ノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物
本発明は、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌（ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して該動物を防御するための医薬組成物であって、ノカルジオフォーム放線菌種の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）と、これらの生細菌のための医薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジオフォーム放線菌（ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物に関する。本発明はまた、該組成物を製造するための、この群の生弱毒化細菌の使用、およびこの組成物での動物の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクチノバクテリア綱の細菌には、一般に放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）と称される、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）と呼ばれる細菌目が存在する。この目に属する細菌は、高いＧ＋Ｃ含量を有する糸状グラム陽性細菌である［しかし、例えば、放線菌目マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する多数の種の場合のように、幾つかの種は、古典的なグラム染色に好適でない又は更には不適当な複雑な細胞壁構造を有する］。種々の株は、植物、およびヒトを含む動物に生息するが、それらは土壌生息生物として最もよく知られている。それらは、気菌糸体または菌糸にしばしば結合している耐性胞子を産生する。放線菌は有機物質の分解において重要な役割を果たしている。幾つかの種は、それらの特徴的な特性のため、産業および医薬研究において使用される。
【０００３】
ほとんどの放線菌は動物（本発明に関して用いられる動物なる語はヒトを含む）に対して非病原性である。しかし、放線菌の多数の亜目［すなわち、ストレプトスポランジネエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｎｅａｅ）、ミクロコクシネエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａｅ）、ストレプトマイシネエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ）およびフランキネエ（Ｆｒａｎｋｉｎｅａｅ）］のなかには、多くの非病原性細菌と共に相当数の動物病原体を含む１つの亜目、すなわち、コリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）が存在する。これらの病原体は、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科を含むノカルジオフォーム放線菌として公知の系統群内に存在するらしい（とりわけ、題名：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ ｅｑｕｉ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｉｎ“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９の第１１章を参照されたい）。注目すべきことに、これらの病原体による感染に関連した疾患の大部分に対しては、利用可能な適当な予防方法（すなわち、疾患に罹患するのを予防し又は該疾患の影響を少なくとも軽減しうる、疾患を引き起こす病原体に対する曝露の前またはそれと実質的に同時の処置）がほとんど存在しない。近年、ノカルジオフォーム放線菌の系統群のマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科はコリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）亜目内の非常に密接に関連した科であるという認識が確認された（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｓｅｎｉｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｍａｒｅｌｌｅ Ｌ．Ｙｅｈｕｄａ，Ｊｕｎｅ ２，２００５をも参照されたい）。特にこの群内の病原性細菌、少なくとも、適当な予防的治療が存在しない病原性細菌［例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）およびロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）］は以下の重要な特性を共有することも明らかになっている：すなわち、感染は典型的には皮膚または粘膜を介して生じ、ついで該細菌はマクロファージ内に広がり、これらのマクロファージ内で複製される（とりわけ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７，２００５，１３５２−１３６３；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｎｏ ２３，ｐｐ ８３２７−８３３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３，２８２−２８４，２００７；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３６，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｊｕｎｅ ２００４，ｐｐ １４１５−１４１８を参照されたい）。実際にマクロファージは微生物感染に対する宿主免疫防御の最前線に位置するが、宿主内で生存するためには食作用の回避に頼る細菌とは異なり、この群内のここで意図される病原性細菌は、宿主内で生存し複製されるためにマクロファージを標的化するのである。本発明は、本発明の場合にはマクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌と称される、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するこれらの細菌に関する。
【０００４】
マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌は、微生物に対する動物の防御の決定的な機能を逃れるように進化してきたようである。特に、結核の原因微生物であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、インビボでのその主要ニッチとしてマクロファージを成功裏に利用している種であるが、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含むノカルジオフォーム放線菌に属する他の細菌種も同じ戦略を採っている。これらは、例えば、ブルリ潰瘍を引き起こすマイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ウシにおいてヨーネ病を引き起こしヒトにおけるクローン病に関連づけられているマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ結核を引き起こすマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、エイズ患者のような免疫無防備状態の患者の日和見感染に関連づけられているマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、魚類においてノカルジア症を引き起こすノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）およびノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉａ）、腎移植レピシエントにおける感染を引き起こすノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、子ウマ（幼いウマ科動物）において肺炎を引き起こし免疫無防備状態の患者における日和見感染にも関連づけられているロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）［かつてはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）として公知であった］、ヒツジ、ヤギ、ウマ、そしてまた、時にはヒトの肺における膿瘍を引き起こすコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などである。これらの細菌種の全ては、マクロファージ内で生存し、それに感染し、このタイプの宿主細胞内で複製される能力を共有する。
【０００５】
この特徴的な特性は、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害（本明細書においては「障害」なる語は「疾患」と同等な語として用いられる）の治療を著しく妨げる。多くの場合、臨床徴候が実際に存在する場合には治療は抗生物質を使用して行われる。しかし、これは難題である。なぜなら、マクロファージ内には相当な量の該細菌が存在し、抗生物質がそれに到達するのは困難だからである。したがって、抗生物質での治療は、しばしば、長い治療期間を要し、その成否は様々である。ヒトにおける結核、魚類におけるノカルジア症および子ウマにおける肺炎のような疾患では、予防的治療が好ましいであろう。そのような予防的治療は典型的には、野生型細菌に由来する不活化または生弱毒化細菌を含むワクチンの使用によるものである。マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に関しては、不活化（死菌）ワクチン（すなわち、死んだ細菌またはその１以上のサブユニットを療法因子として含むワクチン）は成功をもたらさないことが判明している。現在、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に対する予防的治療の成功のためには生細菌を要すると一般に考えられている。なぜなら、これらのみが、マクロファージに到達する能力、および適度な免疫応答を誘発するのに十分な程度に野生型細菌を模擬する能力を有しうるからである。実際、結核を治療するためには、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に非常に密接に関連しているマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）種に基づく生ワクチン（ＢＣＧ，カルメット・ゲラン桿菌）が利用可能である。しかし、防御効果は優れたものではない。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）およびノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）のようなノカルジアセエ科の種に関しては、現在、商業的に入手可能なワクチンは存在しない。コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に関しては、自己ワクチンを使用する防除が試みられているが、その成否は様々である（ＲＵＭＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００６）。
【０００６】
マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための適当な予防的治療が明らかに必要とされている。この意味における治療は、野生型微生物でのチャレンジの負の効果を少なくとも軽減するのに十分な程度に標的動物の免疫系を刺激することを意味する。その目的は、これが該障害に対する防御を招くこと、すなわち、該障害が予防され、または少なくとも、該動物における感染または疾患の臨床徴候のレベルが低下し、結果的に疾患の重症度も低下することである。マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌が宿主内での生存のために同じ戦略を採っていることは、これらの細菌による感染に対する予防的治療のための共通の戦略の着想をもたらす。
【０００７】
この点に関しては、コレステロール代謝がマクロファージにおけるノカルジオフォーム放線菌の生存において極めて重要な役割を果たしており、重要なビルレンス（毒性）因子でありうる、と文献に記載されていることが注目される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２）。この代謝は、病原性株と戦うための新規治療用物質、すなわち、感染が生じた後の治療のための薬物の論理的標的となることも示唆された。実際、先行技術を精査してみると、全てのマクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に関して、宿主マクロファージ内での該細菌の生存および維持においてコレステロール代謝が或る役割を果たしているという確立された事実を裏付ける他の証拠が見出される。例えば、第１１章（題名：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ ｅｑｕｉ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｉｎ“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）からは、幾つかのノカルジオフォーム放線菌により引き起こされる感染の間には臨床総体症状における大きな類似性が存在することが公知であり、コレステロールオキシダーゼがビルレンス因子の酵素成分であることが確認された。Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５６，Ｉｓｓｕｅ ３−４，Ｊｕｎｅ １９９７，２６９−２７６には、該コレステロールオキシダーゼ過程にはロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）と共にコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が関与することが示されている。
【０００８】
したがって、一見したところでは、そのことは、コレステロール代謝がマクロファージ内のこれらの細菌の生存において極めて重要な役割を果たしているという認識により、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物（そのような組成物はワクチンとも称されうる）を開発する気にさせそうである。しかし、前記で言及したＰＮＡＳ論文（２００７年の論文）においてなされている示唆は薬物に関連しており、したがって、該細菌のコレステロール代謝を妨げることにより該細菌を完全に殺すことを目的としていることを認識すれば、同じ戦略に従うことは生ワクチンには不適と思われる。すなわち、複製の必須部位における該細菌の生存を阻害することにより細菌を弱毒化することを試みると、該細菌は複製されず、宿主動物内に存続するであろう。確かに、薬物での治療の場合には、これは理想的な状況である。しかし、生ワクチンの場合には、該細菌の生存を完全に阻止すると、不活化細菌を含むワクチンを模擬すると予想される。
【０００９】
そのようなワクチンは、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に対する治療には成功しないことが判明している。野生型病原性ナカルジオフォーム放線菌でのチャレンジに対して動物を防御するための医薬組成物における、コレステロール代謝において欠損した生細菌の使用を評価するための試みが尚も行われている。そのような試みの一例は、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株１０３＋（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８，２００６，ｐｐ ２４０−２４６）のコレステロールオキシダーゼ（ＣｈｏＥ）突然変異体に基づく生ワクチンである。この試みは成功しなかった。しかし、それは、前記で言及したＰＮＡＳ論文（ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２）の技術的教示に基づいて予想されるとおり、それが防御を誘導しなかったからではなく、該突然変異株が尚も強すぎる毒性を示したからである。該突然変異体は尚も、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）に匹敵するレベルでマクロファージ内で生存し増殖することが可能であった。また、このコレステロール欠損突然変異体の抗原負荷は野生型生物の場合に匹敵するようであった。したがって、該突然変異体は尚も疾患を誘発する能力を有していた。一方、実際に、コレステロールを全く取り込み得ない生突然変異ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）［Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，４ｔｈ Ｈａｖｅｍｅｙｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１３−１６ Ｊｕｌｙ，２００８、およびＶａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら：“Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｍａｒｋｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｕｓｉｎｇ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ８１１（更に、“Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８”とも称される）に提示されているステロール取り込みパーミアーゼ突然変異体ｓｕｐＡＢ］［これは、（少なくとも出発化合物としてコレステロールが使用される場合）完全なコレステロール代謝が遮断されていることを意味する］は尚もマクロファージ内で生存し存続することが可能であり（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）、したがって強すぎる毒性を有することが確認されている。生ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を弱毒化するためには、コレステロール代謝以外に影響を及ぼす追加的な突然変異を必要とするらしい（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ：Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２５，２００７，１００−１１０）。これらの結果に基づいて、コレステロール代謝自体は重要なビルレンス因子ではなく、これらの細菌を十分に弱毒化するためには利用できないと結論づけられた。コレステロール代謝における突然変異を有する細菌は、野生型生物と同じ又は少なくとも比較しうる抗原負荷を有するらしく、したがって、（対象動物が該突然変異細菌でのチャレンジの後で生存した場合には）適度な防御をもたらしうるものの、医薬組成物中で使用されるには余りにも強すぎる毒性を有する。したがって、コレステロール代謝に関与する遺伝子を不活化することにより弱毒化された生細菌を含有する予防的治療用の医薬組成物を目標とすることは、袋小路に入るようなものだと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９，第１１章
【非特許文献２】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｓｅｎｉｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｍａｒｅｌｌｅ Ｌ．Ｙｅｈｕｄａ，Ｊｕｎｅ ２，２００５
【非特許文献３】Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７，２００５，１３５２−１３６３
【非特許文献４】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｎｏ ２３，ｐｐ ８３２７−８３３２
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３，２８２−２８４，２００７
【非特許文献６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３６，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｊｕｎｅ ２００４，ｐｐ １４１５−１４１８
【非特許文献７】ＲＵＭＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００６
【非特許文献８】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２
【非特許文献９】Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５６，Ｉｓｓｕｅ ３−４，Ｊｕｎｅ １９９７，２６９−２７６
【非特許文献１０】Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８，２００６，ｐｐ ２４０−２４６
【非特許文献１１】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，４ｔｈ Ｈａｖｅｍｅｙｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１３−１６ Ｊｕｌｙ，２００８
【非特許文献１２】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｍａｒｋｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｕｓｉｎｇ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ８１１
【非特許文献１３】Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２５，２００７，１００−１１０
【発明の概要】
【００１１】
しかし、驚くべきことに、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するために、ノカルジオフォーム放線菌種［典型的には、感染細菌と同じ種、あるいはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）とマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）との場合のように非常に密接に関連していて多数のＴ細胞エピトープを共有する種である］の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）と、該細菌を運搬するための医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を使用しうることを、本出願人は見出した。
【００１２】
この場合における「弱毒化」は、該弱毒化細菌のビルレント（しばしば、野生型）病原性対応物に通常関連している疾患の完全な症状を誘導し得ないことを意味する。本発明の場合における「不活化（不活性化）」は、例えばオペロン（すなわち、タンパク質を機能的レベルで実際に発現するのに必要な遺伝子の組）の一部である遺伝子がゲノムから完全に除去されている、または変化していて（いずれかの公知の又は更には今後案出される技術により；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｎａｉｒ，ＩＮＦＩＮＩＴＹ ＳＣＩＥＮＣＥ ＰＲＥＳＳ ＬＬＣ，２００８，ｃｈａｐｔｅｒ １３“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，ｐｐ ４７６−４９６およびｃｈａｐｔｅｒ １５“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，ｐｐ ５６３−６１２を参照されたい）、それが対応野生型タンパク質を、もはやコードしていない、または完全な転写に、もはや利用不可能であることを意味し、あるいは該遺伝子がゲノム内のいずれかの他の変化を受けていて、該遺伝子（または適用可能な場合にはオペロン）が、正常な代謝を支持するのに適した形態である状況と比較された場合に、少なくとも、正常なメチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート異化作用を支持するレベルでは、該野生型タンパク質が該弱毒化細菌によりインビボで産生されないことを意味する。本発明の場合における「タンパク質をコードする」は、遺伝子（例えば、オペロンの一部であるもの）が、該タンパク質または該タンパク質のサブユニット（酵素的に活性なタンパク質を一緒になって形成する多サブユニット）を直接的にコードすること、あるいは該遺伝子が、該タンパク質または該タンパク質のサブユニット（酵素的に活性なタンパク質を一緒になって形成する多サブユニット）における、直接的に又は複数の工程により変換される１以上の中間体をコードすることを意味する。「医薬上許容される担体」は、例えばとりわけ無菌状態にされることにより、標的動物に生理的に適合可能な又は許容される、任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌物質、等張および吸収遅延物質などでありうる。そのような運搬媒体の幾つかの具体例としては、水、塩類液、リン酸緩衝食塩水、細菌培養液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。それらは、意図される投与方法に応じて、液体、半固体および固体剤形を与えうる。一般に公知のとおり、運搬媒体の存在はワクチンの効力に必須ではないが、それは該抗原の投与量調整および投与を著しく簡単にしうる。該医薬組成物は、該担体および抗原に加えて、他の物質、例えばアジュバント、安定剤、粘度調節物質または他の成分を含むことが可能であり、該組成物の意図される用途または要求される特性に応じて、それらは添加される。
【００１３】
本発明の医薬組成物中には生細菌が存在し、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子が不活化されるように該細菌は突然変異している。一般に公知のとおり、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート［ＨＩＰまたは３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１，５−インダンジオンとしても公知である］および５−ヒドロキシ−メチルヘキサヒドロインダノンプロピオナート［ＨＩＬまたは３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１−インダノン−δ−ラクトンとしても公知である］は、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌を含むアクチノバクテリアによりコレステロールの分解中に生成される。最近、コリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）亜目に属する細菌種において、ＨＩＰ分解に関与するトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードするオペロン［ｉｐｄＡＢ：インダンジオンプロピオナート分解アルファ＋ベータ（ｉｎｄａｎｅｄｉｏｎｅ ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ ｄｅｇｒａｄｉａｔｉｏｎ Ａｌｆａ＋Ｂｅｔａ）と称される］が特定された（２００７年８月２１日付け出願の米国優先権主張基礎出願に基づく２００８年８月１９日付け出願の同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０８４４を参照されたい）。該公知トランスフェラーゼノックアウト突然変異体は、もはや、ＨＩＰおよびＨＩＬを分解する能力を有さず（前記特許出願の図３を参照されたい）、また、それはＨＩＰ、ＨＩＬまたは４−アンドロステン−３，１７−ジオン上で増殖しない。いずれの場合にも、「ＨＩＰ分解に関与する」は、ノックアウト突然変異体が、もはや、唯一の炭素およびエネルギー源としてのＨＩＰ上で増殖する能力を有さず、あるいは少なくとも、非突然変異細菌により得られうるレベルではＨＩＰ上で増殖する能力を有さないことを意味する。現在のところ、該トランスフェラーゼがＨＩＰ分解自体を異化するのかどうか、また、ＨＩＰ分解が依拠する反応が触媒されるのかどうかは、明らかでない。それでも、ＨＩＰ分解はコレステロール代謝における比較的遅い段階で生じ、コレステロール分解経路における非常に特異的な段階である。コレステロール代謝における突然変異に関する公に入手可能な知見に基づけば（前記のＰｒｅｓｃｏｔｔの文献）、この突然変異は、防御効果をもたらすものの、毒性が余りにも強すぎる生細菌を与える、と予想されるであろう。しかし、本出願人が驚いたことには、そのような突然変異体は適度に弱毒化されているらしく、これはマクロファージ内の該突然変異体の生存能の著しい低下によるものである。ＨＩＰ分解に関与する遺伝子がマクロファージ内の生存におけるそのような重要な役割を果たしている理由は明らかでない。さらに、それは、コレステロール代謝の完全な遮断でさえも、どうやらノカルジオフォーム放線菌のマクロファージ内生存能に対する効果が無いため、乏しい弱毒化効果しか示していない先行技術の結果と矛盾するようである。したがって、この突然変異が、コレステロール異化経路に沿った副次的段階に影響を及ぼし、マクロファージ内の病原性ノカルジオフォーム放線菌の生存能を著しく阻害することを見出したことは、非常に驚くべきことであった。特に、該突然変異生細菌はマクロファージに侵入しそこにおいて存続する能力を尚も有するが（したがって防御免疫応答の刺激は確保される）、それは非常に低レベルであるため、それらのビルレンスは有意に低下するらしく、そしてこのことにより該生細菌は予防的治療に許容されるものとなることが、本発明において見出された。
【００１４】
１つの実施形態においては、１つのオペロン内の複数の遺伝子が不活化されている。複数の遺伝子を不活化することにより、野生型（類似）表現型への該細菌の変化の可能性が減少するであろう。特に、遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢが不活化されている。これらの遺伝子を不活化することにより、有効かつ安全な弱毒化がもたらされうる。好ましい実施形態においては、該不活化は、非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失により少なくとも１つの遺伝子を欠失させることにより実現される。非標識突然変異の利点は、それが同一株における突然変異の反復導入を可能にすることである。該突然変異の導入の過程で外来ＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）が除去される。したがって、第２の突然変異の導入のための新たに導入されるベクターＤＮＡは（ベクターＤＮＡ間の相同組換えによっては）前の突然変異の部位においては組込まれ得ない。組込みは、ベクターＤＮＡが尚も存在すれば、限定的に生じ、多数の偽陽性組込み体を与えるであろう。該系は、莫大な数の突然変異の導入のための唯一の抗生物質遺伝子の使用を可能にする。非標識突然変異はまた、産業における容易な使用を可能にする。なぜなら、異種ＤＮＡが存在しないため、発酵ブロスの容易な使い捨てが可能となるからである。遺伝子欠失による遺伝子不活化は安定な非復帰突然変異体の構築を可能にする。特に小さい遺伝子（＜５００ｂｐ）は単一組換え組込みによる遺伝子破壊より容易に遺伝子欠失により不活化される。遺伝子欠失突然変異誘発は、ゲノムからの幾つかの遺伝子のクラスターを不活化するのに適用されうる。該遺伝子欠失突然変異誘発法は遺伝子置換（例えば、野生型遺伝子を突然変異遺伝子に変化させること）にも適用されうる。
【００１５】
１つの実施形態においては、該細菌はノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）またはマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する。好ましくは、該細菌はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、特に、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種のいずれかに属する。これらの種に関しては、現在のところ、適当なワクチンが商業的に入手できない。本発明は、これらの細菌と戦うための、そしてひいては、それらが動物において引き起こす対応疾患を緩和するためのワクチンとして使用されうる医薬組成物の提供を可能にする。
【００１６】
１つの実施形態においては、該医薬組成物は、経口投与に適した形態である。それは非常に簡便な投与方法であることに加えて、特に、この投与方法は安全であることが明らかとなっている。非経口投与は膿瘍を引き起こしうる。好ましくは、該生細菌は１×１０４〜１×１０１０ ＣＦＵ／用量の濃度で存在する。
【００１７】
本発明はまた、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株に由来するロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌、およびこの株に属する細菌に関する。
【００１８】
本発明はまた、対応する野生型細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物を製造するための、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）の使用に関する。
【００１９】
本発明はまた、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための動物の治療方法に関する。該方法は、ノカルジオフォーム放線菌の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）を含む医薬組成物を動物に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】マクロファージにおける生存を示す。
【図１−２】マクロファージにおける生存を示す。
【図２−１】マクロファージにおける生存を示す。
【図２−２】マクロファージにおける生存を示す。
【図３−１】チャレンジ後の直腸温度を示す。
【図３−２】チャレンジ後の直腸温度を示す。
【図４】肺に関する死後所見を示す。
【図５−１】プライマーオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図５−２】プライマーオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図６】遺伝子の概要を示す。
【図７】チャレンジ後の結果を示す。
【図８】遺伝子の概要を示す。
【図９−１】マクロファージ内の生存を示す。
【図９−２】マクロファージ内の生存を示す。
【図１０】弱毒化実験の結果を示す。
【図１１】効力実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、本発明の具体的な実施形態を記載する以下の実施例を用いて更に詳しく説明される。該実施形態は以下の３つの部にわたる。
Ａ部：株の同定および構築。
Ｂ部：インビボ弱毒化のモデルとしてのマクロファージ生存。
Ｃ部：野生型による感染に対する防御における突然変異細菌の効力。
【００２２】
Ａ部：株の同定および構築
Ａ１ 培地および増殖条件
バクト−トリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）（ＢＤ）、酵母エキス（ＢＤ）および１％ ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）またはミネラルアセタート培地からなるルリア・バータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地内でロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株を３０℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０で補足されたＢＢＬトリプチカーゼダイズブロス（ＴＳＢ；ＢＤ）エム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５（Ｓｎａｐｐｅｒら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１９１１−１９１９）を３７℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。ミネラルアセタート培地（ＭＭ−Ａｃ）は、Ｋ２ＨＰＯ４（４．６５ｇ／ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（１．５ｇ／ｌ）、酢酸Ｎａ（２ｇ／ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（３ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、チアミン（４０ｍｇ／ｌ、濾過滅菌；Ｓｉｇｍａ）およびビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）ストック溶液（１ｍｌ／ｌ）を含有していた。ビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）ストック溶液は、以下のとおりに調製した（ＶｉｓｈｎｉａｃおよびＳａｎｔｅｒ，１９５７，Ｒｅｖ．２１：１９５−２１３から改変）。ＥＤＴＡ（１０ｇ／ｌ）およびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（４．４ｇ／ｌ）を蒸留水（２Ｍ ＫＯＨを使用してｐＨ８）に溶解した。ついでＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１．４７ｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（０．２２ｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．３１５ｇ／ｌ）およびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．３２ｇ／ｌ）をその順序でｐＨ６において加え、最後にｐＨ４で保存した。固形培地上の増殖のために、Ｂａｃｔｏ−寒天（１５ｇ／ｌ；ＢＤ）を加えた。５−フルオロシトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を蒸留水中で調製し、５０℃に加熱することにより溶解し、濾過滅菌し、高圧滅菌培地に加えた。
【００２３】
ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）株ＩＮＳ４３６を、Ｔｗｅｅｎ８０（０．０５％）で補足されたユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）ブロス（ＢＤ）内で２６℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。固形培地上での増殖のために、バクト（Ｂａｃｔｏ）−寒天（１５ｇ／ｌ；ＢＤ）を加えた。ｓａｃＢ依存性スクロース選択のために、スクロース（２％）を該寒天培地に加えた。
【００２４】
Ａ２ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株１０３＋におけるｉｐｄＡ、ｉｐｄＢおよびｆａｄＥ３０ならびにノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢの同定
前記のとおり、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ遺伝子はメチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート［ＨＩＰ；３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１，５−インダンジオン］および５−ヒドロキシ−メチルヘキサヒドロインダノンプロピオナート［ＨＩＬ；３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１−インダノン−δ−ラクトン］の分解に関与することが判明している。ゲノムデータベースにおけるロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＳＱ１のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢのタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析は、ＩｐｄＡおよびＩｐｄＢをコードする遺伝子ならびにそれらの見掛け上のオペロン体制がロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋（Ｊ．Ｆ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手した野生型株；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８（２００６）２４０−２４６において言及されているとおり）のゲノムにおいて保存されていることを示した。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋ゲノム配列はＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにおけるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）配列決定グループにより決定されている（「Ｒ．ｅｑｕｉ １０３Ｓ」として公開されているゲノム）。ゲノム解析は更に、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋がｉｐｄＡおよびｉｐｄＢの追加的なパラログ遺伝子（それぞれｉｐｄＡ２およびｉｐｄＢ２と称される）を含有することを示した。これらの遺伝子はコレステロール異化遺伝子クラスターの外部に位置する。ＩｐｄＡ、ＩｐｄＢ、ＩｐｄＡ２およびＩｐｄＢ２のアミノ酸配列を、それぞれ、添付の配列番号１、２、３および４に示す。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢタンパク質のアミノ酸配列の実体を、これらのパラログおよび幾つかの他のアクチノバクテリア（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）オルソログを表６に示す。この表は、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株１０３＋のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢのオルソログをコードする、ノカルジオフォーム放線菌の他のゲノムにおいて同定された遺伝子の概要を示す。本発明に関しては、これらの及び他のオルソログはＩｐｄＡおよびＩｐｄＢと称される。タンパク質の同一性は、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３ＳのＩｐｄＡとＩｐｄＢとの完全長アミノ酸配列の同一性（％）を示している。アクチノバクテリアゲノム配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の微生物ゲノムのゲノムＢＬＡＳＴサーバーから入手した。該ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋配列データはＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）配列決定グループにより作製された。株１０３＋（１０３Ｓとして公知である）のゲノムをこれらの同定目的に使用した。以下に例示するとおり、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）での実際の研究は、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１［ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）感染により引き起こされる肉芽腫性肺炎に罹患した子ウマから分離されたもの］を使用して行った。
【００２５】
メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナートの分解に関与する第２の遺伝子はｆａｄＥ３０である。ΔｆａｄＥ３０突然変異体はＨＩＬおよびＨＩＰ上の増殖において著しく損なわれており、２４時間のインキュベーション後には増殖を実質的に全く示さない。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）のｆａｄＥ３０遺伝子を、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）において入手可能なロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋ゲノム上で行うタンパク質配列類似性検索により同定した。ロドコッカス・ジョスティイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）株ＲＨＡ１（Ｒｏ４５９６，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＧ９６３８２）のＦａｄＥ３０のアノテーション付きタンパク質配列をタンパク質配列鋳型として使用した（ＭｃＬｅｏｄら，２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１５５８２−１５５８７；およびＶａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１９４７−１９５２）。Ｒｏ０４５９６でのデータベース類似性検索は、Ｒｏ０４５９６に対して７３％のアミノ酸配列同一性を示すタンパク質をコードするロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）１０３Ｓの遺伝子を示した。このタンパク質はロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）１０３ＳのＦａｄＥ３０（配列番号４３）としてアノテーション付けされ、その対応遺伝子はｆａｄＥ３０と称される。他のアクチノバクテリアにおいてＦａｄＥ３０をコードするオルソログ遺伝子が同様にして同定されうるであろう。これらのうちの選ばれたものを表８に示す。
【００２６】
アクチノバクテリアｉｐｄＡＢ遺伝子座の高度に保存されたヌクレオチド配列上で得られたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢゲノム遺伝子座を３つの部分においてＰＣＲにより増幅した。これらの保存領域は、ｉｐｄＡＢ遺伝子の幾つかの公知アクチノバクテリア配列のヌクレオチド配列アライメントにより同定された。ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）のｉｐｄＡＢ領域のヌクレオチドゲノム配列（ｎｆａ０５０８０−ｎｆａ０５０９０）（ＤＤＢＪアクセッション番号ＡＰ００６６１８）を、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを得るための一次鋳型として使用した。使用したプライマーオリゴヌクレオチド配列を表５に示す。ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６の染色体ＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用した。プライマーｉｐｄＡ−ａｃｔｉｎｏ−ＦおよびｉｐｄＢ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２２）を使用してノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢ遺伝子を増幅し、ｉｐｄ−ａｃｔｉｎｏ−Ｆ２およびｉｐｄＡ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２３）を使用してｉｐｄＡＢの上流領域を増幅し、ｉｐｄＢ−ａｃｔｉｎｏ−Ｆおよびｉｐｄ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２１）を使用して下流領域を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター内にクローニングし、該インサートのヌクレオチド配列を決定した。ついで、得られたＤＮＡ配列上で、異なるプライマーペアを得、それを使用してｉｐｄ遺伝子座を再クローニングし、再配列決定した。これは、４，１３９ｂｐを含むノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢの完全なヌクレオチド配列を与えた。配列決定されたＤＮＡ断片はノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ遺伝子ならびにそれらの隣接遺伝子を含有していた。ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢの推定タンパク質配列を、それぞれ配列番号５８および配列番号５９に示す。
【００２７】
Ａ３ クローニング、ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡ単離
全てのクローニング法の宿主としてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを使用した。制限酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨから入手した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を該製造業者の説明に従い使用して、細胞培養の染色体ＤＮＡを単離した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ，ｐＨ８）、１×標準ポリメラーゼバッファー、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＤＭＳＯ（２％）、ＰＣＲプライマー（それぞれ１０ｎｇ／μｌ、表５）および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）またはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）からなる反応混合物（２５μｌ）中でＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲのために、細胞物質を１００μｌのクロロホルムおよび１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と混合し、激しくボルテックスし、遠心分離（２分間、１４，０００×ｇ）した。ついで上部水相（１μｌ）のサンプルをＰＣＲのための鋳型として使用した。標準的なＰＣＲは、９５℃で５分間のＤＮＡ融解工程、ならびにそれに続く９５℃で４５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリングおよび７２℃で１〜３分間の伸長の３０サイクルを含むものであった。用いた伸長時間は、１．５分／１ｋｂを一般則として採用して、予想されるＰＣＲアンプリコンの長さに左右された。
【００２８】
Ａ４ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａｅ）の電気的形質転換
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）の細胞を、記載されているのと実質的に同じ方法で（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，受理された前記ＮＡＲ論文；Ｎａｖａｓら，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４７９６−４８０５）、エレクトロポレーションにより形質転換した。簡潔に説明すると、ＯＤ６００が０．８〜１．０に達するまで、細胞培養を５０ｍｌ ＬＢ中、３０℃で成長させた。該細胞をペレット化し（４，５００×ｇで２０分間）、１０％ 氷冷グリセロールで２回洗浄した。ペレット化細胞を０．５〜１ｍｌの氷冷１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌ アリコートに分割した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５の細胞を、記載されているのと実質的に同じ方法で（Ｊａｃｏｂｓら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：５３７−５５５）、エレクトロポレーションにより形質転換した。簡潔に説明すると、細胞培養（２５０ｍｌ）を、ＯＤ６００が０．８に達するまで、ＴＳＢ培地＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０中、３７℃で成長させ、氷上に１時間半放置し、遠心分離（５，０００×ｇで１０分間）して該細胞をペレット化した。該細胞を蒸留水で２回洗浄した。ペレット化細胞を０．５〜１ｍｌの氷冷１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌ アリコートに分割した。ＭｉｌｌｉＱ溶出プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｌ；ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｍギャップ化（ｇａｐｐｅｄ）キュベット内の２００μｌの細胞に加えた。１２．５ｋＶ／ｃｍ、１０００オームおよび２５μＦの単一パルスでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションされた細胞を１ｍｌのＬＢ培地（Ｒ．ｅｑｕｉ）または１ｍｌのＴＳＢ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）と穏やかに混合し、２時間（Ｒ．ｅｑｕｉ）または５時間（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）にわたって３７℃で２００ｒｐｍで回収した。回収された細胞のアリコート（２００μｌ）を選択寒天培地上にプレーティングした。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）形質転換体を、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天上で選択し、３０℃で２〜３日間のインキュベーションの後にそれが出現した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＴＳＢ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０寒天上で選択し、３７℃で４〜５日間のインキュベーションの後にそれが出現した。
【００２９】
ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａｅ）の場合には、株ＩＮＳ４３６の前培養（２０ｍｌ）を、ユーゴンブロス＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（ＯＤ６００ｎｍ＝６）中、２６℃（２００ｒｐｍ）で５日間成長させ、それを使用して１００ｍｌの新鮮なユーゴンブロス＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０培地（１：１００）に接種した。初代培養を、ＯＤ６００ｎｍ＝１．３まで、２６℃で２０時間にわたって一晩成長させた。該細胞を４℃でペレット化し（２０分間、４０００ｇ）、５０ｍｌの氷冷１０％ グリセロールで２回洗浄した。該ペレット化細胞を５００μｌの１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌのアリコートに分割し、直ちに電気的形質転換のために使用した。ＭｉｌｌｉＱ溶出プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｌ；ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｍギャップ化（ｇａｐｐｅｄ）キュベット内の２００μｌの細胞に加え、混合し、氷上で１分間放置した。１７．５ｋＶ／ｃｍ、２００オームおよび５０μＦ（おおよその時間パルス９．３ｍｓ）の単一パルスでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションされた細胞を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０で補足された１ｍｌのユーゴンブロスと穏やかに混合し、３．５時間にわたって２６℃で２２０ｒｐｍで回収した。回収された細胞の５０および１００μｌのアリコートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）で補足された選択ユーゴン寒天上にプレーティングした。２６℃で７日間のインキュベーションの後、形質転換体が出現した。
【００３０】
Ａ５ ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）選択を用いるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株における非標識遺伝子欠失
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）の非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失突然変異体を、記載されているのと実質的に同じ方法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）で作製した。野生型または突然変異細胞のエレクトロポレーションから得たロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）形質転換体を、アプラマイシンで補足されたＬＢ寒天培地上にストリークしてアプラマイシン耐性（ＡｐｒａＲ）を確認した。形質転換当たり４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、２５ｍｌのＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍで一晩（２０〜２４時間）増殖させ、１００μｌ アリコート中の５−ＦＣ（１００μｇ／ｍｌ）で補足されたＭＭ−Ａｃ寒天プレート上にＭＭ−Ａｃ培地中の１０１〜１０３倍希釈度でプレーティングした。３０℃で３日間のインキュベーションの後に出現した５−ＦＣ耐性コロニーを、ＬＢ寒天上、およびアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）で補足されたＬＢ寒天上にレプリカストリークして、アプラマイシン感受性（ＡｐｒａＳ）および５−ＦＣ耐性（５−ＦＣＲ）コロニーを選択した。遺伝子欠失の遺伝子座を増幅するプライマー（表５）を使用するコロニーＰＣＲにより、ＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーを所望の遺伝子欠失の存在に関して確認した。潜在的遺伝子欠失突然変異体からゲノムＤＮＡを単離し、それを使用して、遺伝子欠失を確認した。これは、ｉｐｄＡＢまたはｉｐｄＡＢ２遺伝子座ならびにこれらの遺伝子座の上流および下流領域を増幅するプライマー（表５に記載されているプライマー）を使用して行った。
【００３１】
Ａ６ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）におけるｉｐｄＡＢおよびｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｉｐｄＡＢオペロンの非標識遺伝子欠失の生成のためのプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１を以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，３６８ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，３９６ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｅｑｕｉＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢｅｑｕｉＤＯＷ番号）隣接領域をＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）により増幅した。得られたアンプリコンをＥｃｏＲＶ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内に連結して、それぞれ上流および下流領域にプラスミドｐＥｑｕｉ１４およびｐＥｑｕｉ１６を得た。ｐＥｑｕｉ１４の１．４ｋｂのＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ断片をＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ消化ｐＥｑｕｉ１６内に連結してｐＥｑｕｉ１８を得た。ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失およびその隣接領域を含有する、ｐＥｑｕｉ１８の２．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクレノウフラグメントで処理し、ＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ自殺ベクター（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）内に連結した。得られたプラスミドを、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１とも称される）の構築のためにｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１と命名した。この突然変異体はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８として寄託された。
【００３２】
二重遺伝子欠失突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７とも称される）を、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を使用して、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢ突然変異株におけるｉｐｄＡＢ２オペロンの非標識遺伝子欠失により作製した。プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡｂ２を以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ２の上流（１，４４４ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，３８７ｂｐ；ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮ−Ｆ、ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷ番号）領域を、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ（表５、ＰＣＲ６およびＰＣＲ７）により増幅した。該アンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ内に連結して、それぞれプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰおよびｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮを得た。ＢｇｌＩＩ／ＳｐｅＩでの両プラスミドの消化の後、ｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮの１，３８１ｂｐの断片をｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ内に連結して、ΔｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失の構築のために使用するｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を得た。得られた突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された。
【００３３】
Ａ７ マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５におけるｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５におけるｉｐｄＡＢ遺伝子の非標識遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，５０２ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ−Ｒ）および下流（１，４３１ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷ番号）隣接領域を、鋳型としてマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１２およびＰＣＲ１３）により増幅した。得られたアンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，１９９４，Ｇｅｎｅ １４５：６９−７３）内に連結して、それぞれｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰおよびｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷＮを得た。ついで、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰから得た１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩで線状化されたｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ内に連結して、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のために使用するｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを構築した。
【００３４】
Ａ８ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）におけるｆａｄＥ３０の遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｆａｄＥ３０の非標識遺伝子欠失の生成のためのプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を以下のとおりに構築した。ｆａｄＥ３０の上流（１，５１１ｂｐ；プライマーｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，４４９ｂｐ；プライマーｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＤＯＷＮ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＤＯＷ番号）隣接ゲノム領域を、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ）を使用する標準的なＰＣＲ（表５；ＰＣＲ１５およびＰＣＲ１６）により増幅した。得られたアンプリコンをｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ）内に連結してｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＵＰおよびｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＤＯＷＮを得た。１．４ｋｂのＢｃｕＩ／ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＤＯＷＮから切断し、ＢｃｕＩ／ＢｇｌＩＩで線状化されたｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＵＰ内に連結してｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０を得た。ｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を構築するために、ｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０をＮｃｏＩおよびＢｃｕＩで消化し、クレノウフラグメントで処理した。ｆａｄＥ３０遺伝子欠失を含有する２．９ｋｂの平滑末端ＤＮＡ断片をＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）内に連結した。得られたプラスミドをｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０と命名し、突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０の構築のために使用した。
【００３５】
Ａ９ ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢ遺伝子の非標識遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，４８７ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ−Ｒ；ＰＣＲ２４）および下流（１，０４９ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷ番号；ＰＣＲ２５）隣接領域を、ＤＮＡ鋳型としてカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６のゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより増幅した（表５）。得られたアンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，１９９４，Ｇｅｎｅ １４５：６９−７３）内に連結して、それぞれｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰおよびｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮを得た。ついで、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化ｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮから得た１．０７ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで線状化されているｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ内に連結して、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを構築した。
【００３６】
Ａ１０ 突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢおよびロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２の構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）のために開発された５−フルオロシトシン対抗選択での２段階相同組換え法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）を用いて、ｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）およびｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）のロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）非標識遺伝子欠失突然変異体を構築した。ΔｉｐｄＡＢ突然変異ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＧ１３４１の構築のために、非複製型プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１を電気的形質転換によりロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１に転移させた。ついで、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１とＲＥ１ゲノムとの間の相同組換えから得られた４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、遺伝子欠失を引き起こす第２の稀有相同組換え事象の発生に関して選択するために、５−ＦＣ選択に付した。１８個のランダムに拾ったＡｐｒａＳ／５ＦＣＲコロニーをコロニーＰＣＲに付した。３個のＦＣＲ／ＡｐｒａＳコロニーが予想サイズ（２９６ｂｐ、表５、ＰＣＲ５）のアンプリコンを与えた。ゲノムＤＮＡをこれらの３つのΔｉｐｄＡＢ突然変異体から単離し、ｉｐｄＡＢ遺伝子座ならびにその上流および下流隣接領域のＰＣＲ分析に付した（表５、ＰＣＲ３およびＰＣＲ４）。この分析は３例中２例において真正ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明し、ｉｐｄＡＢ遺伝子座における異常なゲノム再構成を示さなかった。ビルレンスプラスミドのマーカーとしてのｖａｐＡの存在がＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１１）により確認された。１つのｉｐｄＡＢ突然変異株を選択し、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＧ１３４１と命名し、更なる研究に使用した。
【００３７】
ΔｉｐｄＡＢ単一突然変異体の単離に関して記載されているのと実質的に同じ方法でプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を使用して、二重遺伝子欠失突然変異株ＲＧ２８３７を株ＲＧ１３４１から構築した。ｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２での株ＲＧ１３４１の細胞のエレクトロポレーションから得た４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、ＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーを選択するために５−ＦＣ選択に付した。ｉｐｄＡＢ２オペロンを増幅するために作製されたオリゴヌクレオチド（表５、ＰＣＲ１０）を使用する、１８個のＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーの後続のＰＣＲ分析は、得られた１２３ｂｐのアンプリコンから明らかなとおり、２つのコロニーがΔｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失を含有することを証明した。ＰＣＲによるｉｐｄＡＢ２遺伝子座の上流および下流領域の更なる分析はｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失の存在を証明し、異常なゲノム再構成を示さなかった（表５、ＰＣＲ８およびＰＣＲ９）。また、ｖａｐＡビルレンス遺伝子の存在がＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１１）により確認された。１つのΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２二重遺伝子欠失突然変異株ＲＧ２８３７を更なる研究のために選択した。
【００３８】
Ａ１１ 突然変異株マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ΔｉｐｄＡＢの構築
以下のとおりにｓａｃＢ対抗選択系（Ｐｅｌｉｃｉｃら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：９１９−９２５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００１，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０５：１９７−２０２）を用いて、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５の非標識ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体を構築した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のΔｉｐｄＡＢ突然変異体の構築のために、非複製型プラスミドｐ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを電気的形質転換によりマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に転移させた。幾つかの形質転換体を得た。１つのカナマイシン耐性形質転換体を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＴＳＢ培地中、３７℃で非選択的に２日間増殖させ、ついで、ｓａｃＢ対抗選択によりカナマイシン感受性（ＫｍＳ）およびスクロース耐性（ＳｕｃＲ）二重組換え体を選択するために、２％ スクロースを含有するＴＳＢ寒天プレート上にプレーティングした。３日間のインキュベーションの後に出現したコロニーをＴＳＢ寒天上、およびカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で補足されたＴＳＢ寒天上にレプリカストリークして、ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを選択した。コロニーＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１４）により、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在に関して真正ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを更に調べた。３つの潜在的ｉｐｄＡＢ突然変異体からゲノムＤＮＡを単離した。ＰＣＲ分析はｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明した。１つのｉｐｄＡＢ突然変異株を更なる研究のために選択し、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ΔｉｐｄＡＢと命名した。
【００３９】
Ａ１２ 突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０の構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）のために開発された５−フルオロシトシン対抗選択での２段階相同組換え法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）を用いて、ｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）およびｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）のロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｆａｄＥ３０の非標識遺伝子欠失を作製した。ΔｆａｄＥ３０突然変異株の構築のために、非複製型プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を電気的形質転換によりロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１に転移させた。ついで、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０とＲＥ１ゲノムとの間の相同組換えから得られた２つのＡｐｒａＲ形質転換体を、ｆａｄＥ３０遺伝子欠失を引き起こす第２の稀有相同組換え事象の発生に関して選択するために、５−ＦＣ選択に付した。１８個のランダムに拾ったＡｐｒａＳ／５ＦＣＲコロニーを、プライマーｆａｄＥ３０ｃｏｎｔ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｃｏｎｔ−Ｒ（表５；ＰＣＲ１９）を使用するコロニーＰＣＲに付した。３個のＦＣＲ／ＡｐｒａＳコロニーが予想サイズ（４２８ｂｐ）のアンプリコンを与えた。ゲノムＤＮＡを２つの潜在的ΔｆａｄＥ３０突然変異体から単離し、ＰＣＲ分析に付した。オリゴヌクレオチドプライマーｆａｄＥ３０ｃｏｎｔｒ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｃｏｎｔｒ−Ｒ（表５）を使用するｆａｄＥ３０遺伝子座のＰＣＲ分析はｆａｄＥ３０遺伝子欠失の存在および野生型ｆａｄＥ３０遺伝子の非存在を証明した。ＰＣＲによる上流および下流隣接領域の分析は、予想されたそれぞれ１．８６ｋｂおよび１．７６ｋｂの産物を与えた。該分析はどちらの場合においても真正ｆａｄＥ３０遺伝子欠失の存在を証明し、ｆａｄＥ３０遺伝子座における異常なゲノム再構成を示さなかった。ビルレンスプラスミドのマーカーとしてのｖａｐＡの存在がＰＣＲにより確認された。１つのｆａｄＥ３０突然変異株をロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０と命名し、更なる研究に使用した。
【００４０】
Ａ１３ 突然変異株ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ΔｉｐｄＡＢの構築
以下のとおりにｓａｃＢ対抗選択系（Ｐｅｌｉｃｉｃら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：９１９−９２５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００１，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０５：１９７−２０２）を用いて、ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６の非標識ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体を構築した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のΔｉｐｄＡＢ突然変異体の構築のために、非複製型プラスミドｐ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを電気的形質転換によりノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６に転移させた。ついで幾つかのカナマイシン耐性形質転換体を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有するユーゴンブロス培地中、非選択的に２６℃で７日間増殖させた。ついで、２％ スクロースを含有するユーゴン寒天プレート上にプレーティングすることにより、ｓａｃＢ対抗選択によるカナマイシン感受性（ＫｍＳ）およびスクロース耐性（ＳｕｃＲ）二重組換え体の選択を行った。２６℃で７日間のインキュベーションの後に出現したコロニーをユーゴン寒天プレート上、およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）で補足されたユーゴン寒天プレート上にレプリカにより移して、ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを選択した。プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｒ（表５）を使用するコロニーＰＣＲにより、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在に関して、真正ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを更に調べた。３つの潜在的ｉｐｄＡＢ突然変異体からゲノムＤＮＡを単離した。プライマーペアｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｒ（ＰＣＲ２３）を使用するＰＣＲ分析は２２２ｂｐのＰＣＲ産物を与え、１，６３４ｂｐの野生型ＰＣＲ産物の非存在を示し、これはｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明した。ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失を更に確認するために、プライマーペアＩｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｆ２およびＩｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮ−Ｃｏｎｔｒ−Ｒ（ＰＣＲ２６）を使用した。このプライマーペアはｉｐｄＡＢ突然変異体に関する１，１４８ｂｐの予想されたＰＣＲ産物を与え、一方、該野生型株の場合においてのみ、２，５６０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。１つの突然変異株をノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ΔｉｐｄＡＢと命名し、更なる研究のために選択した。
【００４１】
Ｂ部：インビボ弱毒化のモデルとしてのマクロファージ生存
Ｂ１ 使用株
ビルレント株
株ＲＥ１：野生型親株。この株はコレステロール上で増殖する。株ＲＥ１ΔｓｕｐＡＢ：ｓｕｐＡＢ遺伝子の欠失体。この株はコレステロール上で増殖できない。
【００４２】
非ビルレント株
株１０３−：８０−から９０−ｋｂのビルレンスプラスミドを欠き、ウマにおいて非病原性であることが公知である（Ｔａｋａｉら，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：６８４０−６８４７）。この株はコレステロール上で増殖する。
【００４３】
本発明の株
株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）：コレステロール異化クラスターにおけるｉｐｄＡＢ遺伝子が欠失している。この株は４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）上で増殖しない。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋：ＡＤ上で増殖するように順応した株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの細菌［唯一の炭素源としてのＡＤと共に株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢを高濃度（１０６ＣＦＵ／ｍｌ以上）でプレーティングした場合には、ＡＤ上で増殖する少数のコロニーが出現しうる］。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）：（コレステロール異化クラスターの部分ではない）ｉｐｄＡＢ遺伝子のもう１つの組も欠失している。この株はＡＤ上では増殖しない。株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０。この株はＨＩＰ／ＨＩＬおよびＡＤ上での増殖に関して著しく欠損している。
【００４４】
Ｂ２ マクロファージ感染のためのロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）培養
マクロファージ生存アッセイにおいて試験すべき種々のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株を栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ）内で３７℃、１００ｒｐｍで一晩（１７時間）増殖させて、１〜２×１０８ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。新鮮に調製した培養のみを使用した。該マクロファージの接種後、感染価を確認するために生存数測定（プレート計数）を行った。
【００４５】
Ｂ３ 子ウマへのチャレンジのためのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）培養
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株ＲＥ１、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋を血液寒天上でプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。プレート当たり４ｍｌの無菌等張ＰＢＳで細菌を集めた。該細菌懸濁液を無菌等張ＰＢＳで希釈して、４×１０４ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。輸送は室温で行った。該希釈培養は、調製後４時間以内に使用した。チャレンジ後、感染価を確認するために生存数測定（プレート計数）を行った。生存数は、それぞれ、ＲＥ１では４．３５×１０４ ＣＦＵ／ｍｌ、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢでは７．１×１０４ ＣＦＵ／ｍｌ、およびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＢ＋では５．８×１０４ ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００４６】
Ｂ４ 試験系
マクロファージ細胞系
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株の生存に関して試験するために細胞系Ｕ９３７（ヒト単球）を使用した。該単球を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで緩衝化され２００ ＩＵ／ｍｌ ペニシリンおよびストレプトマイシンならびに１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足されたＲＰＭＩ １６４０＋ＮａＨＣＯ３＋ＮＡＰＹＲ＋グルコース培地（ＲＰＭＩ １６４０培地）内で増殖させ。該細胞を３７℃および５％ ＣＯ２において懸濁状態で増殖させた。
【００４７】
子ウマ
８頭の子ウマ（７頭は３〜５週齢の子ウマであり、１頭は７週齢であった）（全て母ウマを伴っていた）を使用した。全群にわたって年齢分布が均等になるように、該子ウマを３頭、３頭および２頭の子ウマの３群に割り当てた。該実験中、該子ウマは乳を吸い、母ウマは標準的な手法により給餌された。新鮮な水道水が自由に摂取できるようにした。
【００４８】
【表１】
【００４９】
Ｔ＝０において、針付きシリンジを使用して（いわゆる、経気管注射）、株ＲＥ１、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢまたはＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋の１００ｍｌのチャレンジ培養物（前記「子ウマへのチャレンジのためのロドコッカス培養」を参照されたい）で全ての子ウマを気管内にチャレンジした。
【００５０】
Ｂ５ 実験方法およびパラメーター
マクロファージ生存試験
マクロファージ生存アッセイのために、前記のとおり、単球を数日間増殖させた。培地を新鮮な培地と交換し、６０ｎｇ／ｍｌ ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で該細胞を一晩活性化させて、マクロファージへのそれらの分化を誘導した。分化した細胞を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、１０％ ＦＢＳを含有する新鮮な抗生物質非含有ＲＰＭＩ１６４０培地にペレットを再懸濁させた。試験すべき各株ごとに、約１０６ 細胞／ｍｌの細胞懸濁液１０ｍｌを含有するチューブにロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を約１０細菌／マクロファージの感染多重度で接種した。該細菌を該マクロファージと共に３７℃、５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした。該培地を、１０％ ＦＢＳおよび１００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンで補足された１０ｍｌのＲＰＭＩ培地と交換し、再び１時間インキュベートして、細胞外細菌を殺した。該マクロファージ（インターナリゼーションされたロドコッカス・エクイを含有するもの）を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで緩衝化され１０％ ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンで補足された４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地にペレットを再懸濁させた。この懸濁液を４本の培養ボトル（それぞれ１０ｍｌ）に分割し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。４、２８、５２および７６時間後、該マクロファージ（株当たり１本の培養ボトル）を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、ペレットを１ｍｌの抗生物質非含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２回洗浄した。最後に、該ペレットを０．０１Ｍ リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で細胞溶解し、ついで生存数測定（プレート計数）を行った。
【００５１】
子ウマへのチャレンジ
１−直腸温度：チャレンジの１日前、チャレンジの当日（チャレンジの直前）、ついで、チャレンジ後は剖検まで１日１回測定した。
【００５２】
２−臨床検査：チャレンジ後３週間にわたり、該ウマを臨床徴候に関して毎日検査した。
【００５３】
３−死後検査および細菌学：チャレンジ後第２１日に、該子ウマを秤量し、ついでキシラジン（１００ｍｇ／１００ｋｇ）およびケタミン（５００ｍｇ／１００ｋｇ）での麻酔ならびにそれに続く失血により死亡させた。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。肺および付随リンパ節に特に注意して、完全な死後検査を行った。異常の場合には、病理学者により必要とみなされたら、組織学的検査のためのサンプルを採取した。
【００５４】
組織サンプル（１ｃｍ３）を、肺の各半分の葉を代表する７つの標準的な部位（半分当たり３つの部位＋付属葉）から切除し、各部位に関して、罹患組織が存在する場合にはそれを優先的に選択した。鏡像サンプル（各半分の同等の葉の２つのサンプル）をプールして、子ウマ当たり３つのサンプル＋１つの付属葉のサンプルを得た。それぞれの（プールされた）サンプルをホモジナイズし、系列希釈し、血液寒天プレート上に接種し、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌホモジネートとして表した。全ての他の異常から追加的スワブを採取した。スワブを血液寒天プレート上にストリークし、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を、まず、その典型的な非溶血性ムコイドコロニー形態学的特徴により同定した。グラム染色、ＡＰＩ／フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）および／またはＰＣＲにより、更なる同定を行った。
【００５５】
Ｂ６ 結果
マクロファージにおける生存
２つの別々の実験の結果を表１（および図１）および表２（および図２）に示す。該結果は、ＲＥ１ΔｓｕｐＡＢ突然変異体が、野生型親株ＲＥ１と同様にマクロファージ内で生存可能であることを示しており、このことは、コレステロール代謝がマクロファージ生存に必須ではないことを示している。これは、コレステロール代謝自体がビルレンスには重要でないという認識と合致する。これとは対照的に、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋および株１０３−のマクロファージ内生存は明らかに低下した。しかし、それらの細菌が、有意に低下したレベル（典型的には野生型レベルの１００〜１０００倍低い濃度）でではあるが、マクロファージ内で尚も生存可能であることに注目されたい。株１０３−は８０−から９０−ｋｂのビルレンスプラスミドを欠き、ウマにおいて非ビルレントであることが公知である（Ｔａｋａｉら）。この株１０３−はワクチン株としては適当でない。なぜなら、それは、おそらくそれが該ビルレンスプラスミドを欠いているため、防御免疫応答を誘導しないからである。表９（および図４）には、野生型株ＲＥ１および株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢと比較された突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０に関する結果が示されている。明らかに、ｆａｄＥ３０突然変異体は、ΔｉｐｄＡＢ株と比較されうる生存特性を有し、また、より低いマクロファージ内生存能を有する。
【００５６】
メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解活性に関与するタンパク質をコードするオペロンにおける突然変異を有する株［すなわち、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋およびロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０］での結果は、これらの株が、より低いマクロファージ内生存能を有すること、特に、それらの生存能が非病原性株１０３−の生存能に匹敵することを示している。これは、既に、適度な弱毒化の良好な指標である。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋は株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢと同じマクロファージ表現型を示した。このことは、野生型レベルでのマクロファージ生存に必須なものが、無傷コレステロール代謝ではなく無傷ｉｐｄＡＢオペロンであることを示している。単一ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失（コレステロール異化遺伝子クラスターにおけるもの）はマクロファージ生存の阻害をもたらした。これらの遺伝子のコピー（ｉｐｄＡ２およびｉｐｄＢ２と称される、コレステロール異化クラスター以外のｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ）における追加的な欠失は該マクロファージ試験において更なる弱毒化効果を及ぼさなかった。これらの結果を考慮して、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋（＝ＡＤ上での増殖に順応した株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ）を子ウマに気管内投与し（通常のチャレンジ法）、野生型親株ＲＥ１と比較してインビボ弱毒化を試験した。
【００５７】
直腸温度
表３（および図３）には、直腸温度の結果が示されている。群１は、野生型ＲＥ１株が投与された群である。群２および３には、それぞれＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋が投与された。第３日〜第１０日の温度は示されていない。なぜなら、それらは正常直腸温度からの有意な変化を何ら示さなかったからである。異常温度が太字で示されている。野生型親株ＲＥ１でチャレンジされた３頭中２頭の子ウマ（番号１８および１９）は、チャレンジの１４日後以降の明らかに増加した直腸温度を示した。１４日後の直腸温度の増加は臨床徴候の発生と符合した（後記を参照されたい）。子ウマ番号２１（株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢでチャレンジされたもの）は、チャレンジ後第１日に、若干増加した温度（３９．１℃）を示したが、これは、おそらく、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）感染に関連していない（このチャレンジモデルにおけるインキュベーション時間は通常、７日を超える）。さらに、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢまたはＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋のいずれでチャレンジされた子ウマにおいても、温度上昇は観察されなかった。
【００５８】
チャレンジ後の臨床徴候
第７日から第２１日までの臨床スコアは実際に、野生型親株ＲＥ１でチャレンジされた子ウマ番号１８および１９がチャレンジの１３日後から呼吸疾患の徴候を現すことを示した。子ウマ番号１７（ＲＥ１チャレンジ群）はチャレンジ後に軽度の臨床徴候を示したに過ぎなかった。突然変異株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋でチャレンジされた子ウマは呼吸疾患の明らかな徴候を示さなかった。後者の２つの群の臨床効果は、主に、若干増加した心拍に基づくものであった。これはまた、（部分的に）ストレスの処理によるものであった可能性がある。なぜなら、それはチャレンジ前にも存在したからである。
【００５９】
死後検査
肺に関する死後所見を表４に示す。野生型親株ＲＥ１でのチャレンジの後、該子ウマは呼吸疾患の徴候を現した（特に子ウマ番号１８および１９）。突然変異株でチャレンジされた子ウマは依然として健康であった。チャレンジ後第２１日に、該子ウマを殺し、剖検した。死後において、該野生型株でチャレンジされた全ての子ウマは典型的な化膿性肉芽腫肺炎を有しているようであった。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）を純粋培養としてそれから再単離し、該野生型株の同一性をＰＣＲにより確認した。また、子ウマ番号１８からは、拡大した縦隔リンパ節から、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）が単離された。該突然変異株でチャレンジされた子ウマの肺は肺炎領域を示さず、子ウマ番号２０の若干拡大した気管支リンパ節からの場合および子ウマ番号２４の健常肺組織からの場合を除き、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）は単離されなかった。これらの単離物の同一性は、それぞれＰＣＲおよびＡＤ寒天上の増殖により、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋と確認された。
【００６０】
Ｂ７ これらの実験のＢ部の結論
株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋はマクロファージ生存において明らかに欠損しており、子ウマにおいて弱毒化されている。ｉｐｄＡＢ遺伝子の第２コピーのノックアウト（ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２を与える）は、マクロファージ生存試験において、そして恐らくは子ウマにおいても、追加的な効果を及ぼさないようであった。株ＲＥ１、ＲＥ１ｓｕｐＡＢ、１０３−、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋でのインビボおよびインビトロの総合的な結果は、ノカルジオフォーム放線菌に属する細菌に関するマクロファージ生存レベルとインビボビルレンスとの間の良好な相関性を示している。特に、突然変異株が、有意に低下（典型的には、ビルレント親株に対して約２〜３ｌｏｇ）したマクロファージ生存能を有する場合、該突然変異株は該親株と比べて有意に弱毒化されている。
【００６１】
感染の様態および毒性因子がノカルジオフォーム放線菌の間で共有されているという一般に公知の事実、したがってロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）が、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を研究するための、特に、マクロファージ生存および存続性に関連したビルレンス因子に関するモデルとして一般に使用されること（とりわけ、ＰＮＡＳ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２を参照されたい）に基づけば、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化による細菌の生存率の低下はノカルジオフォーム放線菌の弱毒化に関して一般的なことだと理解される。
【００６２】
Ｃ部：野生型による感染に対する防御における突然変異細菌の効力
Ｃ１ 序論
本発明の生突然変異細菌を含有する医薬組成物に関する効力は固有のものだと考えられる。これは、コレステロール代謝における突然変異を有する細菌が、野生型生物のものに匹敵する抗原負荷を尚も有することを、コレステロール代謝における突然変異に関する公に入手可能な知見が明らかに示していることを認識することにより理解されうる。該突然変異生細菌はマクロファージに侵入しそのなかで存続する能力を尚も有するという本発明により入手可能となった現在の知見と組合せると、免疫応答の刺激が確保されることは疑いがない。それでもなお、本出願人は、この見解を証明するための実験を行った。このために、生ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を含有するワクチンを使用した。本質的に、この細菌に対して利用可能なワクチンは尚も存在せず、このことは該実験を本質的に重要なものとする。しかし、より重要なことには、この細菌は、他のノカルジオフォーム放線菌、特にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関する良好なモデルと一般に認識されている。他の証明実験（ノカルジオフォーム放線菌の全範囲を含む証明結果を得るためのもの）は、例えばノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）を使用して行われうるであろう（Ｃ６節を参照されたい）。これは魚類病原体であり、他のマクロファージ生存ノカルジオフォーム放線菌に対する適当なワクチンが利用可能でないのと同じ理由により、それに対する適当なワクチンは利用可能でない。
【００６３】
Ｃ２ 実験計画
１６頭の２〜４週齢の子ウマを該研究に使用した。該子ウマを４頭の子ウマの４つの群に分け、種々の用量のＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ（無菌等張リン酸緩衝食塩水中で還元される）を含有する１ｍｌのワクチンをそれに経口的にワクチン接種した。群１には５×１０９ ＣＦＵをワクチン接種し、群２には５×１０８ ＣＦＵをワクチン接種し、群３には５×１０７ ＣＦＵをワクチン接種し、群４は未ワクチン接種対照として残された。ワクチン接種はＴ＝０およびＴ＝２週の時点で行った。Ｔ＝４週において、全ての子ウマをロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株８５Ｆ（１００ｍｌ用量当たり５×１０６ ＣＦＵを含有する）の１００ｍｌの培養物で気管内にチャレンジした。
【００６４】
チャレンジ後の３週間にわたり、該ウマを臨床的に評価した。該子ウマを初回ワクチン接種の日、チャレンジの日および剖検の日に秤量した。チャレンジ後３週間の時点で（または重篤な臨床徴候の場合には、それより早期に）、該子ウマを秤量し、安楽死させ、肺および呼吸リンパ節に特に注意して完全な死後検査を行った。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。全ての肺葉からの組織サンプルを検査のために採取した。
【００６５】
Ｃ３ 材料および方法
試験物品
該ワクチンは、無菌等張リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で還元される株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの生ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）を含有していた。該チャレンジ培養物は以下のとおりに調製した。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株８５Ｆを血液寒天上にプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。プレート当たり４ｍｌの無菌等張ＰＢＳで細菌を集めた。該細菌懸濁液を無菌等張ＰＢＳで希釈して、４×１０４ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。輸送は室温で行った。希釈培養は、調製後４時間以内に使用した。チャレンジ後、感染価を確認するために生存数測定を行った。該感染価は５．３×１０４ ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００６６】
実験方法およびパラメーター
各ワクチン接種の直前ならびに第０、１、２、３、６、１０、１４、１５、１６、１７、２０および２４日（ワクチン接種後）に直腸スワブを採取することにより、細菌の再単離を行った。Ｔ＝０（初回ワクチン接種の直前）に該子ウマから鼻スワブを採取した。該スワブサンプルを生理的塩溶液中で系列希釈し、血液寒天上でプレーティングし、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを、まず、典型的な非溶血性ムコイドコロニー形態学的特徴により同定し、計数し、ＣＦＵ／ｍｌとして表した。それぞれの単離の日に３つの再単離物を（存在する場合には３つの異なるウマから）ランダムに選択し、それを使用して同一性［グラム染色、ＡＰＩ／フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）およびＩｉｐｄＡＢ遺伝子上のＰＣＲ］を確認した。
【００６７】
該研究中、全身健康状態および／または行動の異常に関して、生物専門家が該ウマを毎日観察した。チャレンジの１日前から、該ウマを臨床徴候に関して（剖検まで）毎日検査した。初回ワクチン接種の直前、チャレンジの直前および剖検の直前に秤量を行った。このようにして、体重増加および肺対体重比を計算することが可能であった。
【００６８】
チャレンジ後第１４〜２０日に（重篤な臨床徴候の場合には、それより早期に）、該子ウマをキシラジン（１００ｍｇ／１００ｋｇ）およびケタミン（５００ｍｇ／１００ｋｇ）での麻酔ならびにそれに続く失血により死亡させた。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。完全な死後検査を行った。組織サンプル（１ｃｍ３）を、肺の各半分の葉を代表する７つの標準的な部位（半分当たり３つの部位＋付属葉）から切除し、各部位に関して、罹患組織が存在する場合にはそれを優先的に選択した。鏡像サンプル（各半分の同等の葉の２つのサンプル）をプールして、子ウマ当たり３つのサンプル＋１つの付属葉のサンプルを得た。それぞれの（プールされた）サンプルをホモジナイズし、系列希釈し、血液寒天プレート上に接種し、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌホモジネートとして表した。尖端（左＋右）、尾側（左＋右）および付属肺節に関して固質化の比率を確定することにより、各動物に関する肺炎肺スコアを得た。各動物ごとに、１つの肺スコア数を得るために、これらの比率を加えた。このようにして、０〜５００の肺スコアが得られる。
【００６９】
Ｃ４ 結果
チャレンジ後の結果を表７に要約する。４つ全ての対照が、唯一の病原体としてのロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）により引き起こされる化膿性肉芽腫肺炎の重篤な徴候を現したことが、要約された結果から明らかである。２つのワクチン被接種体番号４および５は、対照と比較されうる徴候を示したが、全ての他のワクチン被接種体はそれより遥かに軽度な徴候を示したか、または徴候を実質的に全く示さなかった。％肺重量（肺炎の量に関する客観的尺度）は該ワクチン被接種体のほとんどにおける部分的な防御を証明している。ワクチン接種された子ウマ番号２は、非特異的細菌により引き起こされる肺炎を有していた。実際、この子ウマは防御されているとみなされうる。なぜなら、大量のチャレンジにもかかわらず、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）が単離されなかったからである。また、肺炎を有するワクチン接種された３頭の子ウマからは、混合感染が単離された。これらの混合感染は、おそらく、種々の防御パラメーターに負の影響を及ぼすであろう。該ワクチンの防御効果は明らかであるが、用量反応効果は観察されなかった。それどころか、最低用量が最良の結果を与えたようである。このことと、子ウマが未熟な胃腸フローラを有することとを考え合わせると、最適用量は１×１０４〜１×１０１０ ＣＦＵであると考えられる。
【００７０】
Ｃ５ 該実験のＣ部の結論
該ワクチンの３つ全ての経口用量は若い子ウマに有効であるらしく、激しい気管内チャレンジに対して相当な防御を誘導した。本実験においては、ｉｐｄＡＢオペロンの遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢを共に、該ワクチンにおける細菌のゲノムから除去した。しかし、同じオペロンに影響を及ぼす他の突然変異も同等に有効でありうることが明らかである。例えば遺伝子ｉｐｄＡまたはｉｐｄＢの１つだけに影響を及ぼす突然変異はそれ自体で同等に有効でありうる。後者の場合のいずれにおいても、関与するトランスフェラーゼは産生され得ず、したがって同じ表現型が得られる。実際、これはＲｅｎｇａｒａｊａｎ（ＰＮＡＳ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．２３，ｐｐ ８３２７−８３３２）からも導かれうる。この参考文献においては、別のノカルジオフォーム放線菌、すなわち、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関する関連証拠が記載されており、オルソログｉｐｄ遺伝子（マイコバクテリウム・ツベルクローシスにおいて、それぞれｒｖ３５５１およびｒｖ３５５２と称される）のいずれかの不活化は同一表現型を与える。
【００７１】
Ｃ６ ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）突然変異体のワクチン効力の証明
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）に関する前記実験を、魚類においてノカルジア症を引き起こす別の放線菌である魚類病原体ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）に関して繰返した。この実験のために、野生型株ＩＮＳ４３６およびΔｉｐｄＡＢ株（前記Ａ１３段落に記載されているもの）を使用した。２０匹のブリ［セリオラ・キンクエラジアタ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）］の群に該野生型株または突然変異株を（種々の濃度で）ＩＰ注射し、２０匹の魚の１つの群を対照として残した。死亡および他の臨床反応の発生に関して該魚を２〜３週間観察して、該突然変異株の弱毒化を評価した。この観察期間の終了時に、生存魚を一定用量の該野生型株でチャレンジして、ワクチンとしての該突然変異株の効力を評価した。さらに２週間にわたり、魚を観察した。
【００７２】
該野生型に関しては、２．２５×１０８ ｃｆｕ／ｍｌの接種物を調製した。該突然変異株に関しては、これは７．８５×１０８ ｃｆｕ／ｍｌ（約３倍高い）であった。これらの原液接種物から、弱毒化研究に使用するための２倍、２０倍、２００倍および２０００倍の希釈物を調製した。該ＩＰチャレンジ物質は１．２×１０６ ｃｆｕ／ｍｌを含有していた。
【００７３】
該弱毒化実験の結果を表１０（これは該観察期間の終了時における死亡率を示す）に示す。該突然変異株は、該野生型株と比べて弱毒化されていることが、この表から明らかとなる。すなわち、該突然変異株の原液接種物はｃｆｕ／ｍｌにおいて３倍高かったが、該突然変異株の投与を受けた群においては死亡率は有意に低かった。該効力実験の結果を表１１に示す。比較されうる防御は得られなかったが、（対照群においては該観察期間中に該魚の６０％が死亡したことを考慮すると）該突然変異体は有意な防御をもたらすことが明らかである。２０００倍希釈物の投与を受けた魚の群においてさえも、野生型ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）でのチャレンジにより、遥かに少数の魚が死亡した。
【００７４】
このように、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化は他のノカルジオフォーム放線菌における弱毒化および防御ワクチン株を与えることが示された。これは、本発明が全範囲のノカルジオフォーム放線菌に適用可能であることを更に支持するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジオフォーム放線菌（ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物に関する。本発明はまた、該組成物を製造するための、この群の生弱毒化細菌の使用、およびこの組成物での動物の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクチノバクテリア綱の細菌には、一般に放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）と称される、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）と呼ばれる細菌目が存在する。この目に属する細菌は、高いＧ＋Ｃ含量を有する糸状グラム陽性細菌である［しかし、例えば、放線菌目マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する多数の種の場合のように、幾つかの種は、古典的なグラム染色に好適でない又は更には不適当な複雑な細胞壁構造を有する］。種々の株は、植物、およびヒトを含む動物に生息するが、それらは土壌生息生物として最もよく知られている。それらは、気菌糸体または菌糸にしばしば結合している耐性胞子を産生する。放線菌は有機物質の分解において重要な役割を果たしている。幾つかの種は、それらの特徴的な特性のため、産業および医薬研究において使用される。
【０００３】
ほとんどの放線菌は動物（本発明に関して用いられる動物なる語はヒトを含む）に対して非病原性である。しかし、放線菌の多数の亜目［すなわち、ストレプトスポランジネエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｎｅａｅ）、ミクロコクシネエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａｅ）、ストレプトマイシネエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ）およびフランキネエ（Ｆｒａｎｋｉｎｅａｅ）］のなかには、多くの非病原性細菌と共に相当数の動物病原体を含む１つの亜目、すなわち、コリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）が存在する。これらの病原体は、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科を含むノカルジオフォーム放線菌として公知の系統群内に存在するらしい（とりわけ、題名：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ ｅｑｕｉ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｉｎ“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９の第１１章を参照されたい）。注目すべきことに、これらの病原体による感染に関連した疾患の大部分に対しては、利用可能な適当な予防方法（すなわち、疾患に罹患するのを予防し又は該疾患の影響を少なくとも軽減しうる、疾患を引き起こす病原体に対する曝露の前またはそれと実質的に同時の処置）がほとんど存在しない。近年、ノカルジオフォーム放線菌の系統群のマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科はコリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）亜目内の非常に密接に関連した科であるという認識が確認された（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｓｅｎｉｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｍａｒｅｌｌｅ Ｌ．Ｙｅｈｕｄａ，Ｊｕｎｅ ２，２００５をも参照されたい）。特にこの群内の病原性細菌、少なくとも、適当な予防的治療が存在しない病原性細菌［例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）およびロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）］は以下の重要な特性を共有することも明らかになっている：すなわち、感染は典型的には皮膚または粘膜を介して生じ、ついで該細菌はマクロファージ内に広がり、これらのマクロファージ内で複製される（とりわけ、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７，２００５，１３５２−１３６３；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｎｏ ２３，ｐｐ ８３２７−８３３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３，２８２−２８４，２００７；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３６，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｊｕｎｅ ２００４，ｐｐ １４１５−１４１８を参照されたい）。実際にマクロファージは微生物感染に対する宿主免疫防御の最前線に位置するが、宿主内で生存するためには食作用の回避に頼る細菌とは異なり、この群内のここで意図される病原性細菌は、宿主内で生存し複製されるためにマクロファージを標的化するのである。本発明は、本発明の場合にはマクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌と称される、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するこれらの細菌に関する。
【０００４】
マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌は、微生物に対する動物の防御の決定的な機能を逃れるように進化してきたようである。特に、結核の原因微生物であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、インビボでのその主要ニッチとしてマクロファージを成功裏に利用している種であるが、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびコリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含むノカルジオフォーム放線菌に属する他の細菌種も同じ戦略を採っている。これらは、例えば、ブルリ潰瘍を引き起こすマイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ウシにおいてヨーネ病を引き起こしヒトにおけるクローン病に関連づけられているマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ結核を引き起こすマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、エイズ患者のような免疫無防備状態の患者の日和見感染に関連づけられているマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、魚類においてノカルジア症を引き起こすノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）およびノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉａ）、腎移植レピシエントにおける感染を引き起こすノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、子ウマ（幼いウマ科動物）において肺炎を引き起こし免疫無防備状態の患者における日和見感染にも関連づけられているロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）［かつてはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）として公知であった］、ヒツジ、ヤギ、ウマ、そしてまた、時にはヒトの肺における膿瘍を引き起こすコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などである。これらの細菌種の全ては、マクロファージ内で生存し、それに感染し、このタイプの宿主細胞内で複製される能力を共有する。
【０００５】
この特徴的な特性は、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害（本明細書においては「障害」なる語は「疾患」と同等な語として用いられる）の治療を著しく妨げる。多くの場合、臨床徴候が実際に存在する場合には治療は抗生物質を使用して行われる。しかし、これは難題である。なぜなら、マクロファージ内には相当な量の該細菌が存在し、抗生物質がそれに到達するのは困難だからである。したがって、抗生物質での治療は、しばしば、長い治療期間を要し、その成否は様々である。ヒトにおける結核、魚類におけるノカルジア症および子ウマにおける肺炎のような疾患では、予防的治療が好ましいであろう。そのような予防的治療は典型的には、野生型細菌に由来する不活化または生弱毒化細菌を含むワクチンの使用によるものである。マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に関しては、不活化（死菌）ワクチン（すなわち、死んだ細菌またはその１以上のサブユニットを療法因子として含むワクチン）は成功をもたらさないことが判明している。現在、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に対する予防的治療の成功のためには生細菌を要すると一般に考えられている。なぜなら、これらのみが、マクロファージに到達する能力、および適度な免疫応答を誘発するのに十分な程度に野生型細菌を模擬する能力を有しうるからである。実際、結核を治療するためには、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に非常に密接に関連しているマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）種に基づく生ワクチン（ＢＣＧ，カルメット・ゲラン桿菌）が利用可能である。しかし、防御効果は優れたものではない。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）およびノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）のようなノカルジアセエ科の種に関しては、現在、商業的に入手可能なワクチンは存在しない。コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に関しては、自己ワクチンを使用する防除が試みられているが、その成否は様々である（ＲＵＭＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００６）。
【０００６】
マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための適当な予防的治療が明らかに必要とされている。この意味における治療は、野生型微生物でのチャレンジの負の効果を少なくとも軽減するのに十分な程度に標的動物の免疫系を刺激することを意味する。その目的は、これが該障害に対する防御を招くこと、すなわち、該障害が予防され、または少なくとも、該動物における感染または疾患の臨床徴候のレベルが低下し、結果的に疾患の重症度も低下することである。マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌が宿主内での生存のために同じ戦略を採っていることは、これらの細菌による感染に対する予防的治療のための共通の戦略の着想をもたらす。
【０００７】
この点に関しては、コレステロール代謝がマクロファージにおけるノカルジオフォーム放線菌の生存において極めて重要な役割を果たしており、重要なビルレンス（毒性）因子でありうる、と文献に記載されていることが注目される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２）。この代謝は、病原性株と戦うための新規治療用物質、すなわち、感染が生じた後の治療のための薬物の論理的標的となることも示唆された。実際、先行技術を精査してみると、全てのマクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に関して、宿主マクロファージ内での該細菌の生存および維持においてコレステロール代謝が或る役割を果たしているという確立された事実を裏付ける他の証拠が見出される。例えば、第１１章（題名：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ ｅｑｕｉ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｉｎ“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）からは、幾つかのノカルジオフォーム放線菌により引き起こされる感染の間には臨床総体症状における大きな類似性が存在することが公知であり、コレステロールオキシダーゼがビルレンス因子の酵素成分であることが確認された。Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５６，Ｉｓｓｕｅ ３−４，Ｊｕｎｅ １９９７，２６９−２７６には、該コレステロールオキシダーゼ過程にはロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）と共にコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が関与することが示されている。
【０００８】
したがって、一見したところでは、そのことは、コレステロール代謝がマクロファージ内のこれらの細菌の生存において極めて重要な役割を果たしているという認識により、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物（そのような組成物はワクチンとも称されうる）を開発する気にさせそうである。しかし、前記で言及したＰＮＡＳ論文（２００７年の論文）においてなされている示唆は薬物に関連しており、したがって、該細菌のコレステロール代謝を妨げることにより該細菌を完全に殺すことを目的としていることを認識すれば、同じ戦略に従うことは生ワクチンには不適と思われる。すなわち、複製の必須部位における該細菌の生存を阻害することにより細菌を弱毒化することを試みると、該細菌は複製されず、宿主動物内に存続するであろう。確かに、薬物での治療の場合には、これは理想的な状況である。しかし、生ワクチンの場合には、該細菌の生存を完全に阻止すると、不活化細菌を含むワクチンを模擬すると予想される。
【０００９】
そのようなワクチンは、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌に対する治療には成功しないことが判明している。野生型病原性ナカルジオフォーム放線菌でのチャレンジに対して動物を防御するための医薬組成物における、コレステロール代謝において欠損した生細菌の使用を評価するための試みが尚も行われている。そのような試みの一例は、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株１０３＋（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８，２００６，ｐｐ ２４０−２４６）のコレステロールオキシダーゼ（ＣｈｏＥ）突然変異体に基づく生ワクチンである。この試みは成功しなかった。しかし、それは、前記で言及したＰＮＡＳ論文（ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２）の技術的教示に基づいて予想されるとおり、それが防御を誘導しなかったからではなく、該突然変異株が尚も強すぎる毒性を示したからである。該突然変異体は尚も、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）に匹敵するレベルでマクロファージ内で生存し増殖することが可能であった。また、このコレステロール欠損突然変異体の抗原負荷は野生型生物の場合に匹敵するようであった。したがって、該突然変異体は尚も疾患を誘発する能力を有していた。一方、実際に、コレステロールを全く取り込み得ない生突然変異ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）［Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，４ｔｈ Ｈａｖｅｍｅｙｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１３−１６ Ｊｕｌｙ，２００８、およびＶａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら：“Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｍａｒｋｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｕｓｉｎｇ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ８１１（更に、“Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８”とも称される）に提示されているステロール取り込みパーミアーゼ突然変異体ｓｕｐＡＢ］［これは、（少なくとも出発化合物としてコレステロールが使用される場合）完全なコレステロール代謝が遮断されていることを意味する］は尚もマクロファージ内で生存し存続することが可能であり（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）、したがって強すぎる毒性を有することが確認されている。生ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を弱毒化するためには、コレステロール代謝以外に影響を及ぼす追加的な突然変異を必要とするらしい（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ：Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２５，２００７，１００−１１０）。これらの結果に基づいて、コレステロール代謝自体は重要なビルレンス因子ではなく、これらの細菌を十分に弱毒化するためには利用できないと結論づけられた。コレステロール代謝における突然変異を有する細菌は、野生型生物と同じ又は少なくとも比較しうる抗原負荷を有するらしく、したがって、（対象動物が該突然変異細菌でのチャレンジの後で生存した場合には）適度な防御をもたらしうるものの、医薬組成物中で使用されるには余りにも強すぎる毒性を有する。したがって、コレステロール代謝に関与する遺伝子を不活化することにより弱毒化された生細菌を含有する予防的治療用の医薬組成物を目標とすることは、袋小路に入るようなものだと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｌｏｉｓ Ｊ．Ｐａｒａｄｉｓｅら（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９，第１１章
【非特許文献２】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｓｅｎｉｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｍａｒｅｌｌｅ Ｌ．Ｙｅｈｕｄａ，Ｊｕｎｅ ２，２００５
【非特許文献３】Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７，２００５，１３５２−１３６３
【非特許文献４】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，ｎｏ ２３，ｐｐ ８３２７−８３３２
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３，２８２−２８４，２００７
【非特許文献６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３６，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｊｕｎｅ ２００４，ｐｐ １４１５−１４１８
【非特許文献７】ＲＵＭＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００６
【非特許文献８】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２
【非特許文献９】Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５６，Ｉｓｓｕｅ ３−４，Ｊｕｎｅ １９９７，２６９−２７６
【非特許文献１０】Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８，２００６，ｐｐ ２４０−２４６
【非特許文献１１】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，４ｔｈ Ｈａｖｅｍｅｙｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１３−１６ Ｊｕｌｙ，２００８
【非特許文献１２】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｍａｒｋｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｕｓｉｎｇ ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ８１１
【非特許文献１３】Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２５，２００７，１００−１１０
【発明の概要】
【００１１】
しかし、驚くべきことに、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するために、ノカルジオフォーム放線菌種［典型的には、感染細菌と同じ種、あるいはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）とマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）との場合のように非常に密接に関連していて多数のＴ細胞エピトープを共有する種である］の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）と、該細菌を運搬するための医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を使用しうることを、本出願人は見出した。
【００１２】
この場合における「弱毒化」は、該弱毒化細菌のビルレント（しばしば、野生型）病原性対応物に通常関連している疾患の完全な症状を誘導し得ないことを意味する。本発明の場合における「不活化（不活性化）」は、例えばオペロン（すなわち、タンパク質を機能的レベルで実際に発現するのに必要な遺伝子の組）の一部である遺伝子がゲノムから完全に除去されている、または変化していて（いずれかの公知の又は更には今後案出される技術により；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｎａｉｒ，ＩＮＦＩＮＩＴＹ ＳＣＩＥＮＣＥ ＰＲＥＳＳ ＬＬＣ，２００８，ｃｈａｐｔｅｒ １３“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，ｐｐ ４７６−４９６およびｃｈａｐｔｅｒ １５“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，ｐｐ ５６３−６１２を参照されたい）、それが対応野生型タンパク質を、もはやコードしていない、または完全な転写に、もはや利用不可能であることを意味し、あるいは該遺伝子がゲノム内のいずれかの他の変化を受けていて、該遺伝子（または適用可能な場合にはオペロン）が、正常な代謝を支持するのに適した形態である状況と比較された場合に、少なくとも、正常なメチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート異化作用を支持するレベルでは、該野生型タンパク質が該弱毒化細菌によりインビボで産生されないことを意味する。本発明の場合における「タンパク質をコードする」は、遺伝子（例えば、オペロンの一部であるもの）が、該タンパク質または該タンパク質のサブユニット（酵素的に活性なタンパク質を一緒になって形成する多サブユニット）を直接的にコードすること、あるいは該遺伝子が、該タンパク質または該タンパク質のサブユニット（酵素的に活性なタンパク質を一緒になって形成する多サブユニット）における、直接的に又は複数の工程により変換される１以上の中間体をコードすることを意味する。「医薬上許容される担体」は、例えばとりわけ無菌状態にされることにより、標的動物に生理的に適合可能な又は許容される、任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌物質、等張および吸収遅延物質などでありうる。そのような運搬媒体の幾つかの具体例としては、水、塩類液、リン酸緩衝食塩水、細菌培養液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。それらは、意図される投与方法に応じて、液体、半固体および固体剤形を与えうる。一般に公知のとおり、運搬媒体の存在はワクチンの効力に必須ではないが、それは該抗原の投与量調整および投与を著しく簡単にしうる。該医薬組成物は、該担体および抗原に加えて、他の物質、例えばアジュバント、安定剤、粘度調節物質または他の成分を含むことが可能であり、該組成物の意図される用途または要求される特性に応じて、それらは添加される。
【００１３】
本発明の医薬組成物中には生細菌が存在し、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子が不活化されるように該細菌は突然変異している。一般に公知のとおり、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート［ＨＩＰまたは３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１，５−インダンジオンとしても公知である］および５−ヒドロキシ−メチルヘキサヒドロインダノンプロピオナート［ＨＩＬまたは３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１−インダノン−δ−ラクトンとしても公知である］は、マクロファージ生存性ノカルジオフォーム放線菌を含むアクチノバクテリアによりコレステロールの分解中に生成される。最近、コリネバクテリネエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）亜目に属する細菌種において、ＨＩＰ分解に関与するトランスフェラーゼのαおよびβサブユニットをコードするオペロン［ｉｐｄＡＢ：インダンジオンプロピオナート分解アルファ＋ベータ（ｉｎｄａｎｅｄｉｏｎｅ ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ ｄｅｇｒａｄｉａｔｉｏｎ Ａｌｆａ＋Ｂｅｔａ）と称される］が特定された（２００７年８月２１日付け出願の米国優先権主張基礎出願に基づく２００８年８月１９日付け出願の同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０８４４を参照されたい）。該公知トランスフェラーゼノックアウト突然変異体は、もはや、ＨＩＰおよびＨＩＬを分解する能力を有さず（前記特許出願の図３を参照されたい）、また、それはＨＩＰ、ＨＩＬまたは４−アンドロステン−３，１７−ジオン上で増殖しない。いずれの場合にも、「ＨＩＰ分解に関与する」は、ノックアウト突然変異体が、もはや、唯一の炭素およびエネルギー源としてのＨＩＰ上で増殖する能力を有さず、あるいは少なくとも、非突然変異細菌により得られうるレベルではＨＩＰ上で増殖する能力を有さないことを意味する。現在のところ、該トランスフェラーゼがＨＩＰ分解自体を異化するのかどうか、また、ＨＩＰ分解が依拠する反応が触媒されるのかどうかは、明らかでない。それでも、ＨＩＰ分解はコレステロール代謝における比較的遅い段階で生じ、コレステロール分解経路における非常に特異的な段階である。コレステロール代謝における突然変異に関する公に入手可能な知見に基づけば（前記のＰｒｅｓｃｏｔｔの文献）、この突然変異は、防御効果をもたらすものの、毒性が余りにも強すぎる生細菌を与える、と予想されるであろう。しかし、本出願人が驚いたことには、そのような突然変異体は適度に弱毒化されているらしく、これはマクロファージ内の該突然変異体の生存能の著しい低下によるものである。ＨＩＰ分解に関与する遺伝子がマクロファージ内の生存におけるそのような重要な役割を果たしている理由は明らかでない。さらに、それは、コレステロール代謝の完全な遮断でさえも、どうやらノカルジオフォーム放線菌のマクロファージ内生存能に対する効果が無いため、乏しい弱毒化効果しか示していない先行技術の結果と矛盾するようである。したがって、この突然変異が、コレステロール異化経路に沿った副次的段階に影響を及ぼし、マクロファージ内の病原性ノカルジオフォーム放線菌の生存能を著しく阻害することを見出したことは、非常に驚くべきことであった。特に、該突然変異生細菌はマクロファージに侵入しそこにおいて存続する能力を尚も有するが（したがって防御免疫応答の刺激は確保される）、それは非常に低レベルであるため、それらのビルレンスは有意に低下するらしく、そしてこのことにより該生細菌は予防的治療に許容されるものとなることが、本発明において見出された。
【００１４】
１つの実施形態においては、１つのオペロン内の複数の遺伝子が不活化されている。複数の遺伝子を不活化することにより、野生型（類似）表現型への該細菌の変化の可能性が減少するであろう。特に、遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢが不活化されている。これらの遺伝子を不活化することにより、有効かつ安全な弱毒化がもたらされうる。好ましい実施形態においては、該不活化は、非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失により少なくとも１つの遺伝子を欠失させることにより実現される。非標識突然変異の利点は、それが同一株における突然変異の反復導入を可能にすることである。該突然変異の導入の過程で外来ＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）が除去される。したがって、第２の突然変異の導入のための新たに導入されるベクターＤＮＡは（ベクターＤＮＡ間の相同組換えによっては）前の突然変異の部位においては組込まれ得ない。組込みは、ベクターＤＮＡが尚も存在すれば、限定的に生じ、多数の偽陽性組込み体を与えるであろう。該系は、莫大な数の突然変異の導入のための唯一の抗生物質遺伝子の使用を可能にする。非標識突然変異はまた、産業における容易な使用を可能にする。なぜなら、異種ＤＮＡが存在しないため、発酵ブロスの容易な使い捨てが可能となるからである。遺伝子欠失による遺伝子不活化は安定な非復帰突然変異体の構築を可能にする。特に小さい遺伝子（＜５００ｂｐ）は単一組換え組込みによる遺伝子破壊より容易に遺伝子欠失により不活化される。遺伝子欠失突然変異誘発は、ゲノムからの幾つかの遺伝子のクラスターを不活化するのに適用されうる。該遺伝子欠失突然変異誘発法は遺伝子置換（例えば、野生型遺伝子を突然変異遺伝子に変化させること）にも適用されうる。
【００１５】
１つの実施形態においては、該細菌はノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）またはマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する。好ましくは、該細菌はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、特に、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種のいずれかに属する。これらの種に関しては、現在のところ、適当なワクチンが商業的に入手できない。本発明は、これらの細菌と戦うための、そしてひいては、それらが動物において引き起こす対応疾患を緩和するためのワクチンとして使用されうる医薬組成物の提供を可能にする。
【００１６】
１つの実施形態においては、該医薬組成物は、経口投与に適した形態である。それは非常に簡便な投与方法であることに加えて、特に、この投与方法は安全であることが明らかとなっている。非経口投与は膿瘍を引き起こしうる。好ましくは、該生細菌は１×１０４〜１×１０１０ ＣＦＵ／用量の濃度で存在する。
【００１７】
本発明はまた、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株に由来するロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌、およびこの株に属する細菌に関する。
【００１８】
本発明はまた、対応する野生型細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物を製造するための、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）の使用に関する。
【００１９】
本発明はまた、動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための動物の治療方法に関する。該方法は、ノカルジオフォーム放線菌の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている）を含む医薬組成物を動物に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】マクロファージにおける生存を示す。
【図１−２】マクロファージにおける生存を示す。
【図２−１】マクロファージにおける生存を示す。
【図２−２】マクロファージにおける生存を示す。
【図３−１】チャレンジ後の直腸温度を示す。
【図３−２】チャレンジ後の直腸温度を示す。
【図４】肺に関する死後所見を示す。
【図５−１】プライマーオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図５−２】プライマーオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図６】遺伝子の概要を示す。
【図７】チャレンジ後の結果を示す。
【図８】遺伝子の概要を示す。
【図９−１】マクロファージ内の生存を示す。
【図９−２】マクロファージ内の生存を示す。
【図１０】弱毒化実験の結果を示す。
【図１１】効力実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、本発明の具体的な実施形態を記載する以下の実施例を用いて更に詳しく説明される。該実施形態は以下の３つの部にわたる。
Ａ部：株の同定および構築。
Ｂ部：インビボ弱毒化のモデルとしてのマクロファージ生存。
Ｃ部：野生型による感染に対する防御における突然変異細菌の効力。
【００２２】
Ａ部：株の同定および構築
Ａ１ 培地および増殖条件
バクト−トリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）（ＢＤ）、酵母エキス（ＢＤ）および１％ ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）またはミネラルアセタート培地からなるルリア・バータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地内でロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株を３０℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０で補足されたＢＢＬトリプチカーゼダイズブロス（ＴＳＢ；ＢＤ）エム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５（Ｓｎａｐｐｅｒら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：１９１１−１９１９）を３７℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。ミネラルアセタート培地（ＭＭ−Ａｃ）は、Ｋ２ＨＰＯ４（４．６５ｇ／ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（１．５ｇ／ｌ）、酢酸Ｎａ（２ｇ／ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（３ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、チアミン（４０ｍｇ／ｌ、濾過滅菌；Ｓｉｇｍａ）およびビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）ストック溶液（１ｍｌ／ｌ）を含有していた。ビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）ストック溶液は、以下のとおりに調製した（ＶｉｓｈｎｉａｃおよびＳａｎｔｅｒ，１９５７，Ｒｅｖ．２１：１９５−２１３から改変）。ＥＤＴＡ（１０ｇ／ｌ）およびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（４．４ｇ／ｌ）を蒸留水（２Ｍ ＫＯＨを使用してｐＨ８）に溶解した。ついでＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１．４７ｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（０．２２ｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．３１５ｇ／ｌ）およびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．３２ｇ／ｌ）をその順序でｐＨ６において加え、最後にｐＨ４で保存した。固形培地上の増殖のために、Ｂａｃｔｏ−寒天（１５ｇ／ｌ；ＢＤ）を加えた。５−フルオロシトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を蒸留水中で調製し、５０℃に加熱することにより溶解し、濾過滅菌し、高圧滅菌培地に加えた。
【００２３】
ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）株ＩＮＳ４３６を、Ｔｗｅｅｎ８０（０．０５％）で補足されたユーゴン（Ｅｕｇｏｎ）ブロス（ＢＤ）内で２６℃（２００ｒｐｍ）で増殖させた。固形培地上での増殖のために、バクト（Ｂａｃｔｏ）−寒天（１５ｇ／ｌ；ＢＤ）を加えた。ｓａｃＢ依存性スクロース選択のために、スクロース（２％）を該寒天培地に加えた。
【００２４】
Ａ２ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株１０３＋におけるｉｐｄＡ、ｉｐｄＢおよびｆａｄＥ３０ならびにノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢの同定
前記のとおり、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ遺伝子はメチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート［ＨＩＰ；３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１，５−インダンジオン］および５−ヒドロキシ−メチルヘキサヒドロインダノンプロピオナート［ＨＩＬ；３ａα−Ｈ−４α（３’−プロピオン酸）−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルヘキサヒドロ−１−インダノン−δ−ラクトン］の分解に関与することが判明している。ゲノムデータベースにおけるロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＳＱ１のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢのタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析は、ＩｐｄＡおよびＩｐｄＢをコードする遺伝子ならびにそれらの見掛け上のオペロン体制がロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋（Ｊ．Ｆ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手した野生型株；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１８（２００６）２４０−２４６において言及されているとおり）のゲノムにおいて保存されていることを示した。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋ゲノム配列はＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにおけるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）配列決定グループにより決定されている（「Ｒ．ｅｑｕｉ １０３Ｓ」として公開されているゲノム）。ゲノム解析は更に、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋がｉｐｄＡおよびｉｐｄＢの追加的なパラログ遺伝子（それぞれｉｐｄＡ２およびｉｐｄＢ２と称される）を含有することを示した。これらの遺伝子はコレステロール異化遺伝子クラスターの外部に位置する。ＩｐｄＡ、ＩｐｄＢ、ＩｐｄＡ２およびＩｐｄＢ２のアミノ酸配列を、それぞれ、添付の配列番号１、２、３および４に示す。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢタンパク質のアミノ酸配列の実体を、これらのパラログおよび幾つかの他のアクチノバクテリア（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）オルソログを表６に示す。この表は、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株１０３＋のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢのオルソログをコードする、ノカルジオフォーム放線菌の他のゲノムにおいて同定された遺伝子の概要を示す。本発明に関しては、これらの及び他のオルソログはＩｐｄＡおよびＩｐｄＢと称される。タンパク質の同一性は、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３ＳのＩｐｄＡとＩｐｄＢとの完全長アミノ酸配列の同一性（％）を示している。アクチノバクテリアゲノム配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の微生物ゲノムのゲノムＢＬＡＳＴサーバーから入手した。該ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋配列データはＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）配列決定グループにより作製された。株１０３＋（１０３Ｓとして公知である）のゲノムをこれらの同定目的に使用した。以下に例示するとおり、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）での実際の研究は、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１［ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）感染により引き起こされる肉芽腫性肺炎に罹患した子ウマから分離されたもの］を使用して行った。
【００２５】
メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナートの分解に関与する第２の遺伝子はｆａｄＥ３０である。ΔｆａｄＥ３０突然変異体はＨＩＬおよびＨＩＰ上の増殖において著しく損なわれており、２４時間のインキュベーション後には増殖を実質的に全く示さない。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）のｆａｄＥ３０遺伝子を、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）において入手可能なロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）１０３＋ゲノム上で行うタンパク質配列類似性検索により同定した。ロドコッカス・ジョスティイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）株ＲＨＡ１（Ｒｏ４５９６，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＧ９６３８２）のＦａｄＥ３０のアノテーション付きタンパク質配列をタンパク質配列鋳型として使用した（ＭｃＬｅｏｄら，２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１５５８２−１５５８７；およびＶａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１９４７−１９５２）。Ｒｏ０４５９６でのデータベース類似性検索は、Ｒｏ０４５９６に対して７３％のアミノ酸配列同一性を示すタンパク質をコードするロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）１０３Ｓの遺伝子を示した。このタンパク質はロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）１０３ＳのＦａｄＥ３０（配列番号４３）としてアノテーション付けされ、その対応遺伝子はｆａｄＥ３０と称される。他のアクチノバクテリアにおいてＦａｄＥ３０をコードするオルソログ遺伝子が同様にして同定されうるであろう。これらのうちの選ばれたものを表８に示す。
【００２６】
アクチノバクテリアｉｐｄＡＢ遺伝子座の高度に保存されたヌクレオチド配列上で得られたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢゲノム遺伝子座を３つの部分においてＰＣＲにより増幅した。これらの保存領域は、ｉｐｄＡＢ遺伝子の幾つかの公知アクチノバクテリア配列のヌクレオチド配列アライメントにより同定された。ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）のｉｐｄＡＢ領域のヌクレオチドゲノム配列（ｎｆａ０５０８０−ｎｆａ０５０９０）（ＤＤＢＪアクセッション番号ＡＰ００６６１８）を、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを得るための一次鋳型として使用した。使用したプライマーオリゴヌクレオチド配列を表５に示す。ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６の染色体ＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用した。プライマーｉｐｄＡ−ａｃｔｉｎｏ−ＦおよびｉｐｄＢ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２２）を使用してノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢ遺伝子を増幅し、ｉｐｄ−ａｃｔｉｎｏ−Ｆ２およびｉｐｄＡ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２３）を使用してｉｐｄＡＢの上流領域を増幅し、ｉｐｄＢ−ａｃｔｉｎｏ−Ｆおよびｉｐｄ−ａｃｔｉｎｏ−Ｒ（ＰＣＲ ２１）を使用して下流領域を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター内にクローニングし、該インサートのヌクレオチド配列を決定した。ついで、得られたＤＮＡ配列上で、異なるプライマーペアを得、それを使用してｉｐｄ遺伝子座を再クローニングし、再配列決定した。これは、４，１３９ｂｐを含むノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡＢの完全なヌクレオチド配列を与えた。配列決定されたＤＮＡ断片はノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）のｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ遺伝子ならびにそれらの隣接遺伝子を含有していた。ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６のＩｐｄＡおよびＩｐｄＢの推定タンパク質配列を、それぞれ配列番号５８および配列番号５９に示す。
【００２７】
Ａ３ クローニング、ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡ単離
全てのクローニング法の宿主としてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを使用した。制限酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨから入手した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を該製造業者の説明に従い使用して、細胞培養の染色体ＤＮＡを単離した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ，ｐＨ８）、１×標準ポリメラーゼバッファー、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＤＭＳＯ（２％）、ＰＣＲプライマー（それぞれ１０ｎｇ／μｌ、表５）および高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）またはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）からなる反応混合物（２５μｌ）中でＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲのために、細胞物質を１００μｌのクロロホルムおよび１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と混合し、激しくボルテックスし、遠心分離（２分間、１４，０００×ｇ）した。ついで上部水相（１μｌ）のサンプルをＰＣＲのための鋳型として使用した。標準的なＰＣＲは、９５℃で５分間のＤＮＡ融解工程、ならびにそれに続く９５℃で４５秒間の変性、６０℃で４５秒間のアニーリングおよび７２℃で１〜３分間の伸長の３０サイクルを含むものであった。用いた伸長時間は、１．５分／１ｋｂを一般則として採用して、予想されるＰＣＲアンプリコンの長さに左右された。
【００２８】
Ａ４ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａｅ）の電気的形質転換
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）の細胞を、記載されているのと実質的に同じ方法で（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，受理された前記ＮＡＲ論文；Ｎａｖａｓら，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４７９６−４８０５）、エレクトロポレーションにより形質転換した。簡潔に説明すると、ＯＤ６００が０．８〜１．０に達するまで、細胞培養を５０ｍｌ ＬＢ中、３０℃で成長させた。該細胞をペレット化し（４，５００×ｇで２０分間）、１０％ 氷冷グリセロールで２回洗浄した。ペレット化細胞を０．５〜１ｍｌの氷冷１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌ アリコートに分割した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５の細胞を、記載されているのと実質的に同じ方法で（Ｊａｃｏｂｓら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：５３７−５５５）、エレクトロポレーションにより形質転換した。簡潔に説明すると、細胞培養（２５０ｍｌ）を、ＯＤ６００が０．８に達するまで、ＴＳＢ培地＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０中、３７℃で成長させ、氷上に１時間半放置し、遠心分離（５，０００×ｇで１０分間）して該細胞をペレット化した。該細胞を蒸留水で２回洗浄した。ペレット化細胞を０．５〜１ｍｌの氷冷１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌ アリコートに分割した。ＭｉｌｌｉＱ溶出プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｌ；ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｍギャップ化（ｇａｐｐｅｄ）キュベット内の２００μｌの細胞に加えた。１２．５ｋＶ／ｃｍ、１０００オームおよび２５μＦの単一パルスでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションされた細胞を１ｍｌのＬＢ培地（Ｒ．ｅｑｕｉ）または１ｍｌのＴＳＢ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）と穏やかに混合し、２時間（Ｒ．ｅｑｕｉ）または５時間（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）にわたって３７℃で２００ｒｐｍで回収した。回収された細胞のアリコート（２００μｌ）を選択寒天培地上にプレーティングした。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）形質転換体を、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天上で選択し、３０℃で２〜３日間のインキュベーションの後にそれが出現した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＴＳＢ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０寒天上で選択し、３７℃で４〜５日間のインキュベーションの後にそれが出現した。
【００２９】
ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａｅ）の場合には、株ＩＮＳ４３６の前培養（２０ｍｌ）を、ユーゴンブロス＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（ＯＤ６００ｎｍ＝６）中、２６℃（２００ｒｐｍ）で５日間成長させ、それを使用して１００ｍｌの新鮮なユーゴンブロス＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０培地（１：１００）に接種した。初代培養を、ＯＤ６００ｎｍ＝１．３まで、２６℃で２０時間にわたって一晩成長させた。該細胞を４℃でペレット化し（２０分間、４０００ｇ）、５０ｍｌの氷冷１０％ グリセロールで２回洗浄した。該ペレット化細胞を５００μｌの１０％ グリセロールに再懸濁させ、２００μｌのアリコートに分割し、直ちに電気的形質転換のために使用した。ＭｉｌｌｉＱ溶出プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｌ；ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｍギャップ化（ｇａｐｐｅｄ）キュベット内の２００μｌの細胞に加え、混合し、氷上で１分間放置した。１７．５ｋＶ／ｃｍ、２００オームおよび５０μＦ（おおよその時間パルス９．３ｍｓ）の単一パルスでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションされた細胞を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０で補足された１ｍｌのユーゴンブロスと穏やかに混合し、３．５時間にわたって２６℃で２２０ｒｐｍで回収した。回収された細胞の５０および１００μｌのアリコートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）で補足された選択ユーゴン寒天上にプレーティングした。２６℃で７日間のインキュベーションの後、形質転換体が出現した。
【００３０】
Ａ５ ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）選択を用いるロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株における非標識遺伝子欠失
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）の非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失突然変異体を、記載されているのと実質的に同じ方法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）で作製した。野生型または突然変異細胞のエレクトロポレーションから得たロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）形質転換体を、アプラマイシンで補足されたＬＢ寒天培地上にストリークしてアプラマイシン耐性（ＡｐｒａＲ）を確認した。形質転換当たり４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、２５ｍｌのＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍで一晩（２０〜２４時間）増殖させ、１００μｌ アリコート中の５−ＦＣ（１００μｇ／ｍｌ）で補足されたＭＭ−Ａｃ寒天プレート上にＭＭ−Ａｃ培地中の１０１〜１０３倍希釈度でプレーティングした。３０℃で３日間のインキュベーションの後に出現した５−ＦＣ耐性コロニーを、ＬＢ寒天上、およびアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）で補足されたＬＢ寒天上にレプリカストリークして、アプラマイシン感受性（ＡｐｒａＳ）および５−ＦＣ耐性（５−ＦＣＲ）コロニーを選択した。遺伝子欠失の遺伝子座を増幅するプライマー（表５）を使用するコロニーＰＣＲにより、ＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーを所望の遺伝子欠失の存在に関して確認した。潜在的遺伝子欠失突然変異体からゲノムＤＮＡを単離し、それを使用して、遺伝子欠失を確認した。これは、ｉｐｄＡＢまたはｉｐｄＡＢ２遺伝子座ならびにこれらの遺伝子座の上流および下流領域を増幅するプライマー（表５に記載されているプライマー）を使用して行った。
【００３１】
Ａ６ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）におけるｉｐｄＡＢおよびｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｉｐｄＡＢオペロンの非標識遺伝子欠失の生成のためのプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１を以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，３６８ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，３９６ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｅｑｕｉＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢｅｑｕｉＤＯＷ番号）隣接領域をＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）により増幅した。得られたアンプリコンをＥｃｏＲＶ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内に連結して、それぞれ上流および下流領域にプラスミドｐＥｑｕｉ１４およびｐＥｑｕｉ１６を得た。ｐＥｑｕｉ１４の１．４ｋｂのＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ断片をＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ消化ｐＥｑｕｉ１６内に連結してｐＥｑｕｉ１８を得た。ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失およびその隣接領域を含有する、ｐＥｑｕｉ１８の２．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクレノウフラグメントで処理し、ＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ自殺ベクター（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）内に連結した。得られたプラスミドを、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１とも称される）の構築のためにｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１と命名した。この突然変異体はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８として寄託された。
【００３２】
二重遺伝子欠失突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７とも称される）を、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を使用して、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢ突然変異株におけるｉｐｄＡＢ２オペロンの非標識遺伝子欠失により作製した。プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡｂ２を以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ２の上流（１，４４４ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，３８７ｂｐ；ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮ−Ｆ、ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷ番号）領域を、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ（表５、ＰＣＲ６およびＰＣＲ７）により増幅した。該アンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ内に連結して、それぞれプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰおよびｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮを得た。ＢｇｌＩＩ／ＳｐｅＩでの両プラスミドの消化の後、ｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＤＯＷＮの１，３８１ｂｐの断片をｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄＡＢ２ｅｑｕｉＵＰ内に連結して、ΔｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失の構築のために使用するｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を得た。得られた突然変異体ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２はＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された。
【００３３】
Ａ７ マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５におけるｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５におけるｉｐｄＡＢ遺伝子の非標識遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，５０２ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ−Ｒ）および下流（１，４３１ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷ番号）隣接領域を、鋳型としてマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１２およびＰＣＲ１３）により増幅した。得られたアンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，１９９４，Ｇｅｎｅ １４５：６９−７３）内に連結して、それぞれｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰおよびｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＤＯＷＮを得た。ついで、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰから得た１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩで線状化されたｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇＵＰ内に連結して、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のために使用するｐＫ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを構築した。
【００３４】
Ａ８ ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）におけるｆａｄＥ３０の遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｆａｄＥ３０の非標識遺伝子欠失の生成のためのプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を以下のとおりに構築した。ｆａｄＥ３０の上流（１，５１１ｂｐ；プライマーｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＵＰ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＵＰ−Ｒ）および下流（１，４４９ｂｐ；プライマーｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＤＯＷＮ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｅｑｕｉＤＯＷ番号）隣接ゲノム領域を、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ）を使用する標準的なＰＣＲ（表５；ＰＣＲ１５およびＰＣＲ１６）により増幅した。得られたアンプリコンをｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ）内に連結してｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＵＰおよびｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＤＯＷＮを得た。１．４ｋｂのＢｃｕＩ／ＢｇｌＩＩ ＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＤＯＷＮから切断し、ＢｃｕＩ／ＢｇｌＩＩで線状化されたｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０ＵＰ内に連結してｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０を得た。ｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を構築するために、ｐＧＥＭＴ−ｆａｄＥ３０をＮｃｏＩおよびＢｃｕＩで消化し、クレノウフラグメントで処理した。ｆａｄＥ３０遺伝子欠失を含有する２．９ｋｂの平滑末端ＤＮＡ断片をＳｍａＩ消化ｐＳｅｌＡｃｔ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）内に連結した。得られたプラスミドをｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０と命名し、突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０の構築のために使用した。
【００３５】
Ａ９ ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のためのプラスミドの構築
ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６におけるｉｐｄＡＢ遺伝子の非標識遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを以下のとおりに構築した。ｉｐｄＡＢ遺伝子の上流（１，４８７ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ−Ｒ；ＰＣＲ２４）および下流（１，０４９ｂｐ；プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷ番号；ＰＣＲ２５）隣接領域を、ＤＮＡ鋳型としてカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６のゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより増幅した（表５）。得られたアンプリコンをＳｍａＩ消化ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，１９９４，Ｇｅｎｅ １４５：６９−７３）内に連結して、それぞれｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰおよびｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮを得た。ついで、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化ｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮから得た１．０７ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで線状化されているｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒＵＰ内に連結して、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失のために使用するプラスミドｐＫ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを構築した。
【００３６】
Ａ１０ 突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢおよびロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２の構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）のために開発された５−フルオロシトシン対抗選択での２段階相同組換え法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）を用いて、ｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）およびｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）のロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）非標識遺伝子欠失突然変異体を構築した。ΔｉｐｄＡＢ突然変異ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＧ１３４１の構築のために、非複製型プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１を電気的形質転換によりロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１に転移させた。ついで、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｉｐｄ１とＲＥ１ゲノムとの間の相同組換えから得られた４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、遺伝子欠失を引き起こす第２の稀有相同組換え事象の発生に関して選択するために、５−ＦＣ選択に付した。１８個のランダムに拾ったＡｐｒａＳ／５ＦＣＲコロニーをコロニーＰＣＲに付した。３個のＦＣＲ／ＡｐｒａＳコロニーが予想サイズ（２９６ｂｐ、表５、ＰＣＲ５）のアンプリコンを与えた。ゲノムＤＮＡをこれらの３つのΔｉｐｄＡＢ突然変異体から単離し、ｉｐｄＡＢ遺伝子座ならびにその上流および下流隣接領域のＰＣＲ分析に付した（表５、ＰＣＲ３およびＰＣＲ４）。この分析は３例中２例において真正ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明し、ｉｐｄＡＢ遺伝子座における異常なゲノム再構成を示さなかった。ビルレンスプラスミドのマーカーとしてのｖａｐＡの存在がＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１１）により確認された。１つのｉｐｄＡＢ突然変異株を選択し、ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＧ１３４１と命名し、更なる研究に使用した。
【００３７】
ΔｉｐｄＡＢ単一突然変異体の単離に関して記載されているのと実質的に同じ方法でプラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２を使用して、二重遺伝子欠失突然変異株ＲＧ２８３７を株ＲＧ１３４１から構築した。ｐＳｅｌＡｃｔ−ΔｉｐｄＡＢ２での株ＲＧ１３４１の細胞のエレクトロポレーションから得た４つのＡｐｒａＲ形質転換体を、ＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーを選択するために５−ＦＣ選択に付した。ｉｐｄＡＢ２オペロンを増幅するために作製されたオリゴヌクレオチド（表５、ＰＣＲ１０）を使用する、１８個のＡｐｒａＳ／５−ＦＣＲコロニーの後続のＰＣＲ分析は、得られた１２３ｂｐのアンプリコンから明らかなとおり、２つのコロニーがΔｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失を含有することを証明した。ＰＣＲによるｉｐｄＡＢ２遺伝子座の上流および下流領域の更なる分析はｉｐｄＡＢ２遺伝子欠失の存在を証明し、異常なゲノム再構成を示さなかった（表５、ＰＣＲ８およびＰＣＲ９）。また、ｖａｐＡビルレンス遺伝子の存在がＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１１）により確認された。１つのΔｉｐｄＡＢΔｉｐｄＡＢ２二重遺伝子欠失突然変異株ＲＧ２８３７を更なる研究のために選択した。
【００３８】
Ａ１１ 突然変異株マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ΔｉｐｄＡＢの構築
以下のとおりにｓａｃＢ対抗選択系（Ｐｅｌｉｃｉｃら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：９１９−９２５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００１，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０５：１９７−２０２）を用いて、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５の非標識ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体を構築した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のΔｉｐｄＡＢ突然変異体の構築のために、非複製型プラスミドｐ１８−ｉｐｄＡＢｓｍｅｇを電気的形質転換によりマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に転移させた。幾つかの形質転換体を得た。１つのカナマイシン耐性形質転換体を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＴＳＢ培地中、３７℃で非選択的に２日間増殖させ、ついで、ｓａｃＢ対抗選択によりカナマイシン感受性（ＫｍＳ）およびスクロース耐性（ＳｕｃＲ）二重組換え体を選択するために、２％ スクロースを含有するＴＳＢ寒天プレート上にプレーティングした。３日間のインキュベーションの後に出現したコロニーをＴＳＢ寒天上、およびカナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で補足されたＴＳＢ寒天上にレプリカストリークして、ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを選択した。コロニーＰＣＲ（表５、ＰＣＲ１４）により、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在に関して真正ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを更に調べた。３つの潜在的ｉｐｄＡＢ突然変異体からゲノムＤＮＡを単離した。ＰＣＲ分析はｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明した。１つのｉｐｄＡＢ突然変異株を更なる研究のために選択し、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ΔｉｐｄＡＢと命名した。
【００３９】
Ａ１２ 突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０の構築
ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）のために開発された５−フルオロシトシン対抗選択での２段階相同組換え法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００８）を用いて、ｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）およびｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）のロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ＲＥ１におけるｆａｄＥ３０の非標識遺伝子欠失を作製した。ΔｆａｄＥ３０突然変異株の構築のために、非複製型プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０を電気的形質転換によりロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）株ＲＥ１に転移させた。ついで、プラスミドｐＳｅｌＡｃｔ−ｆａｄＥ３０とＲＥ１ゲノムとの間の相同組換えから得られた２つのＡｐｒａＲ形質転換体を、ｆａｄＥ３０遺伝子欠失を引き起こす第２の稀有相同組換え事象の発生に関して選択するために、５−ＦＣ選択に付した。１８個のランダムに拾ったＡｐｒａＳ／５ＦＣＲコロニーを、プライマーｆａｄＥ３０ｃｏｎｔ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｃｏｎｔ−Ｒ（表５；ＰＣＲ１９）を使用するコロニーＰＣＲに付した。３個のＦＣＲ／ＡｐｒａＳコロニーが予想サイズ（４２８ｂｐ）のアンプリコンを与えた。ゲノムＤＮＡを２つの潜在的ΔｆａｄＥ３０突然変異体から単離し、ＰＣＲ分析に付した。オリゴヌクレオチドプライマーｆａｄＥ３０ｃｏｎｔｒ−ＦおよびｆａｄＥ３０ｃｏｎｔｒ−Ｒ（表５）を使用するｆａｄＥ３０遺伝子座のＰＣＲ分析はｆａｄＥ３０遺伝子欠失の存在および野生型ｆａｄＥ３０遺伝子の非存在を証明した。ＰＣＲによる上流および下流隣接領域の分析は、予想されたそれぞれ１．８６ｋｂおよび１．７６ｋｂの産物を与えた。該分析はどちらの場合においても真正ｆａｄＥ３０遺伝子欠失の存在を証明し、ｆａｄＥ３０遺伝子座における異常なゲノム再構成を示さなかった。ビルレンスプラスミドのマーカーとしてのｖａｐＡの存在がＰＣＲにより確認された。１つのｆａｄＥ３０突然変異株をロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０と命名し、更なる研究に使用した。
【００４０】
Ａ１３ 突然変異株ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ΔｉｐｄＡＢの構築
以下のとおりにｓａｃＢ対抗選択系（Ｐｅｌｉｃｉｃら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：９１９−９２５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｉｚｅら，２００１，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０５：１９７−２０２）を用いて、ノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６の非標識ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失突然変異体を構築した。マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｍｃ２１５５のΔｉｐｄＡＢ突然変異体の構築のために、非複製型プラスミドｐ１８−ｉｐｄＡＢＮｓｅｒを電気的形質転換によりノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ＩＮＳ４３６に転移させた。ついで幾つかのカナマイシン耐性形質転換体を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有するユーゴンブロス培地中、非選択的に２６℃で７日間増殖させた。ついで、２％ スクロースを含有するユーゴン寒天プレート上にプレーティングすることにより、ｓａｃＢ対抗選択によるカナマイシン感受性（ＫｍＳ）およびスクロース耐性（ＳｕｃＲ）二重組換え体の選択を行った。２６℃で７日間のインキュベーションの後に出現したコロニーをユーゴン寒天プレート上、およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）で補足されたユーゴン寒天プレート上にレプリカにより移して、ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを選択した。プライマーｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｒ（表５）を使用するコロニーＰＣＲにより、ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在に関して、真正ＫｍＳ／ＳｕｃＲコロニーを更に調べた。３つの潜在的ｉｐｄＡＢ突然変異体からゲノムＤＮＡを単離した。プライマーペアｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−ＦおよびｉｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｒ（ＰＣＲ２３）を使用するＰＣＲ分析は２２２ｂｐのＰＣＲ産物を与え、１，６３４ｂｐの野生型ＰＣＲ産物の非存在を示し、これはｉｐｄＡＢ遺伝子欠失の存在を証明した。ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失を更に確認するために、プライマーペアＩｐｄＡＢＮｓｅｒ−Ｆ２およびＩｐｄＡＢＮｓｅｒＤＯＷＮ−Ｃｏｎｔｒ−Ｒ（ＰＣＲ２６）を使用した。このプライマーペアはｉｐｄＡＢ突然変異体に関する１，１４８ｂｐの予想されたＰＣＲ産物を与え、一方、該野生型株の場合においてのみ、２，５６０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。１つの突然変異株をノカルジア・セリオレ（Ｎ．ｓｅｒｉｏｌａ）ΔｉｐｄＡＢと命名し、更なる研究のために選択した。
【００４１】
Ｂ部：インビボ弱毒化のモデルとしてのマクロファージ生存
Ｂ１ 使用株
ビルレント株
株ＲＥ１：野生型親株。この株はコレステロール上で増殖する。株ＲＥ１ΔｓｕｐＡＢ：ｓｕｐＡＢ遺伝子の欠失体。この株はコレステロール上で増殖できない。
【００４２】
非ビルレント株
株１０３−：８０−から９０−ｋｂのビルレンスプラスミドを欠き、ウマにおいて非病原性であることが公知である（Ｔａｋａｉら，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：６８４０−６８４７）。この株はコレステロール上で増殖する。
【００４３】
本発明の株
株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ（ＲＧ１３４１）：コレステロール異化クラスターにおけるｉｐｄＡＢ遺伝子が欠失している。この株は４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）上で増殖しない。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋：ＡＤ上で増殖するように順応した株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの細菌［唯一の炭素源としてのＡＤと共に株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢを高濃度（１０６ＣＦＵ／ｍｌ以上）でプレーティングした場合には、ＡＤ上で増殖する少数のコロニーが出現しうる］。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２（ＲＧ２８３７）：（コレステロール異化クラスターの部分ではない）ｉｐｄＡＢ遺伝子のもう１つの組も欠失している。この株はＡＤ上では増殖しない。株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０。この株はＨＩＰ／ＨＩＬおよびＡＤ上での増殖に関して著しく欠損している。
【００４４】
Ｂ２ マクロファージ感染のためのロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）培養
マクロファージ生存アッセイにおいて試験すべき種々のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株を栄養ブロス（Ｄｉｆｃｏ）内で３７℃、１００ｒｐｍで一晩（１７時間）増殖させて、１〜２×１０８ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。新鮮に調製した培養のみを使用した。該マクロファージの接種後、感染価を確認するために生存数測定（プレート計数）を行った。
【００４５】
Ｂ３ 子ウマへのチャレンジのためのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）培養
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株ＲＥ１、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋を血液寒天上でプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。プレート当たり４ｍｌの無菌等張ＰＢＳで細菌を集めた。該細菌懸濁液を無菌等張ＰＢＳで希釈して、４×１０４ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。輸送は室温で行った。該希釈培養は、調製後４時間以内に使用した。チャレンジ後、感染価を確認するために生存数測定（プレート計数）を行った。生存数は、それぞれ、ＲＥ１では４．３５×１０４ ＣＦＵ／ｍｌ、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢでは７．１×１０４ ＣＦＵ／ｍｌ、およびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＢ＋では５．８×１０４ ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００４６】
Ｂ４ 試験系
マクロファージ細胞系
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株の生存に関して試験するために細胞系Ｕ９３７（ヒト単球）を使用した。該単球を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで緩衝化され２００ ＩＵ／ｍｌ ペニシリンおよびストレプトマイシンならびに１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足されたＲＰＭＩ １６４０＋ＮａＨＣＯ３＋ＮＡＰＹＲ＋グルコース培地（ＲＰＭＩ １６４０培地）内で増殖させ。該細胞を３７℃および５％ ＣＯ２において懸濁状態で増殖させた。
【００４７】
子ウマ
８頭の子ウマ（７頭は３〜５週齢の子ウマであり、１頭は７週齢であった）（全て母ウマを伴っていた）を使用した。全群にわたって年齢分布が均等になるように、該子ウマを３頭、３頭および２頭の子ウマの３群に割り当てた。該実験中、該子ウマは乳を吸い、母ウマは標準的な手法により給餌された。新鮮な水道水が自由に摂取できるようにした。
【００４８】
【表１】
【００４９】
Ｔ＝０において、針付きシリンジを使用して（いわゆる、経気管注射）、株ＲＥ１、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢまたはＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋の１００ｍｌのチャレンジ培養物（前記「子ウマへのチャレンジのためのロドコッカス培養」を参照されたい）で全ての子ウマを気管内にチャレンジした。
【００５０】
Ｂ５ 実験方法およびパラメーター
マクロファージ生存試験
マクロファージ生存アッセイのために、前記のとおり、単球を数日間増殖させた。培地を新鮮な培地と交換し、６０ｎｇ／ｍｌ ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で該細胞を一晩活性化させて、マクロファージへのそれらの分化を誘導した。分化した細胞を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、１０％ ＦＢＳを含有する新鮮な抗生物質非含有ＲＰＭＩ１６４０培地にペレットを再懸濁させた。試験すべき各株ごとに、約１０６ 細胞／ｍｌの細胞懸濁液１０ｍｌを含有するチューブにロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を約１０細菌／マクロファージの感染多重度で接種した。該細菌を該マクロファージと共に３７℃、５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした。該培地を、１０％ ＦＢＳおよび１００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンで補足された１０ｍｌのＲＰＭＩ培地と交換し、再び１時間インキュベートして、細胞外細菌を殺した。該マクロファージ（インターナリゼーションされたロドコッカス・エクイを含有するもの）を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで緩衝化され１０％ ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンで補足された４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地にペレットを再懸濁させた。この懸濁液を４本の培養ボトル（それぞれ１０ｍｌ）に分割し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。４、２８、５２および７６時間後、該マクロファージ（株当たり１本の培養ボトル）を遠心沈降（２００×ｇで５分間）させ、ペレットを１ｍｌの抗生物質非含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２回洗浄した。最後に、該ペレットを０．０１Ｍ リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で細胞溶解し、ついで生存数測定（プレート計数）を行った。
【００５１】
子ウマへのチャレンジ
１−直腸温度：チャレンジの１日前、チャレンジの当日（チャレンジの直前）、ついで、チャレンジ後は剖検まで１日１回測定した。
【００５２】
２−臨床検査：チャレンジ後３週間にわたり、該ウマを臨床徴候に関して毎日検査した。
【００５３】
３−死後検査および細菌学：チャレンジ後第２１日に、該子ウマを秤量し、ついでキシラジン（１００ｍｇ／１００ｋｇ）およびケタミン（５００ｍｇ／１００ｋｇ）での麻酔ならびにそれに続く失血により死亡させた。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。肺および付随リンパ節に特に注意して、完全な死後検査を行った。異常の場合には、病理学者により必要とみなされたら、組織学的検査のためのサンプルを採取した。
【００５４】
組織サンプル（１ｃｍ３）を、肺の各半分の葉を代表する７つの標準的な部位（半分当たり３つの部位＋付属葉）から切除し、各部位に関して、罹患組織が存在する場合にはそれを優先的に選択した。鏡像サンプル（各半分の同等の葉の２つのサンプル）をプールして、子ウマ当たり３つのサンプル＋１つの付属葉のサンプルを得た。それぞれの（プールされた）サンプルをホモジナイズし、系列希釈し、血液寒天プレート上に接種し、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌホモジネートとして表した。全ての他の異常から追加的スワブを採取した。スワブを血液寒天プレート上にストリークし、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を、まず、その典型的な非溶血性ムコイドコロニー形態学的特徴により同定した。グラム染色、ＡＰＩ／フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）および／またはＰＣＲにより、更なる同定を行った。
【００５５】
Ｂ６ 結果
マクロファージにおける生存
２つの別々の実験の結果を表１（および図１）および表２（および図２）に示す。該結果は、ＲＥ１ΔｓｕｐＡＢ突然変異体が、野生型親株ＲＥ１と同様にマクロファージ内で生存可能であることを示しており、このことは、コレステロール代謝がマクロファージ生存に必須ではないことを示している。これは、コレステロール代謝自体がビルレンスには重要でないという認識と合致する。これとは対照的に、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋および株１０３−のマクロファージ内生存は明らかに低下した。しかし、それらの細菌が、有意に低下したレベル（典型的には野生型レベルの１００〜１０００倍低い濃度）でではあるが、マクロファージ内で尚も生存可能であることに注目されたい。株１０３−は８０−から９０−ｋｂのビルレンスプラスミドを欠き、ウマにおいて非ビルレントであることが公知である（Ｔａｋａｉら）。この株１０３−はワクチン株としては適当でない。なぜなら、それは、おそらくそれが該ビルレンスプラスミドを欠いているため、防御免疫応答を誘導しないからである。表９（および図４）には、野生型株ＲＥ１および株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢと比較された突然変異株ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０に関する結果が示されている。明らかに、ｆａｄＥ３０突然変異体は、ΔｉｐｄＡＢ株と比較されうる生存特性を有し、また、より低いマクロファージ内生存能を有する。
【００５６】
メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解活性に関与するタンパク質をコードするオペロンにおける突然変異を有する株［すなわち、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋およびロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）ΔｆａｄＥ３０］での結果は、これらの株が、より低いマクロファージ内生存能を有すること、特に、それらの生存能が非病原性株１０３−の生存能に匹敵することを示している。これは、既に、適度な弱毒化の良好な指標である。株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋は株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢと同じマクロファージ表現型を示した。このことは、野生型レベルでのマクロファージ生存に必須なものが、無傷コレステロール代謝ではなく無傷ｉｐｄＡＢオペロンであることを示している。単一ｉｐｄＡＢ遺伝子欠失（コレステロール異化遺伝子クラスターにおけるもの）はマクロファージ生存の阻害をもたらした。これらの遺伝子のコピー（ｉｐｄＡ２およびｉｐｄＢ２と称される、コレステロール異化クラスター以外のｉｐｄＡおよびｉｐｄＢ）における追加的な欠失は該マクロファージ試験において更なる弱毒化効果を及ぼさなかった。これらの結果を考慮して、株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋（＝ＡＤ上での増殖に順応した株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ）を子ウマに気管内投与し（通常のチャレンジ法）、野生型親株ＲＥ１と比較してインビボ弱毒化を試験した。
【００５７】
直腸温度
表３（および図３）には、直腸温度の結果が示されている。群１は、野生型ＲＥ１株が投与された群である。群２および３には、それぞれＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋が投与された。第３日〜第１０日の温度は示されていない。なぜなら、それらは正常直腸温度からの有意な変化を何ら示さなかったからである。異常温度が太字で示されている。野生型親株ＲＥ１でチャレンジされた３頭中２頭の子ウマ（番号１８および１９）は、チャレンジの１４日後以降の明らかに増加した直腸温度を示した。１４日後の直腸温度の増加は臨床徴候の発生と符合した（後記を参照されたい）。子ウマ番号２１（株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢでチャレンジされたもの）は、チャレンジ後第１日に、若干増加した温度（３９．１℃）を示したが、これは、おそらく、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）感染に関連していない（このチャレンジモデルにおけるインキュベーション時間は通常、７日を超える）。さらに、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢまたはＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋のいずれでチャレンジされた子ウマにおいても、温度上昇は観察されなかった。
【００５８】
チャレンジ後の臨床徴候
第７日から第２１日までの臨床スコアは実際に、野生型親株ＲＥ１でチャレンジされた子ウマ番号１８および１９がチャレンジの１３日後から呼吸疾患の徴候を現すことを示した。子ウマ番号１７（ＲＥ１チャレンジ群）はチャレンジ後に軽度の臨床徴候を示したに過ぎなかった。突然変異株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋でチャレンジされた子ウマは呼吸疾患の明らかな徴候を示さなかった。後者の２つの群の臨床効果は、主に、若干増加した心拍に基づくものであった。これはまた、（部分的に）ストレスの処理によるものであった可能性がある。なぜなら、それはチャレンジ前にも存在したからである。
【００５９】
死後検査
肺に関する死後所見を表４に示す。野生型親株ＲＥ１でのチャレンジの後、該子ウマは呼吸疾患の徴候を現した（特に子ウマ番号１８および１９）。突然変異株でチャレンジされた子ウマは依然として健康であった。チャレンジ後第２１日に、該子ウマを殺し、剖検した。死後において、該野生型株でチャレンジされた全ての子ウマは典型的な化膿性肉芽腫肺炎を有しているようであった。ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）を純粋培養としてそれから再単離し、該野生型株の同一性をＰＣＲにより確認した。また、子ウマ番号１８からは、拡大した縦隔リンパ節から、野生型ロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）が単離された。該突然変異株でチャレンジされた子ウマの肺は肺炎領域を示さず、子ウマ番号２０の若干拡大した気管支リンパ節からの場合および子ウマ番号２４の健常肺組織からの場合を除き、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）は単離されなかった。これらの単離物の同一性は、それぞれＰＣＲおよびＡＤ寒天上の増殖により、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋と確認された。
【００６０】
Ｂ７ これらの実験のＢ部の結論
株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋はマクロファージ生存において明らかに欠損しており、子ウマにおいて弱毒化されている。ｉｐｄＡＢ遺伝子の第２コピーのノックアウト（ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２を与える）は、マクロファージ生存試験において、そして恐らくは子ウマにおいても、追加的な効果を及ぼさないようであった。株ＲＥ１、ＲＥ１ｓｕｐＡＢ、１０３−、ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋でのインビボおよびインビトロの総合的な結果は、ノカルジオフォーム放線菌に属する細菌に関するマクロファージ生存レベルとインビボビルレンスとの間の良好な相関性を示している。特に、突然変異株が、有意に低下（典型的には、ビルレント親株に対して約２〜３ｌｏｇ）したマクロファージ生存能を有する場合、該突然変異株は該親株と比べて有意に弱毒化されている。
【００６１】
感染の様態および毒性因子がノカルジオフォーム放線菌の間で共有されているという一般に公知の事実、したがってロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）が、マイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を研究するための、特に、マクロファージ生存および存続性に関連したビルレンス因子に関するモデルとして一般に使用されること（とりわけ、ＰＮＡＳ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．６，ｐｐ １９４７−１９５２を参照されたい）に基づけば、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化による細菌の生存率の低下はノカルジオフォーム放線菌の弱毒化に関して一般的なことだと理解される。
【００６２】
Ｃ部：野生型による感染に対する防御における突然変異細菌の効力
Ｃ１ 序論
本発明の生突然変異細菌を含有する医薬組成物に関する効力は固有のものだと考えられる。これは、コレステロール代謝における突然変異を有する細菌が、野生型生物のものに匹敵する抗原負荷を尚も有することを、コレステロール代謝における突然変異に関する公に入手可能な知見が明らかに示していることを認識することにより理解されうる。該突然変異生細菌はマクロファージに侵入しそのなかで存続する能力を尚も有するという本発明により入手可能となった現在の知見と組合せると、免疫応答の刺激が確保されることは疑いがない。それでもなお、本出願人は、この見解を証明するための実験を行った。このために、生ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を含有するワクチンを使用した。本質的に、この細菌に対して利用可能なワクチンは尚も存在せず、このことは該実験を本質的に重要なものとする。しかし、より重要なことには、この細菌は、他のノカルジオフォーム放線菌、特にマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関する良好なモデルと一般に認識されている。他の証明実験（ノカルジオフォーム放線菌の全範囲を含む証明結果を得るためのもの）は、例えばノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）を使用して行われうるであろう（Ｃ６節を参照されたい）。これは魚類病原体であり、他のマクロファージ生存ノカルジオフォーム放線菌に対する適当なワクチンが利用可能でないのと同じ理由により、それに対する適当なワクチンは利用可能でない。
【００６３】
Ｃ２ 実験計画
１６頭の２〜４週齢の子ウマを該研究に使用した。該子ウマを４頭の子ウマの４つの群に分け、種々の用量のＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ（無菌等張リン酸緩衝食塩水中で還元される）を含有する１ｍｌのワクチンをそれに経口的にワクチン接種した。群１には５×１０９ ＣＦＵをワクチン接種し、群２には５×１０８ ＣＦＵをワクチン接種し、群３には５×１０７ ＣＦＵをワクチン接種し、群４は未ワクチン接種対照として残された。ワクチン接種はＴ＝０およびＴ＝２週の時点で行った。Ｔ＝４週において、全ての子ウマをロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株８５Ｆ（１００ｍｌ用量当たり５×１０６ ＣＦＵを含有する）の１００ｍｌの培養物で気管内にチャレンジした。
【００６４】
チャレンジ後の３週間にわたり、該ウマを臨床的に評価した。該子ウマを初回ワクチン接種の日、チャレンジの日および剖検の日に秤量した。チャレンジ後３週間の時点で（または重篤な臨床徴候の場合には、それより早期に）、該子ウマを秤量し、安楽死させ、肺および呼吸リンパ節に特に注意して完全な死後検査を行った。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。全ての肺葉からの組織サンプルを検査のために採取した。
【００６５】
Ｃ３ 材料および方法
試験物品
該ワクチンは、無菌等張リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で還元される株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの生ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）を含有していた。該チャレンジ培養物は以下のとおりに調製した。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）株８５Ｆを血液寒天上にプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。プレート当たり４ｍｌの無菌等張ＰＢＳで細菌を集めた。該細菌懸濁液を無菌等張ＰＢＳで希釈して、４×１０４ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度とした。輸送は室温で行った。希釈培養は、調製後４時間以内に使用した。チャレンジ後、感染価を確認するために生存数測定を行った。該感染価は５．３×１０４ ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００６６】
実験方法およびパラメーター
各ワクチン接種の直前ならびに第０、１、２、３、６、１０、１４、１５、１６、１７、２０および２４日（ワクチン接種後）に直腸スワブを採取することにより、細菌の再単離を行った。Ｔ＝０（初回ワクチン接種の直前）に該子ウマから鼻スワブを採取した。該スワブサンプルを生理的塩溶液中で系列希釈し、血液寒天上でプレーティングし、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを、まず、典型的な非溶血性ムコイドコロニー形態学的特徴により同定し、計数し、ＣＦＵ／ｍｌとして表した。それぞれの単離の日に３つの再単離物を（存在する場合には３つの異なるウマから）ランダムに選択し、それを使用して同一性［グラム染色、ＡＰＩ／フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）およびＩｉｐｄＡＢ遺伝子上のＰＣＲ］を確認した。
【００６７】
該研究中、全身健康状態および／または行動の異常に関して、生物専門家が該ウマを毎日観察した。チャレンジの１日前から、該ウマを臨床徴候に関して（剖検まで）毎日検査した。初回ワクチン接種の直前、チャレンジの直前および剖検の直前に秤量を行った。このようにして、体重増加および肺対体重比を計算することが可能であった。
【００６８】
チャレンジ後第１４〜２０日に（重篤な臨床徴候の場合には、それより早期に）、該子ウマをキシラジン（１００ｍｇ／１００ｋｇ）およびケタミン（５００ｍｇ／１００ｋｇ）での麻酔ならびにそれに続く失血により死亡させた。肺対体重比を計算するために肺を秤量した。完全な死後検査を行った。組織サンプル（１ｃｍ３）を、肺の各半分の葉を代表する７つの標準的な部位（半分当たり３つの部位＋付属葉）から切除し、各部位に関して、罹患組織が存在する場合にはそれを優先的に選択した。鏡像サンプル（各半分の同等の葉の２つのサンプル）をプールして、子ウマ当たり３つのサンプル＋１つの付属葉のサンプルを得た。それぞれの（プールされた）サンプルをホモジナイズし、系列希釈し、血液寒天プレート上に接種し、ついで３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）コロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍｌホモジネートとして表した。尖端（左＋右）、尾側（左＋右）および付属肺節に関して固質化の比率を確定することにより、各動物に関する肺炎肺スコアを得た。各動物ごとに、１つの肺スコア数を得るために、これらの比率を加えた。このようにして、０〜５００の肺スコアが得られる。
【００６９】
Ｃ４ 結果
チャレンジ後の結果を表７に要約する。４つ全ての対照が、唯一の病原体としてのロドコッカス・エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉ）により引き起こされる化膿性肉芽腫肺炎の重篤な徴候を現したことが、要約された結果から明らかである。２つのワクチン被接種体番号４および５は、対照と比較されうる徴候を示したが、全ての他のワクチン被接種体はそれより遥かに軽度な徴候を示したか、または徴候を実質的に全く示さなかった。％肺重量（肺炎の量に関する客観的尺度）は該ワクチン被接種体のほとんどにおける部分的な防御を証明している。ワクチン接種された子ウマ番号２は、非特異的細菌により引き起こされる肺炎を有していた。実際、この子ウマは防御されているとみなされうる。なぜなら、大量のチャレンジにもかかわらず、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）が単離されなかったからである。また、肺炎を有するワクチン接種された３頭の子ウマからは、混合感染が単離された。これらの混合感染は、おそらく、種々の防御パラメーターに負の影響を及ぼすであろう。該ワクチンの防御効果は明らかであるが、用量反応効果は観察されなかった。それどころか、最低用量が最良の結果を与えたようである。このことと、子ウマが未熟な胃腸フローラを有することとを考え合わせると、最適用量は１×１０４〜１×１０１０ ＣＦＵであると考えられる。
【００７０】
Ｃ５ 該実験のＣ部の結論
該ワクチンの３つ全ての経口用量は若い子ウマに有効であるらしく、激しい気管内チャレンジに対して相当な防御を誘導した。本実験においては、ｉｐｄＡＢオペロンの遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢを共に、該ワクチンにおける細菌のゲノムから除去した。しかし、同じオペロンに影響を及ぼす他の突然変異も同等に有効でありうることが明らかである。例えば遺伝子ｉｐｄＡまたはｉｐｄＢの１つだけに影響を及ぼす突然変異はそれ自体で同等に有効でありうる。後者の場合のいずれにおいても、関与するトランスフェラーゼは産生され得ず、したがって同じ表現型が得られる。実際、これはＲｅｎｇａｒａｊａｎ（ＰＮＡＳ，Ｊｕｎｅ ７，２００５，Ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．２３，ｐｐ ８３２７−８３３２）からも導かれうる。この参考文献においては、別のノカルジオフォーム放線菌、すなわち、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関する関連証拠が記載されており、オルソログｉｐｄ遺伝子（マイコバクテリウム・ツベルクローシスにおいて、それぞれｒｖ３５５１およびｒｖ３５５２と称される）のいずれかの不活化は同一表現型を与える。
【００７１】
Ｃ６ ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）突然変異体のワクチン効力の証明
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）に関する前記実験を、魚類においてノカルジア症を引き起こす別の放線菌である魚類病原体ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）に関して繰返した。この実験のために、野生型株ＩＮＳ４３６およびΔｉｐｄＡＢ株（前記Ａ１３段落に記載されているもの）を使用した。２０匹のブリ［セリオラ・キンクエラジアタ（Ｓｅｒｉｏｌａ ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）］の群に該野生型株または突然変異株を（種々の濃度で）ＩＰ注射し、２０匹の魚の１つの群を対照として残した。死亡および他の臨床反応の発生に関して該魚を２〜３週間観察して、該突然変異株の弱毒化を評価した。この観察期間の終了時に、生存魚を一定用量の該野生型株でチャレンジして、ワクチンとしての該突然変異株の効力を評価した。さらに２週間にわたり、魚を観察した。
【００７２】
該野生型に関しては、２．２５×１０８ ｃｆｕ／ｍｌの接種物を調製した。該突然変異株に関しては、これは７．８５×１０８ ｃｆｕ／ｍｌ（約３倍高い）であった。これらの原液接種物から、弱毒化研究に使用するための２倍、２０倍、２００倍および２０００倍の希釈物を調製した。該ＩＰチャレンジ物質は１．２×１０６ ｃｆｕ／ｍｌを含有していた。
【００７３】
該弱毒化実験の結果を表１０（これは該観察期間の終了時における死亡率を示す）に示す。該突然変異株は、該野生型株と比べて弱毒化されていることが、この表から明らかとなる。すなわち、該突然変異株の原液接種物はｃｆｕ／ｍｌにおいて３倍高かったが、該突然変異株の投与を受けた群においては死亡率は有意に低かった。該効力実験の結果を表１１に示す。比較されうる防御は得られなかったが、（対照群においては該観察期間中に該魚の６０％が死亡したことを考慮すると）該突然変異体は有意な防御をもたらすことが明らかである。２０００倍希釈物の投与を受けた魚の群においてさえも、野生型ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）でのチャレンジにより、遥かに少数の魚が死亡した。
【００７４】
このように、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化は他のノカルジオフォーム放線菌における弱毒化および防御ワクチン株を与えることが示された。これは、本発明が全範囲のノカルジオフォーム放線菌に適用可能であることを更に支持するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌（ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して該動物を防御するための医薬組成物であって、ノカルジオフォーム放線菌種の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）、およびこれらの生細菌のための医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
オペロン内の複数の遺伝子が不活化されていることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢが不活化されていることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
不活化が、非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失により少なくとも１つの遺伝子を欠失させることにより実現される、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
細菌がノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）またはマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
細菌がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細菌がロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に属することを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
経口投与に適した形態であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
生細菌が１×１０４から１×１０１０ ＣＦＵ／用量の濃度で存在することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株に由来するロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌。
【請求項１１】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌。
【請求項１２】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）の使用であって、対応する野生型細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物を製造するための、使用。
【請求項１３】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための動物の治療方法であって、ノカルジオフォーム放線菌種の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）を含む医薬組成物を該動物に投与することを含む方法。
【請求項１】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌（ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して該動物を防御するための医薬組成物であって、ノカルジオフォーム放線菌種の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）、およびこれらの生細菌のための医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
オペロン内の複数の遺伝子が不活化されていることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
遺伝子ｉｐｄＡおよびｉｐｄＢが不活化されていることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
不活化が、非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失により少なくとも１つの遺伝子を欠失させることにより実現される、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
細菌がノカルジアセエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）またはマイコバクテリアセエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
細菌がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細菌がロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）種に属することを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
経口投与に適した形態であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
生細菌が１×１０４から１×１０１０ ＣＦＵ／用量の濃度で存在することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株に由来するロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌。
【請求項１１】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）に番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０８または番号ＣＮＣＭ Ｉ−４１０９として寄託された株のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）細菌。
【請求項１２】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）の使用であって、対応する野生型細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための医薬組成物を製造するための、使用。
【請求項１３】
動物のマクロファージ内で生存する能力を有するノカルジオフォーム放線菌の群に属する細菌による感染から生じる障害に対して動物を防御するための動物の治療方法であって、ノカルジオフォーム放線菌種の生細菌（該生細菌は、メチルヘキサヒドロインダンジオンプロピオナート分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活化により弱毒化されている。）を含む医薬組成物を該動物に投与することを含む方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５１５１４７（Ｐ２０１２−５１５１４７Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４８７８（Ｐ２０１１−５４４８７８）
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０１９６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２２４
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０１９６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２２４
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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