ニューロトロフィンの精製
【課題】治療用途に適した、成熟ＮＧＦを含むニューロトロフィンの大規模な精製方法が提供される。
【解決手段】ニューロトロフィンを、様々なあまり望ましくない誤って加工され、誤って折り畳まれた、サイズ、グリコシル化もしくは荷電型から、逆相液体クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーカラム等によって分離する手段を使用する。また、これらの変種が実質的に含まれない成熟ＮＧＦを含むニューロトロフィンの組成物も製造することができる。
【解決手段】ニューロトロフィンを、様々なあまり望ましくない誤って加工され、誤って折り畳まれた、サイズ、グリコシル化もしくは荷電型から、逆相液体クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーカラム等によって分離する手段を使用する。また、これらの変種が実質的に含まれない成熟ＮＧＦを含むニューロトロフィンの組成物も製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのニューロトロフィン、より詳細には神経成長因子（ＮＧＦ）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、及びニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）を、特に細菌もしくは哺乳動物細胞発酵により産生される場合に、これらに付随する変種、不純物、及び汚染物質から精製するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
比較的純粋で生物学的に活性なポリペプチド及びタンパク質を大量に生産することは、ヒトと動物の医薬製剤、酵素及びその他の特殊化学製品の製造に対して経済的に重要である。多数のタンパク質の生産に対して、多量の外来性タンパク質を哺乳動物の宿主細胞及び細菌及びその他の宿主細胞中に発現しうることから、組換えＤＮＡ技術が選択方法になった。
【０００３】
哺乳動物ＮＧＦ（マウスＮＧＦ）の一次構造は、非特許文献１によって最初に解明された。その前駆物質であるプレプロＮＧＦの一次構造は、マウスＮＧＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推論された（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
相同的ヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）遺伝子もまた同定された（非特許文献４；特許文献１）。マウスＮＧＦに対するその相同性は、アミノ酸とヌクレオチド配列レベルでそれぞれ約９０％と８７％である。天然に生じるヒトＮＧＦは希少であるため、ヒトＧＮＦは生化学的に細かく詳細に特徴付けるのに充分な量では天然源から調製されていない。
【０００５】
ＮＧＦに関連する更なる神経栄養因子がそれ以降に同定されている。これらには、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（非特許文献５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、及びニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（非特許文献９）が含まれる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの遠いメンバーであるＧＤＮＦとニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ：「ＮＴＮ」）は、交感感覚神経細胞及び中枢神経系神経細胞に対する二つの最近同定された構造的に関連している強力な生存因子である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
組換えタンパク質を生産するには、そのタンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞に形質移入し、組換えタンパク質の発現に好ましい条件下で細胞を成長させる。原核生物の大腸菌が、低コスト高収量で組換えタンパク質を生産することを可能にすることから、好まれる宿主であった。タンパク質をコードするＤＮＡの一般的な細菌での発現に関しては、細胞外又は周辺質担体タンパク質に対する細菌遺伝子と非細菌遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ分子に関する特許文献２、凝集体形成ポリペプチドとの外来性ポリペプチドの同時生産に関する特許文献３、ＩＧＦ−ＩのようなポリペプチドとのｔｒｐＬＥ融合とｔｒｐプロモーター／オペレーターを持つ発現ベクターに関する特許文献４、外来性タンパク質と共に含む発現調節配列に関する特許文献５及びＩＧＦ−Ｉをコードしているもののような特異的環状ＤＮＡプラスミドに関する特許文献６を含む多くの米国特許が存在する。
【０００７】
遺伝子操作により作成されるバイオ医薬品は、典型的には種々の多様な宿主細胞汚染物質を含んでいる上清から精製される。特にＮＧＦは、多数の異なった方法を使用し、様々な度合いの努力と成功度をもって様々な度合いに精製されたことは報告されている。例えば、非特許文献１４、ＮＧＦのＣＨＯ細胞による産生を開示している特許文献７、非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７を参照せよ。これらの努力は主として研究室規模のものであった。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５２８８６２２号
【特許文献２】米国特許第４５６５７８５号
【特許文献３】米国特許第４６７３６４１号
【特許文献４】米国特許第４７３８９２１号
【特許文献５】米国特許第４７９５７０６号
【特許文献６】米国特許第４７１０４７３号
【特許文献７】米国特許第５０８２７７４号
【非特許文献１】AngelettiとBradshaw（Proc.Natl.Acad.Aci. USA 68:2417(1971)）
【非特許文献２】Scottら Nature 302:538(1983)
【非特許文献３】Ullrichら Nature 303:821(1983)
【非特許文献４】Ullrich, Symp. on Quan.Biol., Cold Spring Harbor 48:435(1983)
【非特許文献５】Leibrockら, Nature, 341:149-152(1989)
【非特許文献６】Kaishoら, FEBS Lett., 266:187(1990)
【非特許文献７】Maisonpierreら, Science, 247:1446(1990)
【非特許文献８】Rosenthalら, Neuron, 4:767(1990)
【非特許文献９】Berkmeierら, Neuron, 7:857-866(1991)
【非特許文献１０】Linら, Science 260:1130-1132(1993)
【非特許文献１１】Hendersonら, Science 266:1062-1064(1994)
【非特許文献１２】Buj-Belloら, Neuron 15:821-828(1995)
【非特許文献１３】Kotzbauerら Nature 384:467-470(1996)
【非特許文献１４】Longoら（IBRO Handbook,vol.12,pp3-30(1989))
【非特許文献１５】BruceとHeinrich（Neurobio. Aging 10:89-94(1989))
【非特許文献１６】Schmelzerら（J.Neurochem. 59:1675-1683(1992))
【非特許文献１７】Burtonら（J.Neurochem. 59:1937-1945(1992))
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、変種が本質的に含まれない製薬的純度と高収量を達成できるような組換えヒトＮＧＦの調製的単離は、従来技術が解決できなかった課題であった。
【００１０】
従って、ニューロトロフィン、特にＮＧＦ及びＮＧＦファミリーのニューロトロフィンを、その変種とその他の分子から、また高いｐＩを持つ他のポリペプチドから選択的に分離するための効率的なプロトコールに対する必要性が従来から存在している。大きな規模でニューロトロフィンを精製する方法は、治療上の必要性を満たすために、発酵ブロス、溶解細菌もしくは哺乳動物細胞を含む様々な供給源からの出発原料に適用できなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
更に、本発明者らは、過去には知られておらず分離が困難なニューロトロフィン変種、例えばＮＧＦ変種を発見したので、ここに提供する方法は、望ましくない変種が実質的に含まれない、ヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）、ｒｈＮＴ−３及びｒｈＮＴ−４／５及びその所望の遺伝子操作突然変異体を含む組換えニューロトロフィンを、商業的に有用な量で提供するために特に有用である。本発明のかかる目的とその他の目的は当業者には明らかであろう。
【００１２】
本発明の一実施態様において、ニューロトロフィン、特に高度に相同的なレセプターファミリー（ｔｒｋｓ）、好ましくはｒｈＮＧＦ、ｒＮＴ−３、ｒｈＮＴ−４／５、ｒｈＢＤＮＦもしくはその所望の遺伝子操作形態による認識を分かつＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、及びＢＤＮＦを含む、特にＮＧＦファミリーのものを、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製する方法が提供される。
【００１３】
ここに報告したように、ニューロトロフィンの組換え生産から生じるある種の望ましくないニューロトロフィン変種を本発明者らが発見したことに鑑みると、ＨＩＣの使用は、ニューロトロフィンの化学的に異なる形態ともしくは誤って折り畳まれた形態でさえも、所望の正しく折り畳まれた無傷のニューロトロフィンから分離することを可能にする。取り除くことができる変種は、部分的にプロセシングされた前駆配列、グリコシル化された成熟及び前駆物質含有形態（真核生物細胞培養にある場合）、及び誤って折り畳まれ部分的に折り畳まれた変種（一般にインビトロ折り畳み工程が使用される場合、細菌細胞培養からのもの）を含む、疎水性が成熟した正しく折り畳まれた無傷のニューロトロフィンとは異なるものである。例えば、ＨＩＣは、ＮＧＦの部分的にプロセシングされた前駆配列、ＮＧＦのグリコシル化された種及び前駆体（真核細胞培養に存在する場合）、及び誤って折り畳まれ部分的に折り畳まれた変種（一般に細菌細胞培養からでインビトロ折り畳み工程からのもの）を成熟ＮＧＦの混合物から除去するのに特に有用である。ＮＧＦは一つのＮ結合グリコシル化部位をＡｓｎ４５に有している。細菌中に発現された再折り畳みｒｈＮＴ−４／５の場合は、ＨＩＣは、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を間違って折り畳まれた形態から分離する。ここに記載した方法によれば、ニューロトロフィンは本質的にこれらの変種を含まない。ニューロトロフィンの精製に対して、ＨＩＣ樹脂官能基は、オクチル及びブチル基も有用であるが、好ましくはフェニル基である。特に好ましい実施態様は、フェニル・トーヨーパール（Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブスティチューション（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｌｏｗ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＴＳＫ−フェニル５ＰＷ（ＴＳＫ−Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ）等々のＨＩＣ樹脂である。
【００１４】
他の実施態様では、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのもの、好ましくｒｈＮＧＦ、ｒＮＴ−３、ｒｈＮＴ−４／５もしくはその所望の遺伝子操作形態を、負荷修飾変種、例えば成熟ニューロトロフィン由来の酸化、ｉｓｏａｓｐ（イソアスパラギン酸）及び脱アミド形態を分離する調製的カチオン交換クロマトグラフィーの使用によって精製する方法が提供される。特に好適な実施態様は、ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤ ＳＯ３、又はポリアスパラギン酸樹脂を用い、なかでもポリキャット（ＰｏｌｙＣＡＴ）Ａが特に好適である。最も好適には、大規模のＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス樹脂又はフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂が使用される。
【００１５】
本発明の更に他の実施態様では、ＨＩＣとカチオン交換クロマトグラフィーの両方が、所望のニューロトロフィン、例えば実質的に均質な、すなわち例えば誤って折り畳まれた変種及び化学変種のような加工及び負荷変種の双方を実質的に含まず、タンパク含量に関してもまた実質的に純粋である組換え成熟ＮＧＦ、好ましくはヒトＮＧＦの組成物を調製するために使用される。
【００１６】
この発明の一実施態様では、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのもの、好ましく組換えヒトＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５及びその所望の遺伝子操作形態を、関連する所望されない変種、例えば発酵、プロテアーゼ切断変種、グリコシル化変種、誤って折り畳まれた変種を、逆相液体クロマトグラフィーによって精製する改良方法が提供される。より好ましくは、ＮＧＦは１２０／１２０又は１１８／１１８ホモ二量体形である。ここに記載した方法によれば、ニューロトロフィンは、最も好ましくは変種を本質的に含まない。
【００１７】
他の実施態様においては、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのものを、生理的ｐＨを含む溶出条件を使用して関連する変種から精製する方法が提供される。
更に他の実施態様では、均一性がかなり改善される結果が得られるニューロトロフィンの精製方法が提供される。
【００１８】
他の実施態様において、本発明は、ＮＧＦファミリーのニューロトロフィンをその変種から分離する方法であって、
ａ）ニューロトロフィンとその変種を含む緩衝液を約５から８のｐＨで疎水的相互作用クロマトグラフィーカラムに装填し；
ｂ）カラムを洗浄し、
ｃ）約５から８のｐＨの緩衝液でニューロトロフィンを溶出させ、
ｄ）約５から８のｐＨでカチオン交換クロマトグラフィーカラムにニューロトロフィン含有溶出物を装填し、
ｅ）約５から８のｐＨ、好ましくはｐＨ６で塩勾配の緩衝液でカラムからニューロトロフィンを溶出させる、
ことを含んでなる方法を提供する。ニューロトロフィンは最も好ましくはｒｈＮＧＦである。
【００１９】
本発明の一実施態様では、好ましくはＮＧＦ分画であるニューロトロフィン分画から宿主細胞タンパク質を効果的に除去するシリカゲルクロマトグラフィー工程が提供される。
【００２０】
本発明の一実施態様では、１２０アミノ酸ＮＧＦがトリプシン様プロテアーゼ処理を受けて、ＶＲＲＡのＣ末端から末端ＲＡジペプチドを選択的に除去して、１１８種を生成する方法の工程が提供される。固定化トリプシンカラムが好適である。
【００２１】
本発明はまた本発明の方法により調製されたニューロトロフィン組成物と製剤及び組成物と製剤への用途にも関する。提供されるものは、実質的に均一な、すなわち例えば誤って折り畳まれた変種と化学変種のような加工及び負荷変種の双方とも実質的に含まず、またタンパク質含量に関して実質的に純粋であるニューロトロフィンの組成物である。好ましくは、成熟ヒトＮＧＦ、成熟ヒトもしくはラットＮＴ−３、及び成熟ヒトＮＴ−４／５がこの形で提供される。好適な実施態様では、ＮＧＦは１２０種で、より好ましくは１１８型であり、最も好ましくはホモ二量体、例えば１１８／１１８である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
＜定義＞
本明細書において、「ニューロトロフィン」とは、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、そして好ましくはヒトを含む任意の種から、また天然であろうと、合成であろうと組換え生産されたものであろうと、任意のソース由来の、未変性配列もしくは遺伝子操作形態のニューロトロフィン、好ましくはＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、及びＢＤＮＦを含むＮＧＦファミリーのニューロトロフィンをいう。例えば、「ＮＧＦ」は、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、そして好ましくはヒトを含む任意の種から、また天然であろうと、合成であろうと組換え生産されたものであろうと、任意のソース由来の神経成長因子をいう。好ましくは、ニューロトロフィンは組換え的に生産される。好適な方法では、ニューロトロフィンはクローン化され、そのＤＮＡは例えば哺乳動物細胞、細菌細胞中で発現される。ここに教示したプロセスと方法はニューロトロフィン、ＧＤＮＦ及びニュールツリンにも適用し得る。
【００２３】
ヒトの用途に対して好ましいものは、ヒト未変性配列、成熟ＮＧＦであり、より好ましくは１２０アミノ酸配列、更により好ましくは１１８アミノ酸配列である。より好適には、この未変性配列ＮＧＦは組替え的に生産される。ヒトプレプロＮＧＦとヒト成熟ＮＧＦに対する好適なアミノ酸配列は、出典明示によりここに特に取込む米国特許第５２８８６２２号によって提供される。更なる翻訳後の修飾のない１２０アミノ酸型はホモ二量体形（つまり、１２０／１２０）における好適な型である。更により好適なものは、更なる翻訳後の修飾のない、特にホモ二量体のような１１８型（つまり、１１８／１１８）である。
【００２４】
「実質的に純粋な」が意味するところは、少なくとも７０％のニューロトロフィン、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、９５％もしくは９９％と増大する、全タンパク質に対する全ニューロトロフィン、例えばＮＧＦの純度の度合いである。特に好適な純度は少なくとも９５％である。「本質的に純粋な」が意味するところは、組成物が、所望のニューロトロフィンについて少なくとも９０％もしくはそれ以上純粋であることである。
【００２５】
「ニューロトロフィン変種が実質的に含まれない」が意味するところは、（望ましさが劣るニューロトロフィン種を含む）全ニューロトロフィンに対する所望のニューロトロフィンのパーセントが少なくとも７０％の所望のニューロトロフィン種、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、９３％、９５％もしくは９９％と増大する組成物である。「本質的に含まれない」が意味するところは、組成物が所望のニューロトロフィンを少なくとも９０％あるいはそれ以上含むことである。特に好適な量は、少なくとも９５％の所望のニューロトロフィン、例えば正しく折り畳まれた無傷の１１８／１１８ｒｈＮＧＦ種である。その他の望まれない種もしくは型は、発酵もしくは精製プロセスから生じる、例えば変更された負荷変種のような、誤ってプロセシングされた型又は化学変種、又は好ましくはここに開示した前記のものの全てである。例えば、ＮＧＦが細菌中での合成後にインビトロで折り畳まれる場合、「種」又は「変種」は誤って折り畳まれた型あるいは部分的に折り畳まれた型を含み得る。
【００２６】
「誤って折り畳まれた」変種が意味するところは、そのシステイン残基対合により、もしくは遊離しているかブロックされている特定のシステイン残基により、ニューロトロフィンとは異なるニューロトロフィンの変種である。誤って折り畳まれた変種もまたニューロトロフィンと同じシステイン対合を有し得るが、誤った折り畳みから生じる異なった三次元高次構造を有する。
【００２７】
「化学」変種が意味するところは、例えば変更された電荷を有することにより、カルバミル化、脱アミド、酸化、グリコシル化、又はタンパク分解性切断により、ニューロトロフィンとは化学的に異なる変種である。
【００２８】
この発明のカラムの観点において、緩衝液は、一般に、約５から８の範囲のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを調節する緩衝液には、例えば、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ジメチルマロン酸、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、トリスバッファー、例えばトリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、グリシンアミド、ＢＩＣＩＮＥ、グリシルグリシン、及びホウ酸塩バッファーが含まれる。好適な緩衝液はＭＯＰＳＯバッファーである。
【００２９】
ここにおいて使用するところでは、「アルコール」と「アルコール溶媒」とは、アルコールに対して通常使用されている技術用語の意味を持つものであり、好ましくは、１から１０の炭素原子を持つアルコール、より好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノ−ル、もしくはｔ−ブタノール、並びにグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコール、最も好ましくはエタノールもしくはイソプロパノールである。このようなアルコールは、水溶液に添加したときに、溶液極性を減少させることにより溶液の疎水性を増大させる溶媒である。
【００３０】
ＭＯＰＳＯは３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸である。ＨＥＰＥＳはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸である。試薬アルコールは９５容量部（特別に変成したアルコール・フォームラ３Ａ及び５容量部のイソプロピルアルコール）である。ＭＥＳは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸である。ＵＦ／ＤＦは限外濾過／ダイアフィルトレーションを意味する。ＴＭＡＣはテトラメチルアンモニウムクロリドである。ＴＥＡＣはテトラエチルアンモニウムクロリドである。ＮＧＦ−１２０は完全長１２０／１２０神経成長因子を意味する。ＮＧＦ−１１８は１１８残基のホモ二量体成熟ＮＧＦを意味する。酸化ＮＧＦは、成熟未変性ＮＧＦの約８０％の生物学的活性があるとここに報告されているＮＧＦ変種分子であるメツルフォキシド（Ｍｅｔｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）３７を意味する。ＩｓｏａｓｐＮＧＦはＮＧＦ異性体化変種分子、Ａｓｐ９３を意味する。脱アミドＮＧＦは、Ａｓｐ４５に転換されたＡｓｎ４５を有するＮＧＦを意味する。ＲＮＧＦはそのＮ末端に余分なアルギニン残基を持つＮＧＦ分子を意味する。ＣＨＯはチャイニーズハムスター卵巣細胞を意味する。
【００３１】
ここに記載された樹脂は、マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換（バイオラッド研究所、強いカチオン交換、ＳＯ３官能基、名目粒径５０ミクロン、名目孔径１０００Ａ）、シリカゲル（未誘導体化）、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブスティチューション（ファーマシア；高度に架橋した６％アガロース；粒径４５−１６５ミクロン）、ＳＰ−セファロースＨＰ（ファーマシア；高度に架橋した６％アガロース；粒径３４ミクロン）、フェニル・トーヨーパール６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ；粒径４０−９０ミクロン）、及びフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３−６５０Ｓ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（ドイツ）の米国関連会社であるＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ；粒径２５−４０ミクロン）を含む。
【００３２】
＜発明を実施するための形態の説明＞
ニューロトロフィンは、神経系の発達と維持に重要な役割を果たす小さい塩基性タンパク質のファミリーに属する。このファミリーの最初に同定され恐らくは最もよく理解されているメンバーは神経成長因子（ＮＧＦ）である。１９９２年１２月８日発行の米国特許第５１６９７６２号を参照せよ。
【００３３】
最近、ＮＧＦと類似した機能を有している配列的に関連しているが別個のポリペプチドが同定された。例えば、ニューロトロフィン−２（ＮＴ２）ともいわれる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が、Leibrockら（Nature, 341:49-159[1989]）によりクローン化され配列決定された。
【００３４】
幾つかの研究グループが、ニューロン因子（ＮＦ）と当初は呼ばれ、今はニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）といわれる神経栄養因子を同定した（Ernforsら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87:5454-5458[1990]; Hoehnら, Nature, 344:339[1990]; Maisonpierreら, Science, 247:1446[1990]; Rosenthalら, Neuron, 4:767[1990]; JonesとReichardt, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87:8060-8064[1990]; Kaishoら, FEBS Lett., 266:187[1990]）。
【００３５】
（ＮＴ４又はＮＴ５といわれる）ニューロトロフィン−４／５が同定された（Hallbookら, Neuron, 6:844-858[1991]; Berkmeierら, Neuron, 7:857-866[1991]; Ipら, Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 89:3060-3064[1992]）。１９９４年１１月１５日に発行された米国特許第５３６４７６９号は、ヒトＮＴ−４／５及びその組換え発現方法を開示しており、出典明示によりここに取り込まれる。
【００３６】
また報告されているのは、キメラ及びパントロピックニューロトロフィン、例えば１９９６年１月３０日に発行された米国特許第５４８８０９９号、Urferら（EMBO J. 13(24):5896-909(1994)）及び、ニューロトロフィンが、一以上のレセプターに結合するように修飾されたか、未変性ニューロトロフィンに有意な程度では通常はないレセプター結合活性を含む（ここに出典明示により取込まれる）１９９５年１２月１４日公開のＷＯ９５／３３８２９に報告されたようなものである。
【００３７】
特に興味深いものはＭＮＴＳ−１及びＤ１５Ａ ＮＴ３と命名されたニューロトロフィンである。また特に興味深いものは、ＮＧＦアミノ酸バックボーンを有するがｔｒｋＡ以外のレセプター、例えばｔｒｋＢ又はｔｒｋＣに結合するように修飾されたニューロトロフィンである。
【００３８】
ＮＴ−３のｔｒｋレセプターへの結合の原因であるＮＴ−３の対応する位置からのアミノ酸を持つＮＧＦにアミノ酸置換がなされたものが好適である。このようなＮＧＦ突然変異体は、ＮＧＦ薬物動態学的及び精製挙動を保持しながらＮＴ−３様レセプター結合活性を有する（Urferら, Biochemistry 36(16):4775-4781(1997)）。これらのＮＧＦ突然変異体はまたｔｒｋＡ結合活性を欠き得る（Shihら, J.Biol.Chem. 269(44):27679-86(1994)）。このようなＮＧＦ突然変異体がここに記載する本発明の用途に対して特に好適なニューロトロフィンである。
【００３９】
組換えヒトニューロトロフィン、例えばｒｈＮＧＦの単離は、種々の多様な宿主細胞汚染物質からのタンパク質の分離を含む。各工程は、十分な分離が生じることを可能にする特別な緩衝液を含む。ニューロトロフィンに対する最後もしくは最後から二番目のプロセシング工程は、通常のクロマトグラフィー媒体を使用して同時精製する幾つかのニューロトロフィン変種の存在により複雑化する。再折り畳み工程が回収・精製工程に含まれる場合、変種はニューロトロフィンの誤って折り畳まれた型を含む。変種はまたニューロトロフィンとは化学的に異なるもの、例えばカルバミル化、脱アミド、脱アミドもしくはタンパク分解性に切断された形態をも含みうる。ＮＧＦの場合、これらの種は主に二量体型−ホモ二量体、例えば１１８／１１８が所望の場合、１２０／１２０又は１１７／１１７、又はヘテロ二量体、例えば１２０／１１８、１１７／１１８−、化学的に修飾された変種−イソアスパラギン酸、モノ酸化、グリコシル化変種、Ｎ末端及びＣ末端切断型、及びその二量体からなる。
【００４０】
本発明は、ニューロトロフィン、特にｒｈＮＧＦを、例えばアルツハイマー病、糖尿病及びエイズ関連神経障害を含む抹消神経障害等々の治療のような治療用途に十分な量で大規模に生産することを可能にする。
【００４１】
ＮＧＦとその他のニューロトロフィン、好ましくはＮＧＦファミリーのものとの間の配列と高次構造の類似性に鑑みると、本発明の方法は、誤ってプロセシングされた変種、誤って折り畳まれもしくは部分的に折り畳まれた変種、グリコシル化変種及び／又は負荷変種を実質的に含まないこれらのニューロトロフィンを調製するために適用しうる。本発明において、これらとその他の密接に関連した変種からニューロトロフィンを選択的に分離するのに望ましいカラム樹脂と条件が特定される。
【００４２】
ニューロトロフィンには、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６、ＢＤＮＦ、及びそのヘテロ二量体、キメラもしくはパントロピック形を含む操作形態が含まれる。好ましくは、ニューロトロフィンはヒトあるいはヒトアミノ酸配列と高度に相同性を有するもので、ヒト配列に対して好ましくは８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、最も好ましくは９５％より多い相同性を有する。操作されたニューロトロフィンは、それが模倣する未変性ニューロトロフィンのｔｒｋレセプター結合機能の少なくとも５０％を保持し、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％を保持する。これらの操作された型は、ここに記載する方法において類似の性能を保持する未変性ニューロトロフィンの疎水的性質又は十分に高いｐＩを保持するものである。
【００４３】
以下に記載するように、ここに記載する方法は、ｒｈＮＧＦ、ｒｈＮＴ−３及びｒｈＮＴ−５に首尾よく適用された。例えば、大腸菌において作られたｒｈＮＴ−４／５が、封入体に単離され、還元され、封入体から可溶化された。還元されたＮＴ−４／５はＤＥセファロース・ファースト・フロー及びＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーによって部分的に精製された。Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・プールはグアニジン含有緩衝液中で２４時間の間再び折り畳まれた。ＮＴ−４／５の誤って折り畳まれた型はここに大規模なもので開示したクロマトグラフィーによって除去した。ＮＴ−４／５のカルバミル化及び切詰め型（誤ってプロセシングされた形態）が、大規模のカラム形式での高速カチオン交換クロマトグラフィーにより、ポリキャットＡ ＨＰＬＣ樹脂もしくはＳＰセファロースＨＰ樹脂で除去された。精製ｒｈＮＴ−４／５は製剤用に酸性緩衝液中に限外濾過されダイアフィルトレーションにかけられた。
【００４４】
本発明の一実施態様は、通常はニューロトロフィンを大抵の他の不純物から既に精製した後、典型的には製剤化の前の脱塩もしくはダイアフィルトレーションの前の最終工程又は最終に近い工程において、ニューロトロフィンをその関連する変種から精製することを含む。混合物中の関連した変種は、発酵の結果生じる変種残渣ばかりでなく、ニューロトロフィンが貯蔵もしくはプロセシング中に分解した場合に生成された変種も含みうる。
【００４５】
本発明の実施態様において使用するのに適したニューロトロフィンは、任意の手段により調製することができるが、好ましくは組替え的に調製される。ここで考察したニューロトロフィンをコードしている核酸分子は幾つかのソースから入手可能であり、例えば既知のＤＮＡ配列を用いて化学合成により、又は当業者に知られている標準的なクローニング法を使用することにより入手できる。例えばｈＧＮＦコード配列のようなニューロトロフィンを保有しているｃＤＮＡクローンは、ニューロトロフィンの既知の配列に基づいて特に設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して同定することができる。
【００４６】
ニューロトロフィンコード配列を有する分子を得る際には、分子を、選ばれた宿主細胞中に発現させるために適したクローニングベクター内に挿入する。クローニングベクターは、コード配列の効率的な転写、翻訳及びプロセシングに必要とされる好適な調節機能をもたらすように作成される。
【００４７】
ニューロトロフィンが組替え的に調製される場合、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを発現するために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母もしくはより高等な真核生物細胞である。この目的に対して適した原核生物は、古細菌及び真正細菌のような細菌を含む。好適な細菌は真正細菌、例えばグラム陰性もしくはグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属；桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）；シュードモナス属、例えば緑膿菌；ストレプトマイセス属；アゾトバクタ；根粒菌；ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）；及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）である。好適な大腸菌宿主には、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、大腸菌９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）が含まれる。これらの例は限定するものではなくむしろ例証のためのものである。
【００４８】
１９９５年１１月１６日に公開されたＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／３０６８６の全体を出典明示によりここに取込む。この刊行物は、そのＮＧＦの細菌合成とインビトロ折り畳みの記載が特に関連する。その方法から得られた生成物を本発明の精製方法により精製することができる。
【００４９】
上述の細菌の任意のものの突然変異体細胞を使用することもできる。細菌の細胞中におけるレプリコンの複製性を考慮に入れて好適な細菌を選択することは勿論必要である。例えば、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ種が、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＡ１７７、もしくはｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドがレプリコンを供給するために使用される場合、宿主として好適に使用することができる。
【００５０】
大腸菌株Ｗ３１１０は組換えＤＮＡ産物発酵に対するよく知られた宿主株であるので、好適な宿主もしくは親宿主である。好適には、宿主細胞は最小量のタンパク分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に対して内在性のタンパク質をコードしている遺伝子で遺伝的突然変異を行うように修飾することができ、そのような宿主の例としては、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔを持つ大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔｐｔｒ３を持つ大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４、完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡΔＥ１５Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ΔｄｅｇＰΔｏｍｐＴｋａｎ<ｒ>を持つ大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５２４４）、完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡΔＥ１５Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ΔｄｅｇＰΔｏｍｐＴΔｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを持つ大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失型変異体を持つ株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４、及び１９９０年８月７日に発行された米国特許第４９４６７８３号に開示された変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株がある。
【００５１】
ヒトＮＧＦは大腸菌中に発現された。ｈＮＧＦのβサブユニットをコードしている遺伝子の単離と配列及び大腸菌中での異種性タンパク質としてのその発現は米国特許第５２８８６２２号に記載された。そこでの教唆もまた哺乳動物細胞から生成した成熟ヒトＮＧＦを提供するのに好適である。組換え技術を使用して、ヒトβ−ＮＧＦはその他の哺乳動物のタンパク質を含まないように発現された。変化したアミノ末端を含む２つの遺伝子を用いて大腸菌中にｈＮＧＦを発現させた結果、融合タンパク質が発現したが、これはIwaiら（Chem.Pharm.Bull.34:4724(1986)）によって記載された。
【００５２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ニューロトロフィンをコードしているベクターのための適切な発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Beach及びNurse, Nature, 290:140(1981);１９８５年５月２日発行のＥＰ１３９３８３）;クルイヴェロミセス宿主［米国特許第４９４３５２９号; FleerらBio/ Technology, 9:968-975(1991)］、例えばＫ.ラクティス［MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.,737(1983)］、Ｋ.フラギリス(ATCC 12424), Ｋ.ブルガリカス (ATCC 16045)、Ｋ.ウィッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ.ワルティイ (ATCC 56,500), Ｋ. ドゥロソフィラルム［ATCC 36,906; Van den Bergら Bio/Technology,8:135(1990)］、Ｋ.サーモトレランス、及びＫ. マルクシアヌス;ヤロウィア[EP 402,226];ピチア・パストリス［EP183070; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol.,28:265-278(1988)］;カンディダ;トリコデルマ・リーシア (EP 244234); ニューロスポラ・クラッサ ［Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)］; シュワニオミセス・オクシデンタリスのようなシュワニオミセス［１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４５３８); 及び糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム［ＷＯ９１／００３５７ １９９１年１月１０日発行］、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデュランス[Balanceら, Biochem Biophys. Res. Commun.,112;284-289(1983); Tilburnら,Gene,26:205-221(1983); Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]及びクロカビ［Kellyら,EMBO J.,4:475-479(1985)］のような、多数の他の属、種、及び菌株が一般に利用でき、ここで有用である。
【００５３】
ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物からもまた誘導できる。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物培養由来であろうと無脊椎動物培養由来であろうと、任意の更に高等の真核生物細胞培養が適している。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、ボンビクス・モリのような宿主が特定されている。例えば、Luckowら, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Millerら, Genetic Engineering, Setlowら編 Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaedaら, Nature,315:592-594(1985)を参照のこと。形質移入には種々のウィルス株が公に利用できる。例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株があり、このようなウィルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入にここで使用することができる。ヒトＮＧＦは１９９３年１２月２１日に発行された米国特許第５２７２０６３号に報告されているように、昆虫細胞において生産されている。
【００５４】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として用いることができる。典型的には、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを含むように前もって操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートすることによって植物細胞は形質移入される。Ａ.トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡが、植物細胞宿主が形質移入されるようにその植物細胞宿主に移され、適切な条件下でニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを発現する。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる（Depickerら,J.Mol.Appl.Gen., 1:561(1982)）。また、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物細胞中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる（１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６）。
【００５５】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株［２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞（BHK, ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［CHO, UrlaubとChasin, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 (1980)］;マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather,Biol.Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 （CVI ATCC CCL 70）; アフリカミドリザルの腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）; ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝臓細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51); ＴＲＩ細胞［Motherら, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］; ＭＲＣ５細胞; ＦＳ４細胞; 及びヒト肝癌ライン(Hep G2)である。好適な方法はＣＨＯ細胞中の発現である。プレプロＮＧＦを含むヒトＮＧＦのエキソンを、適切なプロモーター及びベクターを使用して分泌された成熟ＮＧＦ（１１８及び１２０型を含む）の発現を達成するために使用することができる（米国特許第５２８８６２２号）。安定して形質移入された安定なＣＨＯ細胞の培養及びＮＧＦの分泌成熟型は本明細書の実施例において検討されるように、本発明において有用である。
【００５６】
宿主細胞に形質移入し、そして上述の発現又はクローニングベクターで好ましくは形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数の形質移入法が当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに一般に形質移入の成功が認められる。
【００５７】
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。SambrookらのMolecular Cloning：A Laboratory Manual［New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989］の１．８２節に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクトすることもできる。
【００５８】
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb（Virology, 52:456-457(1978)）のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら（J.Bact., 130:946(1977)）及びHsiaoら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA,76:3829(1979)）の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等々を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の方法については、Keownら（Methods in Enzymology(1990),Vol185:pp527-537）及び Mansourら（Nature,336:348-352(1988)）を参照のこと。
【００５９】
好適には、ｈＮＧＦの遺伝子が、メチオニン開始コドン、好ましくはUllrichら（Nature,303:821-825(1983)）により同定されたような二つのメチオニン開始コドンの一方を利用できるようにするためにベクター内に挿入される。ｈＮＧＦ遺伝子（Ullrichら, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, p.435(1983);米国特許第５２８８６２２号）は、転写開始コドンとして使用されそうな２つの殆ど隣接するメチオニンを有している（位置１は成熟ｈＮＧＦのＮ末端セリン残基をいう）。これに対して、ＮＧＦに対するマウス顎下腺ｃＤＮＡは、神経成長因子の最も完全に研究されているものであるが、１２１と１１９の位置のメチオニンに加えて１８７の位置にもメチオニンを有している。哺乳動物細胞中の発現に対する好適な実施態様では、プレプロＮＧＦ配列が存在する。
【００６０】
原核生物細胞がニューロトロフィンを生産するために使用される場合には、例えばSambrookらのMolecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989）において一般に記載されているようにしてプロモーターを構成的に又は人為的に誘導することができる適切な培地中で培養される。炭素、窒素、及び無機リン酸塩源以外に、あらゆる必要な補充物質を、単独もしくは複合窒素源のような他の補充物質又は培地との混合物として導入される適当な濃度で含めることもできる。
【００６１】
ニューロトロフィンを生産するために哺乳動物の宿主細胞が用いられる場合、これは種々の培地において培養することができる。ハム（Ham）のＦ１０（Sigma）、最小必須培地（[MEM] Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）及びダルベッコの改良イーグル培地（[DMEM], Sigma）のような市販培地が当該宿主細胞の培養に適している。また、HamとWallace, Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes及びSato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号;４６５７８６６号;４９２７７６２号; ５１２２４６９号;４５６０６５５号;ＷＯ９０／０３４３０;ＷＯ８７／００１９５;米国再発行特許第３０９８５号（これらの全ての開示を出典明示によりここに取込む）に記載された任意の培地を宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６２】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler編 (IRL Press at Oxford University Press,Oxford,1991)に見出すことができる。上記の方法は、ニューロトロフィンが細胞内に生産されようが、細胞膜周辺膣に生産されようが、あるいは培地に直接分泌されようが、使用することができる。
【００６３】
典型的には、培養液は適当な時間後に収集され、標準的な同定アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析のようなイムノアッセイ、又は生物学的アッセイ、例えばＰＣ１２細胞分化（Greene,L.A., Trends Neurosci. 7:91 (1986)）が実施される。ここに開示された変種の種類と程度を決定するためのアッセイは従来から知られているか、あるいは実施例において提供されもしくは引用される（例えば、出典明示によりここに取込むSchmelzerらJ.Neurochem.59 (5):1675-83(1992)及びBurtonら,J.Neurochem. 59(5):1937-45(1992)を参照）。
【００６４】
細胞から調製されるニューロトロフィン組成物は、好ましくはＨＩＣに先立って少なくとも一つの精製工程に通される。好適な精製工程の例には、回収すべきニューロトロフィン及び使用する出発培養に依存して、アフィニティクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換樹脂クロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、及び調製的ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようなタンパク質精製の他の方法を含むここに記載したものを含む。
【００６５】
ニューロトロフィンが培地中に直接分泌される一実施態様においては、培地を遠心分離により細胞片から分離し、清澄化された発酵ブロス又は培地を次にシリカゲルでの精製に使用する。シリカクロマトグラフィーに対しては、典型的にはニューロトロフィンポリペプチドがシリカ粒子に付着するように誘導体化されていないシリカ粒子にブロスを通す；シリカ粒子を洗浄して汚染物質を除去する；そしてアルコール性もしくは極性非プロトン溶媒とアルカリ土類、アルカリ金属もしくは無機アンモニウム塩を含む緩衝液でシリカ粒子からポリペプチドを溶出させる。
【００６６】
本発明の好適な実施態様では、ニューロトロフィンをその変種から分離し、またバルク汚染物質を減少させるためにマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーを用いる。この樹脂は、哺乳動物細胞培養からのニューロトロフィンの精製の初期の工程として、好ましくは収集細胞培地の分画に対して使用することができる。他の実施態様では、マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーは、最も好ましくはタンパク質再折り畳み工程の直後に使用される。このカチオン交換カラムの非常に高い流れ性により、大量の希薄な再折り畳みタンパク質又は収集細胞培地ニューロトロフィンを、例えばＨＩＣ又はＳＰ−セファロースのような次のクロマトグラフィー工程の前に、ニューロトロフィンがカラムに結合する条件を調節することにより、容易く濃縮することが可能になる。更に、樹脂のカチオン交換性により、非結合バルクタンパク質及びある種の誤ってプロセシングされた変種及び化学的に修飾された変種（例えば変更負荷、ＭＥＴ３７−酸化変種）の除去が可能になる。最も重要なことは、未変性のニューロトロフィンと疎水性が異なる誤ってプロセシングされた変種もしくは化学的に修飾された変種（例えば（哺乳動物細胞培養生産からの）誤ってプロセシングされた変種、グリコシル化変種）が存在する場合、マクロプレップ樹脂により、これらの疎水性変種の部分的な除去が可能になり、ここで測定されるように、未変性のニューロトロフィンを実質的に富化することになることである。限定することを意図するものではないが、樹脂支持体のバックボーンはニューロトロフィンと樹脂の間の非特異的相互作用を促進する疎水性含量を含むものと信じられ、これがここに教示されるようにして利用される。典型的には、約５から８、より好ましくは６から８のｐＨの溶出緩衝液に対しては、０から３ＭのＴＭＡＣ濃度が有用である。酢酸ナトリウムが、溶出緩衝液のイオン強度を増大させるために存在する場合、より低いＴＭＡＣ濃度を使用することができる。塩化物は酢酸塩イオンに対する好適な代替物である。
【００６７】
ニューロトロフィンが細胞膜周辺膣において生産される実施態様の一例では、培地又は可溶化物が遠心分離されて粒子状の細胞片を除去する。ついで、必要に応じて膜と可溶性タンパク質分画を分離することができる。ついで、ニューロトロフィンは、ニューロトロフィンが膜結合性か、可溶性か、凝集化形態で存在しているかに応じて、可溶性タンパク質分画から、そして培養可溶化物の膜分画から精製することができる。その後、ニューロトロフィンは可溶化され、ついで適切な緩衝液を使用して再び折り畳まれる。再折り畳みタンパク質を生産するための周辺質からのこの単離方法の詳細については以下に記載する。
【００６８】
不溶性の未変性ではないニューロトロフィンは、適切な単離緩衝液中の原核生物宿主細胞から、任意の適当な技術、例えば細胞を適切なイオン強度の緩衝液に曝露して殆どの宿主タンパク質を可溶化させ（しかし凝集ニューロトロフィンは実質的に不溶性である）、封入体を放出し、例えば遠心分離により回収に利用できるようにするように細胞を破壊することにより、単離される。この技術はよく知られており、例えば米国特許第４５１１５０３号に記載されている。
【００６９】
簡単には、細胞は（典型的には、約０．０１から２Ｍ、好ましくは０．１から０．２Ｍのイオン強度を使用して、ｐＨ５から９、好ましくはｐＨ約６から８の）緩衝液中に懸濁される。塩化ナトリウムを含む任意の適切な塩が十分なイオン強度値を維持するために有用である。細胞は、この緩衝液中に懸濁され、ついで、例えば機械的方法、例えばＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎプレスマイクロフルイダイザー、フレンチプレスもしくは音波オシレーター、あるいは化学的又は酵素的方法のような通常用いられている技術を使用して溶解により破壊する。
【００７０】
細胞破壊の化学的もしくは酵素的方法の例には、細菌壁を溶解するリゾチームの使用を伴うスフェロプラスティング（Neuら, Biochem.Biophys.Res.Comm.,17:215(1964)）及びポリペプチドの放出のために生細胞を高緊張度の溶液と低緊張度の冷水洗浄で処理することを含む浸透圧ショック（Neuら, J.Biol.Chem.,240:3685-3692(1965)）が含まれる。米国特許第４６８０２６２号に記載されている第３の方法は、形質転換された細菌細胞を、細胞を死滅させ溶解するのに充分な時間と温度で、有効量の２から４の炭素原子を持つ低級アルカノールに接触させるものである。
【００７１】
細胞を破壊した後、懸濁液は典型的には遠心分離されて封入体をペレット化する。一実施態様では、この工程は、標準的な遠心機において、容量と遠心設計に依存する充分な時間、通常は約１０分から０．５時間、約５００から１５０００ｘｇ、好ましくは約１２０００ｘｇで実施される。得られたペレットは実質的に全ての不溶性のポリペプチド分画を含むが、細胞破壊プロセスが完全でないならば、無傷の細胞もしくは破壊された細胞フラグメントも含有し得る。細胞破壊の完全性は、ペレットを少量の同じ緩衝液中に懸濁させ、懸濁液を位相差顕微鏡で調べることにより検査することができる。破壊細胞フラグメントもしくはホールセルの存在は、フラグメントもしくは細胞及び随伴する非屈折性（ｎｏｎ−ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）ポリペプチドを除去するために更なる破壊が必要であることを示している。そのような更なる破壊後に、必要ならば、懸濁液を再び遠心分離し、ペレットを回収し、再懸濁し、分析する。このプロセスを、視覚検査でペレット化材料中に破壊細胞フラグメントが無いことが明らかになるか、更なる処理でも得られるペレットの寸法を低減することができなくなるまで繰り返す。
【００７２】
別の実施態様では、ニューロトロフィンは、適切な緩衝液中での可溶化により細胞膜周辺膣から単離される。この方法は、ニューロトロフィンが組換え的に生産された後に発酵ベッセルに試薬を直接添加して、収集、ホモジェナイゼーション、及び遠心分離という余分な工程を避けてニューロトロフィンを得るインサイツ溶解化とできる。残りの粒子は遠心分離か濾過もしくはその組合せにより除去することができる。
【００７３】
ニューロトロフィンがアンフォールディングされているならば、アンフォールディングの度合いは、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む非天然ニューロトロフィンのクロマトグラフィーによって適切に決定される。非天然材料に対して増加するピーク領域は、どのくらいの非天然ニューロトロフィンが存在しているかを示す。
【００７４】
可溶化された封入体から又は後の精製の段階で一度得られると、ニューロトロフィンは以下に記載されるように活性な高次構造に適切に再折り畳みされる。
【００７５】
ニューロトロフィンが、再折り畳みされる前に既に可溶形態ではないならば、ニューロトロフィンを実質的に溶解させるのに必要な量のカオトロピック剤と還元剤を含有するアルカリ緩衝液におけるインキュベーションにより可溶化することができる。
【００７６】
ニューロトロフィンの緩衝液中における可溶化の度合いの測定は、濁度決定法により、還元されたＳＤＳゲル上の遠心分離後に上清とペレット間のニューロトロフィン分画を分析することにより、プロテインアッセイ（例えば、バイオ-ラッドタンパク質アッセイキット）により、又はＨＰＬＣにより好適に実施される。
【００７７】
可溶化に対するアルカリ緩衝液のｐＨ範囲は典型的には少なくとも約７．５であり、好適な範囲は約８−１１である。この後の範囲のｐＨをもたらす適切な緩衝液の例としては、グリシン、ＣＡＰＳＯ（３-[シクロヘキシルアミノ]-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２-アミノ-２-メチル-１-プロパノール）、ＣＡＰＳ（３-[シクロヘキシルアミノ]-１-プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２-[Ｎ-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸）、及びトリスＨＣｌ（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンヒドロクロリド）が含まれる。ここで好適な緩衝液は、好ましくは約２０ｍＭの濃度、約８．５から１１のｐＨ、好ましくは約１０−１１のｐＨのグリシン又はＣＡＰＳＯである。
【００７８】
可溶化のための緩衝溶液中のニューロトロフィンの濃度は、ニューロトロフィンが実質的に溶解化され、部分的に又は充分に還元し、変性するようなものでなければならない。あるいは、ニューロトロフィンは最初は不溶性であってもよい。使用する正確な量は、例えば緩衝溶液中の他の成分の濃度とタイプ、特に還元剤のタイプと量、カオトロピック剤のタイプと量、および緩衝液のｐＨに依存する。例えば、ニューロトロフィンの濃度は、還元剤、例えばＤＴＴの濃度が、約３：１から１０：１のＤＤＴ：ニューロトロフィンの比を維持するために、同時に増加させられるならば、少なくとも３倍増加させることができる。希釈再折り畳みの前により濃縮された可溶化タンパク質溶液をつくることが望ましい。従って、ニューロトロフィンの好適な濃度は少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬで、より好ましい範囲は３０−５０ｍｇ／ｍＬである。例えば、ニューロトロフィンは、５Ｍから７Ｍの尿素中に約３０−５０ｍｇ／ｍＬの濃度まで可溶化し、例えば約１ｍｇ／ｍＬまで折り畳みのために希釈することができる。
【００７９】
ニューロトロフィンを可溶化した後、これを、５−４０％（ｖ／ｖ）のアルコール性又は非プロトン溶媒、カオトロピック剤、及びアルカリ金属、アルカリ土類、もしくはアンモニウム塩を含む再折り畳み緩衝液中に入れるか希釈する。緩衝液は、最初の緩衝溶液に対しては任意の緩衝液とすることができ、ＣＡＰＳＯ、グリシン、及びＣＡＰＳがｐＨ８．５−１１、特に約２０ｍＭの濃度で好ましく、ＣＡＰＳＯとグリシンが最も好ましい。ニューロトロフィンは、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍に、再折り畳み緩衝液で希釈することができる。あるいは、ニューロトロフィンは、再折り畳み緩衝液に対して透析することができる。再折り畳みは約２℃−４５℃、最も好ましくは２℃−８℃で少なくとも約１時間の間、実施することができる。溶液は、場合によっては還元剤と浸透質（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）をまた含有してもよい。
【００８０】
還元剤は与えられた濃度範囲における可溶化工程に対して上述したものから好適に選択される。その濃度は、特に、アルカリ土類、アルカリ金属、又はアンモニウム塩、ニューロトロフィン、及び溶媒の濃度に依存する。好ましくは、還元剤の濃度は、約０．５から８ｍＭ、より好ましくは約０．５−５ｍＭ、更により好ましくは約０．５−２ｍＭである。好適な還元剤はＤＴＴとシステインである。
【００８１】
再折り畳み溶液中の酸素は必要に応じて不活性ガス、例えばヘリウム又はアルゴンの添加により除去して酸素を置換することもできる。
【００８２】
任意の浸透質は好ましくはスクロース（約０．２５−１Ｍの濃度）又はグリセロール（約１−４の濃度）である。より好ましくは、スクロース濃度は約１Ｍであり、グリセロール濃度は約４Ｍである。
【００８３】
折り畳み緩衝液中のニューロトロフィンの初期濃度は、回収された誤って折り畳まれた配座異性体に対する正しく折り畳まれたものの比が、ＨＰＬＣ、ＲＩＡ、もしくはバイオアッセイにより決定したとき、最大になるようなものである。（最大収量の正しく折り畳まれた配座異性体が得られる）ニューロトロフィンの好適な濃度は約０．１から１５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１から６ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約０．２から５ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００８４】
このインキュベーション時に生じる再折り畳みの度合いは、ニューロトロフィンのＲＩＡ力価又はＨＰＬＣ分析により適切に決定され、ＲＩＡ力価又は正しく折り畳まれたニューロトロフィンピーク寸法の増加は、緩衝液中に存在する正しく折り畳まれた生物学的に活性なニューロトロフィン配座異性体の量の増大に相関する。インキュベーションは、ＲＩＡもしくはＨＰＬＣにより決定される、正しく折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体の収量と回収された誤って折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体に対する正しく折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体の比を最大にし、質量バランスにより決定される多量体関連ニューロトロフィンの収量を最小にするために実施される。あるいは、以下と実施例に記載する方法によって種を決定することもできる。グアニジンが再折り畳みに対する好適な変性剤である。
【００８５】
ニューロトロフィンが再折り畳みされた後、ここに教示されたような次の方法が、個々にあるいは組み合わせて、より高い純度と相同性を得るための好適な精製法である。すなわち、カチオン交換カラムでの分画、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、そしてシリカクロマトグラフィーである。
【００８６】
再折り畳み工程がプロセスの一部であろうとなかろうと、ニューロトロフィンをその変種から分離するための好適な工程は疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂上での分離である。発酵、精製又はインビトロタンパク質再折り畳みの間、あるタンパク質は化学的に修飾され、誤ってプロセシングされ得、あるいはその未変性の三次元構造ではなくむしろその安定性、溶解性、免疫原性、もしくは生物活性について異なる他の構造に再折り畳みされうる。これらの変種は、抗原性又は作用強度の喪失のような望ましくない副作用を避けるために回収中に除去されなければならない。変種が不溶性であれば、遠心分離と濾過のような固体／液体分離法により容易く除去することができる。しかしながら、変種が可溶性であれば、クロマトグラフィーのようなより高度の分離吸着法がそれらを除去するために必要とされる。原核生物細胞中に生産されるとき、あるいはインビトロで再折り畳みされるとき、ニューロトロフィンは可溶性の安定した誤って折り畳まれた変種を生成する。誤って折り畳まれたニューロトロフィンは、未変性のニューロトロフィンに対して変更されたジスルフィド対合パターンと三次元構造を有しており、天然の薬理学的活性を欠く。真核生物細胞培養、例えば哺乳動物細胞培養中に生産されるとき、変種型は典型的には誤ってプロセシングされた型である。これらはまた典型的に天然の薬理学的活性を欠き、除去されるべきである。ここではＨＩＣが、未変性のニューロトロフィンからこれらの変種を分離するために適したものであることが見出された。
【００８７】
ＨＩＣは非共有性疎水的結合によって媒介された固体マトリックスに対するタンパク質の順次の吸着と脱着を含む。一般に、高塩緩衝液中の試料分子がＨＩＣカラムに装填される。緩衝液中の塩は水分子と相互作用をして溶液中の分子の溶媒和を低減させ、よってＨＩＣカラムにより結果的に吸着される試料分子の疎水性領域を暴露する。分子がより疎水性であればある程、結合を促進するために必要とされる塩は少なくなる。通常、塩勾配の低下を使用してカラムから試料を溶出させる。イオン強度が減少すると、分子の親水性領域の暴露が増加し、疎水性を増加させるために分子がカラムから溶出する。試料の溶出はまた溶出緩衝液に穏やかな有機修飾因子又は洗浄剤を添加することによっても達成される。ＨＩＣは、Protein Purification２版（Springer-Verlag, New York, pp.176-179(1988)）においてレビューされている。
【００８８】
タンパク質とマトリックスの間の会合の強さは、固定化された官能基の大きさと疎水的性質、周囲の溶媒の極性と表面張力、及びタンパク質の疎水性を含む幾つかの要因に依存する。ＨＩＣマトリックスの結合能は、固定化された疎水性リガンドが広く間隔をあけられるべきという必要性のために低くなる傾向がある。更に、あるタンパク質に対する培地の能力は試料調製における疎水性不純物の量に対して逆に変化する。所望のタンパク質を、能力を同時に最大化しながら、変種と他の不純物から分離するためには、好適なＨＩＣ固相媒体並びに装填、洗浄及び溶出のための好適な移動相を特定する必要がある。
【００８９】
ここにおいて決定したところでは、無傷の正しく折り畳まれた型から正しく折り畳まれたニューロトロフィン及び誤って折り畳まれたニューロトロフィンもしくは誤ってプロセシングされた型を分離するための最も好適な媒体は、固定化されたフェニル官能基を有するものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのニューロトロフィン型を分離するための異なった効率を示した。最良の結果はＴｏｓｏＨａａｓによるフェニル・トーヨーパール媒体及びフェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）で達成された。ＴＳＫフェニル５ＰＷもまた適していた。他のＨＩＣ固定化官能基も機能してこれらの型を分離しうる。例としては、オクチル基、例えばファーマシアからのオクチルセファロースＣＬ４Ｂ媒体、及びプロピル基、たとえばＢａｋｅｒからのハイ・プロピル媒体であった。好ましさが劣ったものはアルコキシ、ブチル、及びイソアミル官能基樹脂である。
【００９０】
ＨＩＣはニューロトロフィンを哺乳動物細胞培養中のその変種から分離するのに有用である。例えば、ここで測定したところでは、ｒｈＮＧＦ発現ＣＨＯ細胞培養は不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、たとえば前駆ＮＧＦ、ハイブリッド前駆ＮＧＦ及び切詰め前駆ＮＧＦ配列のような部分的配列が存在するものを含んでいた。また哺乳動物細胞培地において見出されるものはグリコシル化ＮＧＦ及び不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種のグリコシル化形態である。望ましくないグリコシル化型は、ＮＧＦの場合大きい分子量の種（＋２０００ｋＤ）として見られるが、患者に望ましくない抗原応答を発生させ、劣った製品品質又は活性をもたらす。ＨＩＣは、ｒｈＮＧＦから疎水性変種、主にグリコシル化型を含むＮ末端がタンパク分解性に誤ってプロセシングされた変種を分離した。実施例に示されるように、前駆配列含有及び切詰め前駆配列ＮＧＦと、ＮＧＦと前駆配列含有ＮＧＦの両方のグリコシル化型がフェニルＨＩＣの間ＮＧＦピークの先端に溶出した。従って、これらの種が実質的に含まれておらず、高速カチオン交換クロマトグラフィーのような次の工程に特に適したｒｈＮＧＦ組成物を得ることができた。ＨＩＣは、ソースに拘わらず、他のニューロトロフィン、並びにＮＧＦにも適用できる。例えば、ＨＩＣは、存在する単量体形に依存してホモ二量体かヘテロ二量体の何れでも、二量体からＮＧＦ単量体を分離し、並びにインビトロの再折り畳みの後、又は哺乳動物細胞から生産され分泌されたときに得られる、疎水性がまた異なる二量体を区別するのに有用である。ＨＩＣに使用するニューロトロフィン混合物の好適なソースは哺乳動物細胞培養、より好ましくはＣＨＯ細胞培養である。該培養は好ましくはここで検討されたような少なくとも１回の前精製工程にかけられる。ＨＩＣは、未変性の組換えニューロトロフィンから誤ってプロセシングされたグリコシル化変種（群）を分離するのに特に有効である。ｒｈＮＧＦの場合、グリコシル化及びプレプロＮＧＦは未変性ＮＧＦより疎水性が低く、従って未変性ＮＧＦの前に溶出する。（細菌的に生産される場合）ニューロトロフィンの誤って折り畳まれた型もまたより疎水性で、未変性のニューロトロフィンより早く溶出する。
【００９１】
ニューロトロフィン型を分離するために最も好適なＨＩＣ樹脂は固定化されたフェニル官能基を有しているものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのＮＧＦ型を分離するための異なった効率を示した。フェニルＨＩＣ樹脂の中で、ＴｏｓｏＨａａｓによるフェニル・トーヨーパール媒体が最も好ましく、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）とＴＳＫフェニル５ＰＷが好ましい。好ましいＨＩＣ官能基としてはアルコキシ、ブチル、及びイソアミル部分が含まれる。
ＨＩＣを使用して、ニューロトロフィン型を洗浄し差次的に溶出させるために様々な移動相条件を使用することができる。これらの移動相はニューロトロフィンと固定相の間の会合に異なった方法で影響を及ぼす幾つかの異なった化学種を含みうる。正しく折り畳まれ、また誤って折り畳まれたニューロトロフィン、例えばＮＴ−４／５が、例えば硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ濃度、酢酸塩濃度のような移動相塩の段階的減少又は減少塩勾配によりＨＩＣカラム上で分離できる。塩は移動相の表面張力を調節することにより樹脂に対するニューロトロフィンの結合に影響を及ぼしうる。表面張力に影響を及ぼした他の薬剤は、実施例で検討したようなクエン酸ナトリウムとテトラメチルアンモニウムクロリドであった。変種はまた、相対的に極性の有機溶媒の濃度を増加勾配で又は段階的に増加させて結合タンパク質を溶出させることにより、カラムクロマトグラフィー中に分離することができる。好適な溶媒の例としてはエタノール、アセトニトリル、及びプロパノールがある。ニューロトロフィン型とＨＩＣ樹脂の間の会合の強さは移動相のｐＨにもまた依存し、中性条件が好ましい。正しく折り畳まれ、誤って折り畳まれたニューロトロフィンの相対的な疎水性はまた溶液のｐＨに依存する。未変性のニューロトロフィンからの変種の分離はまた、勾配もしくは段階的溶出の間、移動相のいくつかの性質を同時に変化させることにより得ることもできる。例えば、溶出時に塩濃度と非極性溶媒濃度を同時に変化させた移動相は塩のみを変化させた場合よりもより良好な分離をもたらした。
【００９２】
ＨＩＣに対して、硫酸アンモニウム、クエン酸塩、酢酸塩、及び塩化カリウムを含むここで検討した塩が使用できる。使用する塩に依存して、樹脂へのニューロトロフィンの結合を達成する塩の濃度は典型的に０．５Ｍから３Ｍ、より好ましくは０．５から２．５Ｍである。例えば、０．８から１．５Ｍの塩の結合緩衝液がＮＧＦに対して好適であり、より高い塩濃度では樹脂上へのＮＧＦの沈殿が生じ、回収率が低下する。ＮＴ−３に対しては、１．０から２．５の塩濃度のｐＨ７の結合緩衝液が好ましく、１．２５から１．７５Ｍの塩が更に好ましく、１．５Ｍが最も好ましい。ＮＴ−４／５に対しては、１から３Ｍの塩のｐＨ７の結合緩衝液が好ましく、２から２．７５Ｍが更に好ましく、２．５ＭのＮａＣｌが最も好ましい。ＮＴ−４／５の場合、２．５ＭのＮａＣｌが装填には好ましく、２ＭのＮａＣｌが有機溶媒の存在する（例えば１０％アルコール、ｐＨ７）溶出には好適であった。好ましくは、塩濃度の低下を使用してニューロトロフィンとその変種を溶出させ分離する。溶出を達成するには、溶出緩衝液中の塩濃度は、典型的には装填緩衝液中のものよりも低いが、有機溶媒で補償するときは同じ濃度にすることができる。
【００９３】
加えて、ここで見出されたところでは、有機溶媒の使用には、有機溶媒の添加がより狭いピークプロファイルをもたらすことにより溶出パターンを改善するというもう一つの利点がある。エタノールに加えて、プロパノール、イソプロパノール、及び低級アルキレングリコール、例えばプロピレングリコール、エチレングルコール及びヘキシレングリコールを含むここで検討した他の有機溶媒を使用することができる。５から２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５から２０（ｖ／ｖ）の有機溶媒が正しく折り畳まれたニューロトロフィンを典型的に溶出させる。有機溶媒での溶出は勾配をもたせても段階的でもよい。ｐＨ範囲は好ましくは殆ど中性から僅かに酸性で、５から８、より好ましくは６から８、６．５から７．５、最も好ましくは７である。ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、アンモニウム、酢酸塩を含むここで検討した任意の緩衝液を、所望のｐＨで緩衝作用を呈する限り、使用することができる。
【００９４】
ここに報告したように、ニューロトロフィンの組換え生産から生じるある望まれないニューロトロフィン変種の本発明者らによる発見に鑑みると、好ましくは調製的態様で、高速カチオン交換クロマトグラフィーを使用することにより未変性ニューロトロフィンからの例えばカルバミル化、酸化、ｉｓｏａｓｐ、脱アミド、およびある種の切詰め型（例えばＮＧＦのＣ末端切断型）のような荷電修飾変種の分離が可能になる。例えば、ＮＴ−４／５とＮＴ−３の場合のように細菌発酵中に生じうる負荷変更の結果として生じるＮ末端クリップ型（例えば２から４のＮ末端アミノ酸欠失）を除去することができる。哺乳動物細胞培養において生産されたニューロトロフィンの場合、Ｃ末端切断が高度に荷電された末端領域に生じ得る。例えば、ＮＧＦの１１８型はＣ末端で誤ってプロセシングされ又は切断されて１１７、１１４及び１１５型になる。これらは高速カチオン交換クロマトグラフィーにより未変性１１８ＮＧＦから分離することができる。特に好適な実施態様はＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、フラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３、またはポリアスパラギン酸樹脂を使用するもので、中でもポリキャットＡが特に好ましい。最も好ましくは、大規模では、ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、又はフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂が使用される。
【００９５】
ここに記載された方法により得られる組成物は、実質的に純粋なニューロトロフィン、更に通常的には好ましくは本質的に純粋で、実質的にニューロトロフィン変種を含まず、より好ましくは本質的にニューロトロフィン変種を含まない。例えば、ＣＨＯ細胞培養からのＮＧＦの精製後の典型的なＳＰ−セファロースプールは、約９２％の１１８、４．６％の１２０、１％の脱アミド化ＮＧＦ、１％の酸化ＮＧＦ、及び１％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含む。各々の量は、常に、１１８に対しては約８５から９３％、（用いられる内因性及び／又は外因性タンパク分解度合いに大きく依存して）１２０に対しては０から５％、１１７に対しては０から５％、脱アミド型に対しては０から３％、ｉｓｏａｓｐ型に対しては０−２％、及び酸化型に対しては０から２％の範囲である。ＮＧＦ（全ての種）の純度は常に９９．５％を越える。
【００９６】
ニューロトロフィンは、カラムから溶出された後、担体と共に好適に組成物、好ましくは生理的に許容できる担体と共に製薬組成物に製剤化される。ニューロトロフィン組成物は好ましくは無菌である。本発明のニューロトロフィン組成物は、例えば培養中において神経細胞の成長と生存を促進するためにインビトロでの用途が見出される。
【００９７】
組換えヒト神経成長因子（ＮＧＦ）の水溶液中における化学的及び物理的安定性を、４．２から５．８のｐＨ範囲で５℃と３７℃の間で調べた。ＮＧＦの化学安定性はｐＨの増加で増大した。ｐＨ５．８のコハク酸塩緩衝液中では、ＮＧＦの物理的安定性はタンパク質凝集化のために減少した。５℃の安定性データと３７℃での加速分解研究の両方に基づいて、最適な製剤はｐＨ５．５の酢酸塩緩衝液であることが分った（ここに出典明示により取込まれるＷＯ９７／１７０８７を参照のこと）。逆相ＨＰＬＣは第１の安定性を示す方法であり、ｉｓｏ−ＡｓｐへのＡｓｎ−９３の転換が５℃での第１の分解経路であることを示した。カチオン交換クロマトグラフィーによるＮＧＦ分解の定量化はＮＧＦ単量体変種の様々な混合二量体への経時的な再構成（二量体交換）により複雑化した。希酸での試料と参照の処理は二量体中の単量体分布を平衡化させ、二量体交換の不存在下で定量化された。ベンジルアルコールとフェノールが、多用途目的に対する２つの液体製剤中へのそのｒｈＮＧＦとの相容性と安定性について評価された。これらの二つの製剤は、界面活性剤として０．０１％のプルロン酸（Ｆ６８）を含む状態と含まない状態で、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウムと１３６ｍＭの塩化ナトリウム中の０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質からなる。これらの二つの製剤の各々におけるベンジルアルコールとフェノールの最終濃度はそれぞれ０．９％と０．２５％である。１２ヶ月の安定性データに基づくと、ｒｈＮＧＦはこれらの製剤においてフェノールよりもベンジルアルコールでより安定である。界面活性剤の存在下でベンジルアルコールで保存したｒｈＮＧＦ製剤は界面活性剤を添加しない製剤と同じほど安定であり、ｒｈＮＧＦ多投薬製剤へのＦ６８の添加は安定性目的では必要とされないことを示している。従って、２０ｍＭの酢酸塩、１３６ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のベンジルアルコール、ｐＨ５．５中に０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含んでなる製剤がフェーズＩＩＩの臨床試験において複数回の投薬に使用されるｒｈＮＧＦに対して推奨される。このｒｈＮＧＦ多投薬製剤は、５℃で６ヶ月後にＵＳＰ及びＥＰ保存剤効能試験をパスしており、２ｍｇ／ｍＬの現在の液体製剤と同じほど安定している。しかし、製剤は、光感受性がある保存剤としてベンジルアルコールを含むので、強い光への曝露は避けるべきである。
【００９８】
一般に、組成物は、好ましくは安定な液体又は凍結乾燥可能形態での調製を不可能にしない量であって、効果的で安全な製薬的投与に適した量で、他の成分を含むことができる。
【００９９】
ニューロトロフィンは、製薬的に許容できる担体、すなわち使用される用量と濃度でレシピエントに対して無毒性であり、製剤の他の成分と相容性があるものと共に製剤化される。例えば、製剤は、ポリペプチドに対して有害であることが知られている酸化剤及びその他の化合物を含有しない。この製剤工程は、標準的な技術を使用する脱塩又はダイアフィルトレーションにより達成される。
【０１００】
一般に、製剤は、液体担体又は細かく分割された固体担体又は両方とニューロトロフィンを均一かつ密に接触させることにより調製される。ついで、必要ならば、製品は所望の製剤に成形される。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンガー液及びブドウ糖溶液が含まれる。固定化オイル及びオレイン酸エチルのような非水性ビヒクル、並びにリポソームがここでは有用である。
【０１０１】
担体は、好適には、等張性及び化学安定性を高める物質のような添加物を少量含有する。このような材料は使用される用量と濃度でレシピエントに対して非毒性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はその塩のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；例えばポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン；セルロース又はその誘導体、トレハロース、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；及び／又はポリソルベート、ポロキサマー、又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。最終調製物は液体又は凍結乾燥固体とできる。
【０１０２】
治療投与に対して使用されるニューロトロフィンは無菌でなければならない。無菌性は無菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通す濾過によって直ぐに達成される。一般に、治療用ニューロトロフィン組成物は、殺菌アクセス口、例えば皮下注射針で穿孔可能なストッパーを持つ静脈内溶液袋又はバイアルを有する容器に入れられる。上記の製剤はまたインビトロ用途に適している。
【０１０３】
通常、ニューロトロフィンは、ユニット又は多投薬容器、例えば密封アンプル又はバイアルに、水溶液として、あるいは再構成のために凍結乾燥製剤として保存される。凍結乾燥製剤の例としては、１０ｍＬのバイアルに５ｍＬの無菌濾過１％（ｗ／ｖ）ニューロトロフィン水溶液が満たされ、得られた混合物が凍結乾燥される。注入溶液は凍結乾燥ニューロトロフィンを注射用静菌水を使用して再構成することにより調製される。
【０１０４】
治療的に有効な用量のニューロトロフィン製剤が患者に投与される。ここにおける「治療的に有効な用量」は、投与される効果をつくりだす用量を意味する。正確な用量は治療すべき疾患に依存し、既知の技術を使用して当業者により決定される。一般に、本発明のニューロトロフィン製剤は、１日当り約０．０１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ投与される。好ましくは０．１から０．３μｇ／ｋｇである。また、従来から知られているように、年齢並びに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および疾患の重症度に対する調節が必要となり、当業者によりルーチン的な実験により決定される。典型的には、臨床医は、神経細胞の機能を修復し、維持し、最適には再構築する用量に達するまで本発明のニューロトロフィン製剤を投与する。この療法の進行は通常のアッセイで容易にモニターされる。
【０１０５】
ニューロトロフィンは、ＮＧＦ、ＮＴ−４／５、ＮＴ−３、及び／又はＢＤＮＦを含む他の神経栄養因子と組み合わされ、あるいは一緒に投与され、神経疾患に対する他の通常の療法と共に使用される。
【０１０６】
ＮＧＦの場合、好ましくは組成物は、製薬的に有効量の神経成長因子と製薬的に許容できる酢酸塩含有緩衝液を含有する。組成物は５から６のｐＨを有し得る。緩衝液は好ましくは酢酸ナトリウムである。酢酸塩の濃度は好ましくは０．１から２００ｍＭである。組成物は好ましくは０．０７から２０ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度を有する。そして、組成物は更に製薬的に許容できる保存剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、又はプロピルパラベンを任意に含有する。好ましくは保存剤はベンジルアルコールである。ベンジルアルコールの濃度は好ましくは０．１から２．０％である。組成物は製薬的に許容できる界面活性剤を任意に含有し得る。そして、組成物は、生理的に許容できる濃度の塩化ナトリウムを任意であるが好ましく含有することができる。より好ましい組成物は少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で神経成長因子を、１０ｍＭから５０ｍＭの濃度の酢酸塩イオンを含有する。更により好ましくは、組成物は少なくとも約０．１から約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で神経成長因子を、１０ｍＭから５０ｍＭの濃度の酢酸塩イオンを含有する。最も好ましい組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム濃度（ｐＨ５．５）、１３６ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び０．９％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを含有する。
【０１０７】
他の実施態様は、２．０ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度、１０ｍＭの酢酸ナトリウム濃度、ｐＨ５．５、及び１４２ｍＭの塩化ナトリウム濃度を含む。０．１ｍｇ／ｍｌのＮＧＦを２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１３６ｍＭの塩化ナトリウム、０．９％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを５．５のｐＨで製剤化することが好ましい。ここで検討したところ、１１８／１１８ホモ二量体がＮＧＦの好適な型である。ＮＧＦは正常な二量体形態を維持するために約６から８のｐＨで精製される。しかし、（タンパク質分解性に）切詰められた型のパーセントは単量体形態を表し、これは逆相ＨＰＬＣによって明らかになり測定される。ＮＧＦの異なった二量体型−１２０／１２０、１２０／１１８、１１８／１１８等々の存在は公表されている（主に本研究に使用された分析的及びバイオアッセイについて、並びにその一般的な教示についてここに出典明示により取込まれるSchmelzerら J.Neurochem. 59:1675-1683(1992)）。この刊行物は、各二量体型についてインビトロ活性が同じであったことを報告している。しかし、対照的に、本明細書における研究では、１２０／１２０二量体は活性が少なく、１１８／１１８種と比較して約８０−９０％の活性であることをラジオレセプターベースアッセイを使用して初めて証明している。アッセイの一形態では、ラットＰＣ−１２細胞膜を単離し、ＮＧＦ標準物質と種々の被験種との間の競合結合に対して使用する。ＲＲＡはＰ７５とｔｒｋＡレセプターを両方有している。１１７／１１７種が１１８／１１８種と同じ程活性であることもここでまた見出された。更に、ＰＣ−１２ベースアッセイの使用によりレセプターベースアッセイの発見を確認し、１２０／１２０型が１１８／１１８型に対して約６０％の活性であることを示す。主に本研究に使用された分析的及びバイオアッセイについて、並びにその一般的な教示についてここにその全体を出典明示により取込むのはBurtonら（J.Neurochem. 59:1937-1945(1992)）である。
【０１０８】
１１８／１１８型は１２０／１２０型よりもヒトの患者において生物利用能が高いと信じられている。生物利用能の増加は少なくとも４から５倍である。この差は顕著で、意外であり、従来では予想できなかったことである。
【実施例】
【０１０９】
次の実施例は例証のために提供されるものであって限定のためではない。本明細書中の全ての引用文献の開示が出典明示により明示的にここに取込まれる。
【０１１０】
＜実施例Ｉ．１１８／１１８ＮＧＦホモ二量体の精製＞
この実施例はＮＧＦの精製と各工程に対する原理を例証する。実施例の各々において、当業者であれば、従来からよく知られているようにして初期培養容積とタンパク質濃度を補償するようにカラム寸法と流量を容易に決定して調節することができる。
収集細胞培養液
【０１１１】
ＤＮＡ配列をコードしている１２０アミノ酸ヒトＮＧＦを含む発現ベクターを組換えＣＨＯ細胞に形質移入した。分泌とプロセシングを促進するためにＮＧＦプレプロ配列もまた存在していた。組換えＣＨＯ細胞の培養後、細胞培地を収集した。収集細胞培地液（ＨＣＣＦ）はＮＧＦ種１２０、１１８及び１１７を含んでいた。ＮＧＦの約４０−７０％は典型的には１１８／１１８ホモ二量体で、残りはヘテロ二量体１２０／１１８、１２０／１２０及び少量の１１８／１１７であった。ここに教示したように、これらの種はＳＰセファロースＨＰカラムにより分離することができる。
【０１１２】
収穫細胞培地は、ミリポア１０Ｋｄカットオフ膜を使用して、およそ２０倍に濃縮された（セルロース、複合体又はポリスルホンの何れかが交換可能に使用された）。濃縮物に０．１容量の１．０Ｍ、ｐＨ８．２のトリスを添加した。希釈材料が０．２２ｕｍフィルターを使用して精密濾過され、保持タンクに移され２から１８時間の間３７℃で保持された。１２０／１２０型の１１８／１１８型へ転換が、保持の間、内在性プロテアーゼにより触媒された。
【０１１３】
シリカゲルクロマトグラフィー
精密濾過物を１ＭのＮａＣｌに調節し、１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化されたシリカゲルカラムに適用した。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。適切なｐＨ範囲は約６から８で、好適なｐＨは７である。ついで、カラムを２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。低伝導率洗浄により宿主細胞タンパク質を除去する。結合したＮＧＦを５０ｍＭのＭＯＰＳＯ、０．５ＭのＴＭＡＣ、２０％の試薬無水等級アルコール（９４−９６％の特別に変性されたアルコール・フォーミュラ３Ａ（５容量のメタノールと１００容量の２００プルーフ・エタノール）と４−６％のイソプロパノール）で溶出させた。例えば２０％プロパのール、２０％イソプロパノール及び２０％メタノールのような他のアルコールを使用することもできる。ここで、「アルコール」及び「アルコール性溶媒」はアルコールについてよく用いられているところの意味を有するもので、好ましくは１から１０の炭素原子のアルコール、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、又はｔ−ブタノールで、最も好ましくはエタノール又はイソプロパノールである。このようなアルコールは、水溶液に添加した場合、溶液の極性を減少させることにより溶液の疎水性を増大させる溶媒である。エタノールが最も好ましい。アルコールの下限は溶出する如何なるパーセントでもよく、上限はタンパク質の変性を避ける必要から決められる。溶媒は好ましくは５％から２５％、より好ましくは５から２０％、更により好ましくは５から１５％である。ＴＭＡＣはテトラメチルアンモニウムクロリドであり、これはＮＧＦを溶出させるために存在する。ＴＭＡＣは０．１から１Ｍの範囲とできる。０．３から０．７Ｍの範囲が更に好ましい。ＮＧＦを溶出するために使用されるＴＭＡＣの量はｐＨとアルコール濃度の関数である。ｐＨがより低く、アルコールの量がより少なくなると、ＴＭＡＣが必要となる。ｐＨは約４から８の間とできる。この実施例では、好適なｐＨは７であり、これは、次のカラムへの装填の前のプール分画の調整を非常に少ないものにする。ｐＨの上限は次のカラムに装填するのに必要なｐＨにより決まり、下限はＮＧＦを効率よく溶出させるのに有用なものとされる。
【０１１４】
Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいる溶出液をプールし、精製水で１５．５ｍｓ／ｃｍ未満の伝導率まで希釈し、ｐＨを７．０に調整した。幾つかのプロテアーゼがなお存在していたので、材料を８時間を越えないで保持した。しかし、１２０アミノ酸を１１８型に転換する内在性プロテアーゼの活性は観測されなかった。材料を２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化されたＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーカラム（カチオン交換樹脂Ｓ−セファロース ＴＭアガロース・ファースト・フローＴＭ（ファーマシア））に適用した。カラムは２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄される。適切なｐＨ範囲は約６から８であり、好ましくはｐＨ７である。ついで、カラムを０．１６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で洗浄した。結合したＮＧＦを０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で溶出させた。溶出液の塩モル濃度は０．３から１．０Ｍ、好ましくは０．４から０．６Ｍの範囲とできる。下限はＮＧＦを全て溶出させるための有用性により決められ、上限は汚染物質を除去し、ＮＧＦの溶出に干渉しうるカラムの疎水的相互作用を生じさせることを避ける必要性により決められる。他の塩を使用することもでき、ＫＣｌが好適な代替物である。０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）での溶出が、小容量のプールを得るためには好適である。より高い塩濃度、例えば１Ｍを越えると、強固に結合した汚染物質が溶出し得る。
【０１１５】
フェニル・トーヨーパール６５０Ｍクロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいるＳＳＦＦカラム分画をプールし、１ＭのＮａＣｌに調節し、フェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラムに適用した。カラムを２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。適切なｐＨは約５から８の範囲である。結合したＮＧＦを、勾配緩衝液Ａ（２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、１．０ＭのＮａＣｌ）で始めて勾配緩衝液Ｂ（８０％の２５ｍＭのＭＯＰＳＯ中の２０％アルコール、ｐＨ７）で終了する１０ＣＶ（カラム容量）の線形勾配で溶出させた。ＮＧＦを含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析して、どの分画に前駆ＮＧＦ種が溜まったかを決定した。ＮＧＦを含む分画を選択しプールして、例えば部分的な前駆配列が存在するもの、例えば前駆ＮＧＦ、ハイブリッド前駆ＮＧＦ、及びクリップ前駆ＮＧＦ配列のような不適切にプロセシングされた変種を主に取り除いて、如何なるＮＧＦ前駆配列も実質的に含まれないＮＧＦ組成物を得た。フェニルカラムはまた少量のグリコシル化ＮＧＦとグリコシル化ＮＧＦ前駆配列を除去した。前駆及び切詰め前駆ＮＧＦ配列がＮＧＦと前駆ＮＧＦの双方のグリコシル化形態と共にＮＧＦピークの先端に溶出した。従って、このカラムは様々なＮＧＦ種からＮＧＦを即座に分離し、これらの種が実質的に含まれないＮＧＦ組成物を得た。この工程において、タンパク分解性及びグリコシル化変種を含む、変種ＮＧＦ疎水性変種、主に誤ってプロセシングされた変種がＨＩＣを使用して分離された。
【０１１６】
ＮＧＦ型を分離するために最も好適な媒体は固定化したフェニル官能基を有するものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのＮＧＦ型を分離するための異なった効率を示した。最良の結果がＴｏｓｏＨａａｓのフェニル・トーヨ・パール媒体で達成された。ＨＩＣ樹脂フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）とＴＳＫフェニル５ＰＷはよく作用した。アルコキシ、ブチル及びイソアミル部分を含む他のＨＩＣ官能基はこれらの条件下では、適正が少なく、効果が少なかった。
【０１１７】
フェニル・トーヨーパール・プールは、７５％の１１８、１０％の１２０、７％の１１７、１．８％の脱アミドＮＧＦ、１．４％の酸化ＮＧＦ、及び２．０％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含有し、残りの２．８％はその他の未同定ＮＧＦ種であった。
【０１１８】
任意であるが、プールされた分画を酸処理して、最小１５分の間、３．９５未満のｐＨでウィルス不活性化を達成した。
【０１１９】
ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー
ＨＩＣプールを０．５から１容量の水で希釈し、希釈したプールをｐＨ６に調節した。このプールを、（シリカゲルカラム工程におけるように）０．２Ｍの塩化ナトリウム、５％の試薬アルコールを含む２０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ６）で平衡化されたＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。カラムを０．２ＭのＮａＣｌ、５％の試薬アルコール（フォーミュラＳＤＡ−３Ａアルコール；アルコールは任意に存在する）を含む２０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ６）で洗浄した。アルコールは、ＮＧＦの樹脂バックボーンとの非特異的（大抵は疎水的）相互作用を低減させる。適切なアルコール範囲は約０から１０％である。負荷ｐＨは約５から８であり、これはＮＧＦの最大の安定性とＮＧＦ変種の分離を達成し維持するように選択される。カラムを２カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。結合したＮＧＦを、１１カラム容量の勾配緩衝液Ａ（５％のアルコールを含む、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍのコハク酸塩、ｐＨ６）と１１カラム容量の勾配緩衝液Ｂ（０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６）を混合して線形の２２カラム容量の勾配によって溶出させ、変種から分離した。アルコールは任意である。０．３５Ｍから０．４０ＭのＮａＣｌ濃度で１１８／１１８ＮＧＦが典型的には溶出した。
【０１２０】
カラム分画をＮＧＦ及び変種ＮＧＦ含量について分析した。分画は好ましくは上掲のSchmelzerら（1992）及び上掲のBurtonらにより記述されたＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析される。分画を選択しプールして、修飾ＮＧＦ変種、例えば酸化、脱アミド、ｉｓｏａｓｐＮＧＦ種が実質的に含まれないＮＧＦの組成物を得た。先のＨＩＣカラムは酸化、ｉｓｏａｓｐＮＧＦのようなＮＧＦの他の変種型を効果的には除去できない。ＨＩＣカラムは誤って折り畳まれたタンパク質とグリコシル化物を効果的に除去し、これは、より疎水性になる傾向があるので、正しく折り畳まれたＮＧＦよりもＨＩＣ樹脂により強固に結合する。従って、カチオン交換樹脂、例えばＳＰ−セファロースＨＰを、ＨＩＣ樹脂によって除かれなかった変化した負荷変種を除去するために使用した。
【０１２１】
ＳＰ−セファロースプールは、典型的には約９２％の１１８、４．６％の１２０、１．８％の脱アミドＮＧＦ、１％の酸化ＮＧＦ、及び１％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含有していた。通常の通り、各々の種の量は、１１８に対しては約８５から９３％、１２０に対しては０から５％、１１７に対しては０から５％、脱アミド化型に対しては０から３％、ｉｓｏａｓｐ型に対しては０−２％、及び酸化型に対しては０から２％の範囲である。ＮＧＦ（全ての種）の純度は通常のように９９．５％よりも大きい。
【０１２２】
製剤
ＳＰ−セファロースＨＰプールを製剤緩衝液中への限外濾過／ダイアフィルトレーションにより製剤のために調製した。酸性緩衝液が好ましくは用いられ、好ましくは上述のようにｐＨ５の酢酸塩が使用される。１１８／１１８ＮＧＦ組成物は実質的にＮＧＦを含んでおらず、実質的に純粋なＮＧＦである。処方された材料は神経疾患、特に糖尿病に伴う末梢神経障害及びエイズに伴う末梢交感神経障害を治療するのに好適である。
【０１２３】
＜実施例ＩＩ．１２０／１２０ＮＧＦホモ二量体の大規模な精製＞
収集細胞培養液
一般に実施例Ｉに記載されているようにして１２０００リットルのＣＨＯ細胞培養からＨＣＣＦを得た。ＨＣＣＦ中のＮＧＦ種分布は、約４０−６５％の１２０／１２０ホモ二量体と、１２０／１１８ヘテロ二量体と残りが１１８／１１８ホモ二量体であった。典型的には培地を素早くプロセシングして１２０から１１８のタンパク分解性転換を最小化した。
【０１２４】
マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィー
ＨＣＣＦをマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーカラムに装填し、１．５Ｍの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で洗浄した。結合したＮＧＦを、１．５ＭのＮａＣｌ、０．２５ＭのＴＭＡＣ、０．２％のチオジグリコール（ｐＨ７）で溶出した。マクロプレップカラムは、酢酸塩濃度を調節してｐＨ５から８で操作することができる。塩化物は酢酸塩イオンの好ましい代替物である。ＮＧＦがＴＭＡＣ勾配により溶出した。ＴＭＡＣはイオン性及び疎水性の双方の性質を持つ塩であり、この性質は、ある種の樹脂のバックボーン支持体がＮＧＦと樹脂の間の非特異的相互作用を促進する疎水的含量を含むので有用である。典型的には、約６から８のｐＨの溶出緩衝液に対しては、０−３ＭのＴＭＡＣ濃度が有用である。ＮＧＦを含む分画をプールした。
【０１２５】
シリカゲルクロマトグラフィー
プールを直接シリカゲルクロマトグラフィーカラムに適用した。シリカは、タンパク結合特性においてある役割を果たすイオン性、極性、及び疎水的相互作用を有する混合態様のクロマトグラフィー樹脂を提供する。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化させた。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）（好ましくはｐＨが約５．０から８．５、より好ましくは６から８、最も好ましくは７である）で洗浄した。結合したＮＧＦを２５ｍＭのコハク酸、ｐＨ３．９、５０ｍＭのＴＥＡＣ（テトラエチルアンモニウムクロリド）で溶出させた。ＴＥＡＣはＴＭＡＣよりも更に強力な溶出剤である。ｐＨは好ましくは３．５から８の範囲である。しかし、長い時間の間７．５を越えるｐＨにするのは、脱アミドＮＧＦ種の生成を防止又は低減するために避けるべきである。一般に、緩衝液のｐＨが低くなればなる程、シリカカラムからＮＧＦを溶出させるのに必要とされる例えばＴＭＡＣ又はＴＥＡＣのような混合特性の塩の濃度を低くする。ｐＨ４又は５の近くで良好な緩衝能力を有する緩衝液が使用に適している。溶出緩衝液中の塩の有無は任意であり、そのためカラムは、溶出緩衝液の適用に先立って塩なしにＭＯＰＳＯ緩衝液で洗浄することができる。
【０１２６】
フェニルセファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいる分画を同定しプールした。そのプールを、０．７Ｍの酢酸塩、ｐＨ７，２５ｍＭのＭＯＰＳＯに調節した。調節したプールを、勾配緩衝液Ａ（０．７Ｍの酢酸塩、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７）で平衡化したフェニル・セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーカラムに装填した。カラムを、９０％の勾配緩衝液Ａ（０．７Ｍの酢酸塩、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７）から１０％の勾配緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、２０％のプロピレングリコール）の勾配で洗浄した。例えばヘキシレングリコールのような他のグリコールに置換することもできる。典型的には、洗浄は約２から３ＣＶ、あるいは安定なベースラインＯＤが達成されるまでとした。洗浄によりいくらかの宿主細胞タンパク質が除去された。結合したＮＧＦを、９０％の勾配緩衝液Ａと１０％の勾配緩衝液Ｂの混合物から１０％の勾配緩衝液Ａと９０％の勾配緩衝液Ｂの混合物までの線形の１０ＣＶ勾配で溶出させた。ＮａＣｌもしくは硫酸ナトリウムをＨＩＣ緩衝液中の酢酸塩と置換することができる。ｐＨは好ましくは約５から８、より好ましくは約５．５から７．５であり、ｐＨ６から８が許容でき、約７が最も好ましい。該カラムは、成熟ＮＧＦ単量体及び存在する前駆配列の一部をなおも有しているＮＧＦ単量体のホモ二量体又はヘテロ二量体として存在する、全ての残っている前駆配列、部分的前駆配列、もしくはグリコシル化形態を分離した。ＮＧＦの前駆及びグリコシル化形態は溶出ピークの先行端に存在しており、ＮＧＦ含有分画がこれらの種を実質的に排除するようにプールされた。
【０１２７】
分析用ＨＰＬＣシステムで分離し検出したところ、ＨＩＣプールは、約７２％の１２０単量体、１７％の１１８単量体、２．８％の１１７単量体、３．６％のＲ１２０単量体、０．８％のｉｓｏａｓｐ型、１．３％の酸化型、及び１％の脱アミド型を含有していた。
【０１２８】
ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー
ＨＩＣ工程からのＮＧＦを含有する分画をプールした。大規模では、これは、カラム溶出液をプールタンク（保持タンク）に適当な時間に流すことにより達成された。プールのｐＨはｐＨ６に調節し、ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーカラムに適用した。カラムを２０ｍＭのコハク酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６（勾配緩衝液Ａ）で洗浄した。結合したＮＧＦを、７０％の勾配緩衝液Ａと３０％の勾配緩衝液Ｂの混合物で開始し、８０％の勾配緩衝液Ｂ（０．７ＭのＮａＣｌ／ｐＨ６）と２０％の勾配緩衝液Ａの最終混合物までの２２ＣＶの勾配で溶出させた。ｐＨは好ましくは５から８、より好ましくは５．７から６．５、最も好ましくは６である。代表的なクロマトグラムを図１に示す。
【０１２９】
ＳＰセファロースＨＰプールはルーチン的に約９５％の１２０型、３％のＲ１２０型、０．６５％のｉｓｏａｓｐ型、０．６％の酸化型、０．６％の脱アミド型を含んでいた。ＮＧＦの他の未同定の形態は約０．６％であり、二酸化型ＮＧＦ（Met３７とMet９２）からなり、脱アミドＡｓｎ４５が存在していた。ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー後に得られたプールと（ＳＰ−セファロース樹脂に装填された）代表的なＨＩＣプールを比較するＨＰＩＥＸ分析を図２に示す。ＮＧＦの３つの主要なクリップ型、１２０、１１８、及び１１７の各々が変種を有しているようであるが、精製中、主な切詰め型（この例では１２０）の変種、例えば酸化及びｉｓｏａｓｐ型が、主要ではない形態（この例では１１８と１１７）からの変種の分析を遮蔽しているようである。代表的な試行からの分画のＨＰＬＣ分析を図３に示す。
【０１３０】
ＳＰ−セファロースＨＰはＨＩＣプール中に存在する変種を効果的に除去した。Ｒ１２０型はＮＧＦのＮ末端に更なるアルギニン残基を有している；通常、ｒｈＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列はＳＳＳＨＰであるが、Ｒ１２０はＲＳＳＳＨＰのＮ末端配列を有している。従って、Ｒ１２０型は成熟ＮＧＦよりより塩基性で、ＳＰ−ＳＨＰにより分離された。これはまた、ＮＧＦのＮ末端がレセプター（ｔｒｋＡ）結合に必要であるという事実に恐らくは関連して、低い生物活性を有している。酸化ＮＧＦ型は酸化された３７位置にメチオニンを有するモノ酸化型であり、ＮＧＦピークの先行端に溶出するより酸性の形態を生じる。ｉｓｏａｓｐ型はアミノ酸９３にアスパラギン酸の修飾を含む。ｉｓｏａｓｐ型は僅かにより塩基性であり、従ってＳＰ−セファロースＨＰ樹脂にややより強固に結合する。ｉｓｏＡｓｐ９３を含んでいるＮＧＦ種は溶出ピークの終端に溶出した。脱アミド化がアスパラギン酸残基、典型的には４５位のアスパラギン酸の位置で生じた。脱アミド化Ａｓｎを含んでいるＮＧＦは、４５位にＡｓｐを生じるが、僅かにより酸性であり、溶出ピークの先行端に現われる。
【０１３１】
フラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３はＮＧＦ種の荷電変種を分離するためのＳＰ−セファロースＨＰ樹脂に対してあまり好適な代替樹脂ではない。このあまり好ましくない樹脂を使用する場合は、ＮＧＦを溶出させるためにより高い濃度のＮａＣｌが必要となる。
【０１３２】
製剤
バルク材料を、先の実施例におけるように、製剤緩衝液中への限外濾過／ダイアフィルトレーションにより製剤化した。最終のバルク生成物において、１２０型はルーチン的に約９２から９７％、Ｒ１２０は約１から４％、ｉｓｏａｓｐ型は約０．２から１．５％、酸化型は約０．２から２％、脱アミド型は約０．２から２％の範囲であった。１１７及び１１８型はルーチン的に約２％未満であった。最終のバルク生成物はルーチン的に少なくとも９９．５％の純ＮＧＦ（全ての種を含む）であった。
【０１３３】
＜実施例ＩＩＩ．１１８／１１８の単離＞
ＮＧＦ変種が実質的に含まれていない実質的に純粋な１１８／１１８ＮＧＦ組成物を得る好適な一実施態様においては、実施例ＩＩの方法を、次の変更をして実施した。マクロプレップ・ハイ・Ｓカラムとシリカカラムの間に固定化トリプシンカラムを使用する。必要に応じてｐＨを約５から８．５、最も典型的には６．５から７．５に調節した後に、マクロプレッププールを固定化トリプシンカラムに直接装填した。プールをカラムに通過させ、その間に殆どのＮＧＦが１１８型に転換された。プロテアーゼ消化が、Ｃ末端のＶＲＲＡをＶＲに切断することにより１２０型を１１８型に転換する。制限された選択的な切断を達成するために、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ、好ましくはトリプシン、より好ましくは直ぐに入手できるブタトリプシン、あるいは代わりにウシトリプシン又は組換えトリプシンが使用される。制限された選択的な切断を実質的にもたらす任意のタンパク分解性方法を使用することができるが、ＮＧＦ調製の汚染を最小化するために好ましいものは固定化トリプシンカラムである。カラムはプロテアーゼ活性を促すｐＨ、好ましくは５．５から８．５のｐＨ、より好ましくは６．０から８．０、最も好ましくは６．５から７．５のｐＨで操作される。
【０１３４】
この実施例において、グリコシル化ＮＧＦはここで検討したようにＨＩＣにより除去された。実施例ＩＩにおいて検討したようなＳＰ−セファロースＨＰ工程に続いて、しかし好ましくは２２カラム容量の０．３Ｍから０．５５Ｍの塩勾配を用いて、治療用途に好適なＮＧＦ組成物を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより決定したところ、７０％を超える１１８単量体、１０％未満の１２０単量体及び１５％未満の１１７単量体の組成物を得ることができる。典型的には、９０％以上の１１８／１１８ｒｈＮＧＦ、より通常的には９３％以上の１１８／１１８ｒｈＧＮＦで、約７％以下の脱アミド、ｉｓｏａｓｐ型及び酸化変種の組成物が得られる。より高い純度を達成する一つの手段は、例えば１１８／１１８ｒｈＮＧＦピークのような主要ニューロトロフィンピークの先端又は後行端に見出されるような有意の量の変種を伴う分画を選択することを避けることである。
【０１３５】
＜実施例ＩＶ．細菌封入体からのｒｈＮＴ−４／５の部分的精製と再折り畳み＞
この実施例において、１０もしくは６０リットルの発酵で出発して、ｒｈＮＴ−４／５を精製した。この実施例において記載した発酵において組換えヒトＮＴ−４／５を生産するために使用された宿主は２７Ｃ７／ｐｍＮＴ５ＤＴと命名された大腸菌株であった。但し、他の菌株と生物体から生産されるＮＴ−４／５もまたここに記載した精製方法に適している。この実施例において使用された発現プラスミドは、大腸菌中のＮＴ−４／５遺伝子の発現に必要とされる転写及び翻訳調節配列下に成熟ＮＴ−４／５コード配列を含んでいた。ＮＴ−４／５発現プラスミドにおいて、大腸菌中での遺伝子の発現に必要とされる転写配列はアルカリホスファターゼプロモータ配列によって提供された。転写ターミネーターに対するラムダはＮＴ−４／５終止コドンに隣接して位置していた。細胞質からのタンパク質の分泌はＳＴＩＩシグナル配列により指示された。ｒｈＮＴ−４／５の大部分は屈折性体のような細胞膜周辺膣に見出された。プラスミドは、形質転換された宿主に対してテトラサイクリン耐性をもたらした。発酵プロセスは３５℃から３９℃、ｐＨ７．０−７．８で実施された。発酵は２５−４０時間続けられ、その後培養は収集前に冷却された。培養は、６０℃で連続流れの装置を使用する加熱処理又はその温度で５−１５分の間インタンク熱不活性化を使用して不活性化した。熱不活性化された培養は、ＡＸアルファ−ラバル遠心機又は等価物を使用して遠心分離された。大腸菌はペレットに回収された。
【０１３６】
封入体中に組換えヒトＮＴ−４／５を発現している大腸菌細胞は、封入体中にＮＴ−４／５を含むペーストを調製するために標準的な手段により溶解させた。緩衝液にはプロテアーゼ阻害薬は含まれていなかった。
【０１３７】
細胞片から封入体を単離するために、大腸菌ＮＴ−５ペーストを、回転式機械的分散装置、例えばトゥラックス（Ｔｕｒｒａｘ）を使用して０．０２Ｍのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を６０００ｐｓｉで３回マイクロフルイダイザーを通過させた。得られたホモジェネートを約４５分間、５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機で遠心分離した。上清を破棄し、ペレットを、トゥラックスを使用して２から３分間、中程度の速度で２０ｍＭのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ（抽出緩衝液）中に再懸濁させた。ホモジェネートを上述のようにして遠心分離した。ペレットを抽出緩衝液に再懸濁させ上述のように遠心分離した。得られたペレット（ペレット群）（ＮＴ−４／５封入体又は屈折体という）を−７０℃で保存した。
【０１３８】
ＮＴ−４／５は次のようにして封入体から単離した。封入体ペレットを２０ｍＭのトリス、ｐＨ８、６Ｍの尿素、２５ｍＭのＤＴＴ（１０ｍｌ緩衝液／封入体グラム）中にトゥラックスを使用して中程度の速度で約１０分間懸濁した。懸濁液を２−８℃で４０分間撹拌し、約４５分間５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂで遠心分離した。ＰＥＩ（ポリ-エチレン-イミン）を０．１％まで上清に添加し、これを２−８℃で３０分間撹拌した。ＰＥＩは核酸とその他の酸性負荷分子を沈殿させる。混合物を約４５分間５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂで遠心分離した。ＰＥＩ上清を、０．０２Ｍのトリス、６Ｍの尿素、１０ｍＭのＤＤＴ、ｐＨ８で平衡化されたＤＥＦＦセファロース・ファースト・フロー・カラム（１０ｃｍｘ１４ｃｍ；ＤＥＦＦはジエチルアミノエチル樹脂である）に装填した。１ｋｇの可溶化屈折体の等価物がＤＥＦＦカラムに装填された。還元された変性ＮＴ−４／５はＤＥＦＦ樹脂に結合しないので、ＮＴ−４／５と６Ｍの尿素を含む素通りプールが収集され（図６）、プールのｐＨが酢酸で５．０に下げられた。ｐＨ調節ＤＥＦＦ素通りプールを、ＮＴ−４／５が樹脂に結合する条件である、６Ｍの尿素を含む２０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５）で平衡化したセファロース・ファースト・フロー・カラム（Ｓは樹脂上のＳＯ３官能基をいう）に装填した。装填後、Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・カラムを数カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。結合したＮＴ−４／５を、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、６Ｍの尿素、ｐＨ５で溶出させた（図７）。０．５ＭのＮａＣｌのＳＳＦＦプールを２０ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８に対して一晩かけて透析した。この条件ではＮＴ−４／５が不適切にではあるが再折り畳みする。誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５分子は凝集して沈殿物を形成した。
【０１３９】
凝集した誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５をプロセシングして正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を得た。凝集した誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５を遠心分離によりペレットとして収集した。ペレットを、０．２Ｍのトリス、ｐＨ８、４Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、約１から２時間もしくはペレットが溶解するまで２−８℃で撹拌した。最終のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光係数１．８に基づいて約１０ｍｇ／ｍｌタンパクに調節した。酸化されたグルタチオンを可溶化されたペレット溶液に添加して２０ｍＭの最終濃度とし、２−８℃で１５から３０分間穏やかに撹拌した。酸化グルタチオンはＮＴ−４／５スルフヒドリル基と反応してＮＴ−４／５−Ｓ−グルタチオン混合ジスルフィドを生成する。ＮＴ−４／５−ＳＧ混合ジスルフィドを、１００ｍＭのトリス、２０ｍＭのグリシン、１５％のＰＥＧ−３００、１ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８．３中に０．１から０．５ｍｇ／ｍｌタンパクの最終濃度まで希釈した。ＮＴ−４／５の正しい再折り畳みを開始するために、再折り畳み混合物に２から４ｍＭの最終濃度でシステインを添加し、続いて酸素を排除するために容器を密封する前に５から６０分間窒素又はヘリウムで溶液をエアレーション（泡立てによる）した。ＮＴ−４／５の再折り畳みは２から８℃で１８から２４時間進められた。
【０１４０】
別法として、ｒｈＮＴ−４／５が次のような亜硫酸分解を使用して再折り畳みされた。封入体ペレット（１１０ｇ）を１．１リットルの２０ｍＭトリス、７Ｍ尿素、１０ｍＭグリシン、１００ｍＭ亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭテトラチオン酸ナトリウムに懸濁させ、中程度の速度で１０分間トゥラックスを使用して溶解させた。混合物（１２６０ｍＬ）をついで２から８℃で４５分間撹拌した。ＰＥＩを０．１％ＰＥＩの最終濃度になるまで添加した。混合物を４℃で更に３０分間撹拌し、ＲＣ３Ｂ遠心機中で５５００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭのトリス、６Ｍの尿素、ｐＨ８で平衡化したＤＥＦＦカラム（４．４ｃｍｘ２５ｃｍ）に装填した。ＤＥＦＦ素通り分を酢酸でｐＨ５に調節して、２０ｍＭの酢酸、６Ｍの尿素、ｐＨ５で平衡化したＳ−セファロース・ファースト・フロー・カラム（４．４ｃｍｘ２５ｃｍ）に装填した。ＮＴ−４／５を２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７で溶出させた。
【０１４１】
スルホニル化ｒｈＮＴ−４／５を含むＳＳＦＦ０．５Ｍ塩化ナトリウムプールを約０．１ｍｇ／ｍｌタンパクに希釈し、１Ｍのグアニジンヒドロクロリド、１００ｍＭのトリス、２０ｍＭのグリシン、１５％のＰＥＧ−３００、ｐＨ８．３に調節した。２から４ｍＭのシステインの添加によりＮＴ−４／５の再折り畳みを開始した。再折り畳み反応は本質的に２４時間以内に完了した。溶液からの酸素を置換するための例えばヘリウム又は窒素のような不活性ガスによるエアレーションを必要に応じて実施することもできる。
【０１４２】
＜実施例Ｖ．高次構造的（誤って折り畳まれた）変種からの正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の単離＞
実施例ＩＶのｒｈＮＴ−４／５の再折り畳み混合物を一晩かけてｐＨ４から５の溶液に対して透析してグアニジンとその他の試薬を除去した。溶液を清澄にするために、溶液を５０００ｒｐｍで４５分間遠心分離するか、０．２ｕｍフィルターを通過させた。
【０１４３】
０．５から５グラムのタンパク質を含む清澄化した上清を、氷酢酸を添加してｐＨ３から５に調節し、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに装填するか、精製の準備ができるまで−２０℃で凍らせて保存した。この実施例では、酸性化され清澄化された溶液を、折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５が結合した樹脂のＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣ（３ｃｍｘ５０ｃｍ）カラムに装填した。正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を、０．０５トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶媒系中のアセトニトリル勾配を用いて（２５ｍｌ／分の流速での０．０５％ＴＦＡ中の２６から４０％のアセトニトリル勾配（９５分間を越える）からなる）溶出させた。分画を１から１．５分間隔で収集した（図８）。分析的Ｃ４ＨＰＬＣ Ｖｙｄａｃ（０．２１ｘ１５ｃｍ）カラム上の溶出時間を正しく折り畳まれたＮＴ−４／５標準物質の時間と比較することにより、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５について分画を分析した（図９）。標準的な正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５は典型的には０．５％ＴＦＡ／アセトニトリル緩衝系で毎分２．５ｍｌの流量で１９分で溶出した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５を含む分画をプールしｐＨを５から７に調節した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５のプールもまたＮＴ−４／５のカルバミル化及びＮ末端切詰め型を含んでいた。
【０１４４】
調製的逆相液体クロマトグラフィー樹脂は好ましくは約１０−４０ミクロンの粒径、約２００−４００オングストロームの孔径、及びＣ４、Ｃ８、又はＣ１８アルキル基を有する媒体である。より好ましくは、樹脂は約１５−４０ミクロンの粒径と約３００オングストロームの孔径を有し、Ｃ４シリカ媒体である。
【０１４５】
＜実施例ＶＩ．高次構造的（誤って折り畳まれた）変種からの正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の別の単離＞
実施例ＩＶの再折り畳みｒｈＮＴ−４／５混合物を、１０ｋＤの分子量のカットオフを持つ２０平方フィートのセルロース（又はポリスルホンもしくは等価物）膜を備えたミリポア−ペリコン限外濾過系を使用して約１０倍に濃縮した。０．２ミクロン膜を通す濾過の前に、濃縮した混合物を一晩かけて５０Ｌの５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析するか、５０ｍＭの酢酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５中でダイアフィルトレーションを施した。
【０１４６】
濾過した再折り畳み混合物を２．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７に調節し、前もって２．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７で平衡化したＨＩＣカラムであるフェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラム（１０ｃｍｘ１９ｃｍ）に装填した。ついで、平衡緩衝液でカラムを洗浄した。ｒｈＮＴ−４／５分子の分子の幾つかの誤って折り畳まれた型が素通り分画に溶出し、その他の誤って折り畳まれた型が２０から４０％の試薬アルコールのような高濃度の有機溶媒で溶出した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５は２Ｍの塩化ナトリウム、１０％の試薬アルコール、ｐＨ７を使用してフェニルカラムから溶出させた（図１０）。フェニルセファロースのような他のフェニル樹脂をトーヨーパールのバックボーンの代わりに使用することができる。硫酸アンモニウム、クエン酸塩、酢酸塩、及び塩化カリウムを含むここで検討した塩を使用することができる。使用する塩に依存して、塩濃度は典型的には１Ｍから３Ｍであり、２．５ＭのＮａＣｌが装填には好適で、２ＭのＮａＣｌが有機溶媒の存在する場合の溶出に好適である。好ましくは、塩濃度の低下がニューロトロフィンとその変種を溶出させ分離するために使用される。溶出を達成するには、溶出緩衝液中の塩濃度は典型的には負荷緩衝液中のものよりも低いが、有機溶媒で補償するときは同じ濃度とすることができる。また、有機溶媒の使用は、ここで見出されたところでは、有機溶媒を添加するとより狭いピークプロファイルが得られて溶出パターンが改善されるという他の利点がある。エタノールに加えて、プロパノール、イソプロパノール、及び低級アルキレングリコール、例えばプロピレングリコール、エチレングリコール及びヘキシレングリコールを含むここで検討するその他の有機溶媒を使用することもできる。５から２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５から２０％（ｖ／ｖ）、更に好ましくは５から１５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒が典型的には正しく折り畳まれたニューロトロフィンを溶出する。有機溶媒での溶出は勾配によるか、段階的に行なう。ｐＨ範囲は、好ましくは中性近くから僅かに酸性であり、５から８、より好ましくは５．５から７．５、最も好ましくは７である。ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、アンモニウム、酢酸塩を含むここで検討した任意の緩衝液を、所望のｐＨで緩衝作用を示す限り使用することができる。
【０１４７】
＜実施例ＶＩＩ．正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の化学変種からの精製＞
ｒｈＮＴ−４／５のカルバミル化及びＮ末端切詰め型を含む化学変種からの正しく折り畳まれた無傷のｒｈＮＴ−４／５の分離は、ＳＰ−セファロースＨＰ樹脂又はポリキャットＡ ＨＰＬＣ樹脂を使用する高速カチオン交換クロマトグラフィーにより達成することができた。
【０１４８】
Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを誤って折り畳まれた変種を取り除くために使用した場合、Ｃ４ＨＰＬＣプールをｐＨ５から７に調節し、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６、５％の試薬アルコール、０．２ＭのＮａＣｌで平衡化した７ｃｍｘ１９ｃｍのＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。結合したＮＴ−４／５を伴う樹脂を平衡緩衝液で洗浄した。結合したｒｈＮＴ−４／５を、ｐＨ６で０．２ＭのＮａＣｌから０．４ＭのＮａＣｌまでの２２カラム容量（ＣＶ）の勾配（すなわち、平衡緩衝液中の塩勾配）を使用して溶出させ、カルバミル化及びＮ末端切詰め型から分離した（図１１）。ＮＴ−４／５を含む分画をプールし、０．０５Ｍの酢酸塩、ｐＨ４から５に製剤化した。無傷のｒｈＮＴ−４／５を同定し、好ましくはここで検討したように分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画内の変種から区別し、標準と比較した。
【０１４９】
別法として、ＮＴ−４／５の変種型をポリアスパラギン酸カラムでの高速カチオン交換ＨＰＬＣ（ポリキャットａ、ポリＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．）（９．４ｘ２００ｍｍ）により除去した（図１２）。Ｃ４ＨＰＬＣプールをｐＨ５から６に調節し、ポリキャットａカラムに装填した。クロマトグラフィー条件は：緩衝液Ａが２０ｍＭのリン酸塩、５％のアセトニトリル、ｐＨ６であった；緩衝液Ｂは２０ｍＭのリン酸塩、５％のアセトニトリル、０．８ＭのＫＣｌ、ｐＨ６であった。ｒｈＮＴ−４／５を、６５分にわたって２５から６０％の緩衝液Ｂの勾配を使用して溶出させた（図１２）。分画を１分間隔で収集し、上述のように分析的Ｃ４ＨＰＬＣにより分析した。
【０１５０】
ＨＩＣを用いて誤って折り畳まれた変種を除いた場合（上記の実施例ＶＩ）は、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５プールを、２０ｍＭのコハク酸塩、０．１ＭのＮａＣｌ、５％の試薬アルコール、ｐＨ６中で一晩かけて透析するか、２０ｍＭのコハク酸塩緩衝液中で限外濾過／ダイアフィルトレーションした。透析もしくはＵＦ／ＤＦプールをついで上述のようなＳＰ−セファロースＨＰ又はポリキャットａカラムに装填した。
【０１５１】
製剤
（ＳＰ−セファロースＨＰ又はポリキャットａＨＰＬＣ工程から得た）正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５を含む分画をプールし、２０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４から５の製剤緩衝液中に１から５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。別法として、ＮＴ−４／５を限外濾過／ダイアフィルトレーションを使用して製剤化した。
【０１５２】
最終のバルク溶液を、アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３）及び生物学的アッセイにより分析した。キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、細胞膜に位置するそのチロシンキナーゼレセプター（ｔｒｋＢ）の自己リン酸化のＮＴ−４／５活性化を検出するものであるが、精製したｒｈＮＴ−４／５を特徴付けるために使用した。ｇＤタグを付したｔｒｋＢを発現するＣＨＯ細胞を使用した。１９９５年６月１日に公開されたＷＯ９５／１４９３０はＫＩＲＡを記述しており、ここに出典明示により取込む。ｒｈＮＴ−４／５はこのアッセイにおいて１２．６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有していた。典型的には、ここに記載されたようにして精製される正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５のＥＣ５０は、５から３０、より好ましくは１０から２０である。
【０１５３】
非ＮＴ−４／５タンパク質に対するｒｈＮＴ−４／５の純度は典型的には９０から９９パーセントであった。カルバミル化及びＮ末端切詰め変種に対してのＮＴ−４／５の相同性は９０から９９パーセントであった。最も典型的かつ好ましくは、純度と相同性は９９％又はそれ以上である。
【０１５４】
＜実施例ＶＩＩＩ．細菌封入体からのｒｈＮＴ−３の初期精製、再折り畳み及び最終精製＞
細胞片から封入体を単離するために、大腸菌ＮＴ−３ペースト（１ｋｇ）を、１０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に、例えばトゥラックスのような回転機械式分散装置を使用して再懸濁させた。細胞懸濁液を６０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーに３回通した。得られたホモジェネートを５０００ｒｐｍで３０分の間ＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機で遠心分離した。
【０１５５】
ＮＴ−３を次のようにして封入体から単離した。封入体ペレットを、約１０分間中程度の速度でトゥラックスを使用して、１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭのテトラチオン酸ナトリウム、７．５Ｍの尿素、ｐＨ８．３（１０ｍｌ／封入体グラム）に懸濁させた。懸濁液を２−８℃で約１時間撹拌した。ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を約０．１５％（最終濃度）になるまで添加し、２−８℃で３０分間撹拌した。混合物を５０００ｒｐｍで約３０分の間ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂにおいて遠心分離した。上清をゲルマン・プレフロー（Ｇｅｌｍａｎ Ｐｒｅｆｌｏｗ）カートリッジで濾過した。濾過した上清を３容量のＳ−セファロース・ファースト・フロー平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５）で希釈した。希釈した濾過上清（７ｍＳ未満の導電率を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５．０で平衡化したＳ−セファロースＦＦカラムに装填する。カラムを最初に５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５で洗浄し、ついで５０ｍＭのＭＯＰＳ，５Ｍの尿素、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ７．０で洗浄した。亜硫酸分解されたＮＴ−３を、５０ｍＭのＭＯＰＳ、５Ｍの尿素、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ７中の０−０．６ＭのＮａＣｌの１０カラム容量の勾配を使用してカラムから溶出させた。
【０１５６】
部分的に精製されたＮＴ−３を、０．１Ｍのトリス、２Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＣｌ、１５％のＰＥＧ３００、１０ｍＭのグリシン、２５ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．１）を含む再折り畳み緩衝液中でＳ−セファロースＦＦプールをおよそ０．１ｍｇ／ｍｌタンパクまで希釈することにより再び折り畳んだ。再折り畳みは、およそ５ｍＭまでシステインを添加し、２−８℃で２−５日間撹拌することにより開始した。必要に応じて、再折り畳み溶液中の酸素濃度を低減させるために、再折り畳み緩衝液をＨｅ又はアルゴンで分散させても良い。
【０１５７】
再折り畳みされたプールのｐＨは７に調節し、濾過し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で平衡化したマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーカラムに装填した。マクロプレップカラムにｐＨ調節再折り畳みプールを装填した後、カラムを５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７）で最初に洗浄し、続いて５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．１ＭのＴＭＡＣ、０．３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）により洗浄した。ＮＴ−３を５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．２５ＭのＴＭＡＣ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で溶出させた。
【０１５８】
次に、マクロプレッププールをフェニルセファロース・ファースト・フロー・ハイ・サブスティチューションカラムで精製した。フェニルカラムを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で平衡化し、マクロプレッププールをフェニルカラムに直接装填した。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、正しく再折り畳みされたＮＴ−３を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）から５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％の試薬アルコール（ｐＨ７）に変わる１５カラム容量の勾配を使用して溶出させた。分画をＣ４ＨＰＬＣかＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、正しく折り畳まれたＮＴ−３を含む分画をプールした。
【０１５９】
フェニルプールを２５ｍＳ未満に希釈（典型的には水で約２倍容量）し、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で前もって平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。カラムを最初に平衡緩衝液で洗浄し、ＮＴ−３を、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）中に０．３５ＭのＴＭＡＣから０．６５ＭのＴＭＡＣまでの２０カラム容量の勾配を使用してカラムから溶出させた。（Ｃ４ＨＰＬＣアッセイにより判断して）ｒｈＮＴ−３を含む分画をプールした。
【０１６０】
ＳＰ−セファロースＨＰプールを１００００分子量の膜上で約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ついで６容量の１０ｍＭの酢酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）でダイアフィルトレーションを行った。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１はＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラムを示す。ＨＩＣクロマトグラフィー後に１２ｋＬの発酵からのＮＧＦ含有混合物を、２５全体適合（ｏｍｎｉｆｉｔ）ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス樹脂（カラム寸法１．０ｘ３５ｃｍ；総容積２７．５ｍｌ）の一つのＳＰＨＰ樹脂上に装填した。緩衝液Ａは、０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（２３ｍｓ）であった。緩衝液Ｂは０．７ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（６３ｍｓ）であった。カラムは最初に緩衝液Ａで平衡にした。０．２４ｍｇ／ｍｌで３４５ｍｌのＨＩＣプールが２５ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（１７ｍｓ）に調整され、その３６２ｍｌを装填して、３ｍｇ／ｍｌ樹脂の負荷とした；８２．５ｍｇのＮＧＦを装填した。装填速度は１時間当り４０ｃｍとした。ＮＧＦを、３０％から８０％までの緩衝液Ｂ（０．３５から０．６０ＭまでのＮａＣｌ；３７から５７ｍｓ）の２２カラム容量の勾配を使用して溶出させた。溶出速度は１時間当り６０ｃｍとした。吸光度単位（２８０ｎｍ）とｍＳ／ｃｍを分画数と溶出容積ｍｌに対してプロットした。ＮＧＦを含有する分画を決定し、プールした。この場合、分画４３から６０をプールして、０．３８ｍｇ／ｍｌＮＧＦの９９ｍｌのサンプルを得た。これは約４６％の回収率になる。
【図２】図２は、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・プールとＳＰ−セファロースＨＰプールのＳＰ−ＮＰＲ ＨＰＬＣカチオン交換（ＨＰＩＥＸ）分析を示す。それぞれに対するクロマトグラムに標しをする。
【図３】図３は、ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程からの選択した分画（主プール、主ピークプールの先端と後端）のＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。３つのシグナルが重ねられて描かれている。分かるように、（成熟ＮＧＦを含む）主ピークは変種ＮＧＦ群を含む幾つかのより小さいピークとは分離している。
【図４】図４は、ヒトプレプロＮＧＦの配列（配列番号：１）を示す。この図上に示されているのは、成熟ＮＧＦの最初のアミノ酸（位置１）と１２０ＮＧＦの最後のアミノ酸（位置１２０）である。好適なＮＧＦアミノ酸配列は成熟１１８型のもの（位置１から位置１１８）である。また示されているのは変種形態：成熟１２０（位置１から位置１２０）；成熟１１７（位置１から位置１１７）；Ｒ１２０（位置１から１２０）；及び成熟１１４（アミノ酸１から１１４）、１１５（アミノ酸１から１１５）及び１１７（アミノ酸１から１１７）変種を含む、Ｎ末端とＣ末端に生じるその他の誤ってプロセシングされた部位である。タンパク分解性に誤ってプロセシングされた主要なミスプロセシング変種は、ＮＧＦのプロ配列のアミノ酸Ｒ（−３９）とＳ（−３８）の間にＮ末端切断を有している。可能な開始メチオニンには下線が付される。他のＮ末端変種には、ＮＧＦの切断型が含まれ、最もありふれたものはアミノ酸Ｈ８とＨ９及びＲ９とＧ１０の間に生じる切断を有している。
【図５】図５は、ヒトＮＧＦ（配列番号：２）、マウスＮＧＦ（配列番号：３）、ＢＤＮＦ（配列番号：４）、ＮＴ−３（配列番号：５）及びＮＴ−４／５（配列番号：６）のニューロトロフィンのアミノ酸配列を示している。ボックスで囲った領域はシステインノットモチーフに関与する相同的システイン含有領域を示している図である（De Youngら, Protein Sci. 5(8):1554-66(1996)）。
【図６】図６は、ＤＥＡＥ−セファロース・ファースト・フロー（ＤＥＦＦ）樹脂カラムでのｒｈＮＴ−４／５のクロマトグラフィーパターンを示す。「ＮＴ４５ＤＥ１：１＿ＵＶ」と標されているクロマトグラムは２８０ｎｍでのＵＶ吸光度測定値である。「ＮＴ４５ＤＥ１：１＿Ｃｏｎｄ１」と標されているクロマトグラムは溶出する分画の伝導率測定値である。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図７】図７は、ＳＰ−セファロース・ファースト・フロー樹脂カラムでのｒｈＮＴ−４／５のクロマトグラフィーパターンを示す。「ＮＴ４５ＳＦＦ１：１＿ＵＶ」と標されているクロマトグラムは２８０ｎｍでのＵＶ吸光度測定値である。「ＮＴ４５ＳＦＦ１：１＿Ｃｏｎｄ１」と標されているクロマトグラムは溶出する分画の伝導率測定値である。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図８】図８は、明細書に記載された条件下でのｒｈＮＴ−４／５の典型的な調製用Ｃ４−ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーパターンを示す。２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図９】図９は、示した時間での再折り畳みの間モニターされたＮＴ４／５試料の分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーパターンを提供する。カラム条件は明細書中に記載した。「ＳＳＦＦ（０．５ｍ）」と標されたパターンは、再折り畳みの前にＳ−セファロース・ファースト・フロー・カラムから０．５ＭのＮａＣｌで溶出させたＮＴ−４／５の分析を示す。ＮＴ−４／５が再折り畳みされるにつれて、溶出パターンは標準のパターンに近づく。
【図１０】図１０は、疎水的相互作用クロマトグラフィーカラムであるフェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラムでの誤って折り畳まれた変種からの無傷の正しく折り畳まれたＮＴ−４／５の分離を示すクロマトグラムを示す。正しく折り畳まれたＮＴ−４／５よりも疎水性が低い誤って折り畳まれた変種は素通り分内に溶出する一方、より疎水性である誤って折り畳まれた変種（ピークＢ）は、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５（ピークＡ）を溶出するのに必要とされるものよりも高い有機溶媒濃度で溶出する。
【図１１】図１１は、カチオン交換樹脂であるＳＰ−セファロースからのＮＴ−４／５と変種の溶出パターンを示す。２８０ｎｍでの吸光度がモニターされた。ピークＡがカルバミル化され切詰められた（ｃｌｉｐｐｅｄ）変種を含む一方、ピークＢは無傷の正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を含む。プールされたＮＴ−４／５含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図１２】図１２は、明細書に記載された条件下でのｒｈＮＴ−４／５の典型的な調製用ポリキャットＡ樹脂クロマトグラフィーパターンを示す。
【図１３】図１３は、本明細書に記載したｒｈＮＴ４／５精製法の示された工程から採られた試料の純度と均一性を評価するための還元条件下での１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サンジエゴのＮｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．からの、予め注がれたトリス−グリシン系）分析を示す。ゲルは、タンパク質を検出するために、クーマジーＲ２５０で染色された。「ＤＥ負荷」と標されたレーンはＤＥ−セファロース・ファースト・フロー・カラム上に負荷されたＰＥＩ混合物の試料を含み、「ＤＥ ＦＴ」と標されたレーンはＤＥ−セファロース・ファースト・フロー・カラムの素通り分の試料を含み、レーン「Ｓプール」は、再折り畳み前に、Ｓ−セファロース・ファースト・フロー樹脂カラムから溶出したＮＴ−４／５を含むプールされた分画からの試料を含み、レーン「再折り畳みプール」は再折り畳みが完了した後のプールの試料を含み、レーン「Ｃ４プール」は調製的Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ後のプール分画の試料を含み、レーン「ポリキャットＡプール」はポリキャットＡ ＨＰＬＣカラムからのプール分画の試料を含む。
【図１４】図１４は、細菌的に調製されたスルホニル化ｒｈＮＴ−３を含む混合物のＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーからの分画のＵＶ吸光度パターンを示す。
【図１５】図１５は、ｒｈＮＴ−３のインビトロ再折り畳み型を含む混合物のマクロプレップ・ハイ・Ｓ（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ）カチオン交換クロマトグラフィーを示す。樹脂は、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）から購入した。カラム寸法は９ｘ９ｃｍであった。ｐＨ６．８の再折り畳みされた（３６時間の再折り畳み後）を含む７００ｍｌＳＳＦＦプールが約３１０ｍｌ／分の流量でマクロプレップ・カラム上に負荷された。条件は明細書に記載する。
【図１６】図１６は、誤って折り畳まれた変種を除去するための、カチオン交換精製再折り畳みｒｈＮＴ−３のフェニル・セファロース・ファースト・フロー・ハイ・サブスティチューション（疎水的相互作用クロマトグラフィー）クロマトグラフィーを示す。
【図１７】図１７は、ＨＩＣ−ｒｈＮＴ−３プールのＳＰ−セファロース高速クロマトグラフィーを示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのニューロトロフィン、より詳細には神経成長因子（ＮＧＦ）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、及びニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）を、特に細菌もしくは哺乳動物細胞発酵により産生される場合に、これらに付随する変種、不純物、及び汚染物質から精製するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
比較的純粋で生物学的に活性なポリペプチド及びタンパク質を大量に生産することは、ヒトと動物の医薬製剤、酵素及びその他の特殊化学製品の製造に対して経済的に重要である。多数のタンパク質の生産に対して、多量の外来性タンパク質を哺乳動物の宿主細胞及び細菌及びその他の宿主細胞中に発現しうることから、組換えＤＮＡ技術が選択方法になった。
【０００３】
哺乳動物ＮＧＦ（マウスＮＧＦ）の一次構造は、非特許文献１によって最初に解明された。その前駆物質であるプレプロＮＧＦの一次構造は、マウスＮＧＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推論された（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
相同的ヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）遺伝子もまた同定された（非特許文献４；特許文献１）。マウスＮＧＦに対するその相同性は、アミノ酸とヌクレオチド配列レベルでそれぞれ約９０％と８７％である。天然に生じるヒトＮＧＦは希少であるため、ヒトＧＮＦは生化学的に細かく詳細に特徴付けるのに充分な量では天然源から調製されていない。
【０００５】
ＮＧＦに関連する更なる神経栄養因子がそれ以降に同定されている。これらには、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（非特許文献５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、及びニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）（非特許文献９）が含まれる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの遠いメンバーであるＧＤＮＦとニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ：「ＮＴＮ」）は、交感感覚神経細胞及び中枢神経系神経細胞に対する二つの最近同定された構造的に関連している強力な生存因子である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
組換えタンパク質を生産するには、そのタンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞に形質移入し、組換えタンパク質の発現に好ましい条件下で細胞を成長させる。原核生物の大腸菌が、低コスト高収量で組換えタンパク質を生産することを可能にすることから、好まれる宿主であった。タンパク質をコードするＤＮＡの一般的な細菌での発現に関しては、細胞外又は周辺質担体タンパク質に対する細菌遺伝子と非細菌遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ分子に関する特許文献２、凝集体形成ポリペプチドとの外来性ポリペプチドの同時生産に関する特許文献３、ＩＧＦ−ＩのようなポリペプチドとのｔｒｐＬＥ融合とｔｒｐプロモーター／オペレーターを持つ発現ベクターに関する特許文献４、外来性タンパク質と共に含む発現調節配列に関する特許文献５及びＩＧＦ−Ｉをコードしているもののような特異的環状ＤＮＡプラスミドに関する特許文献６を含む多くの米国特許が存在する。
【０００７】
遺伝子操作により作成されるバイオ医薬品は、典型的には種々の多様な宿主細胞汚染物質を含んでいる上清から精製される。特にＮＧＦは、多数の異なった方法を使用し、様々な度合いの努力と成功度をもって様々な度合いに精製されたことは報告されている。例えば、非特許文献１４、ＮＧＦのＣＨＯ細胞による産生を開示している特許文献７、非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７を参照せよ。これらの努力は主として研究室規模のものであった。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５２８８６２２号
【特許文献２】米国特許第４５６５７８５号
【特許文献３】米国特許第４６７３６４１号
【特許文献４】米国特許第４７３８９２１号
【特許文献５】米国特許第４７９５７０６号
【特許文献６】米国特許第４７１０４７３号
【特許文献７】米国特許第５０８２７７４号
【非特許文献１】AngelettiとBradshaw（Proc.Natl.Acad.Aci. USA 68:2417(1971)）
【非特許文献２】Scottら Nature 302:538(1983)
【非特許文献３】Ullrichら Nature 303:821(1983)
【非特許文献４】Ullrich, Symp. on Quan.Biol., Cold Spring Harbor 48:435(1983)
【非特許文献５】Leibrockら, Nature, 341:149-152(1989)
【非特許文献６】Kaishoら, FEBS Lett., 266:187(1990)
【非特許文献７】Maisonpierreら, Science, 247:1446(1990)
【非特許文献８】Rosenthalら, Neuron, 4:767(1990)
【非特許文献９】Berkmeierら, Neuron, 7:857-866(1991)
【非特許文献１０】Linら, Science 260:1130-1132(1993)
【非特許文献１１】Hendersonら, Science 266:1062-1064(1994)
【非特許文献１２】Buj-Belloら, Neuron 15:821-828(1995)
【非特許文献１３】Kotzbauerら Nature 384:467-470(1996)
【非特許文献１４】Longoら（IBRO Handbook,vol.12,pp3-30(1989))
【非特許文献１５】BruceとHeinrich（Neurobio. Aging 10:89-94(1989))
【非特許文献１６】Schmelzerら（J.Neurochem. 59:1675-1683(1992))
【非特許文献１７】Burtonら（J.Neurochem. 59:1937-1945(1992))
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、変種が本質的に含まれない製薬的純度と高収量を達成できるような組換えヒトＮＧＦの調製的単離は、従来技術が解決できなかった課題であった。
【００１０】
従って、ニューロトロフィン、特にＮＧＦ及びＮＧＦファミリーのニューロトロフィンを、その変種とその他の分子から、また高いｐＩを持つ他のポリペプチドから選択的に分離するための効率的なプロトコールに対する必要性が従来から存在している。大きな規模でニューロトロフィンを精製する方法は、治療上の必要性を満たすために、発酵ブロス、溶解細菌もしくは哺乳動物細胞を含む様々な供給源からの出発原料に適用できなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
更に、本発明者らは、過去には知られておらず分離が困難なニューロトロフィン変種、例えばＮＧＦ変種を発見したので、ここに提供する方法は、望ましくない変種が実質的に含まれない、ヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）、ｒｈＮＴ−３及びｒｈＮＴ−４／５及びその所望の遺伝子操作突然変異体を含む組換えニューロトロフィンを、商業的に有用な量で提供するために特に有用である。本発明のかかる目的とその他の目的は当業者には明らかであろう。
【００１２】
本発明の一実施態様において、ニューロトロフィン、特に高度に相同的なレセプターファミリー（ｔｒｋｓ）、好ましくはｒｈＮＧＦ、ｒＮＴ−３、ｒｈＮＴ−４／５、ｒｈＢＤＮＦもしくはその所望の遺伝子操作形態による認識を分かつＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、及びＢＤＮＦを含む、特にＮＧＦファミリーのものを、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して精製する方法が提供される。
【００１３】
ここに報告したように、ニューロトロフィンの組換え生産から生じるある種の望ましくないニューロトロフィン変種を本発明者らが発見したことに鑑みると、ＨＩＣの使用は、ニューロトロフィンの化学的に異なる形態ともしくは誤って折り畳まれた形態でさえも、所望の正しく折り畳まれた無傷のニューロトロフィンから分離することを可能にする。取り除くことができる変種は、部分的にプロセシングされた前駆配列、グリコシル化された成熟及び前駆物質含有形態（真核生物細胞培養にある場合）、及び誤って折り畳まれ部分的に折り畳まれた変種（一般にインビトロ折り畳み工程が使用される場合、細菌細胞培養からのもの）を含む、疎水性が成熟した正しく折り畳まれた無傷のニューロトロフィンとは異なるものである。例えば、ＨＩＣは、ＮＧＦの部分的にプロセシングされた前駆配列、ＮＧＦのグリコシル化された種及び前駆体（真核細胞培養に存在する場合）、及び誤って折り畳まれ部分的に折り畳まれた変種（一般に細菌細胞培養からでインビトロ折り畳み工程からのもの）を成熟ＮＧＦの混合物から除去するのに特に有用である。ＮＧＦは一つのＮ結合グリコシル化部位をＡｓｎ４５に有している。細菌中に発現された再折り畳みｒｈＮＴ−４／５の場合は、ＨＩＣは、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を間違って折り畳まれた形態から分離する。ここに記載した方法によれば、ニューロトロフィンは本質的にこれらの変種を含まない。ニューロトロフィンの精製に対して、ＨＩＣ樹脂官能基は、オクチル及びブチル基も有用であるが、好ましくはフェニル基である。特に好ましい実施態様は、フェニル・トーヨーパール（Ｐｈｅｎｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブスティチューション（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｌｏｗ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＴＳＫ−フェニル５ＰＷ（ＴＳＫ−Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ）等々のＨＩＣ樹脂である。
【００１４】
他の実施態様では、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのもの、好ましくｒｈＮＧＦ、ｒＮＴ−３、ｒｈＮＴ−４／５もしくはその所望の遺伝子操作形態を、負荷修飾変種、例えば成熟ニューロトロフィン由来の酸化、ｉｓｏａｓｐ（イソアスパラギン酸）及び脱アミド形態を分離する調製的カチオン交換クロマトグラフィーの使用によって精製する方法が提供される。特に好適な実施態様は、ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤ ＳＯ３、又はポリアスパラギン酸樹脂を用い、なかでもポリキャット（ＰｏｌｙＣＡＴ）Ａが特に好適である。最も好適には、大規模のＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス樹脂又はフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂が使用される。
【００１５】
本発明の更に他の実施態様では、ＨＩＣとカチオン交換クロマトグラフィーの両方が、所望のニューロトロフィン、例えば実質的に均質な、すなわち例えば誤って折り畳まれた変種及び化学変種のような加工及び負荷変種の双方を実質的に含まず、タンパク含量に関してもまた実質的に純粋である組換え成熟ＮＧＦ、好ましくはヒトＮＧＦの組成物を調製するために使用される。
【００１６】
この発明の一実施態様では、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのもの、好ましく組換えヒトＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５及びその所望の遺伝子操作形態を、関連する所望されない変種、例えば発酵、プロテアーゼ切断変種、グリコシル化変種、誤って折り畳まれた変種を、逆相液体クロマトグラフィーによって精製する改良方法が提供される。より好ましくは、ＮＧＦは１２０／１２０又は１１８／１１８ホモ二量体形である。ここに記載した方法によれば、ニューロトロフィンは、最も好ましくは変種を本質的に含まない。
【００１７】
他の実施態様においては、ニューロトロフィン、特にＮＧＦファミリーのものを、生理的ｐＨを含む溶出条件を使用して関連する変種から精製する方法が提供される。
更に他の実施態様では、均一性がかなり改善される結果が得られるニューロトロフィンの精製方法が提供される。
【００１８】
他の実施態様において、本発明は、ＮＧＦファミリーのニューロトロフィンをその変種から分離する方法であって、
ａ）ニューロトロフィンとその変種を含む緩衝液を約５から８のｐＨで疎水的相互作用クロマトグラフィーカラムに装填し；
ｂ）カラムを洗浄し、
ｃ）約５から８のｐＨの緩衝液でニューロトロフィンを溶出させ、
ｄ）約５から８のｐＨでカチオン交換クロマトグラフィーカラムにニューロトロフィン含有溶出物を装填し、
ｅ）約５から８のｐＨ、好ましくはｐＨ６で塩勾配の緩衝液でカラムからニューロトロフィンを溶出させる、
ことを含んでなる方法を提供する。ニューロトロフィンは最も好ましくはｒｈＮＧＦである。
【００１９】
本発明の一実施態様では、好ましくはＮＧＦ分画であるニューロトロフィン分画から宿主細胞タンパク質を効果的に除去するシリカゲルクロマトグラフィー工程が提供される。
【００２０】
本発明の一実施態様では、１２０アミノ酸ＮＧＦがトリプシン様プロテアーゼ処理を受けて、ＶＲＲＡのＣ末端から末端ＲＡジペプチドを選択的に除去して、１１８種を生成する方法の工程が提供される。固定化トリプシンカラムが好適である。
【００２１】
本発明はまた本発明の方法により調製されたニューロトロフィン組成物と製剤及び組成物と製剤への用途にも関する。提供されるものは、実質的に均一な、すなわち例えば誤って折り畳まれた変種と化学変種のような加工及び負荷変種の双方とも実質的に含まず、またタンパク質含量に関して実質的に純粋であるニューロトロフィンの組成物である。好ましくは、成熟ヒトＮＧＦ、成熟ヒトもしくはラットＮＴ−３、及び成熟ヒトＮＴ−４／５がこの形で提供される。好適な実施態様では、ＮＧＦは１２０種で、より好ましくは１１８型であり、最も好ましくはホモ二量体、例えば１１８／１１８である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
＜定義＞
本明細書において、「ニューロトロフィン」とは、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、そして好ましくはヒトを含む任意の種から、また天然であろうと、合成であろうと組換え生産されたものであろうと、任意のソース由来の、未変性配列もしくは遺伝子操作形態のニューロトロフィン、好ましくはＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、及びＢＤＮＦを含むＮＧＦファミリーのニューロトロフィンをいう。例えば、「ＮＧＦ」は、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、そして好ましくはヒトを含む任意の種から、また天然であろうと、合成であろうと組換え生産されたものであろうと、任意のソース由来の神経成長因子をいう。好ましくは、ニューロトロフィンは組換え的に生産される。好適な方法では、ニューロトロフィンはクローン化され、そのＤＮＡは例えば哺乳動物細胞、細菌細胞中で発現される。ここに教示したプロセスと方法はニューロトロフィン、ＧＤＮＦ及びニュールツリンにも適用し得る。
【００２３】
ヒトの用途に対して好ましいものは、ヒト未変性配列、成熟ＮＧＦであり、より好ましくは１２０アミノ酸配列、更により好ましくは１１８アミノ酸配列である。より好適には、この未変性配列ＮＧＦは組替え的に生産される。ヒトプレプロＮＧＦとヒト成熟ＮＧＦに対する好適なアミノ酸配列は、出典明示によりここに特に取込む米国特許第５２８８６２２号によって提供される。更なる翻訳後の修飾のない１２０アミノ酸型はホモ二量体形（つまり、１２０／１２０）における好適な型である。更により好適なものは、更なる翻訳後の修飾のない、特にホモ二量体のような１１８型（つまり、１１８／１１８）である。
【００２４】
「実質的に純粋な」が意味するところは、少なくとも７０％のニューロトロフィン、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、９５％もしくは９９％と増大する、全タンパク質に対する全ニューロトロフィン、例えばＮＧＦの純度の度合いである。特に好適な純度は少なくとも９５％である。「本質的に純粋な」が意味するところは、組成物が、所望のニューロトロフィンについて少なくとも９０％もしくはそれ以上純粋であることである。
【００２５】
「ニューロトロフィン変種が実質的に含まれない」が意味するところは、（望ましさが劣るニューロトロフィン種を含む）全ニューロトロフィンに対する所望のニューロトロフィンのパーセントが少なくとも７０％の所望のニューロトロフィン種、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、９３％、９５％もしくは９９％と増大する組成物である。「本質的に含まれない」が意味するところは、組成物が所望のニューロトロフィンを少なくとも９０％あるいはそれ以上含むことである。特に好適な量は、少なくとも９５％の所望のニューロトロフィン、例えば正しく折り畳まれた無傷の１１８／１１８ｒｈＮＧＦ種である。その他の望まれない種もしくは型は、発酵もしくは精製プロセスから生じる、例えば変更された負荷変種のような、誤ってプロセシングされた型又は化学変種、又は好ましくはここに開示した前記のものの全てである。例えば、ＮＧＦが細菌中での合成後にインビトロで折り畳まれる場合、「種」又は「変種」は誤って折り畳まれた型あるいは部分的に折り畳まれた型を含み得る。
【００２６】
「誤って折り畳まれた」変種が意味するところは、そのシステイン残基対合により、もしくは遊離しているかブロックされている特定のシステイン残基により、ニューロトロフィンとは異なるニューロトロフィンの変種である。誤って折り畳まれた変種もまたニューロトロフィンと同じシステイン対合を有し得るが、誤った折り畳みから生じる異なった三次元高次構造を有する。
【００２７】
「化学」変種が意味するところは、例えば変更された電荷を有することにより、カルバミル化、脱アミド、酸化、グリコシル化、又はタンパク分解性切断により、ニューロトロフィンとは化学的に異なる変種である。
【００２８】
この発明のカラムの観点において、緩衝液は、一般に、約５から８の範囲のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを調節する緩衝液には、例えば、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ジメチルマロン酸、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＥＳ、トリスバッファー、例えばトリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、グリシンアミド、ＢＩＣＩＮＥ、グリシルグリシン、及びホウ酸塩バッファーが含まれる。好適な緩衝液はＭＯＰＳＯバッファーである。
【００２９】
ここにおいて使用するところでは、「アルコール」と「アルコール溶媒」とは、アルコールに対して通常使用されている技術用語の意味を持つものであり、好ましくは、１から１０の炭素原子を持つアルコール、より好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノ−ル、もしくはｔ−ブタノール、並びにグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリエチレングリコール、最も好ましくはエタノールもしくはイソプロパノールである。このようなアルコールは、水溶液に添加したときに、溶液極性を減少させることにより溶液の疎水性を増大させる溶媒である。
【００３０】
ＭＯＰＳＯは３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸である。ＨＥＰＥＳはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸である。試薬アルコールは９５容量部（特別に変成したアルコール・フォームラ３Ａ及び５容量部のイソプロピルアルコール）である。ＭＥＳは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸である。ＵＦ／ＤＦは限外濾過／ダイアフィルトレーションを意味する。ＴＭＡＣはテトラメチルアンモニウムクロリドである。ＴＥＡＣはテトラエチルアンモニウムクロリドである。ＮＧＦ−１２０は完全長１２０／１２０神経成長因子を意味する。ＮＧＦ−１１８は１１８残基のホモ二量体成熟ＮＧＦを意味する。酸化ＮＧＦは、成熟未変性ＮＧＦの約８０％の生物学的活性があるとここに報告されているＮＧＦ変種分子であるメツルフォキシド（Ｍｅｔｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）３７を意味する。ＩｓｏａｓｐＮＧＦはＮＧＦ異性体化変種分子、Ａｓｐ９３を意味する。脱アミドＮＧＦは、Ａｓｐ４５に転換されたＡｓｎ４５を有するＮＧＦを意味する。ＲＮＧＦはそのＮ末端に余分なアルギニン残基を持つＮＧＦ分子を意味する。ＣＨＯはチャイニーズハムスター卵巣細胞を意味する。
【００３１】
ここに記載された樹脂は、マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換（バイオラッド研究所、強いカチオン交換、ＳＯ３官能基、名目粒径５０ミクロン、名目孔径１０００Ａ）、シリカゲル（未誘導体化）、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブスティチューション（ファーマシア；高度に架橋した６％アガロース；粒径４５−１６５ミクロン）、ＳＰ−セファロースＨＰ（ファーマシア；高度に架橋した６％アガロース；粒径３４ミクロン）、フェニル・トーヨーパール６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ；粒径４０−９０ミクロン）、及びフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３−６５０Ｓ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（ドイツ）の米国関連会社であるＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ；粒径２５−４０ミクロン）を含む。
【００３２】
＜発明を実施するための形態の説明＞
ニューロトロフィンは、神経系の発達と維持に重要な役割を果たす小さい塩基性タンパク質のファミリーに属する。このファミリーの最初に同定され恐らくは最もよく理解されているメンバーは神経成長因子（ＮＧＦ）である。１９９２年１２月８日発行の米国特許第５１６９７６２号を参照せよ。
【００３３】
最近、ＮＧＦと類似した機能を有している配列的に関連しているが別個のポリペプチドが同定された。例えば、ニューロトロフィン−２（ＮＴ２）ともいわれる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が、Leibrockら（Nature, 341:49-159[1989]）によりクローン化され配列決定された。
【００３４】
幾つかの研究グループが、ニューロン因子（ＮＦ）と当初は呼ばれ、今はニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）といわれる神経栄養因子を同定した（Ernforsら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87:5454-5458[1990]; Hoehnら, Nature, 344:339[1990]; Maisonpierreら, Science, 247:1446[1990]; Rosenthalら, Neuron, 4:767[1990]; JonesとReichardt, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87:8060-8064[1990]; Kaishoら, FEBS Lett., 266:187[1990]）。
【００３５】
（ＮＴ４又はＮＴ５といわれる）ニューロトロフィン−４／５が同定された（Hallbookら, Neuron, 6:844-858[1991]; Berkmeierら, Neuron, 7:857-866[1991]; Ipら, Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 89:3060-3064[1992]）。１９９４年１１月１５日に発行された米国特許第５３６４７６９号は、ヒトＮＴ−４／５及びその組換え発現方法を開示しており、出典明示によりここに取り込まれる。
【００３６】
また報告されているのは、キメラ及びパントロピックニューロトロフィン、例えば１９９６年１月３０日に発行された米国特許第５４８８０９９号、Urferら（EMBO J. 13(24):5896-909(1994)）及び、ニューロトロフィンが、一以上のレセプターに結合するように修飾されたか、未変性ニューロトロフィンに有意な程度では通常はないレセプター結合活性を含む（ここに出典明示により取込まれる）１９９５年１２月１４日公開のＷＯ９５／３３８２９に報告されたようなものである。
【００３７】
特に興味深いものはＭＮＴＳ−１及びＤ１５Ａ ＮＴ３と命名されたニューロトロフィンである。また特に興味深いものは、ＮＧＦアミノ酸バックボーンを有するがｔｒｋＡ以外のレセプター、例えばｔｒｋＢ又はｔｒｋＣに結合するように修飾されたニューロトロフィンである。
【００３８】
ＮＴ−３のｔｒｋレセプターへの結合の原因であるＮＴ−３の対応する位置からのアミノ酸を持つＮＧＦにアミノ酸置換がなされたものが好適である。このようなＮＧＦ突然変異体は、ＮＧＦ薬物動態学的及び精製挙動を保持しながらＮＴ−３様レセプター結合活性を有する（Urferら, Biochemistry 36(16):4775-4781(1997)）。これらのＮＧＦ突然変異体はまたｔｒｋＡ結合活性を欠き得る（Shihら, J.Biol.Chem. 269(44):27679-86(1994)）。このようなＮＧＦ突然変異体がここに記載する本発明の用途に対して特に好適なニューロトロフィンである。
【００３９】
組換えヒトニューロトロフィン、例えばｒｈＮＧＦの単離は、種々の多様な宿主細胞汚染物質からのタンパク質の分離を含む。各工程は、十分な分離が生じることを可能にする特別な緩衝液を含む。ニューロトロフィンに対する最後もしくは最後から二番目のプロセシング工程は、通常のクロマトグラフィー媒体を使用して同時精製する幾つかのニューロトロフィン変種の存在により複雑化する。再折り畳み工程が回収・精製工程に含まれる場合、変種はニューロトロフィンの誤って折り畳まれた型を含む。変種はまたニューロトロフィンとは化学的に異なるもの、例えばカルバミル化、脱アミド、脱アミドもしくはタンパク分解性に切断された形態をも含みうる。ＮＧＦの場合、これらの種は主に二量体型−ホモ二量体、例えば１１８／１１８が所望の場合、１２０／１２０又は１１７／１１７、又はヘテロ二量体、例えば１２０／１１８、１１７／１１８−、化学的に修飾された変種−イソアスパラギン酸、モノ酸化、グリコシル化変種、Ｎ末端及びＣ末端切断型、及びその二量体からなる。
【００４０】
本発明は、ニューロトロフィン、特にｒｈＮＧＦを、例えばアルツハイマー病、糖尿病及びエイズ関連神経障害を含む抹消神経障害等々の治療のような治療用途に十分な量で大規模に生産することを可能にする。
【００４１】
ＮＧＦとその他のニューロトロフィン、好ましくはＮＧＦファミリーのものとの間の配列と高次構造の類似性に鑑みると、本発明の方法は、誤ってプロセシングされた変種、誤って折り畳まれもしくは部分的に折り畳まれた変種、グリコシル化変種及び／又は負荷変種を実質的に含まないこれらのニューロトロフィンを調製するために適用しうる。本発明において、これらとその他の密接に関連した変種からニューロトロフィンを選択的に分離するのに望ましいカラム樹脂と条件が特定される。
【００４２】
ニューロトロフィンには、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６、ＢＤＮＦ、及びそのヘテロ二量体、キメラもしくはパントロピック形を含む操作形態が含まれる。好ましくは、ニューロトロフィンはヒトあるいはヒトアミノ酸配列と高度に相同性を有するもので、ヒト配列に対して好ましくは８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、最も好ましくは９５％より多い相同性を有する。操作されたニューロトロフィンは、それが模倣する未変性ニューロトロフィンのｔｒｋレセプター結合機能の少なくとも５０％を保持し、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％を保持する。これらの操作された型は、ここに記載する方法において類似の性能を保持する未変性ニューロトロフィンの疎水的性質又は十分に高いｐＩを保持するものである。
【００４３】
以下に記載するように、ここに記載する方法は、ｒｈＮＧＦ、ｒｈＮＴ−３及びｒｈＮＴ−５に首尾よく適用された。例えば、大腸菌において作られたｒｈＮＴ−４／５が、封入体に単離され、還元され、封入体から可溶化された。還元されたＮＴ−４／５はＤＥセファロース・ファースト・フロー及びＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーによって部分的に精製された。Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・プールはグアニジン含有緩衝液中で２４時間の間再び折り畳まれた。ＮＴ−４／５の誤って折り畳まれた型はここに大規模なもので開示したクロマトグラフィーによって除去した。ＮＴ−４／５のカルバミル化及び切詰め型（誤ってプロセシングされた形態）が、大規模のカラム形式での高速カチオン交換クロマトグラフィーにより、ポリキャットＡ ＨＰＬＣ樹脂もしくはＳＰセファロースＨＰ樹脂で除去された。精製ｒｈＮＴ−４／５は製剤用に酸性緩衝液中に限外濾過されダイアフィルトレーションにかけられた。
【００４４】
本発明の一実施態様は、通常はニューロトロフィンを大抵の他の不純物から既に精製した後、典型的には製剤化の前の脱塩もしくはダイアフィルトレーションの前の最終工程又は最終に近い工程において、ニューロトロフィンをその関連する変種から精製することを含む。混合物中の関連した変種は、発酵の結果生じる変種残渣ばかりでなく、ニューロトロフィンが貯蔵もしくはプロセシング中に分解した場合に生成された変種も含みうる。
【００４５】
本発明の実施態様において使用するのに適したニューロトロフィンは、任意の手段により調製することができるが、好ましくは組替え的に調製される。ここで考察したニューロトロフィンをコードしている核酸分子は幾つかのソースから入手可能であり、例えば既知のＤＮＡ配列を用いて化学合成により、又は当業者に知られている標準的なクローニング法を使用することにより入手できる。例えばｈＧＮＦコード配列のようなニューロトロフィンを保有しているｃＤＮＡクローンは、ニューロトロフィンの既知の配列に基づいて特に設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して同定することができる。
【００４６】
ニューロトロフィンコード配列を有する分子を得る際には、分子を、選ばれた宿主細胞中に発現させるために適したクローニングベクター内に挿入する。クローニングベクターは、コード配列の効率的な転写、翻訳及びプロセシングに必要とされる好適な調節機能をもたらすように作成される。
【００４７】
ニューロトロフィンが組替え的に調製される場合、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを発現するために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母もしくはより高等な真核生物細胞である。この目的に対して適した原核生物は、古細菌及び真正細菌のような細菌を含む。好適な細菌は真正細菌、例えばグラム陰性もしくはグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属；桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）；シュードモナス属、例えば緑膿菌；ストレプトマイセス属；アゾトバクタ；根粒菌；ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）；及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）である。好適な大腸菌宿主には、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、大腸菌９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）が含まれる。これらの例は限定するものではなくむしろ例証のためのものである。
【００４８】
１９９５年１１月１６日に公開されたＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／３０６８６の全体を出典明示によりここに取込む。この刊行物は、そのＮＧＦの細菌合成とインビトロ折り畳みの記載が特に関連する。その方法から得られた生成物を本発明の精製方法により精製することができる。
【００４９】
上述の細菌の任意のものの突然変異体細胞を使用することもできる。細菌の細胞中におけるレプリコンの複製性を考慮に入れて好適な細菌を選択することは勿論必要である。例えば、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ種が、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＡ１７７、もしくはｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドがレプリコンを供給するために使用される場合、宿主として好適に使用することができる。
【００５０】
大腸菌株Ｗ３１１０は組換えＤＮＡ産物発酵に対するよく知られた宿主株であるので、好適な宿主もしくは親宿主である。好適には、宿主細胞は最小量のタンパク分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に対して内在性のタンパク質をコードしている遺伝子で遺伝的突然変異を行うように修飾することができ、そのような宿主の例としては、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔを持つ大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔｐｔｒ３を持つ大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４、完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡΔＥ１５Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ΔｄｅｇＰΔｏｍｐＴｋａｎ<ｒ>を持つ大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５２４４）、完全遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡΔＥ１５Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ΔｄｅｇＰΔｏｍｐＴΔｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを持つ大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失型変異体を持つ株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４、及び１９９０年８月７日に発行された米国特許第４９４６７８３号に開示された変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株がある。
【００５１】
ヒトＮＧＦは大腸菌中に発現された。ｈＮＧＦのβサブユニットをコードしている遺伝子の単離と配列及び大腸菌中での異種性タンパク質としてのその発現は米国特許第５２８８６２２号に記載された。そこでの教唆もまた哺乳動物細胞から生成した成熟ヒトＮＧＦを提供するのに好適である。組換え技術を使用して、ヒトβ−ＮＧＦはその他の哺乳動物のタンパク質を含まないように発現された。変化したアミノ末端を含む２つの遺伝子を用いて大腸菌中にｈＮＧＦを発現させた結果、融合タンパク質が発現したが、これはIwaiら（Chem.Pharm.Bull.34:4724(1986)）によって記載された。
【００５２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ニューロトロフィンをコードしているベクターのための適切な発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Beach及びNurse, Nature, 290:140(1981);１９８５年５月２日発行のＥＰ１３９３８３）;クルイヴェロミセス宿主［米国特許第４９４３５２９号; FleerらBio/ Technology, 9:968-975(1991)］、例えばＫ.ラクティス［MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.,737(1983)］、Ｋ.フラギリス(ATCC 12424), Ｋ.ブルガリカス (ATCC 16045)、Ｋ.ウィッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ.ワルティイ (ATCC 56,500), Ｋ. ドゥロソフィラルム［ATCC 36,906; Van den Bergら Bio/Technology,8:135(1990)］、Ｋ.サーモトレランス、及びＫ. マルクシアヌス;ヤロウィア[EP 402,226];ピチア・パストリス［EP183070; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol.,28:265-278(1988)］;カンディダ;トリコデルマ・リーシア (EP 244234); ニューロスポラ・クラッサ ［Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)］; シュワニオミセス・オクシデンタリスのようなシュワニオミセス［１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４５３８); 及び糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム［ＷＯ９１／００３５７ １９９１年１月１０日発行］、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデュランス[Balanceら, Biochem Biophys. Res. Commun.,112;284-289(1983); Tilburnら,Gene,26:205-221(1983); Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]及びクロカビ［Kellyら,EMBO J.,4:475-479(1985)］のような、多数の他の属、種、及び菌株が一般に利用でき、ここで有用である。
【００５３】
ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物からもまた誘導できる。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物培養由来であろうと無脊椎動物培養由来であろうと、任意の更に高等の真核生物細胞培養が適している。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、ボンビクス・モリのような宿主が特定されている。例えば、Luckowら, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Millerら, Genetic Engineering, Setlowら編 Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaedaら, Nature,315:592-594(1985)を参照のこと。形質移入には種々のウィルス株が公に利用できる。例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株があり、このようなウィルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入にここで使用することができる。ヒトＮＧＦは１９９３年１２月２１日に発行された米国特許第５２７２０６３号に報告されているように、昆虫細胞において生産されている。
【００５４】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として用いることができる。典型的には、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを含むように前もって操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスのある菌株と共にインキュベートすることによって植物細胞は形質移入される。Ａ.トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ニューロトロフィンをコードしているＤＮＡが、植物細胞宿主が形質移入されるようにその植物細胞宿主に移され、適切な条件下でニューロトロフィンをコードしているＤＮＡを発現する。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる（Depickerら,J.Mol.Appl.Gen., 1:561(1982)）。また、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物細胞中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる（１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６）。
【００５５】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株［２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)］;ハムスター乳児腎細胞（BHK, ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［CHO, UrlaubとChasin, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 (1980)］;マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather,Biol.Reprod., 23:243-251 (1980)］;サルの腎細胞 （CVI ATCC CCL 70）; アフリカミドリザルの腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）; ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝臓細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51); ＴＲＩ細胞［Motherら, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)］; ＭＲＣ５細胞; ＦＳ４細胞; 及びヒト肝癌ライン(Hep G2)である。好適な方法はＣＨＯ細胞中の発現である。プレプロＮＧＦを含むヒトＮＧＦのエキソンを、適切なプロモーター及びベクターを使用して分泌された成熟ＮＧＦ（１１８及び１２０型を含む）の発現を達成するために使用することができる（米国特許第５２８８６２２号）。安定して形質移入された安定なＣＨＯ細胞の培養及びＮＧＦの分泌成熟型は本明細書の実施例において検討されるように、本発明において有用である。
【００５６】
宿主細胞に形質移入し、そして上述の発現又はクローニングベクターで好ましくは形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数の形質移入法が当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに一般に形質移入の成功が認められる。
【００５７】
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように、生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。SambrookらのMolecular Cloning：A Laboratory Manual［New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989］の１．８２節に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクトすることもできる。
【００５８】
このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb（Virology, 52:456-457(1978)）のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら（J.Bact., 130:946(1977)）及びHsiaoら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA,76:3829(1979)）の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等々を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の方法については、Keownら（Methods in Enzymology(1990),Vol185:pp527-537）及び Mansourら（Nature,336:348-352(1988)）を参照のこと。
【００５９】
好適には、ｈＮＧＦの遺伝子が、メチオニン開始コドン、好ましくはUllrichら（Nature,303:821-825(1983)）により同定されたような二つのメチオニン開始コドンの一方を利用できるようにするためにベクター内に挿入される。ｈＮＧＦ遺伝子（Ullrichら, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, p.435(1983);米国特許第５２８８６２２号）は、転写開始コドンとして使用されそうな２つの殆ど隣接するメチオニンを有している（位置１は成熟ｈＮＧＦのＮ末端セリン残基をいう）。これに対して、ＮＧＦに対するマウス顎下腺ｃＤＮＡは、神経成長因子の最も完全に研究されているものであるが、１２１と１１９の位置のメチオニンに加えて１８７の位置にもメチオニンを有している。哺乳動物細胞中の発現に対する好適な実施態様では、プレプロＮＧＦ配列が存在する。
【００６０】
原核生物細胞がニューロトロフィンを生産するために使用される場合には、例えばSambrookらのMolecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989）において一般に記載されているようにしてプロモーターを構成的に又は人為的に誘導することができる適切な培地中で培養される。炭素、窒素、及び無機リン酸塩源以外に、あらゆる必要な補充物質を、単独もしくは複合窒素源のような他の補充物質又は培地との混合物として導入される適当な濃度で含めることもできる。
【００６１】
ニューロトロフィンを生産するために哺乳動物の宿主細胞が用いられる場合、これは種々の培地において培養することができる。ハム（Ham）のＦ１０（Sigma）、最小必須培地（[MEM] Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）及びダルベッコの改良イーグル培地（[DMEM], Sigma）のような市販培地が当該宿主細胞の培養に適している。また、HamとWallace, Meth. Enz., 58:44(1979), Barnes及びSato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号;４６５７８６６号;４９２７７６２号; ５１２２４６９号;４５６０６５５号;ＷＯ９０／０３４３０;ＷＯ８７／００１９５;米国再発行特許第３０９８５号（これらの全ての開示を出典明示によりここに取込む）に記載された任意の培地を宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６２】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler編 (IRL Press at Oxford University Press,Oxford,1991)に見出すことができる。上記の方法は、ニューロトロフィンが細胞内に生産されようが、細胞膜周辺膣に生産されようが、あるいは培地に直接分泌されようが、使用することができる。
【００６３】
典型的には、培養液は適当な時間後に収集され、標準的な同定アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析のようなイムノアッセイ、又は生物学的アッセイ、例えばＰＣ１２細胞分化（Greene,L.A., Trends Neurosci. 7:91 (1986)）が実施される。ここに開示された変種の種類と程度を決定するためのアッセイは従来から知られているか、あるいは実施例において提供されもしくは引用される（例えば、出典明示によりここに取込むSchmelzerらJ.Neurochem.59 (5):1675-83(1992)及びBurtonら,J.Neurochem. 59(5):1937-45(1992)を参照）。
【００６４】
細胞から調製されるニューロトロフィン組成物は、好ましくはＨＩＣに先立って少なくとも一つの精製工程に通される。好適な精製工程の例には、回収すべきニューロトロフィン及び使用する出発培養に依存して、アフィニティクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換樹脂クロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、及び調製的ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようなタンパク質精製の他の方法を含むここに記載したものを含む。
【００６５】
ニューロトロフィンが培地中に直接分泌される一実施態様においては、培地を遠心分離により細胞片から分離し、清澄化された発酵ブロス又は培地を次にシリカゲルでの精製に使用する。シリカクロマトグラフィーに対しては、典型的にはニューロトロフィンポリペプチドがシリカ粒子に付着するように誘導体化されていないシリカ粒子にブロスを通す；シリカ粒子を洗浄して汚染物質を除去する；そしてアルコール性もしくは極性非プロトン溶媒とアルカリ土類、アルカリ金属もしくは無機アンモニウム塩を含む緩衝液でシリカ粒子からポリペプチドを溶出させる。
【００６６】
本発明の好適な実施態様では、ニューロトロフィンをその変種から分離し、またバルク汚染物質を減少させるためにマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーを用いる。この樹脂は、哺乳動物細胞培養からのニューロトロフィンの精製の初期の工程として、好ましくは収集細胞培地の分画に対して使用することができる。他の実施態様では、マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーは、最も好ましくはタンパク質再折り畳み工程の直後に使用される。このカチオン交換カラムの非常に高い流れ性により、大量の希薄な再折り畳みタンパク質又は収集細胞培地ニューロトロフィンを、例えばＨＩＣ又はＳＰ−セファロースのような次のクロマトグラフィー工程の前に、ニューロトロフィンがカラムに結合する条件を調節することにより、容易く濃縮することが可能になる。更に、樹脂のカチオン交換性により、非結合バルクタンパク質及びある種の誤ってプロセシングされた変種及び化学的に修飾された変種（例えば変更負荷、ＭＥＴ３７−酸化変種）の除去が可能になる。最も重要なことは、未変性のニューロトロフィンと疎水性が異なる誤ってプロセシングされた変種もしくは化学的に修飾された変種（例えば（哺乳動物細胞培養生産からの）誤ってプロセシングされた変種、グリコシル化変種）が存在する場合、マクロプレップ樹脂により、これらの疎水性変種の部分的な除去が可能になり、ここで測定されるように、未変性のニューロトロフィンを実質的に富化することになることである。限定することを意図するものではないが、樹脂支持体のバックボーンはニューロトロフィンと樹脂の間の非特異的相互作用を促進する疎水性含量を含むものと信じられ、これがここに教示されるようにして利用される。典型的には、約５から８、より好ましくは６から８のｐＨの溶出緩衝液に対しては、０から３ＭのＴＭＡＣ濃度が有用である。酢酸ナトリウムが、溶出緩衝液のイオン強度を増大させるために存在する場合、より低いＴＭＡＣ濃度を使用することができる。塩化物は酢酸塩イオンに対する好適な代替物である。
【００６７】
ニューロトロフィンが細胞膜周辺膣において生産される実施態様の一例では、培地又は可溶化物が遠心分離されて粒子状の細胞片を除去する。ついで、必要に応じて膜と可溶性タンパク質分画を分離することができる。ついで、ニューロトロフィンは、ニューロトロフィンが膜結合性か、可溶性か、凝集化形態で存在しているかに応じて、可溶性タンパク質分画から、そして培養可溶化物の膜分画から精製することができる。その後、ニューロトロフィンは可溶化され、ついで適切な緩衝液を使用して再び折り畳まれる。再折り畳みタンパク質を生産するための周辺質からのこの単離方法の詳細については以下に記載する。
【００６８】
不溶性の未変性ではないニューロトロフィンは、適切な単離緩衝液中の原核生物宿主細胞から、任意の適当な技術、例えば細胞を適切なイオン強度の緩衝液に曝露して殆どの宿主タンパク質を可溶化させ（しかし凝集ニューロトロフィンは実質的に不溶性である）、封入体を放出し、例えば遠心分離により回収に利用できるようにするように細胞を破壊することにより、単離される。この技術はよく知られており、例えば米国特許第４５１１５０３号に記載されている。
【００６９】
簡単には、細胞は（典型的には、約０．０１から２Ｍ、好ましくは０．１から０．２Ｍのイオン強度を使用して、ｐＨ５から９、好ましくはｐＨ約６から８の）緩衝液中に懸濁される。塩化ナトリウムを含む任意の適切な塩が十分なイオン強度値を維持するために有用である。細胞は、この緩衝液中に懸濁され、ついで、例えば機械的方法、例えばＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎプレスマイクロフルイダイザー、フレンチプレスもしくは音波オシレーター、あるいは化学的又は酵素的方法のような通常用いられている技術を使用して溶解により破壊する。
【００７０】
細胞破壊の化学的もしくは酵素的方法の例には、細菌壁を溶解するリゾチームの使用を伴うスフェロプラスティング（Neuら, Biochem.Biophys.Res.Comm.,17:215(1964)）及びポリペプチドの放出のために生細胞を高緊張度の溶液と低緊張度の冷水洗浄で処理することを含む浸透圧ショック（Neuら, J.Biol.Chem.,240:3685-3692(1965)）が含まれる。米国特許第４６８０２６２号に記載されている第３の方法は、形質転換された細菌細胞を、細胞を死滅させ溶解するのに充分な時間と温度で、有効量の２から４の炭素原子を持つ低級アルカノールに接触させるものである。
【００７１】
細胞を破壊した後、懸濁液は典型的には遠心分離されて封入体をペレット化する。一実施態様では、この工程は、標準的な遠心機において、容量と遠心設計に依存する充分な時間、通常は約１０分から０．５時間、約５００から１５０００ｘｇ、好ましくは約１２０００ｘｇで実施される。得られたペレットは実質的に全ての不溶性のポリペプチド分画を含むが、細胞破壊プロセスが完全でないならば、無傷の細胞もしくは破壊された細胞フラグメントも含有し得る。細胞破壊の完全性は、ペレットを少量の同じ緩衝液中に懸濁させ、懸濁液を位相差顕微鏡で調べることにより検査することができる。破壊細胞フラグメントもしくはホールセルの存在は、フラグメントもしくは細胞及び随伴する非屈折性（ｎｏｎ−ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）ポリペプチドを除去するために更なる破壊が必要であることを示している。そのような更なる破壊後に、必要ならば、懸濁液を再び遠心分離し、ペレットを回収し、再懸濁し、分析する。このプロセスを、視覚検査でペレット化材料中に破壊細胞フラグメントが無いことが明らかになるか、更なる処理でも得られるペレットの寸法を低減することができなくなるまで繰り返す。
【００７２】
別の実施態様では、ニューロトロフィンは、適切な緩衝液中での可溶化により細胞膜周辺膣から単離される。この方法は、ニューロトロフィンが組換え的に生産された後に発酵ベッセルに試薬を直接添加して、収集、ホモジェナイゼーション、及び遠心分離という余分な工程を避けてニューロトロフィンを得るインサイツ溶解化とできる。残りの粒子は遠心分離か濾過もしくはその組合せにより除去することができる。
【００７３】
ニューロトロフィンがアンフォールディングされているならば、アンフォールディングの度合いは、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む非天然ニューロトロフィンのクロマトグラフィーによって適切に決定される。非天然材料に対して増加するピーク領域は、どのくらいの非天然ニューロトロフィンが存在しているかを示す。
【００７４】
可溶化された封入体から又は後の精製の段階で一度得られると、ニューロトロフィンは以下に記載されるように活性な高次構造に適切に再折り畳みされる。
【００７５】
ニューロトロフィンが、再折り畳みされる前に既に可溶形態ではないならば、ニューロトロフィンを実質的に溶解させるのに必要な量のカオトロピック剤と還元剤を含有するアルカリ緩衝液におけるインキュベーションにより可溶化することができる。
【００７６】
ニューロトロフィンの緩衝液中における可溶化の度合いの測定は、濁度決定法により、還元されたＳＤＳゲル上の遠心分離後に上清とペレット間のニューロトロフィン分画を分析することにより、プロテインアッセイ（例えば、バイオ-ラッドタンパク質アッセイキット）により、又はＨＰＬＣにより好適に実施される。
【００７７】
可溶化に対するアルカリ緩衝液のｐＨ範囲は典型的には少なくとも約７．５であり、好適な範囲は約８−１１である。この後の範囲のｐＨをもたらす適切な緩衝液の例としては、グリシン、ＣＡＰＳＯ（３-[シクロヘキシルアミノ]-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２-アミノ-２-メチル-１-プロパノール）、ＣＡＰＳ（３-[シクロヘキシルアミノ]-１-プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２-[Ｎ-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸）、及びトリスＨＣｌ（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンヒドロクロリド）が含まれる。ここで好適な緩衝液は、好ましくは約２０ｍＭの濃度、約８．５から１１のｐＨ、好ましくは約１０−１１のｐＨのグリシン又はＣＡＰＳＯである。
【００７８】
可溶化のための緩衝溶液中のニューロトロフィンの濃度は、ニューロトロフィンが実質的に溶解化され、部分的に又は充分に還元し、変性するようなものでなければならない。あるいは、ニューロトロフィンは最初は不溶性であってもよい。使用する正確な量は、例えば緩衝溶液中の他の成分の濃度とタイプ、特に還元剤のタイプと量、カオトロピック剤のタイプと量、および緩衝液のｐＨに依存する。例えば、ニューロトロフィンの濃度は、還元剤、例えばＤＴＴの濃度が、約３：１から１０：１のＤＤＴ：ニューロトロフィンの比を維持するために、同時に増加させられるならば、少なくとも３倍増加させることができる。希釈再折り畳みの前により濃縮された可溶化タンパク質溶液をつくることが望ましい。従って、ニューロトロフィンの好適な濃度は少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬで、より好ましい範囲は３０−５０ｍｇ／ｍＬである。例えば、ニューロトロフィンは、５Ｍから７Ｍの尿素中に約３０−５０ｍｇ／ｍＬの濃度まで可溶化し、例えば約１ｍｇ／ｍＬまで折り畳みのために希釈することができる。
【００７９】
ニューロトロフィンを可溶化した後、これを、５−４０％（ｖ／ｖ）のアルコール性又は非プロトン溶媒、カオトロピック剤、及びアルカリ金属、アルカリ土類、もしくはアンモニウム塩を含む再折り畳み緩衝液中に入れるか希釈する。緩衝液は、最初の緩衝溶液に対しては任意の緩衝液とすることができ、ＣＡＰＳＯ、グリシン、及びＣＡＰＳがｐＨ８．５−１１、特に約２０ｍＭの濃度で好ましく、ＣＡＰＳＯとグリシンが最も好ましい。ニューロトロフィンは、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍に、再折り畳み緩衝液で希釈することができる。あるいは、ニューロトロフィンは、再折り畳み緩衝液に対して透析することができる。再折り畳みは約２℃−４５℃、最も好ましくは２℃−８℃で少なくとも約１時間の間、実施することができる。溶液は、場合によっては還元剤と浸透質（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）をまた含有してもよい。
【００８０】
還元剤は与えられた濃度範囲における可溶化工程に対して上述したものから好適に選択される。その濃度は、特に、アルカリ土類、アルカリ金属、又はアンモニウム塩、ニューロトロフィン、及び溶媒の濃度に依存する。好ましくは、還元剤の濃度は、約０．５から８ｍＭ、より好ましくは約０．５−５ｍＭ、更により好ましくは約０．５−２ｍＭである。好適な還元剤はＤＴＴとシステインである。
【００８１】
再折り畳み溶液中の酸素は必要に応じて不活性ガス、例えばヘリウム又はアルゴンの添加により除去して酸素を置換することもできる。
【００８２】
任意の浸透質は好ましくはスクロース（約０．２５−１Ｍの濃度）又はグリセロール（約１−４の濃度）である。より好ましくは、スクロース濃度は約１Ｍであり、グリセロール濃度は約４Ｍである。
【００８３】
折り畳み緩衝液中のニューロトロフィンの初期濃度は、回収された誤って折り畳まれた配座異性体に対する正しく折り畳まれたものの比が、ＨＰＬＣ、ＲＩＡ、もしくはバイオアッセイにより決定したとき、最大になるようなものである。（最大収量の正しく折り畳まれた配座異性体が得られる）ニューロトロフィンの好適な濃度は約０．１から１５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１から６ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約０．２から５ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００８４】
このインキュベーション時に生じる再折り畳みの度合いは、ニューロトロフィンのＲＩＡ力価又はＨＰＬＣ分析により適切に決定され、ＲＩＡ力価又は正しく折り畳まれたニューロトロフィンピーク寸法の増加は、緩衝液中に存在する正しく折り畳まれた生物学的に活性なニューロトロフィン配座異性体の量の増大に相関する。インキュベーションは、ＲＩＡもしくはＨＰＬＣにより決定される、正しく折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体の収量と回収された誤って折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体に対する正しく折り畳まれたニューロトロフィン配座異性体の比を最大にし、質量バランスにより決定される多量体関連ニューロトロフィンの収量を最小にするために実施される。あるいは、以下と実施例に記載する方法によって種を決定することもできる。グアニジンが再折り畳みに対する好適な変性剤である。
【００８５】
ニューロトロフィンが再折り畳みされた後、ここに教示されたような次の方法が、個々にあるいは組み合わせて、より高い純度と相同性を得るための好適な精製法である。すなわち、カチオン交換カラムでの分画、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、そしてシリカクロマトグラフィーである。
【００８６】
再折り畳み工程がプロセスの一部であろうとなかろうと、ニューロトロフィンをその変種から分離するための好適な工程は疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂上での分離である。発酵、精製又はインビトロタンパク質再折り畳みの間、あるタンパク質は化学的に修飾され、誤ってプロセシングされ得、あるいはその未変性の三次元構造ではなくむしろその安定性、溶解性、免疫原性、もしくは生物活性について異なる他の構造に再折り畳みされうる。これらの変種は、抗原性又は作用強度の喪失のような望ましくない副作用を避けるために回収中に除去されなければならない。変種が不溶性であれば、遠心分離と濾過のような固体／液体分離法により容易く除去することができる。しかしながら、変種が可溶性であれば、クロマトグラフィーのようなより高度の分離吸着法がそれらを除去するために必要とされる。原核生物細胞中に生産されるとき、あるいはインビトロで再折り畳みされるとき、ニューロトロフィンは可溶性の安定した誤って折り畳まれた変種を生成する。誤って折り畳まれたニューロトロフィンは、未変性のニューロトロフィンに対して変更されたジスルフィド対合パターンと三次元構造を有しており、天然の薬理学的活性を欠く。真核生物細胞培養、例えば哺乳動物細胞培養中に生産されるとき、変種型は典型的には誤ってプロセシングされた型である。これらはまた典型的に天然の薬理学的活性を欠き、除去されるべきである。ここではＨＩＣが、未変性のニューロトロフィンからこれらの変種を分離するために適したものであることが見出された。
【００８７】
ＨＩＣは非共有性疎水的結合によって媒介された固体マトリックスに対するタンパク質の順次の吸着と脱着を含む。一般に、高塩緩衝液中の試料分子がＨＩＣカラムに装填される。緩衝液中の塩は水分子と相互作用をして溶液中の分子の溶媒和を低減させ、よってＨＩＣカラムにより結果的に吸着される試料分子の疎水性領域を暴露する。分子がより疎水性であればある程、結合を促進するために必要とされる塩は少なくなる。通常、塩勾配の低下を使用してカラムから試料を溶出させる。イオン強度が減少すると、分子の親水性領域の暴露が増加し、疎水性を増加させるために分子がカラムから溶出する。試料の溶出はまた溶出緩衝液に穏やかな有機修飾因子又は洗浄剤を添加することによっても達成される。ＨＩＣは、Protein Purification２版（Springer-Verlag, New York, pp.176-179(1988)）においてレビューされている。
【００８８】
タンパク質とマトリックスの間の会合の強さは、固定化された官能基の大きさと疎水的性質、周囲の溶媒の極性と表面張力、及びタンパク質の疎水性を含む幾つかの要因に依存する。ＨＩＣマトリックスの結合能は、固定化された疎水性リガンドが広く間隔をあけられるべきという必要性のために低くなる傾向がある。更に、あるタンパク質に対する培地の能力は試料調製における疎水性不純物の量に対して逆に変化する。所望のタンパク質を、能力を同時に最大化しながら、変種と他の不純物から分離するためには、好適なＨＩＣ固相媒体並びに装填、洗浄及び溶出のための好適な移動相を特定する必要がある。
【００８９】
ここにおいて決定したところでは、無傷の正しく折り畳まれた型から正しく折り畳まれたニューロトロフィン及び誤って折り畳まれたニューロトロフィンもしくは誤ってプロセシングされた型を分離するための最も好適な媒体は、固定化されたフェニル官能基を有するものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのニューロトロフィン型を分離するための異なった効率を示した。最良の結果はＴｏｓｏＨａａｓによるフェニル・トーヨーパール媒体及びフェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）で達成された。ＴＳＫフェニル５ＰＷもまた適していた。他のＨＩＣ固定化官能基も機能してこれらの型を分離しうる。例としては、オクチル基、例えばファーマシアからのオクチルセファロースＣＬ４Ｂ媒体、及びプロピル基、たとえばＢａｋｅｒからのハイ・プロピル媒体であった。好ましさが劣ったものはアルコキシ、ブチル、及びイソアミル官能基樹脂である。
【００９０】
ＨＩＣはニューロトロフィンを哺乳動物細胞培養中のその変種から分離するのに有用である。例えば、ここで測定したところでは、ｒｈＮＧＦ発現ＣＨＯ細胞培養は不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、たとえば前駆ＮＧＦ、ハイブリッド前駆ＮＧＦ及び切詰め前駆ＮＧＦ配列のような部分的配列が存在するものを含んでいた。また哺乳動物細胞培地において見出されるものはグリコシル化ＮＧＦ及び不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種のグリコシル化形態である。望ましくないグリコシル化型は、ＮＧＦの場合大きい分子量の種（＋２０００ｋＤ）として見られるが、患者に望ましくない抗原応答を発生させ、劣った製品品質又は活性をもたらす。ＨＩＣは、ｒｈＮＧＦから疎水性変種、主にグリコシル化型を含むＮ末端がタンパク分解性に誤ってプロセシングされた変種を分離した。実施例に示されるように、前駆配列含有及び切詰め前駆配列ＮＧＦと、ＮＧＦと前駆配列含有ＮＧＦの両方のグリコシル化型がフェニルＨＩＣの間ＮＧＦピークの先端に溶出した。従って、これらの種が実質的に含まれておらず、高速カチオン交換クロマトグラフィーのような次の工程に特に適したｒｈＮＧＦ組成物を得ることができた。ＨＩＣは、ソースに拘わらず、他のニューロトロフィン、並びにＮＧＦにも適用できる。例えば、ＨＩＣは、存在する単量体形に依存してホモ二量体かヘテロ二量体の何れでも、二量体からＮＧＦ単量体を分離し、並びにインビトロの再折り畳みの後、又は哺乳動物細胞から生産され分泌されたときに得られる、疎水性がまた異なる二量体を区別するのに有用である。ＨＩＣに使用するニューロトロフィン混合物の好適なソースは哺乳動物細胞培養、より好ましくはＣＨＯ細胞培養である。該培養は好ましくはここで検討されたような少なくとも１回の前精製工程にかけられる。ＨＩＣは、未変性の組換えニューロトロフィンから誤ってプロセシングされたグリコシル化変種（群）を分離するのに特に有効である。ｒｈＮＧＦの場合、グリコシル化及びプレプロＮＧＦは未変性ＮＧＦより疎水性が低く、従って未変性ＮＧＦの前に溶出する。（細菌的に生産される場合）ニューロトロフィンの誤って折り畳まれた型もまたより疎水性で、未変性のニューロトロフィンより早く溶出する。
【００９１】
ニューロトロフィン型を分離するために最も好適なＨＩＣ樹脂は固定化されたフェニル官能基を有しているものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのＮＧＦ型を分離するための異なった効率を示した。フェニルＨＩＣ樹脂の中で、ＴｏｓｏＨａａｓによるフェニル・トーヨーパール媒体が最も好ましく、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）とＴＳＫフェニル５ＰＷが好ましい。好ましいＨＩＣ官能基としてはアルコキシ、ブチル、及びイソアミル部分が含まれる。
ＨＩＣを使用して、ニューロトロフィン型を洗浄し差次的に溶出させるために様々な移動相条件を使用することができる。これらの移動相はニューロトロフィンと固定相の間の会合に異なった方法で影響を及ぼす幾つかの異なった化学種を含みうる。正しく折り畳まれ、また誤って折り畳まれたニューロトロフィン、例えばＮＴ−４／５が、例えば硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ濃度、酢酸塩濃度のような移動相塩の段階的減少又は減少塩勾配によりＨＩＣカラム上で分離できる。塩は移動相の表面張力を調節することにより樹脂に対するニューロトロフィンの結合に影響を及ぼしうる。表面張力に影響を及ぼした他の薬剤は、実施例で検討したようなクエン酸ナトリウムとテトラメチルアンモニウムクロリドであった。変種はまた、相対的に極性の有機溶媒の濃度を増加勾配で又は段階的に増加させて結合タンパク質を溶出させることにより、カラムクロマトグラフィー中に分離することができる。好適な溶媒の例としてはエタノール、アセトニトリル、及びプロパノールがある。ニューロトロフィン型とＨＩＣ樹脂の間の会合の強さは移動相のｐＨにもまた依存し、中性条件が好ましい。正しく折り畳まれ、誤って折り畳まれたニューロトロフィンの相対的な疎水性はまた溶液のｐＨに依存する。未変性のニューロトロフィンからの変種の分離はまた、勾配もしくは段階的溶出の間、移動相のいくつかの性質を同時に変化させることにより得ることもできる。例えば、溶出時に塩濃度と非極性溶媒濃度を同時に変化させた移動相は塩のみを変化させた場合よりもより良好な分離をもたらした。
【００９２】
ＨＩＣに対して、硫酸アンモニウム、クエン酸塩、酢酸塩、及び塩化カリウムを含むここで検討した塩が使用できる。使用する塩に依存して、樹脂へのニューロトロフィンの結合を達成する塩の濃度は典型的に０．５Ｍから３Ｍ、より好ましくは０．５から２．５Ｍである。例えば、０．８から１．５Ｍの塩の結合緩衝液がＮＧＦに対して好適であり、より高い塩濃度では樹脂上へのＮＧＦの沈殿が生じ、回収率が低下する。ＮＴ−３に対しては、１．０から２．５の塩濃度のｐＨ７の結合緩衝液が好ましく、１．２５から１．７５Ｍの塩が更に好ましく、１．５Ｍが最も好ましい。ＮＴ−４／５に対しては、１から３Ｍの塩のｐＨ７の結合緩衝液が好ましく、２から２．７５Ｍが更に好ましく、２．５ＭのＮａＣｌが最も好ましい。ＮＴ−４／５の場合、２．５ＭのＮａＣｌが装填には好ましく、２ＭのＮａＣｌが有機溶媒の存在する（例えば１０％アルコール、ｐＨ７）溶出には好適であった。好ましくは、塩濃度の低下を使用してニューロトロフィンとその変種を溶出させ分離する。溶出を達成するには、溶出緩衝液中の塩濃度は、典型的には装填緩衝液中のものよりも低いが、有機溶媒で補償するときは同じ濃度にすることができる。
【００９３】
加えて、ここで見出されたところでは、有機溶媒の使用には、有機溶媒の添加がより狭いピークプロファイルをもたらすことにより溶出パターンを改善するというもう一つの利点がある。エタノールに加えて、プロパノール、イソプロパノール、及び低級アルキレングリコール、例えばプロピレングリコール、エチレングルコール及びヘキシレングリコールを含むここで検討した他の有機溶媒を使用することができる。５から２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５から２０（ｖ／ｖ）の有機溶媒が正しく折り畳まれたニューロトロフィンを典型的に溶出させる。有機溶媒での溶出は勾配をもたせても段階的でもよい。ｐＨ範囲は好ましくは殆ど中性から僅かに酸性で、５から８、より好ましくは６から８、６．５から７．５、最も好ましくは７である。ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、アンモニウム、酢酸塩を含むここで検討した任意の緩衝液を、所望のｐＨで緩衝作用を呈する限り、使用することができる。
【００９４】
ここに報告したように、ニューロトロフィンの組換え生産から生じるある望まれないニューロトロフィン変種の本発明者らによる発見に鑑みると、好ましくは調製的態様で、高速カチオン交換クロマトグラフィーを使用することにより未変性ニューロトロフィンからの例えばカルバミル化、酸化、ｉｓｏａｓｐ、脱アミド、およびある種の切詰め型（例えばＮＧＦのＣ末端切断型）のような荷電修飾変種の分離が可能になる。例えば、ＮＴ−４／５とＮＴ−３の場合のように細菌発酵中に生じうる負荷変更の結果として生じるＮ末端クリップ型（例えば２から４のＮ末端アミノ酸欠失）を除去することができる。哺乳動物細胞培養において生産されたニューロトロフィンの場合、Ｃ末端切断が高度に荷電された末端領域に生じ得る。例えば、ＮＧＦの１１８型はＣ末端で誤ってプロセシングされ又は切断されて１１７、１１４及び１１５型になる。これらは高速カチオン交換クロマトグラフィーにより未変性１１８ＮＧＦから分離することができる。特に好適な実施態様はＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、フラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３、またはポリアスパラギン酸樹脂を使用するもので、中でもポリキャットＡが特に好ましい。最も好ましくは、大規模では、ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス、又はフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂が使用される。
【００９５】
ここに記載された方法により得られる組成物は、実質的に純粋なニューロトロフィン、更に通常的には好ましくは本質的に純粋で、実質的にニューロトロフィン変種を含まず、より好ましくは本質的にニューロトロフィン変種を含まない。例えば、ＣＨＯ細胞培養からのＮＧＦの精製後の典型的なＳＰ−セファロースプールは、約９２％の１１８、４．６％の１２０、１％の脱アミド化ＮＧＦ、１％の酸化ＮＧＦ、及び１％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含む。各々の量は、常に、１１８に対しては約８５から９３％、（用いられる内因性及び／又は外因性タンパク分解度合いに大きく依存して）１２０に対しては０から５％、１１７に対しては０から５％、脱アミド型に対しては０から３％、ｉｓｏａｓｐ型に対しては０−２％、及び酸化型に対しては０から２％の範囲である。ＮＧＦ（全ての種）の純度は常に９９．５％を越える。
【００９６】
ニューロトロフィンは、カラムから溶出された後、担体と共に好適に組成物、好ましくは生理的に許容できる担体と共に製薬組成物に製剤化される。ニューロトロフィン組成物は好ましくは無菌である。本発明のニューロトロフィン組成物は、例えば培養中において神経細胞の成長と生存を促進するためにインビトロでの用途が見出される。
【００９７】
組換えヒト神経成長因子（ＮＧＦ）の水溶液中における化学的及び物理的安定性を、４．２から５．８のｐＨ範囲で５℃と３７℃の間で調べた。ＮＧＦの化学安定性はｐＨの増加で増大した。ｐＨ５．８のコハク酸塩緩衝液中では、ＮＧＦの物理的安定性はタンパク質凝集化のために減少した。５℃の安定性データと３７℃での加速分解研究の両方に基づいて、最適な製剤はｐＨ５．５の酢酸塩緩衝液であることが分った（ここに出典明示により取込まれるＷＯ９７／１７０８７を参照のこと）。逆相ＨＰＬＣは第１の安定性を示す方法であり、ｉｓｏ−ＡｓｐへのＡｓｎ−９３の転換が５℃での第１の分解経路であることを示した。カチオン交換クロマトグラフィーによるＮＧＦ分解の定量化はＮＧＦ単量体変種の様々な混合二量体への経時的な再構成（二量体交換）により複雑化した。希酸での試料と参照の処理は二量体中の単量体分布を平衡化させ、二量体交換の不存在下で定量化された。ベンジルアルコールとフェノールが、多用途目的に対する２つの液体製剤中へのそのｒｈＮＧＦとの相容性と安定性について評価された。これらの二つの製剤は、界面活性剤として０．０１％のプルロン酸（Ｆ６８）を含む状態と含まない状態で、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウムと１３６ｍＭの塩化ナトリウム中の０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質からなる。これらの二つの製剤の各々におけるベンジルアルコールとフェノールの最終濃度はそれぞれ０．９％と０．２５％である。１２ヶ月の安定性データに基づくと、ｒｈＮＧＦはこれらの製剤においてフェノールよりもベンジルアルコールでより安定である。界面活性剤の存在下でベンジルアルコールで保存したｒｈＮＧＦ製剤は界面活性剤を添加しない製剤と同じほど安定であり、ｒｈＮＧＦ多投薬製剤へのＦ６８の添加は安定性目的では必要とされないことを示している。従って、２０ｍＭの酢酸塩、１３６ｍＭのＮａＣｌ、０．９％のベンジルアルコール、ｐＨ５．５中に０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含んでなる製剤がフェーズＩＩＩの臨床試験において複数回の投薬に使用されるｒｈＮＧＦに対して推奨される。このｒｈＮＧＦ多投薬製剤は、５℃で６ヶ月後にＵＳＰ及びＥＰ保存剤効能試験をパスしており、２ｍｇ／ｍＬの現在の液体製剤と同じほど安定している。しかし、製剤は、光感受性がある保存剤としてベンジルアルコールを含むので、強い光への曝露は避けるべきである。
【００９８】
一般に、組成物は、好ましくは安定な液体又は凍結乾燥可能形態での調製を不可能にしない量であって、効果的で安全な製薬的投与に適した量で、他の成分を含むことができる。
【００９９】
ニューロトロフィンは、製薬的に許容できる担体、すなわち使用される用量と濃度でレシピエントに対して無毒性であり、製剤の他の成分と相容性があるものと共に製剤化される。例えば、製剤は、ポリペプチドに対して有害であることが知られている酸化剤及びその他の化合物を含有しない。この製剤工程は、標準的な技術を使用する脱塩又はダイアフィルトレーションにより達成される。
【０１００】
一般に、製剤は、液体担体又は細かく分割された固体担体又は両方とニューロトロフィンを均一かつ密に接触させることにより調製される。ついで、必要ならば、製品は所望の製剤に成形される。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンガー液及びブドウ糖溶液が含まれる。固定化オイル及びオレイン酸エチルのような非水性ビヒクル、並びにリポソームがここでは有用である。
【０１０１】
担体は、好適には、等張性及び化学安定性を高める物質のような添加物を少量含有する。このような材料は使用される用量と濃度でレシピエントに対して非毒性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はその塩のような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；例えばポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン；セルロース又はその誘導体、トレハロース、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；及び／又はポリソルベート、ポロキサマー、又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。最終調製物は液体又は凍結乾燥固体とできる。
【０１０２】
治療投与に対して使用されるニューロトロフィンは無菌でなければならない。無菌性は無菌濾過膜（例えば０．２ミクロン膜）を通す濾過によって直ぐに達成される。一般に、治療用ニューロトロフィン組成物は、殺菌アクセス口、例えば皮下注射針で穿孔可能なストッパーを持つ静脈内溶液袋又はバイアルを有する容器に入れられる。上記の製剤はまたインビトロ用途に適している。
【０１０３】
通常、ニューロトロフィンは、ユニット又は多投薬容器、例えば密封アンプル又はバイアルに、水溶液として、あるいは再構成のために凍結乾燥製剤として保存される。凍結乾燥製剤の例としては、１０ｍＬのバイアルに５ｍＬの無菌濾過１％（ｗ／ｖ）ニューロトロフィン水溶液が満たされ、得られた混合物が凍結乾燥される。注入溶液は凍結乾燥ニューロトロフィンを注射用静菌水を使用して再構成することにより調製される。
【０１０４】
治療的に有効な用量のニューロトロフィン製剤が患者に投与される。ここにおける「治療的に有効な用量」は、投与される効果をつくりだす用量を意味する。正確な用量は治療すべき疾患に依存し、既知の技術を使用して当業者により決定される。一般に、本発明のニューロトロフィン製剤は、１日当り約０．０１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ投与される。好ましくは０．１から０．３μｇ／ｋｇである。また、従来から知られているように、年齢並びに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および疾患の重症度に対する調節が必要となり、当業者によりルーチン的な実験により決定される。典型的には、臨床医は、神経細胞の機能を修復し、維持し、最適には再構築する用量に達するまで本発明のニューロトロフィン製剤を投与する。この療法の進行は通常のアッセイで容易にモニターされる。
【０１０５】
ニューロトロフィンは、ＮＧＦ、ＮＴ−４／５、ＮＴ−３、及び／又はＢＤＮＦを含む他の神経栄養因子と組み合わされ、あるいは一緒に投与され、神経疾患に対する他の通常の療法と共に使用される。
【０１０６】
ＮＧＦの場合、好ましくは組成物は、製薬的に有効量の神経成長因子と製薬的に許容できる酢酸塩含有緩衝液を含有する。組成物は５から６のｐＨを有し得る。緩衝液は好ましくは酢酸ナトリウムである。酢酸塩の濃度は好ましくは０．１から２００ｍＭである。組成物は好ましくは０．０７から２０ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度を有する。そして、組成物は更に製薬的に許容できる保存剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、又はプロピルパラベンを任意に含有する。好ましくは保存剤はベンジルアルコールである。ベンジルアルコールの濃度は好ましくは０．１から２．０％である。組成物は製薬的に許容できる界面活性剤を任意に含有し得る。そして、組成物は、生理的に許容できる濃度の塩化ナトリウムを任意であるが好ましく含有することができる。より好ましい組成物は少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で神経成長因子を、１０ｍＭから５０ｍＭの濃度の酢酸塩イオンを含有する。更により好ましくは、組成物は少なくとも約０．１から約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で神経成長因子を、１０ｍＭから５０ｍＭの濃度の酢酸塩イオンを含有する。最も好ましい組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム濃度（ｐＨ５．５）、１３６ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び０．９％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを含有する。
【０１０７】
他の実施態様は、２．０ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度、１０ｍＭの酢酸ナトリウム濃度、ｐＨ５．５、及び１４２ｍＭの塩化ナトリウム濃度を含む。０．１ｍｇ／ｍｌのＮＧＦを２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１３６ｍＭの塩化ナトリウム、０．９％（ｖ／ｖ）のベンジルアルコールを５．５のｐＨで製剤化することが好ましい。ここで検討したところ、１１８／１１８ホモ二量体がＮＧＦの好適な型である。ＮＧＦは正常な二量体形態を維持するために約６から８のｐＨで精製される。しかし、（タンパク質分解性に）切詰められた型のパーセントは単量体形態を表し、これは逆相ＨＰＬＣによって明らかになり測定される。ＮＧＦの異なった二量体型−１２０／１２０、１２０／１１８、１１８／１１８等々の存在は公表されている（主に本研究に使用された分析的及びバイオアッセイについて、並びにその一般的な教示についてここに出典明示により取込まれるSchmelzerら J.Neurochem. 59:1675-1683(1992)）。この刊行物は、各二量体型についてインビトロ活性が同じであったことを報告している。しかし、対照的に、本明細書における研究では、１２０／１２０二量体は活性が少なく、１１８／１１８種と比較して約８０−９０％の活性であることをラジオレセプターベースアッセイを使用して初めて証明している。アッセイの一形態では、ラットＰＣ−１２細胞膜を単離し、ＮＧＦ標準物質と種々の被験種との間の競合結合に対して使用する。ＲＲＡはＰ７５とｔｒｋＡレセプターを両方有している。１１７／１１７種が１１８／１１８種と同じ程活性であることもここでまた見出された。更に、ＰＣ−１２ベースアッセイの使用によりレセプターベースアッセイの発見を確認し、１２０／１２０型が１１８／１１８型に対して約６０％の活性であることを示す。主に本研究に使用された分析的及びバイオアッセイについて、並びにその一般的な教示についてここにその全体を出典明示により取込むのはBurtonら（J.Neurochem. 59:1937-1945(1992)）である。
【０１０８】
１１８／１１８型は１２０／１２０型よりもヒトの患者において生物利用能が高いと信じられている。生物利用能の増加は少なくとも４から５倍である。この差は顕著で、意外であり、従来では予想できなかったことである。
【実施例】
【０１０９】
次の実施例は例証のために提供されるものであって限定のためではない。本明細書中の全ての引用文献の開示が出典明示により明示的にここに取込まれる。
【０１１０】
＜実施例Ｉ．１１８／１１８ＮＧＦホモ二量体の精製＞
この実施例はＮＧＦの精製と各工程に対する原理を例証する。実施例の各々において、当業者であれば、従来からよく知られているようにして初期培養容積とタンパク質濃度を補償するようにカラム寸法と流量を容易に決定して調節することができる。
収集細胞培養液
【０１１１】
ＤＮＡ配列をコードしている１２０アミノ酸ヒトＮＧＦを含む発現ベクターを組換えＣＨＯ細胞に形質移入した。分泌とプロセシングを促進するためにＮＧＦプレプロ配列もまた存在していた。組換えＣＨＯ細胞の培養後、細胞培地を収集した。収集細胞培地液（ＨＣＣＦ）はＮＧＦ種１２０、１１８及び１１７を含んでいた。ＮＧＦの約４０−７０％は典型的には１１８／１１８ホモ二量体で、残りはヘテロ二量体１２０／１１８、１２０／１２０及び少量の１１８／１１７であった。ここに教示したように、これらの種はＳＰセファロースＨＰカラムにより分離することができる。
【０１１２】
収穫細胞培地は、ミリポア１０Ｋｄカットオフ膜を使用して、およそ２０倍に濃縮された（セルロース、複合体又はポリスルホンの何れかが交換可能に使用された）。濃縮物に０．１容量の１．０Ｍ、ｐＨ８．２のトリスを添加した。希釈材料が０．２２ｕｍフィルターを使用して精密濾過され、保持タンクに移され２から１８時間の間３７℃で保持された。１２０／１２０型の１１８／１１８型へ転換が、保持の間、内在性プロテアーゼにより触媒された。
【０１１３】
シリカゲルクロマトグラフィー
精密濾過物を１ＭのＮａＣｌに調節し、１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化されたシリカゲルカラムに適用した。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。適切なｐＨ範囲は約６から８で、好適なｐＨは７である。ついで、カラムを２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。低伝導率洗浄により宿主細胞タンパク質を除去する。結合したＮＧＦを５０ｍＭのＭＯＰＳＯ、０．５ＭのＴＭＡＣ、２０％の試薬無水等級アルコール（９４−９６％の特別に変性されたアルコール・フォーミュラ３Ａ（５容量のメタノールと１００容量の２００プルーフ・エタノール）と４−６％のイソプロパノール）で溶出させた。例えば２０％プロパのール、２０％イソプロパノール及び２０％メタノールのような他のアルコールを使用することもできる。ここで、「アルコール」及び「アルコール性溶媒」はアルコールについてよく用いられているところの意味を有するもので、好ましくは１から１０の炭素原子のアルコール、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、又はｔ−ブタノールで、最も好ましくはエタノール又はイソプロパノールである。このようなアルコールは、水溶液に添加した場合、溶液の極性を減少させることにより溶液の疎水性を増大させる溶媒である。エタノールが最も好ましい。アルコールの下限は溶出する如何なるパーセントでもよく、上限はタンパク質の変性を避ける必要から決められる。溶媒は好ましくは５％から２５％、より好ましくは５から２０％、更により好ましくは５から１５％である。ＴＭＡＣはテトラメチルアンモニウムクロリドであり、これはＮＧＦを溶出させるために存在する。ＴＭＡＣは０．１から１Ｍの範囲とできる。０．３から０．７Ｍの範囲が更に好ましい。ＮＧＦを溶出するために使用されるＴＭＡＣの量はｐＨとアルコール濃度の関数である。ｐＨがより低く、アルコールの量がより少なくなると、ＴＭＡＣが必要となる。ｐＨは約４から８の間とできる。この実施例では、好適なｐＨは７であり、これは、次のカラムへの装填の前のプール分画の調整を非常に少ないものにする。ｐＨの上限は次のカラムに装填するのに必要なｐＨにより決まり、下限はＮＧＦを効率よく溶出させるのに有用なものとされる。
【０１１４】
Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいる溶出液をプールし、精製水で１５．５ｍｓ／ｃｍ未満の伝導率まで希釈し、ｐＨを７．０に調整した。幾つかのプロテアーゼがなお存在していたので、材料を８時間を越えないで保持した。しかし、１２０アミノ酸を１１８型に転換する内在性プロテアーゼの活性は観測されなかった。材料を２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化されたＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーカラム（カチオン交換樹脂Ｓ−セファロース ＴＭアガロース・ファースト・フローＴＭ（ファーマシア））に適用した。カラムは２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄される。適切なｐＨ範囲は約６から８であり、好ましくはｐＨ７である。ついで、カラムを０．１６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で洗浄した。結合したＮＧＦを０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で溶出させた。溶出液の塩モル濃度は０．３から１．０Ｍ、好ましくは０．４から０．６Ｍの範囲とできる。下限はＮＧＦを全て溶出させるための有用性により決められ、上限は汚染物質を除去し、ＮＧＦの溶出に干渉しうるカラムの疎水的相互作用を生じさせることを避ける必要性により決められる。他の塩を使用することもでき、ＫＣｌが好適な代替物である。０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）での溶出が、小容量のプールを得るためには好適である。より高い塩濃度、例えば１Ｍを越えると、強固に結合した汚染物質が溶出し得る。
【０１１５】
フェニル・トーヨーパール６５０Ｍクロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいるＳＳＦＦカラム分画をプールし、１ＭのＮａＣｌに調節し、フェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラムに適用した。カラムを２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で洗浄した。適切なｐＨは約５から８の範囲である。結合したＮＧＦを、勾配緩衝液Ａ（２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、１．０ＭのＮａＣｌ）で始めて勾配緩衝液Ｂ（８０％の２５ｍＭのＭＯＰＳＯ中の２０％アルコール、ｐＨ７）で終了する１０ＣＶ（カラム容量）の線形勾配で溶出させた。ＮＧＦを含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析して、どの分画に前駆ＮＧＦ種が溜まったかを決定した。ＮＧＦを含む分画を選択しプールして、例えば部分的な前駆配列が存在するもの、例えば前駆ＮＧＦ、ハイブリッド前駆ＮＧＦ、及びクリップ前駆ＮＧＦ配列のような不適切にプロセシングされた変種を主に取り除いて、如何なるＮＧＦ前駆配列も実質的に含まれないＮＧＦ組成物を得た。フェニルカラムはまた少量のグリコシル化ＮＧＦとグリコシル化ＮＧＦ前駆配列を除去した。前駆及び切詰め前駆ＮＧＦ配列がＮＧＦと前駆ＮＧＦの双方のグリコシル化形態と共にＮＧＦピークの先端に溶出した。従って、このカラムは様々なＮＧＦ種からＮＧＦを即座に分離し、これらの種が実質的に含まれないＮＧＦ組成物を得た。この工程において、タンパク分解性及びグリコシル化変種を含む、変種ＮＧＦ疎水性変種、主に誤ってプロセシングされた変種がＨＩＣを使用して分離された。
【０１１６】
ＮＧＦ型を分離するために最も好適な媒体は固定化したフェニル官能基を有するものであった。異なった販売者からのフェニルベースＨＩＣ媒体はこれらのＮＧＦ型を分離するための異なった効率を示した。最良の結果がＴｏｓｏＨａａｓのフェニル・トーヨ・パール媒体で達成された。ＨＩＣ樹脂フェニル・セファロース・ファースト・フロー・ロー・サブ（低置換）とＴＳＫフェニル５ＰＷはよく作用した。アルコキシ、ブチル及びイソアミル部分を含む他のＨＩＣ官能基はこれらの条件下では、適正が少なく、効果が少なかった。
【０１１７】
フェニル・トーヨーパール・プールは、７５％の１１８、１０％の１２０、７％の１１７、１．８％の脱アミドＮＧＦ、１．４％の酸化ＮＧＦ、及び２．０％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含有し、残りの２．８％はその他の未同定ＮＧＦ種であった。
【０１１８】
任意であるが、プールされた分画を酸処理して、最小１５分の間、３．９５未満のｐＨでウィルス不活性化を達成した。
【０１１９】
ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー
ＨＩＣプールを０．５から１容量の水で希釈し、希釈したプールをｐＨ６に調節した。このプールを、（シリカゲルカラム工程におけるように）０．２Ｍの塩化ナトリウム、５％の試薬アルコールを含む２０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ６）で平衡化されたＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。カラムを０．２ＭのＮａＣｌ、５％の試薬アルコール（フォーミュラＳＤＡ−３Ａアルコール；アルコールは任意に存在する）を含む２０ｍＭのコハク酸塩（ｐＨ６）で洗浄した。アルコールは、ＮＧＦの樹脂バックボーンとの非特異的（大抵は疎水的）相互作用を低減させる。適切なアルコール範囲は約０から１０％である。負荷ｐＨは約５から８であり、これはＮＧＦの最大の安定性とＮＧＦ変種の分離を達成し維持するように選択される。カラムを２カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。結合したＮＧＦを、１１カラム容量の勾配緩衝液Ａ（５％のアルコールを含む、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍのコハク酸塩、ｐＨ６）と１１カラム容量の勾配緩衝液Ｂ（０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６）を混合して線形の２２カラム容量の勾配によって溶出させ、変種から分離した。アルコールは任意である。０．３５Ｍから０．４０ＭのＮａＣｌ濃度で１１８／１１８ＮＧＦが典型的には溶出した。
【０１２０】
カラム分画をＮＧＦ及び変種ＮＧＦ含量について分析した。分画は好ましくは上掲のSchmelzerら（1992）及び上掲のBurtonらにより記述されたＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析される。分画を選択しプールして、修飾ＮＧＦ変種、例えば酸化、脱アミド、ｉｓｏａｓｐＮＧＦ種が実質的に含まれないＮＧＦの組成物を得た。先のＨＩＣカラムは酸化、ｉｓｏａｓｐＮＧＦのようなＮＧＦの他の変種型を効果的には除去できない。ＨＩＣカラムは誤って折り畳まれたタンパク質とグリコシル化物を効果的に除去し、これは、より疎水性になる傾向があるので、正しく折り畳まれたＮＧＦよりもＨＩＣ樹脂により強固に結合する。従って、カチオン交換樹脂、例えばＳＰ−セファロースＨＰを、ＨＩＣ樹脂によって除かれなかった変化した負荷変種を除去するために使用した。
【０１２１】
ＳＰ−セファロースプールは、典型的には約９２％の１１８、４．６％の１２０、１．８％の脱アミドＮＧＦ、１％の酸化ＮＧＦ、及び１％のｉｓｏａｓｐＮＧＦを含有していた。通常の通り、各々の種の量は、１１８に対しては約８５から９３％、１２０に対しては０から５％、１１７に対しては０から５％、脱アミド化型に対しては０から３％、ｉｓｏａｓｐ型に対しては０−２％、及び酸化型に対しては０から２％の範囲である。ＮＧＦ（全ての種）の純度は通常のように９９．５％よりも大きい。
【０１２２】
製剤
ＳＰ−セファロースＨＰプールを製剤緩衝液中への限外濾過／ダイアフィルトレーションにより製剤のために調製した。酸性緩衝液が好ましくは用いられ、好ましくは上述のようにｐＨ５の酢酸塩が使用される。１１８／１１８ＮＧＦ組成物は実質的にＮＧＦを含んでおらず、実質的に純粋なＮＧＦである。処方された材料は神経疾患、特に糖尿病に伴う末梢神経障害及びエイズに伴う末梢交感神経障害を治療するのに好適である。
【０１２３】
＜実施例ＩＩ．１２０／１２０ＮＧＦホモ二量体の大規模な精製＞
収集細胞培養液
一般に実施例Ｉに記載されているようにして１２０００リットルのＣＨＯ細胞培養からＨＣＣＦを得た。ＨＣＣＦ中のＮＧＦ種分布は、約４０−６５％の１２０／１２０ホモ二量体と、１２０／１１８ヘテロ二量体と残りが１１８／１１８ホモ二量体であった。典型的には培地を素早くプロセシングして１２０から１１８のタンパク分解性転換を最小化した。
【０１２４】
マクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィー
ＨＣＣＦをマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーカラムに装填し、１．５Ｍの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で洗浄した。結合したＮＧＦを、１．５ＭのＮａＣｌ、０．２５ＭのＴＭＡＣ、０．２％のチオジグリコール（ｐＨ７）で溶出した。マクロプレップカラムは、酢酸塩濃度を調節してｐＨ５から８で操作することができる。塩化物は酢酸塩イオンの好ましい代替物である。ＮＧＦがＴＭＡＣ勾配により溶出した。ＴＭＡＣはイオン性及び疎水性の双方の性質を持つ塩であり、この性質は、ある種の樹脂のバックボーン支持体がＮＧＦと樹脂の間の非特異的相互作用を促進する疎水的含量を含むので有用である。典型的には、約６から８のｐＨの溶出緩衝液に対しては、０−３ＭのＴＭＡＣ濃度が有用である。ＮＧＦを含む分画をプールした。
【０１２５】
シリカゲルクロマトグラフィー
プールを直接シリカゲルクロマトグラフィーカラムに適用した。シリカは、タンパク結合特性においてある役割を果たすイオン性、極性、及び疎水的相互作用を有する混合態様のクロマトグラフィー樹脂を提供する。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で平衡化させた。カラムを１ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）（好ましくはｐＨが約５．０から８．５、より好ましくは６から８、最も好ましくは７である）で洗浄した。結合したＮＧＦを２５ｍＭのコハク酸、ｐＨ３．９、５０ｍＭのＴＥＡＣ（テトラエチルアンモニウムクロリド）で溶出させた。ＴＥＡＣはＴＭＡＣよりも更に強力な溶出剤である。ｐＨは好ましくは３．５から８の範囲である。しかし、長い時間の間７．５を越えるｐＨにするのは、脱アミドＮＧＦ種の生成を防止又は低減するために避けるべきである。一般に、緩衝液のｐＨが低くなればなる程、シリカカラムからＮＧＦを溶出させるのに必要とされる例えばＴＭＡＣ又はＴＥＡＣのような混合特性の塩の濃度を低くする。ｐＨ４又は５の近くで良好な緩衝能力を有する緩衝液が使用に適している。溶出緩衝液中の塩の有無は任意であり、そのためカラムは、溶出緩衝液の適用に先立って塩なしにＭＯＰＳＯ緩衝液で洗浄することができる。
【０１２６】
フェニルセファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィー
ＮＧＦを含んでいる分画を同定しプールした。そのプールを、０．７Ｍの酢酸塩、ｐＨ７，２５ｍＭのＭＯＰＳＯに調節した。調節したプールを、勾配緩衝液Ａ（０．７Ｍの酢酸塩、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７）で平衡化したフェニル・セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーカラムに装填した。カラムを、９０％の勾配緩衝液Ａ（０．７Ｍの酢酸塩、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７）から１０％の勾配緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、２０％のプロピレングリコール）の勾配で洗浄した。例えばヘキシレングリコールのような他のグリコールに置換することもできる。典型的には、洗浄は約２から３ＣＶ、あるいは安定なベースラインＯＤが達成されるまでとした。洗浄によりいくらかの宿主細胞タンパク質が除去された。結合したＮＧＦを、９０％の勾配緩衝液Ａと１０％の勾配緩衝液Ｂの混合物から１０％の勾配緩衝液Ａと９０％の勾配緩衝液Ｂの混合物までの線形の１０ＣＶ勾配で溶出させた。ＮａＣｌもしくは硫酸ナトリウムをＨＩＣ緩衝液中の酢酸塩と置換することができる。ｐＨは好ましくは約５から８、より好ましくは約５．５から７．５であり、ｐＨ６から８が許容でき、約７が最も好ましい。該カラムは、成熟ＮＧＦ単量体及び存在する前駆配列の一部をなおも有しているＮＧＦ単量体のホモ二量体又はヘテロ二量体として存在する、全ての残っている前駆配列、部分的前駆配列、もしくはグリコシル化形態を分離した。ＮＧＦの前駆及びグリコシル化形態は溶出ピークの先行端に存在しており、ＮＧＦ含有分画がこれらの種を実質的に排除するようにプールされた。
【０１２７】
分析用ＨＰＬＣシステムで分離し検出したところ、ＨＩＣプールは、約７２％の１２０単量体、１７％の１１８単量体、２．８％の１１７単量体、３．６％のＲ１２０単量体、０．８％のｉｓｏａｓｐ型、１．３％の酸化型、及び１％の脱アミド型を含有していた。
【０１２８】
ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー
ＨＩＣ工程からのＮＧＦを含有する分画をプールした。大規模では、これは、カラム溶出液をプールタンク（保持タンク）に適当な時間に流すことにより達成された。プールのｐＨはｐＨ６に調節し、ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィーカラムに適用した。カラムを２０ｍＭのコハク酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６（勾配緩衝液Ａ）で洗浄した。結合したＮＧＦを、７０％の勾配緩衝液Ａと３０％の勾配緩衝液Ｂの混合物で開始し、８０％の勾配緩衝液Ｂ（０．７ＭのＮａＣｌ／ｐＨ６）と２０％の勾配緩衝液Ａの最終混合物までの２２ＣＶの勾配で溶出させた。ｐＨは好ましくは５から８、より好ましくは５．７から６．５、最も好ましくは６である。代表的なクロマトグラムを図１に示す。
【０１２９】
ＳＰセファロースＨＰプールはルーチン的に約９５％の１２０型、３％のＲ１２０型、０．６５％のｉｓｏａｓｐ型、０．６％の酸化型、０．６％の脱アミド型を含んでいた。ＮＧＦの他の未同定の形態は約０．６％であり、二酸化型ＮＧＦ（Met３７とMet９２）からなり、脱アミドＡｓｎ４５が存在していた。ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー後に得られたプールと（ＳＰ−セファロース樹脂に装填された）代表的なＨＩＣプールを比較するＨＰＩＥＸ分析を図２に示す。ＮＧＦの３つの主要なクリップ型、１２０、１１８、及び１１７の各々が変種を有しているようであるが、精製中、主な切詰め型（この例では１２０）の変種、例えば酸化及びｉｓｏａｓｐ型が、主要ではない形態（この例では１１８と１１７）からの変種の分析を遮蔽しているようである。代表的な試行からの分画のＨＰＬＣ分析を図３に示す。
【０１３０】
ＳＰ−セファロースＨＰはＨＩＣプール中に存在する変種を効果的に除去した。Ｒ１２０型はＮＧＦのＮ末端に更なるアルギニン残基を有している；通常、ｒｈＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列はＳＳＳＨＰであるが、Ｒ１２０はＲＳＳＳＨＰのＮ末端配列を有している。従って、Ｒ１２０型は成熟ＮＧＦよりより塩基性で、ＳＰ−ＳＨＰにより分離された。これはまた、ＮＧＦのＮ末端がレセプター（ｔｒｋＡ）結合に必要であるという事実に恐らくは関連して、低い生物活性を有している。酸化ＮＧＦ型は酸化された３７位置にメチオニンを有するモノ酸化型であり、ＮＧＦピークの先行端に溶出するより酸性の形態を生じる。ｉｓｏａｓｐ型はアミノ酸９３にアスパラギン酸の修飾を含む。ｉｓｏａｓｐ型は僅かにより塩基性であり、従ってＳＰ−セファロースＨＰ樹脂にややより強固に結合する。ｉｓｏＡｓｐ９３を含んでいるＮＧＦ種は溶出ピークの終端に溶出した。脱アミド化がアスパラギン酸残基、典型的には４５位のアスパラギン酸の位置で生じた。脱アミド化Ａｓｎを含んでいるＮＧＦは、４５位にＡｓｐを生じるが、僅かにより酸性であり、溶出ピークの先行端に現われる。
【０１３１】
フラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３はＮＧＦ種の荷電変種を分離するためのＳＰ−セファロースＨＰ樹脂に対してあまり好適な代替樹脂ではない。このあまり好ましくない樹脂を使用する場合は、ＮＧＦを溶出させるためにより高い濃度のＮａＣｌが必要となる。
【０１３２】
製剤
バルク材料を、先の実施例におけるように、製剤緩衝液中への限外濾過／ダイアフィルトレーションにより製剤化した。最終のバルク生成物において、１２０型はルーチン的に約９２から９７％、Ｒ１２０は約１から４％、ｉｓｏａｓｐ型は約０．２から１．５％、酸化型は約０．２から２％、脱アミド型は約０．２から２％の範囲であった。１１７及び１１８型はルーチン的に約２％未満であった。最終のバルク生成物はルーチン的に少なくとも９９．５％の純ＮＧＦ（全ての種を含む）であった。
【０１３３】
＜実施例ＩＩＩ．１１８／１１８の単離＞
ＮＧＦ変種が実質的に含まれていない実質的に純粋な１１８／１１８ＮＧＦ組成物を得る好適な一実施態様においては、実施例ＩＩの方法を、次の変更をして実施した。マクロプレップ・ハイ・Ｓカラムとシリカカラムの間に固定化トリプシンカラムを使用する。必要に応じてｐＨを約５から８．５、最も典型的には６．５から７．５に調節した後に、マクロプレッププールを固定化トリプシンカラムに直接装填した。プールをカラムに通過させ、その間に殆どのＮＧＦが１１８型に転換された。プロテアーゼ消化が、Ｃ末端のＶＲＲＡをＶＲに切断することにより１２０型を１１８型に転換する。制限された選択的な切断を達成するために、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ、好ましくはトリプシン、より好ましくは直ぐに入手できるブタトリプシン、あるいは代わりにウシトリプシン又は組換えトリプシンが使用される。制限された選択的な切断を実質的にもたらす任意のタンパク分解性方法を使用することができるが、ＮＧＦ調製の汚染を最小化するために好ましいものは固定化トリプシンカラムである。カラムはプロテアーゼ活性を促すｐＨ、好ましくは５．５から８．５のｐＨ、より好ましくは６．０から８．０、最も好ましくは６．５から７．５のｐＨで操作される。
【０１３４】
この実施例において、グリコシル化ＮＧＦはここで検討したようにＨＩＣにより除去された。実施例ＩＩにおいて検討したようなＳＰ−セファロースＨＰ工程に続いて、しかし好ましくは２２カラム容量の０．３Ｍから０．５５Ｍの塩勾配を用いて、治療用途に好適なＮＧＦ組成物を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより決定したところ、７０％を超える１１８単量体、１０％未満の１２０単量体及び１５％未満の１１７単量体の組成物を得ることができる。典型的には、９０％以上の１１８／１１８ｒｈＮＧＦ、より通常的には９３％以上の１１８／１１８ｒｈＧＮＦで、約７％以下の脱アミド、ｉｓｏａｓｐ型及び酸化変種の組成物が得られる。より高い純度を達成する一つの手段は、例えば１１８／１１８ｒｈＮＧＦピークのような主要ニューロトロフィンピークの先端又は後行端に見出されるような有意の量の変種を伴う分画を選択することを避けることである。
【０１３５】
＜実施例ＩＶ．細菌封入体からのｒｈＮＴ−４／５の部分的精製と再折り畳み＞
この実施例において、１０もしくは６０リットルの発酵で出発して、ｒｈＮＴ−４／５を精製した。この実施例において記載した発酵において組換えヒトＮＴ−４／５を生産するために使用された宿主は２７Ｃ７／ｐｍＮＴ５ＤＴと命名された大腸菌株であった。但し、他の菌株と生物体から生産されるＮＴ−４／５もまたここに記載した精製方法に適している。この実施例において使用された発現プラスミドは、大腸菌中のＮＴ−４／５遺伝子の発現に必要とされる転写及び翻訳調節配列下に成熟ＮＴ−４／５コード配列を含んでいた。ＮＴ−４／５発現プラスミドにおいて、大腸菌中での遺伝子の発現に必要とされる転写配列はアルカリホスファターゼプロモータ配列によって提供された。転写ターミネーターに対するラムダはＮＴ−４／５終止コドンに隣接して位置していた。細胞質からのタンパク質の分泌はＳＴＩＩシグナル配列により指示された。ｒｈＮＴ−４／５の大部分は屈折性体のような細胞膜周辺膣に見出された。プラスミドは、形質転換された宿主に対してテトラサイクリン耐性をもたらした。発酵プロセスは３５℃から３９℃、ｐＨ７．０−７．８で実施された。発酵は２５−４０時間続けられ、その後培養は収集前に冷却された。培養は、６０℃で連続流れの装置を使用する加熱処理又はその温度で５−１５分の間インタンク熱不活性化を使用して不活性化した。熱不活性化された培養は、ＡＸアルファ−ラバル遠心機又は等価物を使用して遠心分離された。大腸菌はペレットに回収された。
【０１３６】
封入体中に組換えヒトＮＴ−４／５を発現している大腸菌細胞は、封入体中にＮＴ−４／５を含むペーストを調製するために標準的な手段により溶解させた。緩衝液にはプロテアーゼ阻害薬は含まれていなかった。
【０１３７】
細胞片から封入体を単離するために、大腸菌ＮＴ−５ペーストを、回転式機械的分散装置、例えばトゥラックス（Ｔｕｒｒａｘ）を使用して０．０２Ｍのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を６０００ｐｓｉで３回マイクロフルイダイザーを通過させた。得られたホモジェネートを約４５分間、５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機で遠心分離した。上清を破棄し、ペレットを、トゥラックスを使用して２から３分間、中程度の速度で２０ｍＭのトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ（抽出緩衝液）中に再懸濁させた。ホモジェネートを上述のようにして遠心分離した。ペレットを抽出緩衝液に再懸濁させ上述のように遠心分離した。得られたペレット（ペレット群）（ＮＴ−４／５封入体又は屈折体という）を−７０℃で保存した。
【０１３８】
ＮＴ−４／５は次のようにして封入体から単離した。封入体ペレットを２０ｍＭのトリス、ｐＨ８、６Ｍの尿素、２５ｍＭのＤＴＴ（１０ｍｌ緩衝液／封入体グラム）中にトゥラックスを使用して中程度の速度で約１０分間懸濁した。懸濁液を２−８℃で４０分間撹拌し、約４５分間５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂで遠心分離した。ＰＥＩ（ポリ-エチレン-イミン）を０．１％まで上清に添加し、これを２−８℃で３０分間撹拌した。ＰＥＩは核酸とその他の酸性負荷分子を沈殿させる。混合物を約４５分間５０００ｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂで遠心分離した。ＰＥＩ上清を、０．０２Ｍのトリス、６Ｍの尿素、１０ｍＭのＤＤＴ、ｐＨ８で平衡化されたＤＥＦＦセファロース・ファースト・フロー・カラム（１０ｃｍｘ１４ｃｍ；ＤＥＦＦはジエチルアミノエチル樹脂である）に装填した。１ｋｇの可溶化屈折体の等価物がＤＥＦＦカラムに装填された。還元された変性ＮＴ−４／５はＤＥＦＦ樹脂に結合しないので、ＮＴ−４／５と６Ｍの尿素を含む素通りプールが収集され（図６）、プールのｐＨが酢酸で５．０に下げられた。ｐＨ調節ＤＥＦＦ素通りプールを、ＮＴ−４／５が樹脂に結合する条件である、６Ｍの尿素を含む２０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５）で平衡化したセファロース・ファースト・フロー・カラム（Ｓは樹脂上のＳＯ３官能基をいう）に装填した。装填後、Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・カラムを数カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。結合したＮＴ−４／５を、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、６Ｍの尿素、ｐＨ５で溶出させた（図７）。０．５ＭのＮａＣｌのＳＳＦＦプールを２０ｍＭのトリス、０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８に対して一晩かけて透析した。この条件ではＮＴ−４／５が不適切にではあるが再折り畳みする。誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５分子は凝集して沈殿物を形成した。
【０１３９】
凝集した誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５をプロセシングして正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を得た。凝集した誤って折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５を遠心分離によりペレットとして収集した。ペレットを、０．２Ｍのトリス、ｐＨ８、４Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、約１から２時間もしくはペレットが溶解するまで２−８℃で撹拌した。最終のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光係数１．８に基づいて約１０ｍｇ／ｍｌタンパクに調節した。酸化されたグルタチオンを可溶化されたペレット溶液に添加して２０ｍＭの最終濃度とし、２−８℃で１５から３０分間穏やかに撹拌した。酸化グルタチオンはＮＴ−４／５スルフヒドリル基と反応してＮＴ−４／５−Ｓ−グルタチオン混合ジスルフィドを生成する。ＮＴ−４／５−ＳＧ混合ジスルフィドを、１００ｍＭのトリス、２０ｍＭのグリシン、１５％のＰＥＧ−３００、１ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８．３中に０．１から０．５ｍｇ／ｍｌタンパクの最終濃度まで希釈した。ＮＴ−４／５の正しい再折り畳みを開始するために、再折り畳み混合物に２から４ｍＭの最終濃度でシステインを添加し、続いて酸素を排除するために容器を密封する前に５から６０分間窒素又はヘリウムで溶液をエアレーション（泡立てによる）した。ＮＴ−４／５の再折り畳みは２から８℃で１８から２４時間進められた。
【０１４０】
別法として、ｒｈＮＴ−４／５が次のような亜硫酸分解を使用して再折り畳みされた。封入体ペレット（１１０ｇ）を１．１リットルの２０ｍＭトリス、７Ｍ尿素、１０ｍＭグリシン、１００ｍＭ亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭテトラチオン酸ナトリウムに懸濁させ、中程度の速度で１０分間トゥラックスを使用して溶解させた。混合物（１２６０ｍＬ）をついで２から８℃で４５分間撹拌した。ＰＥＩを０．１％ＰＥＩの最終濃度になるまで添加した。混合物を４℃で更に３０分間撹拌し、ＲＣ３Ｂ遠心機中で５５００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭのトリス、６Ｍの尿素、ｐＨ８で平衡化したＤＥＦＦカラム（４．４ｃｍｘ２５ｃｍ）に装填した。ＤＥＦＦ素通り分を酢酸でｐＨ５に調節して、２０ｍＭの酢酸、６Ｍの尿素、ｐＨ５で平衡化したＳ−セファロース・ファースト・フロー・カラム（４．４ｃｍｘ２５ｃｍ）に装填した。ＮＴ−４／５を２５ｍＭのＭＯＰＳＯ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７で溶出させた。
【０１４１】
スルホニル化ｒｈＮＴ−４／５を含むＳＳＦＦ０．５Ｍ塩化ナトリウムプールを約０．１ｍｇ／ｍｌタンパクに希釈し、１Ｍのグアニジンヒドロクロリド、１００ｍＭのトリス、２０ｍＭのグリシン、１５％のＰＥＧ−３００、ｐＨ８．３に調節した。２から４ｍＭのシステインの添加によりＮＴ−４／５の再折り畳みを開始した。再折り畳み反応は本質的に２４時間以内に完了した。溶液からの酸素を置換するための例えばヘリウム又は窒素のような不活性ガスによるエアレーションを必要に応じて実施することもできる。
【０１４２】
＜実施例Ｖ．高次構造的（誤って折り畳まれた）変種からの正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の単離＞
実施例ＩＶのｒｈＮＴ−４／５の再折り畳み混合物を一晩かけてｐＨ４から５の溶液に対して透析してグアニジンとその他の試薬を除去した。溶液を清澄にするために、溶液を５０００ｒｐｍで４５分間遠心分離するか、０．２ｕｍフィルターを通過させた。
【０１４３】
０．５から５グラムのタンパク質を含む清澄化した上清を、氷酢酸を添加してｐＨ３から５に調節し、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに装填するか、精製の準備ができるまで−２０℃で凍らせて保存した。この実施例では、酸性化され清澄化された溶液を、折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５が結合した樹脂のＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣ（３ｃｍｘ５０ｃｍ）カラムに装填した。正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を、０．０５トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶媒系中のアセトニトリル勾配を用いて（２５ｍｌ／分の流速での０．０５％ＴＦＡ中の２６から４０％のアセトニトリル勾配（９５分間を越える）からなる）溶出させた。分画を１から１．５分間隔で収集した（図８）。分析的Ｃ４ＨＰＬＣ Ｖｙｄａｃ（０．２１ｘ１５ｃｍ）カラム上の溶出時間を正しく折り畳まれたＮＴ−４／５標準物質の時間と比較することにより、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５について分画を分析した（図９）。標準的な正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５は典型的には０．５％ＴＦＡ／アセトニトリル緩衝系で毎分２．５ｍｌの流量で１９分で溶出した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５を含む分画をプールしｐＨを５から７に調節した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５のプールもまたＮＴ−４／５のカルバミル化及びＮ末端切詰め型を含んでいた。
【０１４４】
調製的逆相液体クロマトグラフィー樹脂は好ましくは約１０−４０ミクロンの粒径、約２００−４００オングストロームの孔径、及びＣ４、Ｃ８、又はＣ１８アルキル基を有する媒体である。より好ましくは、樹脂は約１５−４０ミクロンの粒径と約３００オングストロームの孔径を有し、Ｃ４シリカ媒体である。
【０１４５】
＜実施例ＶＩ．高次構造的（誤って折り畳まれた）変種からの正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の別の単離＞
実施例ＩＶの再折り畳みｒｈＮＴ−４／５混合物を、１０ｋＤの分子量のカットオフを持つ２０平方フィートのセルロース（又はポリスルホンもしくは等価物）膜を備えたミリポア−ペリコン限外濾過系を使用して約１０倍に濃縮した。０．２ミクロン膜を通す濾過の前に、濃縮した混合物を一晩かけて５０Ｌの５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５、５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析するか、５０ｍＭの酢酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５中でダイアフィルトレーションを施した。
【０１４６】
濾過した再折り畳み混合物を２．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７に調節し、前もって２．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７で平衡化したＨＩＣカラムであるフェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラム（１０ｃｍｘ１９ｃｍ）に装填した。ついで、平衡緩衝液でカラムを洗浄した。ｒｈＮＴ−４／５分子の分子の幾つかの誤って折り畳まれた型が素通り分画に溶出し、その他の誤って折り畳まれた型が２０から４０％の試薬アルコールのような高濃度の有機溶媒で溶出した。正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５は２Ｍの塩化ナトリウム、１０％の試薬アルコール、ｐＨ７を使用してフェニルカラムから溶出させた（図１０）。フェニルセファロースのような他のフェニル樹脂をトーヨーパールのバックボーンの代わりに使用することができる。硫酸アンモニウム、クエン酸塩、酢酸塩、及び塩化カリウムを含むここで検討した塩を使用することができる。使用する塩に依存して、塩濃度は典型的には１Ｍから３Ｍであり、２．５ＭのＮａＣｌが装填には好適で、２ＭのＮａＣｌが有機溶媒の存在する場合の溶出に好適である。好ましくは、塩濃度の低下がニューロトロフィンとその変種を溶出させ分離するために使用される。溶出を達成するには、溶出緩衝液中の塩濃度は典型的には負荷緩衝液中のものよりも低いが、有機溶媒で補償するときは同じ濃度とすることができる。また、有機溶媒の使用は、ここで見出されたところでは、有機溶媒を添加するとより狭いピークプロファイルが得られて溶出パターンが改善されるという他の利点がある。エタノールに加えて、プロパノール、イソプロパノール、及び低級アルキレングリコール、例えばプロピレングリコール、エチレングリコール及びヘキシレングリコールを含むここで検討するその他の有機溶媒を使用することもできる。５から２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは５から２０％（ｖ／ｖ）、更に好ましくは５から１５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒が典型的には正しく折り畳まれたニューロトロフィンを溶出する。有機溶媒での溶出は勾配によるか、段階的に行なう。ｐＨ範囲は、好ましくは中性近くから僅かに酸性であり、５から８、より好ましくは５．５から７．５、最も好ましくは７である。ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、アンモニウム、酢酸塩を含むここで検討した任意の緩衝液を、所望のｐＨで緩衝作用を示す限り使用することができる。
【０１４７】
＜実施例ＶＩＩ．正しく折り畳まれたｒｈＮＴ−４／５の化学変種からの精製＞
ｒｈＮＴ−４／５のカルバミル化及びＮ末端切詰め型を含む化学変種からの正しく折り畳まれた無傷のｒｈＮＴ−４／５の分離は、ＳＰ−セファロースＨＰ樹脂又はポリキャットＡ ＨＰＬＣ樹脂を使用する高速カチオン交換クロマトグラフィーにより達成することができた。
【０１４８】
Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを誤って折り畳まれた変種を取り除くために使用した場合、Ｃ４ＨＰＬＣプールをｐＨ５から７に調節し、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６、５％の試薬アルコール、０．２ＭのＮａＣｌで平衡化した７ｃｍｘ１９ｃｍのＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。結合したＮＴ−４／５を伴う樹脂を平衡緩衝液で洗浄した。結合したｒｈＮＴ−４／５を、ｐＨ６で０．２ＭのＮａＣｌから０．４ＭのＮａＣｌまでの２２カラム容量（ＣＶ）の勾配（すなわち、平衡緩衝液中の塩勾配）を使用して溶出させ、カルバミル化及びＮ末端切詰め型から分離した（図１１）。ＮＴ−４／５を含む分画をプールし、０．０５Ｍの酢酸塩、ｐＨ４から５に製剤化した。無傷のｒｈＮＴ−４／５を同定し、好ましくはここで検討したように分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画内の変種から区別し、標準と比較した。
【０１４９】
別法として、ＮＴ−４／５の変種型をポリアスパラギン酸カラムでの高速カチオン交換ＨＰＬＣ（ポリキャットａ、ポリＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．）（９．４ｘ２００ｍｍ）により除去した（図１２）。Ｃ４ＨＰＬＣプールをｐＨ５から６に調節し、ポリキャットａカラムに装填した。クロマトグラフィー条件は：緩衝液Ａが２０ｍＭのリン酸塩、５％のアセトニトリル、ｐＨ６であった；緩衝液Ｂは２０ｍＭのリン酸塩、５％のアセトニトリル、０．８ＭのＫＣｌ、ｐＨ６であった。ｒｈＮＴ−４／５を、６５分にわたって２５から６０％の緩衝液Ｂの勾配を使用して溶出させた（図１２）。分画を１分間隔で収集し、上述のように分析的Ｃ４ＨＰＬＣにより分析した。
【０１５０】
ＨＩＣを用いて誤って折り畳まれた変種を除いた場合（上記の実施例ＶＩ）は、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５プールを、２０ｍＭのコハク酸塩、０．１ＭのＮａＣｌ、５％の試薬アルコール、ｐＨ６中で一晩かけて透析するか、２０ｍＭのコハク酸塩緩衝液中で限外濾過／ダイアフィルトレーションした。透析もしくはＵＦ／ＤＦプールをついで上述のようなＳＰ−セファロースＨＰ又はポリキャットａカラムに装填した。
【０１５１】
製剤
（ＳＰ−セファロースＨＰ又はポリキャットａＨＰＬＣ工程から得た）正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５を含む分画をプールし、２０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４から５の製剤緩衝液中に１から５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。別法として、ＮＴ−４／５を限外濾過／ダイアフィルトレーションを使用して製剤化した。
【０１５２】
最終のバルク溶液を、アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３）及び生物学的アッセイにより分析した。キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、細胞膜に位置するそのチロシンキナーゼレセプター（ｔｒｋＢ）の自己リン酸化のＮＴ−４／５活性化を検出するものであるが、精製したｒｈＮＴ−４／５を特徴付けるために使用した。ｇＤタグを付したｔｒｋＢを発現するＣＨＯ細胞を使用した。１９９５年６月１日に公開されたＷＯ９５／１４９３０はＫＩＲＡを記述しており、ここに出典明示により取込む。ｒｈＮＴ−４／５はこのアッセイにおいて１２．６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を有していた。典型的には、ここに記載されたようにして精製される正しく折り畳まれた無傷のＮＴ−４／５のＥＣ５０は、５から３０、より好ましくは１０から２０である。
【０１５３】
非ＮＴ−４／５タンパク質に対するｒｈＮＴ−４／５の純度は典型的には９０から９９パーセントであった。カルバミル化及びＮ末端切詰め変種に対してのＮＴ−４／５の相同性は９０から９９パーセントであった。最も典型的かつ好ましくは、純度と相同性は９９％又はそれ以上である。
【０１５４】
＜実施例ＶＩＩＩ．細菌封入体からのｒｈＮＴ−３の初期精製、再折り畳み及び最終精製＞
細胞片から封入体を単離するために、大腸菌ＮＴ−３ペースト（１ｋｇ）を、１０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に、例えばトゥラックスのような回転機械式分散装置を使用して再懸濁させた。細胞懸濁液を６０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーに３回通した。得られたホモジェネートを５０００ｒｐｍで３０分の間ＳｏｒｖａｌｌＲＣ−３Ｂ遠心機で遠心分離した。
【０１５５】
ＮＴ−３を次のようにして封入体から単離した。封入体ペレットを、約１０分間中程度の速度でトゥラックスを使用して、１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの亜硫酸ナトリウム、１０ｍＭのテトラチオン酸ナトリウム、７．５Ｍの尿素、ｐＨ８．３（１０ｍｌ／封入体グラム）に懸濁させた。懸濁液を２−８℃で約１時間撹拌した。ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を約０．１５％（最終濃度）になるまで添加し、２−８℃で３０分間撹拌した。混合物を５０００ｒｐｍで約３０分の間ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂにおいて遠心分離した。上清をゲルマン・プレフロー（Ｇｅｌｍａｎ Ｐｒｅｆｌｏｗ）カートリッジで濾過した。濾過した上清を３容量のＳ−セファロース・ファースト・フロー平衡緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５）で希釈した。希釈した濾過上清（７ｍＳ未満の導電率を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５．０で平衡化したＳ−セファロースＦＦカラムに装填する。カラムを最初に５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５Ｍの尿素、ｐＨ５で洗浄し、ついで５０ｍＭのＭＯＰＳ，５Ｍの尿素、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ７．０で洗浄した。亜硫酸分解されたＮＴ−３を、５０ｍＭのＭＯＰＳ、５Ｍの尿素、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ７中の０−０．６ＭのＮａＣｌの１０カラム容量の勾配を使用してカラムから溶出させた。
【０１５６】
部分的に精製されたＮＴ−３を、０．１Ｍのトリス、２Ｍの尿素、０．１ＭのＮａＣｌ、１５％のＰＥＧ３００、１０ｍＭのグリシン、２５ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．１）を含む再折り畳み緩衝液中でＳ−セファロースＦＦプールをおよそ０．１ｍｇ／ｍｌタンパクまで希釈することにより再び折り畳んだ。再折り畳みは、およそ５ｍＭまでシステインを添加し、２−８℃で２−５日間撹拌することにより開始した。必要に応じて、再折り畳み溶液中の酸素濃度を低減させるために、再折り畳み緩衝液をＨｅ又はアルゴンで分散させても良い。
【０１５７】
再折り畳みされたプールのｐＨは７に調節し、濾過し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）で平衡化したマクロプレップ・ハイ・Ｓカチオン交換クロマトグラフィーカラムに装填した。マクロプレップカラムにｐＨ調節再折り畳みプールを装填した後、カラムを５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７）で最初に洗浄し、続いて５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．１ＭのＴＭＡＣ、０．３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）により洗浄した。ＮＴ−３を５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．２５ＭのＴＭＡＣ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で溶出させた。
【０１５８】
次に、マクロプレッププールをフェニルセファロース・ファースト・フロー・ハイ・サブスティチューションカラムで精製した。フェニルカラムを５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で平衡化し、マクロプレッププールをフェニルカラムに直接装填した。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、正しく再折り畳みされたＮＴ−３を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）から５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％の試薬アルコール（ｐＨ７）に変わる１５カラム容量の勾配を使用して溶出させた。分画をＣ４ＨＰＬＣかＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、正しく折り畳まれたＮＴ−３を含む分画をプールした。
【０１５９】
フェニルプールを２５ｍＳ未満に希釈（典型的には水で約２倍容量）し、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）で前もって平衡化したＳＰ−セファロースＨＰカラムに装填した。カラムを最初に平衡緩衝液で洗浄し、ＮＴ−３を、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７）中に０．３５ＭのＴＭＡＣから０．６５ＭのＴＭＡＣまでの２０カラム容量の勾配を使用してカラムから溶出させた。（Ｃ４ＨＰＬＣアッセイにより判断して）ｒｈＮＴ−３を含む分画をプールした。
【０１６０】
ＳＰ−セファロースＨＰプールを１００００分子量の膜上で約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ついで６容量の１０ｍＭの酢酸塩、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）でダイアフィルトレーションを行った。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１はＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラムを示す。ＨＩＣクロマトグラフィー後に１２ｋＬの発酵からのＮＧＦ含有混合物を、２５全体適合（ｏｍｎｉｆｉｔ）ＳＰ−セファロース・ハイ・パーフォーマンス樹脂（カラム寸法１．０ｘ３５ｃｍ；総容積２７．５ｍｌ）の一つのＳＰＨＰ樹脂上に装填した。緩衝液Ａは、０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（２３ｍｓ）であった。緩衝液Ｂは０．７ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（６３ｍｓ）であった。カラムは最初に緩衝液Ａで平衡にした。０．２４ｍｇ／ｍｌで３４５ｍｌのＨＩＣプールが２５ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０（１７ｍｓ）に調整され、その３６２ｍｌを装填して、３ｍｇ／ｍｌ樹脂の負荷とした；８２．５ｍｇのＮＧＦを装填した。装填速度は１時間当り４０ｃｍとした。ＮＧＦを、３０％から８０％までの緩衝液Ｂ（０．３５から０．６０ＭまでのＮａＣｌ；３７から５７ｍｓ）の２２カラム容量の勾配を使用して溶出させた。溶出速度は１時間当り６０ｃｍとした。吸光度単位（２８０ｎｍ）とｍＳ／ｃｍを分画数と溶出容積ｍｌに対してプロットした。ＮＧＦを含有する分画を決定し、プールした。この場合、分画４３から６０をプールして、０．３８ｍｇ／ｍｌＮＧＦの９９ｍｌのサンプルを得た。これは約４６％の回収率になる。
【図２】図２は、フェニル・セファロース・ファースト・フロー・プールとＳＰ−セファロースＨＰプールのＳＰ−ＮＰＲ ＨＰＬＣカチオン交換（ＨＰＩＥＸ）分析を示す。それぞれに対するクロマトグラムに標しをする。
【図３】図３は、ＳＰ−セファロースＨＰクロマトグラフィー工程からの選択した分画（主プール、主ピークプールの先端と後端）のＣ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。３つのシグナルが重ねられて描かれている。分かるように、（成熟ＮＧＦを含む）主ピークは変種ＮＧＦ群を含む幾つかのより小さいピークとは分離している。
【図４】図４は、ヒトプレプロＮＧＦの配列（配列番号：１）を示す。この図上に示されているのは、成熟ＮＧＦの最初のアミノ酸（位置１）と１２０ＮＧＦの最後のアミノ酸（位置１２０）である。好適なＮＧＦアミノ酸配列は成熟１１８型のもの（位置１から位置１１８）である。また示されているのは変種形態：成熟１２０（位置１から位置１２０）；成熟１１７（位置１から位置１１７）；Ｒ１２０（位置１から１２０）；及び成熟１１４（アミノ酸１から１１４）、１１５（アミノ酸１から１１５）及び１１７（アミノ酸１から１１７）変種を含む、Ｎ末端とＣ末端に生じるその他の誤ってプロセシングされた部位である。タンパク分解性に誤ってプロセシングされた主要なミスプロセシング変種は、ＮＧＦのプロ配列のアミノ酸Ｒ（−３９）とＳ（−３８）の間にＮ末端切断を有している。可能な開始メチオニンには下線が付される。他のＮ末端変種には、ＮＧＦの切断型が含まれ、最もありふれたものはアミノ酸Ｈ８とＨ９及びＲ９とＧ１０の間に生じる切断を有している。
【図５】図５は、ヒトＮＧＦ（配列番号：２）、マウスＮＧＦ（配列番号：３）、ＢＤＮＦ（配列番号：４）、ＮＴ−３（配列番号：５）及びＮＴ−４／５（配列番号：６）のニューロトロフィンのアミノ酸配列を示している。ボックスで囲った領域はシステインノットモチーフに関与する相同的システイン含有領域を示している図である（De Youngら, Protein Sci. 5(8):1554-66(1996)）。
【図６】図６は、ＤＥＡＥ−セファロース・ファースト・フロー（ＤＥＦＦ）樹脂カラムでのｒｈＮＴ−４／５のクロマトグラフィーパターンを示す。「ＮＴ４５ＤＥ１：１＿ＵＶ」と標されているクロマトグラムは２８０ｎｍでのＵＶ吸光度測定値である。「ＮＴ４５ＤＥ１：１＿Ｃｏｎｄ１」と標されているクロマトグラムは溶出する分画の伝導率測定値である。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図７】図７は、ＳＰ−セファロース・ファースト・フロー樹脂カラムでのｒｈＮＴ−４／５のクロマトグラフィーパターンを示す。「ＮＴ４５ＳＦＦ１：１＿ＵＶ」と標されているクロマトグラムは２８０ｎｍでのＵＶ吸光度測定値である。「ＮＴ４５ＳＦＦ１：１＿Ｃｏｎｄ１」と標されているクロマトグラムは溶出する分画の伝導率測定値である。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図８】図８は、明細書に記載された条件下でのｒｈＮＴ−４／５の典型的な調製用Ｃ４−ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーパターンを示す。２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。プールされたニューロトロフィン含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図９】図９は、示した時間での再折り畳みの間モニターされたＮＴ４／５試料の分析用ＨＰＬＣクロマトグラフィーパターンを提供する。カラム条件は明細書中に記載した。「ＳＳＦＦ（０．５ｍ）」と標されたパターンは、再折り畳みの前にＳ−セファロース・ファースト・フロー・カラムから０．５ＭのＮａＣｌで溶出させたＮＴ−４／５の分析を示す。ＮＴ−４／５が再折り畳みされるにつれて、溶出パターンは標準のパターンに近づく。
【図１０】図１０は、疎水的相互作用クロマトグラフィーカラムであるフェニル・トーヨーパール６５０Ｍカラムでの誤って折り畳まれた変種からの無傷の正しく折り畳まれたＮＴ−４／５の分離を示すクロマトグラムを示す。正しく折り畳まれたＮＴ−４／５よりも疎水性が低い誤って折り畳まれた変種は素通り分内に溶出する一方、より疎水性である誤って折り畳まれた変種（ピークＢ）は、正しく折り畳まれたＮＴ−４／５（ピークＡ）を溶出するのに必要とされるものよりも高い有機溶媒濃度で溶出する。
【図１１】図１１は、カチオン交換樹脂であるＳＰ−セファロースからのＮＴ−４／５と変種の溶出パターンを示す。２８０ｎｍでの吸光度がモニターされた。ピークＡがカルバミル化され切詰められた（ｃｌｉｐｐｅｄ）変種を含む一方、ピークＢは無傷の正しく折り畳まれたＮＴ−４／５を含む。プールされたＮＴ−４／５含有分画は「プール」と標された水平な矢印により示されている。
【図１２】図１２は、明細書に記載された条件下でのｒｈＮＴ−４／５の典型的な調製用ポリキャットＡ樹脂クロマトグラフィーパターンを示す。
【図１３】図１３は、本明細書に記載したｒｈＮＴ４／５精製法の示された工程から採られた試料の純度と均一性を評価するための還元条件下での１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サンジエゴのＮｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．からの、予め注がれたトリス−グリシン系）分析を示す。ゲルは、タンパク質を検出するために、クーマジーＲ２５０で染色された。「ＤＥ負荷」と標されたレーンはＤＥ−セファロース・ファースト・フロー・カラム上に負荷されたＰＥＩ混合物の試料を含み、「ＤＥ ＦＴ」と標されたレーンはＤＥ−セファロース・ファースト・フロー・カラムの素通り分の試料を含み、レーン「Ｓプール」は、再折り畳み前に、Ｓ−セファロース・ファースト・フロー樹脂カラムから溶出したＮＴ−４／５を含むプールされた分画からの試料を含み、レーン「再折り畳みプール」は再折り畳みが完了した後のプールの試料を含み、レーン「Ｃ４プール」は調製的Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ後のプール分画の試料を含み、レーン「ポリキャットＡプール」はポリキャットＡ ＨＰＬＣカラムからのプール分画の試料を含む。
【図１４】図１４は、細菌的に調製されたスルホニル化ｒｈＮＴ−３を含む混合物のＳ−セファロース・ファースト・フロー・クロマトグラフィーからの分画のＵＶ吸光度パターンを示す。
【図１５】図１５は、ｒｈＮＴ−３のインビトロ再折り畳み型を含む混合物のマクロプレップ・ハイ・Ｓ（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ）カチオン交換クロマトグラフィーを示す。樹脂は、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）から購入した。カラム寸法は９ｘ９ｃｍであった。ｐＨ６．８の再折り畳みされた（３６時間の再折り畳み後）を含む７００ｍｌＳＳＦＦプールが約３１０ｍｌ／分の流量でマクロプレップ・カラム上に負荷された。条件は明細書に記載する。
【図１６】図１６は、誤って折り畳まれた変種を除去するための、カチオン交換精製再折り畳みｒｈＮＴ−３のフェニル・セファロース・ファースト・フロー・ハイ・サブスティチューション（疎水的相互作用クロマトグラフィー）クロマトグラフィーを示す。
【図１７】図１７は、ＨＩＣ−ｒｈＮＴ−３プールのＳＰ−セファロース高速クロマトグラフィーを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロトロフィンを他のタンパク質を含む混合物から分離する方法において、疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂を使用して、混合物中の他のタンパク質からニューロトロフィンを分離することを含んでなる方法。
【請求項２】
混合物が、誤って折り畳まれた変種、不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、又はそのニューロトロフィンのグリコシル化変種を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
分離が、ニューロトロフィンと、誤って折り畳まれた変種、不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、又はそのニューロトロフィンのグリコシル化変種を含む混合物を、疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂上に負荷し、ニューロトロフィンが変種もしくは変種群から分離する条件下で樹脂からニューロトロフィンを溶出させることを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
樹脂がフェニル官能基を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂に装填される混合物が５から８のｐＨを有する請求項１記載の方法。
【請求項６】
樹脂上に装填される混合物が０．５Ｍから３Ｍの塩濃度を有する請求項１記載の方法。
【請求項７】
樹脂上に装填される混合物が０．５Ｍないし２．５Ｍの塩濃度を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
樹脂上に装填される混合物が０．７Ｍ酢酸塩又は１．０Ｍから２．５ＭのＮａＣｌを有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
溶出緩衝液が有機溶媒を含有する請求項３記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒が５容量％から５容量％から２０容量％である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
溶出緩衝液のｐＨがｐＨ５からｐＨ８である請求項３記載の方法。
【請求項１２】
溶出が減少する塩勾配からなる請求項３記載の方法。
【請求項１３】
ニューロトロフィンがＮＧＦスーパーファミリーのものである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ニューロトロフィンがＮＧＦ、ＮＴ−４／５又はＮＴ−３である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ニューロトロフィンが細菌培養から調製され、疎水的相互作用樹脂を用いる前にインビトロで再び折り畳まれる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ニューロトロフィンが哺乳動物細胞培養から単離される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ニューロトロフィンを、高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、その化学変種から分離することを更に含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項１８】
高速カチオン交換クロマトグラフィーによる分離工程が、ニューロトロフィンと該ニューロトロフィンの化学変種を含む混合物を高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂に装填し、ニューロトロフィンが化学変種から分離する条件下で樹脂からニューロトロフィンを溶出させることを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
カチオン交換樹脂が、ＳＰ−セファロースＨＰ、ポリアスパラギン酸、ポリスルホエチルカチオン交換、もしくはフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
カチオン交換樹脂からのニューロトロフィン含有溶出液を脱塩するか、ダイアフィルトレーションにかけ、ついで担体と製剤化する請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ニューロトロフィンを他のタンパク質からシリカゲル樹脂を使用して分離することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ニューロトロフィンをタンパク質の混合物から分離する方法であって、ニューロトロフィンを他のタンパク質からシリカゲル樹脂を使用して分離する方法。
【請求項２３】
ニューロトロフィンを該ニューロトロフィンの化学変種から分離する方法であって、高速カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、ニューロトロフィンをその化学変種から分離する方法。
【請求項２４】
ニューロトロフィンとその変種が、分離前に本質的に純粋である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
樹脂が、ＳＰ−セファロースＨＰ、ポリアスパラギン酸樹脂、ポリスルホエチルカチオン交換樹脂、もしくはフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
調製的逆相液体クロマトグラフィー樹脂を使用してニューロトロフィンを該ニューロトロフィンの誤って折り畳まれた変種から分離する工程を更に含んでいてもよい請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
樹脂がＣ４官能基を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２２又は２３に記載の方法により調製されるニューロトロフィン組成物。
【請求項２９】
担体と、変種を本質的に含まないことにより本質的に純粋で均一なニューロトロフィンとを含有する組成物。
【請求項３０】
無菌である請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
ニューロトロフィンを精製する方法であって、
（ａ） ニューロトロフィンとその変種を含む混合物を、ｐＨ５から８で疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂に装填し、
（ｂ） ｐＨ５から８で緩衝液により樹脂を洗浄し、
（ｃ） 約５から２５％（ｖ／ｖ）の濃度でアルコール性又は極性非プロトン溶媒を含むｐＨ５から８の緩衝液でニューロトロフィンを溶出させ、
（ｄ） ｐＨ５から６の高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂にニューロトロフィン含有溶出物を装填し、
（ｅ） ０．２から０．５Ｍの濃度でカチオンを含むｐＨ５から６の緩衝液で、高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂からのニューロトロフィンを溶出させる方法。
【請求項１】
ニューロトロフィンを他のタンパク質を含む混合物から分離する方法において、疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂を使用して、混合物中の他のタンパク質からニューロトロフィンを分離することを含んでなる方法。
【請求項２】
混合物が、誤って折り畳まれた変種、不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、又はそのニューロトロフィンのグリコシル化変種を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
分離が、ニューロトロフィンと、誤って折り畳まれた変種、不適切にタンパク分解性にプロセシングされた変種、又はそのニューロトロフィンのグリコシル化変種を含む混合物を、疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂上に負荷し、ニューロトロフィンが変種もしくは変種群から分離する条件下で樹脂からニューロトロフィンを溶出させることを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
樹脂がフェニル官能基を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂に装填される混合物が５から８のｐＨを有する請求項１記載の方法。
【請求項６】
樹脂上に装填される混合物が０．５Ｍから３Ｍの塩濃度を有する請求項１記載の方法。
【請求項７】
樹脂上に装填される混合物が０．５Ｍないし２．５Ｍの塩濃度を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
樹脂上に装填される混合物が０．７Ｍ酢酸塩又は１．０Ｍから２．５ＭのＮａＣｌを有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
溶出緩衝液が有機溶媒を含有する請求項３記載の方法。
【請求項１０】
有機溶媒が５容量％から５容量％から２０容量％である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
溶出緩衝液のｐＨがｐＨ５からｐＨ８である請求項３記載の方法。
【請求項１２】
溶出が減少する塩勾配からなる請求項３記載の方法。
【請求項１３】
ニューロトロフィンがＮＧＦスーパーファミリーのものである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ニューロトロフィンがＮＧＦ、ＮＴ−４／５又はＮＴ−３である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ニューロトロフィンが細菌培養から調製され、疎水的相互作用樹脂を用いる前にインビトロで再び折り畳まれる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ニューロトロフィンが哺乳動物細胞培養から単離される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ニューロトロフィンを、高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、その化学変種から分離することを更に含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項１８】
高速カチオン交換クロマトグラフィーによる分離工程が、ニューロトロフィンと該ニューロトロフィンの化学変種を含む混合物を高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂に装填し、ニューロトロフィンが化学変種から分離する条件下で樹脂からニューロトロフィンを溶出させることを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
カチオン交換樹脂が、ＳＰ−セファロースＨＰ、ポリアスパラギン酸、ポリスルホエチルカチオン交換、もしくはフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
カチオン交換樹脂からのニューロトロフィン含有溶出液を脱塩するか、ダイアフィルトレーションにかけ、ついで担体と製剤化する請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ニューロトロフィンを他のタンパク質からシリカゲル樹脂を使用して分離することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ニューロトロフィンをタンパク質の混合物から分離する方法であって、ニューロトロフィンを他のタンパク質からシリカゲル樹脂を使用して分離する方法。
【請求項２３】
ニューロトロフィンを該ニューロトロフィンの化学変種から分離する方法であって、高速カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、ニューロトロフィンをその化学変種から分離する方法。
【請求項２４】
ニューロトロフィンとその変種が、分離前に本質的に純粋である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
樹脂が、ＳＰ−セファロースＨＰ、ポリアスパラギン酸樹脂、ポリスルホエチルカチオン交換樹脂、もしくはフラクトゲルＥＭＤ ＳＯ３樹脂である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
調製的逆相液体クロマトグラフィー樹脂を使用してニューロトロフィンを該ニューロトロフィンの誤って折り畳まれた変種から分離する工程を更に含んでいてもよい請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
樹脂がＣ４官能基を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２２又は２３に記載の方法により調製されるニューロトロフィン組成物。
【請求項２９】
担体と、変種を本質的に含まないことにより本質的に純粋で均一なニューロトロフィンとを含有する組成物。
【請求項３０】
無菌である請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
ニューロトロフィンを精製する方法であって、
（ａ） ニューロトロフィンとその変種を含む混合物を、ｐＨ５から８で疎水的相互作用クロマトグラフィー樹脂に装填し、
（ｂ） ｐＨ５から８で緩衝液により樹脂を洗浄し、
（ｃ） 約５から２５％（ｖ／ｖ）の濃度でアルコール性又は極性非プロトン溶媒を含むｐＨ５から８の緩衝液でニューロトロフィンを溶出させ、
（ｄ） ｐＨ５から６の高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂にニューロトロフィン含有溶出物を装填し、
（ｅ） ０．２から０．５Ｍの濃度でカチオンを含むｐＨ５から６の緩衝液で、高速カチオン交換クロマトグラフィー樹脂からのニューロトロフィンを溶出させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−４０７８６（Ｐ２００９−４０７８６Ａ）
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２０８４３４（Ｐ２００８−２０８４３４）
【出願日】平成２０年８月１３日（２００８．８．１３）
【分割の表示】特願２００７−１６８１０４（Ｐ２００７−１６８１０４）の分割
【原出願日】平成９年１１月１４日（１９９７．１１．１４）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０８４３４（Ｐ２００８−２０８４３４）
【出願日】平成２０年８月１３日（２００８．８．１３）
【分割の表示】特願２００７−１６８１０４（Ｐ２００７−１６８１０４）の分割
【原出願日】平成９年１１月１４日（１９９７．１１．１４）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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