ハーブエキス末およびその調製および使用法
ハーブエキス末を多糖類−ペプチドに富むキノコ、例えば、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）から調製する方法が開示されている。さらに有効で、高度に純粋なＹｕｎｚｈｉエキス末、その調製法ならびに癌細胞増殖および肝炎の改善におけるその使用法も開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および肝炎の予防または補助療法または治療のためのＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含有するハーブエキス末に関する。本発明はさらに、Ｙｕｎｚｈｉを包含する多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製し、使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｙｕｎｚｈｉ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒまたはキクラゲともいう）はキノコ属のＰｏｌｙｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ、およびＢａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅ目に属する食用菌である。これは薬効のあるキノコと考えられ、漢方において使用される。
【０００３】
Ｙｕｎｚｈｉは、免疫機能を向上させ、免疫細胞の量を増大させ、腫瘍細胞を飲み込んで、殺し、白血球数を増大させることが証明されている活性成分多糖類を含有する。これは、慢性、持続性および活性肝炎、Ｂ型肝炎を治療するためにも使用され、一般的な有効率は８２．４％である。慢性気管支炎の治療におけるその有効率は８５％に達する。老化防止および健康維持機能があるので、これはフリーラジカルを除去し、薬物効果を刺激し、腎臓を活性化し、肝臓を増強することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫系機能の促進におけるＹｕｎｚｈｉの有効性が１９４３年に見出されてから、Ｙｕｎｚｈｉ多糖類の供給に対する要求が存在する。Ｙｕｎｚｈｉ抽出物の全てが多糖類含量の点で同じであるわけではないことを理解することは重要である。より有効で、高純度のＹｕｎｚｈｉエキス末を含有するＹｕｎｚｈｉ処方を調製するためのさらに良好な方法を提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法に関する。この方法は、多糖類−ペプチドに富むキノコを提供し、キノコを粉砕し、アルカノールおよび水性溶媒により抽出し、抽出物を濾過し、濃縮し、濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を得ることを含む。アルカノールは、エタノールまたはエタノール：水混合物であってよい。水性溶媒は水であってよい。
【０００６】
本発明はさらに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法にも関する。この方法は、Ｙｕｎｚｈｉ原料を提供し、前記原料を粉砕し、溶媒により抽出し、抽出物を濾過し、濃縮し、濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む。
【０００７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は４回（５０％エタノールで２回、水で２回）抽出することにより行われる。もう一つ別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ハーブ材料および溶媒の重量対体積比が好ましくは、それぞれ、第１および第二抽出については約１：５、１：２〜３、第三および第四抽出については１：２〜３および１：１〜３である条件下で行われる。
【０００８】
もう一つ別の態様において、本発明は、本発明の方法により調製されるＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含有するハーブエキス末に関する。一つの実施形態において、本発明のハーブエキス末は、下記の化学プロファイリングを特徴とする。本発明のハーブエキス末は、他の旧来の方法により調製されたものよりも、癌細胞の増殖防止においてより有効であるＹｕｎｚｈｉ粉末を含有する。
【０００９】
本発明のハーブエキス末はさらに、医薬的に許容される賦形剤および／または担体を含有することができ、経口投与用に、様々な投与形態、例えば、顆粒剤、カプセル、錠剤、散剤、およびボーラスに処方することができる。好ましい処方はカプセルである。
【００１０】
本発明のハーブエキス末は、身体の免疫系を刺激または調節することにより軽減できる疾患に対して潜在的な治療効果を有し、肝炎ならびに乳癌および白血病をはじめとする癌の予防および／または治療に使用できる。ハーブ医薬組成物は、任意の年齢および健康状態、例えば、虚弱、高齢、および衰弱した患者により安全に使用され得る。
【００１１】
本発明のさらなる態様において、前記ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳を含む栄養補助食品が提供される。好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は、１：１：１０−１：４：５０の範囲である。もう一つ別の好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は約１：２：２２である。
【００１２】
本発明のさらなる態様において、前記ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末を含む栄養補助食品が提供される。好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は１：１：１０−１：４：５０の範囲である。もう一つ別の好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比は約１：２：２２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法を提供する。この方法は（ａ）多糖類−ペプチドに富むキノコを提供し、キノコを粗末に粉砕し；（ｂ）キノコ粗末をアルカノールで抽出して、アルカノール抽出物を得、アルカノール抽出物を濾過して、アルカノール濾液を得；（ｃ）工程（ｂ）からの残留物を水性溶媒で抽出して、水性抽出物を得、水性抽出物を濾過して、水性濾液を得；（ｄ）前記濾液を合し、濃縮して、濃縮物を得；（ｅ）濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を形成することを含む。
【００１４】
本発明はさらに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法も提供する。この方法は（ａ）Ｙｕｎｚｈｉ原料を提供し、前記原料を粗末に粉砕し；（ｂ）粗末を溶媒で抽出して、液体抽出物を得；（ｃ）液体抽出物を濾過して、濾液を得；（ｄ）濾液を濃縮して、濃縮物を得；（ｅ）濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、抽出のための溶媒として、５０％水中エタノール（ｖ／ｖ）を使用する。さらに、好ましい実施形態において、エタノールまたは水抽出工程は１回より多く行われる。ある好ましい実施形態において、抽出工程は４回行われ、使用される溶媒は、第一および第二抽出については５０％エタノール、第三および第四抽出については水である。
【００１６】
本発明の方法により調製されるＹｕｎｚｈｉエキス末は高度に精製され、癌細胞の増殖の阻害においてさらに有効である。本発明の方法により調製されるＹｕｎｚｈｉエキス末は肝炎の予防および治療、ならびに白血病および乳癌をはじめとする癌細胞の増殖の阻害に有用である。
【００１７】
アルカノールは、Ｃ１−Ｃ１２アルカノール、Ｃ１−Ｃ１０アルカノール、Ｃ１−Ｃ８アルカノール、Ｃ１−Ｃ６アルカノール、Ｃ１−Ｃ４アルカノール、Ｃ１−Ｃ３アルカノール、Ｃ２−Ｃ１２アルカノール、Ｃ２−Ｃ１０アルカノール、Ｃ２−Ｃ９アルカノール、Ｃ２−Ｃ８アルカノール、Ｃ２−Ｃ７アルカノール、Ｃ２−Ｃ６アルカノール、Ｃ２−Ｃ５アルカノール、Ｃ２−Ｃ４アルカノールまたはＣ２−Ｃ３アルカノール、あるいはその混合物の範囲のアルカノールであってよい。アルカノールは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、またはＣ１２アルカノールであってよい。アルカノールはそれだけで使用できるか、または水性混合物として使用できる。例えば、９９：１から２０：８０アルカノール：水ｗｔ／ｗｔまたはｖｏｌ／ｖｏｌまたはｗｔ／ｖｏｌまたはｖｏｌ／ｗｔ混合物を使用できる。１０：９０から９０：１０（体積／体積）、２０：８０から８０：２０（体積／体積）、３０：７０から７０：３０（体積／体積）、４０：６０から６０：４０（体積／体積）または４５：５５から５５：４５（体積／体積）の範囲のアルカノール：水混合物を抽出の溶媒として使用できる。明細書および請求の範囲全体にわたって、「アルカノール」なる用語は、アルカノール単独またはアルカノール：水混合物を包含すると解釈されるべきである。
実施例
【実施例１】
【００１８】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末および処方
【００１９】
本発明のＹｕｎｚｈｉ純粋エキス末および処方は次の手順により調製される：
（１）粗末の調製
【００２０】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブＰｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ科のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｌ．であって、中国の広西省、雲南省および貴州省において集められたもの（Ｐｏｌｙｓｔｉｃｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒとも呼ばれる）を粉砕して粗末にし、これは次いで抽出物の調製に使用される。天然のＹｕｎｚｈｉが好ましいが、栽培されたＹｕｎｚｈｉを抽出に使用できる。
（２）抽出物の調製
【００２１】
Ｙｕｎｚｈｉ粗末を溶媒で繰り返し抽出する。エタノール、好ましくは５０％水中エタノール（ｖ／ｖ）が第一および第二抽出に使用され、精製水が第三および第四抽出に使用される。粗末および溶媒の好ましい重量対体積比は、第一、第二、第三および第四抽出についてそれぞれ約１：５、１：２〜３、１：２〜３および１：１〜３である。各抽出の時間は１．５〜２時間であるのが好ましい。抽出物を下記のように濾過し、濾液を合し、濃縮し、純粋な粉末にする。
（３）抽出物の濃縮
【００２２】
前記（２）において得られた濾液を真空下、約５０〜８５℃で、１．０５〜１．１２、好ましくは１．０５〜１．０８付近の最適相対密度を有する濃縮物が得られるまで蒸発させることにより濃縮する。
（４）純粋な粉末の調製
【００２３】
（３）において記載される濃縮物をさらに噴霧乾燥して、純粋な粉末を形成する。濃縮物を約６０〜７０℃の温度に予熱した後、噴霧乾燥機のキャビネット中に注入する。噴霧乾燥機キャビネットの流入温度は、最適温度に調節される。最適温度は、最終粉末生成物中の全多糖類の最高収率を得ることができる温度として定義される。流入空気の最適温度範囲は、約１５０〜２５０℃、好ましくは、２００〜２３０℃、さらに好ましくは１５０〜１７０℃である。外向温度は７０〜１００℃であるのが好ましい。最終粉末生成物中の全多糖類の最高収率を得るために好ましい温度範囲は、使用される個々の噴霧乾燥機によって様々である。乾燥粉末を次に約８０のメッシュサイズを有する篩いに通して、乾燥粉末粒子のサイズが許容される範囲内であることを保証する。
（５）製剤処方の調製
【００２４】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末を、特に製薬産業において通常の技術を有する者に周知の処方手段により錠剤、ボーラス、散剤、カプセル、および顆粒剤に加工することができる。賦形剤、バインダー、担体、フィラーを純粋な粉末に添加して、必要に応じて様々な投与形態を形成することができる。
【００２５】
次の実施例は、説明の目的のためであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。妥当なバリエーション、例えば、分別のある技術者により理解されるものを本発明の範囲から逸脱することなく調製することができる。
【実施例２】
【００２６】
Ｙｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２およびＦ２ａの調製
【００２７】
本発明の一つの実施形態に従って、Ｆ２およびＦ２ａという名のＹｕｎｚｈｉ純粋粉末を次の工程のようにして調製した。Ｆ２とＦ２ａの製造における違いは、これらがどのように乾燥されたかにある。Ｆ２は噴霧乾燥プロセスにより乾燥された。Ｆ２ａは真空乾燥プロセスにより乾燥された。
原料
【００２８】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｐｏｌｙｓｔｉｃｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒとも呼ばれる）は、Ｔｉｅｎ Ｌｉｎ Ｃｏｕｎｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃｈｉｎａから入手し、これは中国本土の広西省のＴｉｅｎ Ｌｉｎ Ｃｏｕｎｔｙに自生するＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体である。Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブは９月および１０月（秋）に集められた。Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒはＺｈａｎ Ｘｉａｏ−ｑｉｎｇ教授（菌類学の専門家、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）により確認された。植物標本（Ｎｏ．２００３−２５１０）を香港中文大学、漢方医学機関の博物館に寄託した。
【００２９】
子実体を前処理プロセスにおいて洗浄し、粉砕した。前処理から得られた、切断された物質、またはＹｕｎｚｈｉ粗末を次に５０％エタノールで抽出した。仕上げ処理された生成物の２８ｋｇ製造バッチごとに、約３５０ＫｇのＹｕｎｚｈｉ粗末および２４５０リットルの５０％エタノールを要した。前処理および抽出工程を以下に記載する：
前処理
【００３０】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブをまず調合および粉砕により前処理して、下記のようなＹｕｎｚｈｉ切断物質またはＹｕｎｚｈｉ粗末を得た。
１．調合
【００３１】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブを流水（水道水）で迅速にすすいで、沈泥および不純物を除去し、次いでステンレス鋼スチーマー中で１時間蒸して、潜在的な植物寄生体および卵を除去し、空気またはオーブン中６０℃で乾燥した。
２．粉砕
【００３２】
３６７．５ＫｇのＹｕｎｚｈｉ原料ハーブを、１２ｍｍのメッシュサイズを有するミル（Ｈａｍｍｅｒ Ｔｙｐｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ、Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．９ＦＱ３７−１８）で圧縮することにより粉砕して粉末にして、１２ｍｍより小さいか、または１２ｍｍ付近の切断された植物材料、または粗末を得た。粗末を集め、密封されたプラスチック容器中で保存した。各容器に物質の名称、バッチ番号、日付および重量を示すラベルを付け、０℃〜３０℃の温度、約６０から７５％の湿度での貯蔵用に指定された場所に置いた。
抽出
【００３３】
Ｙｕｎｚｈｉ粗末を５０％エタノールで次のように繰り返し抽出した：
１．第一抽出
【００３４】
約３５０ＫｇのＹｕｎｚｈｉ粗末をまず１７５０リットルの５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）（あるいは、５０％エタノールと称する）で抽出した。２層のガーゼでパーコレーターの底の内側を覆い、十分な量の５０％エタノールを溶媒送達孔から添加して、底部の空気を置換した。Ｙｕｎｚｈｉ粗末の約１／３を添加し、均一に分布させた。約８７５リットルの５０％エタノールを添加し、パーコレーターの内容物を押さえて平らにした。残りの２／３のＹｕｎｚｈｉ粗末を添加し、物質送達孔を閉鎖し、密封した。さらに約８７５リットルの５０％エタノールを添加した。循環ポンプを１０分間作動させ、混合物を１２時間にわたって浸漬した後、蒸気抽出を開始した。循環ポンプをパーコレーターに連結し、パーコレーターの底部の抽出物をパーコレーターの最上部へ循環させた。
【００３５】
蒸気抽出を行うために、水蒸気をパーコレーターの蒸気層中に向けた。水蒸気圧を、パーコレーターの蒸気層上に位置する手動蒸気弁により０．１〜０．２ＭＰａに調節した。循環ポンプを１０分ごとに１回、この期間中のそれぞれで１０分間作動させた。
【００３６】
水蒸気がパーコレーターの蒸気層に侵入する際、溶媒を加熱し、蒸気が上昇し、冷却し、凝結して、パーコレーターの底部に落下した。このリサイクルプロセスは溶媒還流と呼ばれる。パーコレーターの最上部に連結した蒸気リサイクル管はコンデンサーおよびクーラーと２つの別個の部分で密着し、溶媒の還流が起こる。抽出物の温度が溶媒の沸点付近（５０％エタノールの場合は７０℃付近）に上昇した場合にクーラーおよびコンデンサーのエントランスバルブを開放した。水がクーラーおよびコンデンサー中に流入した。
【００３７】
溶媒還流が起こるために必要な時間は、溶媒水蒸気圧の量および溶媒の沸点に依存した。ここで用いられる入力植物材料の量に基づいて、溶媒還流に必要な時間は、エタノール抽出については約３０分、水抽出については約１時間であった。
【００３８】
溶媒還流が開始したら、時間を記録した。溶媒還流の状態が維持され得るような温度は、混合物を沸騰させるために使用される「固定温度」である。混合物を固定温度で約２時間沸騰させ、その間、パーコレーターの内圧を蒸気弁により０．０２〜０．０５ＭＰａ付近に維持した。５０％エタノールを抽出に使用する場合、固定温度は約８０℃であり、水が使用される場合、固定温度は約９０〜９５℃であった。抽出物を循環ポンプにより、１０〜１５分ごとに１回、好ましくは１５分ごとに１回、この期間中のそれぞれで５分間分布させる。これにより、液体抽出物は周期的に循環し、ハーブ材料を完全に抽出できる。
【００３９】
抽出物を標準的操作手順に従って濾過した。実際には、抽出物はパーコレーターを出て、フィルターを通り、濾液は循環ポンプにより貯蔵容器中に入った。
２．第二抽出
【００４０】
前記第一抽出から得られた残留物を約７００リットルの５０％エタノールで、前記方法に従って第二抽出としてさらに抽出した。第二抽出から得られた濾液を第一抽出のものと合した。
３．第三および第四抽出
【００４１】
第二抽出から得られた残留物をさらに２回、それぞれ７００リットルおよび３００リットルの精製水で第三および第四抽出として抽出した。水抽出は、循環下での抽出の時間が第三および第四抽出についてそれぞれ２時間および１．５時間である以外は前記方法に従って循環しながら行った。
濃縮
【００４２】
前記抽出から得られた濾液を合し、次いでエタノール回収および濃縮プロセスを行った。
１．エタノール回収
【００４３】
エタノールを濾液から約−０．０７Ｍｐａの真空、約０．０３５Ｍｐａの蒸気圧で回収した。回収されたエタノールの濃度が４０％より低い場合に回収プロセスを停止した。
２．濃縮
【００４４】
エタノール回収後、液体抽出物を、同時に濃縮する（３つのチャンバーが同時に運転する）ための標準的操作手順に従って３つの連続して連結された真空コンセントレーターからなるトリプルコンセントレーターに移した。濃縮中、コンセントレーター中の抽出物を加熱するために使用される蒸気の圧力は０．１〜０．２Ｍｐａに維持され、第一チャンバーは−０．０３〜−０．０４Ｍｐａの真空、８０〜８５℃であり、第二チャンバーは−０．０５〜０．０６Ｍｐａおよび６５〜７０℃；第三チャンバーは−０．０７〜０．０８Ｍｐａおよび５０〜５５℃であった。第一および第二チャンバー中の抽出物の体積が減少した後、濃縮物を第三チャンバーに移して、濃縮プロセスを続行した。第三チャンバー中の濃縮物の相対密度が約１．０５〜１．１２（６０±５℃で測定）、好ましくは約１．０５〜１．０８に達したら、濃縮プロセスを中断し、濃縮物を後に使用するために集めた。
Ｆ２を製造するための噴霧乾燥
【００４５】
濃縮物を約６５℃の温度まで加熱し、噴霧乾燥機のキャビネット中に遠心噴霧により注入した（デキストリンは添加しなかった）。キャビネットの入口および出口空気の温度をそれぞれ２１５℃付近および９０℃付近に調節した。入口空気の温度は最終粉末製品中の全多糖類の収率および最終粉末製品の外観に影響を及ぼした。１６０℃および２００℃および２４０℃の流入温度で、最終Ｙｕｎｚｈｉ粉末製品中の全多糖類の収率は、それぞれ２０．６％、１６．３％および１２．１％であった。Ｙｕｎｚｈｉ粉末は若干苦味を有していた。粉末は流入空気温度が１６０℃または２００℃で暗褐色であり、２４０℃で褐色であった。
【００４６】
濃縮物はキャビネット中で乾燥粉末になった。８０メッシュ篩いを有するミルに粉末を通した。微粉末Ｆ２を集めた。
外装
粉末（Ｆ２）をアルミ箔バッグ中に真空包装機により梱包し、密封した（３Ｋｇ／バッグ）。各バッグをアルミ箔の第二層で包装し、各バッチからの製品が全ての試験に適合することが証明された後に適切に標識した。バッグを次にバレル中に入れ、冷・乾燥条件下で保存した。
Ｆ２ａを製造するための真空乾燥
Ｆ２ａを製造するために、濃縮物をデキストリンとミキサー中２５分間混合した。混合物を次に真空乾燥機の清浄化されたトレイ上に置き、混合物を７０℃、＜−０．０８Ｍｐａで乾燥した。混合物の水分量が６％以下である場合に乾燥プロセスを停止した。混合物を粉砕し、８０メッシュ篩を有するミルに通した。最終粉末（Ｆ２ａ）を集めた。結果として得られたＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａの主成分は多糖類およびトリテルペノイドであることが見出された。
【実施例３】
【００４７】
高性能液体クロマトグラフィー研究
【００４８】
本発明は、異なる乾燥法により調製されるＹｕｎｚｈｉ粉末を特徴づけるために高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用する。
【００４９】
Ｆ２およびＦ２ａの違いは、分子サイズの差に従って化学成分を分離する高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用いた化学プロファイリングにより検出された。ＨＰＬＣ法および試験結果を以下に記載する：
１．材料および方法
１．１ＨＰＬＣ分析のサンプル調製
【００５０】
粉末形態におけるＦ２またはＦ２ａ（８４ｍｇ）を１ｍｌの滅菌二重蒸留および脱イオン水中に、丸底ポリプロピレンマイクロチューブ中１００ｒｐｍで振盪しながら別々に１２時間にわたって溶解させた。それぞれの溶液を０．４５μｍナイロンａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ、カタログ番号４４８４）を通して濾過し、４℃で貯蔵した。
１，２
分子サイズ標準
【００５１】
分子量１０１０のデキストラン（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｃｈｗｅｉｚ、カタログ番号３１４１６）および８０９００のデキストラン（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｃｈｗｅｉｚ、カタログ番号３１４２１）の混合物（それぞれ５０ｍｇ／ｍｌ）を含有する分子サイズ標準を、ＨＰＬＣシステムの性能における一貫性を検証するためのサイズマーカーとして使用した。
１．３ ＨＰＬＣシステム
【００５２】
全ＨＰＬＣシステムおよび全てのその機械的部品は、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡから購入した。使用した装置は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ ２４１０ 屈折率検出器（Ｒ．Ｉ．）、Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（サンプルをＵＶ ２６５ｎｍで分析）を包含する。カラムは次のように順次連結した：１．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（カタログ番号１１５６５）；２．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １０００（カタログ番号ＷＡＴ０１１５３５）；３．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ５００（カタログ番号ＷＡＴ０１１５３０）；および４．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０（カタログ番号ＷＡＴ０１１５２５）。ウルトラヒドロゲルガードカラムは内径６．０ｍｍ、長さ４０ｍｍであった。ウルトラヒドロゲル分析カラムは全て、内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍであった。
１．４ ＨＰＬＣ運転条件
【００５３】
サイズ標準の各運転後の洗浄：ＤＤＩで０．３／分で１２０分。
サンプル−標準運転順序：デキストラン標準混合物を開始時、最中、およびサンプル後に１回運転した。
１．５ Ｆ２およびＦ２ａの化学フィンガープリントの分析
【００５４】
いずれかの検出法（Ｒ．Ｉ．またはＵＶ ２６５ｎｍ）を用いて異なるサンプルバッチから得られるクロマトグラムを並べ、比較した。Ｒ．Ｉ検出を用いてデキストラン標準混合物の異なるバッチから得られるクロマトグラムも並べて、実験間の変動を検証するために比較した。
２．結果
【００５５】
Ｆ２ａおよびＦ２サンプルのＨＰＬＣベースの分析により、図１において示されるように、ＵＶ２６５ｎｍ検出を用いて７より多い独立したピークが生じた。２つのサンプルのクロマトグラムは、３つのピーク（Ａ、Ｂ、およびＣ）の強度の違いを除いては類似していた。ピークＢ強度における差は、このピークの同じサンプル中の他のピークに対する相対強度がＦ２ａとＦ２間で異なるので、顕著である。示差Ｒ．Ｉ．での検出により、２つのサンプル間で非常に類似したパターンが得られ、従って、図２において示されるように、これらの間の差に適さない。試験は、デキストラン標準混合物間のクロマトグラムを並べることにより検証され、図３において示されるように、性能において有意な差は検出されなかった。
【実施例４】
【００５６】
薬理学的研究
【００５７】
次の薬理学的研究は、Ｆ２由来のＹｕｎｚｈｉが白血病および乳癌細胞系においてインビトロ増殖防止活性を示すことを証明した。Ｆ２はＹｕｎｚｈｉ純粋抽出よりも、正常なヒト細胞系ではなく、癌細胞に対するその選択的細胞毒性に関して良好であった。このような処方は白血病または乳癌の患者を治療するために潜在的に有用であり得る。
【００５８】
処方Ｆ２およびＦ２ａ由来のＹｕｎｚｈｉはどちらも白血病および乳癌細胞において有効性を示したが、Ｆ２はＭＴＴ分析により決定されるように、腫瘍細胞系について５０％成長阻害（ＩＣ５０）をもたらすために必要な濃度に関してＦ２ａよりも優れているようである。ヒト癌細胞系に関する両方の場合においてＹｕｎｚｈｉ純水抽出物についてのＩＣ５０値はＦ２よりも小さいが、抽出物はまた正常なヒト細胞系に関して非常に高い細胞毒性および低いＩＣ５０値を示した。従って、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物はＦ２が示すような選択的細胞毒性を示さなかったが、Ｆ２は選択された癌細胞系に対して顕著な細胞毒性を示したが、正常な細胞系には示さなかった。従って、本発明者らは、Ｆ２がＹｕｎｚｈｉ純水抽出物よりも良好な抗癌剤候補であると結論づけた。
【実施例５】
【００５９】
Ｆ２およびＦ２ａを調べるための細胞培養およびＭＴＴ分析のプロトコル
【００６０】
細胞培養の前に、Ｆ２、Ｆ２ａおよびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物を素ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）中に、それぞれ３．０ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌおよび１．１５ｍｇ／ｍｌ（溶解度の程度が異なるため）のストック溶液として、４８時間室温で、連続して振盪しながら溶解させた。不溶性物質を遠心分離により除去し、０．２２μｍフィルターを用いて可溶性上清を滅菌し、さらに素培地で希釈した。Ｆ２およびＦ２ａについて、希釈後の濃度範囲は２５〜１６００μｇ／ｍｌ（２ｘ最終濃度）であり、一方、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物について 濃度は１１４２．８６ｕｇ／ｍｌ（最終８００μｇ／ｍｌ用量）および２５−８００μｇ／ｍｌ（２ｘ最終濃度）の範囲であった。
【００６１】
ヒト急性前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）、乳癌（ＭＣＦ−７）および正常肝臓（ＷＲＬ−６８）細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。細胞系を増殖させ、加湿インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中に維持した。２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）で補足されたＲＰＭＩ培地１６４０をＨＬ−６０の細胞培養に使用した。１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足されたＲＰＭＩ培地をＭＣＦ−７およびＷＲＬ−６８細胞の培地として使用した。
【００６２】
培養フラスコから収穫された後、血球計を使用いて細胞を計数し、細胞生存をトリパンブルー排除により決定した。Ｆ２およびＦ２ａに関する分析について、対数期培養物からの１０４個のＨＬ−６０細胞を９６ウェル平底Ｃｏｓｔａｒ培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）のウェルあたり４０％ＦＢＳで補足された１００μｌのＲＰＭＩ培地中にシードし；ＭＣＦ−７細胞について、５０００細胞を、２０％ＦＢＳで補足された１００μｌのＲＰＭＩ培地中にウェルごとにシードした。１００マイクロリットルの、最終濃度の２倍のＦ２またはＦ２ａを素培地中に含有する溶液をウェルあたり添加した。対照ウェルを１００μｌの素培地単独とともに添加した。最終濃度２０μｇ／ｍｌの化学療法抗腫瘍剤マイトマイシンＣ（ＭＭＣ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を正の対照として添加した。Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物に関する分析について、１０４細胞のＨＬ−６０細胞系をウェルあたり６６．７％ＦＢＳで補足された６０μｌのＲＰＭＩ培地中にシードし；一方、５０００細胞のＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８細胞系のいずれかをウェルあたり３３．３％ＦＢＳで補足された６０μｌのＲＰＭＩ培地中にシードした。８００μｇ／ｍｌの用量で、１４０μｌの希釈された抽出物を素培地中１１４２．８６ｕｇ／ｍｌの用量でウェルあたり添加した。１２．５〜４００μｇ／ｍｌの用量について、１００μｌの、素培地中最終濃度の２倍を含有する希釈された抽出物をウェルあたり添加した。対照ウェルを１４０μｌの素培地単独とともに添加した。細胞を次いで薬剤とともに４８時間（ＭＣＦ−７）または７２時間（ＨＬ−６０）インキュベートした。ＭＴＴ分析を用いて処理された細胞の増殖反応を決定した。
ＭＴＴ細胞毒性分析
【００６３】
ＭＴＴ分析は、ミトコンドリア脱水酵素によるＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ］のブルーホルマゾン生成物への還元を検出し、これはミトコンドリアの正常な機能、従って生存可能な細胞を反映する。細胞のＦ２、Ｆ２ａまたはＹｕｎｚｈｉ純水抽出物との４８時間（ＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８）または７２時間（ＨＬ−６０）のインキュベーション後、３０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴのリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）中溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを次に遠心分離し、続いて上清を除去した。１００マイクロリットルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を次に各ウェルに添加した。３７℃で５分間インキュベーション後、溶解した溶液の吸光度を分光光度測定により５４０ｎｍでＢｅｎｃｈｍａｒｋ マイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により検出した。未処理細胞の吸光度を１００％とみなした。結果をＭＴＴ吸光度の平均％（Ｙｕｎｚｈｉエキス末−処理されたものにおける吸収の対照ウェルの吸光度に対する比＊１００％）±それぞれ６ウェルに関する３つの独立した実験の標準偏差として表した。処理および未処理対照（１００％）ウェル間の差をスチューデント不対Ｔテストにより試験した。
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）および乳癌（ＭＣＦ−７）に対するＦ２およびＦ２ａのインビトロ抗腫瘍活性の比較についてのＭＴＴ分析結果
【００６４】
図４および５は、Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方、Ｆ２およびＦ２ａがどちらも、それぞれヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）および乳癌（ＭＣＦ−７）に対してインビトロ抗増殖効果を有していたことを示す。Ｙｕｎｚｈｉエキス末の濃度を増大させつつ（１２．５〜８００μｇ／ｍｌで２倍の増加）細胞を培地中４８時間（ＭＣＦ−７細胞）または７２時間（ＨＬ−６０細胞）インキュベートし、増殖応答をＭＴＴ分析により評価した。両Ｙｕｎｚｈｉエキス末、Ｆ２およびＦ２ａは、ＭＣＦ−７細胞（５０から８００μｇ／ｍｌ）およびＨＬ−６０細胞（１００〜８００μｇ／ｍｌ）の増殖を用量に依存した方法で有意に阻害できた。
【００６５】
これらの薬理学的研究は、Ｆ２が低いＩＣ５０値を有し、従って、Ｆ２ａよりも活性であることを証明した。従って、本発明のＹｕｎｚｈｉ由来の処方は他のプロセスにより製造されたものよりも良好な処方であることが証明された。
【表１】
「＊」はデータが有意であることを示す。
【００６６】
図６、７および８は、Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物の、それぞれ、ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）、乳癌（ＭＣＦ−７）および正常肝臓細胞（ＷＲＬ−６８）に対するインビトロ増殖防止効果の結果を示す。細胞を培地中Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方の濃度を増加させつつ（１２．５〜８００μｇ／ｍｌ、２倍の増加）、４８時間（ＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８細胞）または７２時間（ＨＬ−６０細胞）インキュベートし、増殖応答をＭＴＴ分析により評価した。Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物はどちらもＭＣＦ−７細胞（５０から８００μｇ／ｍｌ）およびＨＬ−６０細胞（１００〜８００μｇ／ｍｌ）の増殖を用量に依存した方法で有意に阻害することができた。しかしながら、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物のみがＷＲＬ−６８細胞の増殖の顕著な阻害を示し（１００から８００μｇ／ｍｌ）、一方、Ｆ２は試験された濃度範囲（１２．５から８００μｇ／ｍｌ）全体にわたって有意な阻害を示さなかった。
【００６７】
表２は試験された細胞系に関するＹｕｎｚｈｉ由来の処方Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物のＩＣ５０値を示す。ＭＣＦ−７細胞の増殖は、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、５０μｇ／ｍｌから出発して、それぞれ２３５．４５±４１．２３μｇ／ｍｌおよび５９．３９±５．９２μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。ＨＬ−６０細胞の増殖は、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、１００μｇ／ｍｌから出発して、それぞれ、１５０．６２±５．６５μｇ／ｍｌおよび１４．８５±１．１８μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。ＷＲＬ−６８細胞の増殖は、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、１００μｇ／ｍｌから出発して、１２７．９１±１７．８５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。１２．５から８００μｇ／ｍｌの試験された濃度範囲全体にわたって、Ｆ２によるＷＲＬ−６８細胞の増殖の有意な阻害は無かった。
【００６８】
結果は、明らかに、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物のＩＣ５０値はヒト癌細胞系ＨＬ−６０およびＭＣＦ−７の両方の場合においてＦ２よりも小さいが、抽出物は正常ヒト細胞系ＷＲＬ−６８に関して非常に高い細胞毒性および小さなＩＣ５０値を示すことを示した。従って、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物はＦ２が有するような選択的細胞毒性を有さず、Ｆ２は選択された癌細胞系に対しては有意な細胞毒性を示すが、正常な細胞系に対しては示さなかった。これらの薬理学的研究は、本発明がＹｕｎｚｈｉ純水抽出物よりも良好な抗癌剤であることが証明されたことを示した。
【表２】
「＊」はデータが有意であることを示す。
【００６９】
本発明はさらに、Ｙｕｎｚｈｉ抽出物を組み入れた２種の処方も提供する。２つの処方およびその調製法の実施形態を以下に記載する。
【実施例６】
【００７０】
Ｙｕｎｚｈｉ粉乳
【００７１】
処方：
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末：４０ｋｇ
マルトデキストリン：８０ｋｇ
粉乳：８８０ｋｇ
Ｉ．Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末の調製
（１）Ｙｕｎｚｈｉ生薬の前処理
【００７２】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブを洗浄し、清浄化して、不純物、例えば、チリまたは砂を除去し、乾燥し、粉砕して、さらに使用するために粗末にした。
（２）第一抽出
【００７３】
５００ｋｇのＹｕｎｚｈｉ粗末を５倍の５０％エタノールで１２時間にわたって浸漬した後、標準的手順に従って抽出した。溶媒を若干沸騰する状況まで加熱し、高温で２時間還流させ（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第一残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（３）第二抽出
【００７４】
第一残留物を３倍の５０％エタノール中に浸漬し、若干沸騰する状況まで加熱し、高温で２時間還流し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第二残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（４）第三抽出
【００７５】
第二残留物を３倍の水中に浸漬し、若干沸騰した状態まで加熱し、高温で２時間加熱し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第三残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（５）第四抽出
【００７６】
第三残留物を３倍の水中に浸漬し、若干沸騰した状態まで加熱し、高温で２時間加熱し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第三残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。第四残留物を廃棄した。
（６）濃縮
【００７７】
前記工程において得られた濾液を合し、１．０５〜１．０８（６５℃±５℃）の相対密度まで標準的手順に従って濃縮した。濃縮物を集め、さらに使用するために（水分量および微生物に関して）試験した。
（７）乾燥
【００７８】
透明ペーストを入口温度１２０℃〜１３０℃、出口温度５０℃±２０℃で標準的手順に従って噴霧乾燥した。後に使用するために１２０メッシュを有する篩いに通すことにより乾燥粉末（Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末）を集めた。
ＩＩ．マルトデキストリンおよび粉乳との混合
（８）乾燥、混合および造粒
【００７９】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末（４０ｋｇ）およびマルトデキストリン（８０ｋｇ）を接着剤として少量の９０％エタノールとよく混合してＹｕｎｚｈｉ純粋粉末をマルトデキストリンと十分に混合した。１２０ｋｇ、２４０ｋｇ、５２０ｋｇの粉乳を連続して添加し、Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末およびマルトデキストリンと十分に混合した。好適な量の９５％エタノールを軟質ペーストにする際に接着剤として添加した。軟質ペーストを高性能湿式造粒機または振り子様造粒機（１６メッシュ篩いを使用）により造粒した。湿潤顆粒を真空乾燥チャンバー中に入れ、０．０８〜−０．０９Ｍｐａ、６０℃±５℃で乾燥させた。乾燥した顆粒をさらに使用するために集めた（ 水分量≦６．０％）。
（９）包装
【００８０】
乾燥した顆粒を４０メッシュで篩別した。メッシュを通過した顆粒を集め、包装した。各包装物は４ｋｇの重量であった。
（１０）貯蔵
【００８１】
湿分を防ぐために生成物パックを密封する。
【実施例７】
【００８２】
Ｙｕｎｚｈｉ豆乳粉末
【００８３】
Ｙｕｎｚｈｉ豆乳粉末は、処方中の８８０ｋｇの粉乳を８８０ｋｇの豆乳粉末と置換し、乾燥顆粒を４０メッシュではなく２０メッシュで篩別する以外は実施例６において示されたＹｕｎｚｈｉ粉乳の類似した製造法により製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ＵＶ２６５ｎｍでのＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａおよびＦ２のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８５】
【図２】屈折率（Ｒ．Ｉ．）により検出されるＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａおよびＦ２のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８６】
【図３】屈折率（Ｒ．Ｉ．）により検出されるスタッキングクロマトグラムにおけるデキストラン標準のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８７】
【図４】様々な濃度で７２時間ＨＬ−６０細胞に対するＦ２およびＦ２ａの増殖防止効果を示す（ｎ＝６ウェル、三重複実験）。
【００８８】
【図５】様々な濃度で４８時間ＭＣＦ−７細胞に対するＦ２およびＦ２ａの増殖防止効果を示す（ｎ＝６ウェル、三重複実験）。
【００８９】
【図６】ＨＬ−６０におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【００９０】
【図７】ＭＣＦ−７におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【００９１】
【図８】ＷＲＬ−６８におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および肝炎の予防または補助療法または治療のためのＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含有するハーブエキス末に関する。本発明はさらに、Ｙｕｎｚｈｉを包含する多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製し、使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｙｕｎｚｈｉ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒまたはキクラゲともいう）はキノコ属のＰｏｌｙｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ、およびＢａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅ目に属する食用菌である。これは薬効のあるキノコと考えられ、漢方において使用される。
【０００３】
Ｙｕｎｚｈｉは、免疫機能を向上させ、免疫細胞の量を増大させ、腫瘍細胞を飲み込んで、殺し、白血球数を増大させることが証明されている活性成分多糖類を含有する。これは、慢性、持続性および活性肝炎、Ｂ型肝炎を治療するためにも使用され、一般的な有効率は８２．４％である。慢性気管支炎の治療におけるその有効率は８５％に達する。老化防止および健康維持機能があるので、これはフリーラジカルを除去し、薬物効果を刺激し、腎臓を活性化し、肝臓を増強することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫系機能の促進におけるＹｕｎｚｈｉの有効性が１９４３年に見出されてから、Ｙｕｎｚｈｉ多糖類の供給に対する要求が存在する。Ｙｕｎｚｈｉ抽出物の全てが多糖類含量の点で同じであるわけではないことを理解することは重要である。より有効で、高純度のＹｕｎｚｈｉエキス末を含有するＹｕｎｚｈｉ処方を調製するためのさらに良好な方法を提供することが本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法に関する。この方法は、多糖類−ペプチドに富むキノコを提供し、キノコを粉砕し、アルカノールおよび水性溶媒により抽出し、抽出物を濾過し、濃縮し、濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を得ることを含む。アルカノールは、エタノールまたはエタノール：水混合物であってよい。水性溶媒は水であってよい。
【０００６】
本発明はさらに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法にも関する。この方法は、Ｙｕｎｚｈｉ原料を提供し、前記原料を粉砕し、溶媒により抽出し、抽出物を濾過し、濃縮し、濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む。
【０００７】
好ましい実施形態において、本発明の方法は４回（５０％エタノールで２回、水で２回）抽出することにより行われる。もう一つ別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ハーブ材料および溶媒の重量対体積比が好ましくは、それぞれ、第１および第二抽出については約１：５、１：２〜３、第三および第四抽出については１：２〜３および１：１〜３である条件下で行われる。
【０００８】
もう一つ別の態様において、本発明は、本発明の方法により調製されるＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含有するハーブエキス末に関する。一つの実施形態において、本発明のハーブエキス末は、下記の化学プロファイリングを特徴とする。本発明のハーブエキス末は、他の旧来の方法により調製されたものよりも、癌細胞の増殖防止においてより有効であるＹｕｎｚｈｉ粉末を含有する。
【０００９】
本発明のハーブエキス末はさらに、医薬的に許容される賦形剤および／または担体を含有することができ、経口投与用に、様々な投与形態、例えば、顆粒剤、カプセル、錠剤、散剤、およびボーラスに処方することができる。好ましい処方はカプセルである。
【００１０】
本発明のハーブエキス末は、身体の免疫系を刺激または調節することにより軽減できる疾患に対して潜在的な治療効果を有し、肝炎ならびに乳癌および白血病をはじめとする癌の予防および／または治療に使用できる。ハーブ医薬組成物は、任意の年齢および健康状態、例えば、虚弱、高齢、および衰弱した患者により安全に使用され得る。
【００１１】
本発明のさらなる態様において、前記ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳を含む栄養補助食品が提供される。好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は、１：１：１０−１：４：５０の範囲である。もう一つ別の好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は約１：２：２２である。
【００１２】
本発明のさらなる態様において、前記ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末を含む栄養補助食品が提供される。好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比は１：１：１０−１：４：５０の範囲である。もう一つ別の好ましい実施形態において、ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比は約１：２：２２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法を提供する。この方法は（ａ）多糖類−ペプチドに富むキノコを提供し、キノコを粗末に粉砕し；（ｂ）キノコ粗末をアルカノールで抽出して、アルカノール抽出物を得、アルカノール抽出物を濾過して、アルカノール濾液を得；（ｃ）工程（ｂ）からの残留物を水性溶媒で抽出して、水性抽出物を得、水性抽出物を濾過して、水性濾液を得；（ｄ）前記濾液を合し、濃縮して、濃縮物を得；（ｅ）濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を形成することを含む。
【００１４】
本発明はさらに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法も提供する。この方法は（ａ）Ｙｕｎｚｈｉ原料を提供し、前記原料を粗末に粉砕し；（ｂ）粗末を溶媒で抽出して、液体抽出物を得；（ｃ）液体抽出物を濾過して、濾液を得；（ｄ）濾液を濃縮して、濃縮物を得；（ｅ）濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、抽出のための溶媒として、５０％水中エタノール（ｖ／ｖ）を使用する。さらに、好ましい実施形態において、エタノールまたは水抽出工程は１回より多く行われる。ある好ましい実施形態において、抽出工程は４回行われ、使用される溶媒は、第一および第二抽出については５０％エタノール、第三および第四抽出については水である。
【００１６】
本発明の方法により調製されるＹｕｎｚｈｉエキス末は高度に精製され、癌細胞の増殖の阻害においてさらに有効である。本発明の方法により調製されるＹｕｎｚｈｉエキス末は肝炎の予防および治療、ならびに白血病および乳癌をはじめとする癌細胞の増殖の阻害に有用である。
【００１７】
アルカノールは、Ｃ１−Ｃ１２アルカノール、Ｃ１−Ｃ１０アルカノール、Ｃ１−Ｃ８アルカノール、Ｃ１−Ｃ６アルカノール、Ｃ１−Ｃ４アルカノール、Ｃ１−Ｃ３アルカノール、Ｃ２−Ｃ１２アルカノール、Ｃ２−Ｃ１０アルカノール、Ｃ２−Ｃ９アルカノール、Ｃ２−Ｃ８アルカノール、Ｃ２−Ｃ７アルカノール、Ｃ２−Ｃ６アルカノール、Ｃ２−Ｃ５アルカノール、Ｃ２−Ｃ４アルカノールまたはＣ２−Ｃ３アルカノール、あるいはその混合物の範囲のアルカノールであってよい。アルカノールは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、またはＣ１２アルカノールであってよい。アルカノールはそれだけで使用できるか、または水性混合物として使用できる。例えば、９９：１から２０：８０アルカノール：水ｗｔ／ｗｔまたはｖｏｌ／ｖｏｌまたはｗｔ／ｖｏｌまたはｖｏｌ／ｗｔ混合物を使用できる。１０：９０から９０：１０（体積／体積）、２０：８０から８０：２０（体積／体積）、３０：７０から７０：３０（体積／体積）、４０：６０から６０：４０（体積／体積）または４５：５５から５５：４５（体積／体積）の範囲のアルカノール：水混合物を抽出の溶媒として使用できる。明細書および請求の範囲全体にわたって、「アルカノール」なる用語は、アルカノール単独またはアルカノール：水混合物を包含すると解釈されるべきである。
実施例
【実施例１】
【００１８】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末および処方
【００１９】
本発明のＹｕｎｚｈｉ純粋エキス末および処方は次の手順により調製される：
（１）粗末の調製
【００２０】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブＰｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ科のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｌ．であって、中国の広西省、雲南省および貴州省において集められたもの（Ｐｏｌｙｓｔｉｃｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒとも呼ばれる）を粉砕して粗末にし、これは次いで抽出物の調製に使用される。天然のＹｕｎｚｈｉが好ましいが、栽培されたＹｕｎｚｈｉを抽出に使用できる。
（２）抽出物の調製
【００２１】
Ｙｕｎｚｈｉ粗末を溶媒で繰り返し抽出する。エタノール、好ましくは５０％水中エタノール（ｖ／ｖ）が第一および第二抽出に使用され、精製水が第三および第四抽出に使用される。粗末および溶媒の好ましい重量対体積比は、第一、第二、第三および第四抽出についてそれぞれ約１：５、１：２〜３、１：２〜３および１：１〜３である。各抽出の時間は１．５〜２時間であるのが好ましい。抽出物を下記のように濾過し、濾液を合し、濃縮し、純粋な粉末にする。
（３）抽出物の濃縮
【００２２】
前記（２）において得られた濾液を真空下、約５０〜８５℃で、１．０５〜１．１２、好ましくは１．０５〜１．０８付近の最適相対密度を有する濃縮物が得られるまで蒸発させることにより濃縮する。
（４）純粋な粉末の調製
【００２３】
（３）において記載される濃縮物をさらに噴霧乾燥して、純粋な粉末を形成する。濃縮物を約６０〜７０℃の温度に予熱した後、噴霧乾燥機のキャビネット中に注入する。噴霧乾燥機キャビネットの流入温度は、最適温度に調節される。最適温度は、最終粉末生成物中の全多糖類の最高収率を得ることができる温度として定義される。流入空気の最適温度範囲は、約１５０〜２５０℃、好ましくは、２００〜２３０℃、さらに好ましくは１５０〜１７０℃である。外向温度は７０〜１００℃であるのが好ましい。最終粉末生成物中の全多糖類の最高収率を得るために好ましい温度範囲は、使用される個々の噴霧乾燥機によって様々である。乾燥粉末を次に約８０のメッシュサイズを有する篩いに通して、乾燥粉末粒子のサイズが許容される範囲内であることを保証する。
（５）製剤処方の調製
【００２４】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末を、特に製薬産業において通常の技術を有する者に周知の処方手段により錠剤、ボーラス、散剤、カプセル、および顆粒剤に加工することができる。賦形剤、バインダー、担体、フィラーを純粋な粉末に添加して、必要に応じて様々な投与形態を形成することができる。
【００２５】
次の実施例は、説明の目的のためであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。妥当なバリエーション、例えば、分別のある技術者により理解されるものを本発明の範囲から逸脱することなく調製することができる。
【実施例２】
【００２６】
Ｙｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２およびＦ２ａの調製
【００２７】
本発明の一つの実施形態に従って、Ｆ２およびＦ２ａという名のＹｕｎｚｈｉ純粋粉末を次の工程のようにして調製した。Ｆ２とＦ２ａの製造における違いは、これらがどのように乾燥されたかにある。Ｆ２は噴霧乾燥プロセスにより乾燥された。Ｆ２ａは真空乾燥プロセスにより乾燥された。
原料
【００２８】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｐｏｌｙｓｔｉｃｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒとも呼ばれる）は、Ｔｉｅｎ Ｌｉｎ Ｃｏｕｎｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃｈｉｎａから入手し、これは中国本土の広西省のＴｉｅｎ Ｌｉｎ Ｃｏｕｎｔｙに自生するＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体である。Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブは９月および１０月（秋）に集められた。Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒはＺｈａｎ Ｘｉａｏ−ｑｉｎｇ教授（菌類学の専門家、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）により確認された。植物標本（Ｎｏ．２００３−２５１０）を香港中文大学、漢方医学機関の博物館に寄託した。
【００２９】
子実体を前処理プロセスにおいて洗浄し、粉砕した。前処理から得られた、切断された物質、またはＹｕｎｚｈｉ粗末を次に５０％エタノールで抽出した。仕上げ処理された生成物の２８ｋｇ製造バッチごとに、約３５０ＫｇのＹｕｎｚｈｉ粗末および２４５０リットルの５０％エタノールを要した。前処理および抽出工程を以下に記載する：
前処理
【００３０】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブをまず調合および粉砕により前処理して、下記のようなＹｕｎｚｈｉ切断物質またはＹｕｎｚｈｉ粗末を得た。
１．調合
【００３１】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブを流水（水道水）で迅速にすすいで、沈泥および不純物を除去し、次いでステンレス鋼スチーマー中で１時間蒸して、潜在的な植物寄生体および卵を除去し、空気またはオーブン中６０℃で乾燥した。
２．粉砕
【００３２】
３６７．５ＫｇのＹｕｎｚｈｉ原料ハーブを、１２ｍｍのメッシュサイズを有するミル（Ｈａｍｍｅｒ Ｔｙｐｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ、Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．９ＦＱ３７−１８）で圧縮することにより粉砕して粉末にして、１２ｍｍより小さいか、または１２ｍｍ付近の切断された植物材料、または粗末を得た。粗末を集め、密封されたプラスチック容器中で保存した。各容器に物質の名称、バッチ番号、日付および重量を示すラベルを付け、０℃〜３０℃の温度、約６０から７５％の湿度での貯蔵用に指定された場所に置いた。
抽出
【００３３】
Ｙｕｎｚｈｉ粗末を５０％エタノールで次のように繰り返し抽出した：
１．第一抽出
【００３４】
約３５０ＫｇのＹｕｎｚｈｉ粗末をまず１７５０リットルの５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）（あるいは、５０％エタノールと称する）で抽出した。２層のガーゼでパーコレーターの底の内側を覆い、十分な量の５０％エタノールを溶媒送達孔から添加して、底部の空気を置換した。Ｙｕｎｚｈｉ粗末の約１／３を添加し、均一に分布させた。約８７５リットルの５０％エタノールを添加し、パーコレーターの内容物を押さえて平らにした。残りの２／３のＹｕｎｚｈｉ粗末を添加し、物質送達孔を閉鎖し、密封した。さらに約８７５リットルの５０％エタノールを添加した。循環ポンプを１０分間作動させ、混合物を１２時間にわたって浸漬した後、蒸気抽出を開始した。循環ポンプをパーコレーターに連結し、パーコレーターの底部の抽出物をパーコレーターの最上部へ循環させた。
【００３５】
蒸気抽出を行うために、水蒸気をパーコレーターの蒸気層中に向けた。水蒸気圧を、パーコレーターの蒸気層上に位置する手動蒸気弁により０．１〜０．２ＭＰａに調節した。循環ポンプを１０分ごとに１回、この期間中のそれぞれで１０分間作動させた。
【００３６】
水蒸気がパーコレーターの蒸気層に侵入する際、溶媒を加熱し、蒸気が上昇し、冷却し、凝結して、パーコレーターの底部に落下した。このリサイクルプロセスは溶媒還流と呼ばれる。パーコレーターの最上部に連結した蒸気リサイクル管はコンデンサーおよびクーラーと２つの別個の部分で密着し、溶媒の還流が起こる。抽出物の温度が溶媒の沸点付近（５０％エタノールの場合は７０℃付近）に上昇した場合にクーラーおよびコンデンサーのエントランスバルブを開放した。水がクーラーおよびコンデンサー中に流入した。
【００３７】
溶媒還流が起こるために必要な時間は、溶媒水蒸気圧の量および溶媒の沸点に依存した。ここで用いられる入力植物材料の量に基づいて、溶媒還流に必要な時間は、エタノール抽出については約３０分、水抽出については約１時間であった。
【００３８】
溶媒還流が開始したら、時間を記録した。溶媒還流の状態が維持され得るような温度は、混合物を沸騰させるために使用される「固定温度」である。混合物を固定温度で約２時間沸騰させ、その間、パーコレーターの内圧を蒸気弁により０．０２〜０．０５ＭＰａ付近に維持した。５０％エタノールを抽出に使用する場合、固定温度は約８０℃であり、水が使用される場合、固定温度は約９０〜９５℃であった。抽出物を循環ポンプにより、１０〜１５分ごとに１回、好ましくは１５分ごとに１回、この期間中のそれぞれで５分間分布させる。これにより、液体抽出物は周期的に循環し、ハーブ材料を完全に抽出できる。
【００３９】
抽出物を標準的操作手順に従って濾過した。実際には、抽出物はパーコレーターを出て、フィルターを通り、濾液は循環ポンプにより貯蔵容器中に入った。
２．第二抽出
【００４０】
前記第一抽出から得られた残留物を約７００リットルの５０％エタノールで、前記方法に従って第二抽出としてさらに抽出した。第二抽出から得られた濾液を第一抽出のものと合した。
３．第三および第四抽出
【００４１】
第二抽出から得られた残留物をさらに２回、それぞれ７００リットルおよび３００リットルの精製水で第三および第四抽出として抽出した。水抽出は、循環下での抽出の時間が第三および第四抽出についてそれぞれ２時間および１．５時間である以外は前記方法に従って循環しながら行った。
濃縮
【００４２】
前記抽出から得られた濾液を合し、次いでエタノール回収および濃縮プロセスを行った。
１．エタノール回収
【００４３】
エタノールを濾液から約−０．０７Ｍｐａの真空、約０．０３５Ｍｐａの蒸気圧で回収した。回収されたエタノールの濃度が４０％より低い場合に回収プロセスを停止した。
２．濃縮
【００４４】
エタノール回収後、液体抽出物を、同時に濃縮する（３つのチャンバーが同時に運転する）ための標準的操作手順に従って３つの連続して連結された真空コンセントレーターからなるトリプルコンセントレーターに移した。濃縮中、コンセントレーター中の抽出物を加熱するために使用される蒸気の圧力は０．１〜０．２Ｍｐａに維持され、第一チャンバーは−０．０３〜−０．０４Ｍｐａの真空、８０〜８５℃であり、第二チャンバーは−０．０５〜０．０６Ｍｐａおよび６５〜７０℃；第三チャンバーは−０．０７〜０．０８Ｍｐａおよび５０〜５５℃であった。第一および第二チャンバー中の抽出物の体積が減少した後、濃縮物を第三チャンバーに移して、濃縮プロセスを続行した。第三チャンバー中の濃縮物の相対密度が約１．０５〜１．１２（６０±５℃で測定）、好ましくは約１．０５〜１．０８に達したら、濃縮プロセスを中断し、濃縮物を後に使用するために集めた。
Ｆ２を製造するための噴霧乾燥
【００４５】
濃縮物を約６５℃の温度まで加熱し、噴霧乾燥機のキャビネット中に遠心噴霧により注入した（デキストリンは添加しなかった）。キャビネットの入口および出口空気の温度をそれぞれ２１５℃付近および９０℃付近に調節した。入口空気の温度は最終粉末製品中の全多糖類の収率および最終粉末製品の外観に影響を及ぼした。１６０℃および２００℃および２４０℃の流入温度で、最終Ｙｕｎｚｈｉ粉末製品中の全多糖類の収率は、それぞれ２０．６％、１６．３％および１２．１％であった。Ｙｕｎｚｈｉ粉末は若干苦味を有していた。粉末は流入空気温度が１６０℃または２００℃で暗褐色であり、２４０℃で褐色であった。
【００４６】
濃縮物はキャビネット中で乾燥粉末になった。８０メッシュ篩いを有するミルに粉末を通した。微粉末Ｆ２を集めた。
外装
粉末（Ｆ２）をアルミ箔バッグ中に真空包装機により梱包し、密封した（３Ｋｇ／バッグ）。各バッグをアルミ箔の第二層で包装し、各バッチからの製品が全ての試験に適合することが証明された後に適切に標識した。バッグを次にバレル中に入れ、冷・乾燥条件下で保存した。
Ｆ２ａを製造するための真空乾燥
Ｆ２ａを製造するために、濃縮物をデキストリンとミキサー中２５分間混合した。混合物を次に真空乾燥機の清浄化されたトレイ上に置き、混合物を７０℃、＜−０．０８Ｍｐａで乾燥した。混合物の水分量が６％以下である場合に乾燥プロセスを停止した。混合物を粉砕し、８０メッシュ篩を有するミルに通した。最終粉末（Ｆ２ａ）を集めた。結果として得られたＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａの主成分は多糖類およびトリテルペノイドであることが見出された。
【実施例３】
【００４７】
高性能液体クロマトグラフィー研究
【００４８】
本発明は、異なる乾燥法により調製されるＹｕｎｚｈｉ粉末を特徴づけるために高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用する。
【００４９】
Ｆ２およびＦ２ａの違いは、分子サイズの差に従って化学成分を分離する高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用いた化学プロファイリングにより検出された。ＨＰＬＣ法および試験結果を以下に記載する：
１．材料および方法
１．１ＨＰＬＣ分析のサンプル調製
【００５０】
粉末形態におけるＦ２またはＦ２ａ（８４ｍｇ）を１ｍｌの滅菌二重蒸留および脱イオン水中に、丸底ポリプロピレンマイクロチューブ中１００ｒｐｍで振盪しながら別々に１２時間にわたって溶解させた。それぞれの溶液を０．４５μｍナイロンａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ、カタログ番号４４８４）を通して濾過し、４℃で貯蔵した。
１，２
分子サイズ標準
【００５１】
分子量１０１０のデキストラン（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｃｈｗｅｉｚ、カタログ番号３１４１６）および８０９００のデキストラン（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｃｈｗｅｉｚ、カタログ番号３１４２１）の混合物（それぞれ５０ｍｇ／ｍｌ）を含有する分子サイズ標準を、ＨＰＬＣシステムの性能における一貫性を検証するためのサイズマーカーとして使用した。
１．３ ＨＰＬＣシステム
【００５２】
全ＨＰＬＣシステムおよび全てのその機械的部品は、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡから購入した。使用した装置は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、Ｗａｔｅｒｓ ２４１０ 屈折率検出器（Ｒ．Ｉ．）、Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（サンプルをＵＶ ２６５ｎｍで分析）を包含する。カラムは次のように順次連結した：１．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（カタログ番号１１５６５）；２．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １０００（カタログ番号ＷＡＴ０１１５３５）；３．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ５００（カタログ番号ＷＡＴ０１１５３０）；および４．Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０（カタログ番号ＷＡＴ０１１５２５）。ウルトラヒドロゲルガードカラムは内径６．０ｍｍ、長さ４０ｍｍであった。ウルトラヒドロゲル分析カラムは全て、内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍであった。
１．４ ＨＰＬＣ運転条件
【００５３】
サイズ標準の各運転後の洗浄：ＤＤＩで０．３／分で１２０分。
サンプル−標準運転順序：デキストラン標準混合物を開始時、最中、およびサンプル後に１回運転した。
１．５ Ｆ２およびＦ２ａの化学フィンガープリントの分析
【００５４】
いずれかの検出法（Ｒ．Ｉ．またはＵＶ ２６５ｎｍ）を用いて異なるサンプルバッチから得られるクロマトグラムを並べ、比較した。Ｒ．Ｉ検出を用いてデキストラン標準混合物の異なるバッチから得られるクロマトグラムも並べて、実験間の変動を検証するために比較した。
２．結果
【００５５】
Ｆ２ａおよびＦ２サンプルのＨＰＬＣベースの分析により、図１において示されるように、ＵＶ２６５ｎｍ検出を用いて７より多い独立したピークが生じた。２つのサンプルのクロマトグラムは、３つのピーク（Ａ、Ｂ、およびＣ）の強度の違いを除いては類似していた。ピークＢ強度における差は、このピークの同じサンプル中の他のピークに対する相対強度がＦ２ａとＦ２間で異なるので、顕著である。示差Ｒ．Ｉ．での検出により、２つのサンプル間で非常に類似したパターンが得られ、従って、図２において示されるように、これらの間の差に適さない。試験は、デキストラン標準混合物間のクロマトグラムを並べることにより検証され、図３において示されるように、性能において有意な差は検出されなかった。
【実施例４】
【００５６】
薬理学的研究
【００５７】
次の薬理学的研究は、Ｆ２由来のＹｕｎｚｈｉが白血病および乳癌細胞系においてインビトロ増殖防止活性を示すことを証明した。Ｆ２はＹｕｎｚｈｉ純粋抽出よりも、正常なヒト細胞系ではなく、癌細胞に対するその選択的細胞毒性に関して良好であった。このような処方は白血病または乳癌の患者を治療するために潜在的に有用であり得る。
【００５８】
処方Ｆ２およびＦ２ａ由来のＹｕｎｚｈｉはどちらも白血病および乳癌細胞において有効性を示したが、Ｆ２はＭＴＴ分析により決定されるように、腫瘍細胞系について５０％成長阻害（ＩＣ５０）をもたらすために必要な濃度に関してＦ２ａよりも優れているようである。ヒト癌細胞系に関する両方の場合においてＹｕｎｚｈｉ純水抽出物についてのＩＣ５０値はＦ２よりも小さいが、抽出物はまた正常なヒト細胞系に関して非常に高い細胞毒性および低いＩＣ５０値を示した。従って、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物はＦ２が示すような選択的細胞毒性を示さなかったが、Ｆ２は選択された癌細胞系に対して顕著な細胞毒性を示したが、正常な細胞系には示さなかった。従って、本発明者らは、Ｆ２がＹｕｎｚｈｉ純水抽出物よりも良好な抗癌剤候補であると結論づけた。
【実施例５】
【００５９】
Ｆ２およびＦ２ａを調べるための細胞培養およびＭＴＴ分析のプロトコル
【００６０】
細胞培養の前に、Ｆ２、Ｆ２ａおよびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物を素ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）中に、それぞれ３．０ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌおよび１．１５ｍｇ／ｍｌ（溶解度の程度が異なるため）のストック溶液として、４８時間室温で、連続して振盪しながら溶解させた。不溶性物質を遠心分離により除去し、０．２２μｍフィルターを用いて可溶性上清を滅菌し、さらに素培地で希釈した。Ｆ２およびＦ２ａについて、希釈後の濃度範囲は２５〜１６００μｇ／ｍｌ（２ｘ最終濃度）であり、一方、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物について 濃度は１１４２．８６ｕｇ／ｍｌ（最終８００μｇ／ｍｌ用量）および２５−８００μｇ／ｍｌ（２ｘ最終濃度）の範囲であった。
【００６１】
ヒト急性前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）、乳癌（ＭＣＦ−７）および正常肝臓（ＷＲＬ−６８）細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。細胞系を増殖させ、加湿インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中に維持した。２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）で補足されたＲＰＭＩ培地１６４０をＨＬ−６０の細胞培養に使用した。１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足されたＲＰＭＩ培地をＭＣＦ−７およびＷＲＬ−６８細胞の培地として使用した。
【００６２】
培養フラスコから収穫された後、血球計を使用いて細胞を計数し、細胞生存をトリパンブルー排除により決定した。Ｆ２およびＦ２ａに関する分析について、対数期培養物からの１０４個のＨＬ−６０細胞を９６ウェル平底Ｃｏｓｔａｒ培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）のウェルあたり４０％ＦＢＳで補足された１００μｌのＲＰＭＩ培地中にシードし；ＭＣＦ−７細胞について、５０００細胞を、２０％ＦＢＳで補足された１００μｌのＲＰＭＩ培地中にウェルごとにシードした。１００マイクロリットルの、最終濃度の２倍のＦ２またはＦ２ａを素培地中に含有する溶液をウェルあたり添加した。対照ウェルを１００μｌの素培地単独とともに添加した。最終濃度２０μｇ／ｍｌの化学療法抗腫瘍剤マイトマイシンＣ（ＭＭＣ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ＭＯ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を正の対照として添加した。Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物に関する分析について、１０４細胞のＨＬ−６０細胞系をウェルあたり６６．７％ＦＢＳで補足された６０μｌのＲＰＭＩ培地中にシードし；一方、５０００細胞のＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８細胞系のいずれかをウェルあたり３３．３％ＦＢＳで補足された６０μｌのＲＰＭＩ培地中にシードした。８００μｇ／ｍｌの用量で、１４０μｌの希釈された抽出物を素培地中１１４２．８６ｕｇ／ｍｌの用量でウェルあたり添加した。１２．５〜４００μｇ／ｍｌの用量について、１００μｌの、素培地中最終濃度の２倍を含有する希釈された抽出物をウェルあたり添加した。対照ウェルを１４０μｌの素培地単独とともに添加した。細胞を次いで薬剤とともに４８時間（ＭＣＦ−７）または７２時間（ＨＬ−６０）インキュベートした。ＭＴＴ分析を用いて処理された細胞の増殖反応を決定した。
ＭＴＴ細胞毒性分析
【００６３】
ＭＴＴ分析は、ミトコンドリア脱水酵素によるＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ］のブルーホルマゾン生成物への還元を検出し、これはミトコンドリアの正常な機能、従って生存可能な細胞を反映する。細胞のＦ２、Ｆ２ａまたはＹｕｎｚｈｉ純水抽出物との４８時間（ＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８）または７２時間（ＨＬ−６０）のインキュベーション後、３０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴのリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）中溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを次に遠心分離し、続いて上清を除去した。１００マイクロリットルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）を次に各ウェルに添加した。３７℃で５分間インキュベーション後、溶解した溶液の吸光度を分光光度測定により５４０ｎｍでＢｅｎｃｈｍａｒｋ マイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により検出した。未処理細胞の吸光度を１００％とみなした。結果をＭＴＴ吸光度の平均％（Ｙｕｎｚｈｉエキス末−処理されたものにおける吸収の対照ウェルの吸光度に対する比＊１００％）±それぞれ６ウェルに関する３つの独立した実験の標準偏差として表した。処理および未処理対照（１００％）ウェル間の差をスチューデント不対Ｔテストにより試験した。
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）および乳癌（ＭＣＦ−７）に対するＦ２およびＦ２ａのインビトロ抗腫瘍活性の比較についてのＭＴＴ分析結果
【００６４】
図４および５は、Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方、Ｆ２およびＦ２ａがどちらも、それぞれヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）および乳癌（ＭＣＦ−７）に対してインビトロ抗増殖効果を有していたことを示す。Ｙｕｎｚｈｉエキス末の濃度を増大させつつ（１２．５〜８００μｇ／ｍｌで２倍の増加）細胞を培地中４８時間（ＭＣＦ−７細胞）または７２時間（ＨＬ−６０細胞）インキュベートし、増殖応答をＭＴＴ分析により評価した。両Ｙｕｎｚｈｉエキス末、Ｆ２およびＦ２ａは、ＭＣＦ−７細胞（５０から８００μｇ／ｍｌ）およびＨＬ−６０細胞（１００〜８００μｇ／ｍｌ）の増殖を用量に依存した方法で有意に阻害できた。
【００６５】
これらの薬理学的研究は、Ｆ２が低いＩＣ５０値を有し、従って、Ｆ２ａよりも活性であることを証明した。従って、本発明のＹｕｎｚｈｉ由来の処方は他のプロセスにより製造されたものよりも良好な処方であることが証明された。
【表１】
「＊」はデータが有意であることを示す。
【００６６】
図６、７および８は、Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物の、それぞれ、ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）、乳癌（ＭＣＦ−７）および正常肝臓細胞（ＷＲＬ−６８）に対するインビトロ増殖防止効果の結果を示す。細胞を培地中Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方の濃度を増加させつつ（１２．５〜８００μｇ／ｍｌ、２倍の増加）、４８時間（ＭＣＦ−７またはＷＲＬ−６８細胞）または７２時間（ＨＬ−６０細胞）インキュベートし、増殖応答をＭＴＴ分析により評価した。Ｙｕｎｚｈｉ由来の処方Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物はどちらもＭＣＦ−７細胞（５０から８００μｇ／ｍｌ）およびＨＬ−６０細胞（１００〜８００μｇ／ｍｌ）の増殖を用量に依存した方法で有意に阻害することができた。しかしながら、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物のみがＷＲＬ−６８細胞の増殖の顕著な阻害を示し（１００から８００μｇ／ｍｌ）、一方、Ｆ２は試験された濃度範囲（１２．５から８００μｇ／ｍｌ）全体にわたって有意な阻害を示さなかった。
【００６７】
表２は試験された細胞系に関するＹｕｎｚｈｉ由来の処方Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物のＩＣ５０値を示す。ＭＣＦ−７細胞の増殖は、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、５０μｇ／ｍｌから出発して、それぞれ２３５．４５±４１．２３μｇ／ｍｌおよび５９．３９±５．９２μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。ＨＬ−６０細胞の増殖は、Ｆ２およびＹｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、１００μｇ／ｍｌから出発して、それぞれ、１５０．６２±５．６５μｇ／ｍｌおよび１４．８５±１．１８μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。ＷＲＬ−６８細胞の増殖は、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物により有意に阻害され、１００μｇ／ｍｌから出発して、１２７．９１±１７．８５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値であった。１２．５から８００μｇ／ｍｌの試験された濃度範囲全体にわたって、Ｆ２によるＷＲＬ−６８細胞の増殖の有意な阻害は無かった。
【００６８】
結果は、明らかに、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物のＩＣ５０値はヒト癌細胞系ＨＬ−６０およびＭＣＦ−７の両方の場合においてＦ２よりも小さいが、抽出物は正常ヒト細胞系ＷＲＬ−６８に関して非常に高い細胞毒性および小さなＩＣ５０値を示すことを示した。従って、Ｙｕｎｚｈｉ純水抽出物はＦ２が有するような選択的細胞毒性を有さず、Ｆ２は選択された癌細胞系に対しては有意な細胞毒性を示すが、正常な細胞系に対しては示さなかった。これらの薬理学的研究は、本発明がＹｕｎｚｈｉ純水抽出物よりも良好な抗癌剤であることが証明されたことを示した。
【表２】
「＊」はデータが有意であることを示す。
【００６９】
本発明はさらに、Ｙｕｎｚｈｉ抽出物を組み入れた２種の処方も提供する。２つの処方およびその調製法の実施形態を以下に記載する。
【実施例６】
【００７０】
Ｙｕｎｚｈｉ粉乳
【００７１】
処方：
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末：４０ｋｇ
マルトデキストリン：８０ｋｇ
粉乳：８８０ｋｇ
Ｉ．Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末の調製
（１）Ｙｕｎｚｈｉ生薬の前処理
【００７２】
Ｙｕｎｚｈｉ原料ハーブを洗浄し、清浄化して、不純物、例えば、チリまたは砂を除去し、乾燥し、粉砕して、さらに使用するために粗末にした。
（２）第一抽出
【００７３】
５００ｋｇのＹｕｎｚｈｉ粗末を５倍の５０％エタノールで１２時間にわたって浸漬した後、標準的手順に従って抽出した。溶媒を若干沸騰する状況まで加熱し、高温で２時間還流させ（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第一残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（３）第二抽出
【００７４】
第一残留物を３倍の５０％エタノール中に浸漬し、若干沸騰する状況まで加熱し、高温で２時間還流し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第二残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（４）第三抽出
【００７５】
第二残留物を３倍の水中に浸漬し、若干沸騰した状態まで加熱し、高温で２時間加熱し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第三残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。
（５）第四抽出
【００７６】
第三残留物を３倍の水中に浸漬し、若干沸騰した状態まで加熱し、高温で２時間加熱し（１５分後ごとに溶媒は強制的に５分間循環した）、濾過して、濾液および第三残留物を得た。濾液をさらに使用するために集めた。第四残留物を廃棄した。
（６）濃縮
【００７７】
前記工程において得られた濾液を合し、１．０５〜１．０８（６５℃±５℃）の相対密度まで標準的手順に従って濃縮した。濃縮物を集め、さらに使用するために（水分量および微生物に関して）試験した。
（７）乾燥
【００７８】
透明ペーストを入口温度１２０℃〜１３０℃、出口温度５０℃±２０℃で標準的手順に従って噴霧乾燥した。後に使用するために１２０メッシュを有する篩いに通すことにより乾燥粉末（Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末）を集めた。
ＩＩ．マルトデキストリンおよび粉乳との混合
（８）乾燥、混合および造粒
【００７９】
Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末（４０ｋｇ）およびマルトデキストリン（８０ｋｇ）を接着剤として少量の９０％エタノールとよく混合してＹｕｎｚｈｉ純粋粉末をマルトデキストリンと十分に混合した。１２０ｋｇ、２４０ｋｇ、５２０ｋｇの粉乳を連続して添加し、Ｙｕｎｚｈｉ純粋粉末およびマルトデキストリンと十分に混合した。好適な量の９５％エタノールを軟質ペーストにする際に接着剤として添加した。軟質ペーストを高性能湿式造粒機または振り子様造粒機（１６メッシュ篩いを使用）により造粒した。湿潤顆粒を真空乾燥チャンバー中に入れ、０．０８〜−０．０９Ｍｐａ、６０℃±５℃で乾燥させた。乾燥した顆粒をさらに使用するために集めた（ 水分量≦６．０％）。
（９）包装
【００８０】
乾燥した顆粒を４０メッシュで篩別した。メッシュを通過した顆粒を集め、包装した。各包装物は４ｋｇの重量であった。
（１０）貯蔵
【００８１】
湿分を防ぐために生成物パックを密封する。
【実施例７】
【００８２】
Ｙｕｎｚｈｉ豆乳粉末
【００８３】
Ｙｕｎｚｈｉ豆乳粉末は、処方中の８８０ｋｇの粉乳を８８０ｋｇの豆乳粉末と置換し、乾燥顆粒を４０メッシュではなく２０メッシュで篩別する以外は実施例６において示されたＹｕｎｚｈｉ粉乳の類似した製造法により製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ＵＶ２６５ｎｍでのＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａおよびＦ２のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８５】
【図２】屈折率（Ｒ．Ｉ．）により検出されるＹｕｎｚｈｉエキス末Ｆ２ａおよびＦ２のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８６】
【図３】屈折率（Ｒ．Ｉ．）により検出されるスタッキングクロマトグラムにおけるデキストラン標準のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）特性を示す。
【００８７】
【図４】様々な濃度で７２時間ＨＬ−６０細胞に対するＦ２およびＦ２ａの増殖防止効果を示す（ｎ＝６ウェル、三重複実験）。
【００８８】
【図５】様々な濃度で４８時間ＭＣＦ−７細胞に対するＦ２およびＦ２ａの増殖防止効果を示す（ｎ＝６ウェル、三重複実験）。
【００８９】
【図６】ＨＬ−６０におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【００９０】
【図７】ＭＣＦ−７におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【００９１】
【図８】ＷＲＬ−６８におけるＹｕｎｚｈｉおよびＦ２の水抽出物の細胞毒性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって：
ａ．多糖類−ペプチドに富むキノコを準備し、該キノコを小片に切断し；
ｂ．キノコ片をアルカノールで抽出して、アルカノール抽出物を得、該アルカノール抽出物を濾過して、エタノール濾液を得；
ｃ．工程（ｂ）からの残留物を水性溶媒で抽出して、水性抽出物を得、該水性抽出物を濾過して、水性濾液を得；
ｄ．該濾液を合し、濃縮して、濃縮物を得;
ｅ．該濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を形成する工程を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、多糖類−ペプチドに富むキノコがＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノール抽出工程（ｂ）が１回より多く行われる、方法。
【請求項４】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、水性溶媒抽出工程（ｃ）が１回より多く行われる、方法。
【請求項５】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノール抽出工程（ｂ）および水性溶媒抽出工程（ｃ）がどちらも１回より多く行われる、方法。
【請求項６】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノールが５０％の水中エタノール（ｖ／ｖ）である方法。
【請求項７】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、該噴霧乾燥工程が、次の工程：
ａ．濃縮された濾液を予熱し、加熱された濃縮濾液を噴霧乾燥機のキャビネット中に注入し；
ｂ．キャビネットの流入空気温度を最適温度に調節し；
ｃ．濃縮濾液を乾燥して、乾燥粉末を得ることをさらに含む、方法。
【請求項８】
アルカノールがエタノールである請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって：
ａ．Ｙｕｎｚｈｉ原料を準備し、該原料を粉砕して粗末にし；
ｂ．該粗末を溶媒で抽出して、液体抽出物を得；
ｃ．該液体抽出物を濾過して、濾液を得：
ｄ．該濾液を濃縮して、濃縮物を得;
ｅ．該濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、溶媒が５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）である、方法。
【請求項１１】
請求項９記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、抽出工程（ａ）が１回より多く行われる方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、抽出工程（ａ）が４回行われ、使用される溶媒が、第一および第二抽出については５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）、第三および第四抽出については水である、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末の調製法であって、ハーブ材料および溶媒の重量対体積比が、それぞれ、第一および第二抽出については約１：５および１：２〜３、第三および第四抽出については１：２〜３および１：１〜３である、方法。
【請求項１４】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含むハーブエキス末であって、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、Ｙｕｎｚｈｉ粗末を溶媒で抽出して液体抽出物を得；該液体抽出物を濾過して、濾液を得；該濾液を濃縮して、濃縮濾液を得;濃縮濾液を噴霧乾燥して、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末を得ることにより得られる、ハーブエキス末。
【請求項１５】
Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、図１において示されるようなＦ２の高圧液体クロマトグラフィーパターンを有する請求項１４記載のハーブエキス末。
【請求項１６】
Ｙｕｎｚｈｉ粉末を含むハーブエキス末であって、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が請求項１２記載の方法により得られ、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、図１において示されるようなＦ２の高圧液体クロマトグラフィーパターンを有するハーブエキス末。
【請求項１７】
ヒトまたは他の哺乳動物において、免疫系の刺激または調節能、肝炎の治療能、あるいは癌細胞の増殖の阻害能を有する、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項１８】
ヒトまたは他の哺乳動物において白血病または乳癌細胞の増殖の阻害能を有する、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項１９】
顆粒剤、カプセル、錠剤、散剤、およびボーラスからなる群から選択されるものとして処方される、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項２０】
カプセルの形態である、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項２１】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物の免疫系を刺激または調節する方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物において癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物において肝炎を予防または治療する方法。
【請求項２４】
請求項１４記載のハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳を含む栄養補助食品。
【請求項２５】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比が１：１：１０〜１：４：５０の範囲である請求項２４記載の栄養補助食品。
【請求項２６】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比が約１：２：２２である請求項２４記載の栄養補助食品。
【請求項２７】
請求項１４記載のハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末を含む栄養補助食品。
【請求項２８】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比が１：１：１０−１：４：５０の範囲である請求項２７記載の栄養補助食品。
【請求項２９】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比が約１：２：２２である請求項２７記載の栄養補助食品。
【請求項１】
多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって：
ａ．多糖類−ペプチドに富むキノコを準備し、該キノコを小片に切断し；
ｂ．キノコ片をアルカノールで抽出して、アルカノール抽出物を得、該アルカノール抽出物を濾過して、エタノール濾液を得；
ｃ．工程（ｂ）からの残留物を水性溶媒で抽出して、水性抽出物を得、該水性抽出物を濾過して、水性濾液を得；
ｄ．該濾液を合し、濃縮して、濃縮物を得;
ｅ．該濃縮物を噴霧乾燥して、多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を形成する工程を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、多糖類−ペプチドに富むキノコがＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノール抽出工程（ｂ）が１回より多く行われる、方法。
【請求項４】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、水性溶媒抽出工程（ｃ）が１回より多く行われる、方法。
【請求項５】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノール抽出工程（ｂ）および水性溶媒抽出工程（ｃ）がどちらも１回より多く行われる、方法。
【請求項６】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、アルカノールが５０％の水中エタノール（ｖ／ｖ）である方法。
【請求項７】
請求項１記載の多糖類−ペプチドに富むキノコエキス末を調製する方法であって、該噴霧乾燥工程が、次の工程：
ａ．濃縮された濾液を予熱し、加熱された濃縮濾液を噴霧乾燥機のキャビネット中に注入し；
ｂ．キャビネットの流入空気温度を最適温度に調節し；
ｃ．濃縮濾液を乾燥して、乾燥粉末を得ることをさらに含む、方法。
【請求項８】
アルカノールがエタノールである請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって：
ａ．Ｙｕｎｚｈｉ原料を準備し、該原料を粉砕して粗末にし；
ｂ．該粗末を溶媒で抽出して、液体抽出物を得；
ｃ．該液体抽出物を濾過して、濾液を得：
ｄ．該濾液を濃縮して、濃縮物を得;
ｅ．該濃縮物を噴霧乾燥して、Ｙｕｎｚｈｉエキス末を形成することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、溶媒が５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）である、方法。
【請求項１１】
請求項９記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、抽出工程（ａ）が１回より多く行われる方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末を調製する方法であって、抽出工程（ａ）が４回行われ、使用される溶媒が、第一および第二抽出については５０％エタノール：５０％水（ｖ／ｖ）、第三および第四抽出については水である、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）エキス末の調製法であって、ハーブ材料および溶媒の重量対体積比が、それぞれ、第一および第二抽出については約１：５および１：２〜３、第三および第四抽出については１：２〜３および１：１〜３である、方法。
【請求項１４】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｙｕｎｚｈｉ）粉末を含むハーブエキス末であって、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、Ｙｕｎｚｈｉ粗末を溶媒で抽出して液体抽出物を得；該液体抽出物を濾過して、濾液を得；該濾液を濃縮して、濃縮濾液を得;濃縮濾液を噴霧乾燥して、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末を得ることにより得られる、ハーブエキス末。
【請求項１５】
Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、図１において示されるようなＦ２の高圧液体クロマトグラフィーパターンを有する請求項１４記載のハーブエキス末。
【請求項１６】
Ｙｕｎｚｈｉ粉末を含むハーブエキス末であって、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が請求項１２記載の方法により得られ、該Ｙｕｎｚｈｉ粉末が、図１において示されるようなＦ２の高圧液体クロマトグラフィーパターンを有するハーブエキス末。
【請求項１７】
ヒトまたは他の哺乳動物において、免疫系の刺激または調節能、肝炎の治療能、あるいは癌細胞の増殖の阻害能を有する、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項１８】
ヒトまたは他の哺乳動物において白血病または乳癌細胞の増殖の阻害能を有する、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項１９】
顆粒剤、カプセル、錠剤、散剤、およびボーラスからなる群から選択されるものとして処方される、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項２０】
カプセルの形態である、請求項１５記載のハーブエキス末。
【請求項２１】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物の免疫系を刺激または調節する方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物において癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１５記載のハーブエキス末を投与することを含む、ヒトまたは他の哺乳動物において肝炎を予防または治療する方法。
【請求項２４】
請求項１４記載のハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳を含む栄養補助食品。
【請求項２５】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比が１：１：１０〜１：４：５０の範囲である請求項２４記載の栄養補助食品。
【請求項２６】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および粉乳の比が約１：２：２２である請求項２４記載の栄養補助食品。
【請求項２７】
請求項１４記載のハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末を含む栄養補助食品。
【請求項２８】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比が１：１：１０−１：４：５０の範囲である請求項２７記載の栄養補助食品。
【請求項２９】
ハーブエキス末、マルトデキストリン、および豆乳粉末の比が約１：２：２２である請求項２７記載の栄養補助食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１４９６０（Ｐ２００９−５１４９６０Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４０１０１（Ｐ２００８−５４０１０１）
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５６２７１
【国際公開日】平成１９年５月１８日（２００７．５．１８）
【出願人】（５０７２１５４２６）ビータ・グリーン・ヘルス・プロダクツ・カンパニー・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＴＡ ＧＲＥＥＮ ＨＥＡＬＴＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３１７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５６２７１
【国際公開日】平成１９年５月１８日（２００７．５．１８）
【出願人】（５０７２１５４２６）ビータ・グリーン・ヘルス・プロダクツ・カンパニー・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＴＡ ＧＲＥＥＮ ＨＥＡＬＴＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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