ノロウイルスＲＮＡの検出方法および検出試薬
【課題】 ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度に検出すること。
【解決手段】 ノロウイルスＲＮＡ中の相同あるいは相補的な核酸配列に対して、ハイブリダイゼーション効率の高い第一のプライマーおよび第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブにて測定する。
【解決手段】 ノロウイルスＲＮＡ中の相同あるいは相補的な核酸配列に対して、ハイブリダイゼーション効率の高い第一のプライマーおよび第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブにて測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、かつ高感度にノロウイルスＲＮＡを検出する方法、および該方法を用いた検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。
【０００３】
我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性も示唆されている。ノロウイルスの流行を阻止するためにはできる限り迅速に対応することが必要である。以上から、ノロウイルスの迅速検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度、かつ迅速でしかもあらゆる遺伝子型の検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。これに対し、現在、ノロウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本である。この方法では、あらゆる遺伝子型の検出か可能であるが、検出するには１０６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で感度が低いために、検体は患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察できても同定することはできなかった。
【０００４】
また、ヒトカリシウイルスのウイルス様中空粒子を用いた、特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬も開発されている（特許文献１）。しかし、検出感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度とはいえない。
【０００５】
ノロウイルスを高感度に測定する手段としてノロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる（特許文献２）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
【０００６】
標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されている（非特許文献１）が、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題もあった。
【０００７】
また、非特異増幅産物を検出しない標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をＴａｑＭａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献２）があげられるが、前述したようにＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、迅速とはいえない。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００８】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４参照）、およびＴＭＡ法（特許文献５参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【０００９】
以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。
【００１０】
簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては，Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献３参照）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階、かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。
【００１１】
前記の各核酸増幅方法は、いずれもセンスプライマー（第一のプライマー）およびアンチセンスプライマー（第二のプライマー）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせにより標的ＲＮＡを増幅する方法であり、該組み合わせが前記核酸増幅の効率および特異性に重要な意義を持つことは周知である。しかし、ノロウイルスはきわめて多様な遺伝子型を有するため、全ての遺伝子型を一様かつ高効率に増幅するプライマーセットの構築はきわめて困難であった。
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０７９２８０号
【特許文献２】特許３７５２１０２号公報
【特許文献３】特許２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許３１５２９２７号公報
【特許文献５】特許３２４１７１７号公報
【特許文献６】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献７】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献８】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献１】Ｋａｇｅｙａｍａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１５４８−１５５７（２００３）
【非特許文献２】食安監発第１１０５００１号、２００３年１１月５日
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献４】感染症発生動向調査週報、６（１１）、１４−１９（２００４）
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ノロウイルスは遺伝子型によりジェノグループＩ（ＧＩ）とジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に大別される。さらに各遺伝子群についても、現時点でＧＩは１から１４の遺伝子型に、ＧＩＩは１から１７の遺伝子型に区別される（非特許文献４参照）。ＧＩに属する遺伝子型間、およびＧＩＩに属する遺伝子型間の塩基配列の相同性は約７０％である。また、ＧＩとＧＩＩの塩基配列の相同性は４０から５０％である。
【００１４】
前記遺伝子増幅法を用いたノロウイルス検出試薬で高い検出率をあげるためには、プライマー結合領域として、各種遺伝子型間で塩基配列が高度に保存された２０塩基以上の領域が、少なくとも２箇所は必要である。しかしながら、ＧｅｎＢａｎｋ上のノロウイルスの配列として、６配列（Ｃｈｉｂａ（Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｎｏ．ＮＣ＿００１９５９）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｎｏ．Ｌ０７４１８）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）、Ｈａｗａｉｉ（Ｎｏ．Ｕ０７６１１）、ＨｕＣＶ（Ｎｏ．ＡＹ０３２６０５））の相同性を調べただけでも、遺伝子型間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域は存在しない。
【００１５】
このような背景のもと、以前発明者らは、ＧＩに属するノロウイルスＲＮＡ（以下、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡと表記）、あるいはＧＩＩに属するノロウイルスＲＮＡ（以下、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡと表記）の広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出する方法を見出している（特願２００７−１６４９２１号および特願２００７−１８２９０４号）。しかしながら前記方法では、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの検出とノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの検出とを個別に行なう必要があるため、試料中にノロウイルスＲＮＡが存在しているかを判断するには、同じ試料をノロウイルス ＧＩ ＲＮＡ検出系とノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ検出系で測定する必要があった。ノロウイルスの遺伝子群／遺伝子型の違いによる臨床的症状の違いはないため、臨床現場では遺伝子群や遺伝子型を問わずノロウイルスＲＮＡを一度に検出できる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は前記課題を解決するべく鋭意検討した結果、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することが可能となった。
【００１７】
第一の発明は、試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出方法である。
【００１８】
第二の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが、配列番号４または５に記載の配列の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第一の発明に記載の検出方法である。
【００１９】
第三の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする、第二の発明に記載の検出方法である。
【００２０】
第四の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０から１２の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の検出方法である。
【００２１】
第五の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第四の発明に記載の検出方法である。
【００２２】
第六の発明は、試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する試薬であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる検出方法を実施するための試薬で、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物を含み、前記第二のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出試薬である。
【００２３】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明中の特定塩基配列とは、ノロウイルスＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列あるいはその相補配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位で種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が既知であり、本発明の使用において特に限定するものではないが、分子生物学的実験などで汎用されているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどが好ましい。また前記プロモーター配列には、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域が付加されていても良い。
【００２５】
本発明中の十分に相補的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度など）において、特定塩基配列に対して特異的に、かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。また、本発明中の十分に相同な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件において、特定塩基配列の完全相補配列に対して特異的に、かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう十分に相補的あるいは十分に相同な配列は、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。
【００２６】
前述したように、現時点でノロウイルス ＧＩ ＲＮＡには１４種の遺伝子型、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡには１７種の遺伝子型が、それぞれ存在し、さらに、塩基配列が高度に保存された領域は十分に長くない。そのため、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することは困難であった。
【００２７】
そこで以前発明者らは、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ二種類以上用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることで、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に測定することを見出した（特願２００７−１６４９２１号）。また、切断用オリゴヌクレオチドを二種類以上用いることで、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出することを見出した（特願２００７−１８２９０４号）
しかし、前述したように、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡとの塩基配列の相同性は４０から５０％と低いため、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ、それぞれに最適化されたオリゴヌクレオチドの組み合わせでは、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度の測定で迅速、かつ高感度に検出するのは困難である。
【００２８】
また、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ、それぞれに最適化されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを単純に混合すれば、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度に検出する系が構築できると考えられるが、前記組み合わせを用いてノロウイルスＲＮＡの検出を行なうと、プライマーの本数が増加するため、プライマーダイマーといった非特異増幅産物が形成しやすくなり、結果としてノロウイルスＲＮＡに対する検出感度が低下する懸念があった。
【００２９】
そのため、今回発明者らが鋭意検討の結果、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度の測定で迅速、かつ高感度に検出する方法を見出した。
【００３０】
すなわち、本発明において第一のプライマーはノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーはノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３１】
本発明において、より好ましくは、第一のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号４または５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３２】
本発明の好ましい一態様は、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３３】
さらに本発明の一態様としては、ノロウイルスＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定塩基配列の前記５’末端部位で切断される。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化などされているものを使用するのが好ましい。
【００３４】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１０から１２に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列から選ばれた少なくとも一種類の切断用オリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１３から１５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列から選ばれた少なくとも一種類の切断用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００３５】
なお、本発明中の配列番号４および１０はＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（ＧＩ／２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ０７４１８）の部分配列、配列番号５はＤｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄ（ＧＩ／３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０４４６９）の部分配列、配列番号７および１１はＣｈｉｂａ（ＧＩ／４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）の部分配列、配列番号８および１２はＷＵＧ１（ＧＩ／８）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０８１７２３）の部分配列、配列番号９はＳａｉｔａｍａ Ｔ２５Ｇ１（ＧＩ／１４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ１１２１００）の部分配列、配列番号６および１３はＬｏｒｓｄａｌｅ（ＧＩＩ／４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ８６５５７）の部分配列、配列番号１５はＳａｉｔａｍａ Ｕ３（ＧＩＩ／６）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０３９７７６）の部分配列である。
【００３６】
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００３７】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１０から１２に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号４または５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号７から９に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなる。さらに、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
より好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２１から２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが配列番号２７および２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、からなる。
【００３９】
本発明のノロウイルスＲＮＡの検出方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素））が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足することなども可能である。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。
【００４０】
本発明の一態様では、試料中のノロウイルスＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００４１】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
【００４２】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００４３】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献６および非特許文献３参照）。
【００４４】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献７および非特許文献５参照）。
【００４５】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献８および非特許文献５参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることも可能である。
【００４６】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号４に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列、配列番号５に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列、および配列番号６に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列）、第二のプライマー（配列番号１８から２０に示す配列）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２７および２８に示す配列）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号２１から２６に示す配列）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００４７】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００４８】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にノロウイルスＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００４９】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度、かつ一段階の同時測定が可能となった。
【発明の効果】
【００５０】
本発明は、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー及び第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなるノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記第一のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴としている。本発明により、試料中に含まれる微量なノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速に、かつ一定温度で増幅、検出することが可能となる。
【００５１】
さらに、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）において、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたノロウイルスＲＮＡの特定核酸に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、ノロウイルスＲＮＡの検出を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことができる。
【００５２】
本発明の検出方法を用いたノロウイルスＲＮＡの検出試薬は、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することができる。そのため、臨床現場において、糞便や吐瀉物といった臨床検体中にノロウイルスが存在するかを迅速、かつ簡便に判定することができ、その後のノロウイルス感染の予防、およびノロウイルス感染経路の調査などに有用である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００５４】
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したノロウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスｃＤＮＡ配列のうち、表１に示す遺伝子型、および塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調整したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００５５】
【表１】
なお、標準ＲＮＡの全長は５３３塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、ノロウイルスＲＮＡの全長（約７０００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるノロウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。また、今回標準ＲＮＡを調製した遺伝子型はノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの遺伝子型全１４種のうちの８種、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの遺伝子型全１７種のうちの７種と、それぞれ一部ではあるが、
（Ａ）ＧＩ／１、ＧＩ／６、およびＧＩ／８との間
（Ｂ）ＧＩ／４、ＧＩ／５、およびＧＩ／９との間
（Ｃ）ＧＩ／３、ＧＩ／１０、ＧＩ／１１、ＧＩ／１２、ＧＩ／１３、およびＧＩ／１４との間
（Ｄ）ＧＩＩ／７、ＧＩＩ／８、ＧＩＩ／９およびＧＩＩ／１３との間
（Ｅ）ＧＩＩ／１１、ＧＩＩ／１４、およびＧＩＩ／１６との間
（Ｆ）ＧＩＩ／１、ＧＩＩ／１２、およびＧＩＩ／１５との間
（Ｇ）ＧＩＩ／２、ＧＩＩ／５、およびＧＩＩ／１０との間
はそれぞれ相同性が高い（非特許文献４）ことから、今回調製した遺伝子型の標準ＲＮＡを全て検出できれば、特殊な遺伝子型であるＧＩＩ／１７以外の全ての遺伝子型に属するノロウイルスＲＮＡを検出可能であることが予想される。
【００５６】
実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献５に記載の方法で、配列番号２７に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間、配列番号２８に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間、配列番号３６に記載の配列の５’末端側から１２番目のＣと１３番目のＡとの間のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００５７】
実施例３ ノロウイルスＲＮＡの検出
表２に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお、表２の組み合わせのうち、組み合わせＡおよびＢに記載の第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブ、切断用オリゴヌクレオチドは、以前発明者らの検討により見出した、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡ（組み合わせＡ、特願２００７−１６４９２１号）またはノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ（組み合わせＢ、特願２００７−１８２９０４号）の広範囲な遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出するオリゴヌクレオチドの組み合わせである。組み合わせＣは、組み合わせＡで使用のオリゴヌクレオチドと組み合わせＢで使用のオリゴヌクレオチドを単純に混合した系である。組み合わせＤからＦは本発明の系である。また、組み合わせＤからＦに記載のオリゴヌクレオチドのうち、配列番号４および５は配列番号１に含まれ、配列番号６は配列番号２に含まれ、配列番号１８から２０は配列番号３の相補鎖に含まれる。
【００５８】
【表２】
（１）前記標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、ＧＩ 標準ＲＮＡは３００コピー／５μＬまたは１０３コピー／５μＬに、ＧＩＩ 標準ＲＮＡは１０２コピー／５μＬまたは１０３コピー／５μＬに、それぞれなるよう希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００５９】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１８ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各０．７５μＭ 第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号４０）が付加されている
各１μＭ 第二のプライマー
２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（組み合わせＣからＦでは各１０ｎＭ使用）：該プローブは実施例２で調製したもの
各０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００６０】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ ソルビトール
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６１】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３および４に示した。なお、表３は、表２の組み合わせＡからＤに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて１０３コピーのＧＩおよび／またはＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときの結果を、表４は、表２の組み合わせＤからＦに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて３００コピーのＧＩ 標準ＲＮＡおよび１０２コピーのＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときの結果を、それぞれ示している。また、表３および４において−とは測定未実施の試料を、Ｎ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料をそれぞれ意味する。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
以前発明者らの検討で、１０３コピーのＧＩまたはＧＩＩ 標準ＲＮＡを遺伝子型を問わず、３０分以内に検出する系を見出している（特願２００７−１６４９２１号、特願２００７−１８２９０４号）。そこで、当該検出系（組み合わせＡおよびＢ）で用いたオリゴヌクレオチドを単純に混合した系（組み合わせＣ）で１０３コピーの標準ＲＮＡを測定した。その結果、表３に示すように、ＧＩ 標準ＲＮＡを測定したときは、組み合わせＡを用いた系では測定した８遺伝子型全てを３０分以内に検出した一方、組み合わせＣを用いた系では検出した遺伝子型が２つに激減した。また、ＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときは、組み合わせＢを用いた系、組み合わせＣを用いた系、ともに、測定した８遺伝子型全てを３０分以内に検出していたものの、検出時間は全ての遺伝子型で組み合わせＣを用いた系の方が遅れていた。試料中のＲＮＡ量が等しい場合、検出時間が早いほど増幅効率が高いため、組み合わせＣを用いた系は、組み合わせＢを用いた系と比較し、増幅効率が低下しているといえる。よって、ノロウイルス ＧＩまたはＧＩＩ 標準ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、高感度に検出する系が見出されたとしても、それらの系で使用しているオリゴヌクレオチドを単純に混合するだけでは、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず検出する系を構築するのは困難であることがわかる。
【００６４】
前記結果を受けて、新たにプライマーダイマーといった非特異的な増幅が起こりにくいオリゴヌクレオチドの組み合わせを鋭意検討を行ない得られた本発明の系（組み合わせＤ）にて、前記１０３コピーの標準ＲＮＡを測定したところ、測定した標準ＲＮＡ（ＧＩ ８遺伝子型、ＧＩＩ ７遺伝子型）全てを２０分以内に検出した。
【００６５】
さらに、本発明の系（組み合わせＤからＦ）にて、３００コピーのＧＩ 標準ＲＮＡ、および１０２コピーのＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定した。その結果、表４に示したように、使用したＲＮＡ量が表３のとき（１０３コピー）よりも少ないにも関わらず、本発明の系はいずれも、組み合わせＣを用いた系と比較し、検出した遺伝子型の数（ＧＩとＧＩＩの合計）は増加した（組み合わせＣ：９遺伝子型、組み合わせＤ：１５遺伝子型、組み合わせＥ：１３遺伝子型、組み合わせＦ：１２遺伝子型）。中でも、組み合わせＤを用いた系は、測定した標準ＲＮＡ（ＧＩ ８遺伝子型、ＧＩＩ ７遺伝子型）全てを３０分以内に検出しており、最も好ましい系といえる。
【００６６】
以上から、本発明に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いることにより、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献５）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、かつ高感度にノロウイルスＲＮＡを検出する方法、および該方法を用いた検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。
【０００３】
我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性も示唆されている。ノロウイルスの流行を阻止するためにはできる限り迅速に対応することが必要である。以上から、ノロウイルスの迅速検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度、かつ迅速でしかもあらゆる遺伝子型の検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。これに対し、現在、ノロウイルスの検出は、電子顕微鏡による観察が基本である。この方法では、あらゆる遺伝子型の検出か可能であるが、検出するには１０６個／ｍＬ以上のウイルス量が必要で感度が低いために、検体は患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察できても同定することはできなかった。
【０００４】
また、ヒトカリシウイルスのウイルス様中空粒子を用いた、特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬も開発されている（特許文献１）。しかし、検出感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度とはいえない。
【０００５】
ノロウイルスを高感度に測定する手段としてノロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる（特許文献２）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。
【０００６】
標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されている（非特許文献１）が、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題もあった。
【０００７】
また、非特異増幅産物を検出しない標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をＴａｑＭａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献２）があげられるが、前述したようにＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、迅速とはいえない。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００８】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４参照）、およびＴＭＡ法（特許文献５参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【０００９】
以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。
【００１０】
簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては，Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献３参照）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階、かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。
【００１１】
前記の各核酸増幅方法は、いずれもセンスプライマー（第一のプライマー）およびアンチセンスプライマー（第二のプライマー）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせにより標的ＲＮＡを増幅する方法であり、該組み合わせが前記核酸増幅の効率および特異性に重要な意義を持つことは周知である。しかし、ノロウイルスはきわめて多様な遺伝子型を有するため、全ての遺伝子型を一様かつ高効率に増幅するプライマーセットの構築はきわめて困難であった。
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０７９２８０号
【特許文献２】特許３７５２１０２号公報
【特許文献３】特許２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許３１５２９２７号公報
【特許文献５】特許３２４１７１７号公報
【特許文献６】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献７】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献８】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献１】Ｋａｇｅｙａｍａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１５４８−１５５７（２００３）
【非特許文献２】食安監発第１１０５００１号、２００３年１１月５日
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献４】感染症発生動向調査週報、６（１１）、１４−１９（２００４）
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ノロウイルスは遺伝子型によりジェノグループＩ（ＧＩ）とジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に大別される。さらに各遺伝子群についても、現時点でＧＩは１から１４の遺伝子型に、ＧＩＩは１から１７の遺伝子型に区別される（非特許文献４参照）。ＧＩに属する遺伝子型間、およびＧＩＩに属する遺伝子型間の塩基配列の相同性は約７０％である。また、ＧＩとＧＩＩの塩基配列の相同性は４０から５０％である。
【００１４】
前記遺伝子増幅法を用いたノロウイルス検出試薬で高い検出率をあげるためには、プライマー結合領域として、各種遺伝子型間で塩基配列が高度に保存された２０塩基以上の領域が、少なくとも２箇所は必要である。しかしながら、ＧｅｎＢａｎｋ上のノロウイルスの配列として、６配列（Ｃｈｉｂａ（Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｎｏ．ＮＣ＿００１９５９）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｎｏ．Ｌ０７４１８）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（Ｎｏ．ＡＦ１４５８９６）、Ｈａｗａｉｉ（Ｎｏ．Ｕ０７６１１）、ＨｕＣＶ（Ｎｏ．ＡＹ０３２６０５））の相同性を調べただけでも、遺伝子型間で塩基配列が同じである２０塩基以上の領域は存在しない。
【００１５】
このような背景のもと、以前発明者らは、ＧＩに属するノロウイルスＲＮＡ（以下、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡと表記）、あるいはＧＩＩに属するノロウイルスＲＮＡ（以下、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡと表記）の広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出する方法を見出している（特願２００７−１６４９２１号および特願２００７−１８２９０４号）。しかしながら前記方法では、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの検出とノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの検出とを個別に行なう必要があるため、試料中にノロウイルスＲＮＡが存在しているかを判断するには、同じ試料をノロウイルス ＧＩ ＲＮＡ検出系とノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ検出系で測定する必要があった。ノロウイルスの遺伝子群／遺伝子型の違いによる臨床的症状の違いはないため、臨床現場では遺伝子群や遺伝子型を問わずノロウイルスＲＮＡを一度に検出できる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は前記課題を解決するべく鋭意検討した結果、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することが可能となった。
【００１７】
第一の発明は、試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出方法である。
【００１８】
第二の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが、配列番号４または５に記載の配列の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第一の発明に記載の検出方法である。
【００１９】
第三の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする、第二の発明に記載の検出方法である。
【００２０】
第四の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０から１２の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の検出方法である。
【００２１】
第五の発明は、前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、第四の発明に記載の検出方法である。
【００２２】
第六の発明は、試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する試薬であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる検出方法を実施するための試薬で、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物を含み、前記第二のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出試薬である。
【００２３】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明中の特定塩基配列とは、ノロウイルスＲＮＡ上で、第一のプライマーと相同領域の５’末端から第二のプライマーと相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、本発明では前記特定塩基配列あるいはその相補配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位で種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が既知であり、本発明の使用において特に限定するものではないが、分子生物学的実験などで汎用されているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどが好ましい。また前記プロモーター配列には、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域が付加されていても良い。
【００２５】
本発明中の十分に相補的な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件（塩濃度、オリゴヌクレオチド濃度、反応温度など）において、特定塩基配列に対して特異的に、かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。また、本発明中の十分に相同な配列とは、最適化された核酸増幅反応条件において、特定塩基配列の完全相補配列に対して特異的に、かつ高効率にハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう十分に相補的あるいは十分に相同な配列は、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。
【００２６】
前述したように、現時点でノロウイルス ＧＩ ＲＮＡには１４種の遺伝子型、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡには１７種の遺伝子型が、それぞれ存在し、さらに、塩基配列が高度に保存された領域は十分に長くない。そのため、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することは困難であった。
【００２７】
そこで以前発明者らは、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ二種類以上用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることで、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に測定することを見出した（特願２００７−１６４９２１号）。また、切断用オリゴヌクレオチドを二種類以上用いることで、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出することを見出した（特願２００７−１８２９０４号）
しかし、前述したように、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡとの塩基配列の相同性は４０から５０％と低いため、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ、それぞれに最適化されたオリゴヌクレオチドの組み合わせでは、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度の測定で迅速、かつ高感度に検出するのは困難である。
【００２８】
また、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡとノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ、それぞれに最適化されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを単純に混合すれば、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度に検出する系が構築できると考えられるが、前記組み合わせを用いてノロウイルスＲＮＡの検出を行なうと、プライマーの本数が増加するため、プライマーダイマーといった非特異増幅産物が形成しやすくなり、結果としてノロウイルスＲＮＡに対する検出感度が低下する懸念があった。
【００２９】
そのため、今回発明者らが鋭意検討の結果、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度の測定で迅速、かつ高感度に検出する方法を見出した。
【００３０】
すなわち、本発明において第一のプライマーはノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーはノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３１】
本発明において、より好ましくは、第一のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号４または５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３２】
本発明の好ましい一態様は、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドからなる。
【００３３】
さらに本発明の一態様としては、ノロウイルスＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定塩基配列の前記５’末端部位で切断される。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内で５’末端を含む部分配列）に重複して５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化などされているものを使用するのが好ましい。
【００３４】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１０から１２に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列から選ばれた少なくとも一種類の切断用オリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１３から１５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列から選ばれた少なくとも一種類の切断用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００３５】
なお、本発明中の配列番号４および１０はＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（ＧＩ／２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ０７４１８）の部分配列、配列番号５はＤｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄ（ＧＩ／３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０４４６９）の部分配列、配列番号７および１１はＣｈｉｂａ（ＧＩ／４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０４２８０８）の部分配列、配列番号８および１２はＷＵＧ１（ＧＩ／８）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０８１７２３）の部分配列、配列番号９はＳａｉｔａｍａ Ｔ２５Ｇ１（ＧＩ／１４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ１１２１００）の部分配列、配列番号６および１３はＬｏｒｓｄａｌｅ（ＧＩＩ／４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ８６５５７）の部分配列、配列番号１５はＳａｉｔａｍａ Ｕ３（ＧＩＩ／６）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０３９７７６）の部分配列である。
【００３６】
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００３７】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１０から１２に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなる。また、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号４または５に記載の配列に対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなる。そして、第二のプライマーは配列番号７から９に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなる。さらに、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
より好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２１から２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、前記インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブが配列番号２７および２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、からなる。
【００３９】
本発明のノロウイルスＲＮＡの検出方法において、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素））が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を合わせ持つ逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素をさらに添加して補足することなども可能である。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験で汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体が使用可能である。
【００４０】
本発明の一態様では、試料中のノロウイルスＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一のプライマーおよび第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行われる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００４１】
このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加することも可能である。
【００４２】
たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
【００４３】
増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。このような測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などが利用できる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを用いることが好ましい。さらに好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献６および非特許文献３参照）。
【００４４】
前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献７および非特許文献５参照）。
【００４５】
オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献８および非特許文献５参照）。また、前記官能基の導入方法としては、汎用されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることも可能である。
【００４６】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号４に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列、配列番号５に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列、および配列番号６に記載の配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４０）を付加した配列）、第二のプライマー（配列番号１８から２０に示す配列）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２７および２８に示す配列）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号２１から２６に示す配列）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００４７】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００４８】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にノロウイルスＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００４９】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度、かつ一段階の同時測定が可能となった。
【発明の効果】
【００５０】
本発明は、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマー及び第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなるノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記第一のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、およびノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドからなり、かつ第二のプライマーがノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの一部に相同な配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴としている。本発明により、試料中に含まれる微量なノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速に、かつ一定温度で増幅、検出することが可能となる。
【００５１】
さらに、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）において、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたノロウイルスＲＮＡの特定核酸に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、ノロウイルスＲＮＡの検出を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことができる。
【００５２】
本発明の検出方法を用いたノロウイルスＲＮＡの検出試薬は、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することができる。そのため、臨床現場において、糞便や吐瀉物といった臨床検体中にノロウイルスが存在するかを迅速、かつ簡便に判定することができ、その後のノロウイルス感染の予防、およびノロウイルス感染経路の調査などに有用である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００５４】
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したノロウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスｃＤＮＡ配列のうち、表１に示す遺伝子型、および塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調整したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００５５】
【表１】
なお、標準ＲＮＡの全長は５３３塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）と、ノロウイルスＲＮＡの全長（約７０００塩基）の一部ではあるが、本発明の測定対象であるノロウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。また、今回標準ＲＮＡを調製した遺伝子型はノロウイルス ＧＩ ＲＮＡの遺伝子型全１４種のうちの８種、ノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡの遺伝子型全１７種のうちの７種と、それぞれ一部ではあるが、
（Ａ）ＧＩ／１、ＧＩ／６、およびＧＩ／８との間
（Ｂ）ＧＩ／４、ＧＩ／５、およびＧＩ／９との間
（Ｃ）ＧＩ／３、ＧＩ／１０、ＧＩ／１１、ＧＩ／１２、ＧＩ／１３、およびＧＩ／１４との間
（Ｄ）ＧＩＩ／７、ＧＩＩ／８、ＧＩＩ／９およびＧＩＩ／１３との間
（Ｅ）ＧＩＩ／１１、ＧＩＩ／１４、およびＧＩＩ／１６との間
（Ｆ）ＧＩＩ／１、ＧＩＩ／１２、およびＧＩＩ／１５との間
（Ｇ）ＧＩＩ／２、ＧＩＩ／５、およびＧＩＩ／１０との間
はそれぞれ相同性が高い（非特許文献４）ことから、今回調製した遺伝子型の標準ＲＮＡを全て検出できれば、特殊な遺伝子型であるＧＩＩ／１７以外の全ての遺伝子型に属するノロウイルスＲＮＡを検出可能であることが予想される。
【００５６】
実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献５に記載の方法で、配列番号２７に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間、配列番号２８に記載の配列の５’末端から１２番目のＣと１３番目のＡの間、配列番号３６に記載の配列の５’末端側から１２番目のＣと１３番目のＡとの間のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００５７】
実施例３ ノロウイルスＲＮＡの検出
表２に示す組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお、表２の組み合わせのうち、組み合わせＡおよびＢに記載の第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブ、切断用オリゴヌクレオチドは、以前発明者らの検討により見出した、ノロウイルス ＧＩ ＲＮＡ（組み合わせＡ、特願２００７−１６４９２１号）またはノロウイルス ＧＩＩ ＲＮＡ（組み合わせＢ、特願２００７−１８２９０４号）の広範囲な遺伝子型を迅速、かつ高感度に検出するオリゴヌクレオチドの組み合わせである。組み合わせＣは、組み合わせＡで使用のオリゴヌクレオチドと組み合わせＢで使用のオリゴヌクレオチドを単純に混合した系である。組み合わせＤからＦは本発明の系である。また、組み合わせＤからＦに記載のオリゴヌクレオチドのうち、配列番号４および５は配列番号１に含まれ、配列番号６は配列番号２に含まれ、配列番号１８から２０は配列番号３の相補鎖に含まれる。
【００５８】
【表２】
（１）前記標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、ＧＩ 標準ＲＮＡは３００コピー／５μＬまたは１０３コピー／５μＬに、ＧＩＩ 標準ＲＮＡは１０２コピー／５μＬまたは１０３コピー／５μＬに、それぞれなるよう希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００５９】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１８ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各０．７５μＭ 第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号４０）が付加されている
各１μＭ 第二のプライマー
２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（組み合わせＣからＦでは各１０ｎＭ使用）：該プローブは実施例２で調製したもの
各０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００６０】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ ソルビトール
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６１】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３および４に示した。なお、表３は、表２の組み合わせＡからＤに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて１０３コピーのＧＩおよび／またはＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときの結果を、表４は、表２の組み合わせＤからＦに示すオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて３００コピーのＧＩ 標準ＲＮＡおよび１０２コピーのＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときの結果を、それぞれ示している。また、表３および４において−とは測定未実施の試料を、Ｎ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料をそれぞれ意味する。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
以前発明者らの検討で、１０３コピーのＧＩまたはＧＩＩ 標準ＲＮＡを遺伝子型を問わず、３０分以内に検出する系を見出している（特願２００７−１６４９２１号、特願２００７−１８２９０４号）。そこで、当該検出系（組み合わせＡおよびＢ）で用いたオリゴヌクレオチドを単純に混合した系（組み合わせＣ）で１０３コピーの標準ＲＮＡを測定した。その結果、表３に示すように、ＧＩ 標準ＲＮＡを測定したときは、組み合わせＡを用いた系では測定した８遺伝子型全てを３０分以内に検出した一方、組み合わせＣを用いた系では検出した遺伝子型が２つに激減した。また、ＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定したときは、組み合わせＢを用いた系、組み合わせＣを用いた系、ともに、測定した８遺伝子型全てを３０分以内に検出していたものの、検出時間は全ての遺伝子型で組み合わせＣを用いた系の方が遅れていた。試料中のＲＮＡ量が等しい場合、検出時間が早いほど増幅効率が高いため、組み合わせＣを用いた系は、組み合わせＢを用いた系と比較し、増幅効率が低下しているといえる。よって、ノロウイルス ＧＩまたはＧＩＩ 標準ＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、高感度に検出する系が見出されたとしても、それらの系で使用しているオリゴヌクレオチドを単純に混合するだけでは、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず検出する系を構築するのは困難であることがわかる。
【００６４】
前記結果を受けて、新たにプライマーダイマーといった非特異的な増幅が起こりにくいオリゴヌクレオチドの組み合わせを鋭意検討を行ない得られた本発明の系（組み合わせＤ）にて、前記１０３コピーの標準ＲＮＡを測定したところ、測定した標準ＲＮＡ（ＧＩ ８遺伝子型、ＧＩＩ ７遺伝子型）全てを２０分以内に検出した。
【００６５】
さらに、本発明の系（組み合わせＤからＦ）にて、３００コピーのＧＩ 標準ＲＮＡ、および１０２コピーのＧＩＩ 標準ＲＮＡを測定した。その結果、表４に示したように、使用したＲＮＡ量が表３のとき（１０３コピー）よりも少ないにも関わらず、本発明の系はいずれも、組み合わせＣを用いた系と比較し、検出した遺伝子型の数（ＧＩとＧＩＩの合計）は増加した（組み合わせＣ：９遺伝子型、組み合わせＤ：１５遺伝子型、組み合わせＥ：１３遺伝子型、組み合わせＦ：１２遺伝子型）。中でも、組み合わせＤを用いた系は、測定した標準ＲＮＡ（ＧＩ ８遺伝子型、ＧＩＩ ７遺伝子型）全てを３０分以内に検出しており、最も好ましい系といえる。
【００６６】
以上から、本発明に記載の第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ、切断用オリゴヌクレオチドを用いることにより、一度の測定でノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献５）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが、配列番号４または５に記載の配列の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０から１２の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する試薬であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる検出方法を実施するための試薬で、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物を含み、前記第二のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出試薬。
【請求項１】
試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなり、前記第一のプライマーが、配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが、配列番号４または５に記載の配列の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号６に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、前記第二のプライマーが、配列番号７から９に記載の配列に対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、第一のプライマーが配列番号４から６に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなり、第二のプライマーが配列番号１８から２０に記載の配列からなる三種のオリゴヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとＲＮａｓｅ Ｈにより前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を、５’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程の前に行なうことを特徴とし、
前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０から１２の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、および配列番号１３から１５の少なくともいずれか一つに対してそれぞれ十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ノロウイルスＲＮＡの検出方法において、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブ共存下で該シグナル変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１６に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号１７に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
試料中のノロウイルスＲＮＡを検出する試薬であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列よりなるＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
からなる検出方法を実施するための試薬で、少なくとも、前記第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチド、および配列番号２に記載の配列に対して十分に相同な配列のオリゴヌクレオチドの混合物を含み、前記第二のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して十分に相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ノロウイルスＲＮＡの検出試薬。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−４７９３（Ｐ２０１０−４７９３Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６７２５７（Ｐ２００８−１６７２５７）
【出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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