ニワトリにおける抗体の組織特異的発現
外因性抗体をコードする導入遺伝子が、ドナー細胞中に安定に組み込まれ、そしてキメラトリの体細胞組織中に存在する。これらの導入遺伝子は外因性抗体をコードし、そして好ましくは、卵における回収のために、輸卵管中で発現される。組織特異性は、導入遺伝子の内容をそれに応じて選択することによって提供される。導入遺伝子に由来する外因性抗体をコードするＤＮＡからゲノムが構成されているトリは、細菌発現系に由来する抗体と比べて、治療的有用性の高い望ましい化学的諸特性を有する外因性抗体を発現する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において記載される発明は、ＵＳＤＡ ＳＢＩＲ ２００３−３３６１０およびＮＩＨ ２ Ｒ４４ ＧＭ６４２６１−０１および２Ｒ４４ ＨＤ ０３９５８３−０２の下で政府により支援されている。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝的に改変された動物は、抗体など有益な薬学的製品の持続可能な製造を大きく前進させる可能性を与える。しかし、遺伝的に改変された動物の作製は、著しい技術的障害を伴い、これらの障害は少数の種でしか克服されていない。特異的発現のために、タンパク質をコードする遺伝的改変をある種のＤＮＡ中に組み入れられるようにするには、各遺伝的改変のために開発されなければならないいくつかの独特な技術が必要となる。ある動物の遺伝的特徴および肉体的特徴を改変するための１つの手法は、その動物のレシピエント胚中に細胞を導入することである。これらの細胞は、レシピエント胚から生まれる動物の組織に寄与し、結果として生じる遺伝的に改変された動物の子孫のゲノに寄与する能力を有する。
【０００３】
細胞株の研究および開発、細胞ゲノムの操作、およびそのような操作された細胞が培養状態で維持されることを可能にする細胞培養技術に、かなりの時間および資源が費やされてきた。多くの試みがなされてきたが、操作された細胞の多能性を培養状態で維持する能力は、ごく少数の種、特にマウスでしか実現されていない。
【０００４】
持続可能な培養物が容易に入手可能であり、そして多能性を維持しつつ遺伝子工学を受け入れることが可能である場合には、新しい技術の幅広い応用が利用可能になると思われる。培養細胞はキメラ動物の組織に寄与することができるため、胚状態のレシピエント動物中にこれらの細胞を組み入れることによって胚性幹細胞の由来元である動物の肉体的特徴をレシピエント胚に導入することができる。これは、２つの主要な利点を与える。第１に、胚性幹細胞の由来元である動物の表現型をレシピエント胚に選択的に導入することができる。第２に、上述したように、細胞培養物が特に安定である場合、これらの細胞のゲノムを遺伝的に改変して、細胞が導入されるレシピエント胚中に遺伝的改変を導入することができる。
【０００５】
いくつかの場合において、抗体をコードする導入遺伝子を用いてこれらの細胞を操作することができる。導入遺伝子は、抗体を作製するための青写真の役割を果たすＤＮＡを含み、そしてレシピエント胚中への細胞の挿入によって作り出される動物の組織における抗体の発現を可能にするのに十分なコードエレメントおよび調節エレメントを含む、遺伝子構築物である。しかし、動物の組織から有益な抗体を回収するには、通常、発現されたタンパク質の回収を容易にし、かつ望ましい化学的諸特性を伝達するいくつかの特定の組織型に発現が限定されている必要がある。例えば、雌ウシにおいては、乳汁におけるタンパク質発現により、単に雌ウシの乳汁を回収し、そして外因性タンパク質を分離することによる、タンパク質の容易な回収が可能になる。ニワトリでは、卵白における抗体の活発な産生もまた、抗体の発現および回収のための魅力的な媒介物になる。さらに、組織特異的な発現がニワトリの輸卵管に特異的である場合、この発現により、ヒト患者の治療において使用された場合に抗体の治療的有用性を高めるいくつかの特定の望ましい化学的諸特性を有する抗体が生じる。したがって、研究および商業的開発の特に魅力的な１つの分野は、卵中で抗体を選択的に発現して、望ましい化学的諸特性を有するタンパク質の単離および回収を容易にする、遺伝子操作されたニワトリである。組織特異性がない場合、動物の全組織において発現される抗体を生じるだけであるため、ある動物の特異的に選択された細胞において外因性抗体を選択的に作製する能力は、特に有益である。このような状況下では、有意義な量の抗体が動物から分離され得る見込みは少なく、外因性抗体の遍在的な発現は通常、動物の全般的健康および幸福に大きな損害を与え、また、ニワトリ輸卵管において提示される望ましい化学的諸特性は存在していない。
【０００６】
細胞培養が十分に安定で、細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれるのが可能となる場合、標的細胞および導入遺伝子として使用される特定の構築物に応じたいくつかの異なる技術によって新しいキメラ生物またはトランスジェニック生物に、抗体の組織特異的発現をコードする導入遺伝子を受け渡すことができる。全ゲノムは細胞ハイブリダイゼーションによって、インタクトな染色体は微小核によって、染色体部分のセグメント（ｓｕｂｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ）は染色体を介した遺伝子導入によって、およびキロベース範囲のＤＮＡ断片はＤＮＡを介した遺伝子導入によって、導入することができる（非特許文献１：Klobutcher, L.A.およびF.H.Ruddle、Annu. Rev. Biochem.、５０巻：５３３〜５５４頁、１９８１年）。インタクトな染色体は、微小核を介した染色体導入（ＭＭＣＴ）によって導入することができる（非特許文献２：Fournier,R. E.およびF. H. Ruddle、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７４巻：３１９〜３２３頁、１９７７年）。導入遺伝子を具体的に設計するには、抗体をコードするＤＮＡ配列の内容、標的細胞株、発現が標的される場となる特異的組織、発現が起こる場となる宿主生物、および発現される抗体を検討しなければならない。組織特異的発現のために設計される導入遺伝子は、細胞のゲノム中への成功な組み込みを可能にし、そして宿主生物の選択された組織における成功な発現を確実にするために、いくつかの条件を満たさなければならない。
【０００７】
上記のように、トランスジェニック動物を作製するための遺伝的改変の導入は、ごく少数の種においてしか実証されていない。マウスの場合、キメラ子孫およびトランスジェニック子孫を作製するための、相同組換えとそれに続く胚性幹（ＥＳ）細胞への染色体導入の別々の使用が周知である。部位特異的な相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの強力な技術が開発された（非特許文献３および４：Thomas, K. R.およびM.R. Capecchi、Cell ５１巻：５０３〜５１２頁、１９８７年；Waldman, A.S.、Crit.Rev. Oncol. Hematol.１２巻：４９〜６４頁、１９９２年による総説を参照されたい）。クローン化ＤＮＡの挿入（非特許文献５：Jakobovits,A.、Curr. Biol.４巻：７６１〜７６３頁、１９９４年）、ならびにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系技術による染色体フラグメントの操作および選択（非特許文献６および７ならびに特許文献１〜４：Smith,A. J.ら、Nat. Genet.９巻：３７６〜３８５頁、１９９５年；Ramirez-Solis, R.ら、Nature ３７８巻：７２０〜７２４頁、１９９５年；米国特許第４，９５９，３１７号；第６，１３０，３６４号；第６，０９１，００１号；第５，９８５，６１４号を参照されたい）は、安定な遺伝子キメラを作製するための操作およびマウスＥＳ細胞への遺伝子導入のために利用可能である。哺乳動物系において有用であることが判明したこのような多くの技術は、必要な長期の細胞培養物が入手可能である場合、ならびに、外因性タンパク質の単離および回収を容易にする、特定の組織における組織特異的発現をもたらす導入遺伝子が設計され得る場合には、非哺乳動物系に適用するために有効であると考えられる。
【０００８】
組織特異的発現を可能にする導入遺伝子は複雑であり、また、レシピエント細胞株中に導入遺伝子を組み入れるのに必要である遺伝子操作は、培養条件が最適化されなければ細胞の多能性を脅かす可能性がある大規模な操作を必要とする。したがって、遺伝子導入において使用するのに適した細胞株は、培養状態で安定でなければならず、かつ組織特異的発現に必要なエレメントをすべて含むのに十分な大きさおよび複雑さを有する遺伝子構築物で細胞がトランスフェクトされた場合に、多能性を維持しなければならない。結果として生じる動物において、導入遺伝子は、導入遺伝子が発現されるように設計されている特定の個々の組織型において効果的に発現されなければならず、そして他の組織で発現されて、その結果、動物の生存能力または結果として生じるタンパク質の有利な化学的性質が損なわれるべきではない。
【０００９】
外因性抗体の作製に対して、トリの生物学的系は、飼育場での効率的な飼育、迅速な成長、および経済的な生産を含めて、多くの利点を与える。さらに、トリ卵は、抗体の大量合成ならびに生成物の単離および回収の平易性の双方に関して理想的な生物学的設計を実現する。さらに、本明細書において後述するように、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系と比較したニワトリをベースとする発現系の利点は、大量の抗体生成物に対して得ることができる。
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１３０，３６４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９１，００１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９８５，６１４号明細書
【非特許文献１】Klobutcher, L.A.およびF.H.Ruddle、Annu. Rev. Biochem.、５０巻：５３３〜５５４頁、１９８１年
【非特許文献２】Fournier, R. E.およびF. H. Ruddle、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７４巻：３１９〜３２３頁、１９７７年
【非特許文献３】Thomas, K. R.およびM.R. Capecchi、Cell ５１巻：５０３〜５１２頁、１９８７年
【非特許文献４】Waldman, A.S.、Crit. Rev. Oncol. Hematol.１２巻：４９〜６４頁、１９９２年
【非特許文献５】Jakobovits, A.、Curr. Biol.４巻：７６１〜７６３頁、１９９４年
【非特許文献６】Smith, A. J.ら、Nat. Genet.９巻：３７６〜３８５頁、１９９５年
【非特許文献７】Ramirez-Solis, R.ら、Nature ３７８巻：７２０〜７２４頁、１９９５年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ニワトリにおけるタンパク質発現、ならびにキメラニワトリおよびトランスジェニックニワトリを作製するために使用される、遺伝子工学、遺伝子導入、および細胞の長期培養などの実現技術を含む。本発明はまた、ニワトリにおいて産生される抗体およびそれらの独特な化学的性質にも関する。具体的には、これらの抗体は、ある種の用途におけるそれらの治療的有用性を高める有利な化学的諸特性を有する。ニワトリにおいて産生される抗体は、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系において産生される抗体と比べて独特なパターンの化学的改変を有し、その結果、腫瘍などの標的組織に毒素を結合させる目的で患者に投与された場合に、標的組織は、高い治療有効性で治療される。一実施形態では、胚性幹細胞の長期培養物は、外因性抗体の組織特異的発現をもたらす導入遺伝子の挿入物を含む、キメラトリに遺伝的改変を導入するために特別に設計された遺伝子構築物を用いて作り出される。本発明のトランスジェニックトリは、導入遺伝子に由来する抗体を輸卵管中で発現し、また、抗体は、卵中に大量に蓄積する。好ましい実施形態では、天然のヒト抗体がニワトリの輸卵管において発現され、そして卵から回収することができるように、外因性抗体タンパク質は、ヒトＤＮＡ配列によってコードされる。
【００１１】
本発明は、抗体の組織特異的発現を示すトリの集団、外因性抗体の発現を可能にする導入遺伝子構築物、ニワトリにおいて産生され、そして特別に定められた化学的諸特性を有する抗体の単離組成物、ならびにこれらのトリの作製、抗体の作製、およびヒトにおけるそれらの治療的使用のための関連した方法を含む。本発明は、長期細胞培養物、および持続的な細胞培養物に由来するキメラトリまたはトランスジェニックトリを作製するための特別な技術であって、ＥＳ細胞のゲノムが外因性タンパク質を発現する安定に組み込まれた導入遺伝子を有し、その結果、培養細胞の子孫が、安定に組み込まれた導入遺伝子を含む技術を使用する。後述する手順によって宿主トリの胚に導入された場合、それらの改変されたドナー細胞は、結果として生じる動物の選択された特定の体細胞組織中に導入遺伝子を発現するトリを生じる。これらのトリは、ドナー細胞に由来する表現型を提示し、また、輸卵管中で抗体を発現して、卵白における抗体の濃縮および回収を容易にする。
【００１２】
本発明はまた、ニワトリ発現系において発現され、そして脊椎動物、植物、または細菌細胞の系と比べて望ましいいくつかの化学的諸特性を有する抗体の組成物も含む。具体的には、これらの抗体は、濃度の低下したフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、および濃度の上昇したマンノースを有する。これらの諸特性のうちのいくつかまたはすべてを有する抗体は、ヒトに投与された場合に、高い治療的有用性を示す。具体的には、これらの抗体組成物は、増強された抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示す。したがって、本発明の方法は、抗体の組成物をニワトリにおいて発現させることにより、ＡＤＣＣ作用に基づいて、それらの治療的有用性を高めることを含む。実際の応用では、これらの方法は、本明細書において説明される抗体組成物を投与するステップと、患者における細胞傷害活性を検出するステップとを含む。本発明はまた、所定の量の外因性抗体が卵白中に濃縮されるように、本明細書において定義される有利な化学的性質を有する外因性抗体を輸卵管組織中で発現するニワトリも含む。好ましい一実施形態では、外因性タンパク質は、ドナー細胞株および子孫のゲノム中に組み入れられた導入遺伝子構築物によってコードされたヒト配列モノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、輸卵管中での発現のために特異的に構築されており、そして組織特異的発現を容易にするための適切なプロモーターおよび調節配列を含む導入遺伝子の内部に含まれている。外因性タンパク質を発現するトランスジェニックトリまたはキメラトリの実施形態では、本発明は、その動物およびタンパク質、例えば本明細書において説明される外因性抗体を含む卵白アルブミンに特異的な組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明によれば、ニワトリＥＳ細胞系は大型の核を有し、かつ顕著な核小体を含むステージＸ胚に由来する（図１）。これらの細胞は、長期の培養後に形態学的にニワトリ胚性幹（ｃＥＳ）細胞であることが確認され、また、レシピエント胚中に注入された場合にキメラを生じることが確認されている。さらに、ＥＳ細胞は、広範囲の羽毛キメラ現象によって判定されるように、体細胞組織に対する高度の寄与を可能にする。さらにまた、これらの胚性幹細胞は、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを有する導入遺伝子でトランスフェクトされることが実証されている。ＥＳ細胞は、導入遺伝子を安定に組み込み、そして導入遺伝子を発現して、形質転換細胞の選択を可能にする。これらの形質転換細胞はキメラを形成することができ、その際、導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質は、このキメラの選択された組織中に存在する。このキメラに由来する細胞は、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質を発現する。特に好ましい実施形態では、この導入遺伝子によってコードされる外因性抗体は、この導入遺伝子によってコードされる抗体に応じて、特定の組織または組織型において発現される。胚性幹細胞の子孫は、レシピエント胚へのＥＳ細胞の導入およびキメラの形成後に非ＥＳ細胞表現型に分化する、ＥＳ細胞の派生物である。
【００１４】
体細胞組織における導入遺伝子の広範な発現は、胚体外組織および体細胞組織における発現によって実証される。トランスジェニック動物の卵のタンパク質内容物を解析することにより、導入遺伝子から、そして本発明の技術を用いて得られる、導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質の卵白における選択的発現が実証される。組織特異的発現は、１つの器官、組織、または細胞型に実質的に限局されている発現によって実証される。
【実施例】
【００１５】
（実施例１）
ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ細胞）の誘導
ニワトリＥＳ細胞を、２種の交雑、すなわち、横斑ロック×横斑ロック、または横斑ロック×ロードアイランドレッドのうちの１つから誘導した。ｃＥＳ細胞の発育能を試験する場合、羽毛マーカーを得るためにこれらの品種を選択した。これらｃＥＳ細胞を、優性の白色遺伝子座においてホモ接合優性である白色レグホーン胚中に注入する。これらのＥＳ細胞の注入の結果として生じるキメラニワトリは、ｃＥＳ細胞由来の黒色の羽毛およびレシピエント胚由来の白色の羽毛を提示する。
【００１６】
ｃＥＳ細胞培養物の最初の樹立を、ＵＳＰ５，５６５，４７９に記載されているプロトコールに従って開始した。ステージＸでは、胚は、約４０，０００〜６０，０００個の細胞からなり、卵黄の表面に位置する、小さな円盤状物体である。この胚を採取するために、紙でできた輪を卵黄膜上に置き、中央に胚を露出させる。この輪の外周に沿って卵黄膜を切断し、次いで卵黄からそれを持ち上げる。輪の内側に付着した胚を顕微鏡下に置き、また、細いループを用いて暗域から明域を単離する。
【００１７】
表１：ＣＥＳ−８０培地中のＳＴＯフィーダー細胞またはポリエステル挿入物のいずれかの上で誘導されたｃＥＳ細胞株。培養は、単一胚およびプールされた胚の双方から開始した。
【００１８】
【表１】
胚を機械的に分散させて単細胞懸濁物とし、有糸分裂が不活化されたＳＴＯ細胞のコンフルエントなフィーダー層上に３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種する。ｃＥＳ培養培地は、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルバート、１×ヌクレオシド、１×非必須アミノ酸、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ（２０％新鮮培地および８０％馴化培地）からなる。使用前に、ＤＭＥＭ培地をバッファローラット肝臓（ＢＲＬ）細胞で馴化させる。手短に言えば、ＢＲＬ細胞をコンフルエントになるまで増殖させた後、５％血清含有ＤＭＥＭを添加し、３日間馴化させる。この培地を除去し、培地の新しいバッチを３日間馴化させ、これを繰り返す。３回分のバッチを合わせ、ｃＥＳ培地を作製するために使用した。ニワトリＥＳ細胞は、胚盤葉細胞の接種後３〜７日目に可視になる。これらのｃＥＳ細胞は、形態学的にｍＥＳ細胞に類似していた。すなわち、これらの細胞は小型であり、大型の核および顕著な核小体を有していた（図１を参照されたい）。
【００１９】
ｃＥＳ細胞の増殖特徴は、縁が滑らかであり、かつ区別が困難な個々の細胞を有する密な円形コロニー中で増殖するｍＥＳ細胞とは異なる。ニワトリＥＳ細胞は、個々の細胞がはっきりと目に見える単層コロニー中で増殖する。密なコロニーは、ｃＥＳ培養物における分化の最初の徴候であることが多い。
【００２０】
培養で誘導された細胞の多能性のマーカーについて試験するために、これらの細胞を固定し、そしてマウスおよびニワトリの始原生殖細胞上のエピトープを認識する、ＳＳＥＡ−１１（Solter,D.およびB.B.Knowles、Proc.Natl.Acad.Sci、U.S.A.７５巻：５５６５〜５５６９頁、１９７８年）、ＥＭＡ−１（Hahnel,A.C.およびE.M.Eddy、GameteResearch １５巻：２５〜３４頁、１９８６年）、および同様に多能性細胞によって発現されるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）で染色した。図２に示すこれらの試験の結果により、ニワトリＥＳ細胞が、アルカリ性ホスファターゼ、ならびにＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１によって認識される抗原を発現することが実証される。
【００２１】
上記のプロトコールを用いた後のｃＥＳ細胞は可視であるが、このような培養物は、数週間より長く維持することができない。以下で考察するように、培養条件にいくつかの変更を起こすことにより、１９種の細胞株（表１）の派生物を生じさせ、このうち１４種をレシピエント胚中に注入することによってそれらの発育能を試験した。羽毛の色素沈着によって判定されるように、１４種の細胞株のうちの１１種が、レシピエント胚に寄与した（下記表２を参照されたい）。このプロトコールは、胚性幹細胞表現型を発現する多能性細胞の持続的培養物をもたらす。任意の時点で、これらの細胞を凍結保存することができ、また、これらの細胞は、損傷を与えられたレシピエント胚中に注入された場合に、体細胞組織に実質的に寄与する潜在能力を有する（以下の実施例３および実施例５を参照されたい）。
【００２２】
表２：単一胚またはプールされた胚に由来する胚性幹細胞株の継代数および培養時間。ステージＸレシピエント中へのこれらのＥＳ細胞の注入後の体細胞キメラ現象の出現率および程度。
【００２３】
【表２】
マウスと同様に、トリ胚性幹細胞は、ＳＴＯ、ＳＴＯ−ｓｎ１、および容易に入手可能である他のものを含めて、様々なフィーダー層上で誘導される。これらのフィーダーによって産生される白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびウシ胎児血清の添加は、ＥＳ細胞を未分化状態で維持するのに寄与する。本発明の好ましい実施形態では、ニワトリＥＳ細胞の培養は、ＳＴＯフィーダー層上で開始する。ＳＴＯ細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンで３〜４時間処理し、洗浄し、トリプシン処理し、そしてゼラチンコート皿上に４×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種する。ｃＥＳ細胞は、ＳＴＯ細胞からなるフィーダーが薄い場合に、より迅速に増殖するようである。ＳＴＯフィーダー細胞濃度を１０３〜１０５細胞／ｃｍ２まで、好ましくは１０４細胞／ｃｍ２未満に低下させると、ｃＥＳ細胞の誘導および増殖が促進される。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞およびマウス初代線維芽細胞をフィーダーとして用いた場合、ｃＥＳ細胞は誘導されなかった。また、予め樹立されたｃＥＳ細胞をこれらのフィーダー上に播種した場合、これらはすべて１週間以内に分化した。
【００２４】
フィーダーの不在下、ポリマー膜（Ｃｏｓｔａｒ社、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ型）などの合成挿入物上でｃＥＳ細胞を増殖させると、ＥＳ細胞を注入する際の、フィーダー細胞によるレシピエント胚の汚染が回避される。表３および表４が示すように、ＳＴＯフィーダーの代わりに挿入物上で培養することにより、ｃＥＳ細胞の誘導が促進され、また、挿入物は、最初の誘導のために使用され得る。しかし、最初に挿入物上で迅速に増殖した後、ＥＳ細胞の有糸分裂活性は４〜６週間の培養後に低下する。培養を延長するためには、これらの細胞をＳＴＯ細胞からなるフィーダーに移さなければならない。
【００２５】
表３．挿入物またはＳＴＯ細胞のフィーダー（１０４細胞／ｃｍ２）のいずれかの上での単一胚からのｃＥＳ細胞の樹立
【００２６】
【表３】
表４．ＳＴＯフィーダーまたは合成挿入物のいずれかの上でのプールされた胚からのｃＥＳ細胞の樹立
【００２７】
【表４】
表３および表４のデータは、ニワトリの胚性フィーダー細胞およびマウス初代胎児線維芽細胞が、ｃＥＳ細胞の誘導も培養も支援しないことを示す。ＳＴＯ細胞のフィーダーは、誘導および増殖を支援するが、１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の限定された濃度、好ましくは、本発明の実施形態では、１０４細胞／ｃｍ２未満または約１０４細胞／ｃｍ２の濃度でＳＴＯ細胞が存在する場合にのみ、支援する。濃密なＳＴＯフィーダー層は、ｃＥＳ細胞の増殖を減退させるが、指定された濃度のＳＴＯ細胞は、ＥＳ細胞の増殖に必要な因子を提供する。これらの細胞が長期の培養期間に渡って維持され、かつ継続して胚性幹細胞表現型を発現し、かつｉｎ ｖｉｖｏで非胚性幹細胞表現型に分化する場合、これらの細胞は、「ＥＳ細胞子孫」と呼ばれる。
【００２８】
ｃＥＳ細胞培養培地は、８０％の馴化培地からなり、好ましくは、ｃＥＳ細胞の誘導および増殖に必要な因子を含むある種のＢＲＬ馴化培地を含む。５０％の濃度では、ｃＥＳ細胞の増殖は、８０％の馴化培地における場合ほど信頼性が高くない。馴化培地の比率が５０％未満まで減少した場合、分化細胞の増加によって立証されるように、ｃＥＳ細胞の増殖は影響を受け、また、３０％以下の濃度では、ｃＥＳ細胞は、１週間以内に分化する。ｃＥＳ細胞の誘導および維持に必要であることが判明したこの馴化培地は、ｍＥＳを維持しないが、それらの分化を引き起こす。
【００２９】
ウシ胎児血清は、本発明によるＥＳ細胞培地の好ましい成分であり、ｃＥＳ細胞を未分化状態に保つ因子を含む。しかし、血清は、分化を誘導する因子を含むことも公知である。市販の血清ロットは、ＥＳ細胞を未分化状態に保つ潜在能力について、使用者によってルーチン的に試験される。ｃＥＳ細胞培養物に対して使用される血清は、マウスＥＳ細胞培養物に使用される血清とは異なることが公知である。例えば、細胞毒およびヘモグロビンの濃度が低く、マウスＥＳ細胞を未分化状態で維持することが公知である、マウスＥＳ細胞の培養のために用いられる血清は、ニワトリＥＳ細胞の持続的な増殖を支援しない。
【００３０】
したがって、ニワトリＥＳ細胞に対して使用される血清は、マウスＥＳ細胞において試験して培地成分としての適性を判定するべきではなく、その代わりに、ニワトリＥＳ細胞において評価すべきである。そのために、ニワトリＥＳ細胞培養物を２つに分け、血清の新しいバッチをそれぞれ試験するために使用する。試験される新しいバッチは、実験的に試験された場合に、ニワトリＥＳ細胞の増殖を明らかに支援しなければならない。
【００３１】
ニワトリ染色体のスプレッドは、１０本の大染色体、６６本の小染色体、および１対の性染色体（雄におけるＺＺおよび雌におけるＺＷ）からなる複雑な核型が原因となって、マウスとは異なる特別な評価技術を必要とする。図３に示す本発明の長期ｃＥＳ細胞を、培養から１８９日後、そして２回凍結保存した後に解析した。図３を参照すると、これらは、１０本の大染色体、２本のＺ染色体、および６６本の小染色体を有する正常な核型を示した。
【００３２】
ニワトリＥＳ細胞を、培地中１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存する。いくつかの細胞株を解凍し、レシピエント胚に注入した後、体細胞キメラが得られる。このことは、これらのｃＥＳ細胞が、凍結保存プロセスの間、それらの発育能を維持していることを示唆する。
【００３３】
（実施例２）
レシピエント胚へのニワトリ胚性幹細胞の注入
新しく産卵された卵中の胚への到達を可能にするためには、殻を割らなければならず、これは、２１日のインキュベーション期間の最終時点のふ化率の低下を不可避的にもたらす。慣例としては、卵の側面を切断して小さな穴（直径１０ｍｍ未満）をあけ、この穴を通して胚を操作し、そしてテープ、カバーガラス、卵殻膜、または一片の殻で再び封じた。実施するのは比較的簡単であるが、この「窓開け」法は、７０％〜１００％の胎児死亡率を引き起こした。胚への到達の改善、および生存およびふ化能力の増大は、２種の異なる殻および（Ｃａｌｌｅｂａｕｔから適応させた）方法（参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Callebaut、Poult. Sci ６０巻：７２３〜７２５頁、１９８１年、ならびにRowlett,K.およびK.Simkiss,J.Exp.Biol.１４３巻：５２９〜５３６頁、１９８９年）を用いて、ふ化までのインキュベーションのために代理卵殻に胚を移入した場合に実現することができ、この技術を用いた場合、平均ふ化率は、約４１％（２３〜７０％の範囲）であり、４６９個のｃＥＳ細胞注入胚から１９１匹のヒヨコがふ化した。
【００３４】
レシピエント胚中へのドナーＥＳ細胞の注入後の胚のインキュベーションは、以下に説明するような系Ａおよび系Ｂを含む、２つの部分に分けることができる。
【００３５】
系Ａは、産卵後発育の最初の３日間を対象として含む。レシピエント胚を含む受精卵は、３〜５グラム重い卵と一致する。鋭端（ｐｏｉｎｔｅｄ ｐｏｌｅ）を切断して直径３２ｍｍの窓を開け、内容物を除去し、そして卵黄上のレシピエント胚を、周囲の卵白と共に代理殻中に注意深く移す。
【００３６】
細胞を、２ミクロンフィルターを取り付けられた口式吸引器に連結された、徐々に先細になる滅菌ガラスピペット中に吸い上げる。ピペットの穴は、直径が５０〜１２０ミクロンでよく、また、３０°の尖った斜面を有する。胚は、低倍率下で、かつ青色光を用いて可視化する。ニワトリＥＳ細胞をトリプシン処理して単細胞懸濁液にし、そして約２，０００〜２６，０００個の細胞、好ましくは約２０，０００個の細胞を胚中に注入する。これらの細胞は、胚の下または上のいずれかの空間中に、すなわち、胚下腔中に、または明域の先端表面と卵黄周囲の層（卵黄膜）の間に穏やかに押し出す。新鮮な受精卵から採取した余分な卵白を添加し、プラスチックフィルムのサランラップで殻を密閉する。
【００３７】
系Ｂは、３日目からふ化までの期間を対象として含む。インキュベーション３日目に、胚は、ステージ１７前後に到達した（Ｈ＆Ｈ）。卵白から胚下腔に水が輸送され、それによって卵黄が拡大し、非常に脆弱になる。系Ａの殻の内容物を、元の卵より３０〜３５グラム重い第２の代理殻（通常、シチメンチョウの卵）に、極めて慎重に移入する。細菌汚染を防止するためにペニシリンおよびストレプトマイシンを添加し、また、鈍端（ｂｌｕｎｔ ｐｏｌｅ）の３８〜４２ｍｍの窓をプラスチックフィルムで封じる。このより大きな殻により、人工的な気室が実現される。インキュベーションの１８日目〜１９日目に、これらの胚培養物を、綿密な観察のために卓上ふ卵器に移す。肺換気が確立されるとき、プラスチックフィルム中に周期的に穴が形成され、周囲空気が気室中に入ることが可能になる。ふ化の約６〜１２時間前に、フィルムを、ふ化の進行中にヒヨコが容易に脇へ押しのけることができる小型ペトリ皿に交換する。
【００３８】
インキュベーションの間、代理殻中の胚のために、通常の飼育温度（３７．５℃〜３８℃）および相対湿度（５０％〜６０％）を維持するが、普通は１時間毎であり、そして９０度までである周期的な卵の揺り動かしは、良好な生存を確実にするように変更しなければならない。系Ａでは、揺り動かしは、４〜５分間毎にに９０°までであり、系Ｂでは、４０〜４５分毎に４０°〜６０°までである。いずれの系においても、揺り動かしの速度は、１分間当たり１５°〜２０°で維持される。
【００３９】
ｃＥＳ細胞の注入の前に、レシピエント胚を（１）６６０ラドのガンマ線照射への曝露によって照射することによって（２）胚の中央から約１０００個の細胞を機械的に除去することにより改変することによって、または（１）および（２）を組み合わせることによって調製した場合には、キメラに対するｃＥＳ細胞の寄与が改善される。表５を参照すると、体細胞組織に対するｃＥＳ細胞の寄与は、レシピエント胚の中央から細胞を除去することまたは放射線照射への曝露のいずれかによってレシピエント胚に損傷を与えた場合に、実質的に増加した。放射線照射および細胞の機械的除去の組合せによってレシピエント胚に損傷を与えた場合、ｃＥＳ細胞がより長期間培養状態にあったにもかかわらず、ＥＳ細胞の寄与はさらに増加した。結果として生じるキメラヒヨコの一部は、純粋な横斑ロックニワトリヒヨコと区別することができない（図４）。表５中のデータが示すように、キメラ現象の割合ならびに胚１つ当たりのキメラ現象の程度は、レシピエント胚に損傷を与えた後に増加する。
【００４０】
表５：異なる方法によって損傷を与えられたレシピエント胚中へのｃＥＳ細胞注入後の体細胞キメラ現象の頻度
【００４１】
【表５】
ステージＸより実質的に若いレシピエント胚もまた、ＥＳ細胞をドナーとして用いてキメラを作製するために使用され得る。初期のレシピエント胚は、オキシトシンを雌鶏に注射して、早期産卵を誘導することによって採取し、また、受精卵は、ステージＶＩＩ〜ＩＸに採取する。
【００４２】
あるいは、輸卵管の膨大部領域からの胚の採取により、約４〜２５０個の細胞からなるステージＩ〜ＶＩの胚を入手する機会が提供され、また、潜在的なレシピエント胚としてのすべての胚ステージからキメラを開発することが可能になる。
【００４３】
（実施例３）
ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ）に由来する体細胞キメラ
ニワトリＥＳ細胞を白色レグホーンレシピエント胚中に注入する。第１期の実験では、２８回の実験において合計１４種の細胞株を、ステージＸのレシピエント胚に注入する（表２を参照されたい）。これらのｃＥＳ細胞は、４〜１０６日間培養して増殖させたものであり、一部の株は、凍結保存したものであった。ニワトリＥＳ細胞を軽くトリプシン処理して、ｃＥＳ細胞の小さな塊を得、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中に再懸濁する。２０００〜５０００個の細胞を含む３μｌ〜５μｌの細胞懸濁液を、レシピエント胚の胚盤下腔中に注入する。羽毛を発達させた胚をすべて分析し、また、羽毛の色によって判定したところ、２４パーセントの胚（８３／３４７）が、キメラである。羽毛キメラは、１４種の細胞株中１１種から得られる。キメラ現象の程度は、１％〜９５％まで様々であり、程度の平均は、２５．９％（ＳＤ＝２０．４）であった。
【００４４】
表２は、細胞株内および細胞株間で実施した実験間の体細胞キメラ現象の差異を示す。キメラに対するＥＳ細胞の寄与の例を、図４および図５に示す。図４では、２匹のヒヨコがキメラであり、２匹が横斑ロックである。これらのヒヨコの間に表現型の差異はなく、キメラに対するＥＳ細胞の寄与が、特に外胚葉由来の系統において多大であることが示唆されることは明らかである。図５では、左側のキメラは、ＥＳ細胞からの比較的低いレベルの寄与を有するのに対し、右のキメラは、中程度の寄与を有する。
【００４５】
（実施例４）
リポフェクションおよびエレクトロポレーションによるｃＥＳ細胞のトランスフェクション
表６に言及すると、トランスフェクトされるウェルのサイズと適合した適切な量のＤＮＡを、血清も抗生物質も含まない培地中に希釈する。適切な体積のＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を添加し、ＤＮＡと混合し、そして５〜１０分間、反応を生じさせる。この培地を除去し、そしてトランスフェクトしようとするウェルを、ＣａおよびＭｇを含まない塩溶液で洗浄する。血清および抗生物質を含み得る適切な体積の培地を、ＤＮＡ／Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物に添加する。これらのプレートを３７℃で２〜３時間インキュベートする。インキュベーションが完了したら、細胞を１〜２回洗浄することによってＳｕｐｅｒｆｅｃｔを除去し、そして新鮮な培養培地を添加する。
【００４６】
表６：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを用いたニワトリＥＳ細胞のトランスフェクションのための条件
【００４７】
【表６】
ペトリ皿用パルサーを用いて、プレートの直径３５ｍｍのウェル中に付着しているｃＥＳ細胞をエレクトロポレーションする。この培地を除去し、そしてＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない塩溶液でウェルを洗浄する。１ｍｌのエレクトロポレーション溶液をこのウェルに添加する。ＤＮＡを添加し、培地を穏やかに混合する。このペトリ皿用パルサーをウェルの底部まで下げ、電流を送達する。（電圧は好ましくは１００〜５００Ｖ／ｃｍであり、また、パルス長は１２〜１６ｍ秒でよい）。ペトリ皿用パルサーを取り出し、エレクトロポレーションしたウェルを室温で１０分間静置する。１０分後、２ｍｌの培地を添加し、インキュベーターに皿を戻す。
【００４８】
懸濁状態の細胞をトランスフェクトするために、培地を除去し、そしてＣａおよびＭｇを含まない塩溶液で細胞を洗浄する。ＥＤＴＡと共にトリプシンを添加して、単細胞懸濁液を得る。細胞を洗浄し、遠心分離し、そしてＰＢＳなどの補正用エレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁する。このＥＳ細胞懸濁液を無菌のキュベット中に入れ、ＤＮＡ（最低濃度１ｍｇ／ｍｌ）をこの細胞懸濁液に添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合する。これらの細胞をエレクトロポレーションし、室温で１０分間放置した。細胞をキュベットから取り出し、予め準備しておいたウェルまたはディッシュに分配する。細胞をインキュベーター中に入れ、また、エレクトロポレーション後２４〜４８時間目の一過性トランスフェクションについて評価する。抗生物質耐性細胞の選択もまた、ピューロマイシンなどの抗生物質を培養培地中に含めることによって開始することができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、トランスフェクトされた細胞を選択するために必要とされるピューロマイシンの濃度は、死滅滴定曲線として算出される。ニワトリ胚性幹細胞に対する死滅滴定曲線は、培養中の細胞を、０．０〜１．０μｇ／ｍｌの範囲のピューロマイシン濃度に１０日間（表７）、および０．０〜２００μｇ／ｍｌの範囲のネオマイシン濃度（表８）に曝露することによって作成する。２日毎に培地を交換し、そして新鮮なピューロマイシンまたはネオマイシンを添加する。濃度０．３μｇ／ｍｌのピューロマイシンに曝露した場合、ＥＳ細胞は、６日間の期間に渡って新鮮なピューロマイシンを含む培地を３回交換した後のすべてのウェルから消失していた（表７を参照されたい）。トランスフェクトされた培養物を選択するために、０．３〜１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度を使用する。４０μｇ／ｍｌを超えるネオマイシン濃度では、７日以内にすべてのｃＥＳ細胞が消失した（表８）。
【００５０】
１０日間の選択後、ｃＥＳ細胞コロニーは目に見え、さらなる増殖のために採取することができる。
【００５１】
表７：様々な濃度のピューロマイシンに様々な長さの期間（ピューロマイシン添加後の日数）曝露した後のｃＥＳ細胞の形態
【００５２】
【表７】
表８：様々な濃度のネオマイシンに様々な長さの期間（ネオマイシン添加後の日数）曝露した後のｃＥＳ細胞の形態
【００５３】
【表８】
（実施例５）
組織特異的な抗体発現
導入遺伝子の設計に応じて、外因性抗体をコードするＤＮＡは、選択された組織おいてのみ有意なレベルの抗体を発現するように設計される。この導入遺伝子構築物は、宿主生物のゲノムに由来する遺伝子エレメントを含み得、また、選択された組織における抗体の公知の発現または発現パターンに基づいて選択され得る。特定の組織における発現のためには、選択される組織において通常発現され、また通常高度に発現される、タンパク質をコードする遺伝子を選択し、そしてこの外因性抗体の発現を駆動するために、この遺伝子に由来する調節エレメントを選択する。この外因性抗体のＤＮＡコード配列と組み合わせる場合、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、オボグロブリン、オボインヒビター、シスタチン、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、またはアビジンのプロモーターなど他の調節エレメントを、選択マーカーをコードする遺伝子と組み合わせて、および／またはＩＲＥＳと組み合わせて、使用してよい。この導入遺伝子は、選択された組織において、好ましくは卵白において優先的な抗体発現をもたらす。特定の組織型における優先的発現は、選択されていない組織と比較して規模が３〜４桁大きな、選択された組織における発現と定義することができる。
【００５４】
トランスジェニックトリにおける組織特異的抗体発現の場合、組織特異的発現は、好ましくは、膨大部、峡部、卵殻腺、または卵管漏斗を含めて、輸卵管のある領域を対象としている。膨大部は、卵白の主なタンパク質を発現する管状腺細胞を含み、一方、峡部は、卵殻膜を発現する細胞を含む。可溶性タンパク質の発現は、好ましくは、輸卵管の膨大部の管状腺細胞に指向され、これは、好ましくはオボアルブミン、ただし、オボトランスフェリン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、オボインヒビター、シスタチン、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、およびアビジンを含む、卵白タンパク質を発現する遺伝子に由来する、プロモーターを通常含む調節配列を選択することによる。上皮細胞における発現を除く、管状腺細胞における選択的発現を以下に実証し、また、２種の細胞型間の選択性を区別するために、優先的発現と命名する。
【００５５】
以下の実施例では、外因性免疫グロブリン遺伝子座と共に、プロモーターを含む内因性卵白調節配列を含む導入遺伝子を構築して、輸卵管の管状腺細胞における組織特異的抗体発現を生じさせる。その場合、このようにして発現された抗体分子は、トランスジェニックニワトリの卵白中に蓄積される。この実施形態では、再配列された任意の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体は、輸卵管の膨大部領域の管状腺細胞を含む組織において特異的に発現され、そして卵白から単離することができる。モノクローナル抗体をコードする再配列された免疫グロブリン遺伝子は、他の組織における発現が検出可能なレベルより上で存在し得るものの、他の組織における発現は実質的になく、輸卵管において優先的に発現される。
【００５６】
この実施形態では、オボアルブミン調節配列の制御下のモノクローナル抗体カセットは、少なくとも３．４Ｋｂ、好ましくは少なくとも約７．５Ｋｂの５’調節配列から構成され、かつ１５Ｋｂ以上の３’調節配列も含んでよい。好ましくは、この構築物は、外因性抗体コード領域の５’末端および３’末端の双方に隣接するオボアルブミン遺伝子の領域を含むが、５’隣接領域の内因性プロモーター配列のセグメントが十分に大きな場合は、３’隣接領域の必要性を回避し得る。抗体の重鎖および軽鎖の双方のコード領域は、導入遺伝子中で提供され、かつ選択されたアイソタイプの可変領域、多様性領域、連結領域、および定常領域を含む。好ましい実施形態では、この抗体は、特徴的にはヒトであり、かつ少なくともヒト重鎖を含む、免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。また、このアイソタイプは好ましくはＩｇＧであり、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【００５７】
オボアルブミンに由来するモノクローナル抗体構築物のために好ましい導入遺伝子構築物を、図６Ａに提供する。この導入遺伝子構築物をＯｖ７．５と呼び、これは、ＭＡｂコードに５’末端配列で隣接しているプロモーター（この特定の実施形態ではオボアルブミンプロモーター）を含む約７．５Ｋｂの卵白調節配列、およびコード領域の３’側の１５Ｋｂのプロモーター配列を有する。コード領域は、軽鎖および重鎖の双方の可変領域、Ｊ−Ｃイントロン配列、κ軽鎖定常領域、ＩＲＥＳ配列、ならびにγ１アイソタイプ重鎖定常領域を含む。この構築物の３’末端は、ＧＦＰ遺伝子および選択マーカー、すなわち、この場合、本明細書において説明されるＣＸプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む。モノクローナル抗体コード領域の３’側および５’側の双方のオボアルブミンプロモーター配列の長さは例にすぎず、類似した構築物は、２５〜１００Ｋｂ以上の５’配列、ならびに様々な長さの３’配列を含み得る。当業者には、ＧＦＰマーカーが、生理学的標本における検出のためにだけ存在し、導入遺伝子の有用性から逸脱することなく除去できることが理解されよう。ピューロマイシン耐性マーカーは、この導入遺伝子で成功裡に形質転換された胚性幹細胞を選択する能力を与える任意のマーカーで置換することができる。いくつかのタイプの類似した選択マーカーが当技術分野において周知であり、また、本実施形態のピューロマイシン耐性遺伝子と本質的に交換可能に使用され得る。
【００５８】
上記のように、このモノクローナル抗体は、本発明の導入遺伝子構築物を用いて発現させることができるいくつかのタイプのモノクローナル抗体生成物のうちの一例にすぎない。さらに、タンパク質の１つのクラスとしてのモノクローナル抗体は、本明細書において説明される方法および技術に従って、組織特異的な様式で発現され得る多くのクラスのタンパク質生成物の一例にすぎない。
【００５９】
図６Ｂを参照すると、エストロゲン注射によってＯｖ７．５導入遺伝子の発現が誘導された２週齢のキメラの膨大部の切片は、形質転換された胚性幹細胞に由来する抗ダンシルモノクローナル抗体産生細胞の組織特異的発現によりＧＦＰが発現していることを示し（図６Ｂの左上のパネルにおいて緑色として示される）、これにより、Ｏｖ７．５導入遺伝子で形質転換された胚性幹細胞による寄与が裏付けられる。図６Ｂの左下のパネルを参照すると、モノクローナル抗体は、管状腺細胞において赤色に染色されるのに対し、同じくドナー胚性幹細胞に由来する上皮細胞は緑色に染色され、赤色には染色されない。染色におけるこの差異により、構築物の発現が組織特異的であり、かつ特定の組織型に対する導入遺伝子の内容によって選択されることが実証される。以下の実施例は輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実証するが、あらゆる細胞型および組織型にわたる発現の実証により、導入遺伝子構築物の構成要素、および例えば、プロモーターまたは他の調節エレメントの対応した選択によって組織特異的発現または細胞特異的発現のために各組織型または任意の組織型を選択し得ることが実証される。
【００６０】
図６Ｂの右上のパネルでは、細胞型のすべてがＤＡＰＩ染色によって示される。右下のパネルでは、染色を重ねて、ドナー由来の管状腺細胞のみがモノクローナル抗体を発現し、一方、レシピエント由来の細胞およびドナー由来の上皮細胞がモノクローナル抗体を発現しないことを実証する。図７Ｃおよび図７Ｄは、抗ダンシルモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖が、それぞれ、３または５キメラの輸卵管組織においてのみ選択的に発現され、また、これらのキメラの脳、腸、膵臓、または筋肉においてはＲＴ−ＰＣＲによって検出されるレベルを上回っては発現されないことを示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【００６１】
ヒトＩｇＧアイソタイプモノクローナル抗体が選択的に発現され得、そして蓄積されるタンパク質が卵白であることを実証するために、Ｏｖ７．５構築物を有するｃＥＳ細胞を注入することによって合計１８匹のキメラ雌を作製した。この群から６匹のキメラを用いて、初期のエストロゲン誘導による導入遺伝子発現を試験した。残りのキメラ雌１２匹は、卵を回収するために性的に成熟するまで飼育した。９匹のキメラ雌が、１７〜２２週齢で産卵を開始し、また、これらのキメラのうちの１匹は、散発的に産卵した。キメラ雌のうちの３匹は、３５週齢の時点で卵を産卵しておらず、剖検時に、それらの性腺が、雄性ＥＳ細胞に由来する組織の存在によって雄性化していることが明らかになった。
【００６２】
卵を産卵する９匹のキメラに由来する卵を回収し、硫酸アンモニウム沈殿法によって代表的な卵白サンプルを調製し、そしてＥＬＩＳＡによって解析した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でマイクロタイタープレートをコーティングし、重鎖に対する標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体および／または軽鎖に対する標識されたヤギ抗ヒトκ（κ鎖特異的）抗体のいずれかによって卵白サンプル中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの存在を明らかにした。精製ヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて標準曲線を作成した。ＥＬＩＳＡの感度は、０．８ｎｇ／ｍｌであった。非トランスジェニック白色レグホーン雌鶏由来の卵白サンプルを、ネガティブコントロールとして使用した。ヒトＩｇＧ ＭＡｂ蓄積は、非トランスジェニック白色レグホーン雌鶏に由来する卵（卵４個）においても、６匹のキメラ雌鶏に由来する卵（雌鶏ＯＶ１１−１７番由来の卵８個、雌鶏ＯＶ１１−５３番由来の卵８個、雌鶏ＯＶ１１−７３番由来の卵６個、雌鶏ＯＶ１１−８８番由来の卵６個、雌鶏ＯＶ１２−９７番由来の卵４個、および雌鶏ＯＶ１３−１３番由来の卵５個）においても、検出不可能であった。
【００６３】
ヒトＩｇＧ ＭＡｂ蓄積が、３種の異なるキメラ雌鶏に由来する卵において検出された（ＥＬＩＳＡによってＩｇＨを決定した場合、雌鶏ＯＶ１１−１３由来の卵の場合に約１．４〜６．３ｎｇ／ｍｌ、雌鶏ＯＶ１１−３７番由来の卵の場合に約２．０〜２．９ｎｇ／ｍｌ、および雌鶏ＯＶ１１−４３番由来の卵の場合に約２．９〜１０．８ｎｇ／ｍｌ）。代表的な卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度を、表９にまとめて示す。ＩｇＬに関してＥＬＩＳＡによって決定された卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度は、ＩｇＨに関してＥＬＩＳＡによって決定された濃度より、一貫して低かった。一般に、ＩｇＬによって決定された濃度は、ＩｇＨによって決定された濃度の６０％であった（表９の３列目および５列目を比較されたい）。この差異は、精製したヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて作製されたスパイクサンプルにおいても存在した。
【００６４】
表９ キメラに由来する卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの蓄積
【００６５】
【表９】
雌鶏ＯＶ１１−１３番、ＯＶ１１−３７番（これらは、卵中にヒトＩｇを蓄積した）および白色レグホーンに由来する血液サンプル中のヒトＩｇＧ ＭＡｂタンパク質の濃度は、アッセイ感度（０．８ｎｇ／ｍｌ）より低かった。これらのデータは、エストロゲンによって誘導したキメラヒヨコの腸、脳、膵臓、および筋肉におけるヒトＩｇ転写物の存在を評価するためにＲＴ−ＰＣＲを用いて観察された、キメラニワトリにおけるヒトＩｇの異所発現の不在と一致している（図７Ｃおよび７Ｄ）。したがって、Ｏｖ７．５構築物は、組織特異的であり、ホルモンによって誘導され、そして発生に関連して調節される遺伝子発現を、トランスジェニックキメラ雌鶏に送達すると思われる。さらに、タンパク質は、膨大部中の管状腺細胞から搬出され、卵白中に蓄積されるようである。
【００６６】
オボアルブミン由来の組織特異的タンパク質発現導入遺伝子を、以下のようにして構築した。
【００６７】
ニワトリゲノムＢＡＣライブラリー（Crooijmans,R.P.ら、Mamm.Genome １１巻：３６０〜３６３頁、２０００年）（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ ＢＡＣ Ｃｅｎｔｅｒ）をスクリーニングして、オボアルブミン遺伝子座中の４６Ｋｂの領域を単離する。ＭＡｂコード領域の５’側に位置するオボアルブミンプロモーターの異なる断片を有する、以下の２種の異なるベクターを構築した：（１）Ｏｖ７．５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４２Ｋｂの発現ベクターであり、オボアルブミン遺伝子に由来する９．２Ｋｂの５’配列（７．５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む（図１０Ａ）。この４２Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子に由来する９．２Ｋｂの５’配列（７．５Ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む。バイシストロン性のモノクローナル抗体カセットは、抗ダンシル抗体の軽鎖、ＩＲＥＳ、および重鎖をコードする。（２）Ｏｖ１５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４９Ｋｂの発現ベクターであり、オボアルブミン遺伝子に由来する１６．８Ｋｂの５’配列（１５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む（図示せず）。この４９Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子に由来する１６．８Ｋｂの５’配列（１５Ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む。このモノクローナル抗体カセットは、双方の構築物において同一である。
【００６８】
上記のように、双方のベクターにおいて発現され得る遺伝子の一例は、マウス−ヒトハイブリッドの抗ダンシルモノクローナル抗体（ＭＡｂｄｎｓ）である。ＣｘＥＧＦＰ／ＣｘＰｕｒｏカセットを３’側の最末端にクローニングして、ｃＥＳ細胞における安定なトランスフェクションをピューロマイシンを用いて選択すること、およびキメラ中のトランスフェクトされた細胞を容易に同定することを可能にする。どちらの構築物も、ｃＥＳ細胞中にトランスフェクションする前に直線状にし、また精製する。ｃＥＳ細胞のトランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）またはペトリ皿用パルサーによるエレクトロポレーションのいずれかを使用して、Ｏｖ７．５ＭＡｂｄｎｓおよびＯｖｌ５ＭＡｂを用いて実施する。ピューロマイシンによる選択後、耐性クローン６つを、分子解析のために採取する。ＭＡｂｄｎｓカセット中、ＧＦＰ遺伝子中、およびＰｕｒｏ遺伝子中に配置されたプライマーを用いるＰＣＲによって導入遺伝子の存在を確認する。
【００６９】
発現され得る抗体の第２の例は、完全なヒト抗ヒトＰＳＭＡモノクローナル抗体（ＭＡｂＦ１）である。ＭＡｂＦ１に対応するＶ遺伝子をＰＣＲによって獲得し、また、Ｏｖ１５ＭＡｂ−ｄｎｓ中のＶ遺伝子と入れ替えるために使用した。
【００７０】
この導入遺伝子は、雌性ＥＳ細胞中に安定に組み入れられ、また、これらの安定にトランスフェクトされた細胞を、ステージＸのレシピエント胚中に注入した。結果として生じるキメラを性的に成熟するまで飼育し、そして卵中のヒトモノクローナル抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。３０匹の雌鶏のうち４匹は、１ｍｇ／卵を上回る濃度で卵中に抗体を蓄積した（表９Ａ）。
【００７１】
表９Ａ Ｏｖ１５ＭＡｂＦ１キメラに由来する卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度
【００７２】
【表９Ａ】
（実施例６）
抗体生成物の特性決定
ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１を、従来のＣＨＯ細胞培養において産生されたＭＡｂＦ１といくつかのアッセイにおいて比較した。
【００７３】
１．抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
４．６×３００ｍｍのＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ Ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ ２７９５ ＨＰＬＣによって約１０μγのＩｇＧサンプルを解析した。０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２において、流速０．４ｍｌ／分で２０分間、クロマトグラフィーを実施した。Ａ２８０で分離をモニターした。分子量標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、概算の分子量を決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析により、双方とも９０％を超えるＩｇＧモノマーであることが示された（表１０）。
【００７４】
表１０ ＭＡｂＦ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
【００７５】
【表１０】
２．タンパク質のＮａｎｏ ＬＣ ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ解析
双方のＭＡｂ調製物を還元およびアルキル化し、一晩透析し、そして２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＰＨ８）中、３７℃で４時間、トリプシンで消化した。双方のトリプシン消化物のタンデム型質量分析を、陽イオンモードで、そしてタンデムスペクトル（ｔａｎｄｅｍ ｓｐｅｃｔｒａ）を得るために衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いるＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ質量分析計（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ社、コンコード、オンタリオ州、カナダ）工程に連結されたＮａｎｏ ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ社、サニーベール、カリフォルニア州）によって実施した。各サンプルをμｌ １ｍｌずつ注入し、７５ｍｍ直径μｍ Ｐｅｐｍａｐ Ｃ１８カラムを用いて流速２５０ｎｌ／分で分離した。移動相は溶媒Ａ（９５％水、５％アセトニトリル、０．５％ギ酸）および溶媒Ｂ（２０％水、８０％アセトニトリル、０．５％ギ酸）であった。機器は、２秒間フルスペクトルを記録し、次いで、最も強度の強いイオンを選択して次の５秒間ＣＩＤスペクトルを記録する７秒間の運転サイクルを用いる情報依存的取得（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）モードで操作した。スペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ロンドン、イギリス）を用いて解析した。説明した方法による双方のＭＡｂ調製物の解析では、配列の差異は示されなかった。
【００７６】
表１１．ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１およびＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１の質量分析による配列解析
【００７７】
【表１１−１】
【００７８】
【表１１−２】
３．ＬＣ−ＭＳ解析
４ＭグアニジンＨＣｌ中ＩｇＧサンプル（５０μγ）を、サンプルを６０℃で９０分間インキュベートすることによって２５ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。次いで、暗所、室温で１５分間、４５ｍＭヨード酢酸中でサンプルをアルキル化し、そして２２ｍＭ ＤＴＴで反応を停止させた。ＬＣ−ＭＳに先立って、サンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム１Ｌに対して透析し、そして各サンプル５０μｌを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ質量分析計を装備されたＷａｔｅｒｓ２７９５ ＨＰＬＣを使用するＰｏｒｏｓ Ｒ１／１０ ２．１×１００ｍｍカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に注入し、陽イオンモードで解析した。移動相は、（Ａ）０．１％ギ酸および０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ならびに（Ｂ）０．１％ギ酸および０．０１％ＴＦＡを含む１００％ＣＨ３ＣＮであった。溶出（０．２５ｍｌ／分）は、１００分に渡って作られる（Ａ）中（Ｂ）の１０〜６０％の直線勾配によって実施した。
【００７９】
Ｌ鎖の解析により、双方のＭＡｂ調製物が同一の質量（±３Ｄａ）を有することが示された（表１２）。
【００８０】
表１２ ＭＡｂ軽鎖のＬＣ−ＭＳ解析
【００８１】
【表１２】
４．示差走査熱量測定による熱安定性
ニワトリ発現系およびＣＨＯ発現系において作製されたＭＡｂＦ１の熱安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定し、そしてＦｃドメインにおいて脱グリコシル化されたそれらの対応する型と比較した。融解温度（Ｔｍ）の熱量測定は、オートサンプラーと組み合わされたＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ示差走査マイクロカロリメータープラットホーム（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ、ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国）を用いて実施した。サンプルセルの容積は０．１４４ｍＬである。これらの抗体のグリコシル化型および脱グリコシル化型に関する変性データは、濃度２．３μＭのこれらのサンプルを１℃／分の速度で３０℃から９５℃まで加熱することによって得た。これらのタンパク質サンプルは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在した。比較してモル熱容量を得るために、同じ緩衝液を参照セルにおいて使用した。観測された温度記録図をベースライン補正し、また、標準化したデータをＯｒｉｇｉｎ ｖ７．０を用いて解析した。
【００８２】
ＣＨＯおよびニワトリに由来する抗体の変性プロファイルは極めて異なるのに対し、Ｆｃを脱グリコシル化した抗体の変性プロファイルはほぼ同一である（図８）。これらのデータから、ニワトリの管状腺細胞において産生されたＭＡｂＦ１のグリコシル化の方が、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１に結合される糖残基より高い熱安定性を与えることが示唆される。
【００８３】
５．ＣＥ−ＬＩＦによるＭＡｂのオリゴ糖の特性決定
サンプルを１２．５ｍＵのＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）と共に４０℃で一晩インキュベーションすることによってＩｇＧサンプル（１００μγ）からオリゴ糖を遊離させた。使用した条件下で、ＣＨＯ細胞およびニワトリにおいて発現されたＨｕＭＡｂＦ１のＦｃ部分に由来するＮ結合型グリカンが遊離された。ＭＡｂタンパク質を除去するためにエタノール沈殿を実施した後、これらのグリカンを含む上清を減圧遠心分離によって乾燥させ、そして１５％酢酸中１９ｍＭ ＡＰＴＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）およびＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ社）中１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム中に再懸濁した。グリカン標識反応を４０℃で一晩継続させ、続いて、サンプルを水で２５倍に希釈した。ＡＰＴＳで標識したグリカンを、有効長５０ｃｍ、内径５０μｍのＮ−ＣＨＯコーティングキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使用する、逆極性を有するＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ ＣＥシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ社）による、レーザー誘起蛍光法を用いたキャピラリー電気泳動に適用した。サンプルは圧力（８秒）注入し、また、分離は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて、２５ｋＶ、２０℃で２０分間実施した。これらの分離物を、３ｍＷアルゴンイオンレーザーならびに４８８ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を用いるレーザー誘起蛍光検出システム（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて観察した。図９に示すように、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１のオリゴ糖プロファイルは、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１のプロファイルと大きく異なることが判明した。
【００８４】
６．ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳによるＭＡｂのオリゴ糖特性決定
精製した抗体（１００μｇ、各１．０ｍｇ／ｍｌ）を４μｌのＰＮＧａｓｅＦ、すなわちＮ結合型糖質を切断するエンドグリコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）で処理した。これらのサンプルを３７℃で一晩インキュベートし、次いで、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）に対して一晩透析した。タンパク質は、エタノール沈殿によって除去した。遊離された糖質を、本質的には供給業者のプロトコールに従って、ただし溶出体積を５μｌに減らして、Ｇｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（コロンビア、メリーランド州）製のマイクロカーボンカラムを用いて脱塩した。各グリカンサンプルの１μｌ分取物を、マトリックス溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸または２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と１：１（体積比）で混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上にスポットし、自然乾燥させる。ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦタンデム型解析を用いて、完全な複合糖質の解析を実施した。すべての質量スペクトルは、糖質のクラスの質量（組成）を提供する、ｏ−ＭＡＬＤＩソース２（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ社、コンコード、オンタリオ州、カナダ）を装備したＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ ｉ質量分析計を用いて記録した。双方のＭＡｂのグリカンをプロファイリングした後、各グリカン中で起こり得るグリコシド結合を調査した。高ＣＩＤによる質量スペクトルを、ＴＯＦ／ＴＯＦオプティクスを装備した４７００Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて記録した。高ＣＩＤのＭＳ／ＭＳ実験の場合、衝突エネルギーは１ｋＶに設定した。衝突セルの内部で、選択したオリゴ糖イオンを２×１０−６トルの圧力でアルゴンと衝突させた。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって解析した、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１中の１１種の主要なグリカンの糖質組成および起こり得るグリコシド結合を表１３に要約する。これらのオリゴ糖構造体は、高マンノース型、複合型、およびハイブリッド型のＮグリカンを含むことが判明した。
【００８５】
表１３ 質量分析法による、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１の糖質解析
【００８６】
【表１３】
７．ＨＰＡＥ−ＰＡＤを用いたＨＰＬＣによる単糖解析
表１４ ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１およびＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１の単糖解析
【００８７】
【表１４】
ＩｇＧサンプル（２００μｇ）を、１００℃で４時間、２Ｎ ＴＦＡ（中性糖を推定する場合）または６Ｎ ＨＣｌ（アミノ糖を推定する場合）のいずれかを用いる酸加水分解に供した。サンプルを周囲温度で減圧遠心分離によって乾燥させ、そしてＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ社）による解析の前に２００μｌの水中に溶解した。単糖は、プレカラムのＡｍｉｎｏ ＴｒａｐおよびＢｏｒａｔｅ Ｔｒａｐ（Ｄｉｏｎｅｘ社）付きのＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ４×２５０ｍｍカラムを用いて分離した。手順は、Ｄｉｏｎｅｘ社の技術注記５３に従った。単糖のピーク一致および相対存在量は、単糖標準物質（Ｄｉｏｎｅｘ社）を用いて決定した。表１４に要約したようなニワトリおよびＣＨＯにおいて産生されたＭＡｂＦ１の単糖解析により、糖質組成の差異が明らかになり、また、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１中にＮ−アセチルグルコサミン残基、マンノース残基、および極めて含有量の少ないガラクトース残基が存在することが示された。
【００８８】
８．化学的諸特性の要約
要約すれば、Ｎ結合型オリゴ糖プロファイルにおける最も目を引く差異は、ニワトリにおいて産生された抗体中に高マンノース型のＮ−グリカンが存在し、フルコースは存在せず、またガラクトース残基の含有量が極めて少ないことであった。これらの特性はいくつかの理由から重要である。第１に、抗原性であることが公知であるα１−３ Ｇａｌ結合の証拠がない。典型的には約２％未満のレベルまでガラクトース濃度が低下すると、ガラクトースを含む結合に起因する抗原性が実質的に減少する。第２に、同じく抗原性であることが公知であるＮ−グリコリルノイラミン酸残基の証拠がない。第３に、ニワトリ管状腺細胞において産生された抗体には、抗体のＡＤＣＣ活性を高めるフコシル残基が実質的にない。この文脈において、実質的にないとは、０．１％未満と定義される。第４に、ニワトリに産生された抗体は、典型的には４０％を上回る高いマンノース含有率を有し、これは、ＣＨＯ細胞において産生された抗体を標準物質として用いてＢａｌｂ／ｃマウスにおいてクリアランスを評価した場合のこの抗体のクリアランス速度を速める。これらの有利な化学的諸特性に加えて、これらの抗体は、ニワトリゲノム中にランダムに組み込まれるか、または組織特異的な様式で発現されない導入遺伝子を用いた場合には観察されない濃度で卵白中に存在する。好ましい濃度は卵１個当たり抗体１ｍｇより高く、卵１個当たり２ｍｇより高く、卵１個当たり３ｍｇより高く、また、卵１個当たり６ｍｇもの高さである。各卵は約２５ｍｌの卵白を含むため、好ましい濃度は４０μｇ／ｍｌより高く、８０μｇ／ｍｌより高く、１２０μｇ／ｍｌより高く、また、２４０μｇ／ｍｌもの高さである。
【００８９】
（実施例７）
卵白からの抗体の抽出および精製
最初に、室温で３０分間、卵白を低剪断速度で混合し、次いで、以前に説明されている改良法によってオボムチンを沈殿させた。１体積のホモジナイズした卵白懸濁液を３倍体積の逆浸透水に添加し、３０分間攪拌した。希釈した懸濁液を、０．５Ｍリン酸を用いてｐＨ６．０に調整し、次いで１２，１００ｇで２０分間遠心分離した。この方法によって主としてオボムチンを含有する卵白タンパク質の約３％を回収した。０．５Ｍリン酸水素二ナトリウムを用いて上清をｐＨ７．４に調整し、そして結晶塩を用いて塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭに調整した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、線流速１２０ｃｍ／時でヒトＩｇＧを精製した。吸着されたヒトＩｇＧを５カラム容量のローディング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、３ｍＭリン酸を用いて溶出させた。２３０ｍＭ ＮａＣｌを含有する６０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いて、溶出されたヒトＩｇＧ画分をｐＨ７．５に調整して、最終濃度を４０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌとした。次いで、サンプルを０．２ｍｍシリンジフィルター（Ｐａｌｌ社）に通してろ過した。図１０に示すように、精製した物質の大半は、９０％を超える純度を有する（ＥＬＩＳＡおよびＡ２８０によって決定、データは示さず）、完全に構築されたＨ２Ｌ２であった。
【００９０】
（実施例８）
結合親和性に関するアッセイ
ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ）上のＰＳＭＡを、結合を分析するための抗原として使用した。ウェル当たり２０万個の細胞を、指定した濃度の５０μｌずつの抗体と共に、デュプリケートで３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、希釈度１：２００のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をウェル当たり５０μｌ、４℃で３０分間、添加した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡに対するＭＡｂ結合のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を利用して、結合曲線から決定した。細胞は、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ニワトリ管状腺細胞において産生されたＭＡｂＦ１の抗原結合特性を、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１の抗原結合特性と比較した。どちらの抗体調製物も、ＬＮＣａＰ細胞上で発現されたＰＳＭＡに対してほぼ同一の結合曲線を描き、ＥＣ５０値は類似していた（図１１）。このデータにより、ニワトリに由来する抗体およびＣＨＯに由来する抗体はグリコシル化の様式は異なるが、同等に抗原を認識し、結合することが実証される。
【００９１】
（実施例９）
抗体内部移行のアッセイ
ＰＳＭＡへのＭＡｂＦ１の結合は、抗体の内部移行を招く。潜在的な１つの応用において、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的とし、そして破壊するために、ＭＡｂを細胞毒と結合させることができる。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡに対する抗体結合の内部移行は、ＭＡｂおよびＨｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に細胞をインキュベートすることによって判定した。ＨｕｍＺａｐは、リボソーム不活性化タンパク質であるサポリンに結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体である。ＭＡｂＦ１／Ｈｕｍ−Ｚａｐ複合体が細胞表面上のＰＳＭＡに結合し、そして内部移行された場合に細胞は死滅するが、抗体またはＨｕｍ−Ｚａｐは単独ではＬＮＣａＰ細胞に対して毒性ではない。３００ｎｇのＨｕｍ−Ｚａｐ、および３００ｎｇのＦ１ＭＡｂまたは対照ＭＡｂを含む培養培地１５０μｌ中で、３７℃で４８時間、トリプリケートでＬＮＣａＰ細胞（１０，０００／ウェル）をインキュベートした。細胞の増殖および生存は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定した。ウェル当たり１０，０００個のＬＮＣａＰ付着細胞と共に、細胞培養培地中の抗体希釈物を４℃で２時間インキュベートすることによって内部移行アッセイも実施した。抗体溶液を穏やかに除去し、ＨｕｍＺａｐ ２００ｎｇを含有する培地１５０μｌに交換した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、細胞生存率を決定した。抗体内部移行に対するＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いてグラフから決定した。図１２に示すように、双方の抗体調製物が同様の効率で内部移行された。一連の抗体濃度に渡って試験した場合、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１およびＣＨＯに由来するＭＡｂＦ１の双方の内部移行に対するＥＣ５０値は０．４９ｎＭであった。
【００９２】
（実施例１０）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＡｂのクリアランス
放射標識した抗体の静脈注射により、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、ＣＨＯに産生された抗体と並行して解析した。ＭＡｂタンパク質１０μｇを、Ｉｏｄｏｂｅａｄ法（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、１２５Ｉで少しヨウ素標識した（抗体当たり１個未満のＩ）。６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）に、実験前の１週間、飲料水に溶かした０．１ｍｇ／ｍｌヨウ化カリウムを与えた。タンパク質当たり４匹のマウスの尾静脈に約６００，０００ｃｐｍの標識ＭＡｂを静脈注射し、そして全身ガンマカウンター（Ｗｍ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ社、Ｌｕｄｌｕｍ社製計数器付きＮａＩ結晶検出器）を用いて、選択された時間に全身の放射能を測定した。半減期は、指数関数的回帰分析または残留放射能に基づいて算出した。図１３に示したように、ニワトリ管状腺細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、１０２．４±０．９時間の半減期（ｔ１／２）で浄化されたのに対し、ＣＨＯ細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、より緩徐に浄化され、半減期は２０７．５±１８．３時間であった。
【００９３】
（実施例１１）
ＡＤＣＣのアッセイ
改良された５１ＣｒＡＤＣＣアッセイにおいてＬＮＣａＰ−Ｃ４２Ｂ細胞を試験した。標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離法によってヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に（１×１０Ｅ６細胞／ｍＬで）再懸濁し、そして３７℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を回収し、培養培地中で１回洗浄し、そして２×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。２００万個のＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ標的細胞を、総体積１ｍｌ中の２００ｕＣｉ ５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートする。標的細胞を１回洗浄し、培地１ｍｌ中に再懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベートする。最終のインキュベーションの後、標的細胞を１回洗浄し、そして最終体積を１×１０５細胞／ｍＬにする。最終のＡＤＣＣアッセイのために、標識ＬＮＣａＰ細胞１００μｌをエフェクター細胞５０μｌおよび抗体５０μｌと共にインキュベートする。標的とエフェクターの最終比率は１：１００を選択した。すべての研究において、対照のヒトＩｇＧ１アイソタイプを試験し、ＣＨＯに由来する抗ＰＳＭＡ ＭＡｂＦ１抗体と比較した。含まれる他の対照は、ａ）標的細胞およびエフェクター細胞、ただし抗体はなし、ｂ）エフェクター細胞を伴わない標的細胞、ならびにｃ）３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下の標的細胞およびエフェクター細胞である。３７℃で４時間インキュベーションした後、上清を回収し、２４０〜４００ｋｅＶの読取領域を有するガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製のＣｏｂｒａ ＩＩオートガンマ）を用いて計数した。抗体濃度の関数としてカウント毎分をプロットし、そしてこのデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた非線形回帰、すなわちＳ字形用量反応（可変勾配）によって解析した。溶解率は以下の式、すなわち、溶解率（％）＝（サンプルＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）／（ＴｒｉｔｏｎＸ ＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）×１００によって決定した。本発明者らは、すべての研究においてＥＣ５０値および溶解率の双方がモニターされることが重要であることを発見した。例えば、２種の抗体を比較する場合に、ＥＣ５０値もしくは溶解率または双方が変化している可能性がある。
【００９４】
抗ＣＤ１６抗体によるＡＤＣＣの阻害を、以下の改変法を用いて実施した。５□ｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８または対照のアイソタイプ抗体の不在下または存在下で、１□ｇ／ｍｌまたは０．０１□ｇ／ｍｌの、ＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１抗体またはニワトリに産生されたＭＡｂＦ１抗体と共に、細胞をインキュベートした。
【００９５】
図１４は、ＣＨＯに由来するＭＡｂが用量依存的な細胞溶解を誘導することを示し、ＩＬ−２で刺激されたエフェクター細胞の場合、３８％の溶解で頭打ちになり、ＥＣ５０は０．１１μｇ／ｍｌである。一方、ニワトリの卵に由来するＭＡｂは、より強力かつより効果的であった。ニワトリの卵に由来するＭＡｂの最大溶解率は、抗体の２種の異なる調製物において６０％であった。この物質のＥＣ５０は０．０１８μｇ／ｍｌであったため、ＣＨＯに由来するＭＡｂを上回る高い力価も実証された。最後に、予想されるように、対照のアイソタイプ抗体は細胞溶解を誘導しなかった。刺激されていないエフェクター細胞（新鮮なＰＢＭＣ）のＡＤＣＣの方が、ＥＣ５０値の差はより大きいが、全体的な細胞死滅のレベルは劣る（図１５）。
【００９６】
ＣＤ１６（ＦＣｇＲＩＩＩ）は、ＡＤＣＣを媒介する重要なレセプターである。ＡＤＣＣ応答の特異性は、ＣＤ１６を対象とするモノクローナル抗体を用いて標的細胞とエフェクター細胞の相互作用を妨害することによって示した。本研究においては、２種の用量、すなわち飽和用量（１μｇ／ｍｌ）および最適以下の用量（０．０１μｇ／ｍｌ）のＭＡｂＦ１抗体を使用した。１μｇ／ｍｌのＭＡｂＦ１抗体は、抗ＣＤ１６抗体の不在下で、ＣＨＯに由来する抗体およびニワトリに由来する抗体の場合、それぞれ約１５％および３８％の溶解を誘導した。この溶解率は、抗ＣＤ１６抗体の存在下では約４％に減少したが、対照のアイソタイプ抗体は影響を及ぼさなかった（図１６）。
【００９７】
（実施例１２）
ＣＤ１６結合
ＣＨＯおよびニワトリに由来するＭＡｂＦ１を、Ｂｉａｃｏｒｅ社によって提供されるアミンカップリングキットを用いて、一級アミンを介してＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ（ＣＭ５）のカルボキシメチルデキストランマトリックス表面に固定化した。どちらの抗体も、約１０，０００ＲＵの密度まで塗った。固定化した抗体表面上にいくつかの濃度のタンパク質を流しかけることによってこれら２種の抗体とＣＤ１６−ＰｈｅおよびＣＤ１６−Ｖａｌとの結合を起こさせた。空白の表面および純粋な緩衝液の結合サイクルを考慮することによって非特異的結合の効果を説明した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を希釈用および泳動用緩衝液として使用した。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ−３０００機器を用いて２５℃で実施した。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって解析し、また、平衡解離定数を推定するために、単一結合部位モデルにデータを適合させた。
【００９８】
高速動態が、抗体へのＦｃＲ結合の特徴的な特色であるため、解離定数は、速度定数ではなく平衡結合実験に基づいて推定した。ＫＤの推定のために使用した曲線適合を図１７に示す。ニワトリに由来する抗体の解離定数ＫＤは、ＣＨＯ由来の対応する抗体と比べて、どちらのＦｃＲに対しても約１０分の１の小ささである。ニワトリに由来する抗体のより高い親和性は、Ｆｃ領域のグリコシル化の差異に起因している可能性があり、特に、ＣＨＯに由来する抗体中には存在するフコースがないことが寄与している可能性がある。
【００９９】
（実施例１３）
治療的有用性
本発明は、具体的に定められたグリコシル化パターンおよび他の化学的諸特性を有し、そして前述の遺伝的に改変されたニワトリを用いて作製された抗体を提供する。これらの特性により、標的組織中の抗原特異的な標的に結合させる目的で患者に投与した場合の治療特性が改善される。具体的には、上記のように、いくつかの臨床適応症に対して、これらの抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示し、また、この効果はいくつかの臨床適応症において重要な利点を与える。
【０１００】
いくつかのタイプの癌の治療に対する非結合型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験では、有望な結果が得られた。Dillman、1997年、Cancer Biother. & Radiopharm.１２巻：２２３〜２２５頁；Deoら、１９９７年、ImmunologyToday １８巻：１２７頁。キメラの非結合型ＩｇＧ１は、軽度または濾胞性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（Dillman、１９９７年、前記）用に認可されており、さらに、別の非結合型ｍＡｂ、すなわち充実性乳房腫瘍を標的とするヒト化ＩｇＧ１もまた、臨床試験の第ＩＩＩ相において期待できる結果を示した。Deoら、１９９７年、前記。これら２種のＭＡｂの抗原は、それぞれの標的組織において高発現される。このような応用の場合、特に、抗体がＡＤＣＣによって強力な腫瘍破壊を媒介する腫瘍細胞において、本発明の抗体は、患者に投与した際の治療的利点を与える。
【０１０１】
治療的用途のために、本発明の抗体を、（例えば、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体を作製するために）別の抗体、（例えば、免疫毒素などの免疫複合体を作製するために）細胞毒、細胞性リガンド、または抗原など１種または複数種の分子単位に、（例えば化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、もしくは別の方法によって）機能的に連結することもできる。本発明の抗体は、他の治療的部分、例えば放射性同位体、低分子抗癌薬、抗炎症剤、細胞毒、または免疫抑制剤に連結することができる。したがって、本発明は、ニワトリ発現系によって可能にされる化学的諸特性を有し、そして治療的用途のために、本質的にすべて公知の抗体結合、連結、および関連した技術と組み合わされた、抗体組成物を包含する。
【０１０２】
したがって、本発明の抗体は、特にＡＤＣＣ機序が標的組織において提示される場合、治療への感受性が高い標的組織において抗原を発現する細胞を伴う様々な疾患を治療および／または予防するために使用することができる。治療（例えば寛解）または予防することができる例示的な疾患には、それだけには限らないが、充実性腫瘍、リンパ腫、びまん性腫瘍、およびすべてのタイプの癌組織が含まれる。
【０１０３】
本発明の治療的実施形態では、ＡＤＣＣの特性を提示する様式による、治療されると思われる状態の診断に具体的に従って、本発明の抗体を患者に投与する。このような臨床現場では、本発明の抗体を投与し、そして治療後に治療の細胞傷害効果を決定して、標的組織におけるＡＤＣＣ効果を決定する。本発明の治療用組成物に加えて、化学療法剤、放射線、またはサイトカインなど、Ｆｃ受容体の発現もしくは活性を調節、例えば増大もしくは阻害する作用物質で、患者をさらに治療してよい。治療期間中に投与するための典型的なサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。典型的な治療用物質としては、とりわけ、ドキソルビシン、シスプラスチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなどの抗悪性腫瘍剤が挙げられる。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、ニワトリにおいて発現された本発明の抗体の１つまたは組合せを含む薬剤組成物を提供する。本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。製薬上許容される担体としては、無菌の水性溶液または水性分散液が挙げられ、薬剤として有効な物質に対するこのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において公知である。無菌の注射液剤は、適切な溶媒中の必要とされる量の活性化合物を１つの成分または成分の組合せと混合し、続いて滅菌および／または精密ろ過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本となる分散媒および他の任意の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。
【０１０５】
投与計画は、最適な所望のＡＤＣＣ効果を提供するように調整する。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に用量を減少もしくは増加させてもよい。単位剤形の非経口組成物を調製することは、投与の容易さおよび投薬量の均一性に対して特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療しようとする対象者に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬剤用担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特徴および達成すべき個々の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の治療のためにこのような活性化合物を配合する技術分野につきものの制約によって必然的に決められ、そして、直接的に依存している。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を実現するのに効果的であり、患者に対する毒性はない有効成分の量を得るために、変更してよい。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排出速度、治療の持続期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野において周知である同様の因子を含めて、様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【０１０７】
本発明の抗体の投与効果は、腫瘍などの標的組織において客観的に観察可能であるため、本発明の治療的方法は、具体的にはＡＤＣＣを使用する治療法を含む治療法を必要とする患者を診断するステップと、効果が望まれる標的組織を同定するステップと、本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与するステップと、患者の標的組織におけるＡＤＣＣの有効性を判定することなどによって患者における治療効果を測定するステップとを含む。治療効果の判定は、細胞死、標的組織の収縮、腫瘍サイズの縮小など標的組織の特性の経時的な変化を分析することによっておよび医薬分野において公知である他の任意の診断技術によって実現することができる。
【０１０８】
本発明の抗体はまた、当業者が利用可能ないくつかの公知のＡＤＣＣモデルのうちのいずれかにおいてＡＤＣＣ活性を試験することもできる。治療的用途または診断的用途に対する本発明の抗体の有用性を判定するために、ＡＤＣＣの測定を独立に実施してもよく、または他の哺乳動物、非哺乳動物、植物、もしくは細菌細胞の発現系と比較してもよい。したがって、本発明の方法は、前述の系において産生された別の抗体と直接または間接的に比較して本発明の抗体を使用することによってＡＤＣＣをもたらすための有用性の差異を判定するステップを含む。具体的には、この方法論は、前述のニワトリ発現系において産生された抗体のＡＤＣＣ効果を比較して、増強されたＡＤＣＣを同定し、ニワトリ発現系のための理想的な抗体候補を同定するステップを含む。
【０１０９】
上記のように、治療的有用性を向上させるために、本発明の抗体は、１種または複数種の他の治療物質、例えば、細胞障害性物質、放射毒性物質、または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、（免疫複合体として）作用物質に連結されてもよく、または作用物質と別々に投与されてもよい。後者の場合（個別投与）、抗体は、作用物質の前、後、もしくは同時に投与してよく、または他の公知の治療法、例えば抗癌療法、例えば放射線療法と同時に投与してもよい。このような治療用物質としては、とりわけ、ドキソルビシン、シスプラスチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなどの抗悪性腫瘍剤が挙げられる。本発明の抗体と化学療法剤との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞障害効果をもたらす、異なる機序を介して機能する２種の抗癌物質を提供する。このような同時投与により、薬物に対する耐性の発達、または抗体との反応性を低下させると考えられる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題が解決され得る。
【０１１０】
当業者には明らかであろう、開示した本発明の様々な修正、改良、および応用があると考えられ、かつ本出願は、法律によって許容される範囲まで、そのような実施形態を包含する。いくつかの好ましい実施形態において本発明を説明したが、本発明の完全な範囲はそのようには限定されず、以下の特許請求の範囲に従う。すべての参考文献、特許、または他の刊行物は、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ニワトリＥＳ細胞の特徴的な形態を示す。細胞は単層で増殖し、細胞質はほとんどなく、核小体が目立っている。
【図２】図２は、ニワトリＥＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性、具体的には、抗体ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１との反応、ならびにアルカリ性ホスファターゼの発現を示す。
【図３】図３は、１８９日間培養されたニワトリＥＳ細胞の核型である。これらの細胞は２倍体であり、３８対の常染色体および１対のＺ染色体を有する。
【図４】図４は、横斑ロックヒヨコ２匹、および横斑ロックＥＳ細胞を白色レグホーンのレシピエント胚中に注入することによって形成されたキメラ２匹である。これらのキメラおよび横斑ロックは区別不能であることから、メラノサイト系列へのＥＳ細胞の寄与が多大であることが示される。
【図５】図５は、横斑ロックＥＳ細胞を白色レグホーンレシピエント中に注入することによって作製されたキメラである。左のパネル中のキメラのペアは、メラノサイト系列に対して少しの寄与を示しているのに対し、左のパネル中のペアは、より大きな寄与を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ニワトリの輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実現する導入遺伝子構築物、および組織特異的発現を裏付ける生理学的証拠である。図６Ａは、指定されたＯｖ７．５ＭＡｂｄｎｓを含む導入遺伝子の図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ニワトリの輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実現する導入遺伝子構築物、および組織特異的発現を裏付ける生理学的証拠である。図６Ｂは、他の細胞型を除いて、選択的に管状腺細胞においてモノクローナル抗体の発現を示す、組織特異的発現導入遺伝子を含むキメラニワトリの膨大部の切片である。
【図７Ａ】図７Ａは、キメラの脳、腸、膵臓、および筋肉組織を除いて、輸卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の双方の発現をそれぞれ示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、キメラの脳、腸、膵臓、および筋肉組織を除いて、輸卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の双方の発現をそれぞれ示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【図８】図８は、ニワトリおよびＣＨＯ細胞に由来するＭＡｂＦ１の熱安定性を示す。ＣＨＯ細胞に由来するＭＡｂＦ１（左上）およびニワトリ管状腺細胞に由来するＭＡｂＦ１（右上）のＤＳＣデータである。どちらの場合も、３つのピークを有する二状態遷移モデルに当てはまるようにデータをデコンボリュートする（赤色で示す）。ＣＨＯ細胞において発現された抗体に関しては６２．７℃、６９．４℃、および８３．４℃のＴｍ値が得られ、ニワトリに由来する抗体に関しては６３．８℃、６８．５℃、および８３．１℃のＴｍ値が得られた。それぞれのＦｃ脱グリコシル化抗体（それぞれ左下および右下）のＤＳＣデータも同様に二状態遷移モデルに当てはめたが、いずれの場合もピークは２つであり、ＣＨＯにおいて発現された抗体に関しては６１．２℃および８４．０℃のＴｍ値が得られ、ニワトリに由来する抗体に関しては６２．６℃および８４．０℃のＴｍ値が得られた。
【図９】図９は、ニワトリ管状腺細胞およびＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１のオリゴ糖プロファイルを示す。ＣＨＯに産生されたＭＡｂの公知のグリカン構造が示されている。マンノースは黒の円として示され、ガラクトースは白の円として示され、Ｎ−アセチルグルコサミンは黒の四角形と示され、フコースは黒の三角形として示される。
【図１０】図１０は、卵白からのＭＡｂＦ１の精製を示す。１：出発原料、２：プロテインＡ添加、３：プロテインＡ通過、４：プロテインＡ溶出。クーマシー染色およびウェスタンブロットの双方とも、非還元条件下である。ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を、ウェスタンブロットにおける検出のために使用した。
【図１１】図１１は、ニワトリまたはＣＨＯ細胞に産生されたＭＡｂＦ１の、ＬＮＣａＰ細胞上で発現されるＰＳＭＡに対する結合を示す。３２４−Ｅｇｇおよび７４１−Ｅｇｇは、卵から単離されたＭＡｂＦ１の２種の異なる調製物である。Ｆ１−ＣＨＯは、ＣＨＯ細胞によって産生されたＭＡｂＦ１である。抗ＣＴＬＡ４は、ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１の対照ＭＡｂである。
【図１２】図１２は、ニワトリ管状腺細胞およびＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１の内部移行アッセイである。５７０−Ｅｇｇおよび７４１−Ｅｇｇは、卵から単離されたＭＡｂＦ１の２種の調製物であった。各３００ｎｇ／ウェルのＭＡｂを、Ｈｕｍ−Ｚａｐ（抗ヒトＩｇＧ、サポリン結合体）または細胞培養培地のいずれかと共にＬＮＣａＰ細胞に添加した。ＭＡｂおよびＨｕｍＺａｐの添加後４８時間目に細胞の生存率を決定した。Ｙ軸は、相対発光量（ＲＬＵ）である。
【図１３】図１３は、ニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ）およびＣＨＯ細胞（Ｆ１−ＣＨＯ）において産生されたＭＡｂＦ１のｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹に、放射標識した各抗体調製物を注射した。全身カウンターを用いて、残留放射能を３５０時間に渡って測定した。データは、残存している注射用量のパーセンテージとして表される。
【図１４】図１４は、ヒトＩＬ−２の存在下でニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ調製物ＩおよびＩＩ）ならびにＣＨＯ細胞（Ｆ１）において産生されたＭＡｂＦ１のＡＤＣＣアッセイを示す。ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した。
【図１５】図１５は、ヒトＩＬ−２の不在下でニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ調製物ＩおよびＩＩ）ならびにＣＨＯ細胞（Ｆ１）において産生されたＭＡｂＦ１のＡＤＣＣアッセイを示す。ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した。
【図１６】図１６は、抗ＣＤ１６抗体を用いたＡＤＣＣの妨害を示す。
【図１７】図１７は、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１（青色）およびＣＨＯに由来するＭＡｂＦ１（赤色）の、ＣＤ１６−Ｐｈｅ（左のパネル）およびＣＤ１６−Ｖａｌ（右のパネル）との平衡結合を示す。解離定数（ＫＤ）の推定値を対応する曲線の近くに示す。
【技術分野】
【０００１】
本明細書において記載される発明は、ＵＳＤＡ ＳＢＩＲ ２００３−３３６１０およびＮＩＨ ２ Ｒ４４ ＧＭ６４２６１−０１および２Ｒ４４ ＨＤ ０３９５８３−０２の下で政府により支援されている。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝的に改変された動物は、抗体など有益な薬学的製品の持続可能な製造を大きく前進させる可能性を与える。しかし、遺伝的に改変された動物の作製は、著しい技術的障害を伴い、これらの障害は少数の種でしか克服されていない。特異的発現のために、タンパク質をコードする遺伝的改変をある種のＤＮＡ中に組み入れられるようにするには、各遺伝的改変のために開発されなければならないいくつかの独特な技術が必要となる。ある動物の遺伝的特徴および肉体的特徴を改変するための１つの手法は、その動物のレシピエント胚中に細胞を導入することである。これらの細胞は、レシピエント胚から生まれる動物の組織に寄与し、結果として生じる遺伝的に改変された動物の子孫のゲノに寄与する能力を有する。
【０００３】
細胞株の研究および開発、細胞ゲノムの操作、およびそのような操作された細胞が培養状態で維持されることを可能にする細胞培養技術に、かなりの時間および資源が費やされてきた。多くの試みがなされてきたが、操作された細胞の多能性を培養状態で維持する能力は、ごく少数の種、特にマウスでしか実現されていない。
【０００４】
持続可能な培養物が容易に入手可能であり、そして多能性を維持しつつ遺伝子工学を受け入れることが可能である場合には、新しい技術の幅広い応用が利用可能になると思われる。培養細胞はキメラ動物の組織に寄与することができるため、胚状態のレシピエント動物中にこれらの細胞を組み入れることによって胚性幹細胞の由来元である動物の肉体的特徴をレシピエント胚に導入することができる。これは、２つの主要な利点を与える。第１に、胚性幹細胞の由来元である動物の表現型をレシピエント胚に選択的に導入することができる。第２に、上述したように、細胞培養物が特に安定である場合、これらの細胞のゲノムを遺伝的に改変して、細胞が導入されるレシピエント胚中に遺伝的改変を導入することができる。
【０００５】
いくつかの場合において、抗体をコードする導入遺伝子を用いてこれらの細胞を操作することができる。導入遺伝子は、抗体を作製するための青写真の役割を果たすＤＮＡを含み、そしてレシピエント胚中への細胞の挿入によって作り出される動物の組織における抗体の発現を可能にするのに十分なコードエレメントおよび調節エレメントを含む、遺伝子構築物である。しかし、動物の組織から有益な抗体を回収するには、通常、発現されたタンパク質の回収を容易にし、かつ望ましい化学的諸特性を伝達するいくつかの特定の組織型に発現が限定されている必要がある。例えば、雌ウシにおいては、乳汁におけるタンパク質発現により、単に雌ウシの乳汁を回収し、そして外因性タンパク質を分離することによる、タンパク質の容易な回収が可能になる。ニワトリでは、卵白における抗体の活発な産生もまた、抗体の発現および回収のための魅力的な媒介物になる。さらに、組織特異的な発現がニワトリの輸卵管に特異的である場合、この発現により、ヒト患者の治療において使用された場合に抗体の治療的有用性を高めるいくつかの特定の望ましい化学的諸特性を有する抗体が生じる。したがって、研究および商業的開発の特に魅力的な１つの分野は、卵中で抗体を選択的に発現して、望ましい化学的諸特性を有するタンパク質の単離および回収を容易にする、遺伝子操作されたニワトリである。組織特異性がない場合、動物の全組織において発現される抗体を生じるだけであるため、ある動物の特異的に選択された細胞において外因性抗体を選択的に作製する能力は、特に有益である。このような状況下では、有意義な量の抗体が動物から分離され得る見込みは少なく、外因性抗体の遍在的な発現は通常、動物の全般的健康および幸福に大きな損害を与え、また、ニワトリ輸卵管において提示される望ましい化学的諸特性は存在していない。
【０００６】
細胞培養が十分に安定で、細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれるのが可能となる場合、標的細胞および導入遺伝子として使用される特定の構築物に応じたいくつかの異なる技術によって新しいキメラ生物またはトランスジェニック生物に、抗体の組織特異的発現をコードする導入遺伝子を受け渡すことができる。全ゲノムは細胞ハイブリダイゼーションによって、インタクトな染色体は微小核によって、染色体部分のセグメント（ｓｕｂｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ）は染色体を介した遺伝子導入によって、およびキロベース範囲のＤＮＡ断片はＤＮＡを介した遺伝子導入によって、導入することができる（非特許文献１：Klobutcher, L.A.およびF.H.Ruddle、Annu. Rev. Biochem.、５０巻：５３３〜５５４頁、１９８１年）。インタクトな染色体は、微小核を介した染色体導入（ＭＭＣＴ）によって導入することができる（非特許文献２：Fournier,R. E.およびF. H. Ruddle、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７４巻：３１９〜３２３頁、１９７７年）。導入遺伝子を具体的に設計するには、抗体をコードするＤＮＡ配列の内容、標的細胞株、発現が標的される場となる特異的組織、発現が起こる場となる宿主生物、および発現される抗体を検討しなければならない。組織特異的発現のために設計される導入遺伝子は、細胞のゲノム中への成功な組み込みを可能にし、そして宿主生物の選択された組織における成功な発現を確実にするために、いくつかの条件を満たさなければならない。
【０００７】
上記のように、トランスジェニック動物を作製するための遺伝的改変の導入は、ごく少数の種においてしか実証されていない。マウスの場合、キメラ子孫およびトランスジェニック子孫を作製するための、相同組換えとそれに続く胚性幹（ＥＳ）細胞への染色体導入の別々の使用が周知である。部位特異的な相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの強力な技術が開発された（非特許文献３および４：Thomas, K. R.およびM.R. Capecchi、Cell ５１巻：５０３〜５１２頁、１９８７年；Waldman, A.S.、Crit.Rev. Oncol. Hematol.１２巻：４９〜６４頁、１９９２年による総説を参照されたい）。クローン化ＤＮＡの挿入（非特許文献５：Jakobovits,A.、Curr. Biol.４巻：７６１〜７６３頁、１９９４年）、ならびにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系技術による染色体フラグメントの操作および選択（非特許文献６および７ならびに特許文献１〜４：Smith,A. J.ら、Nat. Genet.９巻：３７６〜３８５頁、１９９５年；Ramirez-Solis, R.ら、Nature ３７８巻：７２０〜７２４頁、１９９５年；米国特許第４，９５９，３１７号；第６，１３０，３６４号；第６，０９１，００１号；第５，９８５，６１４号を参照されたい）は、安定な遺伝子キメラを作製するための操作およびマウスＥＳ細胞への遺伝子導入のために利用可能である。哺乳動物系において有用であることが判明したこのような多くの技術は、必要な長期の細胞培養物が入手可能である場合、ならびに、外因性タンパク質の単離および回収を容易にする、特定の組織における組織特異的発現をもたらす導入遺伝子が設計され得る場合には、非哺乳動物系に適用するために有効であると考えられる。
【０００８】
組織特異的発現を可能にする導入遺伝子は複雑であり、また、レシピエント細胞株中に導入遺伝子を組み入れるのに必要である遺伝子操作は、培養条件が最適化されなければ細胞の多能性を脅かす可能性がある大規模な操作を必要とする。したがって、遺伝子導入において使用するのに適した細胞株は、培養状態で安定でなければならず、かつ組織特異的発現に必要なエレメントをすべて含むのに十分な大きさおよび複雑さを有する遺伝子構築物で細胞がトランスフェクトされた場合に、多能性を維持しなければならない。結果として生じる動物において、導入遺伝子は、導入遺伝子が発現されるように設計されている特定の個々の組織型において効果的に発現されなければならず、そして他の組織で発現されて、その結果、動物の生存能力または結果として生じるタンパク質の有利な化学的性質が損なわれるべきではない。
【０００９】
外因性抗体の作製に対して、トリの生物学的系は、飼育場での効率的な飼育、迅速な成長、および経済的な生産を含めて、多くの利点を与える。さらに、トリ卵は、抗体の大量合成ならびに生成物の単離および回収の平易性の双方に関して理想的な生物学的設計を実現する。さらに、本明細書において後述するように、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系と比較したニワトリをベースとする発現系の利点は、大量の抗体生成物に対して得ることができる。
【特許文献１】米国特許第４，９５９，３１７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１３０，３６４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９１，００１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９８５，６１４号明細書
【非特許文献１】Klobutcher, L.A.およびF.H.Ruddle、Annu. Rev. Biochem.、５０巻：５３３〜５５４頁、１９８１年
【非特許文献２】Fournier, R. E.およびF. H. Ruddle、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７４巻：３１９〜３２３頁、１９７７年
【非特許文献３】Thomas, K. R.およびM.R. Capecchi、Cell ５１巻：５０３〜５１２頁、１９８７年
【非特許文献４】Waldman, A.S.、Crit. Rev. Oncol. Hematol.１２巻：４９〜６４頁、１９９２年
【非特許文献５】Jakobovits, A.、Curr. Biol.４巻：７６１〜７６３頁、１９９４年
【非特許文献６】Smith, A. J.ら、Nat. Genet.９巻：３７６〜３８５頁、１９９５年
【非特許文献７】Ramirez-Solis, R.ら、Nature ３７８巻：７２０〜７２４頁、１９９５年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、ニワトリにおけるタンパク質発現、ならびにキメラニワトリおよびトランスジェニックニワトリを作製するために使用される、遺伝子工学、遺伝子導入、および細胞の長期培養などの実現技術を含む。本発明はまた、ニワトリにおいて産生される抗体およびそれらの独特な化学的性質にも関する。具体的には、これらの抗体は、ある種の用途におけるそれらの治療的有用性を高める有利な化学的諸特性を有する。ニワトリにおいて産生される抗体は、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系において産生される抗体と比べて独特なパターンの化学的改変を有し、その結果、腫瘍などの標的組織に毒素を結合させる目的で患者に投与された場合に、標的組織は、高い治療有効性で治療される。一実施形態では、胚性幹細胞の長期培養物は、外因性抗体の組織特異的発現をもたらす導入遺伝子の挿入物を含む、キメラトリに遺伝的改変を導入するために特別に設計された遺伝子構築物を用いて作り出される。本発明のトランスジェニックトリは、導入遺伝子に由来する抗体を輸卵管中で発現し、また、抗体は、卵中に大量に蓄積する。好ましい実施形態では、天然のヒト抗体がニワトリの輸卵管において発現され、そして卵から回収することができるように、外因性抗体タンパク質は、ヒトＤＮＡ配列によってコードされる。
【００１１】
本発明は、抗体の組織特異的発現を示すトリの集団、外因性抗体の発現を可能にする導入遺伝子構築物、ニワトリにおいて産生され、そして特別に定められた化学的諸特性を有する抗体の単離組成物、ならびにこれらのトリの作製、抗体の作製、およびヒトにおけるそれらの治療的使用のための関連した方法を含む。本発明は、長期細胞培養物、および持続的な細胞培養物に由来するキメラトリまたはトランスジェニックトリを作製するための特別な技術であって、ＥＳ細胞のゲノムが外因性タンパク質を発現する安定に組み込まれた導入遺伝子を有し、その結果、培養細胞の子孫が、安定に組み込まれた導入遺伝子を含む技術を使用する。後述する手順によって宿主トリの胚に導入された場合、それらの改変されたドナー細胞は、結果として生じる動物の選択された特定の体細胞組織中に導入遺伝子を発現するトリを生じる。これらのトリは、ドナー細胞に由来する表現型を提示し、また、輸卵管中で抗体を発現して、卵白における抗体の濃縮および回収を容易にする。
【００１２】
本発明はまた、ニワトリ発現系において発現され、そして脊椎動物、植物、または細菌細胞の系と比べて望ましいいくつかの化学的諸特性を有する抗体の組成物も含む。具体的には、これらの抗体は、濃度の低下したフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、および濃度の上昇したマンノースを有する。これらの諸特性のうちのいくつかまたはすべてを有する抗体は、ヒトに投与された場合に、高い治療的有用性を示す。具体的には、これらの抗体組成物は、増強された抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示す。したがって、本発明の方法は、抗体の組成物をニワトリにおいて発現させることにより、ＡＤＣＣ作用に基づいて、それらの治療的有用性を高めることを含む。実際の応用では、これらの方法は、本明細書において説明される抗体組成物を投与するステップと、患者における細胞傷害活性を検出するステップとを含む。本発明はまた、所定の量の外因性抗体が卵白中に濃縮されるように、本明細書において定義される有利な化学的性質を有する外因性抗体を輸卵管組織中で発現するニワトリも含む。好ましい一実施形態では、外因性タンパク質は、ドナー細胞株および子孫のゲノム中に組み入れられた導入遺伝子構築物によってコードされたヒト配列モノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、輸卵管中での発現のために特異的に構築されており、そして組織特異的発現を容易にするための適切なプロモーターおよび調節配列を含む導入遺伝子の内部に含まれている。外因性タンパク質を発現するトランスジェニックトリまたはキメラトリの実施形態では、本発明は、その動物およびタンパク質、例えば本明細書において説明される外因性抗体を含む卵白アルブミンに特異的な組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明によれば、ニワトリＥＳ細胞系は大型の核を有し、かつ顕著な核小体を含むステージＸ胚に由来する（図１）。これらの細胞は、長期の培養後に形態学的にニワトリ胚性幹（ｃＥＳ）細胞であることが確認され、また、レシピエント胚中に注入された場合にキメラを生じることが確認されている。さらに、ＥＳ細胞は、広範囲の羽毛キメラ現象によって判定されるように、体細胞組織に対する高度の寄与を可能にする。さらにまた、これらの胚性幹細胞は、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを有する導入遺伝子でトランスフェクトされることが実証されている。ＥＳ細胞は、導入遺伝子を安定に組み込み、そして導入遺伝子を発現して、形質転換細胞の選択を可能にする。これらの形質転換細胞はキメラを形成することができ、その際、導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質は、このキメラの選択された組織中に存在する。このキメラに由来する細胞は、この導入遺伝子によってコードされる外因性タンパク質を発現する。特に好ましい実施形態では、この導入遺伝子によってコードされる外因性抗体は、この導入遺伝子によってコードされる抗体に応じて、特定の組織または組織型において発現される。胚性幹細胞の子孫は、レシピエント胚へのＥＳ細胞の導入およびキメラの形成後に非ＥＳ細胞表現型に分化する、ＥＳ細胞の派生物である。
【００１４】
体細胞組織における導入遺伝子の広範な発現は、胚体外組織および体細胞組織における発現によって実証される。トランスジェニック動物の卵のタンパク質内容物を解析することにより、導入遺伝子から、そして本発明の技術を用いて得られる、導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質の卵白における選択的発現が実証される。組織特異的発現は、１つの器官、組織、または細胞型に実質的に限局されている発現によって実証される。
【実施例】
【００１５】
（実施例１）
ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ細胞）の誘導
ニワトリＥＳ細胞を、２種の交雑、すなわち、横斑ロック×横斑ロック、または横斑ロック×ロードアイランドレッドのうちの１つから誘導した。ｃＥＳ細胞の発育能を試験する場合、羽毛マーカーを得るためにこれらの品種を選択した。これらｃＥＳ細胞を、優性の白色遺伝子座においてホモ接合優性である白色レグホーン胚中に注入する。これらのＥＳ細胞の注入の結果として生じるキメラニワトリは、ｃＥＳ細胞由来の黒色の羽毛およびレシピエント胚由来の白色の羽毛を提示する。
【００１６】
ｃＥＳ細胞培養物の最初の樹立を、ＵＳＰ５，５６５，４７９に記載されているプロトコールに従って開始した。ステージＸでは、胚は、約４０，０００〜６０，０００個の細胞からなり、卵黄の表面に位置する、小さな円盤状物体である。この胚を採取するために、紙でできた輪を卵黄膜上に置き、中央に胚を露出させる。この輪の外周に沿って卵黄膜を切断し、次いで卵黄からそれを持ち上げる。輪の内側に付着した胚を顕微鏡下に置き、また、細いループを用いて暗域から明域を単離する。
【００１７】
表１：ＣＥＳ−８０培地中のＳＴＯフィーダー細胞またはポリエステル挿入物のいずれかの上で誘導されたｃＥＳ細胞株。培養は、単一胚およびプールされた胚の双方から開始した。
【００１８】
【表１】
胚を機械的に分散させて単細胞懸濁物とし、有糸分裂が不活化されたＳＴＯ細胞のコンフルエントなフィーダー層上に３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種する。ｃＥＳ培養培地は、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルバート、１×ヌクレオシド、１×非必須アミノ酸、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ（２０％新鮮培地および８０％馴化培地）からなる。使用前に、ＤＭＥＭ培地をバッファローラット肝臓（ＢＲＬ）細胞で馴化させる。手短に言えば、ＢＲＬ細胞をコンフルエントになるまで増殖させた後、５％血清含有ＤＭＥＭを添加し、３日間馴化させる。この培地を除去し、培地の新しいバッチを３日間馴化させ、これを繰り返す。３回分のバッチを合わせ、ｃＥＳ培地を作製するために使用した。ニワトリＥＳ細胞は、胚盤葉細胞の接種後３〜７日目に可視になる。これらのｃＥＳ細胞は、形態学的にｍＥＳ細胞に類似していた。すなわち、これらの細胞は小型であり、大型の核および顕著な核小体を有していた（図１を参照されたい）。
【００１９】
ｃＥＳ細胞の増殖特徴は、縁が滑らかであり、かつ区別が困難な個々の細胞を有する密な円形コロニー中で増殖するｍＥＳ細胞とは異なる。ニワトリＥＳ細胞は、個々の細胞がはっきりと目に見える単層コロニー中で増殖する。密なコロニーは、ｃＥＳ培養物における分化の最初の徴候であることが多い。
【００２０】
培養で誘導された細胞の多能性のマーカーについて試験するために、これらの細胞を固定し、そしてマウスおよびニワトリの始原生殖細胞上のエピトープを認識する、ＳＳＥＡ−１１（Solter,D.およびB.B.Knowles、Proc.Natl.Acad.Sci、U.S.A.７５巻：５５６５〜５５６９頁、１９７８年）、ＥＭＡ−１（Hahnel,A.C.およびE.M.Eddy、GameteResearch １５巻：２５〜３４頁、１９８６年）、および同様に多能性細胞によって発現されるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）で染色した。図２に示すこれらの試験の結果により、ニワトリＥＳ細胞が、アルカリ性ホスファターゼ、ならびにＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１によって認識される抗原を発現することが実証される。
【００２１】
上記のプロトコールを用いた後のｃＥＳ細胞は可視であるが、このような培養物は、数週間より長く維持することができない。以下で考察するように、培養条件にいくつかの変更を起こすことにより、１９種の細胞株（表１）の派生物を生じさせ、このうち１４種をレシピエント胚中に注入することによってそれらの発育能を試験した。羽毛の色素沈着によって判定されるように、１４種の細胞株のうちの１１種が、レシピエント胚に寄与した（下記表２を参照されたい）。このプロトコールは、胚性幹細胞表現型を発現する多能性細胞の持続的培養物をもたらす。任意の時点で、これらの細胞を凍結保存することができ、また、これらの細胞は、損傷を与えられたレシピエント胚中に注入された場合に、体細胞組織に実質的に寄与する潜在能力を有する（以下の実施例３および実施例５を参照されたい）。
【００２２】
表２：単一胚またはプールされた胚に由来する胚性幹細胞株の継代数および培養時間。ステージＸレシピエント中へのこれらのＥＳ細胞の注入後の体細胞キメラ現象の出現率および程度。
【００２３】
【表２】
マウスと同様に、トリ胚性幹細胞は、ＳＴＯ、ＳＴＯ−ｓｎ１、および容易に入手可能である他のものを含めて、様々なフィーダー層上で誘導される。これらのフィーダーによって産生される白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびウシ胎児血清の添加は、ＥＳ細胞を未分化状態で維持するのに寄与する。本発明の好ましい実施形態では、ニワトリＥＳ細胞の培養は、ＳＴＯフィーダー層上で開始する。ＳＴＯ細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンで３〜４時間処理し、洗浄し、トリプシン処理し、そしてゼラチンコート皿上に４×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種する。ｃＥＳ細胞は、ＳＴＯ細胞からなるフィーダーが薄い場合に、より迅速に増殖するようである。ＳＴＯフィーダー細胞濃度を１０３〜１０５細胞／ｃｍ２まで、好ましくは１０４細胞／ｃｍ２未満に低下させると、ｃＥＳ細胞の誘導および増殖が促進される。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞およびマウス初代線維芽細胞をフィーダーとして用いた場合、ｃＥＳ細胞は誘導されなかった。また、予め樹立されたｃＥＳ細胞をこれらのフィーダー上に播種した場合、これらはすべて１週間以内に分化した。
【００２４】
フィーダーの不在下、ポリマー膜（Ｃｏｓｔａｒ社、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ型）などの合成挿入物上でｃＥＳ細胞を増殖させると、ＥＳ細胞を注入する際の、フィーダー細胞によるレシピエント胚の汚染が回避される。表３および表４が示すように、ＳＴＯフィーダーの代わりに挿入物上で培養することにより、ｃＥＳ細胞の誘導が促進され、また、挿入物は、最初の誘導のために使用され得る。しかし、最初に挿入物上で迅速に増殖した後、ＥＳ細胞の有糸分裂活性は４〜６週間の培養後に低下する。培養を延長するためには、これらの細胞をＳＴＯ細胞からなるフィーダーに移さなければならない。
【００２５】
表３．挿入物またはＳＴＯ細胞のフィーダー（１０４細胞／ｃｍ２）のいずれかの上での単一胚からのｃＥＳ細胞の樹立
【００２６】
【表３】
表４．ＳＴＯフィーダーまたは合成挿入物のいずれかの上でのプールされた胚からのｃＥＳ細胞の樹立
【００２７】
【表４】
表３および表４のデータは、ニワトリの胚性フィーダー細胞およびマウス初代胎児線維芽細胞が、ｃＥＳ細胞の誘導も培養も支援しないことを示す。ＳＴＯ細胞のフィーダーは、誘導および増殖を支援するが、１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の限定された濃度、好ましくは、本発明の実施形態では、１０４細胞／ｃｍ２未満または約１０４細胞／ｃｍ２の濃度でＳＴＯ細胞が存在する場合にのみ、支援する。濃密なＳＴＯフィーダー層は、ｃＥＳ細胞の増殖を減退させるが、指定された濃度のＳＴＯ細胞は、ＥＳ細胞の増殖に必要な因子を提供する。これらの細胞が長期の培養期間に渡って維持され、かつ継続して胚性幹細胞表現型を発現し、かつｉｎ ｖｉｖｏで非胚性幹細胞表現型に分化する場合、これらの細胞は、「ＥＳ細胞子孫」と呼ばれる。
【００２８】
ｃＥＳ細胞培養培地は、８０％の馴化培地からなり、好ましくは、ｃＥＳ細胞の誘導および増殖に必要な因子を含むある種のＢＲＬ馴化培地を含む。５０％の濃度では、ｃＥＳ細胞の増殖は、８０％の馴化培地における場合ほど信頼性が高くない。馴化培地の比率が５０％未満まで減少した場合、分化細胞の増加によって立証されるように、ｃＥＳ細胞の増殖は影響を受け、また、３０％以下の濃度では、ｃＥＳ細胞は、１週間以内に分化する。ｃＥＳ細胞の誘導および維持に必要であることが判明したこの馴化培地は、ｍＥＳを維持しないが、それらの分化を引き起こす。
【００２９】
ウシ胎児血清は、本発明によるＥＳ細胞培地の好ましい成分であり、ｃＥＳ細胞を未分化状態に保つ因子を含む。しかし、血清は、分化を誘導する因子を含むことも公知である。市販の血清ロットは、ＥＳ細胞を未分化状態に保つ潜在能力について、使用者によってルーチン的に試験される。ｃＥＳ細胞培養物に対して使用される血清は、マウスＥＳ細胞培養物に使用される血清とは異なることが公知である。例えば、細胞毒およびヘモグロビンの濃度が低く、マウスＥＳ細胞を未分化状態で維持することが公知である、マウスＥＳ細胞の培養のために用いられる血清は、ニワトリＥＳ細胞の持続的な増殖を支援しない。
【００３０】
したがって、ニワトリＥＳ細胞に対して使用される血清は、マウスＥＳ細胞において試験して培地成分としての適性を判定するべきではなく、その代わりに、ニワトリＥＳ細胞において評価すべきである。そのために、ニワトリＥＳ細胞培養物を２つに分け、血清の新しいバッチをそれぞれ試験するために使用する。試験される新しいバッチは、実験的に試験された場合に、ニワトリＥＳ細胞の増殖を明らかに支援しなければならない。
【００３１】
ニワトリ染色体のスプレッドは、１０本の大染色体、６６本の小染色体、および１対の性染色体（雄におけるＺＺおよび雌におけるＺＷ）からなる複雑な核型が原因となって、マウスとは異なる特別な評価技術を必要とする。図３に示す本発明の長期ｃＥＳ細胞を、培養から１８９日後、そして２回凍結保存した後に解析した。図３を参照すると、これらは、１０本の大染色体、２本のＺ染色体、および６６本の小染色体を有する正常な核型を示した。
【００３２】
ニワトリＥＳ細胞を、培地中１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存する。いくつかの細胞株を解凍し、レシピエント胚に注入した後、体細胞キメラが得られる。このことは、これらのｃＥＳ細胞が、凍結保存プロセスの間、それらの発育能を維持していることを示唆する。
【００３３】
（実施例２）
レシピエント胚へのニワトリ胚性幹細胞の注入
新しく産卵された卵中の胚への到達を可能にするためには、殻を割らなければならず、これは、２１日のインキュベーション期間の最終時点のふ化率の低下を不可避的にもたらす。慣例としては、卵の側面を切断して小さな穴（直径１０ｍｍ未満）をあけ、この穴を通して胚を操作し、そしてテープ、カバーガラス、卵殻膜、または一片の殻で再び封じた。実施するのは比較的簡単であるが、この「窓開け」法は、７０％〜１００％の胎児死亡率を引き起こした。胚への到達の改善、および生存およびふ化能力の増大は、２種の異なる殻および（Ｃａｌｌｅｂａｕｔから適応させた）方法（参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Callebaut、Poult. Sci ６０巻：７２３〜７２５頁、１９８１年、ならびにRowlett,K.およびK.Simkiss,J.Exp.Biol.１４３巻：５２９〜５３６頁、１９８９年）を用いて、ふ化までのインキュベーションのために代理卵殻に胚を移入した場合に実現することができ、この技術を用いた場合、平均ふ化率は、約４１％（２３〜７０％の範囲）であり、４６９個のｃＥＳ細胞注入胚から１９１匹のヒヨコがふ化した。
【００３４】
レシピエント胚中へのドナーＥＳ細胞の注入後の胚のインキュベーションは、以下に説明するような系Ａおよび系Ｂを含む、２つの部分に分けることができる。
【００３５】
系Ａは、産卵後発育の最初の３日間を対象として含む。レシピエント胚を含む受精卵は、３〜５グラム重い卵と一致する。鋭端（ｐｏｉｎｔｅｄ ｐｏｌｅ）を切断して直径３２ｍｍの窓を開け、内容物を除去し、そして卵黄上のレシピエント胚を、周囲の卵白と共に代理殻中に注意深く移す。
【００３６】
細胞を、２ミクロンフィルターを取り付けられた口式吸引器に連結された、徐々に先細になる滅菌ガラスピペット中に吸い上げる。ピペットの穴は、直径が５０〜１２０ミクロンでよく、また、３０°の尖った斜面を有する。胚は、低倍率下で、かつ青色光を用いて可視化する。ニワトリＥＳ細胞をトリプシン処理して単細胞懸濁液にし、そして約２，０００〜２６，０００個の細胞、好ましくは約２０，０００個の細胞を胚中に注入する。これらの細胞は、胚の下または上のいずれかの空間中に、すなわち、胚下腔中に、または明域の先端表面と卵黄周囲の層（卵黄膜）の間に穏やかに押し出す。新鮮な受精卵から採取した余分な卵白を添加し、プラスチックフィルムのサランラップで殻を密閉する。
【００３７】
系Ｂは、３日目からふ化までの期間を対象として含む。インキュベーション３日目に、胚は、ステージ１７前後に到達した（Ｈ＆Ｈ）。卵白から胚下腔に水が輸送され、それによって卵黄が拡大し、非常に脆弱になる。系Ａの殻の内容物を、元の卵より３０〜３５グラム重い第２の代理殻（通常、シチメンチョウの卵）に、極めて慎重に移入する。細菌汚染を防止するためにペニシリンおよびストレプトマイシンを添加し、また、鈍端（ｂｌｕｎｔ ｐｏｌｅ）の３８〜４２ｍｍの窓をプラスチックフィルムで封じる。このより大きな殻により、人工的な気室が実現される。インキュベーションの１８日目〜１９日目に、これらの胚培養物を、綿密な観察のために卓上ふ卵器に移す。肺換気が確立されるとき、プラスチックフィルム中に周期的に穴が形成され、周囲空気が気室中に入ることが可能になる。ふ化の約６〜１２時間前に、フィルムを、ふ化の進行中にヒヨコが容易に脇へ押しのけることができる小型ペトリ皿に交換する。
【００３８】
インキュベーションの間、代理殻中の胚のために、通常の飼育温度（３７．５℃〜３８℃）および相対湿度（５０％〜６０％）を維持するが、普通は１時間毎であり、そして９０度までである周期的な卵の揺り動かしは、良好な生存を確実にするように変更しなければならない。系Ａでは、揺り動かしは、４〜５分間毎にに９０°までであり、系Ｂでは、４０〜４５分毎に４０°〜６０°までである。いずれの系においても、揺り動かしの速度は、１分間当たり１５°〜２０°で維持される。
【００３９】
ｃＥＳ細胞の注入の前に、レシピエント胚を（１）６６０ラドのガンマ線照射への曝露によって照射することによって（２）胚の中央から約１０００個の細胞を機械的に除去することにより改変することによって、または（１）および（２）を組み合わせることによって調製した場合には、キメラに対するｃＥＳ細胞の寄与が改善される。表５を参照すると、体細胞組織に対するｃＥＳ細胞の寄与は、レシピエント胚の中央から細胞を除去することまたは放射線照射への曝露のいずれかによってレシピエント胚に損傷を与えた場合に、実質的に増加した。放射線照射および細胞の機械的除去の組合せによってレシピエント胚に損傷を与えた場合、ｃＥＳ細胞がより長期間培養状態にあったにもかかわらず、ＥＳ細胞の寄与はさらに増加した。結果として生じるキメラヒヨコの一部は、純粋な横斑ロックニワトリヒヨコと区別することができない（図４）。表５中のデータが示すように、キメラ現象の割合ならびに胚１つ当たりのキメラ現象の程度は、レシピエント胚に損傷を与えた後に増加する。
【００４０】
表５：異なる方法によって損傷を与えられたレシピエント胚中へのｃＥＳ細胞注入後の体細胞キメラ現象の頻度
【００４１】
【表５】
ステージＸより実質的に若いレシピエント胚もまた、ＥＳ細胞をドナーとして用いてキメラを作製するために使用され得る。初期のレシピエント胚は、オキシトシンを雌鶏に注射して、早期産卵を誘導することによって採取し、また、受精卵は、ステージＶＩＩ〜ＩＸに採取する。
【００４２】
あるいは、輸卵管の膨大部領域からの胚の採取により、約４〜２５０個の細胞からなるステージＩ〜ＶＩの胚を入手する機会が提供され、また、潜在的なレシピエント胚としてのすべての胚ステージからキメラを開発することが可能になる。
【００４３】
（実施例３）
ニワトリ胚性幹細胞（ｃＥＳ）に由来する体細胞キメラ
ニワトリＥＳ細胞を白色レグホーンレシピエント胚中に注入する。第１期の実験では、２８回の実験において合計１４種の細胞株を、ステージＸのレシピエント胚に注入する（表２を参照されたい）。これらのｃＥＳ細胞は、４〜１０６日間培養して増殖させたものであり、一部の株は、凍結保存したものであった。ニワトリＥＳ細胞を軽くトリプシン処理して、ｃＥＳ細胞の小さな塊を得、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中に再懸濁する。２０００〜５０００個の細胞を含む３μｌ〜５μｌの細胞懸濁液を、レシピエント胚の胚盤下腔中に注入する。羽毛を発達させた胚をすべて分析し、また、羽毛の色によって判定したところ、２４パーセントの胚（８３／３４７）が、キメラである。羽毛キメラは、１４種の細胞株中１１種から得られる。キメラ現象の程度は、１％〜９５％まで様々であり、程度の平均は、２５．９％（ＳＤ＝２０．４）であった。
【００４４】
表２は、細胞株内および細胞株間で実施した実験間の体細胞キメラ現象の差異を示す。キメラに対するＥＳ細胞の寄与の例を、図４および図５に示す。図４では、２匹のヒヨコがキメラであり、２匹が横斑ロックである。これらのヒヨコの間に表現型の差異はなく、キメラに対するＥＳ細胞の寄与が、特に外胚葉由来の系統において多大であることが示唆されることは明らかである。図５では、左側のキメラは、ＥＳ細胞からの比較的低いレベルの寄与を有するのに対し、右のキメラは、中程度の寄与を有する。
【００４５】
（実施例４）
リポフェクションおよびエレクトロポレーションによるｃＥＳ細胞のトランスフェクション
表６に言及すると、トランスフェクトされるウェルのサイズと適合した適切な量のＤＮＡを、血清も抗生物質も含まない培地中に希釈する。適切な体積のＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を添加し、ＤＮＡと混合し、そして５〜１０分間、反応を生じさせる。この培地を除去し、そしてトランスフェクトしようとするウェルを、ＣａおよびＭｇを含まない塩溶液で洗浄する。血清および抗生物質を含み得る適切な体積の培地を、ＤＮＡ／Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物に添加する。これらのプレートを３７℃で２〜３時間インキュベートする。インキュベーションが完了したら、細胞を１〜２回洗浄することによってＳｕｐｅｒｆｅｃｔを除去し、そして新鮮な培養培地を添加する。
【００４６】
表６：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを用いたニワトリＥＳ細胞のトランスフェクションのための条件
【００４７】
【表６】
ペトリ皿用パルサーを用いて、プレートの直径３５ｍｍのウェル中に付着しているｃＥＳ細胞をエレクトロポレーションする。この培地を除去し、そしてＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない塩溶液でウェルを洗浄する。１ｍｌのエレクトロポレーション溶液をこのウェルに添加する。ＤＮＡを添加し、培地を穏やかに混合する。このペトリ皿用パルサーをウェルの底部まで下げ、電流を送達する。（電圧は好ましくは１００〜５００Ｖ／ｃｍであり、また、パルス長は１２〜１６ｍ秒でよい）。ペトリ皿用パルサーを取り出し、エレクトロポレーションしたウェルを室温で１０分間静置する。１０分後、２ｍｌの培地を添加し、インキュベーターに皿を戻す。
【００４８】
懸濁状態の細胞をトランスフェクトするために、培地を除去し、そしてＣａおよびＭｇを含まない塩溶液で細胞を洗浄する。ＥＤＴＡと共にトリプシンを添加して、単細胞懸濁液を得る。細胞を洗浄し、遠心分離し、そしてＰＢＳなどの補正用エレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁する。このＥＳ細胞懸濁液を無菌のキュベット中に入れ、ＤＮＡ（最低濃度１ｍｇ／ｍｌ）をこの細胞懸濁液に添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合する。これらの細胞をエレクトロポレーションし、室温で１０分間放置した。細胞をキュベットから取り出し、予め準備しておいたウェルまたはディッシュに分配する。細胞をインキュベーター中に入れ、また、エレクトロポレーション後２４〜４８時間目の一過性トランスフェクションについて評価する。抗生物質耐性細胞の選択もまた、ピューロマイシンなどの抗生物質を培養培地中に含めることによって開始することができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、トランスフェクトされた細胞を選択するために必要とされるピューロマイシンの濃度は、死滅滴定曲線として算出される。ニワトリ胚性幹細胞に対する死滅滴定曲線は、培養中の細胞を、０．０〜１．０μｇ／ｍｌの範囲のピューロマイシン濃度に１０日間（表７）、および０．０〜２００μｇ／ｍｌの範囲のネオマイシン濃度（表８）に曝露することによって作成する。２日毎に培地を交換し、そして新鮮なピューロマイシンまたはネオマイシンを添加する。濃度０．３μｇ／ｍｌのピューロマイシンに曝露した場合、ＥＳ細胞は、６日間の期間に渡って新鮮なピューロマイシンを含む培地を３回交換した後のすべてのウェルから消失していた（表７を参照されたい）。トランスフェクトされた培養物を選択するために、０．３〜１．０μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度を使用する。４０μｇ／ｍｌを超えるネオマイシン濃度では、７日以内にすべてのｃＥＳ細胞が消失した（表８）。
【００５０】
１０日間の選択後、ｃＥＳ細胞コロニーは目に見え、さらなる増殖のために採取することができる。
【００５１】
表７：様々な濃度のピューロマイシンに様々な長さの期間（ピューロマイシン添加後の日数）曝露した後のｃＥＳ細胞の形態
【００５２】
【表７】
表８：様々な濃度のネオマイシンに様々な長さの期間（ネオマイシン添加後の日数）曝露した後のｃＥＳ細胞の形態
【００５３】
【表８】
（実施例５）
組織特異的な抗体発現
導入遺伝子の設計に応じて、外因性抗体をコードするＤＮＡは、選択された組織おいてのみ有意なレベルの抗体を発現するように設計される。この導入遺伝子構築物は、宿主生物のゲノムに由来する遺伝子エレメントを含み得、また、選択された組織における抗体の公知の発現または発現パターンに基づいて選択され得る。特定の組織における発現のためには、選択される組織において通常発現され、また通常高度に発現される、タンパク質をコードする遺伝子を選択し、そしてこの外因性抗体の発現を駆動するために、この遺伝子に由来する調節エレメントを選択する。この外因性抗体のＤＮＡコード配列と組み合わせる場合、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、オボグロブリン、オボインヒビター、シスタチン、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、またはアビジンのプロモーターなど他の調節エレメントを、選択マーカーをコードする遺伝子と組み合わせて、および／またはＩＲＥＳと組み合わせて、使用してよい。この導入遺伝子は、選択された組織において、好ましくは卵白において優先的な抗体発現をもたらす。特定の組織型における優先的発現は、選択されていない組織と比較して規模が３〜４桁大きな、選択された組織における発現と定義することができる。
【００５４】
トランスジェニックトリにおける組織特異的抗体発現の場合、組織特異的発現は、好ましくは、膨大部、峡部、卵殻腺、または卵管漏斗を含めて、輸卵管のある領域を対象としている。膨大部は、卵白の主なタンパク質を発現する管状腺細胞を含み、一方、峡部は、卵殻膜を発現する細胞を含む。可溶性タンパク質の発現は、好ましくは、輸卵管の膨大部の管状腺細胞に指向され、これは、好ましくはオボアルブミン、ただし、オボトランスフェリン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、オボインヒビター、シスタチン、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、およびアビジンを含む、卵白タンパク質を発現する遺伝子に由来する、プロモーターを通常含む調節配列を選択することによる。上皮細胞における発現を除く、管状腺細胞における選択的発現を以下に実証し、また、２種の細胞型間の選択性を区別するために、優先的発現と命名する。
【００５５】
以下の実施例では、外因性免疫グロブリン遺伝子座と共に、プロモーターを含む内因性卵白調節配列を含む導入遺伝子を構築して、輸卵管の管状腺細胞における組織特異的抗体発現を生じさせる。その場合、このようにして発現された抗体分子は、トランスジェニックニワトリの卵白中に蓄積される。この実施形態では、再配列された任意の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体は、輸卵管の膨大部領域の管状腺細胞を含む組織において特異的に発現され、そして卵白から単離することができる。モノクローナル抗体をコードする再配列された免疫グロブリン遺伝子は、他の組織における発現が検出可能なレベルより上で存在し得るものの、他の組織における発現は実質的になく、輸卵管において優先的に発現される。
【００５６】
この実施形態では、オボアルブミン調節配列の制御下のモノクローナル抗体カセットは、少なくとも３．４Ｋｂ、好ましくは少なくとも約７．５Ｋｂの５’調節配列から構成され、かつ１５Ｋｂ以上の３’調節配列も含んでよい。好ましくは、この構築物は、外因性抗体コード領域の５’末端および３’末端の双方に隣接するオボアルブミン遺伝子の領域を含むが、５’隣接領域の内因性プロモーター配列のセグメントが十分に大きな場合は、３’隣接領域の必要性を回避し得る。抗体の重鎖および軽鎖の双方のコード領域は、導入遺伝子中で提供され、かつ選択されたアイソタイプの可変領域、多様性領域、連結領域、および定常領域を含む。好ましい実施形態では、この抗体は、特徴的にはヒトであり、かつ少なくともヒト重鎖を含む、免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。また、このアイソタイプは好ましくはＩｇＧであり、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【００５７】
オボアルブミンに由来するモノクローナル抗体構築物のために好ましい導入遺伝子構築物を、図６Ａに提供する。この導入遺伝子構築物をＯｖ７．５と呼び、これは、ＭＡｂコードに５’末端配列で隣接しているプロモーター（この特定の実施形態ではオボアルブミンプロモーター）を含む約７．５Ｋｂの卵白調節配列、およびコード領域の３’側の１５Ｋｂのプロモーター配列を有する。コード領域は、軽鎖および重鎖の双方の可変領域、Ｊ−Ｃイントロン配列、κ軽鎖定常領域、ＩＲＥＳ配列、ならびにγ１アイソタイプ重鎖定常領域を含む。この構築物の３’末端は、ＧＦＰ遺伝子および選択マーカー、すなわち、この場合、本明細書において説明されるＣＸプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む。モノクローナル抗体コード領域の３’側および５’側の双方のオボアルブミンプロモーター配列の長さは例にすぎず、類似した構築物は、２５〜１００Ｋｂ以上の５’配列、ならびに様々な長さの３’配列を含み得る。当業者には、ＧＦＰマーカーが、生理学的標本における検出のためにだけ存在し、導入遺伝子の有用性から逸脱することなく除去できることが理解されよう。ピューロマイシン耐性マーカーは、この導入遺伝子で成功裡に形質転換された胚性幹細胞を選択する能力を与える任意のマーカーで置換することができる。いくつかのタイプの類似した選択マーカーが当技術分野において周知であり、また、本実施形態のピューロマイシン耐性遺伝子と本質的に交換可能に使用され得る。
【００５８】
上記のように、このモノクローナル抗体は、本発明の導入遺伝子構築物を用いて発現させることができるいくつかのタイプのモノクローナル抗体生成物のうちの一例にすぎない。さらに、タンパク質の１つのクラスとしてのモノクローナル抗体は、本明細書において説明される方法および技術に従って、組織特異的な様式で発現され得る多くのクラスのタンパク質生成物の一例にすぎない。
【００５９】
図６Ｂを参照すると、エストロゲン注射によってＯｖ７．５導入遺伝子の発現が誘導された２週齢のキメラの膨大部の切片は、形質転換された胚性幹細胞に由来する抗ダンシルモノクローナル抗体産生細胞の組織特異的発現によりＧＦＰが発現していることを示し（図６Ｂの左上のパネルにおいて緑色として示される）、これにより、Ｏｖ７．５導入遺伝子で形質転換された胚性幹細胞による寄与が裏付けられる。図６Ｂの左下のパネルを参照すると、モノクローナル抗体は、管状腺細胞において赤色に染色されるのに対し、同じくドナー胚性幹細胞に由来する上皮細胞は緑色に染色され、赤色には染色されない。染色におけるこの差異により、構築物の発現が組織特異的であり、かつ特定の組織型に対する導入遺伝子の内容によって選択されることが実証される。以下の実施例は輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実証するが、あらゆる細胞型および組織型にわたる発現の実証により、導入遺伝子構築物の構成要素、および例えば、プロモーターまたは他の調節エレメントの対応した選択によって組織特異的発現または細胞特異的発現のために各組織型または任意の組織型を選択し得ることが実証される。
【００６０】
図６Ｂの右上のパネルでは、細胞型のすべてがＤＡＰＩ染色によって示される。右下のパネルでは、染色を重ねて、ドナー由来の管状腺細胞のみがモノクローナル抗体を発現し、一方、レシピエント由来の細胞およびドナー由来の上皮細胞がモノクローナル抗体を発現しないことを実証する。図７Ｃおよび図７Ｄは、抗ダンシルモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖が、それぞれ、３または５キメラの輸卵管組織においてのみ選択的に発現され、また、これらのキメラの脳、腸、膵臓、または筋肉においてはＲＴ−ＰＣＲによって検出されるレベルを上回っては発現されないことを示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【００６１】
ヒトＩｇＧアイソタイプモノクローナル抗体が選択的に発現され得、そして蓄積されるタンパク質が卵白であることを実証するために、Ｏｖ７．５構築物を有するｃＥＳ細胞を注入することによって合計１８匹のキメラ雌を作製した。この群から６匹のキメラを用いて、初期のエストロゲン誘導による導入遺伝子発現を試験した。残りのキメラ雌１２匹は、卵を回収するために性的に成熟するまで飼育した。９匹のキメラ雌が、１７〜２２週齢で産卵を開始し、また、これらのキメラのうちの１匹は、散発的に産卵した。キメラ雌のうちの３匹は、３５週齢の時点で卵を産卵しておらず、剖検時に、それらの性腺が、雄性ＥＳ細胞に由来する組織の存在によって雄性化していることが明らかになった。
【００６２】
卵を産卵する９匹のキメラに由来する卵を回収し、硫酸アンモニウム沈殿法によって代表的な卵白サンプルを調製し、そしてＥＬＩＳＡによって解析した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でマイクロタイタープレートをコーティングし、重鎖に対する標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体および／または軽鎖に対する標識されたヤギ抗ヒトκ（κ鎖特異的）抗体のいずれかによって卵白サンプル中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの存在を明らかにした。精製ヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて標準曲線を作成した。ＥＬＩＳＡの感度は、０．８ｎｇ／ｍｌであった。非トランスジェニック白色レグホーン雌鶏由来の卵白サンプルを、ネガティブコントロールとして使用した。ヒトＩｇＧ ＭＡｂ蓄積は、非トランスジェニック白色レグホーン雌鶏に由来する卵（卵４個）においても、６匹のキメラ雌鶏に由来する卵（雌鶏ＯＶ１１−１７番由来の卵８個、雌鶏ＯＶ１１−５３番由来の卵８個、雌鶏ＯＶ１１−７３番由来の卵６個、雌鶏ＯＶ１１−８８番由来の卵６個、雌鶏ＯＶ１２−９７番由来の卵４個、および雌鶏ＯＶ１３−１３番由来の卵５個）においても、検出不可能であった。
【００６３】
ヒトＩｇＧ ＭＡｂ蓄積が、３種の異なるキメラ雌鶏に由来する卵において検出された（ＥＬＩＳＡによってＩｇＨを決定した場合、雌鶏ＯＶ１１−１３由来の卵の場合に約１．４〜６．３ｎｇ／ｍｌ、雌鶏ＯＶ１１−３７番由来の卵の場合に約２．０〜２．９ｎｇ／ｍｌ、および雌鶏ＯＶ１１−４３番由来の卵の場合に約２．９〜１０．８ｎｇ／ｍｌ）。代表的な卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度を、表９にまとめて示す。ＩｇＬに関してＥＬＩＳＡによって決定された卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度は、ＩｇＨに関してＥＬＩＳＡによって決定された濃度より、一貫して低かった。一般に、ＩｇＬによって決定された濃度は、ＩｇＨによって決定された濃度の６０％であった（表９の３列目および５列目を比較されたい）。この差異は、精製したヒトＩｇγ１、κタンパク質を用いて作製されたスパイクサンプルにおいても存在した。
【００６４】
表９ キメラに由来する卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの蓄積
【００６５】
【表９】
雌鶏ＯＶ１１−１３番、ＯＶ１１−３７番（これらは、卵中にヒトＩｇを蓄積した）および白色レグホーンに由来する血液サンプル中のヒトＩｇＧ ＭＡｂタンパク質の濃度は、アッセイ感度（０．８ｎｇ／ｍｌ）より低かった。これらのデータは、エストロゲンによって誘導したキメラヒヨコの腸、脳、膵臓、および筋肉におけるヒトＩｇ転写物の存在を評価するためにＲＴ−ＰＣＲを用いて観察された、キメラニワトリにおけるヒトＩｇの異所発現の不在と一致している（図７Ｃおよび７Ｄ）。したがって、Ｏｖ７．５構築物は、組織特異的であり、ホルモンによって誘導され、そして発生に関連して調節される遺伝子発現を、トランスジェニックキメラ雌鶏に送達すると思われる。さらに、タンパク質は、膨大部中の管状腺細胞から搬出され、卵白中に蓄積されるようである。
【００６６】
オボアルブミン由来の組織特異的タンパク質発現導入遺伝子を、以下のようにして構築した。
【００６７】
ニワトリゲノムＢＡＣライブラリー（Crooijmans,R.P.ら、Mamm.Genome １１巻：３６０〜３６３頁、２０００年）（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ ＢＡＣ Ｃｅｎｔｅｒ）をスクリーニングして、オボアルブミン遺伝子座中の４６Ｋｂの領域を単離する。ＭＡｂコード領域の５’側に位置するオボアルブミンプロモーターの異なる断片を有する、以下の２種の異なるベクターを構築した：（１）Ｏｖ７．５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４２Ｋｂの発現ベクターであり、オボアルブミン遺伝子に由来する９．２Ｋｂの５’配列（７．５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む（図１０Ａ）。この４２Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子に由来する９．２Ｋｂの５’配列（７．５Ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む。バイシストロン性のモノクローナル抗体カセットは、抗ダンシル抗体の軽鎖、ＩＲＥＳ、および重鎖をコードする。（２）Ｏｖ１５ＭＡｂ−ｄｎｓ：４９Ｋｂの発現ベクターであり、オボアルブミン遺伝子に由来する１６．８Ｋｂの５’配列（１５Ｋｂプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む（図示せず）。この４９Ｋｂの発現ベクターは、オボアルブミン遺伝子に由来する１６．８Ｋｂの５’配列（１５Ｋｂのプロモーターを含む）および１５．５Ｋｂの３’隣接配列を含む。このモノクローナル抗体カセットは、双方の構築物において同一である。
【００６８】
上記のように、双方のベクターにおいて発現され得る遺伝子の一例は、マウス−ヒトハイブリッドの抗ダンシルモノクローナル抗体（ＭＡｂｄｎｓ）である。ＣｘＥＧＦＰ／ＣｘＰｕｒｏカセットを３’側の最末端にクローニングして、ｃＥＳ細胞における安定なトランスフェクションをピューロマイシンを用いて選択すること、およびキメラ中のトランスフェクトされた細胞を容易に同定することを可能にする。どちらの構築物も、ｃＥＳ細胞中にトランスフェクションする前に直線状にし、また精製する。ｃＥＳ細胞のトランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）またはペトリ皿用パルサーによるエレクトロポレーションのいずれかを使用して、Ｏｖ７．５ＭＡｂｄｎｓおよびＯｖｌ５ＭＡｂを用いて実施する。ピューロマイシンによる選択後、耐性クローン６つを、分子解析のために採取する。ＭＡｂｄｎｓカセット中、ＧＦＰ遺伝子中、およびＰｕｒｏ遺伝子中に配置されたプライマーを用いるＰＣＲによって導入遺伝子の存在を確認する。
【００６９】
発現され得る抗体の第２の例は、完全なヒト抗ヒトＰＳＭＡモノクローナル抗体（ＭＡｂＦ１）である。ＭＡｂＦ１に対応するＶ遺伝子をＰＣＲによって獲得し、また、Ｏｖ１５ＭＡｂ−ｄｎｓ中のＶ遺伝子と入れ替えるために使用した。
【００７０】
この導入遺伝子は、雌性ＥＳ細胞中に安定に組み入れられ、また、これらの安定にトランスフェクトされた細胞を、ステージＸのレシピエント胚中に注入した。結果として生じるキメラを性的に成熟するまで飼育し、そして卵中のヒトモノクローナル抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。３０匹の雌鶏のうち４匹は、１ｍｇ／卵を上回る濃度で卵中に抗体を蓄積した（表９Ａ）。
【００７１】
表９Ａ Ｏｖ１５ＭＡｂＦ１キメラに由来する卵中のヒトＩｇＧ ＭＡｂの濃度
【００７２】
【表９Ａ】
（実施例６）
抗体生成物の特性決定
ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１を、従来のＣＨＯ細胞培養において産生されたＭＡｂＦ１といくつかのアッセイにおいて比較した。
【００７３】
１．抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
４．６×３００ｍｍのＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ Ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ ２７９５ ＨＰＬＣによって約１０μγのＩｇＧサンプルを解析した。０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２において、流速０．４ｍｌ／分で２０分間、クロマトグラフィーを実施した。Ａ２８０で分離をモニターした。分子量標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、概算の分子量を決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析により、双方とも９０％を超えるＩｇＧモノマーであることが示された（表１０）。
【００７４】
表１０ ＭＡｂＦ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
【００７５】
【表１０】
２．タンパク質のＮａｎｏ ＬＣ ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ解析
双方のＭＡｂ調製物を還元およびアルキル化し、一晩透析し、そして２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＰＨ８）中、３７℃で４時間、トリプシンで消化した。双方のトリプシン消化物のタンデム型質量分析を、陽イオンモードで、そしてタンデムスペクトル（ｔａｎｄｅｍ ｓｐｅｃｔｒａ）を得るために衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いるＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ質量分析計（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ社、コンコード、オンタリオ州、カナダ）工程に連結されたＮａｎｏ ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ社、サニーベール、カリフォルニア州）によって実施した。各サンプルをμｌ １ｍｌずつ注入し、７５ｍｍ直径μｍ Ｐｅｐｍａｐ Ｃ１８カラムを用いて流速２５０ｎｌ／分で分離した。移動相は溶媒Ａ（９５％水、５％アセトニトリル、０．５％ギ酸）および溶媒Ｂ（２０％水、８０％アセトニトリル、０．５％ギ酸）であった。機器は、２秒間フルスペクトルを記録し、次いで、最も強度の強いイオンを選択して次の５秒間ＣＩＤスペクトルを記録する７秒間の運転サイクルを用いる情報依存的取得（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）モードで操作した。スペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ロンドン、イギリス）を用いて解析した。説明した方法による双方のＭＡｂ調製物の解析では、配列の差異は示されなかった。
【００７６】
表１１．ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１およびＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１の質量分析による配列解析
【００７７】
【表１１−１】
【００７８】
【表１１−２】
３．ＬＣ−ＭＳ解析
４ＭグアニジンＨＣｌ中ＩｇＧサンプル（５０μγ）を、サンプルを６０℃で９０分間インキュベートすることによって２５ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。次いで、暗所、室温で１５分間、４５ｍＭヨード酢酸中でサンプルをアルキル化し、そして２２ｍＭ ＤＴＴで反応を停止させた。ＬＣ−ＭＳに先立って、サンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム１Ｌに対して透析し、そして各サンプル５０μｌを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ質量分析計を装備されたＷａｔｅｒｓ２７９５ ＨＰＬＣを使用するＰｏｒｏｓ Ｒ１／１０ ２．１×１００ｍｍカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に注入し、陽イオンモードで解析した。移動相は、（Ａ）０．１％ギ酸および０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ならびに（Ｂ）０．１％ギ酸および０．０１％ＴＦＡを含む１００％ＣＨ３ＣＮであった。溶出（０．２５ｍｌ／分）は、１００分に渡って作られる（Ａ）中（Ｂ）の１０〜６０％の直線勾配によって実施した。
【００７９】
Ｌ鎖の解析により、双方のＭＡｂ調製物が同一の質量（±３Ｄａ）を有することが示された（表１２）。
【００８０】
表１２ ＭＡｂ軽鎖のＬＣ−ＭＳ解析
【００８１】
【表１２】
４．示差走査熱量測定による熱安定性
ニワトリ発現系およびＣＨＯ発現系において作製されたＭＡｂＦ１の熱安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定し、そしてＦｃドメインにおいて脱グリコシル化されたそれらの対応する型と比較した。融解温度（Ｔｍ）の熱量測定は、オートサンプラーと組み合わされたＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ示差走査マイクロカロリメータープラットホーム（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ、ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国）を用いて実施した。サンプルセルの容積は０．１４４ｍＬである。これらの抗体のグリコシル化型および脱グリコシル化型に関する変性データは、濃度２．３μＭのこれらのサンプルを１℃／分の速度で３０℃から９５℃まで加熱することによって得た。これらのタンパク質サンプルは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在した。比較してモル熱容量を得るために、同じ緩衝液を参照セルにおいて使用した。観測された温度記録図をベースライン補正し、また、標準化したデータをＯｒｉｇｉｎ ｖ７．０を用いて解析した。
【００８２】
ＣＨＯおよびニワトリに由来する抗体の変性プロファイルは極めて異なるのに対し、Ｆｃを脱グリコシル化した抗体の変性プロファイルはほぼ同一である（図８）。これらのデータから、ニワトリの管状腺細胞において産生されたＭＡｂＦ１のグリコシル化の方が、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１に結合される糖残基より高い熱安定性を与えることが示唆される。
【００８３】
５．ＣＥ−ＬＩＦによるＭＡｂのオリゴ糖の特性決定
サンプルを１２．５ｍＵのＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）と共に４０℃で一晩インキュベーションすることによってＩｇＧサンプル（１００μγ）からオリゴ糖を遊離させた。使用した条件下で、ＣＨＯ細胞およびニワトリにおいて発現されたＨｕＭＡｂＦ１のＦｃ部分に由来するＮ結合型グリカンが遊離された。ＭＡｂタンパク質を除去するためにエタノール沈殿を実施した後、これらのグリカンを含む上清を減圧遠心分離によって乾燥させ、そして１５％酢酸中１９ｍＭ ＡＰＴＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）およびＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ社）中１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム中に再懸濁した。グリカン標識反応を４０℃で一晩継続させ、続いて、サンプルを水で２５倍に希釈した。ＡＰＴＳで標識したグリカンを、有効長５０ｃｍ、内径５０μｍのＮ−ＣＨＯコーティングキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使用する、逆極性を有するＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ ＣＥシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ社）による、レーザー誘起蛍光法を用いたキャピラリー電気泳動に適用した。サンプルは圧力（８秒）注入し、また、分離は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて、２５ｋＶ、２０℃で２０分間実施した。これらの分離物を、３ｍＷアルゴンイオンレーザーならびに４８８ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を用いるレーザー誘起蛍光検出システム（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて観察した。図９に示すように、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１のオリゴ糖プロファイルは、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１のプロファイルと大きく異なることが判明した。
【００８４】
６．ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳによるＭＡｂのオリゴ糖特性決定
精製した抗体（１００μｇ、各１．０ｍｇ／ｍｌ）を４μｌのＰＮＧａｓｅＦ、すなわちＮ結合型糖質を切断するエンドグリコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社）で処理した。これらのサンプルを３７℃で一晩インキュベートし、次いで、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）に対して一晩透析した。タンパク質は、エタノール沈殿によって除去した。遊離された糖質を、本質的には供給業者のプロトコールに従って、ただし溶出体積を５μｌに減らして、Ｇｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（コロンビア、メリーランド州）製のマイクロカーボンカラムを用いて脱塩した。各グリカンサンプルの１μｌ分取物を、マトリックス溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸または２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と１：１（体積比）で混合し、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上にスポットし、自然乾燥させる。ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦタンデム型解析を用いて、完全な複合糖質の解析を実施した。すべての質量スペクトルは、糖質のクラスの質量（組成）を提供する、ｏ−ＭＡＬＤＩソース２（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ社、コンコード、オンタリオ州、カナダ）を装備したＱＳＴＡＲ ｐｕｌｓａｒ ｉ質量分析計を用いて記録した。双方のＭＡｂのグリカンをプロファイリングした後、各グリカン中で起こり得るグリコシド結合を調査した。高ＣＩＤによる質量スペクトルを、ＴＯＦ／ＴＯＦオプティクスを装備した４７００Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて記録した。高ＣＩＤのＭＳ／ＭＳ実験の場合、衝突エネルギーは１ｋＶに設定した。衝突セルの内部で、選択したオリゴ糖イオンを２×１０−６トルの圧力でアルゴンと衝突させた。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって解析した、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１中の１１種の主要なグリカンの糖質組成および起こり得るグリコシド結合を表１３に要約する。これらのオリゴ糖構造体は、高マンノース型、複合型、およびハイブリッド型のＮグリカンを含むことが判明した。
【００８５】
表１３ 質量分析法による、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１の糖質解析
【００８６】
【表１３】
７．ＨＰＡＥ−ＰＡＤを用いたＨＰＬＣによる単糖解析
表１４ ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１およびＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１の単糖解析
【００８７】
【表１４】
ＩｇＧサンプル（２００μｇ）を、１００℃で４時間、２Ｎ ＴＦＡ（中性糖を推定する場合）または６Ｎ ＨＣｌ（アミノ糖を推定する場合）のいずれかを用いる酸加水分解に供した。サンプルを周囲温度で減圧遠心分離によって乾燥させ、そしてＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ社）による解析の前に２００μｌの水中に溶解した。単糖は、プレカラムのＡｍｉｎｏ ＴｒａｐおよびＢｏｒａｔｅ Ｔｒａｐ（Ｄｉｏｎｅｘ社）付きのＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ４×２５０ｍｍカラムを用いて分離した。手順は、Ｄｉｏｎｅｘ社の技術注記５３に従った。単糖のピーク一致および相対存在量は、単糖標準物質（Ｄｉｏｎｅｘ社）を用いて決定した。表１４に要約したようなニワトリおよびＣＨＯにおいて産生されたＭＡｂＦ１の単糖解析により、糖質組成の差異が明らかになり、また、ニワトリにおいて産生されたＭＡｂＦ１中にＮ−アセチルグルコサミン残基、マンノース残基、および極めて含有量の少ないガラクトース残基が存在することが示された。
【００８８】
８．化学的諸特性の要約
要約すれば、Ｎ結合型オリゴ糖プロファイルにおける最も目を引く差異は、ニワトリにおいて産生された抗体中に高マンノース型のＮ−グリカンが存在し、フルコースは存在せず、またガラクトース残基の含有量が極めて少ないことであった。これらの特性はいくつかの理由から重要である。第１に、抗原性であることが公知であるα１−３ Ｇａｌ結合の証拠がない。典型的には約２％未満のレベルまでガラクトース濃度が低下すると、ガラクトースを含む結合に起因する抗原性が実質的に減少する。第２に、同じく抗原性であることが公知であるＮ−グリコリルノイラミン酸残基の証拠がない。第３に、ニワトリ管状腺細胞において産生された抗体には、抗体のＡＤＣＣ活性を高めるフコシル残基が実質的にない。この文脈において、実質的にないとは、０．１％未満と定義される。第４に、ニワトリに産生された抗体は、典型的には４０％を上回る高いマンノース含有率を有し、これは、ＣＨＯ細胞において産生された抗体を標準物質として用いてＢａｌｂ／ｃマウスにおいてクリアランスを評価した場合のこの抗体のクリアランス速度を速める。これらの有利な化学的諸特性に加えて、これらの抗体は、ニワトリゲノム中にランダムに組み込まれるか、または組織特異的な様式で発現されない導入遺伝子を用いた場合には観察されない濃度で卵白中に存在する。好ましい濃度は卵１個当たり抗体１ｍｇより高く、卵１個当たり２ｍｇより高く、卵１個当たり３ｍｇより高く、また、卵１個当たり６ｍｇもの高さである。各卵は約２５ｍｌの卵白を含むため、好ましい濃度は４０μｇ／ｍｌより高く、８０μｇ／ｍｌより高く、１２０μｇ／ｍｌより高く、また、２４０μｇ／ｍｌもの高さである。
【００８９】
（実施例７）
卵白からの抗体の抽出および精製
最初に、室温で３０分間、卵白を低剪断速度で混合し、次いで、以前に説明されている改良法によってオボムチンを沈殿させた。１体積のホモジナイズした卵白懸濁液を３倍体積の逆浸透水に添加し、３０分間攪拌した。希釈した懸濁液を、０．５Ｍリン酸を用いてｐＨ６．０に調整し、次いで１２，１００ｇで２０分間遠心分離した。この方法によって主としてオボムチンを含有する卵白タンパク質の約３％を回収した。０．５Ｍリン酸水素二ナトリウムを用いて上清をｐＨ７．４に調整し、そして結晶塩を用いて塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭに調整した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、線流速１２０ｃｍ／時でヒトＩｇＧを精製した。吸着されたヒトＩｇＧを５カラム容量のローディング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、３ｍＭリン酸を用いて溶出させた。２３０ｍＭ ＮａＣｌを含有する６０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いて、溶出されたヒトＩｇＧ画分をｐＨ７．５に調整して、最終濃度を４０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌとした。次いで、サンプルを０．２ｍｍシリンジフィルター（Ｐａｌｌ社）に通してろ過した。図１０に示すように、精製した物質の大半は、９０％を超える純度を有する（ＥＬＩＳＡおよびＡ２８０によって決定、データは示さず）、完全に構築されたＨ２Ｌ２であった。
【００９０】
（実施例８）
結合親和性に関するアッセイ
ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ）上のＰＳＭＡを、結合を分析するための抗原として使用した。ウェル当たり２０万個の細胞を、指定した濃度の５０μｌずつの抗体と共に、デュプリケートで３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、希釈度１：２００のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をウェル当たり５０μｌ、４℃で３０分間、添加した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡに対するＭＡｂ結合のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を利用して、結合曲線から決定した。細胞は、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ニワトリ管状腺細胞において産生されたＭＡｂＦ１の抗原結合特性を、ＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１の抗原結合特性と比較した。どちらの抗体調製物も、ＬＮＣａＰ細胞上で発現されたＰＳＭＡに対してほぼ同一の結合曲線を描き、ＥＣ５０値は類似していた（図１１）。このデータにより、ニワトリに由来する抗体およびＣＨＯに由来する抗体はグリコシル化の様式は異なるが、同等に抗原を認識し、結合することが実証される。
【００９１】
（実施例９）
抗体内部移行のアッセイ
ＰＳＭＡへのＭＡｂＦ１の結合は、抗体の内部移行を招く。潜在的な１つの応用において、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を標的とし、そして破壊するために、ＭＡｂを細胞毒と結合させることができる。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡに対する抗体結合の内部移行は、ＭＡｂおよびＨｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に細胞をインキュベートすることによって判定した。ＨｕｍＺａｐは、リボソーム不活性化タンパク質であるサポリンに結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体である。ＭＡｂＦ１／Ｈｕｍ−Ｚａｐ複合体が細胞表面上のＰＳＭＡに結合し、そして内部移行された場合に細胞は死滅するが、抗体またはＨｕｍ−Ｚａｐは単独ではＬＮＣａＰ細胞に対して毒性ではない。３００ｎｇのＨｕｍ−Ｚａｐ、および３００ｎｇのＦ１ＭＡｂまたは対照ＭＡｂを含む培養培地１５０μｌ中で、３７℃で４８時間、トリプリケートでＬＮＣａＰ細胞（１０，０００／ウェル）をインキュベートした。細胞の増殖および生存は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定した。ウェル当たり１０，０００個のＬＮＣａＰ付着細胞と共に、細胞培養培地中の抗体希釈物を４℃で２時間インキュベートすることによって内部移行アッセイも実施した。抗体溶液を穏やかに除去し、ＨｕｍＺａｐ ２００ｎｇを含有する培地１５０μｌに交換した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、細胞生存率を決定した。抗体内部移行に対するＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いてグラフから決定した。図１２に示すように、双方の抗体調製物が同様の効率で内部移行された。一連の抗体濃度に渡って試験した場合、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１およびＣＨＯに由来するＭＡｂＦ１の双方の内部移行に対するＥＣ５０値は０．４９ｎＭであった。
【００９２】
（実施例１０）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＡｂのクリアランス
放射標識した抗体の静脈注射により、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ニワトリに産生されたＭＡｂＦ１のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、ＣＨＯに産生された抗体と並行して解析した。ＭＡｂタンパク質１０μｇを、Ｉｏｄｏｂｅａｄ法（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、１２５Ｉで少しヨウ素標識した（抗体当たり１個未満のＩ）。６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）に、実験前の１週間、飲料水に溶かした０．１ｍｇ／ｍｌヨウ化カリウムを与えた。タンパク質当たり４匹のマウスの尾静脈に約６００，０００ｃｐｍの標識ＭＡｂを静脈注射し、そして全身ガンマカウンター（Ｗｍ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ社、Ｌｕｄｌｕｍ社製計数器付きＮａＩ結晶検出器）を用いて、選択された時間に全身の放射能を測定した。半減期は、指数関数的回帰分析または残留放射能に基づいて算出した。図１３に示したように、ニワトリ管状腺細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、１０２．４±０．９時間の半減期（ｔ１／２）で浄化されたのに対し、ＣＨＯ細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、より緩徐に浄化され、半減期は２０７．５±１８．３時間であった。
【００９３】
（実施例１１）
ＡＤＣＣのアッセイ
改良された５１ＣｒＡＤＣＣアッセイにおいてＬＮＣａＰ−Ｃ４２Ｂ細胞を試験した。標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離法によってヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に（１×１０Ｅ６細胞／ｍＬで）再懸濁し、そして３７℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を回収し、培養培地中で１回洗浄し、そして２×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。２００万個のＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ標的細胞を、総体積１ｍｌ中の２００ｕＣｉ ５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートする。標的細胞を１回洗浄し、培地１ｍｌ中に再懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベートする。最終のインキュベーションの後、標的細胞を１回洗浄し、そして最終体積を１×１０５細胞／ｍＬにする。最終のＡＤＣＣアッセイのために、標識ＬＮＣａＰ細胞１００μｌをエフェクター細胞５０μｌおよび抗体５０μｌと共にインキュベートする。標的とエフェクターの最終比率は１：１００を選択した。すべての研究において、対照のヒトＩｇＧ１アイソタイプを試験し、ＣＨＯに由来する抗ＰＳＭＡ ＭＡｂＦ１抗体と比較した。含まれる他の対照は、ａ）標的細胞およびエフェクター細胞、ただし抗体はなし、ｂ）エフェクター細胞を伴わない標的細胞、ならびにｃ）３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下の標的細胞およびエフェクター細胞である。３７℃で４時間インキュベーションした後、上清を回収し、２４０〜４００ｋｅＶの読取領域を有するガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製のＣｏｂｒａ ＩＩオートガンマ）を用いて計数した。抗体濃度の関数としてカウント毎分をプロットし、そしてこのデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた非線形回帰、すなわちＳ字形用量反応（可変勾配）によって解析した。溶解率は以下の式、すなわち、溶解率（％）＝（サンプルＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）／（ＴｒｉｔｏｎＸ ＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）×１００によって決定した。本発明者らは、すべての研究においてＥＣ５０値および溶解率の双方がモニターされることが重要であることを発見した。例えば、２種の抗体を比較する場合に、ＥＣ５０値もしくは溶解率または双方が変化している可能性がある。
【００９４】
抗ＣＤ１６抗体によるＡＤＣＣの阻害を、以下の改変法を用いて実施した。５□ｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８または対照のアイソタイプ抗体の不在下または存在下で、１□ｇ／ｍｌまたは０．０１□ｇ／ｍｌの、ＣＨＯに産生されたＭＡｂＦ１抗体またはニワトリに産生されたＭＡｂＦ１抗体と共に、細胞をインキュベートした。
【００９５】
図１４は、ＣＨＯに由来するＭＡｂが用量依存的な細胞溶解を誘導することを示し、ＩＬ−２で刺激されたエフェクター細胞の場合、３８％の溶解で頭打ちになり、ＥＣ５０は０．１１μｇ／ｍｌである。一方、ニワトリの卵に由来するＭＡｂは、より強力かつより効果的であった。ニワトリの卵に由来するＭＡｂの最大溶解率は、抗体の２種の異なる調製物において６０％であった。この物質のＥＣ５０は０．０１８μｇ／ｍｌであったため、ＣＨＯに由来するＭＡｂを上回る高い力価も実証された。最後に、予想されるように、対照のアイソタイプ抗体は細胞溶解を誘導しなかった。刺激されていないエフェクター細胞（新鮮なＰＢＭＣ）のＡＤＣＣの方が、ＥＣ５０値の差はより大きいが、全体的な細胞死滅のレベルは劣る（図１５）。
【００９６】
ＣＤ１６（ＦＣｇＲＩＩＩ）は、ＡＤＣＣを媒介する重要なレセプターである。ＡＤＣＣ応答の特異性は、ＣＤ１６を対象とするモノクローナル抗体を用いて標的細胞とエフェクター細胞の相互作用を妨害することによって示した。本研究においては、２種の用量、すなわち飽和用量（１μｇ／ｍｌ）および最適以下の用量（０．０１μｇ／ｍｌ）のＭＡｂＦ１抗体を使用した。１μｇ／ｍｌのＭＡｂＦ１抗体は、抗ＣＤ１６抗体の不在下で、ＣＨＯに由来する抗体およびニワトリに由来する抗体の場合、それぞれ約１５％および３８％の溶解を誘導した。この溶解率は、抗ＣＤ１６抗体の存在下では約４％に減少したが、対照のアイソタイプ抗体は影響を及ぼさなかった（図１６）。
【００９７】
（実施例１２）
ＣＤ１６結合
ＣＨＯおよびニワトリに由来するＭＡｂＦ１を、Ｂｉａｃｏｒｅ社によって提供されるアミンカップリングキットを用いて、一級アミンを介してＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ（ＣＭ５）のカルボキシメチルデキストランマトリックス表面に固定化した。どちらの抗体も、約１０，０００ＲＵの密度まで塗った。固定化した抗体表面上にいくつかの濃度のタンパク質を流しかけることによってこれら２種の抗体とＣＤ１６−ＰｈｅおよびＣＤ１６−Ｖａｌとの結合を起こさせた。空白の表面および純粋な緩衝液の結合サイクルを考慮することによって非特異的結合の効果を説明した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を希釈用および泳動用緩衝液として使用した。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ−３０００機器を用いて２５℃で実施した。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって解析し、また、平衡解離定数を推定するために、単一結合部位モデルにデータを適合させた。
【００９８】
高速動態が、抗体へのＦｃＲ結合の特徴的な特色であるため、解離定数は、速度定数ではなく平衡結合実験に基づいて推定した。ＫＤの推定のために使用した曲線適合を図１７に示す。ニワトリに由来する抗体の解離定数ＫＤは、ＣＨＯ由来の対応する抗体と比べて、どちらのＦｃＲに対しても約１０分の１の小ささである。ニワトリに由来する抗体のより高い親和性は、Ｆｃ領域のグリコシル化の差異に起因している可能性があり、特に、ＣＨＯに由来する抗体中には存在するフコースがないことが寄与している可能性がある。
【００９９】
（実施例１３）
治療的有用性
本発明は、具体的に定められたグリコシル化パターンおよび他の化学的諸特性を有し、そして前述の遺伝的に改変されたニワトリを用いて作製された抗体を提供する。これらの特性により、標的組織中の抗原特異的な標的に結合させる目的で患者に投与した場合の治療特性が改善される。具体的には、上記のように、いくつかの臨床適応症に対して、これらの抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を示し、また、この効果はいくつかの臨床適応症において重要な利点を与える。
【０１００】
いくつかのタイプの癌の治療に対する非結合型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験では、有望な結果が得られた。Dillman、1997年、Cancer Biother. & Radiopharm.１２巻：２２３〜２２５頁；Deoら、１９９７年、ImmunologyToday １８巻：１２７頁。キメラの非結合型ＩｇＧ１は、軽度または濾胞性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫（Dillman、１９９７年、前記）用に認可されており、さらに、別の非結合型ｍＡｂ、すなわち充実性乳房腫瘍を標的とするヒト化ＩｇＧ１もまた、臨床試験の第ＩＩＩ相において期待できる結果を示した。Deoら、１９９７年、前記。これら２種のＭＡｂの抗原は、それぞれの標的組織において高発現される。このような応用の場合、特に、抗体がＡＤＣＣによって強力な腫瘍破壊を媒介する腫瘍細胞において、本発明の抗体は、患者に投与した際の治療的利点を与える。
【０１０１】
治療的用途のために、本発明の抗体を、（例えば、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体を作製するために）別の抗体、（例えば、免疫毒素などの免疫複合体を作製するために）細胞毒、細胞性リガンド、または抗原など１種または複数種の分子単位に、（例えば化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、もしくは別の方法によって）機能的に連結することもできる。本発明の抗体は、他の治療的部分、例えば放射性同位体、低分子抗癌薬、抗炎症剤、細胞毒、または免疫抑制剤に連結することができる。したがって、本発明は、ニワトリ発現系によって可能にされる化学的諸特性を有し、そして治療的用途のために、本質的にすべて公知の抗体結合、連結、および関連した技術と組み合わされた、抗体組成物を包含する。
【０１０２】
したがって、本発明の抗体は、特にＡＤＣＣ機序が標的組織において提示される場合、治療への感受性が高い標的組織において抗原を発現する細胞を伴う様々な疾患を治療および／または予防するために使用することができる。治療（例えば寛解）または予防することができる例示的な疾患には、それだけには限らないが、充実性腫瘍、リンパ腫、びまん性腫瘍、およびすべてのタイプの癌組織が含まれる。
【０１０３】
本発明の治療的実施形態では、ＡＤＣＣの特性を提示する様式による、治療されると思われる状態の診断に具体的に従って、本発明の抗体を患者に投与する。このような臨床現場では、本発明の抗体を投与し、そして治療後に治療の細胞傷害効果を決定して、標的組織におけるＡＤＣＣ効果を決定する。本発明の治療用組成物に加えて、化学療法剤、放射線、またはサイトカインなど、Ｆｃ受容体の発現もしくは活性を調節、例えば増大もしくは阻害する作用物質で、患者をさらに治療してよい。治療期間中に投与するための典型的なサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。典型的な治療用物質としては、とりわけ、ドキソルビシン、シスプラスチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなどの抗悪性腫瘍剤が挙げられる。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、ニワトリにおいて発現された本発明の抗体の１つまたは組合せを含む薬剤組成物を提供する。本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。製薬上許容される担体としては、無菌の水性溶液または水性分散液が挙げられ、薬剤として有効な物質に対するこのような媒体および作用物質の使用は当技術分野において公知である。無菌の注射液剤は、適切な溶媒中の必要とされる量の活性化合物を１つの成分または成分の組合せと混合し、続いて滅菌および／または精密ろ過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本となる分散媒および他の任意の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。
【０１０５】
投与計画は、最適な所望のＡＤＣＣ効果を提供するように調整する。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に用量を減少もしくは増加させてもよい。単位剤形の非経口組成物を調製することは、投与の容易さおよび投薬量の均一性に対して特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療しようとする対象者に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬剤用担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特徴および達成すべき個々の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の治療のためにこのような活性化合物を配合する技術分野につきものの制約によって必然的に決められ、そして、直接的に依存している。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を実現するのに効果的であり、患者に対する毒性はない有効成分の量を得るために、変更してよい。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排出速度、治療の持続期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野において周知である同様の因子を含めて、様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【０１０７】
本発明の抗体の投与効果は、腫瘍などの標的組織において客観的に観察可能であるため、本発明の治療的方法は、具体的にはＡＤＣＣを使用する治療法を含む治療法を必要とする患者を診断するステップと、効果が望まれる標的組織を同定するステップと、本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与するステップと、患者の標的組織におけるＡＤＣＣの有効性を判定することなどによって患者における治療効果を測定するステップとを含む。治療効果の判定は、細胞死、標的組織の収縮、腫瘍サイズの縮小など標的組織の特性の経時的な変化を分析することによっておよび医薬分野において公知である他の任意の診断技術によって実現することができる。
【０１０８】
本発明の抗体はまた、当業者が利用可能ないくつかの公知のＡＤＣＣモデルのうちのいずれかにおいてＡＤＣＣ活性を試験することもできる。治療的用途または診断的用途に対する本発明の抗体の有用性を判定するために、ＡＤＣＣの測定を独立に実施してもよく、または他の哺乳動物、非哺乳動物、植物、もしくは細菌細胞の発現系と比較してもよい。したがって、本発明の方法は、前述の系において産生された別の抗体と直接または間接的に比較して本発明の抗体を使用することによってＡＤＣＣをもたらすための有用性の差異を判定するステップを含む。具体的には、この方法論は、前述のニワトリ発現系において産生された抗体のＡＤＣＣ効果を比較して、増強されたＡＤＣＣを同定し、ニワトリ発現系のための理想的な抗体候補を同定するステップを含む。
【０１０９】
上記のように、治療的有用性を向上させるために、本発明の抗体は、１種または複数種の他の治療物質、例えば、細胞障害性物質、放射毒性物質、または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、（免疫複合体として）作用物質に連結されてもよく、または作用物質と別々に投与されてもよい。後者の場合（個別投与）、抗体は、作用物質の前、後、もしくは同時に投与してよく、または他の公知の治療法、例えば抗癌療法、例えば放射線療法と同時に投与してもよい。このような治療用物質としては、とりわけ、ドキソルビシン、シスプラスチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなどの抗悪性腫瘍剤が挙げられる。本発明の抗体と化学療法剤との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞障害効果をもたらす、異なる機序を介して機能する２種の抗癌物質を提供する。このような同時投与により、薬物に対する耐性の発達、または抗体との反応性を低下させると考えられる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題が解決され得る。
【０１１０】
当業者には明らかであろう、開示した本発明の様々な修正、改良、および応用があると考えられ、かつ本出願は、法律によって許容される範囲まで、そのような実施形態を包含する。いくつかの好ましい実施形態において本発明を説明したが、本発明の完全な範囲はそのようには限定されず、以下の特許請求の範囲に従う。すべての参考文献、特許、または他の刊行物は、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ニワトリＥＳ細胞の特徴的な形態を示す。細胞は単層で増殖し、細胞質はほとんどなく、核小体が目立っている。
【図２】図２は、ニワトリＥＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性、具体的には、抗体ＳＳＥＡ−１およびＥＭＡ−１との反応、ならびにアルカリ性ホスファターゼの発現を示す。
【図３】図３は、１８９日間培養されたニワトリＥＳ細胞の核型である。これらの細胞は２倍体であり、３８対の常染色体および１対のＺ染色体を有する。
【図４】図４は、横斑ロックヒヨコ２匹、および横斑ロックＥＳ細胞を白色レグホーンのレシピエント胚中に注入することによって形成されたキメラ２匹である。これらのキメラおよび横斑ロックは区別不能であることから、メラノサイト系列へのＥＳ細胞の寄与が多大であることが示される。
【図５】図５は、横斑ロックＥＳ細胞を白色レグホーンレシピエント中に注入することによって作製されたキメラである。左のパネル中のキメラのペアは、メラノサイト系列に対して少しの寄与を示しているのに対し、左のパネル中のペアは、より大きな寄与を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ニワトリの輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実現する導入遺伝子構築物、および組織特異的発現を裏付ける生理学的証拠である。図６Ａは、指定されたＯｖ７．５ＭＡｂｄｎｓを含む導入遺伝子の図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ニワトリの輸卵管の管状腺細胞における組織特異的発現を実現する導入遺伝子構築物、および組織特異的発現を裏付ける生理学的証拠である。図６Ｂは、他の細胞型を除いて、選択的に管状腺細胞においてモノクローナル抗体の発現を示す、組織特異的発現導入遺伝子を含むキメラニワトリの膨大部の切片である。
【図７Ａ】図７Ａは、キメラの脳、腸、膵臓、および筋肉組織を除いて、輸卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の双方の発現をそれぞれ示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、キメラの脳、腸、膵臓、および筋肉組織を除いて、輸卵管におけるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の双方の発現をそれぞれ示すＲＴ−ＰＣＲ解析である。
【図８】図８は、ニワトリおよびＣＨＯ細胞に由来するＭＡｂＦ１の熱安定性を示す。ＣＨＯ細胞に由来するＭＡｂＦ１（左上）およびニワトリ管状腺細胞に由来するＭＡｂＦ１（右上）のＤＳＣデータである。どちらの場合も、３つのピークを有する二状態遷移モデルに当てはまるようにデータをデコンボリュートする（赤色で示す）。ＣＨＯ細胞において発現された抗体に関しては６２．７℃、６９．４℃、および８３．４℃のＴｍ値が得られ、ニワトリに由来する抗体に関しては６３．８℃、６８．５℃、および８３．１℃のＴｍ値が得られた。それぞれのＦｃ脱グリコシル化抗体（それぞれ左下および右下）のＤＳＣデータも同様に二状態遷移モデルに当てはめたが、いずれの場合もピークは２つであり、ＣＨＯにおいて発現された抗体に関しては６１．２℃および８４．０℃のＴｍ値が得られ、ニワトリに由来する抗体に関しては６２．６℃および８４．０℃のＴｍ値が得られた。
【図９】図９は、ニワトリ管状腺細胞およびＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１のオリゴ糖プロファイルを示す。ＣＨＯに産生されたＭＡｂの公知のグリカン構造が示されている。マンノースは黒の円として示され、ガラクトースは白の円として示され、Ｎ−アセチルグルコサミンは黒の四角形と示され、フコースは黒の三角形として示される。
【図１０】図１０は、卵白からのＭＡｂＦ１の精製を示す。１：出発原料、２：プロテインＡ添加、３：プロテインＡ通過、４：プロテインＡ溶出。クーマシー染色およびウェスタンブロットの双方とも、非還元条件下である。ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を、ウェスタンブロットにおける検出のために使用した。
【図１１】図１１は、ニワトリまたはＣＨＯ細胞に産生されたＭＡｂＦ１の、ＬＮＣａＰ細胞上で発現されるＰＳＭＡに対する結合を示す。３２４−Ｅｇｇおよび７４１−Ｅｇｇは、卵から単離されたＭＡｂＦ１の２種の異なる調製物である。Ｆ１−ＣＨＯは、ＣＨＯ細胞によって産生されたＭＡｂＦ１である。抗ＣＴＬＡ４は、ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１の対照ＭＡｂである。
【図１２】図１２は、ニワトリ管状腺細胞およびＣＨＯ細胞において産生されたＭＡｂＦ１の内部移行アッセイである。５７０−Ｅｇｇおよび７４１−Ｅｇｇは、卵から単離されたＭＡｂＦ１の２種の調製物であった。各３００ｎｇ／ウェルのＭＡｂを、Ｈｕｍ−Ｚａｐ（抗ヒトＩｇＧ、サポリン結合体）または細胞培養培地のいずれかと共にＬＮＣａＰ細胞に添加した。ＭＡｂおよびＨｕｍＺａｐの添加後４８時間目に細胞の生存率を決定した。Ｙ軸は、相対発光量（ＲＬＵ）である。
【図１３】図１３は、ニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ）およびＣＨＯ細胞（Ｆ１−ＣＨＯ）において産生されたＭＡｂＦ１のｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹に、放射標識した各抗体調製物を注射した。全身カウンターを用いて、残留放射能を３５０時間に渡って測定した。データは、残存している注射用量のパーセンテージとして表される。
【図１４】図１４は、ヒトＩＬ−２の存在下でニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ調製物ＩおよびＩＩ）ならびにＣＨＯ細胞（Ｆ１）において産生されたＭＡｂＦ１のＡＤＣＣアッセイを示す。ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した。
【図１５】図１５は、ヒトＩＬ−２の不在下でニワトリ管状腺細胞（Ｆ１−ニワトリ調製物ＩおよびＩＩ）ならびにＣＨＯ細胞（Ｆ１）において産生されたＭＡｂＦ１のＡＤＣＣアッセイを示す。ＬＮＣａＰ細胞上の抗原を認識しないヒトＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した。
【図１６】図１６は、抗ＣＤ１６抗体を用いたＡＤＣＣの妨害を示す。
【図１７】図１７は、ニワトリに由来するＭＡｂＦ１（青色）およびＣＨＯに由来するＭＡｂＦ１（赤色）の、ＣＤ１６−Ｐｈｅ（左のパネル）およびＣＤ１６−Ｖａｌ（右のパネル）との平衡結合を示す。解離定数（ＫＤ）の推定値を対応する曲線の近くに示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性ポリヌクレオチドにコードされ、そして遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において選択的に発現され、そして該ニワトリによって産卵された卵中で回収されるモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗体が、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する組成物。
【請求項２】
卵中に含まれる前記モノクローナル抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
マンノース濃度が約４０％より高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
フコシル残基を実質的に含まないモノクローナル抗体を作製するための方法であって、
ニワトリのゲノム中に組み入れられた外因性ポリヌクレオチドを有する遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において該抗体を発現させるステップと、
該ニワトリによって産卵された卵から、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する該抗体を回収するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記抗体のマンノース濃度が約４０％より高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体が、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する、外因性ポリヌクレオチドにコードされたモノクローナル抗体を管状腺細胞において発現する遺伝的に改変されたニワトリ。
【請求項９】
前記抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項８に記載のニワトリ。
【請求項１０】
マンノース濃度が約４０％より高い、請求項８に記載のニワトリ。
【請求項１１】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項８に記載のニワトリ。
【請求項１】
外因性ポリヌクレオチドにコードされ、そして遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において選択的に発現され、そして該ニワトリによって産卵された卵中で回収されるモノクローナル抗体を含む組成物であって、該抗体が、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する組成物。
【請求項２】
卵中に含まれる前記モノクローナル抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
マンノース濃度が約４０％より高い、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
フコシル残基を実質的に含まないモノクローナル抗体を作製するための方法であって、
ニワトリのゲノム中に組み入れられた外因性ポリヌクレオチドを有する遺伝的に改変されたニワトリの管状腺細胞において該抗体を発現させるステップと、
該ニワトリによって産卵された卵から、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する該抗体を回収するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記抗体のマンノース濃度が約４０％より高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体が、少なくとも４０μｇ／ｍｌの濃度で卵白中に存在する、外因性ポリヌクレオチドにコードされたモノクローナル抗体を管状腺細胞において発現する遺伝的に改変されたニワトリ。
【請求項９】
前記抗体がフコシル残基を実質的に含まない、請求項８に記載のニワトリ。
【請求項１０】
マンノース濃度が約４０％より高い、請求項８に記載のニワトリ。
【請求項１１】
ガラクトース濃度が約２％より低い、請求項８に記載のニワトリ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００８−５３２９３９（Ｐ２００８−５３２９３９Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６４１６（Ｐ２００７−５５６４１６）
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９２９４
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（５０７２５７２１９）オリジェン セラピューティクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２１日（２００６．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００６２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９２９４
【国際公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（５０７２５７２１９）オリジェン セラピューティクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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