定するために使用される分析的基準に依存して、ニュートロカインαポリペプチドの細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「アドレス」は、僅かに異なり得ることがさらに理解される。例えば、図１（配列番号２）の、ニュートロカインα細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用した基準に依存して、僅かに変化し得る（例えば、アドレスは、約１〜約２０残基、より可能性が高いのは約１〜約５残基「シフト」し得る）。この場合、膜貫通ドメインの末端、および細胞外ドメインの開始部は、図３に示されるように、上記の位置における疎水性アミノ酸配列の同定に基づいて予測される。いずれにしても、以下でさらに考察されるように、本発明はさらに、完全なポリペプチドのＮ末端から種々の残基が欠失されたポリペプチド（ニュートロカインαタンパク質の可溶型の細胞外ドメインを構築する、本明細書中に記載の細胞外ドメインのＮ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失するポリペプチドを含む）を提供する。
【００６７】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００６８】
「単離された」核酸分子（単数または複数）によって、天然の環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。
【００６９】
本発明の単離される核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の１４７〜１４９位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含む。さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列と実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重に起因してなおニュートロカインαタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において周知である。従って、上記の縮重変異体を生成することは、当業者にとって日常的である。別の局面において、本発明は、１９９６年１０月２２日に寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする配列を含む。
【００７０】
本発明はさらに、図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列、または上記の寄託されたクローンに含まれるニュートロカインαｃＤＮＡ、もしくは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離される分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、および例えばノーザンブロット分析によるヒト組織中のニュートロカインα遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００７１】
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。詳細には、本発明は配列番号１の部分を示すヌクレオチド配列（配列番号１の１〜１００１位からなる）を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００７２】
さらに、本発明は、図１（配列番号１）のヌクレオチド１からヌクレオチド８０９の配列の内、少なくとも約３０の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分と少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７３】
より一般的には、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、本明細書中で考察されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さであるフラグメントを意図される。もちろん、本発明による５０〜３００ｎｔの長さのより大きいフラグメントもまた、有用である。なぜなら、これらのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列の、全てではないかもしれないが、大部分の対応するフラグメントだからである。例えば、少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡの、または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメントは、図１に同定され、そして以下により詳細に記載されるようなニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保持部分をコードする核酸分子を含む。
【００７４】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、括弧内を含む溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡ ）中４２℃での一晩のインキュベーション、続く約６５℃にて０．１×ＳＳＣにおいてフィルターを洗浄することが意図される。
【００７５】
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０（例えば、５０）ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【００７６】
例えば、「少なくとも２０ｎｔの長さ」のポリヌクレオチドの一部によって、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）からの配列の２０以上の連続するヌクレオチドが意図される。当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるニュートロカインα ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）区域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的領域にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）領域またはその相補体（例えば、特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
【００７７】
示されるように、ニュートロカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下をコードする核酸分子を含み得るが、それらに限定されない：それ自体によって、ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；および、ポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列およびさらなる配列（例えば細胞内および膜貫通ドメイン配列、またはプレタンパク質配列もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列をコードする配列）；上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まないポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列。
【００７８】
また、本発明の核酸によってコードされるのは、さらなる非コード配列を伴う上記のタンパク質配列であり、例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を担う転写される非翻訳配列（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む））；さらなる機能性を提供する配列のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列を含むがこれらに限定されない。
【００７９】
従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）において提供されるタグ）であり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４ （１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ （１９８４）によって記載されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合されるニュートロカインαを含む。
【００８０】
（改変体および変異体ポリヌクレオチド）
本発明は、さらに、ニュートロカインαタンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子改変体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８５）。天然に存在しない変異体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００８１】
このような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって産生された改変体が挙げられる。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード領域における変化は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、ニュートロカインαタンパク質、またはその部分の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加、および欠失である。また、このことについて特に好ましいのは保存的置換である。
【００８２】
最も好ましくは、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるニュートロカインαアミノ酸配列の細胞外ドメインを有するタンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸分子である。さらなる実施態様は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）図１（配列番号２）中の完全アミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）中の７３〜２８５位でアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドの推定される細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣに含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００８３】
ニュートロカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、ニュートロカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置でか、または参照配列内のヌクレオチドの中で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
【００８４】
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ． ２：４８２−４８９ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。Ｂｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【００８５】
本出願は、ニュートロカインα活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図１（配列番号１）において示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がニュートロカインα活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するかをなお知るからである。ニュートロカインα活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ（１）ニュートロカインα遺伝子またはその対立遺伝子改変体をｃＤＮＡライブラリーにおいて単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）に記載の、ニュートロカインα遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および、（３）特定の組織におけるニュートロカインα ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
【００８６】
しかし、実際に、ニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする図１（配列番号１）示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「ニュートロカインα活性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定される場合、本発明のニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインまたは全長ニュートロカインαタンパク質の活性と類似する（しかし、必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、本発明のニュートロカインαタンパク質は、細胞増殖、細胞傷害性、および細胞死を調節する。特定の細胞に対するタンパク質の作用を測定するためのインビトロ細胞増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、および細胞死アッセイは、周知の、ならびに細胞複製および／または細胞死を検出するために当該分野で通常に利用可能な試薬を用いることによって行われ得る。例えば、ＴＮＦ関連タンパク質活性についての多数のそのようなアッセイが、上記の本開示の背景のセクションにおける種々の参考文献に記載されている。手短に言えば、そのようなアッセイは、ヒトまたは動物（例えば、マウス）細胞を回収し、そして（１）ニュートロカインαタンパク質（または候補ポリペプチド）を含むトランスフェクトされた宿主細胞上清、または（２）トランスフェクトされていない宿主細胞上清コントロールと混合すること、ならびに特定の期間のインキュベーション後に細胞数または生存率に対する作用を測定することを含む。このタイプのアッセイにおいて測定され得るようなこのような細胞増殖調節活性は、腫瘍、腫瘍転移、感染、自己免疫疾患炎症、および他の免疫関連疾患の処置に有用である。
【００８７】
ニュートロカインαは、上記のアッセイにおいて用量依存的様式で細胞増殖および分化を調節する。従って、「ニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチド」はまた、上記のアッセイにおいて用量依存的様式で同じ細胞調節（特に免疫調節）活性のいずれかを示すポリペプチドを含む。用量依存活性の程度は、ニュートロカインαタンパク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは「ニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチド」は、ニュートロカインαタンパク質と比較して所定の活性において実質的に類似の用量依存を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ニュートロカインαタンパク質と比較して約２５倍より大きい活性か、またはより小さい活性、そして好ましくは、約１０倍以下の活性を示す）。
【００８８】
ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、ニュートロカインαは、例えば、単球、リンパ球、および好中球を含む白血球に対する活性を示す。こういう訳で、ニュートロカインαは、これらの細胞タイプの増殖、分化、および動員を指示することにおいて活性である。このような活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の炎症の制御、ならびに白血病の処置に有用である。このような活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら， Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １７：２７３（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８２：１１１１（１９９５）；Ｃａｕｘら， Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２５８（１９９２）；およびＳａｎｔｉａｇｏ−Ｓｈｗａｒｚら， Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ． ３７８：７（１９９５）を参照のこと。
【００８９】
もちろん、遺伝暗号の縮重のために、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列または図１（配列番号１）に示される核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「ニュートロカインαタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、これは上記の比較アッセイを実施することなしでさえ当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核酸分子について、合理的な数がまたニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、下記でさらに記載されるように、当業者が、タンパク質の機能に有意な影響をあまり与えそうにないか、または有意な影響を与えそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知っているからである。
【００９０】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるニュートロカインαポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミド、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００９１】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される転写物の細胞外ドメインのコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始を含み、そして終わりに適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。
【００９２】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【００９３】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．から入手可能、前出）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００９４】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００９５】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３（カナダ対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に全く有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にＦｃ部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用される場合）である。薬物発見において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照のこと。
【００９６】
ニュートロカインαタンパク質は、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００９７】
（ニュートロカインαポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、もしくは図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有する単離されたニュートロカインαポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
【００９８】
（改変体および変異体ポリペプチド）
ニュートロカインαポリペプチドの特徴を改善または改変するために、タンパク質操作を用い得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規な変異体タンパク質または「単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含むムテイン、または融合タンパク質」を作製するために用いられ得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製条件および保存条件下で対応する天然のポリペプチドよりも良好な溶解度を示し得る。
【００９９】
（Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体）
例えば、分泌タンパク質の細胞外ドメインまたは成熟形態を含む多くのタンパク質について、１個以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失を伴わずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることが当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基が失われたとしてもヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧＦタンパク質を報告した。
【０１００】
この場合、本発明のタンパク質はＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、図１（配列番号２）の１９１位のＧｌｙ（Ｇ）残基までのＮ末端アミノ酸の欠失は、いくらかの生物学的活性（例えば、適切な標的細胞に対する細胞傷害性）を保持し得る。
【０１０１】
Ｇｌｙ（Ｇ）残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持するとは考えられない。なぜなら、この残基は、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必要とされる保存されたドメインの始まりであるからである。しかし、タンパク質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失の改変をもたらしたとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導するかおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインの大多数よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合、保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載の日常的な方法および他の当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。
【０１０２】
従って、本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαのアミノ酸配列のアミノ末端からの１個以上の残基より、アミノ末端からのＧｌｙ１９１残基までを有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２の残基ｎ〜１９０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここで、ｎは、２〜１９０の範囲の整数であり、そして１９１は、ニュートロカインαタンパク質の活性に必要とされると考えられる、完全なニュートロカインαポリペプチド（配列番号２に示す）のＮ末端からの最初の残基の位置である。より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１０３】
【化１】

【０１０４】
【化２】

【０１０５】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０６】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させることにより、１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。本タンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、２８４位のＬｅｕまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、全てではなくても大部分の生物学的活性（例えば、レセプター結合および細胞複製の調整）を保持すると考えられる。約１０個までのさらなるＣ末端残基の欠失を有するポリペプチドはまた、いくらかの活性（例えば、レセプター結合）を保持し得るが、このようなポリペプチドは、ほぼＬｅｕ２８４で始まる保存されたＴＮＦドメインの部分を欠く。しかし、タンパク質のＣ末端の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化タンパク質が完全なまたは成熟タンパク質を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、完全なまたは成熟タンパク質の大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される日常的な方法および他の当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。
【０１０７】
従って、本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαのアミノ酸配列のカルボキシ末端からの１個以上の残基より、カルボキシ末端からのＧｌｙ２７４残基までを有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍを有するポリペプチドを提供し、ここで、ｍは、２７４〜２８４の範囲の任意の整数である。より詳細には、本発明は、配列番号２の残基１〜２７４、１〜２７５、１〜２７６、１〜２７７、１〜２７８、１〜２７９、１〜２８０、１〜２８１、１〜２８２、１〜２８３、および１〜２８４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０８】
また、１個以上のアミノ酸がアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から欠失されたポリペプチドが提供され、これは、一般に、配列番号２のアミノ酸配列の残基ｎ〜ｍを有し、ここでｎおよびｍが上記のような整数であるとして記載され得る。また、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なニュートロカインαアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドであって、ここでこの部分は、寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの１〜１９０アミノ酸またはＣ末端からの１〜１１アミノ酸（またはこれらのＮ末端欠失およびＣ末端欠失の任意の組合せ）から排除されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。上記の欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０９】
（他の変異体）
上記のタンパク質の末端欠失形態に加えて、ニュートロカインαポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に有意な効果を有さずに変化し得ることが当業者に認識される。このような配列の相違が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在することを思い出すべきである。
【０１１０】
従って、本発明はさらに、実質的なニュートロカインαポリペプチド活性を示すかまたはニュートロカインαタンパク質の領域（例えば、以下で議論するタンパク質部分）を含む、ニュートロカインαポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は、活性にほとんど影響を有さないことが当該分野で公知の一般的規則に従って選択される、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製することに関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：
Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に提供される。ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主なアプローチが存在することを示す。第１の方法は、進化のプロセスにより、ここで、変異は、自然選択により受け入れられるかまたは拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用してアミノ酸変化を、クローン化された遺伝子の特異の位置に導入し、そして選択またはスクリーニングにより機能性を保持する配列が同定される。
【０１１１】
著者の述べるところによれば、これらの研究は、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸置換が、タンパク質の特異の位置で許容されるようであるかを示す。例えば、ほとんどの埋没アミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とし、一方表面側鎖の特徴は、一般に、ほとんど保存されない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら、前出およびその中での引用文献に記載される。保存的置換として代表的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１１２】
従って、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるものであるかそうでなくてもよく、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されるもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列あるいはポリペプチドまたはプロタンパク質配列の細胞外ドメインの精製に使用される配列のようなポリペプチドの細胞外ドメインに融合されるもの、であり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【０１１３】
従って、本発明のニュートロカインαは、天然の変異または人工操作のいずれかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。
【０１１４】
【表１】

【０１１５】
機能に必須である本発明のニュートロカインαタンパク質中のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発）によって同定され得る （ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））。後者の手順は、分子中の全ての残基に単一のアラニン変異を誘導する。次いで、得られる変異分子は、レセプター結合またはインビトロもしくはインビボ増殖活性のような生物学的活性について試験される。
【０１１６】
特に問題であることは、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での置換である。これは非常に望ましい改善された特性（例えば凝集が少ない）を有するタンパク質を生じ得る。凝集は、活性の減少を生じ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する際に凝集物が免疫原性であり得るため問題である（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）； Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６： ８３８−８４５ （１９８７）； Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７ （１９９３））。
【０１１７】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変化させ得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８ （１９９３）は、２つの既知型のＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦαの選択的結合を生じる特定の変異を記載している。ニューロカインαは、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、ＴＮＦ−αのそれに類似した変異は、ニューロカインαにおいて類似した効果を有するようである。
【０１１８】
リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。ニューロカインαは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ニューロカインαの生物学的活性を完全に除去するのではなく調節するためには、好ましくは変異は、ＴＮＦ保存ドメインのアミノ酸をコードする配列（すなわち、図１（配列番号２）の１９１〜２８４位）内に、より好ましくはＴＧＦファミリーの全てのメンバーには保存されていないこの領域内の残基に作製される。このような保存アミノ酸が、関連するＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカインα中に特異的変異を作製することによって、ニュートロカインαは、アンタゴニストとして作用し、これにより血管形成活性を保有する。従って、本発明のポリペプチドは、ニューロカインα変異体を含む。このようなニュートロカインα変異体は、図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαアミノ酸配列の全長または好ましくは細胞外ドメインからなる。さらに、本発明の形成部はまた、上記のニュートロカインα変異体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０１１９】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製される。ニュートロカインαポリペプチドの組換え産生型は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８）に記載されるような１工程法によって実質的に精製され得る。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる完全なポリペプチド、このタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた細胞外ドメイン、図１（配列番号２）の完全なポリペプチド、細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた図１（配列番号２）の細胞外ドメイン、ならびに上記のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、およびさらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。
【０１２１】
発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドまたは図１（配列番号２）のポリペプチドに、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【０１２２】
２つのポリペプチドについての「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）および類似性を決定するための初期設定（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じる類似性の値が意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
【０１２３】
ニュートロカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列がニュートロカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列における５％までの総アミノ酸残基の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以上の近接したグループ内のいずれかに分散される末端位置の間のどこかで、起こり得る。
【０１２４】
実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される。
【０１２５】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおいて分子量マーカーとして使用され得る。
【０１２６】
下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、下記のようにニュートロカインαタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用である、またはニュートロカインαタンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるニュートロカインαタンパク質結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０１２７】
（エピトープ保有部分）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０１２８】
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６」を参照のこと。タンパク質−反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列に頻繁に存在し、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質（すなわち、免疫原性エピトープ）の免疫ドミナント領域にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８ （１９８４）の７７７を参照のこと。
【０１２９】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の配列を含む。ニュートロカイン特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたペプチドの非限定的な例としては以下が挙げられる：図１（配列番号２）の約Ｐｈｅ１１５〜約Ｌｅｕ１４７のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｉｌｅ１５０〜約Ｔｙｒ１６３のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｓｅｒ１７１〜約Ｐｈｅ１９４のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｇｌｕ２２３〜約Ｔｙｒ２４７のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｓｅｒ２７１〜約Ｌｅｕ２７８のアミノ酸残基を含有するポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図３に示されるようなＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によってニュートロカインαタンパク質の抗原性エピトープを保有するように決定された。
【０１３０】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の簡便な手段によって産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ．Ａ． （１９８５） Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏｓ ａｃｉｄｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５； この「複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。
【０１３１】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）は、タンパク質全体が免疫原である場合、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、上述。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ＭｉｘｔｕｒｅｓにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。
【０１３２】
（融合タンパク質）
当業者が理解するように、本発明のニュートロカインαポリペプチドならびに上記のそれらのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を促進し、そしてインビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合および中和において、モノマーニュートロカインαタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも有効であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１３３】
（免疫系関連障害の診断）
ニュートロカインαが種々の組織および特に好中球において発現されることを本発明者らは発見した。多数の免疫系関連障害について、「標準的」ニューロカインα遺伝子発現レベル（すなわち、免疫系障害を有さない個体由来の免疫系組織または体液におけるニュートロカインα発現レベル）と比較して、実質的に変化（増大または減少）したレベルのニュートロカインα遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取された免疫系組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において検出され得る。従って、本発明は、系障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、これは、個体由来の免疫系組織または他の細胞または体液中のニュートロカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定された遺伝子発現レベルと標準ニュートロカインα遺伝子発現レベルとを比較することを含み、それによって標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が免疫系障害の指標となる。
【０１３４】
詳細には、免疫のガンを有する哺乳動物における特定の組織が、対応する「標準」レベルと比較した場合、ニュートロカインαタンパク質、およびニュートロカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡの有意に増大または減少したレベルを発現すると考えられる。さらに、増強または抑制したレベルのニュートロカインαタンパク質が、ガンを有さない同じ種の哺乳動物由来の血清と比較した場合、このようなガンを有する哺乳動物からの特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）中に検出され得る。
【０１３５】
従って、本発明は免疫系障害（この系のガンを含む）の診断の間に有用な診断方法を提供する。この方法は、個体由来の免疫系組織または他の細胞または体液中のニュートロカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定された遺伝子発現レベルと標準ニュートロカインα遺伝子発現レベルとを比較することを含み、それによって標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が免疫系障害の指標となる。
【０１３６】
免疫系における障害の診断（腫瘍の診断を含む）が、従来の方法に従ってすでに行われた場合、本発明は、予後の指標として有用であり、それによって増強または抑圧されたニュートロカインα遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較してより悪い臨床結果を経験する。
【０１３７】
「ニュートロカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること」により、第一の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することにより）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるニュートロカインαタンパク質タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することにより）のいずれかで、ニュートロカインαタンパク質のレベルまたはニュートロカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの定性的測定もしくは定量的測定または評価が意図される。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるニュートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準ニュートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較される。標準は、障害を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから得られるか、または免疫系の障害を有さない個体の集団からの平均レベルにより決定され得る。当該分野において評価されるように、一旦標準ニュートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になると、それは比較のための標準として繰り返して使用され得る。
【０１３８】
「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはニュートロカインαタンパク質もしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、ニュートロカインαタンパク質の遊離した細胞外ドメインを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、および完全なまたは遊離したニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインあるいはニュートロカインαレセプターを発現することが見出された他の組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０１３９】
本発明は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障害の診断または処置に有用である。このような障害としては、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび他の寄生体による感染、免疫不全症、炎症性疾患、リンパ節腫脹、自己免疫疾患、および対宿主性移植片疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
全細胞ＲＮＡが、任意の適切な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９ （１９８７）に記載されている一工程のグアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ニュートロカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０１４１】
生物学的サンプル中のニュートロカインαタンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術を用いて起こり得る。例えば、組織におけるニュートロカインαタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５ （１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６ （１９８７））。ニュートロカインαタンパク質遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体に基づく方法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼ、および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（^１２５Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、イオウ（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンのような酵素、標識が挙げられる。
【０１４２】
個体から得られる生物学的サンプル中のニュートロカインαタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、ニュートロカインαタンパク質はまた、画像解析によってインビボで検出され得る。ニュートロカインαタンパク質のインビボでの画像解析のための抗体標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。
【０１４３】
放射性同位元素（例えば、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、放射性不透明体（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、ニュートロカインαタンパク質−特異的抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の^９９ｍＴｃである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、ニュートロカインαタンパク質を含む細胞の位置にそれぞれ優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ 第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ．Ｗ． ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２））に記載されている。
【０１４４】
（抗体）
本発明での使用のためのニュートロカインαタンパク質特異的抗体は、完全なニュートロカインαタンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得る。これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質と共に、またはそれが充分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合はキャリアを伴わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、ニュートロカインαタンパク質に特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントのような）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４：３１６−３２５ （１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１４６】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ニュートロカインαタンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、ニュートロカインαタンパク質の調製物は、それが天然の混入物を実質的に含まないように、上記のように調製され、そして精製される。次いで、このような調製物は、より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０１４７】
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（あるいはそのニュートロカインαタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１ （１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２ （１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１） ｐｐ５６３−６８１）を用いて調製され得る。一般に、このような手順は、ニュートロカインαタンパク質抗原、またはより好ましくはニュートロカインαタンパク質発現細胞で動物（好ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗ニュートロカインαタンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活化した）を補充し、約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、アメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））に記載されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、ニュートロカインαタンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０１４８】
あるいは、ニュートロカインαタンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体はそれ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、ニュートロカインαタンパク質特異的抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、ニュートロカインαタンパク質−特異的抗体に結合する能力が、それぞれニュートロカインαタンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、ニュートロカインαタンパク質−特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるニュートロカインαタンパク質−特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１４９】
本発明の抗体のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントおよび他のフラグメントが、本明細書中に開示される方法に従って用いられ得ることが認識される。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生成するため）のような酵素を用いるタンパク質分解切断により生成される。あるいは、ニュートロカインαタンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用を通して、または合成化学を通して生成され得る。
【０１５０】
ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、増強されたレベルのニュートロカインαタンパク質を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２ （１９８５）； Ｏｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４ （１９８６）； Ｃａｂｉｌｌｙら， 米国特許第４，８１６，５６７号；
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら， ＥＰ １７１４９６； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， ＥＰ １７３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， ＷＯ ８６０１５３３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，
ＷＯ ８７０２６７１； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８ （１９８５）を参照のこと。
【０１５１】
（免疫系関連障害の処置）
上記のように、ニュートロカインαポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ニュートロカインα活性の異常に高いまたは低い発現に関与する状態の診断に有用である。ニュートロカインαが発現される細胞および組織、ならびにニュートロカインαによって調整される活性が与えられると、標準または「正常」レベルと比較して個体における実質的に変化（増大または減少）したレベルのニュートロカインαの発現は、ニュートロカインαが発現され、そして／または活性である身体系に関連する病理状態を生じる。
【０１５２】
本発明のニュートロカインαタンパク質はＴＮＦファミリーのメンバーであるので、タンパク質の細胞外ドメインが、タンパク質分解切断によってニュートロカインαを発現する細胞から可溶性形態で放出され得、それゆえ、ニュートロカインαタンパク質（特に可溶性形態の細胞外ドメイン）が、個体の細胞、組織または身体に外来性供給源から添加される場合、このタンパク質は、その個体の任意の標的細胞においてその調整活性を発揮することもまた当業者に理解される。さらに、このＩＩ型膜貫通タンパク質を発現する細胞は、個体の細胞、組織または身体に添加され得、それによって、添加された細胞はニュートロカインαのレセプターを発現する細胞に結合し、それによってニュートロカインαを発現する細胞は、レセプター保有標的細胞において作用（例えば、細胞傷害性）を引き起こし得る。
【０１５３】
それゆえ、個体におけるニュートロカインα活性の標準または正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニュートロカインαタンパク質（可溶性細胞外ドメインの形態または完全なタンパク質を発現する細胞）の投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニュートロカインαのレベルの増大を必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるニュートロカインα活性レベルを増大するのに効果的な量の本発明の単離されたニュートロカインαポリペプチドを含有する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を含む。
【０１５４】
ニュートロカインαは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するので、血管形成をも調整するはずである。さらに、ニュートロカインαは、免疫細胞機能を阻害するので、広範な範囲の抗炎症活性を有する。ニュートロカインαは、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害Ｔ細胞およびマクロファージ）の浸潤および活性化を刺激し、そして腫瘍の血管形成を阻害することによって固相腫瘍を処置するための抗新血管新生因子として使用され得る。血管増殖が望まれない他の非ガン徴候を当業者は認識している。それらはまた、耐性の慢性および急性感染（例えば、殺菌白血球の誘引および活性化を介するミコバクテリア感染）に対して宿主防御を増大するために使用され得る。ニュートロカインαはまた、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患およびリンパ性白血病の処置のために、ＩＬ−２生合成の阻害によりＴ細胞増殖を阻害するために使用され得る。ニュートロカインαはまた、細片除去および結合組織促進炎症細胞の漸加の両方を介して、創傷治癒を刺激するために使用され得る。この同じ様式で、ニュートロカインαはまた、他の線維性障害（肝硬変、骨関節炎、および肺線維症を含む）を処置するのに使用され得る。ニュートロカインαはまた、住血吸虫症、旋毛虫病、回虫症のような場合に、組織に侵入する寄生体の幼生を死滅させる特有の機能を有する好酸球の存在を増大させる。例えば、化学療法の後に骨髄から成熟白血球を放出するために（すなわち、幹細胞動員において）、種々の造血前駆細胞の活性化および分化を調節することによって、造血を調節するために使用され得る。ニュートロカインαはまた、敗血症を処置するために使用され得る。
【０１５５】
（処方物）
ニュートロカインαポリペプチド組成物（特に、可溶性形態の細胞外ドメインであるポリペプチドを含む）は、個々の患者の臨床状態（特にニュートロカインαポリペプチド単独での処置の副作用）、ニュートロカインαポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および実施者に公知の他の要素を考慮して、良好な医療行為と一致した様式で処方および投薬される。従って、本明細書中の目的のためのニュートロカインαポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０１５６】
一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるニュートロカインαポリペプチドの総薬学的有効量は、患者の体重あたり、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトについてホルモンで、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、ニュートロカインαポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。変化を観察するために必要とされる処置の長さ、および処置後に応答が起きるまでの間隔は、所望される効果に従って変化するようである。
【０１５７】
本発明のニュートロカインαポリペプチドを含む薬学的組成物は、経口、直腸、非経口、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、点眼薬、または経皮パッチによるような）、頬に、または経口もしくは鼻腔内スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の型の非毒性の固体、半固体、または液体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、または処方助剤を意味する。本明細書中で用いられる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与態様をいう。
【０１５８】
ニュートロカインαポリペプチドはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ．ら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６ （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７−２７７ （１９８１）およびＲ． Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：９８−１０５ （１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒら， 同書）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。持続放出ニュートロカインαポリペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたニュートロカインαポリペプチドを含む。ニュートロカインαポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法により調製される（ＤＥ ３，２１８，１２１； Ｅｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８２：３６８８−３６９２ （１９８５）； Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７７：４０３０−４０３４ （１９８０）； ＥＰ ５２，３２２； ＥＰ ３６，６７６； ＥＰ ８８，０４６； ＥＰ １４３，９４９； ＥＰ
１４２， ６４１； 日本国特許出願第８３−１１８００８号； 米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号； ならびにＥＰ １０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものであり、ここで脂肪含量は約３０ｍｏｌ．％コレステロールより高く、選択される比率は、最適なニュートロカインαポリペプチド治療のために調整される。
【０１５９】
非経口投与のために、１つの実施態様では、ニュートロカインαポリペプチドは、一般的に、所望の程度の純度で単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）のこのポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合性であるキャリア）と混合することにより処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１６０】
一般的に、処方物は、ニュートロカインαポリペプチドを、液体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアまたはその両方と均一にかつ直接接触させることにより調製される。次いで、必要に応じて、産物は、所望の処方物に成形される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルはまた、ならびにリポソームは、本明細書中で有用である。
【０１６１】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加剤を適切に含む。このような物質は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ならびに／あるいはポリソルベート、ポロオキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６２】
ニュートロカインαポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクルに、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで処方される。上述の賦形剤、キャリア、または安定化剤の特定のものの使用が、ニュートロカインαポリペプチド塩の処方をもたらすことが理解される。
【０１６３】
治療的投与のために用いられるニュートロカインαポリペプチドは、無菌でなければならない。無菌は、無菌の濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的ニュートロカインαポリペプチド組成物は、一般的に、無菌の出入り口を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が貫通し得るストッパーを有するバイアル）に入れられる。
【０１６４】
ニュートロカインαポリペプチドは、通常、単位用量のまたは多回用量の容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）において、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の１例として、１０ｍｌバイアルが、無菌濾過された１％（ｗ／ｖ）水性ニュートロカインαポリペプチド溶液５ｍｌで満たされ、そして得られた混合物は凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥されたニュートロカインαポリペプチドを、静菌性の注射用蒸留水を用いて再構成することにより調製される。
【０１６５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットを提供する。このような容器に、薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方された形態での注意書であって、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販売の機関による認可を反映する注意書が付随し得る。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と組み合わせて用いられ得る。
【０１６６】
（アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子）
本発明はまた、細胞におけるニュートロカインαの作用（例えば、レセプター分子のようなニュートロカインα結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、ニュートロカインαの天然の生物学的機能を増大するか、またはニュートロカインと類似した様式で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストは、そのような機能を減少または除去する。
【０１６７】
この実施態様の別の局面では、本発明は、ニュートロカインαポリペプチドに特異的に結合するレセプタータンパク質またはリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞区画（例えば、膜またはその調製物）は、ニュートロカインαに結合する分子を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、標識されたニュートロカインαとともにインキュベートされ、そしてこのレセプターまたは他の結合タンパク質に結合したニュートロカインαの複合体が、当該分野において公知の日常的な方法に従って単離され、そして特徴付けられる。あるいは、ニュートロカインαポリペプチドは、細胞から可溶化された結合分子がカラムに結合し、次いで日常的な方法に従って溶出され、そして特徴付けられるように固相支持体に結合され得る。
【０１６８】
アゴニストまたはアンタゴニストに関する本発明のアッセイにおいて、細胞区画（例えば、膜またはその調製物）は、ニュートロカインαに結合する分子（例えば、ニュートロカインαによって調整されるシグナル伝達または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、ニュートロカインαアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で、標識されたニュートロカインαとともにインキュベートされる。結合分子に結合する候補分子の能力は、標識されたリガンドの減少した結合において反映される。理由なく（すなわち、ニュートロカインα結合分子を結合することに対するニュートロカインαの効果を誘導することなく）結合する分子は、ほとんど良好なアンタゴニストである。十分に結合し、そしてニュートロカインαと同一か、または密接に関連した効果を誘発する分子は、アゴニストである。
【０１６９】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのニュートロカインα様効果は、例えば、候補分子の、細胞または適切な細胞調製物との相互作用後の第２のメッセンジャー系の活性を決定すること、そしてその効果を、ニュートロカインα、またはニュートロカインαと同じ効果を誘発する分子の効果と比較することによって測定され得る。この点において有用であり得る第２のメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解第２メッセンジャー系を含むが、これらに限定されない。
【０１７０】
ニュートロカインαアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合阻害アッセイに適切な条件下で、ニュートロカインαと、膜結合レセプター分子または組換えニュートロカインαレセプター分子を有する潜在的なアンタゴニストと組み合わせる、競合アッセイである。ニュートロカインαは、レセプター分子に結合するニュートロカインα分子の数が、潜在的なアンタゴニストの効果を評価するために正確に決定され得るように、例えば放射能によって標識され得る。
【０１７１】
潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれによってその活性を阻害または失活させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を含む。潜在的なアンタゴニストはまた、ニュートロカインα誘導活性を誘導することなしに結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に結合し、それによりニュートロカインαが結合するのを妨げることによってニュートロカインαの作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような、小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであり得る。
【０１７２】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して、または三重らせん形成を介して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えばＯｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５６：５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）において議論されている。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０ （１９９１）において議論されている。本方法は、ポリヌクレオチドの、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明のポリペプチドの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関連する遺伝子領域に相補的であるように設計され、それによってニュートロカインαの転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の、ニュートロカインαポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、インビボで発現され、ニュートロカインαの産生を阻害し得る。
【０１７３】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば上記のような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。
【０１７４】
アンタゴニストは、例えば、マクロファージおよびそれらの前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球、およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、特定の自己免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、活性化ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）のニュートロカインα走化性および活性を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例は、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病を含む。アンタゴニストはまた、単球食細胞の補充および活性化を妨げることによって、感染性疾患（珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む）を処置するために使用され得る。それらはまた、好酸球産生および移動を妨げることによって、好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。内毒素ショックもまた、マクロファージの移動および本発明のヒトケモカインポリペプチドの産生を妨げることによって、アンタゴニストによって処置され得る。アンタゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げることによってアテローム性硬化症を処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導肥満細胞および好酸球脱顆粒およびヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介アレルギー反応および免疫学的障害（後期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚炎を含む）を処置するために使用され得る。ＩｇＥ媒介アレルギー反応（例えば、アレルギー性ぜん息、鼻炎、および湿疹）もまた、処置され得る。アンタゴニストはまた、単球の創傷領域への誘引を妨げることによって慢性および急性の炎症を処置するために使用され得る。それらはまた、正常な肺性マクロファージ集団を制御するために使用され得る。なぜなら、慢性および急性の炎症性肺疾患は、肺における単核食細胞の壊死巣分離と関連するからである。アンタゴニストはまた、単球の、患者の関節中の関節液への誘引を妨げることによって慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球流入および活性化は、変性および炎症性の両方の関節症の病原において有意な役割を果たす。アンタゴニストは、ＩＬ−１およびＴＮＦ（これらは、他の炎症性サイトカインの生合成を妨げる）に主に起因する有害なカスケードを妨げるために使用され得る。この様にして、アンタゴニストは炎症を妨げるために使用され得る。アンタゴニストはまた、ケモカインによって誘導されるプロスタグランジン依存性熱を阻害するために使用され得る。アンタゴニストはまた、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群）の症例を処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げることによってぜん息およびアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、ぜん息肺の顕著な特徴である、上皮下基底膜線維症を処置するために使用され得る。
【０１７５】
ニュートロカインαに対する抗体は、傷害後の肺への好中球の浸潤を妨げることによって、ニュートロカインαに結合し、そしてニュートロカインα活性を阻害し、ＡＲＤＳを処置するために使用され得る。アンタゴニストは、例えば本明細書中下記のような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。
【０１７６】
（染色体アッセイ）
本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんどが、染色体位置の標識に利用可能でない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。
【０１７７】
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるｃＤＮＡは、ニュートロカインαタンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために使用される。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用される。
【０１７８】
さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。ｃＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１つの工程において正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、５０または６０ｂｐほど短いｃＤＮＡ由来のプローブとともに使用され得る。本技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
【０１７９】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１８０】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における相違を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１８１】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示のために提供され、そして限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１ａ：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ニュートロカインαの発現および精製）
細菌発現ベクターｐＱＥ９ （ｐＤ１０）を、本実施例における細菌発現のために使用する。（ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． 前出）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出によって販売されるニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を用いてアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードする挿入ＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように整列される。
【０１８３】
細胞外ドメイン配列を含むニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列は、ニュートロカインαタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列に、およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅される。ｐＱＥ９ベクターにおけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、それぞれ５’および３’プライマー配列に付加される。
【０１８４】
タンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、配列５’
ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧ ３’（配列番号１０）を有し、これは、下線を付したＢａｍＨ Ｉ制限部位、続いて図１におけるニュートロカインα配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１８ヌクレオチドを含む。当然のことながら、当業者は、タンパク質コード配列中の５’プライマーが始まる点は、形態の細胞外ドメインより短いかまたは長い完全なニュートロカインαタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するように変更され得ることを理解する。３’プライマーは、配列５’ ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１１）を有し、これは、下線を付したＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位、続いて２つの終止コドン、および図１におけるニュートロカインαＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０１８５】
増幅されたニュートロカインαＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ９０をＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡを一緒に連結する。ニュートロカインαＤＮＡの制限されたｐＱＥ９０ベクターへの挿入は、ニュートロカインαタンパク質のコード領域を、ＩＰＴＧ誘導プロモーターの下流に、そして開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンにインフレームに配置する。
【０１８６】
連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントのＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されている。複数のコピーのプラスミドｐＲＥＰ４（これは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^ｒ」）を付与する）を含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用する。この株（これは、ニュートロカインαタンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一である）は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． 前出から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化ＤＮＡの同定を制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定により確認する。所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５〜１：２５０の希釈で大規模培養に接種する。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの吸光度（「ＯＤ６００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベートする。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により採集する。
【０１８７】
次いで、細胞を６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ ８中で３〜４時間、４℃で撹拌する。細胞細片を、遠心分離によって除去し、そしてニュートロカインαを含有する上清をニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高親和性で結合させ、そして単回の１工程手順（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ， １９９５， ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，
前出）で精製し得る。簡単には、上清を１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、カラムをまず６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８中でロードし、次いで１０容量の６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、そして最後にニュートロカインαで６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０１８８】
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ Ｎａ−アセテート、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによって再生する。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定化する間に、首尾良く再折り畳みし得る。推奨される条件は、以下の通りである：直線６Ｍ−１Ｍ尿素勾配を使用して、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４（プロテアーゼインヒビターを含有する）中で再生する。再生は、１．５時間以上の時間行われるべきである。再生した後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
６）緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最後の透析工程によって除去する。精製されたタンパク質を４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０１８９】
（実施例１ｂ： ニュートロカインαのＥ． ｃｏｌｉ中での発現および精製）
細菌発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例において細菌発現について使用する。（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、そして複製の細菌起源（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．（前出）から市販されるニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を用いるアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含む。このようなエレメントは、ポリぺプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、そのペプチドのカルボキシ末端に共有結合された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６ Ｘ Ｈｉｓタグ」）を有するそのポリぺプチドを生成するような様式で挿入され得るように配置される。しかし、この実施例では、６つのＨｉｓコドンの翻訳が防止され、それゆえポリぺプチドが６ Ｘ Ｈｉｓタグなしに産生されるように、ポリぺプチドコード配列を挿入する。
【０１９０】
細胞外ドメイン配列を含むニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、寄託されているｃＤＮＡクローンから、ニュートロカインαタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列、およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ｐＱＥ６０ベクターへのクローニングを容易にするための制限部位を含有するさらなるヌクレオチドを、５’および３’配列のそれぞれに付加する。
【０１９１】
タンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、下線を付したＢｓｐＨ制限部位、続いて図１のニュートロカインα配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１７ヌクレオチドを含有する配列５’ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧ ３’（配列番号１２）を有する。当業者は、当然に、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列中の点が、その形態の細胞外ドメインよりも短いか長い完全なタンパク質の所望の部分を増幅するように変化され得ることを理解する。３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて２つの終止コドン、および図１のニュートロカインαＤＮＡ配列中のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含有する配列５’ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１３）を有する。
【０１９２】
増幅されたニュートロカインαＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０は、ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、次いで消化されたＤＮＡは、一緒に連結される。ニュートロカインαＤＮＡの、制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、その付随する終止コドンを含むニュートロカインαタンパク質コード領域を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、そして開始ＡＵＧとインフレームに配置する。付随する終止コドンは、挿入点の下流の６つのヒスチジンコドンの翻訳を防止する。
【０１９３】
連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に記載されるような標準的な手順を使用して、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換する。ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎｒ」）を付与する、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含有するＥ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される例示的な実施例を行うために使用する。この株（これは、ニュートロカインαタンパク質を発現するために適した多くのもののうちの唯一のものである）は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．（前出）から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖する能力によって同定する。耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そしてクローンＤＮＡの同定を制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１９４】
所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補充したＬＢ培地中の液体培養物中で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、約１：２５〜１：２５０の希釈で大培養物を接種する。細胞を、０．４と０．６の間の６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）まで培養させる。次いで、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することによって、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。続いて、細胞をさらに３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって回収する。
【０１９５】
次いで、細胞を、６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ８）中で４℃で３〜４時間撹拌する。細胞細片を、遠心分離によって除去し、そしてニュートロカインαを含有する上清を、２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６）に対して透析する。あるいは、タンパク質を、５００ｍＭ ＮａＣｌ， ２０％グリセロール、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ７．４（プロテアーゼインヒビターを含有する）に対して透析することによって首尾良く再折り畳みし得る。再生した後、タンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し得る。あるいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程を、純粋なニュートロカインαタンパク質を得るために使用し得る。精製されたタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０１９６】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるニュートロカインαタンパク質のクローニングおよび発現）
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ ＧＰを使用して、その天然に付随する細胞内配列および膜貫通配列を欠失するタンパク質の細胞外ドメインをコードするクローン化したＤＮＡを、バキュロウイルスに挿入して、バキュロウイルスリーダーおよびＳｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５ （１９８７）に記載される標準的な方法を使用して、ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインを発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）、およびＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような都合の良い制限部位を含有する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスの簡単な選択のために、プラスミドは、同じ方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する。挿入された遺伝子は、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成するための、野生型ウイルスＤＮＡでの細胞媒介性相同組換えのための、ウイルス配列が両側に隣接する。
【０１９７】
多くの他のバキュロウイルスベクターは、当業者が容易に理解するように、構築物が、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナル（必要であれば、シグナルペプチドおよびインフレームのＡＵＧを含む）を提供する限り、上記のベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）の代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９）に記載される。
【０１９８】
寄託されたクローンのニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインをコードし、ＡＵＧ開始コドン、ならびに図１（配列番号２）に示される天然に付随する細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列を欠くｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１に示すニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの配列の１８ヌクレオチド（タンパク質の細胞外ドメインの示された末端で始まる）を含有する配列５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣ ３’（配列番号１４）を有する。３’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位、続いて２つの終結コドン、および図１の３’コード配列に相補的なの１８ヌクレオチドを含有する配列５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１５）を有する。
【０１９９】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」， ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを本明細書中でＦ１と命名する。
【０２００】
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、そして必要に応じて、ウシ腸ホスファターゼを使用して、当該分野で公知の日常的な手順を使用して、脱リン酸化し得る。次いで、ＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と命名する。
【０２０１】
フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと一緒に連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）細胞）を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に拡大した。個々のコロニーからのＤＮＡを、ＢａｍＨＩを使用して消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって、ヒトニュートロカインα遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を同定する。クローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＡ２ＧＰニュートロカインαと命名する。
【０２０２】
５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いで、プレートを、５時間２７℃でインキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで、２７℃で４日間培養を続ける。
【０２０３】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載されるようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するｇａｌ発現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをマイクロピペッター（エッペンドルフ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むマイクロ遠心チューブ中に再懸濁し、そして組換えバキュロウイルスを含有する懸濁物を使用して、３５ｍｍのディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。この組換えウイルスを、Ｖ−ニュートロカインαと呼ぶ。
【０２０４】
ニュートロカインα遺伝子の発現を評価するために、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＳｆ９細胞をグレース培地中で増殖させる。細胞を、組み換えバキュロウイルスＶ−ニュートロカインαで、約２の感染の多重度（「ＭＯＩ」）で感染させる。放射標識されたタンパク質が所望の場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可能）で置き換える。４２時間後に、５μＣｉの^３５Ｓメチオニンおよび５μＣｉの^３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞を１６時間さらにインキュベートし、次いで遠心分離によって回収する。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてオートラジオグラフィー（放射標識されている場合）により分析する。
【０２０５】
精製されたタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列のミクロシークエンシングは、タンパク質の細胞外ドメインのアミノ末端配列、従って分泌シグナルペプチドの切断点および長さを決定するために使用され得る。
【０２０６】
（実施例３：哺乳動物細胞中でのニュートロカインαのクローニングおよび発現）
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が隣接する介在配列が挙げられる。非常に有効な転写を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかし、細胞性エレメントもまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０２０７】
あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株において発現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０２０８】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に取り込まれる増幅遺伝子（単数または複数）を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０２０９】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットのプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。
【０２１０】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドｐニュートロカインα ＨＡを、ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインをコードする寄託されたｃＤＮＡの部分を、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．から入手し得る）内へクローニングすることによって作製する。ポリぺプチドの可溶性の、分泌された形態を生成するために、細胞外ドメインをヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リーダー配列に融合する。
【０２１１】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）血液凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易にする、「ＨＡ」タグ）をコードするいくつかのコドン、続いて終結コドンおよび配列されたポリアデニル化シグナルを含み、その結果ｃＤＮＡは、都合良くＣＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結し得る。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７ （１９８４）によって記載されたインフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合体は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いて組み換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩは、さらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０２１２】
ニュートロカインαポリぺプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域へクローン化する。プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。寄託されたクローンのニュートロカインα ｃＤＮＡを、上記のＥ．ｃｏｌｉにおけるニュートロカインαの発現のためのベクターの構築についてと同様に、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。本実施例において使用される適切なプライマーは、以下を含む。下線のＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子からの分泌リーダーペプチドをコードする配列、およびニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’ ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣ ３’ （配列番号１６）。下線のＢａｍＨＩ制限部位、終止コドンの直前の３’コード配列に相補的なヌクレオチドの１８を含む３’プライマーは以下の配列を有する：５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’ （配列番号１７）。
【０２１３】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩで消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥへ形質転換し（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７から入手可能）、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、ニュートロカインα細胞外ドメインをコードするフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。
【０２１４】
組換えニュートロカインαの発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載のＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記のように発現ベクターで形質転換する。細胞をベクターによるニュートロカインαの発現のための条件下でインキュベートする。
【０２１５】
ニュートロカインα−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、^３５Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記に引用された）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物が細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては観察されない。
【０２１６】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
ベクターｐＣ４を、ニュートロカインαタンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。ニュートロカインαポリぺプチドの可溶性の、分泌された形態を生成するために、細胞外ドメインをコードする寄託されたｃＤＮＡの部分を、ヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リーダー配列に融合する。このベクタープラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドで形質転換されるチャイニーズハムスター卵巣細胞または他のジヒドロ葉酸活性を欠如する細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ， Ｆ．Ｗ．， Ｋｅｌｌｅｍｓ， Ｒ．Ｍ．， Ｂｅｒｔｉｎｏ， Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ， Ｒ．Ｔ．， １９７８， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ， Ｊ．Ｌ．およびＭａ， Ｃ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３（１９９０）、Ｐａｇｅ， Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ， Ｍ．Ａ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。このアプローチは、増幅遺伝子（単数または複数）の１，０００を越えるコピーを有する細胞株を開発するために使用され得ることは、当該分野で公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、細胞株は、宿主細胞の染色体（単数または複数）に取り込まれる増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０２１７】
プラスミドｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８５年３月： ４３８−４４７）の長末端反復（ＬＴＲ）の目的の強力なプロモーターの遺伝子、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントの遺伝子の発現を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする以下の単一制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）からの長末端反復のために使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならびに類似の系を使用して、哺乳動物細胞中で調節された方法でニュートロカインαを発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ， Ｈ． １９９２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使用し得る。染色体に挿入された目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクションに基づいて選択し得る。開始において２つ以上の選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有用である。
【０２１８】
プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ついでウシ小腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０２１９】
ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列（リーダー配列を含む）を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。下線を付したＢａｍＨＩ部位、続いてＫｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダーペプチドをコードする配列、およびニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下の配列を含む： ５’ ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣ ３’ （配列番号１６） 。下線を付したＢａｍＨＩ、および終結コドンの直前の３’コード配列に相補的なヌクレオチドの１８を含む３’プライマーは、以下の配列を含む： ５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’ （配列番号１７）。
【０２２０】
増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１％アガロースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１
Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０２２１】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートと１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日の後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローンが１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によってか、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２２２】
（実施例４：ニュートロカインα ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用される）によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるニュートロカインα遺伝子の発現を試験した。ニュートロカインαタンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブ（配列番号１）を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^ＴＭＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の説明書に従って、^３２Ｐで標識した。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^ＴＭカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って、精製した。次いで、精製した標識化プローブを使用して、ニュートロカインαｍＲＮＡについて、種々のヒト組織を試験した。
【０２２３】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^ＴＭ ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って、標識化プローブで試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続いて、ブロットを取り付け、そして−７０℃にて一晩フィルムに暴露し、そして標準的な手順に従ってフィルムを現像した。
【０２２４】
本発明が、上記説明および実施例に特に記載したものとは別のやり方で実施され得ることは明らかである。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲内にある。
【０２２５】
本明細書中で引用された全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌文献、研究室マニュアル、本、または他の文献を含む）の開示が、本明細書中に参考として援用される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号１に記載の完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【公開番号】特開２０１２−４４９９９（Ｐ２０１２−４４９９９Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４２２５５（Ｐ２０１１−２４２２５５）
【出願日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【分割の表示】特願２００９−１２９６９（Ｐ２００９−１２９６９）の分割
【原出願日】平成８年１０月２５日（１９９６．１０．２５）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】