ハーブ抽出物の抗酸化剤及びＦｅ２＋キレート形成剤としての特性
本件発明は、北米薬用ニンジン（特許権のある抽出物ＨＴ１００１）を、単独で、或いはイチョウ（ＧＢ）、西洋オトギリソウ（ＳＪＷ）、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及び／又はヒペルフォリンと組み合わせた医薬組成物に関する。本件発明に係る抗酸化剤及び増殖抑制剤は、Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化とＦｅ２＋とキレートを形成する挙動を有意に抑制し、ヒドロキシルフリーラジカルを除去する能力、神経芽細胞腫の細胞数を低減する能力、及び／又は神経突起伸長を促進する能力を示す。これらの効果は、Ｆｅ２＋キレート剤の挙動と一致し、個々の化学成分が示す、効果の種類と大きさの違いは、作用が相乗的であることを示唆している。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幾多の世紀に渡って、多種多様な神経症や軽病に対応するための漢方薬には、薬用ニンジン、イチョウ（Ｇｉｎｋｏ ｂｉｌｏｂａ）（ＧＢ）、及び西洋オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒｕｍ、ＳＪＷ）を有効活用してきた。最近のメタアナリシスは、ＧＢ抽出物が備える、認知、気分や感情の機能、痴呆の治療に向けたクオリティオブライフ（生活の質）に対する副作用のない有効性に言及してきた。しかし、より大規模な臨床試験の必要性が強調されている［Ｂｉｒｋｓ Ｊ，Ｇｒｉｍｌｅｙ ＥＶ，ｖａｎ ＤＭ「Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ」Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２００２；（４）：ＣＤ００３１２０］。同様に、北米薬用ニンジン（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）抽出物についても、記憶力を改善し［Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｈｕａｎｇ ＢＨ，Ｂａ Ｆ，Ｌｉ ＦＬ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ，Ｇｒｅｅｎｓｈａｗ ＡＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｍｎｅｓｉａ ｉｎ ａ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔａｓｋ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２４（５）：４４２〜５２］、その成分ジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１は、神経保護効果を発揮する［Ｒｕｄａｋｅｗｉｃｈ Ｍ，Ｂａ Ｆ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ（１）ａｎｄ Ｒｇ（１）」Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ２００１ Ａｕｇｕｓｔ；６７（６）：５３３〜７］ことが報告されている。薬用ニンジンの有益な特性は、そのサポニン含有物、集約してジンセノシドと呼ばれているダンマラントリテルペングルコシドの混合物に起因すると考えられる。ある種のジンセノシドは単離されており、その構造が決定されている。このようなジンセノシドには、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇが含まれている（特許文献１参照）。最近のメタアナリシスによれば、ドイツでは軽症及び中等症鬱病の治療に関して承認されているＳＪＷは、合成抗鬱薬に較べて明らかに優れた結果を示しており、副作用の面からもより好ましいとされている。［Ｒｏｄｅｒ Ｃ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｍ，Ｌｅｕｃｈｔ Ｓ「Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｄ ｔｏ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ Ｗｏｒｔ」Ｆｏｒｔｓｃｈｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ ２００４ Ｊｕｌｙ；７２（６）：３３０〜４３］。
【０００２】
酸化的ストレスは、種々の神経学的病理に関連しており、それゆえ、ＧＢ、北米薬用ニンジン、及びＳＪＷ抽出物の効果の若干は、それらの固有の抗酸化作用に起因している可能性がある。ＧＢ及びＳＪＷ中に含まれる主な生理的に活性な成分であることが知られているフラボノイドは、脂質の過酸化防止、フリーラジカルの除去、及びＦｅ２＋のキレート化をはじめとする抗酸化作用を有することがわかっている［Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ ＣＡ，Ｍｉｌｌｅｒ ＮＪ，Ｐａｇａｎｇａ Ｇ「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９６；２０（７）：９３３〜５６；Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９；Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２］。
【０００３】
また、抗酸化作用は、ジンセノシド、Ｒｂ１及びＲｇ３については［Ｋｉｍ ＹＣ，Ｋｉｍ ＳＲ，Ｍａｒｋｅｌｏｎｉｓ ＧＪ，Ｏｈ ＴＨ「Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ１ ａｎｄ Ｒｇ３ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ １９９８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５；５３（４）：４２６〜３２；Ｌｉｍ ＪＨ，Ｗｅｎ ＴＣ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ｊ，Ｍａｅｄａ Ｎ，Ｐｅｎｇ Ｈ，Ａｂｕｒａｙａ Ｊ，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ，Ｓａｋａｎａｋａ Ｍ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ１，ａ ｍａｉｎ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｇ ｒｏｏｔ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ １９９７ Ｊｕｌｙ；２８（３）：１９１〜２００］に、ＳＪＷ抽出物については［Ｊａｎｇ ＭＨ，Ｌｅｅ ＴＨ，Ｓｈｉｎ ＭＣ，Ｂａｈｎ ＧＨ，Ｋｉｍ ＪＷ，Ｓｈｉｎ ＤＨ，Ｋｉｍ ＥＨ，Ｋｉｍ ＣＪ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌｉｎｎ（Ｓｔ，Ｊｏｈｎ’ｓ ｗｏｒｔ）ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２００２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３０；３２９（２）：１７７〜８０］に記載されている。Ｆｅ２＋のキレート化に伴う抗酸化作用により細胞を保護する効果を発揮する抽出物は、使用されるモデルの状態及びその性質に応じて、増殖抑制効果／アポトーシス促進効果を示すとの仮説を立てることができる。Ｆｅ２＋は、細胞の増殖にとって決定的に重要な要素なので、新生細胞のＦｅ２＋に対する要求は大きい。Ｆｅ２＋キレート剤の抗癌作用は、また、神経芽細胞腫をはじめとする種々の病理に対して臨床例が報告されている［Ｄｏｎｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａ，Ｄｅｂ Ｇ，Ｄｅ ＳＬ，Ｃｏｚｚａ Ｒ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ Ａ「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９６；９５（１）：６６〜９］。それらの明らかにされた増殖抑制効果［Ｒｅｎｔｏｎ ＦＪ，Ｊｅｉｔｎｅｒ ＴＭ「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９６ Ｊｕｌｙ １４；５１（１１）：１５５３〜６１］に加えて、Ｆｅ２＋キレート剤は、また、アポトーシスを誘発し［Ｆａｎ Ｌ，Ｉｙｅｒ Ｊ，Ｚｈｕ Ｓ，Ｆｒｉｃｋ ＫＫ，Ｗａｄａ ＲＫ，Ｅｓｋｅｎａｚｉ ＡＥ，Ｂｅｒｇ ＰＥ，Ｉｋｅｇａｋｉ Ｎ，Ｋｅｎｎｅｔｔ ＲＨ，Ｆｒａｎｔｚ ＣＮ「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｍｙｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１ Ｍａｒｃｈ １；６１（３）：１０７３〜９］、且つ、胎児性癌腫Ｆ９を含むいくつかの腫瘍系における細胞の分別化を促進する［Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｍｕｔｏ Ｎ，Ｉｄｏ Ｙ，Ｉｔｏｈ Ｎ，Ｔａｎａｋａ Ｋ「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７ Ｊｕｌｙ ５；１３５７（１）：９１〜７］。
【０００４】
最近、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）の治療で使用されている、特許製品である北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１とＧＢとを含む特異な抽出物配合製品（ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＡＤ−ｆＸ（登録商標）、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州）に関する試験的な研究では、これらが、認知問題を含むＡＤＨＤ症候を改善する可能性があることを示唆している［Ｌｙｏｎ ＭＲ，Ｃｌｉｎｅ ＪＣ，Ｔｏｔｏｓｙ ｄｅ ＺＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ Ｐ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ Ｃ「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂａｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ ａｎｄ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｏｎ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００１ Ｊｕｎｅ；２６（３）：２２１〜８］。この研究は、北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷの神経保護／神経向性及び抗酸化作用に関する報告に止まらず、それぞれの物質とそれらの組み合わせ、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６（Ｍｅｎｔａ−ｆＸ（登録商標）；ＧＢ、北米薬用ニンジン、及びＳＪＷ）の作用機構に関する研究を促進することになった。
【０００５】
特許文献２及び特許文献３は、従来技術による抽出物に触れている。特許文献２及び特許文献３が開示している内容は、本出願でも引用している。特許文献２は、ジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１が、大脳皮質及び海馬領域におけるＡＣｈのアベイラビリティを高め、アルツハイマー型老人性痴呆の症状を軽減することを開示している。該特許は、また、ジンセノシドＲｂ１の単離方法を開示している。特許文献３は、薬用ニンジンに由来する医薬組成物、及び各種の脳の健康状態又は病気の治療方法、加えて鬱又は一般的認知の改善を開示している。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４１５７８９４号
【特許文献２】米国特許第５１３７８７８号
【特許文献３】米国特許第６０８３９３２号
【０００７】
［発明の効果］
本発明者らは、北米薬用ニンジンの特定の抽出物、ＧＢ及びＳＪＷの抽出物、及びそれらの生理的に活性な成分である、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ；ギンコライドＡ及びＢ；フラボノイドのクエルセチン及びルチン；ヒペリシン及びヒペルフォリンは、抗酸化作用及び増殖抑制作用を有することを見出した。本発明者らがＨＴ１００１と呼び、約１５〜５０％、好ましくは約２５〜４０％の総ジンセノシド（サポニンとしても知られている）を含有する特定の薬用ニンジン抽出物は、抗酸化剤又は増殖抑制剤として単独で或いはＧＢ及び／又はＳＪＷと組み合わせて投与できる。
【０００８】
［発明を実施するための最良の形態］
本件発明者らは、専売品である北米薬用ニンジンの抽出物（ＨＴ１００１）は、単独或いはＧＢ及び／又はＳＪＷと組み合わせて、抗酸化作用及び抗癌作用を有することを見出した。試験の結果、化学成分であるギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンも抗酸化作用を有することを見出した。試験に供したハーブ抽出物及びそれらの組み合わせのすべてについて、Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制する能力、無菌化学分析装置内でＦｅ２＋をキレート化する能力、そして、ＧＢ及びＣＶＴ−Ｅ０３３（北米薬用ニンジン＋ＧＢ）の場合にはフリーラジカルの除去によって抗酸化作用が確認された。更に、Ｆｅ２＋キレート剤の示す挙動と同様、すべてのハーブ抽出物の増殖抑制効果及び／又は分別化促進効果が、いくつかの神経芽細胞腫モデルで立証された。
【０００９】
抗酸化作用は、すべての被試験ハーブ抽出物及びそれらの化学成分のいくつかに見られた。ＣＶＴ−Ｅ０３３（北米薬用ニンジン＋ＧＢ）及びＣＶＴ−Ｅ０３６（北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷ）は、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５ＹにおいてＦｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制することがわかった。このことは、Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化をすべて個別に抑制するＨＴ１００１、ＧＢ、及びＳＪＷが寄与していると考えられる。ＧＢ（Ｒａｍａｓｓａｍｙ Ｃ，Ｇｉｒｂｅ Ｆ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ Ｙ、Ｃｏｓｔｅｎｔｉｎ Ｊ「Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＧｂ７６１ ｏｒ ｔｒｏｌｏｘ Ｃ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ／Ｆｅ２＋ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９３；１９（５）：３４１〜５０）、北米薬用ニンジン（Ｋｉｔｔｓ ＤＤ，Ｗｉｊｅｗｉｃｋｒｅｍｅ ＡＮ，Ｈｕ Ｃ「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２０３（１〜２）：１〜１０）、及びＳＪＷ（Ｚｏｕ Ｙ，Ｌｕ Ｙ，Ｗｅｉ Ｄ「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ−ｒｉｃｈ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２００４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １１；５２（１６）：５０３２〜９）、及びフラボノイドの構成成分（Ｃｈｅｎ ＹＴ，Ｚｈｅｎｇ ＲＬ，Ｊｉａ ＺＫ，Ｊｕ Ｙ「Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｓ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９０；９（１）：１９〜２１）の抽出物は、脂質又はリポソームの過酸化を抑制することが報告されている。Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化は、フリーラジカルの除去又はＦｅ２＋のキレート化によって直接的に防止され得る。ＣＶＴ−Ｅ０３３は、適度のフリーラジカルの除去性を示したが、これは、検知可能な効果を有さない薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１よりはむしろ、かなりのフリーラジカルの除去性を備えるＧＢ成分抽出物によるものと考えられる。このことは、ＧＢ抽出物によるフリーラジカルの除去性に関する別の報告（Ｒａｍａｓｓａｍｙ Ｃ，Ｎａｕｄｉｎ Ｂ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ Ｙ，Ｃｌｏｓｔｒｅ Ｆ，Ｃｏｓｔｅｎｔｉｎ Ｊ「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ（ＥＧｂ７６１） ａｎｄ ｔｒｏｌｏｘ Ｃ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｏｒ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｕｐｔａｋｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９２；４４（１２）：２３９５〜４０１）と一致している。更に、化学モデルでは、すべての抽出物が同程度までのＦｅ２＋のキレート化を示した。これら抽出物の純化学成分のいくつかに関する試験では、クエルセチン（Ｓｅｓｔｉｌｉ Ｐ，Ｇｕｉｄａｒｅｌｌｉ Ａ，Ｄａｃｈａ Ｍ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｏ「Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＤＮＡ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋａｇｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ：ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｖｅｒｓｕｓ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９８ Ａｕｇｕｓｔ １５；２５（２）：１９６〜２００に報告済み）、ヒペリシン、並びに２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシドＲｂ１、Ｒｃ、及びＲｄは、特異構造と効果との相関を暗示する、Ｆｅ２＋とキレートを形成する挙動を示し、２０−（ｓ）−プロトパナキサトリオールジンセノシドＲｇ１及びＲｅの効果は顕著でない。後の実施例で示すデータは、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６は、Ｆｅ２＋キレート剤として機能する可能性のある異なる化学的成分を有していることを示唆している。しかし、個々の成分をハーブ抽出物中におけるそれらの含有量を反映した濃度で試験すると、極めてわずかな効果しか示さないため、Ｆｅ２＋の固定は、抽出物の各成分の相乗効果、又は総合効果であると考えられる。
【００１０】
各種の神経芽細胞腫細胞系に対する増殖抑制効果及び／又は分別化促進効果は、すべての抽出物に観察された。すべてのハーブ調合剤がＦｅ２＋キレート剤の挙動を示したことは、これらが神経芽細胞腫中で抗癌特性及び増殖抑制特性を示した物質であることからすれば驚くべきことではない（Ｄｏｎｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａ，Ｄｅｂ Ｇ，Ｄｅ ＳＬ，Ｃｏｚｚａ Ｒ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ Ａ「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９６；９５（１）：６６〜９）。この研究で使用された神経芽細胞腫培養モデルでは、Ｆｅ２＋キレート形成に関連する神経保護（すなわち、生存促進）効果（血清欠乏モデル中で試験された）と増殖抑制効果／分別化促進効果との間におけるバランスは、後者よりと考えられる。試験した化学成分の中では、クエルセチン及びヒペルフォリンのみが、神経芽細胞腫の細胞数の抑制を示している。ヒペルフォリン（Ｄｏｎａ Ｍ，Ｄｅｌｌ’Ａｉｃａ Ｉ，Ｐｅｚｚａｔｏ Ｅ，Ｓａｒｔｏｒ Ｌ，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ Ｆ，Ｄｅｌｌａ ＢＭ，Ｄｏｎｅｌｌａ−Ｄｅａｎａ Ａ，Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ Ｇ，Ｂｏｒｓａｒｉｎｉ Ａ，Ｃａｎｉａｔｏ Ｒ，Ｇａｒｂｉｓａ Ｓ「Ｈｙｐｅｒｆｏｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ １；６４（１７）：６２２５〜３２）、ＧＢ、及び一部のフラボノイドは、他の新生物モデルでは増殖抑制効果／アポトーシス促進効果を発揮することが報告されている（Ｈｕａｎｇ ＹＴ，Ｈｗａｎｇ ＪＪ，Ｌｅｅ ＰＰ，Ｋｅ ＦＣ，Ｈｕａｎｇ ＪＨ，Ｈｕａｎｇ ＣＪ，Ｋａｎｄａｓｗａｍｉ Ｃ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ Ｅ Ｊｒ，Ｌｅｅ ＭＴ「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ａ４３１ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１２８（５）：９９９〜１０１０）。若干の特定ジンセノシドは、既にヒト白血病（ＴＨＰ−１）細胞をはじめとする種々の新生物モデルにおいて増殖抑制効果及びアポトーシス促進効果を発揮することがわかっているが（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＤＧ，Ｋｉｔｔｓ ＤＤ「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｅｘｉｓｔｓ ｆｏｒ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＴＨＰ−１）ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ」Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２００２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １；４０６（１）：１〜８）、この研究で試験されたジンセノシド（Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ）では顕著でなかったことは、本明細書の結果と一致している。このことは、また、北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１が、単独では、神経芽細胞腫の細胞数抑制と関連していなかったという知見と一致している。ＨＴ１００１とＧＢの間には相乗効果が観察される。ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６は、双方とも、個々の材料と比較した場合、低血清条件（ストレス）下で細胞数を減少させる。ＣＶＴ−Ｅ０３６は、また、非ストレス条件下でこれを行なうことができる。本件発明者らが抽出物の組み合わせ中におけるそれらの比率を反映した濃度で個々の成分の効果を分析した際には、細胞数に対して有意な効果は観察されなかった（図９）。従って、該成分は相乗的に作用すると思われる。
【００１１】
また、Ｆｅ２＋キレート剤は、増殖抑制効果／アポトーシス促進効果の他に、細胞を分別化する効果を備えることが報告されている（Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｍｕｔｏ Ｎ，Ｉｔｏｈ Ｎ，Ｄｏｔａ Ａ，Ｎｉｓｈｉｎａ Ｙ，Ｉｎａｄａ Ａ， Ｔａｎａｋａ Ｋ「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｆ９ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ」Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；９０（２）：２１１〜２０）。この研究では、神経芽細胞腫を区別する指標を得るために、神経突起伸長の程度を定量化している。ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ及びＨＴ１００１のすべては、Ｎ１Ｅ１１５細胞に対して、かなりの神経突起伸長を同じ程度まで誘発することが見出された。ＧＢ抽出物は、高濃度で培養神経芽細胞中で細胞死を誘発することが観察されたが、生き残ったものは、極めて高度の神経突起伸長を示した。ＨＴ１００１は、神経芽細胞腫の細胞数を抑制せず、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では細胞数をわずかに増すことさえあったので、北米薬用ニンジン抽出物は、未知の機構を介して細胞の生き残りを高めること、及び分別化を起こすことの双方で作用する可能性がある。いくつかの薬用ニンジン粗抽出物、並びにジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１は、神経突起伸長を直接的に促進するか、或いはＮ１Ｅ１１５細胞中での神経突起伸長に対して神経成長因子（ＮＧＦ）の刺激効果を増強することが既に示されている（Ｒｕｄａｋｅｗｉｃｈ Ｍ，Ｂａ Ｆ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ（１） ａｎｄ Ｒｇ（１）」Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ２００１ Ａｕｇｕｓｔ；６７（６）：５３３〜７）。更に、ジンセノシドＲｂ１及びＲｂ３、並びにノトジンセノシドＲ４、６及びＦａ７も、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞中で神経突起伸長を促進する能力を示している（Ｚｏｕ Ｋ，Ｚｈｕ Ｓ，Ｍｅｓｅｌｈｙ ＭＲ，Ｔｏｈｄａ Ｃ，Ｃａｉ Ｓ，Ｋｏｍａｔｓｕ Ｋ「Ｄａｍｍａｒａｎｅ−ｔｙｐｅ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＳＫ−Ｎ−ＳＨ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ ２００２ Ｏｃｔｏｂｅｒ；６５（９）：１２８８〜９２）。
【００１２】
北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷの抽出物に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、且つ、神経向性と神経保護効果の両方について多数の報告がなされている。これらの効果の多くは、神経伝達物質系に対する特定の効果に帰することができ、抗酸化作用も、実質的な貢献要因である可能性がある。本件発明は、神経芽細胞腫に対する、５つの標準的なハーブと北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷとの配合物の抗酸化作用、鉄キレート形成性、及び増殖抑制効果／分別化促進効果に関する。本件発明は、また、ジンセノシド（２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシド）がＦｅ２＋とキレートを形成する挙動を備えることを示し、特異構造と効果との相関を解明し、ＳＪＷ抽出物成分であるヒペリシンを提供する。被試験抽出物及びそれらが含む生物学的に活性な若干の純粋な化学成分がＦｅ２＋とキレートを形成する挙動は、神経芽細胞腫の悪性細胞系で観察される増殖抑制効果及び分別化促進効果の少なくとも一部分であると考えられる。
【００１３】
ＨＴ１００１の好ましい抽出法は、特許文献３に記載されている。この方法では、出発原料として乾燥、粉砕された３００ｋｇの薬用ニンジン粉末を使用する。必要に応じて、薬用ニンジンをフィッツミルに入れ、約８０メッシュまで粉砕してもよい。次いで、薬用ニンジンを、エタノールを使用する抽出工程に供する。濃度８５％のエタノールを使用することが望ましいが、当業者であれば通常の技術の範囲内で調整可能である。固形物：溶剤比は約１：５〜１：１０とするが、１：８が好ましい。抽出は、必要に応じて約１〜５時間行なう。好ましい抽出時間は、３時間である。抽出温度は、８０℃〜１０５℃の範囲とできるが、９０℃〜９５℃が好ましい。撹拌することが推奨される。液相と固相とは、排出ラインに２５ミクロンのインラインカートリッジフィルターを備えた、速度が約４２００ｒｐｍのデカンター遠心分離機を用いれば好ましく分離できる。
【００１４】
多数回の抽出を行なうのであれば、上澄み液を保管しておく。いずれにしても、上澄み液を濃縮工程に供してエタノールを回収する。真空蒸留法を用いることが好ましい。目標とする固形物含有量は、約１０°〜１２°（ブリックス）である。温度は、好ましくは約５０℃とし、１５インチＨｇ、２２０〜２２５ｋｇ／ｈの速度で供給する。濃縮を避けるためには、水を添加してもよい。
【００１５】
濃縮された抽出物は、フリーズドライ、オーブン乾燥、又はドラム乾燥してもよいが、好ましくは、約４２℃〜５８℃の温度とし、約２０ｋｇ／ｈで供給して噴霧乾燥するのが好ましい。入り口の温度は、好ましくは約１５０℃〜１７５℃であり、出口の温度は、好ましくは約７０℃〜９０℃である。乾燥したら、抽出物を粉砕し、塊があれば必要に応じて取り除く。０．０６５インチのスクリーンを取り付けたフィッツミルを使用するのが好ましい。次いで、抽出物をブレンドして約２０％の製品とすることが好ましい。
【００１６】
イチョウ抽出物は、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃａｌ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）などを通じて市場で入手できる。イチョウ葉の標準的な抽出物は、Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴが「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９）で論じているように、約２４％のイチョウフラボングリコシド及び約６％のテルペンラクトンを含有している。
【００１７】
西洋オトギリソウ抽出物は市場で入手でき、Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ等が「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２）中で論じているように、一般には、０．３％のヒペリシンを含有するものが標準品である。
【００１８】
特殊な薬用ニンジン抽出物であるＨＴ１００１は、ジンセノシド（サポニンとしても知られている）の総量で約１５〜５０％、好ましくは約２５〜４０％を含有し、単独で、又はＧＢ、ＳＪＷ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及び／又はヒペルフォリンと組み合わせて、抗酸化剤又は増殖抑制剤として投与できる。
【００１９】
本件発明に係る抗酸化剤又は増殖抑制剤は、経口、肺に送達するためのエアゾール又はその他のデバイス、鼻腔スプレー、静脈内、筋内、腹膜内、膣、直腸、及び局所若しくは経皮をはじめとする任意の好適な経路で投与できる。抗酸化剤又は増殖抑制剤を送達するための担持体として使用できる賦形剤は、当業者にとっては明らかである。例えば、抗酸化剤又は増殖抑制剤は、乾燥した形態でもよく、静脈注射による投与の直前に溶解してもよい。ＨＴ１００１を単独又はＢＢ、ＳＪＷ及び／又はそれらの活性成分と組み合わせた場合の好ましい投与手段は、経口又は静脈投与である。経口投与するのであれば、ＨＴ１００１は、好ましくは、１００ｍｇ入りのカプセルにする。ＣＶＴ−Ｅ０３３（ＨＴ１００１とＧＢとの組み合わせ）は、好ましくは、１２５ｍｇ入りのカプセルにする。ＣＶＴ−Ｅ０３６（ＨＴ１００１とＧＢの組み合わせ）は、好ましくは、３２５ｍｇ（ＳＪＷ：ＨＴ１００１：ＧＢ、２００ｍｇ：１００ｍｇ：２５ｍｇ）入りのカプセルにする。
【００２０】
好適なキャリア、希釈剤又は賦形剤は、医薬組成物の調製に関する技術分野では公知である。このような好適な希釈剤又は賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、アラビアガム、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コーン又はポテトデンプンなどのデンプン、ケイ酸、粘性パラフィン、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに限定はされない。医薬組成物は殺菌してもよく、必要に応じて滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩、緩衝剤、着色料、着香料及び／又は芳香性物質などの補助剤と混合できる。単独で投与する場合には、７５ｋｇの個体に対して、有効薬剤ＨＴ１００１を１日当り１０ｍｇ〜１０００ｍｇの投与量範囲で投与するのが好ましい。そして、１日当り７５ｍｇ〜５００ｍｇの投与量とするのがより好ましく、１日当り１００ｍｇ〜２００ｍｇの投与量とするのが最も好ましい。
【００２１】
本明細書中で「有効量」と言う場合は、ＨＴ１００１を、単独で、或いはＧＢ、ＳＪＷ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及び／又はヒペルフォリンと組み合わせて投与する量を含む。ＨＴ１００１を別の抗酸化剤又は増殖抑制剤と共に投与するのであれば、ＨＴ１００１の通常の有効量を削減できる。従って、用語「有効量」とは、その材料を組み合わせることが効果的であり、且つ各材料の投与量を比例的に低減できるその他の有効材料と組み合わせたＨＴ１００１の使用量を包むものと解釈する。例えば、ＨＴ１００１が、通常、１個体当り１日につき１００ｍｇ投与するのが効果的であり、イチョウが、通常、１個体当り１日につき１００ｍｇ投与するのが効果的であるなら、２種の材料を組み合わせて使用すれば、各々を１日につき個体当り５０ｍｇの投与にできる。このように組み合わせて使用すれば、多くの医薬がそうであるように、その他の有効材料（ＨＴ１００１以外の）が高価であるなら、消費者にとっては経済的である。
【００２２】
本件発明に係る組成物は、酸化的ストレス、鉄過剰症を治療し、且つ／又は神経突起伸長を促進するのに使用できる。酸化的ストレス及び鉄過剰症は、限定はされないが、癌、アルツハイマー病、結核、パーキンソン病、鎌状赤血球、ウィルソン病、肝損傷、βサラセミア、心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、感染症、新生物、心筋症、及び／又は関節症をはじめとする多くの健康状態及び疾患を引き起こす。特定細胞組織への鉄負荷は、疾患リスクの増大と関連している（Ｅｕｇｅｎｅ Ｄ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ「Ｉｒｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ」Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，Ｍａｙ〜Ｊｕｎｅ １９９９ ３４６〜３５２）。鉄は、フリーラジカルとして知られている物質が体内で傷害作用を刺激する酸化促進剤として作用する。各種細胞組織中での鉄過剰症と関連する疾患を、以下の表１に示す。
【００２３】
【表１】
【実施例】
【００２４】
［材料］
フェロジン、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、クエルセチン、ルチン、ギンコライドＡ、及びギンコライドＢは、Ｓｉｇｍａから入手した。すべての抽出物（ＨＴ１００１、ＧＢ、ＳＪＷ、ＣＶＴ−Ｅ０３３、及びＣＶＴ−Ｅ０３６）とその化学成分であるジンセノシド（Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅ）は、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州、カナダ）で調製し、精製した。北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１（ＲＥＭＥＭＢＥＲ−ｆＸ（登録商標））（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｈｕａｎｇ ＢＨ，Ｂａ Ｆ，Ｌｉ ＦＬ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ，Ｇｒｅｅｎｓｈａｗ ＡＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｍｎｅｓｉａ ｉｎ ａ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔａｓｋ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２４（５）：４４２〜５２）、ＧＢ抽出物（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９）及びＳＪＷ（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２）の化学同定結果は前述の通りである。ＣＶＴ−Ｅ０３３（ＡＤ−ｆＸ（登録商標）、ＨＴ１００１：ＧＢ抽出物が４：１（ｗ／ｗ））、及びＣＶＴ−Ｅ０３６（ＭＥＮＴＡ−ｆＸ（登録商標）、ＳＪＷの標準的な抽出物：ＨＴ１００１：ＧＢ抽出物が８：４：１（ｗ／ｗ））は、ＣｈｅｍＢｉｏＰｒｉｎｔ（商標）が組み合わせを標準化した製品であり、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能である。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬は、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．（Ｐｏｓｔｆａｃｈ、スイス）から購入した。細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｎａｄａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、オンタリオ州、カナダ）から購入した。その他のすべての化学試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、オンタリオ州、カナダ）又はＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州、カナダ）から購入した。水溶性ジンセノシドを除くすべての試料は、まずＤＭＳＯに溶解し、その後水で希釈して実験に用いた。
【００２５】
［脂質の過酸化抑制性の調査］
ハーブ抽出物が脂質の過酸化を抑制する能力を、Ｏｈｋａｗａらが開発したチオバルビツール酸分析法（Ｏｈｋａｗａ Ｈ，Ｏｈｉｓｈｉ Ｎ，Ｙａｇｉ Ｋ「Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７９ Ｊｕｌｙ；９５（２）：３５１〜８）、及びカテコールアミン作動性神経芽細胞腫の細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ大学、Ｐｅｔｅｒ Ｙｕ博士からの寛大な贈呈物）を使用して評価した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｖ／ｖ）及び１％抗生物質混合物（ペニシリン５０μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ；ＰＳＮ）を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にほぼ９０〜１００％の集密度になるまで維持した。次いで、それらを、６−ウェルのＮｕｎｃｌｏｎ組織培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間増殖させ、その後、０．１ｍＭの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）の存在下又は不在下でハーブ抽出物に４８時間曝露した。次いで、細胞を採取し、使い捨てガラス培養チューブに入れ、遠心分離し、ペレットを０．４ｍＬの１．１５％塩化カリウム中に再懸濁し、超音波除膜器（ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）を用いて均一にした。次いで、３００μＬのアリコートを、テトラエトキシプロパンを参照基準品とし、Ｏｈｋａｗａらの方法を使用して脂質の過酸化物を分析した。残りの材料を用い、Ｌｏｗｒｙの方法を使用してタンパク質含有量を分析した。
【００２６】
０．１ｍＭのＦｅ２＋の存在下又は不在下での脂質の過酸化抑制に対するハーブ抽出物の効果を図１に示す。すべての試料が、Ｆｅ２＋存在下でのみ脂質の過酸化を有意（Ｐ＜０．０５）に抑制したが、Ｆｅ２＋の不在下では効果がなかった（データは示していない）。有効性は、ＧＢ＞ＳＪＷ＞ＣＶＴ−Ｅ０３３＝ＣＶＴ−Ｅ０３６＞ＨＴ１００１の順番であった。
【００２７】
［フリーラジカルの除去性の調査］
ハーブ抽出物及び純粋化学成分のヒドロキシルフリーラジカルの除去能力を、Ａｒｎａｏらが開発した動的な方法を応用して評価した（Ａｒｎａｏ ＭＢ，Ｃａｎｏ Ａ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ Ｊ，Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｆ，Ａｃｏｓｔａ Ｍ「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｆｏｏｄｓ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６ Ｊｕｎｅ １；２３６（２）：２５５〜６１）。簡潔に説明すると、ハーブ抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、過酸化水素と２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）とを混合し、２ｎＭの西洋ワサビ過酸化酵素で反応を開始させた。有色のＡＢＴＳラジカル（４０５ｎｍでの吸光度）の形成を防止する能力によって、試料のヒドロキシルラジカルの除去効果を推測した。各試料に関するフリーラジカルの除去性を、アスコルビン酸で作成した標準曲線と比較した。
【００２８】
抽出物ＧＢ、ＨＴ１００１、及びＣＶＴ−Ｅ０３３のフリーラジカルの除去能力を以下の表２に示す。ヒドロキシラジカルの除去効果を、過酸化酵素触媒として形成されるＡＢＴＳラジカルの形成を防止する能力から推測した。ＣＶＴ−Ｅ０３３、そしてより大きな程度でＧＢは、かなりのヒドロキシルラジカルの除去効果を示したが、ＨＴ１００１は、検知可能な効果を示していない。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２では、北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１、ＧＢ抽出物、及び組み合わせＣＶＴ−Ｅ０３３（ＨＴ１００１＋ＧＢ）によるフリーラジカルの除去性を調査している。具体的には、ハーブ抽出物を過酸化水素及びＡＢＴＳと共に培養し、西洋ワサビ過酸化酵素を添加して反応を開始した。そして、試料のヒドロキシルラジカルの除去効果を、有色のＡＢＴＳラジカルの形成を抑制する能力によって推測した（４０５ｎｍでの吸光度）。更に、各試料に関するフリーラジカルの除去性を、アスコルビン酸を用いて作成した標準曲線と比較し、重量％アスコルビン酸として表現している。
【００３１】
［Ｆｅ２＋とのキレート形成挙動の調査］
ハーブ抽出物又は純粋な化学成分が無菌分析装置内でＦｅ２＋をキレート化する能力を、以下に示すＦｅＳＯ４とＦｅ２＋キレートを形成する色素発生バクテリアであるフェロジンを培養して追跡し、有色のＦｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制する効果で評価した。フェロジンは、以前、フェリチンが放出する遊離Ｆｅ２＋の測定に活用されていた。試験対象であるすべてのハーブ抽出物及び純粋化学物質は、４％ＤＭＳＯ水溶液を用い、それぞれを５ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬで調製した。５０μＬのアリコートを、９６−ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で５０μＬの１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に室温で３０分間培養した。次いで、得られた５０μＬのアリコート溶液を、新たな９６−ウェルＭＴＰに移し、５０μＬの２ｍＭ（飽和濃度）フェロジン溶液と合わせた。ＨＴ１００１、ＧＢ、ＳＪＷ、ＣＶＴ−Ｅ０３３、及びＣＶＴ−Ｅ０３６を１．２５ｍｇ／ｍＬで試験し、純粋化学成分を５０μｇ／ｍＬ（最終濃度）で試験した。発色は瞬間的であり、５６２ｎｍで吸光度を読み取った。結果を参照試料との比較で表し、試料の効果を既知のＦｅ２＋キレート剤であるＤＦＯと比較した。ＤＭＳＯは、Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制できたので、試験抽出物及び化学成分毎にＤＭＳＯ参照試料と比較したパーセンテージで示した。
【００３２】
すべてのハーブ抽出物、及び純粋化学成分、ギンコライドＡ及びＢ、フラボノイドのクエルセチン及びルチン、ヒペルフォリン、ヒペリシン、並びに５種のジンセノシド、Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅを、無菌化学分析装置中でフェロジンとＦｅ２＋との結合を抑制する能力について試験した。Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体に対して十分な吸光度を信号として得るために、非生理学的濃度のＦｅ２＋を選択してフェロジンと反応させた。そのため、Ｆｅ２＋をキレート化するように、ハーブ抽出物及び各成分を高濃度にした。同程度のＦｅ（フェロジン）３２＋錯体形成に対する投薬量に依存する阻害効果が、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６について観察された（図３）。図２に示す既知のＦｅ２＋キレート剤、ＤＦＯの投薬量に対する応答曲線から、ＤＦＯは、我々の分析装置ではＦｅ（フェロジン）３２＋錯体生成を抑制できることを示している。ギンコライドＡ及びＢ、並びにフラボノイド・ルチンを滴加した曲線は効果を示していないが、フラボノイド・クエルセチンは、Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体生成を抑制できている（図４）。２０−（ｓ）−プロトパナキサトリオールジンセノシドＲｇ１及びＲｅを除き、２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシドＲｂ１、Ｒｃ、及びＲｄも、フェロジンとＦｅ２＋との相互作用を抑制する能力を示した（図５）。ＳＪＷから分析される主な既知の生活性成分では、ヒペルフォリンを除き、ヒペリシンはＦｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制できる（図６）。纏めて考えると、これらのデータは、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６が、Ｆｅ２＋キレート剤として機能できる化学成分を明確に含んでいることを示唆している。しかし、各成分を、ハーブ抽出物におけるそれらの含有量を反映した濃度で試験した場合に、効果はほとんど認められず、抽出物の各成分が、Ｆｅ２＋の結合にたいして相乗的に寄与するか、或いは総合的に効果を表すことを示唆している。
【００３３】
［神経芽細胞腫の生存能力調査］
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｎ１Ｅ１１５、及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国）神経芽細胞腫細胞を、１０容量％のＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及びＭＥＭ非必須アミノ酸混合物を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２と９５％空気のもとに３７℃で継代培養することによって維持した。ほぼ８０％の集密度になったところで細胞を採取し、ハーブ抽出物又は純粋な化学成分、及び異なる量のＦＢＳを含有する９６−ウェルの培養プレート中に１×１０４細胞／ウェルで接種した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．０５％を超えないようにした。製造業者の示す仕様書に従って各試料ウェルにＷＳＴ−１細胞増殖試薬を添加し、９６時間後に細胞数に対する効果を評価した。細胞数は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１法を使用し、指示通りに判定した（Ｂａ Ｆ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＳＫ−Ｎ−ＳＨ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄ ２００３ Ｍａｒｃｈ １５；１２３（１）：１１〜２２）。伝統的なトリパンブルー排除法の細胞計数に比較した場合のＷＳＴ−１法の精度は、２つの方法の間に強い相関があることを示した。結果を参照試料との比較として示した。
【００３４】
すべての抽出物の効果を、通常（１０％）と低（２％）の両方の血清条件下において、５０μｇ／ｍＬで３種の神経芽細胞腫細胞系に対して比較した。結果を図７〜図９に示す。イチョウ含有抽出物ＧＢ、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６では、最も多くの図で細胞数の抑制を示している。具体的には、ＧＢは、ヒト神経芽細胞腫系ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（低血清及び通常血清）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ（低血清）で細胞数を抑制した。ＣＶＴ−Ｅ０３３は、対照的に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（低血清）及びハツカネズミ神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ１１５（低血清及び通常血清）で細胞数を有意に抑制し、ＣＶＴ−Ｅ０３６は、低血清条件の３種すべての細胞系で、更に通常血清条件のＮ１Ｅ１１５で細胞数を抑制した。ＳＪＷの抽出物も、ＳＨ−ＳＹ５Ｙでは低血清条件で、Ｎ１Ｅ１１５細胞では双方の条件で細胞数を抑制した。ＨＴ１００１は、細胞数に対して抑制効果をもたず、高血清条件下のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に細胞数の小さな刺激を生み出した。Ｆｅ２＋キレート剤ＤＦＯは、また、Ｎ１Ｅ１１５細胞で神経芽細胞腫の細胞数を抑制する（図１０）が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では二相の効果を発揮している。
【００３５】
個々の成分を、抽出物中における比率を反映した濃度で分析した場合には、いずれの細胞系においても、細胞数に対する有意な効果は観察されなかった。化合物の若干の部分は、濾過中に失われていると推測されるので、投薬量に対する応答曲線は、ハツカネズミモデル（Ｎ１Ｅ１１５）及びヒト神経芽細胞腫モデル（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）の双方ですべての成分に対して作図した。ＧＢ抽出物、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６が含むギンコライド（Ａ及びＢ）と、ＳＪＷ中が付加的に含むフラボノイド（クエルセチン及びルチン）との投薬量に対する応答曲線を図１１（Ｎ１Ｅ１１５細胞）及び図１２（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に示す。クエルセチンのみが、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びマウスＮ１Ｅ１１５細胞系の双方において、５μｇ／ｍＬで初めて明らかな有意性（Ｐ＜０．０５）で細胞数のかなりの抑制効果を示した。ジンセノシド及びヒペルフォリンに関する結果を示す図１３（Ｎ１Ｅ１１５細胞）及び図１４（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）によれば、ヒペルフォリンのみが、双方の細胞系で、投薬量にかなり依存する細胞数の抑制効果を示すことを表している。
【００３６】
［神経突起伸長性の調査］
ハツカネズミ神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ１１５を使用して、ハーブ抽出物ＨＴ１００１、ＧＢ、及びＣＶＴ−Ｅ００３の神経突起伸長に対する効果を調査した。Ｎ１Ｅ１１５細胞を、１０容量％ＦＢＳ及び１容量％ＰＳＮ抗生物質を補充した３７℃のＤＭＥＭ中で、１００ｃｍ２の組織培養皿に接種し、維持した。次いで、細胞を機械的に取り出し、コラーゲンで被覆された組織培養皿に２×１０４細胞／皿の密度で塗り広げた。細胞突起成長は、ハーブ抽出物と共存させて培養した７日後又は１４日後に、細胞の代表的な細胞フィールドについて定量化した。各処理皿について２つの細胞フィールドを写真撮影し、神経突起伸長の程度を以下のように評点化した。
Ｓ１：細胞が伸びた状態になるか、或いは極めてわずかな神経突起が成長した状態。
Ｓ２：細胞本体から２つを超える小さな神経突起が伸びた状態。
Ｓ３：１つ又は２つの神経突起が、細胞本体直径の少なくとも２倍に成長した状態。
Ｓ４：２つを超える長い突起が存在する状態。
神経突起指標は以下の数１で計算した。
【００３７】
【数１】
【００３８】
ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＨＴ１００１、ＧＢの神経突起伸長に対する効果の纏めを図１５に示す。試験したすべてのハーブ抽出物は５０μｇ／ｍＬから、Ｎ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞からの神経突起伸長を同程度まで誘発する能力を示した。ＧＢ及びＨＴ１００１の効果は、投薬量に依存していた。ＧＢは、細胞死を誘導するが（細胞数に関する上記研究で支持されるように）、残存している細胞に対しては神経突起伸長を刺激することが観察された。
【００３９】
［統計的な解析］
特記しない限り、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）（スチューデント−ニューマン−クルーズ検定）を使用し、有意水準を０．０５に設定して有意差を判定した。すべての結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計的な解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ又はＳｉｇｍａＳｔａｔのグラフ及び統計ソフトウェアを使用して実施した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるＦｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制する能力に対するハーブ調合剤の効果を示す図である。細胞を、１×１０６細胞／ウェルで接種し、２４時間増殖させ、その後、０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４の存在下又は不在下でハーブ抽出物に４８時間曝露した。次いで、細胞膜を採取し、過酸化脂質を分析した。過酸化脂質の存在は、有色のＭＤＡ生成物の形成で示され、結果を参照試料との比較で表している。ハーブ調合剤を用いた場合は、未加工の吸光度値と対比すると＊Ｐ＜０．０５の有意差で参照試料と異なる。
【図２】ハーブ抽出物によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。種々のハーブ抽出物（図３）及び強力なＦｅ２＋キレート剤ＤＦＯ（図２）を、無菌化学分析装置の中で０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に指示された濃度で培養し、その後、色原体フェロジン（１ｍＭ、最終濃度）と共に培養した。適切な参照試料と比較した、試験試料の５６２ｎｍでの吸光度の結果を示している。
【図３】ハーブ抽出物によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図４】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。純粋な化学物質であるクエルセチン、ルチン、ギンコライドＡ及びギンコライドＢ（図４）、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ（図５）、並びにヒペリシン及びヒペルフォリン（図６）を、無菌化学分析装置中で０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に指示された濃度で培養し、その後、色原体フェロジン（１ｍＭ、最終濃度）と共に培養した。適切な参照試料と比較した、試験試料の５６２ｎｍでの吸光度の結果を示している。
【図５】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図６】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図７】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。種々のハーブ抽出物又は担持体そのもの（参照試料）を、低（２％）ＦＢＳ又は通常（１０％）ＦＢＳ中で培養した、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（図７）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（図８）及びＮ１Ｅ１１５（図９）細胞と共に５０μｇ／ｍＬで培養した。Ｆｅ２＋キレート剤ＤＦＯの細胞数に対する効果も、Ｎ１Ｅ１１５（固形シンボル）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ（非定形シンボル）細胞（図１０）の双方について調査した。生存細胞数は、試薬ＷＳＴ−１を使用して判定した。細胞数の抑制効果の有意性は＊Ｐ＜０．０５又は＊＊Ｐ＜０．００１で判定し、細胞数への刺激性は同一血清条件の参照試料に対する有意性＃Ｐ＜０．０５で判定している。
【図８】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図９】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図１０】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図１１】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。ギンコライドＡ（ＧＡ）及びＢ（ＧＢ）並びにフラボノイドであるルチン及びクエルセチン（Ｑ）（図１１、図１２）、或いはヒペルフォリン又はジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅ（図１３、図１４）、或いは担持体そのもの（参照試料）を、培養したＮ１Ｅ１１５（図１１、図１３）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（図１２、図１４）細胞と共に図に示す濃度で９６時間培養した。生存細胞数は、試薬ＷＳＴ−１を使用して判定した。有意性は、参照試料に対して有意性＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１で判定している。
【図１２】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１３】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１４】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１５】ハーブ抽出物のＮ１Ｅ１１５の神経突起伸長に対する投薬量に依存する効果を示す図である。ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＨＴ１００１、及びＧＢを、培養したＮ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞と共に図に示す濃度で７日間培養し、神経突起伸長評点を判定した。参照試料に対する有意性は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１で判定している。
【背景技術】
【０００１】
幾多の世紀に渡って、多種多様な神経症や軽病に対応するための漢方薬には、薬用ニンジン、イチョウ（Ｇｉｎｋｏ ｂｉｌｏｂａ）（ＧＢ）、及び西洋オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒｕｍ、ＳＪＷ）を有効活用してきた。最近のメタアナリシスは、ＧＢ抽出物が備える、認知、気分や感情の機能、痴呆の治療に向けたクオリティオブライフ（生活の質）に対する副作用のない有効性に言及してきた。しかし、より大規模な臨床試験の必要性が強調されている［Ｂｉｒｋｓ Ｊ，Ｇｒｉｍｌｅｙ ＥＶ，ｖａｎ ＤＭ「Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｆｏｒ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ」Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ ２００２；（４）：ＣＤ００３１２０］。同様に、北米薬用ニンジン（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）抽出物についても、記憶力を改善し［Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｈｕａｎｇ ＢＨ，Ｂａ Ｆ，Ｌｉ ＦＬ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ，Ｇｒｅｅｎｓｈａｗ ＡＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｍｎｅｓｉａ ｉｎ ａ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔａｓｋ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２４（５）：４４２〜５２］、その成分ジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１は、神経保護効果を発揮する［Ｒｕｄａｋｅｗｉｃｈ Ｍ，Ｂａ Ｆ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ（１）ａｎｄ Ｒｇ（１）」Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ２００１ Ａｕｇｕｓｔ；６７（６）：５３３〜７］ことが報告されている。薬用ニンジンの有益な特性は、そのサポニン含有物、集約してジンセノシドと呼ばれているダンマラントリテルペングルコシドの混合物に起因すると考えられる。ある種のジンセノシドは単離されており、その構造が決定されている。このようなジンセノシドには、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇが含まれている（特許文献１参照）。最近のメタアナリシスによれば、ドイツでは軽症及び中等症鬱病の治療に関して承認されているＳＪＷは、合成抗鬱薬に較べて明らかに優れた結果を示しており、副作用の面からもより好ましいとされている。［Ｒｏｄｅｒ Ｃ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｍ，Ｌｅｕｃｈｔ Ｓ「Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｄ ｔｏ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ Ｗｏｒｔ」Ｆｏｒｔｓｃｈｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ ２００４ Ｊｕｌｙ；７２（６）：３３０〜４３］。
【０００２】
酸化的ストレスは、種々の神経学的病理に関連しており、それゆえ、ＧＢ、北米薬用ニンジン、及びＳＪＷ抽出物の効果の若干は、それらの固有の抗酸化作用に起因している可能性がある。ＧＢ及びＳＪＷ中に含まれる主な生理的に活性な成分であることが知られているフラボノイドは、脂質の過酸化防止、フリーラジカルの除去、及びＦｅ２＋のキレート化をはじめとする抗酸化作用を有することがわかっている［Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ ＣＡ，Ｍｉｌｌｅｒ ＮＪ，Ｐａｇａｎｇａ Ｇ「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９６；２０（７）：９３３〜５６；Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９；Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２］。
【０００３】
また、抗酸化作用は、ジンセノシド、Ｒｂ１及びＲｇ３については［Ｋｉｍ ＹＣ，Ｋｉｍ ＳＲ，Ｍａｒｋｅｌｏｎｉｓ ＧＪ，Ｏｈ ＴＨ「Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ１ ａｎｄ Ｒｇ３ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ １９９８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５；５３（４）：４２６〜３２；Ｌｉｍ ＪＨ，Ｗｅｎ ＴＣ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ｊ，Ｍａｅｄａ Ｎ，Ｐｅｎｇ Ｈ，Ａｂｕｒａｙａ Ｊ，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ，Ｓａｋａｎａｋａ Ｍ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ１，ａ ｍａｉｎ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｇ ｒｏｏｔ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ １９９７ Ｊｕｌｙ；２８（３）：１９１〜２００］に、ＳＪＷ抽出物については［Ｊａｎｇ ＭＨ，Ｌｅｅ ＴＨ，Ｓｈｉｎ ＭＣ，Ｂａｈｎ ＧＨ，Ｋｉｍ ＪＷ，Ｓｈｉｎ ＤＨ，Ｋｉｍ ＥＨ，Ｋｉｍ ＣＪ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌｉｎｎ（Ｓｔ，Ｊｏｈｎ’ｓ ｗｏｒｔ）ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ２００２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３０；３２９（２）：１７７〜８０］に記載されている。Ｆｅ２＋のキレート化に伴う抗酸化作用により細胞を保護する効果を発揮する抽出物は、使用されるモデルの状態及びその性質に応じて、増殖抑制効果／アポトーシス促進効果を示すとの仮説を立てることができる。Ｆｅ２＋は、細胞の増殖にとって決定的に重要な要素なので、新生細胞のＦｅ２＋に対する要求は大きい。Ｆｅ２＋キレート剤の抗癌作用は、また、神経芽細胞腫をはじめとする種々の病理に対して臨床例が報告されている［Ｄｏｎｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａ，Ｄｅｂ Ｇ，Ｄｅ ＳＬ，Ｃｏｚｚａ Ｒ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ Ａ「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９６；９５（１）：６６〜９］。それらの明らかにされた増殖抑制効果［Ｒｅｎｔｏｎ ＦＪ，Ｊｅｉｔｎｅｒ ＴＭ「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９６ Ｊｕｌｙ １４；５１（１１）：１５５３〜６１］に加えて、Ｆｅ２＋キレート剤は、また、アポトーシスを誘発し［Ｆａｎ Ｌ，Ｉｙｅｒ Ｊ，Ｚｈｕ Ｓ，Ｆｒｉｃｋ ＫＫ，Ｗａｄａ ＲＫ，Ｅｓｋｅｎａｚｉ ＡＥ，Ｂｅｒｇ ＰＥ，Ｉｋｅｇａｋｉ Ｎ，Ｋｅｎｎｅｔｔ ＲＨ，Ｆｒａｎｔｚ ＣＮ「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｍｙｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１ Ｍａｒｃｈ １；６１（３）：１０７３〜９］、且つ、胎児性癌腫Ｆ９を含むいくつかの腫瘍系における細胞の分別化を促進する［Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｍｕｔｏ Ｎ，Ｉｄｏ Ｙ，Ｉｔｏｈ Ｎ，Ｔａｎａｋａ Ｋ「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７ Ｊｕｌｙ ５；１３５７（１）：９１〜７］。
【０００４】
最近、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）の治療で使用されている、特許製品である北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１とＧＢとを含む特異な抽出物配合製品（ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＡＤ−ｆＸ（登録商標）、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州）に関する試験的な研究では、これらが、認知問題を含むＡＤＨＤ症候を改善する可能性があることを示唆している［Ｌｙｏｎ ＭＲ，Ｃｌｉｎｅ ＪＣ，Ｔｏｔｏｓｙ ｄｅ ＺＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ Ｐ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ Ｃ「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂａｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ ａｎｄ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｏｎ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ａ ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００１ Ｊｕｎｅ；２６（３）：２２１〜８］。この研究は、北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷの神経保護／神経向性及び抗酸化作用に関する報告に止まらず、それぞれの物質とそれらの組み合わせ、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６（Ｍｅｎｔａ−ｆＸ（登録商標）；ＧＢ、北米薬用ニンジン、及びＳＪＷ）の作用機構に関する研究を促進することになった。
【０００５】
特許文献２及び特許文献３は、従来技術による抽出物に触れている。特許文献２及び特許文献３が開示している内容は、本出願でも引用している。特許文献２は、ジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１が、大脳皮質及び海馬領域におけるＡＣｈのアベイラビリティを高め、アルツハイマー型老人性痴呆の症状を軽減することを開示している。該特許は、また、ジンセノシドＲｂ１の単離方法を開示している。特許文献３は、薬用ニンジンに由来する医薬組成物、及び各種の脳の健康状態又は病気の治療方法、加えて鬱又は一般的認知の改善を開示している。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４１５７８９４号
【特許文献２】米国特許第５１３７８７８号
【特許文献３】米国特許第６０８３９３２号
【０００７】
［発明の効果］
本発明者らは、北米薬用ニンジンの特定の抽出物、ＧＢ及びＳＪＷの抽出物、及びそれらの生理的に活性な成分である、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ；ギンコライドＡ及びＢ；フラボノイドのクエルセチン及びルチン；ヒペリシン及びヒペルフォリンは、抗酸化作用及び増殖抑制作用を有することを見出した。本発明者らがＨＴ１００１と呼び、約１５〜５０％、好ましくは約２５〜４０％の総ジンセノシド（サポニンとしても知られている）を含有する特定の薬用ニンジン抽出物は、抗酸化剤又は増殖抑制剤として単独で或いはＧＢ及び／又はＳＪＷと組み合わせて投与できる。
【０００８】
［発明を実施するための最良の形態］
本件発明者らは、専売品である北米薬用ニンジンの抽出物（ＨＴ１００１）は、単独或いはＧＢ及び／又はＳＪＷと組み合わせて、抗酸化作用及び抗癌作用を有することを見出した。試験の結果、化学成分であるギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンも抗酸化作用を有することを見出した。試験に供したハーブ抽出物及びそれらの組み合わせのすべてについて、Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制する能力、無菌化学分析装置内でＦｅ２＋をキレート化する能力、そして、ＧＢ及びＣＶＴ−Ｅ０３３（北米薬用ニンジン＋ＧＢ）の場合にはフリーラジカルの除去によって抗酸化作用が確認された。更に、Ｆｅ２＋キレート剤の示す挙動と同様、すべてのハーブ抽出物の増殖抑制効果及び／又は分別化促進効果が、いくつかの神経芽細胞腫モデルで立証された。
【０００９】
抗酸化作用は、すべての被試験ハーブ抽出物及びそれらの化学成分のいくつかに見られた。ＣＶＴ−Ｅ０３３（北米薬用ニンジン＋ＧＢ）及びＣＶＴ−Ｅ０３６（北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷ）は、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５ＹにおいてＦｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制することがわかった。このことは、Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化をすべて個別に抑制するＨＴ１００１、ＧＢ、及びＳＪＷが寄与していると考えられる。ＧＢ（Ｒａｍａｓｓａｍｙ Ｃ，Ｇｉｒｂｅ Ｆ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ Ｙ、Ｃｏｓｔｅｎｔｉｎ Ｊ「Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＧｂ７６１ ｏｒ ｔｒｏｌｏｘ Ｃ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ／Ｆｅ２＋ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｔｙ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９３；１９（５）：３４１〜５０）、北米薬用ニンジン（Ｋｉｔｔｓ ＤＤ，Ｗｉｊｅｗｉｃｋｒｅｍｅ ＡＮ，Ｈｕ Ｃ「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２０３（１〜２）：１〜１０）、及びＳＪＷ（Ｚｏｕ Ｙ，Ｌｕ Ｙ，Ｗｅｉ Ｄ「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ−ｒｉｃｈ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ Ｌ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２００４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １１；５２（１６）：５０３２〜９）、及びフラボノイドの構成成分（Ｃｈｅｎ ＹＴ，Ｚｈｅｎｇ ＲＬ，Ｊｉａ ＺＫ，Ｊｕ Ｙ「Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｓ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９０；９（１）：１９〜２１）の抽出物は、脂質又はリポソームの過酸化を抑制することが報告されている。Ｆｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化は、フリーラジカルの除去又はＦｅ２＋のキレート化によって直接的に防止され得る。ＣＶＴ−Ｅ０３３は、適度のフリーラジカルの除去性を示したが、これは、検知可能な効果を有さない薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１よりはむしろ、かなりのフリーラジカルの除去性を備えるＧＢ成分抽出物によるものと考えられる。このことは、ＧＢ抽出物によるフリーラジカルの除去性に関する別の報告（Ｒａｍａｓｓａｍｙ Ｃ，Ｎａｕｄｉｎ Ｂ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ Ｙ，Ｃｌｏｓｔｒｅ Ｆ，Ｃｏｓｔｅｎｔｉｎ Ｊ「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｔｒａｃｔ（ＥＧｂ７６１） ａｎｄ ｔｒｏｌｏｘ Ｃ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｏｒ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｕｐｔａｋｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９２；４４（１２）：２３９５〜４０１）と一致している。更に、化学モデルでは、すべての抽出物が同程度までのＦｅ２＋のキレート化を示した。これら抽出物の純化学成分のいくつかに関する試験では、クエルセチン（Ｓｅｓｔｉｌｉ Ｐ，Ｇｕｉｄａｒｅｌｌｉ Ａ，Ｄａｃｈａ Ｍ，Ｃａｎｔｏｎｉ Ｏ「Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＤＮＡ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋａｇｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ：ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｖｅｒｓｕｓ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １９９８ Ａｕｇｕｓｔ １５；２５（２）：１９６〜２００に報告済み）、ヒペリシン、並びに２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシドＲｂ１、Ｒｃ、及びＲｄは、特異構造と効果との相関を暗示する、Ｆｅ２＋とキレートを形成する挙動を示し、２０−（ｓ）−プロトパナキサトリオールジンセノシドＲｇ１及びＲｅの効果は顕著でない。後の実施例で示すデータは、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６は、Ｆｅ２＋キレート剤として機能する可能性のある異なる化学的成分を有していることを示唆している。しかし、個々の成分をハーブ抽出物中におけるそれらの含有量を反映した濃度で試験すると、極めてわずかな効果しか示さないため、Ｆｅ２＋の固定は、抽出物の各成分の相乗効果、又は総合効果であると考えられる。
【００１０】
各種の神経芽細胞腫細胞系に対する増殖抑制効果及び／又は分別化促進効果は、すべての抽出物に観察された。すべてのハーブ調合剤がＦｅ２＋キレート剤の挙動を示したことは、これらが神経芽細胞腫中で抗癌特性及び増殖抑制特性を示した物質であることからすれば驚くべきことではない（Ｄｏｎｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａ，Ｄｅｂ Ｇ，Ｄｅ ＳＬ，Ｃｏｚｚａ Ｒ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ Ａ「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９６；９５（１）：６６〜９）。この研究で使用された神経芽細胞腫培養モデルでは、Ｆｅ２＋キレート形成に関連する神経保護（すなわち、生存促進）効果（血清欠乏モデル中で試験された）と増殖抑制効果／分別化促進効果との間におけるバランスは、後者よりと考えられる。試験した化学成分の中では、クエルセチン及びヒペルフォリンのみが、神経芽細胞腫の細胞数の抑制を示している。ヒペルフォリン（Ｄｏｎａ Ｍ，Ｄｅｌｌ’Ａｉｃａ Ｉ，Ｐｅｚｚａｔｏ Ｅ，Ｓａｒｔｏｒ Ｌ，Ｃａｌａｂｒｅｓｅ Ｆ，Ｄｅｌｌａ ＢＭ，Ｄｏｎｅｌｌａ−Ｄｅａｎａ Ａ，Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ Ｇ，Ｂｏｒｓａｒｉｎｉ Ａ，Ｃａｎｉａｔｏ Ｒ，Ｇａｒｂｉｓａ Ｓ「Ｈｙｐｅｒｆｏｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ １；６４（１７）：６２２５〜３２）、ＧＢ、及び一部のフラボノイドは、他の新生物モデルでは増殖抑制効果／アポトーシス促進効果を発揮することが報告されている（Ｈｕａｎｇ ＹＴ，Ｈｗａｎｇ ＪＪ，Ｌｅｅ ＰＰ，Ｋｅ ＦＣ，Ｈｕａｎｇ ＪＨ，Ｈｕａｎｇ ＣＪ，Ｋａｎｄａｓｗａｍｉ Ｃ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ Ｅ Ｊｒ，Ｌｅｅ ＭＴ「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ａ４３１ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９９ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１２８（５）：９９９〜１０１０）。若干の特定ジンセノシドは、既にヒト白血病（ＴＨＰ−１）細胞をはじめとする種々の新生物モデルにおいて増殖抑制効果及びアポトーシス促進効果を発揮することがわかっているが（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＤＧ，Ｋｉｔｔｓ ＤＤ「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｅｘｉｓｔｓ ｆｏｒ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＴＨＰ−１）ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ」Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２００２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １；４０６（１）：１〜８）、この研究で試験されたジンセノシド（Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅ）では顕著でなかったことは、本明細書の結果と一致している。このことは、また、北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１が、単独では、神経芽細胞腫の細胞数抑制と関連していなかったという知見と一致している。ＨＴ１００１とＧＢの間には相乗効果が観察される。ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６は、双方とも、個々の材料と比較した場合、低血清条件（ストレス）下で細胞数を減少させる。ＣＶＴ−Ｅ０３６は、また、非ストレス条件下でこれを行なうことができる。本件発明者らが抽出物の組み合わせ中におけるそれらの比率を反映した濃度で個々の成分の効果を分析した際には、細胞数に対して有意な効果は観察されなかった（図９）。従って、該成分は相乗的に作用すると思われる。
【００１１】
また、Ｆｅ２＋キレート剤は、増殖抑制効果／アポトーシス促進効果の他に、細胞を分別化する効果を備えることが報告されている（Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｍｕｔｏ Ｎ，Ｉｔｏｈ Ｎ，Ｄｏｔａ Ａ，Ｎｉｓｈｉｎａ Ｙ，Ｉｎａｄａ Ａ， Ｔａｎａｋａ Ｋ「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｆ９ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｒｏｎ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ」Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；９０（２）：２１１〜２０）。この研究では、神経芽細胞腫を区別する指標を得るために、神経突起伸長の程度を定量化している。ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ及びＨＴ１００１のすべては、Ｎ１Ｅ１１５細胞に対して、かなりの神経突起伸長を同じ程度まで誘発することが見出された。ＧＢ抽出物は、高濃度で培養神経芽細胞中で細胞死を誘発することが観察されたが、生き残ったものは、極めて高度の神経突起伸長を示した。ＨＴ１００１は、神経芽細胞腫の細胞数を抑制せず、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では細胞数をわずかに増すことさえあったので、北米薬用ニンジン抽出物は、未知の機構を介して細胞の生き残りを高めること、及び分別化を起こすことの双方で作用する可能性がある。いくつかの薬用ニンジン粗抽出物、並びにジンセノシドＲｂ１及びＲｇ１は、神経突起伸長を直接的に促進するか、或いはＮ１Ｅ１１５細胞中での神経突起伸長に対して神経成長因子（ＮＧＦ）の刺激効果を増強することが既に示されている（Ｒｕｄａｋｅｗｉｃｈ Ｍ，Ｂａ Ｆ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ（１） ａｎｄ Ｒｇ（１）」Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ ２００１ Ａｕｇｕｓｔ；６７（６）：５３３〜７）。更に、ジンセノシドＲｂ１及びＲｂ３、並びにノトジンセノシドＲ４、６及びＦａ７も、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞中で神経突起伸長を促進する能力を示している（Ｚｏｕ Ｋ，Ｚｈｕ Ｓ，Ｍｅｓｅｌｈｙ ＭＲ，Ｔｏｈｄａ Ｃ，Ｃａｉ Ｓ，Ｋｏｍａｔｓｕ Ｋ「Ｄａｍｍａｒａｎｅ−ｔｙｐｅ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＳＫ−Ｎ−ＳＨ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ ２００２ Ｏｃｔｏｂｅｒ；６５（９）：１２８８〜９２）。
【００１２】
北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷの抽出物に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、且つ、神経向性と神経保護効果の両方について多数の報告がなされている。これらの効果の多くは、神経伝達物質系に対する特定の効果に帰することができ、抗酸化作用も、実質的な貢献要因である可能性がある。本件発明は、神経芽細胞腫に対する、５つの標準的なハーブと北米薬用ニンジン、ＧＢ、及びＳＪＷとの配合物の抗酸化作用、鉄キレート形成性、及び増殖抑制効果／分別化促進効果に関する。本件発明は、また、ジンセノシド（２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシド）がＦｅ２＋とキレートを形成する挙動を備えることを示し、特異構造と効果との相関を解明し、ＳＪＷ抽出物成分であるヒペリシンを提供する。被試験抽出物及びそれらが含む生物学的に活性な若干の純粋な化学成分がＦｅ２＋とキレートを形成する挙動は、神経芽細胞腫の悪性細胞系で観察される増殖抑制効果及び分別化促進効果の少なくとも一部分であると考えられる。
【００１３】
ＨＴ１００１の好ましい抽出法は、特許文献３に記載されている。この方法では、出発原料として乾燥、粉砕された３００ｋｇの薬用ニンジン粉末を使用する。必要に応じて、薬用ニンジンをフィッツミルに入れ、約８０メッシュまで粉砕してもよい。次いで、薬用ニンジンを、エタノールを使用する抽出工程に供する。濃度８５％のエタノールを使用することが望ましいが、当業者であれば通常の技術の範囲内で調整可能である。固形物：溶剤比は約１：５〜１：１０とするが、１：８が好ましい。抽出は、必要に応じて約１〜５時間行なう。好ましい抽出時間は、３時間である。抽出温度は、８０℃〜１０５℃の範囲とできるが、９０℃〜９５℃が好ましい。撹拌することが推奨される。液相と固相とは、排出ラインに２５ミクロンのインラインカートリッジフィルターを備えた、速度が約４２００ｒｐｍのデカンター遠心分離機を用いれば好ましく分離できる。
【００１４】
多数回の抽出を行なうのであれば、上澄み液を保管しておく。いずれにしても、上澄み液を濃縮工程に供してエタノールを回収する。真空蒸留法を用いることが好ましい。目標とする固形物含有量は、約１０°〜１２°（ブリックス）である。温度は、好ましくは約５０℃とし、１５インチＨｇ、２２０〜２２５ｋｇ／ｈの速度で供給する。濃縮を避けるためには、水を添加してもよい。
【００１５】
濃縮された抽出物は、フリーズドライ、オーブン乾燥、又はドラム乾燥してもよいが、好ましくは、約４２℃〜５８℃の温度とし、約２０ｋｇ／ｈで供給して噴霧乾燥するのが好ましい。入り口の温度は、好ましくは約１５０℃〜１７５℃であり、出口の温度は、好ましくは約７０℃〜９０℃である。乾燥したら、抽出物を粉砕し、塊があれば必要に応じて取り除く。０．０６５インチのスクリーンを取り付けたフィッツミルを使用するのが好ましい。次いで、抽出物をブレンドして約２０％の製品とすることが好ましい。
【００１６】
イチョウ抽出物は、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃａｌ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）などを通じて市場で入手できる。イチョウ葉の標準的な抽出物は、Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴが「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９）で論じているように、約２４％のイチョウフラボングリコシド及び約６％のテルペンラクトンを含有している。
【００１７】
西洋オトギリソウ抽出物は市場で入手でき、Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ等が「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２）中で論じているように、一般には、０．３％のヒペリシンを含有するものが標準品である。
【００１８】
特殊な薬用ニンジン抽出物であるＨＴ１００１は、ジンセノシド（サポニンとしても知られている）の総量で約１５〜５０％、好ましくは約２５〜４０％を含有し、単独で、又はＧＢ、ＳＪＷ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及び／又はヒペルフォリンと組み合わせて、抗酸化剤又は増殖抑制剤として投与できる。
【００１９】
本件発明に係る抗酸化剤又は増殖抑制剤は、経口、肺に送達するためのエアゾール又はその他のデバイス、鼻腔スプレー、静脈内、筋内、腹膜内、膣、直腸、及び局所若しくは経皮をはじめとする任意の好適な経路で投与できる。抗酸化剤又は増殖抑制剤を送達するための担持体として使用できる賦形剤は、当業者にとっては明らかである。例えば、抗酸化剤又は増殖抑制剤は、乾燥した形態でもよく、静脈注射による投与の直前に溶解してもよい。ＨＴ１００１を単独又はＢＢ、ＳＪＷ及び／又はそれらの活性成分と組み合わせた場合の好ましい投与手段は、経口又は静脈投与である。経口投与するのであれば、ＨＴ１００１は、好ましくは、１００ｍｇ入りのカプセルにする。ＣＶＴ−Ｅ０３３（ＨＴ１００１とＧＢとの組み合わせ）は、好ましくは、１２５ｍｇ入りのカプセルにする。ＣＶＴ−Ｅ０３６（ＨＴ１００１とＧＢの組み合わせ）は、好ましくは、３２５ｍｇ（ＳＪＷ：ＨＴ１００１：ＧＢ、２００ｍｇ：１００ｍｇ：２５ｍｇ）入りのカプセルにする。
【００２０】
好適なキャリア、希釈剤又は賦形剤は、医薬組成物の調製に関する技術分野では公知である。このような好適な希釈剤又は賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、アラビアガム、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コーン又はポテトデンプンなどのデンプン、ケイ酸、粘性パラフィン、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに限定はされない。医薬組成物は殺菌してもよく、必要に応じて滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩、緩衝剤、着色料、着香料及び／又は芳香性物質などの補助剤と混合できる。単独で投与する場合には、７５ｋｇの個体に対して、有効薬剤ＨＴ１００１を１日当り１０ｍｇ〜１０００ｍｇの投与量範囲で投与するのが好ましい。そして、１日当り７５ｍｇ〜５００ｍｇの投与量とするのがより好ましく、１日当り１００ｍｇ〜２００ｍｇの投与量とするのが最も好ましい。
【００２１】
本明細書中で「有効量」と言う場合は、ＨＴ１００１を、単独で、或いはＧＢ、ＳＪＷ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及び／又はヒペルフォリンと組み合わせて投与する量を含む。ＨＴ１００１を別の抗酸化剤又は増殖抑制剤と共に投与するのであれば、ＨＴ１００１の通常の有効量を削減できる。従って、用語「有効量」とは、その材料を組み合わせることが効果的であり、且つ各材料の投与量を比例的に低減できるその他の有効材料と組み合わせたＨＴ１００１の使用量を包むものと解釈する。例えば、ＨＴ１００１が、通常、１個体当り１日につき１００ｍｇ投与するのが効果的であり、イチョウが、通常、１個体当り１日につき１００ｍｇ投与するのが効果的であるなら、２種の材料を組み合わせて使用すれば、各々を１日につき個体当り５０ｍｇの投与にできる。このように組み合わせて使用すれば、多くの医薬がそうであるように、その他の有効材料（ＨＴ１００１以外の）が高価であるなら、消費者にとっては経済的である。
【００２２】
本件発明に係る組成物は、酸化的ストレス、鉄過剰症を治療し、且つ／又は神経突起伸長を促進するのに使用できる。酸化的ストレス及び鉄過剰症は、限定はされないが、癌、アルツハイマー病、結核、パーキンソン病、鎌状赤血球、ウィルソン病、肝損傷、βサラセミア、心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、感染症、新生物、心筋症、及び／又は関節症をはじめとする多くの健康状態及び疾患を引き起こす。特定細胞組織への鉄負荷は、疾患リスクの増大と関連している（Ｅｕｇｅｎｅ Ｄ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ「Ｉｒｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ」Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，Ｍａｙ〜Ｊｕｎｅ １９９９ ３４６〜３５２）。鉄は、フリーラジカルとして知られている物質が体内で傷害作用を刺激する酸化促進剤として作用する。各種細胞組織中での鉄過剰症と関連する疾患を、以下の表１に示す。
【００２３】
【表１】
【実施例】
【００２４】
［材料］
フェロジン、デスフェロキサミン（ＤＦＯ）、クエルセチン、ルチン、ギンコライドＡ、及びギンコライドＢは、Ｓｉｇｍａから入手した。すべての抽出物（ＨＴ１００１、ＧＢ、ＳＪＷ、ＣＶＴ−Ｅ０３３、及びＣＶＴ−Ｅ０３６）とその化学成分であるジンセノシド（Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅ）は、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州、カナダ）で調製し、精製した。北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１（ＲＥＭＥＭＢＥＲ−ｆＸ（登録商標））（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｈｕａｎｇ ＢＨ，Ｂａ Ｆ，Ｌｉ ＦＬ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ，Ｇｒｅｅｎｓｈａｗ ＡＪ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ａｍｅｒｉｃａｎ ｇｉｎｓｅｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｍｎｅｓｉａ ｉｎ ａ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔａｓｋ」Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２４（５）：４４２〜５２）、ＧＢ抽出物（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｍｏｒｌｅｙ Ｐ，Ｄｕｒｋｉｎ Ｊ，Ｓｈａｎ ＪＪ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ ａｓ ａ ｍｏｎｏａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅｓ」Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５２（４）：４５１〜９）及びＳＪＷ（Ｓｌｏｌｅｙ ＢＤ，Ｕｒｉｃｈｕｋ ＬＪ，Ｌｉｎｇ Ｌ，Ｇｕ ＬＤ，Ｃｏｕｔｔｓ ＲＴ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｓｈａｎ ＪＪ「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｓ」Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２０００；２１（１２）：１１４５〜５２）の化学同定結果は前述の通りである。ＣＶＴ−Ｅ０３３（ＡＤ−ｆＸ（登録商標）、ＨＴ１００１：ＧＢ抽出物が４：１（ｗ／ｗ））、及びＣＶＴ−Ｅ０３６（ＭＥＮＴＡ−ｆＸ（登録商標）、ＳＪＷの標準的な抽出物：ＨＴ１００１：ＧＢ抽出物が８：４：１（ｗ／ｗ））は、ＣｈｅｍＢｉｏＰｒｉｎｔ（商標）が組み合わせを標準化した製品であり、ＣＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能である。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬は、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．（Ｐｏｓｔｆａｃｈ、スイス）から購入した。細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｎａｄａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、オンタリオ州、カナダ）から購入した。その他のすべての化学試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、オンタリオ州、カナダ）又はＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州、カナダ）から購入した。水溶性ジンセノシドを除くすべての試料は、まずＤＭＳＯに溶解し、その後水で希釈して実験に用いた。
【００２５】
［脂質の過酸化抑制性の調査］
ハーブ抽出物が脂質の過酸化を抑制する能力を、Ｏｈｋａｗａらが開発したチオバルビツール酸分析法（Ｏｈｋａｗａ Ｈ，Ｏｈｉｓｈｉ Ｎ，Ｙａｇｉ Ｋ「Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７９ Ｊｕｌｙ；９５（２）：３５１〜８）、及びカテコールアミン作動性神経芽細胞腫の細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ大学、Ｐｅｔｅｒ Ｙｕ博士からの寛大な贈呈物）を使用して評価した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｖ／ｖ）及び１％抗生物質混合物（ペニシリン５０μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ；ＰＳＮ）を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にほぼ９０〜１００％の集密度になるまで維持した。次いで、それらを、６−ウェルのＮｕｎｃｌｏｎ組織培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで接種して２４時間増殖させ、その後、０．１ｍＭの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）の存在下又は不在下でハーブ抽出物に４８時間曝露した。次いで、細胞を採取し、使い捨てガラス培養チューブに入れ、遠心分離し、ペレットを０．４ｍＬの１．１５％塩化カリウム中に再懸濁し、超音波除膜器（ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）を用いて均一にした。次いで、３００μＬのアリコートを、テトラエトキシプロパンを参照基準品とし、Ｏｈｋａｗａらの方法を使用して脂質の過酸化物を分析した。残りの材料を用い、Ｌｏｗｒｙの方法を使用してタンパク質含有量を分析した。
【００２６】
０．１ｍＭのＦｅ２＋の存在下又は不在下での脂質の過酸化抑制に対するハーブ抽出物の効果を図１に示す。すべての試料が、Ｆｅ２＋存在下でのみ脂質の過酸化を有意（Ｐ＜０．０５）に抑制したが、Ｆｅ２＋の不在下では効果がなかった（データは示していない）。有効性は、ＧＢ＞ＳＪＷ＞ＣＶＴ−Ｅ０３３＝ＣＶＴ−Ｅ０３６＞ＨＴ１００１の順番であった。
【００２７】
［フリーラジカルの除去性の調査］
ハーブ抽出物及び純粋化学成分のヒドロキシルフリーラジカルの除去能力を、Ａｒｎａｏらが開発した動的な方法を応用して評価した（Ａｒｎａｏ ＭＢ，Ｃａｎｏ Ａ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｕｉｚ Ｊ，Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｆ，Ａｃｏｓｔａ Ｍ「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｆｏｏｄｓ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６ Ｊｕｎｅ １；２３６（２）：２５５〜６１）。簡潔に説明すると、ハーブ抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、過酸化水素と２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）とを混合し、２ｎＭの西洋ワサビ過酸化酵素で反応を開始させた。有色のＡＢＴＳラジカル（４０５ｎｍでの吸光度）の形成を防止する能力によって、試料のヒドロキシルラジカルの除去効果を推測した。各試料に関するフリーラジカルの除去性を、アスコルビン酸で作成した標準曲線と比較した。
【００２８】
抽出物ＧＢ、ＨＴ１００１、及びＣＶＴ−Ｅ０３３のフリーラジカルの除去能力を以下の表２に示す。ヒドロキシラジカルの除去効果を、過酸化酵素触媒として形成されるＡＢＴＳラジカルの形成を防止する能力から推測した。ＣＶＴ−Ｅ０３３、そしてより大きな程度でＧＢは、かなりのヒドロキシルラジカルの除去効果を示したが、ＨＴ１００１は、検知可能な効果を示していない。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２では、北米薬用ニンジン抽出物ＨＴ１００１、ＧＢ抽出物、及び組み合わせＣＶＴ−Ｅ０３３（ＨＴ１００１＋ＧＢ）によるフリーラジカルの除去性を調査している。具体的には、ハーブ抽出物を過酸化水素及びＡＢＴＳと共に培養し、西洋ワサビ過酸化酵素を添加して反応を開始した。そして、試料のヒドロキシルラジカルの除去効果を、有色のＡＢＴＳラジカルの形成を抑制する能力によって推測した（４０５ｎｍでの吸光度）。更に、各試料に関するフリーラジカルの除去性を、アスコルビン酸を用いて作成した標準曲線と比較し、重量％アスコルビン酸として表現している。
【００３１】
［Ｆｅ２＋とのキレート形成挙動の調査］
ハーブ抽出物又は純粋な化学成分が無菌分析装置内でＦｅ２＋をキレート化する能力を、以下に示すＦｅＳＯ４とＦｅ２＋キレートを形成する色素発生バクテリアであるフェロジンを培養して追跡し、有色のＦｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制する効果で評価した。フェロジンは、以前、フェリチンが放出する遊離Ｆｅ２＋の測定に活用されていた。試験対象であるすべてのハーブ抽出物及び純粋化学物質は、４％ＤＭＳＯ水溶液を用い、それぞれを５ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬで調製した。５０μＬのアリコートを、９６−ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で５０μＬの１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に室温で３０分間培養した。次いで、得られた５０μＬのアリコート溶液を、新たな９６−ウェルＭＴＰに移し、５０μＬの２ｍＭ（飽和濃度）フェロジン溶液と合わせた。ＨＴ１００１、ＧＢ、ＳＪＷ、ＣＶＴ−Ｅ０３３、及びＣＶＴ−Ｅ０３６を１．２５ｍｇ／ｍＬで試験し、純粋化学成分を５０μｇ／ｍＬ（最終濃度）で試験した。発色は瞬間的であり、５６２ｎｍで吸光度を読み取った。結果を参照試料との比較で表し、試料の効果を既知のＦｅ２＋キレート剤であるＤＦＯと比較した。ＤＭＳＯは、Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制できたので、試験抽出物及び化学成分毎にＤＭＳＯ参照試料と比較したパーセンテージで示した。
【００３２】
すべてのハーブ抽出物、及び純粋化学成分、ギンコライドＡ及びＢ、フラボノイドのクエルセチン及びルチン、ヒペルフォリン、ヒペリシン、並びに５種のジンセノシド、Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅを、無菌化学分析装置中でフェロジンとＦｅ２＋との結合を抑制する能力について試験した。Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体に対して十分な吸光度を信号として得るために、非生理学的濃度のＦｅ２＋を選択してフェロジンと反応させた。そのため、Ｆｅ２＋をキレート化するように、ハーブ抽出物及び各成分を高濃度にした。同程度のＦｅ（フェロジン）３２＋錯体形成に対する投薬量に依存する阻害効果が、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６について観察された（図３）。図２に示す既知のＦｅ２＋キレート剤、ＤＦＯの投薬量に対する応答曲線から、ＤＦＯは、我々の分析装置ではＦｅ（フェロジン）３２＋錯体生成を抑制できることを示している。ギンコライドＡ及びＢ、並びにフラボノイド・ルチンを滴加した曲線は効果を示していないが、フラボノイド・クエルセチンは、Ｆｅ（フェロジン）３２＋錯体生成を抑制できている（図４）。２０−（ｓ）−プロトパナキサトリオールジンセノシドＲｇ１及びＲｅを除き、２０−（ｓ）−プロトパナキサジオールジンセノシドＲｂ１、Ｒｃ、及びＲｄも、フェロジンとＦｅ２＋との相互作用を抑制する能力を示した（図５）。ＳＪＷから分析される主な既知の生活性成分では、ヒペルフォリンを除き、ヒペリシンはＦｅ（フェロジン）３２＋錯体の形成を抑制できる（図６）。纏めて考えると、これらのデータは、ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＧＢ、ＨＴ１００１、ＳＪＷ、及びＣＶＴ−Ｅ０３６が、Ｆｅ２＋キレート剤として機能できる化学成分を明確に含んでいることを示唆している。しかし、各成分を、ハーブ抽出物におけるそれらの含有量を反映した濃度で試験した場合に、効果はほとんど認められず、抽出物の各成分が、Ｆｅ２＋の結合にたいして相乗的に寄与するか、或いは総合的に効果を表すことを示唆している。
【００３３】
［神経芽細胞腫の生存能力調査］
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｎ１Ｅ１１５、及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国）神経芽細胞腫細胞を、１０容量％のＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及びＭＥＭ非必須アミノ酸混合物を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２と９５％空気のもとに３７℃で継代培養することによって維持した。ほぼ８０％の集密度になったところで細胞を採取し、ハーブ抽出物又は純粋な化学成分、及び異なる量のＦＢＳを含有する９６−ウェルの培養プレート中に１×１０４細胞／ウェルで接種した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．０５％を超えないようにした。製造業者の示す仕様書に従って各試料ウェルにＷＳＴ−１細胞増殖試薬を添加し、９６時間後に細胞数に対する効果を評価した。細胞数は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１法を使用し、指示通りに判定した（Ｂａ Ｆ，Ｐａｎｇ ＰＫ，Ｂｅｎｉｓｈｉｎ ＣＧ「Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＳＫ−Ｎ−ＳＨ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄ ２００３ Ｍａｒｃｈ １５；１２３（１）：１１〜２２）。伝統的なトリパンブルー排除法の細胞計数に比較した場合のＷＳＴ−１法の精度は、２つの方法の間に強い相関があることを示した。結果を参照試料との比較として示した。
【００３４】
すべての抽出物の効果を、通常（１０％）と低（２％）の両方の血清条件下において、５０μｇ／ｍＬで３種の神経芽細胞腫細胞系に対して比較した。結果を図７〜図９に示す。イチョウ含有抽出物ＧＢ、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６では、最も多くの図で細胞数の抑制を示している。具体的には、ＧＢは、ヒト神経芽細胞腫系ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（低血清及び通常血清）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ（低血清）で細胞数を抑制した。ＣＶＴ−Ｅ０３３は、対照的に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（低血清）及びハツカネズミ神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ１１５（低血清及び通常血清）で細胞数を有意に抑制し、ＣＶＴ−Ｅ０３６は、低血清条件の３種すべての細胞系で、更に通常血清条件のＮ１Ｅ１１５で細胞数を抑制した。ＳＪＷの抽出物も、ＳＨ−ＳＹ５Ｙでは低血清条件で、Ｎ１Ｅ１１５細胞では双方の条件で細胞数を抑制した。ＨＴ１００１は、細胞数に対して抑制効果をもたず、高血清条件下のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に細胞数の小さな刺激を生み出した。Ｆｅ２＋キレート剤ＤＦＯは、また、Ｎ１Ｅ１１５細胞で神経芽細胞腫の細胞数を抑制する（図１０）が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では二相の効果を発揮している。
【００３５】
個々の成分を、抽出物中における比率を反映した濃度で分析した場合には、いずれの細胞系においても、細胞数に対する有意な効果は観察されなかった。化合物の若干の部分は、濾過中に失われていると推測されるので、投薬量に対する応答曲線は、ハツカネズミモデル（Ｎ１Ｅ１１５）及びヒト神経芽細胞腫モデル（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）の双方ですべての成分に対して作図した。ＧＢ抽出物、ＣＶＴ−Ｅ０３３及びＣＶＴ−Ｅ０３６が含むギンコライド（Ａ及びＢ）と、ＳＪＷ中が付加的に含むフラボノイド（クエルセチン及びルチン）との投薬量に対する応答曲線を図１１（Ｎ１Ｅ１１５細胞）及び図１２（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に示す。クエルセチンのみが、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びマウスＮ１Ｅ１１５細胞系の双方において、５μｇ／ｍＬで初めて明らかな有意性（Ｐ＜０．０５）で細胞数のかなりの抑制効果を示した。ジンセノシド及びヒペルフォリンに関する結果を示す図１３（Ｎ１Ｅ１１５細胞）及び図１４（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）によれば、ヒペルフォリンのみが、双方の細胞系で、投薬量にかなり依存する細胞数の抑制効果を示すことを表している。
【００３６】
［神経突起伸長性の調査］
ハツカネズミ神経芽細胞腫細胞系Ｎ１Ｅ１１５を使用して、ハーブ抽出物ＨＴ１００１、ＧＢ、及びＣＶＴ−Ｅ００３の神経突起伸長に対する効果を調査した。Ｎ１Ｅ１１５細胞を、１０容量％ＦＢＳ及び１容量％ＰＳＮ抗生物質を補充した３７℃のＤＭＥＭ中で、１００ｃｍ２の組織培養皿に接種し、維持した。次いで、細胞を機械的に取り出し、コラーゲンで被覆された組織培養皿に２×１０４細胞／皿の密度で塗り広げた。細胞突起成長は、ハーブ抽出物と共存させて培養した７日後又は１４日後に、細胞の代表的な細胞フィールドについて定量化した。各処理皿について２つの細胞フィールドを写真撮影し、神経突起伸長の程度を以下のように評点化した。
Ｓ１：細胞が伸びた状態になるか、或いは極めてわずかな神経突起が成長した状態。
Ｓ２：細胞本体から２つを超える小さな神経突起が伸びた状態。
Ｓ３：１つ又は２つの神経突起が、細胞本体直径の少なくとも２倍に成長した状態。
Ｓ４：２つを超える長い突起が存在する状態。
神経突起指標は以下の数１で計算した。
【００３７】
【数１】
【００３８】
ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＨＴ１００１、ＧＢの神経突起伸長に対する効果の纏めを図１５に示す。試験したすべてのハーブ抽出物は５０μｇ／ｍＬから、Ｎ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞からの神経突起伸長を同程度まで誘発する能力を示した。ＧＢ及びＨＴ１００１の効果は、投薬量に依存していた。ＧＢは、細胞死を誘導するが（細胞数に関する上記研究で支持されるように）、残存している細胞に対しては神経突起伸長を刺激することが観察された。
【００３９】
［統計的な解析］
特記しない限り、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）（スチューデント−ニューマン−クルーズ検定）を使用し、有意水準を０．０５に設定して有意差を判定した。すべての結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計的な解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ又はＳｉｇｍａＳｔａｔのグラフ及び統計ソフトウェアを使用して実施した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるＦｅ２＋が触媒機能を果たす脂質の過酸化を抑制する能力に対するハーブ調合剤の効果を示す図である。細胞を、１×１０６細胞／ウェルで接種し、２４時間増殖させ、その後、０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４の存在下又は不在下でハーブ抽出物に４８時間曝露した。次いで、細胞膜を採取し、過酸化脂質を分析した。過酸化脂質の存在は、有色のＭＤＡ生成物の形成で示され、結果を参照試料との比較で表している。ハーブ調合剤を用いた場合は、未加工の吸光度値と対比すると＊Ｐ＜０．０５の有意差で参照試料と異なる。
【図２】ハーブ抽出物によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。種々のハーブ抽出物（図３）及び強力なＦｅ２＋キレート剤ＤＦＯ（図２）を、無菌化学分析装置の中で０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に指示された濃度で培養し、その後、色原体フェロジン（１ｍＭ、最終濃度）と共に培養した。適切な参照試料と比較した、試験試料の５６２ｎｍでの吸光度の結果を示している。
【図３】ハーブ抽出物によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図４】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。純粋な化学物質であるクエルセチン、ルチン、ギンコライドＡ及びギンコライドＢ（図４）、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ（図５）、並びにヒペリシン及びヒペルフォリン（図６）を、無菌化学分析装置中で０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液と共に指示された濃度で培養し、その後、色原体フェロジン（１ｍＭ、最終濃度）と共に培養した。適切な参照試料と比較した、試験試料の５６２ｎｍでの吸光度の結果を示している。
【図５】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図６】いくつかのハーブ抽出物中の純粋な化学成分によるＦｅ２＋とフェロジンとの相互作用の抑制効果を示す図である。
【図７】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。種々のハーブ抽出物又は担持体そのもの（参照試料）を、低（２％）ＦＢＳ又は通常（１０％）ＦＢＳ中で培養した、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（図７）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（図８）及びＮ１Ｅ１１５（図９）細胞と共に５０μｇ／ｍＬで培養した。Ｆｅ２＋キレート剤ＤＦＯの細胞数に対する効果も、Ｎ１Ｅ１１５（固形シンボル）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ（非定形シンボル）細胞（図１０）の双方について調査した。生存細胞数は、試薬ＷＳＴ−１を使用して判定した。細胞数の抑制効果の有意性は＊Ｐ＜０．０５又は＊＊Ｐ＜０．００１で判定し、細胞数への刺激性は同一血清条件の参照試料に対する有意性＃Ｐ＜０．０５で判定している。
【図８】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図９】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図１０】低血清及び通常血清条件での神経芽細胞腫の細胞増殖に対するハーブ抽出物の効果を示す図である。
【図１１】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。ギンコライドＡ（ＧＡ）及びＢ（ＧＢ）並びにフラボノイドであるルチン及びクエルセチン（Ｑ）（図１１、図１２）、或いはヒペルフォリン又はジンセノシドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅ（図１３、図１４）、或いは担持体そのもの（参照試料）を、培養したＮ１Ｅ１１５（図１１、図１３）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（図１２、図１４）細胞と共に図に示す濃度で９６時間培養した。生存細胞数は、試薬ＷＳＴ−１を使用して判定した。有意性は、参照試料に対して有意性＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１で判定している。
【図１２】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１３】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１４】ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、及びヒペルフォリンの神経芽細胞腫細胞に対する効果を示す図である。
【図１５】ハーブ抽出物のＮ１Ｅ１１５の神経突起伸長に対する投薬量に依存する効果を示す図である。ＣＶＴ−Ｅ０３３、ＨＴ１００１、及びＧＢを、培養したＮ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞と共に図に示す濃度で７日間培養し、神経突起伸長評点を判定した。参照試料に対する有意性は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１で判定している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ＨＴ１００１は、ジンセノシドの総含有量が約１５〜５０重量％の薬用ニンジン抽出物である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記薬剤がイチョウである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記薬剤が西洋オトギリソウである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
酸化的ストレスの治療方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して酸化的ストレスの低減に有効な量投与することを特徴とする酸化的ストレスの治療方法。
【請求項６】
前記酸化的ストレスが癌に起因するものである請求項５に記載の酸化的ストレスの治療方法。
【請求項７】
鉄過剰症の治療方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して鉄過剰を低減するのに有効な量投与することを特徴とする鉄過剰症の治療方法。
【請求項８】
前記鉄過剰症が、癌、アルツハイマー病、結核、パーキンソン病、鎌状赤血球、ウィルソン病、肝損傷、βサラセミア、心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、感染症、新生物、心筋症、又は関節症に起因するものである請求項７に記載の鉄過剰症の治療方法。
【請求項９】
神経突起伸長の促進方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して神経突起伸長を促進するのに有効な量投与することを特徴とする神経突起伸長の促進方法。
【請求項１】
イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記ＨＴ１００１は、ジンセノシドの総含有量が約１５〜５０重量％の薬用ニンジン抽出物である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記薬剤がイチョウである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記薬剤が西洋オトギリソウである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
酸化的ストレスの治療方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して酸化的ストレスの低減に有効な量投与することを特徴とする酸化的ストレスの治療方法。
【請求項６】
前記酸化的ストレスが癌に起因するものである請求項５に記載の酸化的ストレスの治療方法。
【請求項７】
鉄過剰症の治療方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して鉄過剰を低減するのに有効な量投与することを特徴とする鉄過剰症の治療方法。
【請求項８】
前記鉄過剰症が、癌、アルツハイマー病、結核、パーキンソン病、鎌状赤血球、ウィルソン病、肝損傷、βサラセミア、心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、感染症、新生物、心筋症、又は関節症に起因するものである請求項７に記載の鉄過剰症の治療方法。
【請求項９】
神経突起伸長の促進方法であって、イチョウ、西洋オトギリソウ、ギンコライド、フラボノイド、ジンセノシド、ヒペリシン、及びヒペルフォリンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤と組み合わせたＨＴ１００１を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に対して神経突起伸長を促進するのに有効な量投与することを特徴とする神経突起伸長の促進方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５１２６７５（Ｐ２００９−５１２６７５Ａ）
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６１４３（Ｐ２００８−５３６１４３）
【出願日】平成１８年１０月１６日（２００６．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００２８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４５９５９
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１２０６７３）エフエックス ライフ サイエンス インターナショナル ジーエムビーエイチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１６日（２００６．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００２８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４５９５９
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０８１２０６７３）エフエックス ライフ サイエンス インターナショナル ジーエムビーエイチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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