ハイドロゲル用組成物及びその製造方法
【課題】本発明の課題は、ハイドロゲルの生成に過酸化水素水を必要とせず、ハイドロゲルの生成時に加熱する等の工程を要せず、ハイドロゲルの生成時間を制御できるハイドロゲル用組成物を提供することである。
【解決手段】(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
【解決手段】(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル用組成物及びその製造方法に関し、特に、創傷被覆又は再生医療等において有用なハイドロゲル用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の生体適合性の高い高分子を用いて製造され、創傷被覆及び再生医療用の材料として多くの検討が行われている。
【０００３】
近年、これらをゲル化させるための方法として、その反応が細胞及び生体分子に対して温和であることから、ラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼ及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ等の架橋形成酵素反応を利用して、前記高分子にフェノール性水酸基を導入してゲル化させる方法が開発されている（特許文献１〜５）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、使用直前に、（１）前記架橋形成酵素と前記高分子を含有する水溶液と、（２）過酸化水素水とを混合する必要があった。すなわち、例えば、傷口を被覆するためにゲルを生成するためには、２つの溶液を用意する必要があり、使用するのが煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２００４９４号公報
【特許文献２】特開２００７−２３０７９号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３６０号公報
【特許文献４】特開２００８−１７４６７１号公報
【特許文献５】特開２００８−１７４５１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ハイドロゲルの生成に過酸化水素水を必要とせず、ハイドロゲルの生成時に加熱する等の工程を要せず、ハイドロゲルの生成時間を制御できるハイドロゲル用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を用いることによって、前記した課題を一挙に解決できることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
［１］(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
［２］架橋性高分子組成物が、天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子からなることを特徴とする前記［１］に記載のハイドロゲル用組成物。
［３］高分子基材が、合成高分子からなる高分子基材であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［４］高分子基材が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド及びそれらの共重合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［５］高分子基材が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン及びアルブミンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［６］フェノール性水酸基を有する重合性化合物が、下記一般式［Ｉ］
【化１】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物であることを特徴とする前記［２］〜［５］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［７］架橋性高分子組成物が、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなることを特徴とする前記［１］記載のハイドロゲル用組成物。
［８］酵素Ａが、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［９］酵素Ａが、グルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１０］架橋形成酵素Ｂが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１１］ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が、鉄ポルフィリン錯体であることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１２］過酸化水素分解剤が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１３］ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする前記［１２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［１４］架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、酵素Ａの含有量が０．１ｍＵ／ｍＬ以上であることを特徴とする前記［１］〜［１３］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１５］過酸化水素分解剤が架橋形成酵素Ｂであって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、架橋形成酵素Ｂの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上であることを特徴とする前記［１］〜［１４］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１６］過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体であって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、前記鉄ポルフィリン錯体の含有量が、０．１質量％以上であることを特徴とする前記［１］〜［１４］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１７］(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合する工程を有することを特徴とする前記［１］〜［１６］のいずれかに記載されたハイドロゲル用組成物の製造方法。
［１８］前記［１］〜［１６］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物を含むことを特徴とする創傷被覆材。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のハイドロゲル用組成物は、基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａを使用するため、創傷被覆材等として体液に接触するよう用いられる場合、該体液に含まれる基質を利用して過酸化水素を生成することができ、ゲル生成のために必要であった過酸化水素水を用意する必要がない。例えば、酵素Ａがグルコースオキシダーゼの場合、体液に含まれるグルコースを利用して、過酸化水素を生成することができる。また、酵素濃度及び架橋性高分子組成物の濃度を調節することによって、ハイドロゲルの生成時間を制御することができる。例えば、創傷部位又は手術の縫合部位等を迅速にハイドロゲルで被覆することもでき、必要に応じて所定時間後にハイドロゲルを生成させて被覆することもできる。このため、雑菌の侵入又は細胞癒着等を効果的に防ぐことができる。また、酵素濃度及び架橋性高分子組成物の濃度を調節することによって、生成されるハイドロゲルの物性を制御することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ゲルの製造例を示す図である。Ａは製造例１及び２のゲルを表し、Ｂは製造例３を表し、Ｃは製造例４を表す。
【図２】図２は、実施例１のハイドロゲル用組成物で得られたハイドロゲルを表す図である。
【図３】図３は、試験例１のゲル化時間を表す図である。Ａは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が１Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表し、Ｂは、ＨＲＰが５Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表し、ＣはＨＲＰが１５Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表す。図中、丸記号が、グルコースを添加したサンプルを表し、三角記号が、過酸化水素を添加したサンプルを表す。
【図４】図４は、試験例２のゲル化時間を表す図である。ＡはＨＲＰ濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、ＢはＧＯｘ濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、Ｃはグルコース濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、Ｄは反応温度を変化させた場合のゲル化時間を表し、ＥはAlg-Ph濃度を変化させた場合のゲル化時間を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のハイドロゲル用組成物及びその製造方法を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のハイドロゲル用組成物は、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明のハイドロゲル用組成物は過酸化水素水を含まない。また、本発明のハイドロゲル用組成物は、酵素Ａが反応する基質を含まないものが好ましい。例えば、ハイドロゲル用組成物が、グルコースオキシダーゼを含む場合、グルコースを含まないものが好ましく、アミノ酸及びコリンは含んでいてもよい。アミノ酸オキシダーゼを含む場合、アミノ酸（高分子基材としてのポリアミノ酸を除く。）を含まないものが好ましく、グルコース及びコリンは含んでいてもよい。本発明のハイドロゲル用組成物は、創傷被覆材等に用いられる場合、血液中又は体液中の基質（グルコース等）を利用できるためである。
【００１４】
本発明に用いる架橋性高分子組成物としては、過酸化水素を消費してゲル状となるものであれば、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば（１）天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子及び／又は（２）官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなる組成物等が挙げられる。
【００１５】
前記（１）天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材（以下、単に「高分子基材」ともいう。）としては、特に限定されないが、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、及びそれらの共重合体等が挙げられる。
【００１６】
前記多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、澱粉、プルラン、それらの薬理学的に許容される塩及びそれらの誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、脱アセチル化キチン類又は脱アセチル化キトサン類等）等が挙げられる。前記脱アセチル化キチン類又は脱アセチル化キトサン類は、キチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合した多糖）類のグルコサミン単位の２位のアセトアミド基が脱アセチル化されている多糖類であり、主にエビ、カニ等の甲殻類の甲羅に含まれるキチン質から公知の手段で得ることができ、脱アセチル化度は、５０〜１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましい。薬理学的に許容される塩は、特に限定されず、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が例として挙げられる。薬理学的に許容される酸付加塩としては、特に限定されず、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が例として挙げられ、薬理学的に許容される金属塩としては、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が例として挙げられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、特に限定されず、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が例として挙げられる。
【００１７】
前記タンパク質としては、単純タンパク質（アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質等）、複合タンパク質（核タンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質等）、誘導タンパク質（ゼラチン、プロテオース、ペプトン等）等が挙げられ、分子形状から分類される繊維状タンパク質（コラーゲン、ケラチン、フィブロイン、ゼラチン）、球状タンパク質等が挙げられる。
【００１８】
これらのうち、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン又はアルブミン等が工業的に容易に供給されること、得られるハイドロゲルの性状が良好なことから好ましい。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ヘミセルロースは除いていてもよい。高分子基材は、架橋密度を制御できるという点から、必要に応じて、合成高分子からなる高分子基材を好適に使用できる。高分子基材としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、Kimica Ｉ-1G（商品名、アルギン酸ナトリウム、フナコシ社製）、ゼラチン（魚ゼラチン、製品番号：Ｇ７７６５、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００１９】
前記（２）官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなる組成物において、アミノ基含有多糖質高分子化合物としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、アセチル化キチン及びキトサン等が好ましく挙げられる。また、ポリフェノール類化合物としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、カテキン類化合物、アントシアニン類化合物、ルチン、並びに、赤キャベツ色素（シアニジンアシルグリコシド類化合物）、ベニバナ黄色素（カーサマスイエロー：サフロミンA、サフロミンB）、カーサマスレッド（カーサミン）、シソ色素（Perilla colour：シソニン、マロニルシソニン）、アカダイコン色素（Red radish colour：ペラルゴニジンアシルグリコシド類化合物）、ムラサキイモ色素（Purple sweet potato colour：シアニジンアシルグルコシド類化合物、ペオニジンアシルグルコシド類化合物）、エルダーベリー色素（Elderberry colour：シアニジングリコシド類化合物）等の天然色素を好ましく例示することができる。
【００２０】
前記フェノール性水酸基を有する重合性化合物（以下、単に「重合性化合物」ともいう。）としては、特に限定されないが、下記一般式［Ｉ］
【化２】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物等が挙げられる。前記高分子基材に前記重合性化合物が有するようなフェノール性水酸基を導入することで、高分子基材が酵素により容易に架橋し得る。Ｒ１は、重合性化合物を高分子基材へ導入しやすいという観点から、カルボキシル基、１級又は２級アミノ基が好ましく、１級又は２級アミノ基がより好ましい。また、Ｒ２としては、重合性化合物の水に対する溶解性の観点、高分子基材との反応時の溶媒の選定を容易にする観点及び架橋性高分子中におけるフェノール性水酸基の反応性の観点等から、炭素数１〜８の炭化水素であることが好ましく、炭素数１〜６の炭化水素であることがより好ましい。かかる炭化水素としては、特に制限はないが、得られた架橋性高分子の反応性の観点から、好ましくはアルキレン基、アルキルアルキレン基等が挙げられる。また、Ｒ２が有してもよい置換基としては、特に制限はなく、例えばアミド基、エステル基、エーテル基等が挙げられる。
【００２１】
前記一般式［Ｉ］で表される化合物として、例えば、チラミン及びホモバニリン誘導体類等のフェノール性水酸基を１つ有する化合物、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等のカテコールアミン誘導体類等のフェノール性水酸基を２つ有する化合物が挙げられる。これらの中でも、得られる架橋性高分子の架橋反応性の観点から、重合性化合物としては、フェノール性水酸基を１つ有する化合物が好ましく、チラミン誘導体類がより好ましい。前記重合性化合物１種又は２種以上を選択して使用することができる。
【００２２】
前記重合性化合物は、その製造方法に特に制限はなく、例えば、公知の化学的な合成方法、生物的な合成方法、又は動物や植物等の自然界から得る方法等を単独又は組み合わせた方法により得ることができる。また、前記重合性化合物としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、チラミン塩酸塩（４−（２−アミノエチル）フェノール・塩酸塩、製品番号：Ｔ２８７９、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００２３】
前記高分子基材と前記重合性化合物との結合方法は、特に限定されないが、重合性化合物が有することがあるカルボキシル基、アミノ基又はアルコール性水酸基等の官能基と、高分子基材が有することがあるアミノ基、カルボキシル基又はチオール基等の官能基とを縮合剤を用いて縮合する方法、グルタミルトランスフェラーゼにより処理することで縮合する方法等が挙げられる。本発明における高分子の製造方法としては、より反応条件が温和であり、高分子基材に与える影響が少ないことからグルタミルトランスフェラーゼを用いる方法がより好ましい。
【００２４】
前記縮合剤としては、特に制限されないが、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド及び３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩等が挙げられる。これらの縮合剤としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ペプチド研究所製）等を使用することができる。
【００２５】
前記グルタミルトランスフェラーゼとは、グルタミル化合物のグルタミル基をアミン化合物に転移する酵素であり、グルタミルトランスペプチダーゼ、プロテイン−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ、プロテイン−グルタミン：アミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ、グルタモトランスフェラーゼ又はトランスグルタミナーゼともよばれる。グルタミルトランスフェラーゼとしては、例えば、生体から得られたものを使用してもよく、生物的に合成したものを使用してもよい。また、これらの方法により得られた市販品を使用してもよく、例えばシグマアルドリッチ社製のモルモット肝臓由来プロテイン−グルタミン−γ−トランスフェラーゼ、和光純薬社製の牛腎臓由来γ−グルタミルトランスフェラーゼ、オリエンタル社製のモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ等の市販されている酵素を使用することができる。
【００２６】
前記の高分子基材及び重合性化合物をグルタミルトランスフェラーゼにて処理する方法においては、上述の縮合反応が進行する限り、特に制限はなく、使用する高分子基材、酵素及び重合性化合物の性質に合わせて適宜、ｐＨ、高分子基材の濃度及び反応温度等の条件を選定することができる。
【００２７】
処理する際に使用する溶媒としては、特に制限されず、高分子基材、重合性化合物及びグルタミルトランスフェラーゼに対して溶解性や反応性の良好な溶媒を選択すればよい。例えば、水；ｐＨ緩衝液（例えば、ＰＢＳ等）；メタノール、エタノール等のアルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類；ジメチルスルフォキシド等又はこれらの混合溶媒が挙げられる。高分子基材、グルタミルトランスフェラーゼの溶解性及び酵素の反応性の観点から水又はｐＨ緩衝液を主体とした溶媒が好ましく、重合性化合物の溶解性に応じて、アルコール類又はアミド類等の有機溶媒を混合することがより好ましい。例えば、高分子基材の水溶液に酵素を作用させる方法で説明すると、溶媒のｐＨは、溶解性等の高分子基材の性質及び酵素活性等を考慮して調整することができ、酵素活性が高い領域を選択するという観点から、４〜１１が好ましく、５〜９がより好ましい。
【００２８】
高分子基材の水溶液中の濃度は、特に限定されないが、高分子基材の溶解性、反応の均一性及び得られる架橋性高分子の回収率等の観点から、０．１〜７０質量％が好ましく、０．５〜３０質量％がより好ましい。
【００２９】
反応温度は、高分子基材が変性せず、酵素活性が損なわれない領域を選択するという観点から、５〜８０℃が好ましく、１０〜５０℃がより好ましい。グルタミルトランスフェラーゼには、その反応性が共存するカルシウムイオンに依存するものがある。このようなグルタミルトランスフェラーゼを用いる場合は、反応を促進する為にカルシウムイオンを添加することが好ましい。カルシウムイオンの濃度は、使用するグルタミルトランスフェラーゼの性質と使用時の反応速度により選択すればよいが、反応速度の観点から０．１〜１０００ｍＭが好ましく、１〜５００ｍＭがより好ましい。
【００３０】
重合性化合物の量は、目的とする架橋性高分子中の重合性化合物の導入量及び架橋能力により適宜選択することができるが、高分子基材に対してフェノール性水酸基を有する重合性化合物の配合比（縮合比）は高分子基材１に対して０．００３〜０．１（質量比）が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．０５（質量比）である。重合性化合物の量が少なすぎると架橋が十分に行われず、強度が低くなりすぎ、重合性化合物の量が多すぎると得られる架橋体ゲルが硬くなり過ぎ、脆くなる。
【００３１】
本発明で使用するグルタミルトランスフェラーゼの量は、酵素の活性やその他の反応条件（例えば反応時間、温度、又は重合性化合物の濃度等）により適宜選択することができる。例えば、所望の反応速度及び重合性化合物の導入量を得るという観点から、高分子基材に対して０．０００１〜９０質量％が好ましく、０．０１〜７０質量％がより好ましい。なお、上述の方法により得られた架橋性高分子は、公知の方法で単離することができる。かかる方法としては、例えば、高分子基材及びグルタミルトランスフェラーゼを混合した反応液を反応後、過剰の溶媒中に滴下し、生成した沈殿物を遠心分離して回収し、未反応物を洗浄する方法や透析により未反応物を除去する方法等が挙げられる。
【００３２】
上記の方法により得られる架橋性高分子を、例えば、１Ｈ−ＮＭＲを用いた構造分析に供することにより、高分子基材と重合性化合物とが結合していることを確認することができる。
【００３３】
また、本発明で使用される架橋性高分子の重合度は種々のものとすることができ、高分子基材の種類により、適宜選択できる。２０℃における架橋性高分子の水溶液粘度は、通常、１〜１０００００ｍＰａ・ｓ程度であり、１０〜１００００ｍＰａ・ｓ程度が好ましく、より迅速にハイドロゲルを生成する場合、３０〜１０００ｍＰａ・ｓがより好ましい。適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、４０分後）にハイドロゲルを生成させる場合、５０〜５００ｍＰａ・ｓがより好ましい。なお、該架橋性高分子の水溶液粘度は、ＪＩＳ Ｋ７１１７−２ プラスチック液状・乳濁状叉は分散状の樹脂−回転粘度計によるせん断速度での粘度の測定方法（ＩＳＯ ３２１９）に従って測定した値であり、粘度は円錐平板型回転粘度計（コーン・プレート タイプ）を用いて測定した値である。測定器としては、例えば、Ｒ２１５形粘度計シリーズ（例えば、ＲＢ２１５Ｌ形粘度計、東機産業社製）等が挙げられる。
【００３４】
ハイドロゲル用組成物における架橋性高分子組成物の含有量は、組成物全体に対して、通常０．１〜３０質量％であり、０．５〜２０質量％が好ましく、０．７５〜１０質量％がより好ましい。架橋性高分子組成物の含有量が、０．１質量％を下回る場合、使用しうる強度のゲルを形成することができないおそれがあり、３０質量％を超えると、ゲル化が容易ではない又はゲルがもろくなるおそれがある。
【００３５】
ハイドロゲル用組成物のｐＨは、特に限定されないが、酵素活性の点から、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０程度が好ましく、特にｐＨ５．０〜ｐＨ９．０程度が好ましい。
【００３６】
本発明に用いる酵素Ａとしては、基質を消費して過酸化水素を生成する酵素が用いられ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上が用いられることが好ましい。これらの酵素は、用途に応じて適宜選択できるが、創傷被覆材として使用する場合、グルコースオキシダーゼが好ましい。酵素Ａは、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（Aspergillus niger起源、SERVA Electrophoresis GmbH社製）等が挙げられる。
【００３７】
ハイドロゲル用組成物における酵素Ａの含有量は、特に限定されないが、反応性の点から約０．１ｍＵ／ｍＬ以上が好ましく、約１ｍＵ／ｍＬ以上がより好ましい。また、酵素Ａの含有量の上限としては、通常２００００ｍＵ／ｍＬ程度であり、１００００ｍＵ／ｍＬ程度が好ましい。例えば、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に迅速にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、酵素Ａを約０．１ｍＵ／ｍＬ程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜１０質量％程度とし、酵素Ａを２．５〜２００ｍＵ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜３０質量％程度とし、酵素Ａを１０〜１８０ｍＵ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、酵素Ａを０．５ｍＵ／ｍＬ程度以上にすることが最も好ましい。また、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、４０分後）にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜１５質量％程度とし、酵素Ａを約１ｍＵ／ｍＬ以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、酵素Ａを５ｍＵ／ｍＬ程度以上とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、酵素Ａを１０ｍＵ／ｍＬ程度以上とすることがさらに好ましい。
【００３８】
本発明において、グルコースオキシダーゼ１Ｕ（ｕｎｉｔ）は、ｐＨ５．１，３５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのβ−Ｄ−グルコ−スをＤ−グルコノラクトンとＨ２Ｏ２に酸化する酵素量である。コリンオキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ８．０，３７℃，１分間で、１μｍｏｌのコリンのベタインアルデヒドへの酸化により１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生じる酵素量である。アミノ酸オキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ６．５、３７℃で１分間あたり１．０μｍｏｌのＬ−フェニルアラニンを酸化的に脱アミノする酵素量である。アルコールオキシダーゼ１ｕｎｉｔは、ｐＨ７．５，２５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのメタノ−ルをホルムアルデヒドへと酸化する酵素量である。ピルビン酸オキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ６．７、３７°Ｃでピルビン酸とリン酸がアセチルリン酸とＣＯ２へと変換される反応において、１分間で１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素量である。コレステロールオキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ７．５，２５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのコレステロ−ルを４−コレステン−３−オンに変換する酵素量である。
【００３９】
本発明に用いる過酸化水素分解剤としては、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又はペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が好ましく用いられる。
【００４０】
前記架橋形成酵素Ｂとしては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、反応が室温、大気圧下で進行し、反応時の安全性が高く、かつ物質自体の安全性も高い点から、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼ等が好ましく挙げられる。これらの酵素は単独でまたは２種以上併用することができる。
【００４１】
前記ラッカーゼ及びチロシナーゼは、ハイドロゲルの構成要素とならない他の薬品を一切加える必要がないため、ゲル化の際に機能発現物質が変性するおそれが全くない点で優れる。ペルオキシダーゼは、酵素Ａの反応によって生成した過酸化水素と反応して、瞬時にゲル化させることができ、医療現場等で瞬間的に、止血することが可能となる。
【００４２】
酵素の起源については、特に限定されないが、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ（フェノールオキシダーゼ）等の銅酵素類の起源は、例えば、ウルシ、キノコ（ツチカブリ、マッシュルーム）、カビ（Polyporus vericolor)等が挙げられる。カタラーゼ、ペルキシダーゼ等のヒドロペルオキシダーゼ類の起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M.lysodeikticus、西洋ワサビ、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalis等が挙げられる。これらの中では、チロシナーゼとしては、マッシュルームチロシナーゼが好ましく、ペルオキシダーゼとしては、基質特異性が低く、汎用性がある点から西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。前記酵素Ｂとしては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（製品番号：１６５−１０７９３、和光純薬工業社製）、マッシュルームチロシナーゼ（製品番号：Ｔ３８２４、lyophilized powder, 1000 Ｕ／ｍｇ以上、固体 シグマアルドリッチ社製）、ラッカーゼ（Myceliophthora thermophila由来、ノボザイム社製）を使用することができる。
【００４３】
前記ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分としては、特に限定されないが、例えば、反応が室温、大気圧下で進行し、反応時の安全性が高く、かつ物質自体の安全性も高い点から、鉄ポルフィリン錯体（ヘマチン）、ヘモグロビン等であってよい。前記ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、牛ヘモグロビン（牛由来、シグマアルドリッチ社製）、ヒトヘモグロビン（シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００４４】
ハイドロゲル用組成物における過酸化水素分解剤の含有量は、特に限定されないが、反応性の点から約０．１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、約１Ｕ／ｍＬがより好ましい。また、過酸化水素分解剤の含有量の上限としては、通常２０００Ｕ／ｍＬ程度であり、１０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体である場合は、約０．１質量％以上が好ましく、約１質量％以上がより好ましい。また、鉄ポルフィリン錯体の含有量の上限としては、通常２０質量％程度であり、１０質量％程度が好ましい。
【００４５】
例えば、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に迅速にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を約０．１Ｕ／ｍＬ以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．５〜２０００Ｕ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜１５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．８〜１０００Ｕ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜５００Ｕ／ｍＬ程度とすることが最も好ましい。また、例えば、過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体である場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を約０．１質量％以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．５〜２０質量％程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜１５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．８〜１０質量％程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることが最も好ましい。
【００４６】
また、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、５分後）にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．５〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましい。過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体の場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．５〜５質量％程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることがさらに好ましい。
【００４７】
本発明において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ１Ｕは、ピロガロールから２０秒で１ｍｇのプルプロガリンをｐＨ６，２０℃の条件下で生成する酵素量である。カタラーゼ１Ｕは、ｐＨ７．０，２５℃，１分間で１．０μｍｏｌのＨ２Ｏ２を分解する酵素量であり、チロシナーゼ１Ｕは、Ｌ−チロシンを含む３ｍＬの反応混合液において、ｐＨ６．５、２５℃、１分間で、２８０ｎｍの波長での吸光度を０．００１とする酵素量である。ラッカーゼ１Ｕは、シリングアルダジンを基質として用いた３ｍＬの反応溶液中で、ｐＨ６．５，３０℃，１分間で、５３０ｎｍでの吸光度を０．００１とする酵素量である。
【００４８】
本発明のハイドロゲル用組成物は、上記の(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合することによって、製造することができる。混合時の条件は、特に限定されないが、酵素活性の点から、通常、４〜４５℃程度であり、１０〜４０℃程度が好ましい。また、混合時には、ｐＨは、酵素活性の点から、通常、２〜１１程度であり、５〜９程度が好ましい。得られる混合物であるハイドロゲル用組成物は、通常、−８０〜２０℃程度で保存しておくのが好ましい。また、本発明のハイドロゲル用組成物は、製造された後、凍結乾燥により、凍結乾燥されたものであってもよい。凍結乾燥の方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００４９】
本発明のハイドロゲル用組成物を用いて、創傷被覆材を製造することができる。創傷被覆材の形態としては、公知の好適なドレッシングであればどのようなものであってもよく、例えば、絆創膏、ストリップ、パッド、ガーゼ、フィルム、ストッキング、テープ等が挙げられる。創傷被覆材は、ハイドロゲル用組成物以外の成分として、ハイドロゲルの生成を妨げない限り、特に限定されないが、例えば、消毒薬、１種以上の生物学的活性剤等の別の作用剤を含有するものであってもよい。これらの作用剤は、従来公知の標準的な方法を用いてドレッシング材料に取り込むことが可能なものであり、或いは、ドレッシングの構造とブレンドされ等の別の作用剤に取り込んでもよい。
【００５０】
創傷被覆材に用いるハイドロゲル用組成物は、使用時に各室が連通可能な容器に、前記架橋性高分子組成物と、酵素Ａと、過酸化水素分解剤とを別々の室に封入したものであってもよいが、使用が簡便であるという点から、すべてを混合したものが好ましい。
【００５１】
例えば、創傷の上にのせると、創傷被覆材は、創傷からの血液又は創傷滲出液と接触して、前記血液又は創傷滲出液に含まれるグルコース、アミノ酸等と接触する。この接触により、例えば、グルコースオキシダーゼ（酵素Ａ）が前記グルコースを、酸素の存在下（例えば、空気中の酸素）、酵素処理することによって、過酸化水素を生成させることができる。過酸化水素分解剤が、生成した過酸化水素を用いて、架橋性高分子組成物を架橋し、ハイドロゲルが生成され、創傷部位を被覆することができる。本発明の創傷被覆材を使用する温度としては、特に限定されないが、ゲル化が容易になる点から、通常１５〜４２℃程度であり、２０〜４０℃程度が好ましい。
【００５２】
本発明の他の態様としては、創傷被覆用であって、創傷被覆材を製造するための、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤の混合物の治療的に有効量からなるハイドロゲル用組成物の使用が挙げられる。前記有効量は、適用部位の大きさ等の条件によって、適宜選択することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」は重量基準を示す。
【００５４】
［ゲル化時間］
以下の実施例において、ゲル化時間とは、グルコースを添加した瞬間から、溶液面が撹拌子によって盛り上がり、ディッシュ底面から離れた瞬間までの時間を意味するものである。
【００５５】
［合成例１］
０．１Ｍの２−モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（2-Morpholinoethanesulfolic acid, monohydrate、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６）１Ｌにアルギン酸ナトリウム（Ｉ−１Ｇ）１０ｇを溶解させた。さらに前記アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基と同モル（０．０５１ｍｏｌ）のチラミン塩酸塩（Tyramine hydrochloride）を加え１５分間攪拌した。得られた溶液に、前記アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基の１５％相当（モル）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を１０ｍＬの精製水に完全に溶解させた溶液を加えた後、アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基の３０％相当（モル）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ）を加え、２１時間攪拌した。塩化ナトリウム１．０ｇを加え、１５分間攪拌した。８０％エタノールに少量ずつ加え、チラミン修飾アルギン酸（Ａｌｇ−Ｐｈ）を析出させた。チラミンを除去するため析出したＡｌｇ−Ｐｈを８０％エタノールで洗浄し、１時間ごとにエタノールを取り替えて吸光度を測定した。２７５ｎｍ付近の吸収がなくなるまで洗浄を続けた。１００％エタノール中で３０分間の洗浄を２回行った。凍結真空乾燥を行い、アルギン酸中の糖単位ユニット１００個あたり約４個のフェノール性水酸基が導入されたフェノール性水酸基導入アルギン酸を得た。
【００５６】
［製造例１］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、及びグルコースを、それぞれ最終濃度が、０．７５質量％、１５Ｕ／ｍＬ、０．８３ｍＵ／ｍＬ、４．６３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ａに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００５７】
［製造例２］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び過酸化水素を、それぞれ最終濃度が、０．７５ｗｔ％、１５Ｕ／ｍＬ、４．６３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ａに示すように、過酸化水素の存在下では、ゲルを製造できることが確認された。
【００５８】
［製造例３］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、コリンオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）、及び塩化コリンを、それぞれ最終濃度が、１．１３質量％、１５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、２３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ｂに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００５９】
［製造例４］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ−ＡＡＯｘ）、及びＬ−フェニルアラニンを、それぞれ最終濃度が、１．１３質量％、１５Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１ｇ／ｍＬとなるように調製した混合液を製造した。図１Ｃに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００６０】
［実施例１］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、のＰＢＳ溶液を混合し、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。前記混合溶液中の最終濃度は、それぞれAlg-Ph：２．４５質量％、ＨＲＰ：１１０Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：９１ｍＵ／ｍＬとした。この混合溶液に、ゲルを見やすくするために少量のメチレンブルーを加えた。得られた混合溶液を、オーストラリア産ＦＢＳ（Biofill Australia Pty. Ltd.製、グルコース濃度３ｍｍｏｌ／Ｌ）を十分に染み込ませた脱脂綿上に広げたところ、約５分でゲル化した。結果を図２に示す。
【００６１】
［実施例２］
合成例１で得られたフェノール性水酸基導入カルボキシメチルセルロース(CMC-Ph)、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のＰＢＳ溶液を混合したハイドロゲル用組成物溶液を直径１４ｍｍのディッシュに播いた。前記混合溶液中の最終濃度は、それぞれCMC -Ph：３．０質量％、ＨＲＰ：１００Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：８３ｍＵ／ｍＬとした。このディッシュ上の溶液を攪拌しながら、グルコースを１．８５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、加えた。なお、生体内のグルコース濃度は、一般に５．４ｍｍｏｌ／Ｌ前後である。ゲル化時間は、３秒であった。
【００６２】
［試験例１］
Alg-Ph、グルコース、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。１．５質量％Alg-Phを４５０μＬ、ＨＲＰ及びＧＯｘ混合溶液１００μＬを直径１４ｍｍのディッシュに加え、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。該溶液中のＧＯｘの最終濃度は、０．０００８３Ｕ／ｍＬとし、ＨＲＰの最終濃度は、１、５又は１５Ｕ／ｍＬとした（３サンプル）。得られた溶液をよく撹拌した後、撹拌しながらグルコース溶液を加えゲル化時間を測定した。ゲルの全体積は６００μＬであった。なお、グルコースの最終濃度は１．３８、４．６３又は４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌとした。結果を図３Ａ〜Ｃ（各ｎ＝３， bar:ＳＤ）に示す。
【００６３】
Alg-Ph、Ｈ２Ｏ２、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。１．５質量％Alg-Phを４５０μＬ、ＨＲＰ溶液１００μＬを最終濃度１、５、又は１５Ｕ／ｍＬとなるように２４ウェルディッシュプレートに加えよく撹拌した。その後、撹拌しながらＨ２Ｏ２水溶液を加えゲル化時間を測定した。ゲルの全体積は６００μＬであった。なお、Ｈ２Ｏ２の最終濃度は１．３８、４．６３又は４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌとした。結果を図３Ａ〜Ｃに示す。
【００６４】
図３の結果から、本発明のハイドロゲル用組成物を用いて、ゲル化できることが確認された。また、図Ｂ及びＣに示されるように、過酸化水素を用いているため、Ｈ２Ｏ２の混合後すぐにゲル化した。過酸化水素を用いると、ゲル化の時間は、制御できないことが確認された。
【００６５】
［試験例２］
Alg-Ph、グルコース、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。Alg-Ph、ＨＲＰ及びＧＯｘ溶液を直径１４ｍｍのディッシュに加えよく攪拌し、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。その後、撹拌しながらグルコース溶液を５０μＬ加えて撹拌し、ゲル化を行った。ゲルの全体積は６００μＬであった。ここで、それぞれの最終濃度をAlg-Ph：１．１３質量％、ＨＲＰ：１Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：０．８３ｍＵ／ｍＬ、グルコース：４．６２５ｍｍｏｌ／Ｌとし、反応温度を２０℃とする条件を基準とし、Alg-Ph、ＨＲＰ、ＧＯｘ、グルコース、反応温度をそれぞれ変化させて測定した。具体的には、ＨＲＰは、１、５、１５Ｕ／ｍＬに変化させてゲル化時間を測定した。ＧＯｘは、０．４２、０．８３、４．２、８．３ｍＵ／ｍＬに変化させてゲル化時間を測定した。グルコースは、１．３８、４．６３、４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌに変化させてゲル化時間を測定した。反応温度は、４、２０、３７℃に変化させてゲル化時間を測定した。Alg-Phは、０．３８、０．７５、１．１３重量％に変化させてゲル化時間を測定した。結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のハイドロゲル用組成物は、ハイドロゲルの生成時間を制御でき、ハイドロゲルの生成に過酸化水素水を必要とせず、ハイドロゲルの生成時に加熱する等の工程を要しないため、創傷被覆等において有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル用組成物及びその製造方法に関し、特に、創傷被覆又は再生医療等において有用なハイドロゲル用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の生体適合性の高い高分子を用いて製造され、創傷被覆及び再生医療用の材料として多くの検討が行われている。
【０００３】
近年、これらをゲル化させるための方法として、その反応が細胞及び生体分子に対して温和であることから、ラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼ及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ等の架橋形成酵素反応を利用して、前記高分子にフェノール性水酸基を導入してゲル化させる方法が開発されている（特許文献１〜５）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、使用直前に、（１）前記架橋形成酵素と前記高分子を含有する水溶液と、（２）過酸化水素水とを混合する必要があった。すなわち、例えば、傷口を被覆するためにゲルを生成するためには、２つの溶液を用意する必要があり、使用するのが煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２００４９４号公報
【特許文献２】特開２００７−２３０７９号公報
【特許文献３】特開２００７−２９７３６０号公報
【特許文献４】特開２００８−１７４６７１号公報
【特許文献５】特開２００８−１７４５１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ハイドロゲルの生成に過酸化水素水を必要とせず、ハイドロゲルの生成時に加熱する等の工程を要せず、ハイドロゲルの生成時間を制御できるハイドロゲル用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を用いることによって、前記した課題を一挙に解決できることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
［１］(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
［２］架橋性高分子組成物が、天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子からなることを特徴とする前記［１］に記載のハイドロゲル用組成物。
［３］高分子基材が、合成高分子からなる高分子基材であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［４］高分子基材が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド及びそれらの共重合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［５］高分子基材が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン及びアルブミンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［６］フェノール性水酸基を有する重合性化合物が、下記一般式［Ｉ］
【化１】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物であることを特徴とする前記［２］〜［５］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［７］架橋性高分子組成物が、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなることを特徴とする前記［１］記載のハイドロゲル用組成物。
［８］酵素Ａが、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［９］酵素Ａが、グルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１０］架橋形成酵素Ｂが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１１］ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が、鉄ポルフィリン錯体であることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１２］過酸化水素分解剤が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１３］ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする前記［１２］に記載のハイドロゲル用組成物。
［１４］架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、酵素Ａの含有量が０．１ｍＵ／ｍＬ以上であることを特徴とする前記［１］〜［１３］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１５］過酸化水素分解剤が架橋形成酵素Ｂであって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、架橋形成酵素Ｂの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上であることを特徴とする前記［１］〜［１４］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１６］過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体であって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、前記鉄ポルフィリン錯体の含有量が、０．１質量％以上であることを特徴とする前記［１］〜［１４］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物。
［１７］(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合する工程を有することを特徴とする前記［１］〜［１６］のいずれかに記載されたハイドロゲル用組成物の製造方法。
［１８］前記［１］〜［１６］のいずれかに記載のハイドロゲル用組成物を含むことを特徴とする創傷被覆材。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のハイドロゲル用組成物は、基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａを使用するため、創傷被覆材等として体液に接触するよう用いられる場合、該体液に含まれる基質を利用して過酸化水素を生成することができ、ゲル生成のために必要であった過酸化水素水を用意する必要がない。例えば、酵素Ａがグルコースオキシダーゼの場合、体液に含まれるグルコースを利用して、過酸化水素を生成することができる。また、酵素濃度及び架橋性高分子組成物の濃度を調節することによって、ハイドロゲルの生成時間を制御することができる。例えば、創傷部位又は手術の縫合部位等を迅速にハイドロゲルで被覆することもでき、必要に応じて所定時間後にハイドロゲルを生成させて被覆することもできる。このため、雑菌の侵入又は細胞癒着等を効果的に防ぐことができる。また、酵素濃度及び架橋性高分子組成物の濃度を調節することによって、生成されるハイドロゲルの物性を制御することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ゲルの製造例を示す図である。Ａは製造例１及び２のゲルを表し、Ｂは製造例３を表し、Ｃは製造例４を表す。
【図２】図２は、実施例１のハイドロゲル用組成物で得られたハイドロゲルを表す図である。
【図３】図３は、試験例１のゲル化時間を表す図である。Ａは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が１Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表し、Ｂは、ＨＲＰが５Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表し、ＣはＨＲＰが１５Ｕ／ｍＬの場合のゲル化時間を表す。図中、丸記号が、グルコースを添加したサンプルを表し、三角記号が、過酸化水素を添加したサンプルを表す。
【図４】図４は、試験例２のゲル化時間を表す図である。ＡはＨＲＰ濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、ＢはＧＯｘ濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、Ｃはグルコース濃度を変化させた場合のゲル化時間を表し、Ｄは反応温度を変化させた場合のゲル化時間を表し、ＥはAlg-Ph濃度を変化させた場合のゲル化時間を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のハイドロゲル用組成物及びその製造方法を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のハイドロゲル用組成物は、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明のハイドロゲル用組成物は過酸化水素水を含まない。また、本発明のハイドロゲル用組成物は、酵素Ａが反応する基質を含まないものが好ましい。例えば、ハイドロゲル用組成物が、グルコースオキシダーゼを含む場合、グルコースを含まないものが好ましく、アミノ酸及びコリンは含んでいてもよい。アミノ酸オキシダーゼを含む場合、アミノ酸（高分子基材としてのポリアミノ酸を除く。）を含まないものが好ましく、グルコース及びコリンは含んでいてもよい。本発明のハイドロゲル用組成物は、創傷被覆材等に用いられる場合、血液中又は体液中の基質（グルコース等）を利用できるためである。
【００１４】
本発明に用いる架橋性高分子組成物としては、過酸化水素を消費してゲル状となるものであれば、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば（１）天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子及び／又は（２）官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなる組成物等が挙げられる。
【００１５】
前記（１）天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材（以下、単に「高分子基材」ともいう。）としては、特に限定されないが、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、及びそれらの共重合体等が挙げられる。
【００１６】
前記多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、澱粉、プルラン、それらの薬理学的に許容される塩及びそれらの誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、脱アセチル化キチン類又は脱アセチル化キトサン類等）等が挙げられる。前記脱アセチル化キチン類又は脱アセチル化キトサン類は、キチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合した多糖）類のグルコサミン単位の２位のアセトアミド基が脱アセチル化されている多糖類であり、主にエビ、カニ等の甲殻類の甲羅に含まれるキチン質から公知の手段で得ることができ、脱アセチル化度は、５０〜１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましい。薬理学的に許容される塩は、特に限定されず、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が例として挙げられる。薬理学的に許容される酸付加塩としては、特に限定されず、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が例として挙げられ、薬理学的に許容される金属塩としては、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が例として挙げられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、特に限定されず、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が例として挙げられる。
【００１７】
前記タンパク質としては、単純タンパク質（アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質等）、複合タンパク質（核タンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質等）、誘導タンパク質（ゼラチン、プロテオース、ペプトン等）等が挙げられ、分子形状から分類される繊維状タンパク質（コラーゲン、ケラチン、フィブロイン、ゼラチン）、球状タンパク質等が挙げられる。
【００１８】
これらのうち、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン又はアルブミン等が工業的に容易に供給されること、得られるハイドロゲルの性状が良好なことから好ましい。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ヘミセルロースは除いていてもよい。高分子基材は、架橋密度を制御できるという点から、必要に応じて、合成高分子からなる高分子基材を好適に使用できる。高分子基材としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、Kimica Ｉ-1G（商品名、アルギン酸ナトリウム、フナコシ社製）、ゼラチン（魚ゼラチン、製品番号：Ｇ７７６５、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００１９】
前記（２）官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなる組成物において、アミノ基含有多糖質高分子化合物としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、アセチル化キチン及びキトサン等が好ましく挙げられる。また、ポリフェノール類化合物としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、カテキン類化合物、アントシアニン類化合物、ルチン、並びに、赤キャベツ色素（シアニジンアシルグリコシド類化合物）、ベニバナ黄色素（カーサマスイエロー：サフロミンA、サフロミンB）、カーサマスレッド（カーサミン）、シソ色素（Perilla colour：シソニン、マロニルシソニン）、アカダイコン色素（Red radish colour：ペラルゴニジンアシルグリコシド類化合物）、ムラサキイモ色素（Purple sweet potato colour：シアニジンアシルグルコシド類化合物、ペオニジンアシルグルコシド類化合物）、エルダーベリー色素（Elderberry colour：シアニジングリコシド類化合物）等の天然色素を好ましく例示することができる。
【００２０】
前記フェノール性水酸基を有する重合性化合物（以下、単に「重合性化合物」ともいう。）としては、特に限定されないが、下記一般式［Ｉ］
【化２】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物等が挙げられる。前記高分子基材に前記重合性化合物が有するようなフェノール性水酸基を導入することで、高分子基材が酵素により容易に架橋し得る。Ｒ１は、重合性化合物を高分子基材へ導入しやすいという観点から、カルボキシル基、１級又は２級アミノ基が好ましく、１級又は２級アミノ基がより好ましい。また、Ｒ２としては、重合性化合物の水に対する溶解性の観点、高分子基材との反応時の溶媒の選定を容易にする観点及び架橋性高分子中におけるフェノール性水酸基の反応性の観点等から、炭素数１〜８の炭化水素であることが好ましく、炭素数１〜６の炭化水素であることがより好ましい。かかる炭化水素としては、特に制限はないが、得られた架橋性高分子の反応性の観点から、好ましくはアルキレン基、アルキルアルキレン基等が挙げられる。また、Ｒ２が有してもよい置換基としては、特に制限はなく、例えばアミド基、エステル基、エーテル基等が挙げられる。
【００２１】
前記一般式［Ｉ］で表される化合物として、例えば、チラミン及びホモバニリン誘導体類等のフェノール性水酸基を１つ有する化合物、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等のカテコールアミン誘導体類等のフェノール性水酸基を２つ有する化合物が挙げられる。これらの中でも、得られる架橋性高分子の架橋反応性の観点から、重合性化合物としては、フェノール性水酸基を１つ有する化合物が好ましく、チラミン誘導体類がより好ましい。前記重合性化合物１種又は２種以上を選択して使用することができる。
【００２２】
前記重合性化合物は、その製造方法に特に制限はなく、例えば、公知の化学的な合成方法、生物的な合成方法、又は動物や植物等の自然界から得る方法等を単独又は組み合わせた方法により得ることができる。また、前記重合性化合物としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、チラミン塩酸塩（４−（２−アミノエチル）フェノール・塩酸塩、製品番号：Ｔ２８７９、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００２３】
前記高分子基材と前記重合性化合物との結合方法は、特に限定されないが、重合性化合物が有することがあるカルボキシル基、アミノ基又はアルコール性水酸基等の官能基と、高分子基材が有することがあるアミノ基、カルボキシル基又はチオール基等の官能基とを縮合剤を用いて縮合する方法、グルタミルトランスフェラーゼにより処理することで縮合する方法等が挙げられる。本発明における高分子の製造方法としては、より反応条件が温和であり、高分子基材に与える影響が少ないことからグルタミルトランスフェラーゼを用いる方法がより好ましい。
【００２４】
前記縮合剤としては、特に制限されないが、例えば、１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド及び３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩等が挙げられる。これらの縮合剤としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ペプチド研究所製）等を使用することができる。
【００２５】
前記グルタミルトランスフェラーゼとは、グルタミル化合物のグルタミル基をアミン化合物に転移する酵素であり、グルタミルトランスペプチダーゼ、プロテイン−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ、プロテイン−グルタミン：アミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ、グルタモトランスフェラーゼ又はトランスグルタミナーゼともよばれる。グルタミルトランスフェラーゼとしては、例えば、生体から得られたものを使用してもよく、生物的に合成したものを使用してもよい。また、これらの方法により得られた市販品を使用してもよく、例えばシグマアルドリッチ社製のモルモット肝臓由来プロテイン−グルタミン−γ−トランスフェラーゼ、和光純薬社製の牛腎臓由来γ−グルタミルトランスフェラーゼ、オリエンタル社製のモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ等の市販されている酵素を使用することができる。
【００２６】
前記の高分子基材及び重合性化合物をグルタミルトランスフェラーゼにて処理する方法においては、上述の縮合反応が進行する限り、特に制限はなく、使用する高分子基材、酵素及び重合性化合物の性質に合わせて適宜、ｐＨ、高分子基材の濃度及び反応温度等の条件を選定することができる。
【００２７】
処理する際に使用する溶媒としては、特に制限されず、高分子基材、重合性化合物及びグルタミルトランスフェラーゼに対して溶解性や反応性の良好な溶媒を選択すればよい。例えば、水；ｐＨ緩衝液（例えば、ＰＢＳ等）；メタノール、エタノール等のアルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類；ジメチルスルフォキシド等又はこれらの混合溶媒が挙げられる。高分子基材、グルタミルトランスフェラーゼの溶解性及び酵素の反応性の観点から水又はｐＨ緩衝液を主体とした溶媒が好ましく、重合性化合物の溶解性に応じて、アルコール類又はアミド類等の有機溶媒を混合することがより好ましい。例えば、高分子基材の水溶液に酵素を作用させる方法で説明すると、溶媒のｐＨは、溶解性等の高分子基材の性質及び酵素活性等を考慮して調整することができ、酵素活性が高い領域を選択するという観点から、４〜１１が好ましく、５〜９がより好ましい。
【００２８】
高分子基材の水溶液中の濃度は、特に限定されないが、高分子基材の溶解性、反応の均一性及び得られる架橋性高分子の回収率等の観点から、０．１〜７０質量％が好ましく、０．５〜３０質量％がより好ましい。
【００２９】
反応温度は、高分子基材が変性せず、酵素活性が損なわれない領域を選択するという観点から、５〜８０℃が好ましく、１０〜５０℃がより好ましい。グルタミルトランスフェラーゼには、その反応性が共存するカルシウムイオンに依存するものがある。このようなグルタミルトランスフェラーゼを用いる場合は、反応を促進する為にカルシウムイオンを添加することが好ましい。カルシウムイオンの濃度は、使用するグルタミルトランスフェラーゼの性質と使用時の反応速度により選択すればよいが、反応速度の観点から０．１〜１０００ｍＭが好ましく、１〜５００ｍＭがより好ましい。
【００３０】
重合性化合物の量は、目的とする架橋性高分子中の重合性化合物の導入量及び架橋能力により適宜選択することができるが、高分子基材に対してフェノール性水酸基を有する重合性化合物の配合比（縮合比）は高分子基材１に対して０．００３〜０．１（質量比）が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．０５（質量比）である。重合性化合物の量が少なすぎると架橋が十分に行われず、強度が低くなりすぎ、重合性化合物の量が多すぎると得られる架橋体ゲルが硬くなり過ぎ、脆くなる。
【００３１】
本発明で使用するグルタミルトランスフェラーゼの量は、酵素の活性やその他の反応条件（例えば反応時間、温度、又は重合性化合物の濃度等）により適宜選択することができる。例えば、所望の反応速度及び重合性化合物の導入量を得るという観点から、高分子基材に対して０．０００１〜９０質量％が好ましく、０．０１〜７０質量％がより好ましい。なお、上述の方法により得られた架橋性高分子は、公知の方法で単離することができる。かかる方法としては、例えば、高分子基材及びグルタミルトランスフェラーゼを混合した反応液を反応後、過剰の溶媒中に滴下し、生成した沈殿物を遠心分離して回収し、未反応物を洗浄する方法や透析により未反応物を除去する方法等が挙げられる。
【００３２】
上記の方法により得られる架橋性高分子を、例えば、１Ｈ−ＮＭＲを用いた構造分析に供することにより、高分子基材と重合性化合物とが結合していることを確認することができる。
【００３３】
また、本発明で使用される架橋性高分子の重合度は種々のものとすることができ、高分子基材の種類により、適宜選択できる。２０℃における架橋性高分子の水溶液粘度は、通常、１〜１０００００ｍＰａ・ｓ程度であり、１０〜１００００ｍＰａ・ｓ程度が好ましく、より迅速にハイドロゲルを生成する場合、３０〜１０００ｍＰａ・ｓがより好ましい。適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、４０分後）にハイドロゲルを生成させる場合、５０〜５００ｍＰａ・ｓがより好ましい。なお、該架橋性高分子の水溶液粘度は、ＪＩＳ Ｋ７１１７−２ プラスチック液状・乳濁状叉は分散状の樹脂−回転粘度計によるせん断速度での粘度の測定方法（ＩＳＯ ３２１９）に従って測定した値であり、粘度は円錐平板型回転粘度計（コーン・プレート タイプ）を用いて測定した値である。測定器としては、例えば、Ｒ２１５形粘度計シリーズ（例えば、ＲＢ２１５Ｌ形粘度計、東機産業社製）等が挙げられる。
【００３４】
ハイドロゲル用組成物における架橋性高分子組成物の含有量は、組成物全体に対して、通常０．１〜３０質量％であり、０．５〜２０質量％が好ましく、０．７５〜１０質量％がより好ましい。架橋性高分子組成物の含有量が、０．１質量％を下回る場合、使用しうる強度のゲルを形成することができないおそれがあり、３０質量％を超えると、ゲル化が容易ではない又はゲルがもろくなるおそれがある。
【００３５】
ハイドロゲル用組成物のｐＨは、特に限定されないが、酵素活性の点から、ｐＨ２．０〜ｐＨ１０．０程度が好ましく、特にｐＨ５．０〜ｐＨ９．０程度が好ましい。
【００３６】
本発明に用いる酵素Ａとしては、基質を消費して過酸化水素を生成する酵素が用いられ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上が用いられることが好ましい。これらの酵素は、用途に応じて適宜選択できるが、創傷被覆材として使用する場合、グルコースオキシダーゼが好ましい。酵素Ａは、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（Aspergillus niger起源、SERVA Electrophoresis GmbH社製）等が挙げられる。
【００３７】
ハイドロゲル用組成物における酵素Ａの含有量は、特に限定されないが、反応性の点から約０．１ｍＵ／ｍＬ以上が好ましく、約１ｍＵ／ｍＬ以上がより好ましい。また、酵素Ａの含有量の上限としては、通常２００００ｍＵ／ｍＬ程度であり、１００００ｍＵ／ｍＬ程度が好ましい。例えば、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に迅速にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、酵素Ａを約０．１ｍＵ／ｍＬ程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜１０質量％程度とし、酵素Ａを２．５〜２００ｍＵ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜３０質量％程度とし、酵素Ａを１０〜１８０ｍＵ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、酵素Ａを０．５ｍＵ／ｍＬ程度以上にすることが最も好ましい。また、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、４０分後）にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜１５質量％程度とし、酵素Ａを約１ｍＵ／ｍＬ以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、酵素Ａを５ｍＵ／ｍＬ程度以上とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、酵素Ａを１０ｍＵ／ｍＬ程度以上とすることがさらに好ましい。
【００３８】
本発明において、グルコースオキシダーゼ１Ｕ（ｕｎｉｔ）は、ｐＨ５．１，３５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのβ−Ｄ−グルコ−スをＤ−グルコノラクトンとＨ２Ｏ２に酸化する酵素量である。コリンオキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ８．０，３７℃，１分間で、１μｍｏｌのコリンのベタインアルデヒドへの酸化により１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生じる酵素量である。アミノ酸オキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ６．５、３７℃で１分間あたり１．０μｍｏｌのＬ−フェニルアラニンを酸化的に脱アミノする酵素量である。アルコールオキシダーゼ１ｕｎｉｔは、ｐＨ７．５，２５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのメタノ−ルをホルムアルデヒドへと酸化する酵素量である。ピルビン酸オキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ６．７、３７°Ｃでピルビン酸とリン酸がアセチルリン酸とＣＯ２へと変換される反応において、１分間で１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素量である。コレステロールオキシダーゼ１Ｕは、ｐＨ７．５，２５℃，１分間で、１．０μｍｏｌのコレステロ−ルを４−コレステン−３−オンに変換する酵素量である。
【００３９】
本発明に用いる過酸化水素分解剤としては、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又はペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が好ましく用いられる。
【００４０】
前記架橋形成酵素Ｂとしては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、反応が室温、大気圧下で進行し、反応時の安全性が高く、かつ物質自体の安全性も高い点から、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼ等が好ましく挙げられる。これらの酵素は単独でまたは２種以上併用することができる。
【００４１】
前記ラッカーゼ及びチロシナーゼは、ハイドロゲルの構成要素とならない他の薬品を一切加える必要がないため、ゲル化の際に機能発現物質が変性するおそれが全くない点で優れる。ペルオキシダーゼは、酵素Ａの反応によって生成した過酸化水素と反応して、瞬時にゲル化させることができ、医療現場等で瞬間的に、止血することが可能となる。
【００４２】
酵素の起源については、特に限定されないが、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ（フェノールオキシダーゼ）等の銅酵素類の起源は、例えば、ウルシ、キノコ（ツチカブリ、マッシュルーム）、カビ（Polyporus vericolor)等が挙げられる。カタラーゼ、ペルキシダーゼ等のヒドロペルオキシダーゼ類の起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M.lysodeikticus、西洋ワサビ、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalis等が挙げられる。これらの中では、チロシナーゼとしては、マッシュルームチロシナーゼが好ましく、ペルオキシダーゼとしては、基質特異性が低く、汎用性がある点から西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましい。前記酵素Ｂとしては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（製品番号：１６５−１０７９３、和光純薬工業社製）、マッシュルームチロシナーゼ（製品番号：Ｔ３８２４、lyophilized powder, 1000 Ｕ／ｍｇ以上、固体 シグマアルドリッチ社製）、ラッカーゼ（Myceliophthora thermophila由来、ノボザイム社製）を使用することができる。
【００４３】
前記ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分としては、特に限定されないが、例えば、反応が室温、大気圧下で進行し、反応時の安全性が高く、かつ物質自体の安全性も高い点から、鉄ポルフィリン錯体（ヘマチン）、ヘモグロビン等であってよい。前記ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分としては、市販品を使用することができる。市販品としては、例えば、牛ヘモグロビン（牛由来、シグマアルドリッチ社製）、ヒトヘモグロビン（シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００４４】
ハイドロゲル用組成物における過酸化水素分解剤の含有量は、特に限定されないが、反応性の点から約０．１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、約１Ｕ／ｍＬがより好ましい。また、過酸化水素分解剤の含有量の上限としては、通常２０００Ｕ／ｍＬ程度であり、１０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体である場合は、約０．１質量％以上が好ましく、約１質量％以上がより好ましい。また、鉄ポルフィリン錯体の含有量の上限としては、通常２０質量％程度であり、１０質量％程度が好ましい。
【００４５】
例えば、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に迅速にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を約０．１Ｕ／ｍＬ以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．５〜２０００Ｕ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜１５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．８〜１０００Ｕ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜５００Ｕ／ｍＬ程度とすることが最も好ましい。また、例えば、過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体である場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を約０．１質量％以上とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．１〜３０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．５〜２０質量％程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．３〜１５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．８〜１０質量％程度とすることがさらに好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることが最も好ましい。
【００４６】
また、適用部位（例えば、創傷部位又は手術部位等）に数分〜数十分後（例えば、５分後）にハイドロゲルを生成させる場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を０．５〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、過酸化水素分解剤を１〜２００Ｕ／ｍＬ程度とすることがさらに好ましい。過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体の場合、架橋性高分子組成物の含有量を０．５〜２０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を０．５〜５質量％程度とすることが好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１５質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることがより好ましく、架橋性高分子組成物の含有量を１〜１０質量％程度とし、鉄ポルフィリン錯体を１〜５質量％程度とすることがさらに好ましい。
【００４７】
本発明において、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ１Ｕは、ピロガロールから２０秒で１ｍｇのプルプロガリンをｐＨ６，２０℃の条件下で生成する酵素量である。カタラーゼ１Ｕは、ｐＨ７．０，２５℃，１分間で１．０μｍｏｌのＨ２Ｏ２を分解する酵素量であり、チロシナーゼ１Ｕは、Ｌ−チロシンを含む３ｍＬの反応混合液において、ｐＨ６．５、２５℃、１分間で、２８０ｎｍの波長での吸光度を０．００１とする酵素量である。ラッカーゼ１Ｕは、シリングアルダジンを基質として用いた３ｍＬの反応溶液中で、ｐＨ６．５，３０℃，１分間で、５３０ｎｍでの吸光度を０．００１とする酵素量である。
【００４８】
本発明のハイドロゲル用組成物は、上記の(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合することによって、製造することができる。混合時の条件は、特に限定されないが、酵素活性の点から、通常、４〜４５℃程度であり、１０〜４０℃程度が好ましい。また、混合時には、ｐＨは、酵素活性の点から、通常、２〜１１程度であり、５〜９程度が好ましい。得られる混合物であるハイドロゲル用組成物は、通常、−８０〜２０℃程度で保存しておくのが好ましい。また、本発明のハイドロゲル用組成物は、製造された後、凍結乾燥により、凍結乾燥されたものであってもよい。凍結乾燥の方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
【００４９】
本発明のハイドロゲル用組成物を用いて、創傷被覆材を製造することができる。創傷被覆材の形態としては、公知の好適なドレッシングであればどのようなものであってもよく、例えば、絆創膏、ストリップ、パッド、ガーゼ、フィルム、ストッキング、テープ等が挙げられる。創傷被覆材は、ハイドロゲル用組成物以外の成分として、ハイドロゲルの生成を妨げない限り、特に限定されないが、例えば、消毒薬、１種以上の生物学的活性剤等の別の作用剤を含有するものであってもよい。これらの作用剤は、従来公知の標準的な方法を用いてドレッシング材料に取り込むことが可能なものであり、或いは、ドレッシングの構造とブレンドされ等の別の作用剤に取り込んでもよい。
【００５０】
創傷被覆材に用いるハイドロゲル用組成物は、使用時に各室が連通可能な容器に、前記架橋性高分子組成物と、酵素Ａと、過酸化水素分解剤とを別々の室に封入したものであってもよいが、使用が簡便であるという点から、すべてを混合したものが好ましい。
【００５１】
例えば、創傷の上にのせると、創傷被覆材は、創傷からの血液又は創傷滲出液と接触して、前記血液又は創傷滲出液に含まれるグルコース、アミノ酸等と接触する。この接触により、例えば、グルコースオキシダーゼ（酵素Ａ）が前記グルコースを、酸素の存在下（例えば、空気中の酸素）、酵素処理することによって、過酸化水素を生成させることができる。過酸化水素分解剤が、生成した過酸化水素を用いて、架橋性高分子組成物を架橋し、ハイドロゲルが生成され、創傷部位を被覆することができる。本発明の創傷被覆材を使用する温度としては、特に限定されないが、ゲル化が容易になる点から、通常１５〜４２℃程度であり、２０〜４０℃程度が好ましい。
【００５２】
本発明の他の態様としては、創傷被覆用であって、創傷被覆材を製造するための、(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤の混合物の治療的に有効量からなるハイドロゲル用組成物の使用が挙げられる。前記有効量は、適用部位の大きさ等の条件によって、適宜選択することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」は重量基準を示す。
【００５４】
［ゲル化時間］
以下の実施例において、ゲル化時間とは、グルコースを添加した瞬間から、溶液面が撹拌子によって盛り上がり、ディッシュ底面から離れた瞬間までの時間を意味するものである。
【００５５】
［合成例１］
０．１Ｍの２−モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（2-Morpholinoethanesulfolic acid, monohydrate、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６）１Ｌにアルギン酸ナトリウム（Ｉ−１Ｇ）１０ｇを溶解させた。さらに前記アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基と同モル（０．０５１ｍｏｌ）のチラミン塩酸塩（Tyramine hydrochloride）を加え１５分間攪拌した。得られた溶液に、前記アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基の１５％相当（モル）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を１０ｍＬの精製水に完全に溶解させた溶液を加えた後、アルギン酸ナトリウムのカルボキシル基の３０％相当（モル）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ）を加え、２１時間攪拌した。塩化ナトリウム１．０ｇを加え、１５分間攪拌した。８０％エタノールに少量ずつ加え、チラミン修飾アルギン酸（Ａｌｇ−Ｐｈ）を析出させた。チラミンを除去するため析出したＡｌｇ−Ｐｈを８０％エタノールで洗浄し、１時間ごとにエタノールを取り替えて吸光度を測定した。２７５ｎｍ付近の吸収がなくなるまで洗浄を続けた。１００％エタノール中で３０分間の洗浄を２回行った。凍結真空乾燥を行い、アルギン酸中の糖単位ユニット１００個あたり約４個のフェノール性水酸基が導入されたフェノール性水酸基導入アルギン酸を得た。
【００５６】
［製造例１］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、及びグルコースを、それぞれ最終濃度が、０．７５質量％、１５Ｕ／ｍＬ、０．８３ｍＵ／ｍＬ、４．６３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ａに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００５７】
［製造例２］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び過酸化水素を、それぞれ最終濃度が、０．７５ｗｔ％、１５Ｕ／ｍＬ、４．６３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ａに示すように、過酸化水素の存在下では、ゲルを製造できることが確認された。
【００５８】
［製造例３］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、コリンオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）、及び塩化コリンを、それぞれ最終濃度が、１．１３質量％、１５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、２３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように調製した混合液を製造した。図１Ｂに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００５９】
［製造例４］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ−ＡＡＯｘ）、及びＬ−フェニルアラニンを、それぞれ最終濃度が、１．１３質量％、１５Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、１ｇ／ｍＬとなるように調製した混合液を製造した。図１Ｃに示すように、過酸化水素なしで、ゲルを製造できることが確認された。
【００６０】
［実施例１］
合成例１で得られたフェノール性水酸基を導入したアルギン酸（Alg-Ph）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、のＰＢＳ溶液を混合し、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。前記混合溶液中の最終濃度は、それぞれAlg-Ph：２．４５質量％、ＨＲＰ：１１０Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：９１ｍＵ／ｍＬとした。この混合溶液に、ゲルを見やすくするために少量のメチレンブルーを加えた。得られた混合溶液を、オーストラリア産ＦＢＳ（Biofill Australia Pty. Ltd.製、グルコース濃度３ｍｍｏｌ／Ｌ）を十分に染み込ませた脱脂綿上に広げたところ、約５分でゲル化した。結果を図２に示す。
【００６１】
［実施例２］
合成例１で得られたフェノール性水酸基導入カルボキシメチルセルロース(CMC-Ph)、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のＰＢＳ溶液を混合したハイドロゲル用組成物溶液を直径１４ｍｍのディッシュに播いた。前記混合溶液中の最終濃度は、それぞれCMC -Ph：３．０質量％、ＨＲＰ：１００Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：８３ｍＵ／ｍＬとした。このディッシュ上の溶液を攪拌しながら、グルコースを１．８５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、加えた。なお、生体内のグルコース濃度は、一般に５．４ｍｍｏｌ／Ｌ前後である。ゲル化時間は、３秒であった。
【００６２】
［試験例１］
Alg-Ph、グルコース、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。１．５質量％Alg-Phを４５０μＬ、ＨＲＰ及びＧＯｘ混合溶液１００μＬを直径１４ｍｍのディッシュに加え、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。該溶液中のＧＯｘの最終濃度は、０．０００８３Ｕ／ｍＬとし、ＨＲＰの最終濃度は、１、５又は１５Ｕ／ｍＬとした（３サンプル）。得られた溶液をよく撹拌した後、撹拌しながらグルコース溶液を加えゲル化時間を測定した。ゲルの全体積は６００μＬであった。なお、グルコースの最終濃度は１．３８、４．６３又は４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌとした。結果を図３Ａ〜Ｃ（各ｎ＝３， bar:ＳＤ）に示す。
【００６３】
Alg-Ph、Ｈ２Ｏ２、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。１．５質量％Alg-Phを４５０μＬ、ＨＲＰ溶液１００μＬを最終濃度１、５、又は１５Ｕ／ｍＬとなるように２４ウェルディッシュプレートに加えよく撹拌した。その後、撹拌しながらＨ２Ｏ２水溶液を加えゲル化時間を測定した。ゲルの全体積は６００μＬであった。なお、Ｈ２Ｏ２の最終濃度は１．３８、４．６３又は４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌとした。結果を図３Ａ〜Ｃに示す。
【００６４】
図３の結果から、本発明のハイドロゲル用組成物を用いて、ゲル化できることが確認された。また、図Ｂ及びＣに示されるように、過酸化水素を用いているため、Ｈ２Ｏ２の混合後すぐにゲル化した。過酸化水素を用いると、ゲル化の時間は、制御できないことが確認された。
【００６５】
［試験例２］
Alg-Ph、グルコース、ＨＲＰ及びＧＯｘの水溶液をそれぞれ調製した。Alg-Ph、ＨＲＰ及びＧＯｘ溶液を直径１４ｍｍのディッシュに加えよく攪拌し、ハイドロゲル用組成物溶液を得た。その後、撹拌しながらグルコース溶液を５０μＬ加えて撹拌し、ゲル化を行った。ゲルの全体積は６００μＬであった。ここで、それぞれの最終濃度をAlg-Ph：１．１３質量％、ＨＲＰ：１Ｕ／ｍＬ、ＧＯｘ：０．８３ｍＵ／ｍＬ、グルコース：４．６２５ｍｍｏｌ／Ｌとし、反応温度を２０℃とする条件を基準とし、Alg-Ph、ＨＲＰ、ＧＯｘ、グルコース、反応温度をそれぞれ変化させて測定した。具体的には、ＨＲＰは、１、５、１５Ｕ／ｍＬに変化させてゲル化時間を測定した。ＧＯｘは、０．４２、０．８３、４．２、８．３ｍＵ／ｍＬに変化させてゲル化時間を測定した。グルコースは、１．３８、４．６３、４６．２５ｍｍｏｌ／Ｌに変化させてゲル化時間を測定した。反応温度は、４、２０、３７℃に変化させてゲル化時間を測定した。Alg-Phは、０．３８、０．７５、１．１３重量％に変化させてゲル化時間を測定した。結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のハイドロゲル用組成物は、ハイドロゲルの生成時間を制御でき、ハイドロゲルの生成に過酸化水素水を必要とせず、ハイドロゲルの生成時に加熱する等の工程を要しないため、創傷被覆等において有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
【請求項２】
架橋性高分子組成物が、天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子からなることを特徴とする請求項１記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項３】
高分子基材が、合成高分子からなる高分子基材であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項４】
高分子基材が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド及びそれらの共重合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項５】
高分子基材が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン及びアルブミンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項６】
フェノール性水酸基を有する重合性化合物が、下記一般式［Ｉ］
【化１】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項７】
架橋性高分子組成物が、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなることを特徴とする請求項１記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項８】
酵素Ａが、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項９】
酵素Ａが、グルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１０】
架橋形成酵素Ｂが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が、鉄ポルフィリン錯体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１２】
過酸化水素分解剤が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１３】
ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１４】
架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、酵素Ａの含有量が０．１ｍＵ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１５】
過酸化水素分解剤が架橋形成酵素Ｂであって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、架橋形成酵素Ｂの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１６】
過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体であって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、前記鉄ポルフィリン錯体の含有量が、０．１質量％以上であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１７】
(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合する工程を有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたハイドロゲル用組成物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物を含むことを特徴とする創傷被覆材。
【請求項１】
(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤、を含有することを特徴とするハイドロゲル用組成物。
【請求項２】
架橋性高分子組成物が、天然及び／又は合成高分子からなる高分子基材とフェノール性水酸基を有する重合性化合物とを結合させて得られる高分子からなることを特徴とする請求項１記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項３】
高分子基材が、合成高分子からなる高分子基材であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項４】
高分子基材が、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド及びそれらの共重合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項５】
高分子基材が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、コラーゲン及びアルブミンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項６】
フェノール性水酸基を有する重合性化合物が、下記一般式［Ｉ］
【化１】
（式中、Ｒ１は、アルコール性水酸基、１級アミノ基、２級アミノ基又はカルボキシル基を表し、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素を表し、Ａ１〜Ａ５のうち１つ又は２つは、フェノール性水酸基を表し、残りは水素原子又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。Ａ１〜Ａ５のうち２つがフェノール性水酸基である場合、２つのフェノール性水酸基はオルト又はパラ位の位置関係にあるものとする。）
で表される化合物であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項７】
架橋性高分子組成物が、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物とからなることを特徴とする請求項１記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項８】
酵素Ａが、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項９】
酵素Ａが、グルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１０】
架橋形成酵素Ｂが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ及びカタラーゼからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１１】
ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分が、鉄ポルフィリン錯体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１２】
過酸化水素分解剤が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１３】
ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１２記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１４】
架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、酵素Ａの含有量が０．１ｍＵ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１５】
過酸化水素分解剤が架橋形成酵素Ｂであって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、架橋形成酵素Ｂの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１６】
過酸化水素分解剤が鉄ポルフィリン錯体であって、架橋性高分子組成物の含有量が０．１〜３０質量％であり、前記鉄ポルフィリン錯体の含有量が、０．１質量％以上であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物。
【請求項１７】
(i)天然及び／又は合成高分子からなる架橋性高分子組成物、(ii)基質を消費して過酸化水素を生成する酵素Ａ、及び、(iii)（a）過酸化水素を消費して架橋性高分子を架橋させる架橋形成酵素Ｂ、及び／又は(b)ペルオキシダーゼ様の活性を有する成分である過酸化水素分解剤を混合する工程を有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載されたハイドロゲル用組成物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のハイドロゲル用組成物を含むことを特徴とする創傷被覆材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１６２６２１（Ｐ２０１２−１６２６２１Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３１４５（Ｐ２０１１−２３１４５）
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月４日（２０１１．２．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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