バイオセンサ
【課題】本発明は、精度がより向上されたバイオセンサを提供することを目的とする。
【解決手段】絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサを提供することにより解決する。
【解決手段】絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサを提供することにより解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量できるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体成分や食品中に含まれる特定成分を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量する方法として、次のようなバイオセンサが知られている。すなわち、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法によって作用極および対極からなる電極を形成し、さらに、絶縁層を形成した後、上記電極上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体からなる酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
基質を含む試料を酵素反応層上へ滴下すると、酵素反応層が溶解し、基質と酵素が反応して基質が酸化され、これに伴い電子伝達体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料中の基質濃度を求めるものである（特許文献１）。
【０００４】
バイオセンサに、疎水性の酵素を用いる場合や、測定対象物質が水に難溶性の場合、バイオセンサ内に界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤は、その他、試料の入りをよくするためや、電極表面に気泡を生じさせないためなどの様々な理由から、バイオセンサの構成成分として加えられることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、全血を試料とする従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でない場合があった。特に、界面活性剤を含んだ従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でなかった。
【０００７】
よって、本発明は、より精度が向上されたバイオセンサを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、上記課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサを提供することによって、解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。より詳しくは、試料としての全血の溶血を抑制することにより、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサの断面図である。
【図３】本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図４】図３のバイオセンサの断面図である。
【図５】実施例１および比較例１の全血中の中性脂肪濃度の測定結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１２】
１．本発明の第１
本発明の第１は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
【００１３】
２．本発明の第２
本発明の第２は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が、前記酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層が他方を含み、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
【００１４】
図１は、本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。
【００１５】
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサ外部を電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
【００１６】
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００１７】
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料（本発明においては、全血であるが、本明細書中「試料」と称することもある）に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
【００１８】
第１のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
【００１９】
続いて、図３は、本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。
【００２０】
図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１のバイオセンサと同様であるが、第１のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。換言すれば、本発明の第２のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素および電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれない。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、酸化還元酵素は含まれず、前記第二の反応層９に、酸化還元酵素が含まれば、電子伝達体が含まれない。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
【００２１】
第２のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
【００２２】
以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、本発明の第１のバイオセンサの構造と、本発明の第２のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）であるか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、本発明の第２のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料（本発明においては全血）が「０．１〜２０μｌ（好ましくは２μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。
【００２３】
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００２４】
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。
【００２５】
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４を含む。
【００２６】
本発明の電極は、試料（測定対象物）と、酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。
【００２７】
本発明においては、作用極２と対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
【００２８】
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
【００２９】
＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
【００３０】
＜試料供給部＞
上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を有する。
【００３１】
本発明の第１のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。
【００３２】
反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、さらに好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００３３】
一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有し、前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。
【００３４】
本発明の第２のバイオセンサのような反応層を２つとする形態においては、酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。
【００３５】
また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と、第二の反応層９との、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５〜１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｍである。０．０５ｍｍ未満であると、保存中に酸化還元酵素と、電子伝達体が接触する場合がある。また、１．５ｍｍを超えると、毛細管現象が起こりにくく、試料が反応層に吸引されない場合がある。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
【００３６】
（酸化還元酵素）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、酸化還元酵素を含む。酸化還元酵素は単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
【００３７】
酸化還元酵素としても特に制限はないが、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００３８】
または、酸化還元酵素として、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種などでもよい。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００３９】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなどが挙げられる。
【００４０】
補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。
【００４１】
補欠分子族としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む酸化還元酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００４２】
中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましい（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）。
【００４３】
ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は、バイオセンサの使用時において、試料中のグリセロールを酸化して電子伝達体を還元するという機能を有する補酵素結合型の酸化還元酵素である。ここで、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は溶液中の溶存酸素の影響を受けない。したがって、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を用いて還元型の電子伝達体の酸化電流を測定することにより、試料中のグリセロール濃度がより正確に測定されうる。
【００４４】
本発明に用いられる酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８−２２０３６７号公報参照）。
【００４５】
具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等が用いられうる。このような微生物の代表菌株としては、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が挙げられる。
【００４６】
上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０℃〜５０℃、好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００４８】
次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００４９】
なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００５０】
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素をさらに添加してもよい。かような酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。
【００５１】
ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、好ましくは１〜５００Ｕ、より好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、ＷＯ２００６／１０４０７７に記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５２】
また、酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ、より好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。また、酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５３】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明に用いられる酸化還元酵素は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に酸化還元酵素を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させる。それは、本発明においては、酸化還元酵素が電極に固着することが有意に防止されているからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。
【００５４】
（電子伝達体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。
【００５５】
電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。
【００５６】
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを好適に使用することができる。
【００５８】
電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、１〜２０００μｇ、好ましくは５〜１０００μｇ、より好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５９】
本発明の第２のバイオセンサおいては、電子伝達体は、酸化還元酵素と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、上記のように、第二の反応層９に酸化還元酵素を含ませることが好ましいからである。また、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれる。
【００６０】
（シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含む。
【００６１】
上記述べたとおり、本発明においてはシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。本発明においては、試料供給部に供給される試料が全血であるため、全血が溶血を引き起こすことがある。その場合、溶血によって、バイオセンサの精度に影響が与えられることがある。そして、全血によっても、溶血し易かったり、し難かったりすることがある。同じ人間の全血を使用する場合であっても、その日の体調等によって溶血し易かったり、し難かったりすることがある。
【００６２】
本発明においては、そのような事実があっても、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血が有意に抑制・防止され、ひいてはバイオセンサの精度がより向上する。換言すれば、本発明においては、供給される試料が、全血であるバイオセンサにおいて、溶血を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法も提供される。
【００６３】
本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の種類にも特に制限はない。シクロデキストリンとしては、α型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、γ-シクロデキストリンが特に好ましい。
【００６４】
また、シクロデキストリン誘導体としてもα型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体が好ましく、より好ましくはγ-シクロデキストリン誘導体である。なお、シクロデキストリン誘導体とは、例えば、アミノ体、トシル体、メチル体、プロピル体、モノアセチル体、トリアセチル体、ベンゾイル体、スルホニル体及びモノクロロトリアジニル体等の化学修飾体を意図したものである（無論、これらに限らない）。
【００６５】
例えば、シクロデキストリン誘導体としては、２−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２,６−ジ−Ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−α−シクロデキストリンモノ、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−Ｏ−トシル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２、３−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−オクチル)−α−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−α−シクロデキストリン、モノ［２，(３)−Ｏ−(カルボキシルメチル)］−α−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−α−シクロデキストリン、スクシニル−α−シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−メチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−エチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、（２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアミノ）プロピル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、ビス(６−アジド−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−β−シクロデキストリン、ヘキサキス［６−デオキシ−６−(１−イミダゾリル)］−β−シクロデキストリン、モノアセチル−β−シクロデキストリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、スクシニル−β−シクロデキストリン、スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、２−カルボキシエチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン、スルホプロピル−β−シクロデキストリン、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン、シリル[（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル）２，３−ジ−Ｏ−アセチル] −β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−メシチレンスルホニル−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，６−ジ−Ｏ−フェニル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−γ−シクロデキストリン、などが挙げられる。中でも、入手の容易さおよびコストの観点で、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンが好ましく、特に好ましくは２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６６】
また、本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体は、塩の形態で含有してもよい。かかる塩としても、特に制限はないが、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、硫酸塩などが好ましい。
【００６７】
シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、溶血を有意に抑制し、さらに反応層の溶解性を下げないという観点から１〜１０００μｇ、好ましくは５〜５００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇが含まれるとよい。より詳しくは、本発明においては、全血が１ｍｌに対して、好ましくは０．５〜５００ｍｇ、より好ましくは２．５〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは５〜５０ｍｇ含有されるとよい。
【００６８】
また、電子伝達体との対比で考えると、前記シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が、好ましくは電子伝達体１モルに対して０．０１〜０．８モル、より好ましくは０．０１〜０．５モル、さらに好ましくは０．０１〜０．２モルである。電子伝達体１モルに対して、０．８モルを超えて含有させてしまうと、バイオセンサに供給する試料へのなじみが悪くなる虞がある。このように有意に少量のシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させることによって、溶血の起因物質の１つと考えられる界面活性剤の溶血活性を有意に抑制する。なお、含有するシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方の量がこのように有意に少ないと、これらが電子伝達体を包接することはないと考えられる（しかも、電子伝達体として例えばフェリシアン化カリウムを使用した場合、溶解性の問題も生じないため包接させる意味もない）。
【００６９】
なお、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量について上記で述べたが、シクロデキストリンと、シクロデキストリン誘導体の組み合わせのように複数の種類を使用する場合は、その総量を意味する。
【００７０】
本発明においてシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させる意図は、溶血の防止を行うことによって、バイオセンサの精度をより向上させようとするものである。
【００７１】
なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７２】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよいが、好ましくは両方の層に含まれるのがよい。
【００７３】
なお、本発明の態のバイオセンサにおいては、その他の成分（界面活性剤、親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子、微粒子など）が、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれると好ましい。以下、説明する。
【００７４】
（界面活性剤）
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が、界面活性剤を有していてもよい。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の溶解が促進されうる。
【００７５】
しかしながら、本発明のように全血を試料とする場合、赤血球に含まれる成分が電子伝達体を還元するため、測定値に正誤差を与える場合がある。また、溶血により、血清中の測定対象物質が希釈されることにより、溶血の程度によって測定誤差が生じる場合がある。そして、その溶血の発生は、界面活性剤が存在すると顕著となる場合がある。
【００７６】
本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、解決することができることを見出した。なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血を抑制する機構は必ずしも明確ではないが、発明者らが考えるに、溶血の一因と考えられる界面活性剤の働きを抑制することによって、溶血を抑制するものと考えている。ただ、あくまで推測に過ぎず、かかるメカニズムによって本発明の技術的範囲が制限されることはない。
【００７７】
本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００７８】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００７９】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate；Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate；Tween 40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate；Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate；Tween 80）などが好ましい。中でも、酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］が好ましい。
【００８０】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有されると、試料溶液（全血）を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシド」よりも「アルキルチオグリコシド」が非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
【００８１】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
【００８２】
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８３】
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８４】
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８５】
上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０（花王製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。特に、溶解性の観点で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。
【００８６】
上記の界面活性剤のうち、本発明の第１のバイオセンサにおいては、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０が好ましく、中でも溶解性の観点から、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。
【００８７】
また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００８８】
より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、酸化還元酵素が含有されることが好ましいが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎなど）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、広がりや濡れ性の観点で考えると、界面活性剤の種類として、前記したアルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）を使用することが好ましい。ただし、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）は広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度を向上させるという利点を有する一方で、溶血を比較的誘発しやすい界面活性剤の部類に属する。この問題を解決するため、本発明においては、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。そのことによって、かような界面活性剤に起因する溶血を有意に抑制、防止し、ひいては、バイオセンサの精度を向上させる。なお、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）が溶血を誘発する可能性があるのであれば、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を、アルキルチオグリコシドを含む同一の反応層に含有させることが好ましいとも考えられる。ただ、上記も述べたが、同一の反応層に含有させると、シクロデキストリン・シクロデキストリン誘導体は、広がりや濡れ性の効果を抑制する虞があるため、敢えて、別の反応層に含有させてもよい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００８９】
界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。
【００９０】
界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。
【００９１】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００９２】
（親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、親水性高分子および膨潤性層状粘度鉱物粒子の少なくとも一方を含むと好ましい。
【００９３】
親水性高分子は、親水性高分子は酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。
【００９４】
本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９５】
なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００９６】
膨潤性層状粘度鉱物粒子も親水性高分子と同様に酸化還元酵素や電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。
【００９７】
本発明者らは、より精度が向上されたバイオセンサを提供すべく鋭意検討を行っていたところ、電子伝達体については、従来の親水性高分子で固定するよりも膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定する方が、より均一に固定化することができることを見出した。固定化が不十分であると、試料が供給された後も反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）における溶解性が不十分となり、測定にバラツキが生じる虞がある。よって、電子伝達体については、膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定することによって、固定化が均一となり、電流値のバラツキを抑え、ひいては、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。
【００９８】
本発明に用いることができる膨潤性層状粘度鉱物粒子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、スメクタイト、ベントナイト、合成フッ素雲母、バーミキュライトなどが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、スメクタイトが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。これらは、市販のものを購入することなどにより準備することができ、例えば、スメクタイトとしては、ルーセンタイト（商品名）などが好ましい。
【００９９】
なお、このような膨潤性層状粘度鉱物粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を下げず、且つ電子伝達体を均一に保持できるという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。膨潤性層状粘度鉱物粒子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１００】
親水性高分子・膨潤性層状粘度鉱物粒子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、上記の通り、好ましくは、第一の反応層８に電子伝達体が含まれるため、膨潤性層状粘度鉱物粒子も電子伝達体が含まれる第一の反応層８に含有させることが好ましい。一方で、好ましくは、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれるため、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。なお、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれる場合、固定化の効果を勘案すると、膨潤性層状粘度鉱物粒子よりも親水性高分子が好ましい。そして、この場合、親水性高分子の溶解性を考慮すると、後述する微粒子を含有させることが好ましい。
【０１０１】
上記の通り、本発明の第２のバイオセンサのように２つの反応層を有する形態において、各反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させるそれぞれの成分に応じて固定化剤を使い分けることも大きな特徴と言える。
【０１０２】
（微粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、微粒子を含むと好ましい。微粒子は、ブラウン運動をするため、拡散、攪拌の役割もある。
【０１０３】
このように、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料溶液（全血）の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酸化還元酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。より具体的には、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に親水性高分子が含有される場合、親水性高分子は難溶解性であるという性質を有する場合があるが、微粒子を添加することによってその問題を解決できる。
【０１０４】
本発明の微粒子としては、特に制限はなく、高分子・低分子を問わず、従来公知のものを使用することができる。ただ、本発明において使用される微粒子は、電解を起こす不純物を含まず、電気化学的に不活性であるものであると好ましい。また、本発明において使用される微粒子は、水に対して不溶もしくは難溶性であることが好ましい。
【０１０５】
より具体的には、微粒子としては、高分子化合物、無機化合物、金属酸化物、炭酸塩などが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１０６】
さらに具体的には、高分子化合物としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１０７】
前記スチレン誘導体を含む重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン、アルキルスチレンなどが挙げられる。
【０１０８】
その他、ポリアミドも例示される。また、例えば、ポリウレタン、ポリウレアなどのウレタン化合物、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン系化合物などが挙げられる。
【０１０９】
無機化合物としては、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラスやエーライトなどに代表されるセラミックスなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１０】
金属酸化物としては、ラテックス球、ダイヤモンド粉末、酸化チタンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１１】
炭酸塩としては、炭酸カルシウムが挙げられる。
【０１１２】
その他、本発明の微粒子としては、ポリマーでコートした金、微細セルロース粉末、微細結晶セルロース粉体なども使用することができる。
【０１１３】
なお、本発明の微粒子は、表面の特性を変化させてもよい。具体的には、微粒子表面に、カルボキシル基やアミノ基を導入してもよい。カルボキシル基やアミノ基を導入する方法は、従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて行うことができ、あるいは、市販品を購入してもよい。このように、カルボキシル基やアミノ基を導入することにより、電荷を有するため、試料中に含まれる不純物（血球など）と吸着し、不純物による感度低下を抑制する効果を有する場合もある。
【０１１４】
微粒子の平均粒径は、特に制限はないが、０．１〜２０μｍであることが好ましい。０．１μｍ未満では、微粒子が小さすぎるため、本発明の効果が得られない場合がある。また、２０μｍより大きいと、微粒子が沈殿し、電極表面に付着する可能性がある。０．１〜１５μｍであることがより好ましく、０．１〜１０μｍであることがさらに好ましい。
【０１１５】
なお、平均粒径は、例えば、ＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察により測定することができる。上記でいう平均粒径は、粒子の形状が一様でない場合もあるため、絶対最大長で表すものとする。ここで、絶対最大長とは、単結合体の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の長さＬの平均をとるものとする。なお、値は１０個から求めた平均値とする。
【０１１６】
なお、このような微粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を向上させるという観点から、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．１〜５００μｇであり、特に好ましくは１〜５０μｇである。
【０１１７】
本発明の第２のバイオセンサにおいては、微粒子は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよい。例えば、第一の反応層８に膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれず、親水性高分子が含まれ、第二の反応層９に親水性高分子が含まれる場合、両方に含まれることが好ましい。このように、両方の反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。また、第一の反応層８に電子伝達体と膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれ、親水性高分子が含まれず、第二の反応層９に酸化還元酵素と親水性高分子が含まれる場合、好ましくは第二の反応層９にのみ含まれる。それは、微粒子が存在しなくても、膨潤性層状粘度鉱物粒子は、電子伝達体を均一に固定し、且つ均一に溶解させることができるからである。
【０１１８】
＜バイオセンサの製造方法＞
（本発明の第１のバイオセンサ）
本発明の第１のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１１９】
酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤を含有させてもよい。界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、微粒子など）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。
【０１２０】
（本発明の第２のバイオセンサ）
本発明の第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１２１】
第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）と、膨潤性層状粘度鉱物粒子（例えば、スメクタイト）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。なお、界面活性剤を含有させてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。
【０１２２】
一方で、第二の反応層９については、例えば酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）と、親水性高分子（例えば、カルボキシメチルセルロース）と、微粒子（例えば、ポリスチレンビーズ）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。なお、界面活性剤が含まれてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。
【０１２３】
最後に、第二の反応層９が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第２のバイオセンサを製造することができる。
【０１２４】
＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、全血である。
【０１２５】
なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。
【０１２６】
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
【０１２７】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
【０１２８】
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。
【０１２９】
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【０１３０】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【０１３１】
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【０１３２】
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、
使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人
体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用
できる。
【０１３３】
本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。
【０１３４】
本発明の効果を以下に纏める。
【０１３５】
本発明のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素が含まれる反応層に、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が含有されるため、溶血が有意に抑制・防止され、赤血球に含まれる成分に基づく電子伝達体の還元を抑制・防止し、測定値に正誤差を与えない。加えて、血清中の測定対象物質を希釈しないようにし、測定誤差が生じさせない。そのことによって、バイオセンサの精度がより向上する。
【実施例】
【０１３６】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【０１３７】
＜応答電流値の測定１（全血中の中性脂肪濃度の測定）＞
応答電流値の測定１は、本発明の第２のバイオセンサ（つまり、反応層が２つの形態）を作製し、シクロデキストリンの添加の有無によって、中性脂肪測定用バイオセンサとしての精度を観察した。
【０１３８】
（実施例１）
電極として、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、金からなる作用極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１を形成した。
【０１３９】
まず、第二の反応層９（酵素層）は以下の手順で形成した。
【０１４０】
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を２．５Ｕ、リポプロテインリパーゼ（天野エンザイム製）を８０Ｕ、粒径０．５μｍのポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を０．６２５％（１２．５μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を１．５％（３０μｇ）、ＣＨＡＰＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ製）を０．０５％（１μｇ）、カルボキシメチルセルロースを０．１％（２μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）になるように混合し酵素溶液を得た。得られた酵素溶液を、ＥＲ−Ｎの作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、および対極作用部分４−１を被覆するように滴下し、４０℃で１０分間乾燥させ、第一の反応層（酵素層）を得た。
【０１４１】
第一の反応層８（電子伝達体層）は以下の手順で形成した。
【０１４２】
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、フェリシアン化カリウム（和光純薬製）を２００ｍＭ（１３２μｇ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．１％（２μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を０．１％（２μｇ）、膨潤性層状粘度鉱物粒子ルーセンタイトＳＷＮ（コープケミカル製）を０．０５％（１μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）、エタノールを５０％（１ｍｇ）になるように混合し、電子伝達体溶液を得た。得られた電子伝達体溶液を、ＰＥＴからなるカバー７に接着剤（両面テープ）６ａを貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層８（電子伝達体層）を形成した。
【０１４３】
第二の反応層９が形成されている基板と、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａ、６ｂと、を互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚みはそれぞれ５μｍであり、離隔距離は０．１５ｍｍであった。
【０１４４】
試料液（全血）２μｌを吸入させてから５５秒後に、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に５００ｍＶの電位を印加し、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。
【０１４５】
中性脂肪濃度が異なる４人の全血（１２１、１３１、２０４、３３６ｍｇ／ｄｌ）を試料として、４回測定を行った。結果を表１および図５に示す。
【０１４６】
（比較例１）
γ−シクロデキストリンを蒸留水に変更した以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。その結果を、表１および図５に示す。
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
表１および図５からわかるように、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を含んでいる実施例の方が、全体的な電流値が低く、またどの全血においてもばらつきが少ないことがわかる。これは、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を加えることにより、血液中の赤血球の溶血反応を防止しているためであると考えられる。
【０１４９】
＜溶血防止効果確認＞
溶血防止効果確認は、γ−シクロデキストリンの添加における溶血防止の程度を測定するため、簡易な測定系（電極反応層内の反応をチューブ内で実施）を用いて評価を行った。なお、本測定系は、実際の電極系にも適用可能である。また、界面活性剤の溶血作用およびγ−シクロデキストリンの溶血防止効果を明確にするため、酸化還元酵素は入れないこととし、試料として全血を使用した。
【０１５０】
（実施例２）
１．５ｍｌのプラスチックチューブに、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を溶媒とした８００ｍＭ フェリシアン化カリウム（和光純薬製）溶液を５μｌ（１３２０μｇ）、３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を２μｌ（６０μｇ）、１０％ γ−シクロデキストリン溶液を２μｌ（２００μｇ）を添加し混合することによって反応溶液（９μｌ）を得た。
【０１５１】
得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、電極（ＥＲ−Ｎ、バイオデバイステクノロジー製）を用いて、電極の各作用部分を覆うように反応溶液３μｌを滴下・塗布し、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に＋５００ｍＶの電位を印加して、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち溶血の度合いに対応している。
【０１５２】
溶血測定を行った結果を表２に示す。
【０１５３】
併せて、目視による溶血の評価を行った。
【０１５４】
上記と同様の手順によって反応溶液を調製した。得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、１．５ｍｌプラスチックチューブを１，５００×ｇで５分間遠心し、上清の色を目視により評価した。評価基準として、溶血が見られなかったものを○、若干の溶血が認められたものを△、明らかに溶血していたものを×として評価した。溶血が起こると、赤血球中の成分が溶出して反応液中のフェリシアン化カリウム（酸化型電子伝達体）と反応し、フェロシアン化カリウム（還元型電子伝達体）を生成する。電極にてフェロシアン化カリウムを酸化することによって得られる酸化電流値は、すなわち、反応液中でどれくらい溶血したかの指標になり、電流値の大きさに比例して溶血も多く起こっていると考えることができる。結果を表２に示す。
【０１５５】
（実施例３）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、５％ ＣＨＡＰＳ溶液に変更した以外（１００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５６】
（実施例４）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド溶液に変更した以外（２０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５７】
（実施例５）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、２％ オクチルチオグルコシド溶液に変更した以外（４０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５８】
（実施例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５９】
（実施例７）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例３と同様の方法で測定した。
【０１６０】
（実施例８）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例４と同様の方法で測定した。
【０１６１】
（実施例９）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例５と同様の方法で測定した。
【０１６２】
（比較例２）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１６３】
（比較例３）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例３と同様の方法で測定した。
【０１６４】
（比較例４）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例４と同様の方法で測定した。
【０１６５】
（比較例５）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例５と同様の方法で測定した。
【０１６６】
（比較例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更し、３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定し、「ブランク」として示す。ブランクは、溶血していない基準となるサンプルである。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
表２の目視評価および電流値評価より、４種の界面活性剤のみでは溶血が起こり、電流値がブランクより上昇している。しかし、終濃度で１％のγ−シクロデキストリンまたは２−ＨＰ−γ−シクロデキストリンを添加すると、溶血が抑えられることで、電流値の上昇が抑制され、ブランクと同等の値を示している。これらの結果から、γ−シクロデキストリンおよびその誘導体は、溶血を防止する効果があると考えられる。なお、本実施例で用いられた界面活性剤の濃度は、バイオセンサにおいて通常設定される濃度によりも高くされている。換言すれば、バイオセンサ中にそのような高い濃度の界面活性剤が存在すると、容易に溶血が引き起こされる。しかしながら、シクロデキストリンが反応層に含有されていると、そのような高い濃度の界面活性剤の存在下においても、有意に溶血を防止でき、ひいては、バイオセンサの精度が有意に向上する。
【符号の説明】
【０１６９】
１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
Ｓ 空間部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量できるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体成分や食品中に含まれる特定成分を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量する方法として、次のようなバイオセンサが知られている。すなわち、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法によって作用極および対極からなる電極を形成し、さらに、絶縁層を形成した後、上記電極上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体からなる酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
基質を含む試料を酵素反応層上へ滴下すると、酵素反応層が溶解し、基質と酵素が反応して基質が酸化され、これに伴い電子伝達体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料中の基質濃度を求めるものである（特許文献１）。
【０００４】
バイオセンサに、疎水性の酵素を用いる場合や、測定対象物質が水に難溶性の場合、バイオセンサ内に界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤は、その他、試料の入りをよくするためや、電極表面に気泡を生じさせないためなどの様々な理由から、バイオセンサの構成成分として加えられることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、全血を試料とする従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でない場合があった。特に、界面活性剤を含んだ従来のバイオセンサにおいては、精度が十分でなかった。
【０００７】
よって、本発明は、より精度が向上されたバイオセンサを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、上記課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサを提供することによって、解決されることを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。より詳しくは、試料としての全血の溶血を抑制することにより、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサの断面図である。
【図３】本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。
【図４】図３のバイオセンサの断面図である。
【図５】実施例１および比較例１の全血中の中性脂肪濃度の測定結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１２】
１．本発明の第１
本発明の第１は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
【００１３】
２．本発明の第２
本発明の第２は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が、前記酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層が他方を含み、前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサである。
【００１４】
図１は、本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。
【００１５】
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサ外部を電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
【００１６】
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００１７】
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料（本発明においては、全血であるが、本明細書中「試料」と称することもある）に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
【００１８】
第１のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
【００１９】
続いて、図３は、本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。
【００２０】
図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１のバイオセンサと同様であるが、第１のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。換言すれば、本発明の第２のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素および電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれない。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、酸化還元酵素は含まれず、前記第二の反応層９に、酸化還元酵素が含まれば、電子伝達体が含まれない。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
【００２１】
第２のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
【００２２】
以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、本発明の第１のバイオセンサの構造と、本発明の第２のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）であるか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、本発明の第２のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料（本発明においては全血）が「０．１〜２０μｌ（好ましくは２μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。
【００２３】
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００２４】
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。
【００２５】
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４を含む。
【００２６】
本発明の電極は、試料（測定対象物）と、酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。
【００２７】
本発明においては、作用極２と対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
【００２８】
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
【００２９】
＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
【００３０】
＜試料供給部＞
上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を有する。
【００３１】
本発明の第１のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。
【００３２】
反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、さらに好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００３３】
一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有し、前記第一の反応層８が、酸化還元酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。
【００３４】
本発明の第２のバイオセンサのような反応層を２つとする形態においては、酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。
【００３５】
また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と、第二の反応層９との、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５〜１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｍである。０．０５ｍｍ未満であると、保存中に酸化還元酵素と、電子伝達体が接触する場合がある。また、１．５ｍｍを超えると、毛細管現象が起こりにくく、試料が反応層に吸引されない場合がある。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
【００３６】
（酸化還元酵素）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、酸化還元酵素を含む。酸化還元酵素は単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
【００３７】
酸化還元酵素としても特に制限はないが、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００３８】
または、酸化還元酵素として、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも１種などでもよい。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００３９】
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト−グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼなどが挙げられる。
【００４０】
補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼなどが挙げられる。
【００４１】
補欠分子族としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含む酸化還元酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
【００４２】
中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましい（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）。
【００４３】
ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は、バイオセンサの使用時において、試料中のグリセロールを酸化して電子伝達体を還元するという機能を有する補酵素結合型の酸化還元酵素である。ここで、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素は溶液中の溶存酸素の影響を受けない。したがって、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を用いて還元型の電子伝達体の酸化電流を測定することにより、試料中のグリセロール濃度がより正確に測定されうる。
【００４４】
本発明に用いられる酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８−２２０３６７号公報参照）。
【００４５】
具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等が用いられうる。このような微生物の代表菌株としては、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が挙げられる。
【００４６】
上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０℃〜５０℃、好ましくは２２℃〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００４８】
次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法などを用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。
【００４９】
なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００５０】
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素をさらに添加してもよい。かような酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。
【００５１】
ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、好ましくは１〜５００Ｕ、より好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、ＷＯ２００６／１０４０７７に記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５２】
また、酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ、より好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。また、酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５３】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、本発明に用いられる酸化還元酵素は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に酸化還元酵素を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させる。それは、本発明においては、酸化還元酵素が電極に固着することが有意に防止されているからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に酸化還元酵素を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。
【００５４】
（電子伝達体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。
【００５５】
電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。
【００５６】
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを好適に使用することができる。
【００５８】
電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、１〜２０００μｇ、好ましくは５〜１０００μｇ、より好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００５９】
本発明の第２のバイオセンサおいては、電子伝達体は、酸化還元酵素と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、上記のように、第二の反応層９に酸化還元酵素を含ませることが好ましいからである。また、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれる。
【００６０】
（シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含む。
【００６１】
上記述べたとおり、本発明においてはシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。本発明においては、試料供給部に供給される試料が全血であるため、全血が溶血を引き起こすことがある。その場合、溶血によって、バイオセンサの精度に影響が与えられることがある。そして、全血によっても、溶血し易かったり、し難かったりすることがある。同じ人間の全血を使用する場合であっても、その日の体調等によって溶血し易かったり、し難かったりすることがある。
【００６２】
本発明においては、そのような事実があっても、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血が有意に抑制・防止され、ひいてはバイオセンサの精度がより向上する。換言すれば、本発明においては、供給される試料が、全血であるバイオセンサにおいて、溶血を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法も提供される。
【００６３】
本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の種類にも特に制限はない。シクロデキストリンとしては、α型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、γ-シクロデキストリンが特に好ましい。
【００６４】
また、シクロデキストリン誘導体としてもα型、β型、γ型、δ型、ε型のいずれでもよい。ただ、溶血を抑制・防止し、溶解性が高いという観点から、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体が好ましく、より好ましくはγ-シクロデキストリン誘導体である。なお、シクロデキストリン誘導体とは、例えば、アミノ体、トシル体、メチル体、プロピル体、モノアセチル体、トリアセチル体、ベンゾイル体、スルホニル体及びモノクロロトリアジニル体等の化学修飾体を意図したものである（無論、これらに限らない）。
【００６５】
例えば、シクロデキストリン誘導体としては、２−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２,６−ジ−Ｏ−メチル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−α−シクロデキストリンモノ、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−Ｏ−トシル)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２、３−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−α−シクロデキストリン、ヘキサキス(２，３，６−トリ−Ｏ−オクチル)−α−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−α−シクロデキストリン、モノ［２，(３)−Ｏ−(カルボキシルメチル)］−α−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−α−シクロデキストリン、スクシニル−α−シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−メチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，６−ジ−Ｏ−エチル) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホ) −β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(３−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル)−β−シクロデキストリン、ヘプタキス(２，３−Ｏ−アセチル−６−ブロモ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、（２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアミノ）プロピル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヘキサキス(６−アミノ−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、ビス(６−アジド−６−デオキシ)−β−シクロデキストリン、モノ(２−Ｏ−ホスホリル)−β−シクロデキストリン、ヘキサキス［６−デオキシ−６−(１−イミダゾリル)］−β−シクロデキストリン、モノアセチル−β−シクロデキストリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−β−シクロデキストリン、スクシニル−β−シクロデキストリン、スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、２−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、２−カルボキシエチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン、スルホプロピル−β−シクロデキストリン、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン、シリル[（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル）２，３−ジ−Ｏ−アセチル] −β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−メシチレンスルホニル−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（２，６−ジ−Ｏ−フェニル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス（６−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−γ−シクロデキストリン、オクタキス(２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル)−γ−シクロデキストリン、などが挙げられる。中でも、入手の容易さおよびコストの観点で、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンが好ましく、特に好ましくは２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−（２ＡＳ，３ＡＳ）−γ−シクロデキストリン、モノ−２−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、モノ−６−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホニル）−γ−シクロデキストリン、ブチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６６】
また、本発明に用いられるシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体は、塩の形態で含有してもよい。かかる塩としても、特に制限はないが、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、硫酸塩などが好ましい。
【００６７】
シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、溶血を有意に抑制し、さらに反応層の溶解性を下げないという観点から１〜１０００μｇ、好ましくは５〜５００μｇ、より好ましくは１０〜１００μｇが含まれるとよい。より詳しくは、本発明においては、全血が１ｍｌに対して、好ましくは０．５〜５００ｍｇ、より好ましくは２．５〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは５〜５０ｍｇ含有されるとよい。
【００６８】
また、電子伝達体との対比で考えると、前記シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が、好ましくは電子伝達体１モルに対して０．０１〜０．８モル、より好ましくは０．０１〜０．５モル、さらに好ましくは０．０１〜０．２モルである。電子伝達体１モルに対して、０．８モルを超えて含有させてしまうと、バイオセンサに供給する試料へのなじみが悪くなる虞がある。このように有意に少量のシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させることによって、溶血の起因物質の１つと考えられる界面活性剤の溶血活性を有意に抑制する。なお、含有するシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方の量がこのように有意に少ないと、これらが電子伝達体を包接することはないと考えられる（しかも、電子伝達体として例えばフェリシアン化カリウムを使用した場合、溶解性の問題も生じないため包接させる意味もない）。
【００６９】
なお、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の含有量について上記で述べたが、シクロデキストリンと、シクロデキストリン誘導体の組み合わせのように複数の種類を使用する場合は、その総量を意味する。
【００７０】
本発明においてシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を含有させる意図は、溶血の防止を行うことによって、バイオセンサの精度をより向上させようとするものである。
【００７１】
なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００７２】
なお、本発明の第２のバイオセンサにおいては、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよいが、好ましくは両方の層に含まれるのがよい。
【００７３】
なお、本発明の態のバイオセンサにおいては、その他の成分（界面活性剤、親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子、微粒子など）が、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれると好ましい。以下、説明する。
【００７４】
（界面活性剤）
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が、界面活性剤を有していてもよい。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の溶解が促進されうる。
【００７５】
しかしながら、本発明のように全血を試料とする場合、赤血球に含まれる成分が電子伝達体を還元するため、測定値に正誤差を与える場合がある。また、溶血により、血清中の測定対象物質が希釈されることにより、溶血の程度によって測定誤差が生じる場合がある。そして、その溶血の発生は、界面活性剤が存在すると顕著となる場合がある。
【００７６】
本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、解決することができることを見出した。なお、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させることによって、溶血を抑制する機構は必ずしも明確ではないが、発明者らが考えるに、溶血の一因と考えられる界面活性剤の働きを抑制することによって、溶血を抑制するものと考えている。ただ、あくまで推測に過ぎず、かかるメカニズムによって本発明の技術的範囲が制限されることはない。
【００７７】
本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
【００７８】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
【００７９】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate；Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate；Tween 40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate；Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate；Tween 80）などが好ましい。中でも、酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］が好ましい。
【００８０】
アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有されると、試料溶液（全血）を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシド」よりも「アルキルチオグリコシド」が非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
【００８１】
両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
【００８２】
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８３】
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８４】
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００８５】
上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０（花王製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。特に、溶解性の観点で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。
【００８６】
上記の界面活性剤のうち、本発明の第１のバイオセンサにおいては、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０が好ましく、中でも溶解性の観点から、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。
【００８７】
また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
【００８８】
より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、酸化還元酵素が含有されることが好ましいが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎなど）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、広がりや濡れ性の観点で考えると、界面活性剤の種類として、前記したアルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）を使用することが好ましい。ただし、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）は広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度を向上させるという利点を有する一方で、溶血を比較的誘発しやすい界面活性剤の部類に属する。この問題を解決するため、本発明においては、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させる。そのことによって、かような界面活性剤に起因する溶血を有意に抑制、防止し、ひいては、バイオセンサの精度を向上させる。なお、アルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）が溶血を誘発する可能性があるのであれば、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方を、アルキルチオグリコシドを含む同一の反応層に含有させることが好ましいとも考えられる。ただ、上記も述べたが、同一の反応層に含有させると、シクロデキストリン・シクロデキストリン誘導体は、広がりや濡れ性の効果を抑制する虞があるため、敢えて、別の反応層に含有させてもよい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
【００８９】
界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。
【００９０】
界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。
【００９１】
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００９２】
（親水性高分子、膨潤性層状粘度鉱物粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、親水性高分子および膨潤性層状粘度鉱物粒子の少なくとも一方を含むと好ましい。
【００９３】
親水性高分子は、親水性高分子は酸化還元酵素または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。
【００９４】
本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００９５】
なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【００９６】
膨潤性層状粘度鉱物粒子も親水性高分子と同様に酸化還元酵素や電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。
【００９７】
本発明者らは、より精度が向上されたバイオセンサを提供すべく鋭意検討を行っていたところ、電子伝達体については、従来の親水性高分子で固定するよりも膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定する方が、より均一に固定化することができることを見出した。固定化が不十分であると、試料が供給された後も反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）における溶解性が不十分となり、測定にバラツキが生じる虞がある。よって、電子伝達体については、膨潤性層状粘度鉱物粒子によって固定することによって、固定化が均一となり、電流値のバラツキを抑え、ひいては、より精度が向上されたバイオセンサを提供することができる。
【００９８】
本発明に用いることができる膨潤性層状粘度鉱物粒子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、スメクタイト、ベントナイト、合成フッ素雲母、バーミキュライトなどが挙げられる。これらのうち、酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、スメクタイトが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。これらは、市販のものを購入することなどにより準備することができ、例えば、スメクタイトとしては、ルーセンタイト（商品名）などが好ましい。
【００９９】
なお、このような膨潤性層状粘度鉱物粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を下げず、且つ電子伝達体を均一に保持できるという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。膨潤性層状粘度鉱物粒子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
【０１００】
親水性高分子・膨潤性層状粘度鉱物粒子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、上記の通り、好ましくは、第一の反応層８に電子伝達体が含まれるため、膨潤性層状粘度鉱物粒子も電子伝達体が含まれる第一の反応層８に含有させることが好ましい。一方で、好ましくは、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれるため、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。なお、第二の反応層９に酸化還元酵素が含まれる場合、固定化の効果を勘案すると、膨潤性層状粘度鉱物粒子よりも親水性高分子が好ましい。そして、この場合、親水性高分子の溶解性を考慮すると、後述する微粒子を含有させることが好ましい。
【０１０１】
上記の通り、本発明の第２のバイオセンサのように２つの反応層を有する形態において、各反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有させるそれぞれの成分に応じて固定化剤を使い分けることも大きな特徴と言える。
【０１０２】
（微粒子）
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、微粒子を含むと好ましい。微粒子は、ブラウン運動をするため、拡散、攪拌の役割もある。
【０１０３】
このように、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料溶液（全血）の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酸化還元酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。より具体的には、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に親水性高分子が含有される場合、親水性高分子は難溶解性であるという性質を有する場合があるが、微粒子を添加することによってその問題を解決できる。
【０１０４】
本発明の微粒子としては、特に制限はなく、高分子・低分子を問わず、従来公知のものを使用することができる。ただ、本発明において使用される微粒子は、電解を起こす不純物を含まず、電気化学的に不活性であるものであると好ましい。また、本発明において使用される微粒子は、水に対して不溶もしくは難溶性であることが好ましい。
【０１０５】
より具体的には、微粒子としては、高分子化合物、無機化合物、金属酸化物、炭酸塩などが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１０６】
さらに具体的には、高分子化合物としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１０７】
前記スチレン誘導体を含む重合体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン、アルキルスチレンなどが挙げられる。
【０１０８】
その他、ポリアミドも例示される。また、例えば、ポリウレタン、ポリウレアなどのウレタン化合物、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン系化合物などが挙げられる。
【０１０９】
無機化合物としては、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラスやエーライトなどに代表されるセラミックスなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１０】
金属酸化物としては、ラテックス球、ダイヤモンド粉末、酸化チタンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【０１１１】
炭酸塩としては、炭酸カルシウムが挙げられる。
【０１１２】
その他、本発明の微粒子としては、ポリマーでコートした金、微細セルロース粉末、微細結晶セルロース粉体なども使用することができる。
【０１１３】
なお、本発明の微粒子は、表面の特性を変化させてもよい。具体的には、微粒子表面に、カルボキシル基やアミノ基を導入してもよい。カルボキシル基やアミノ基を導入する方法は、従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて行うことができ、あるいは、市販品を購入してもよい。このように、カルボキシル基やアミノ基を導入することにより、電荷を有するため、試料中に含まれる不純物（血球など）と吸着し、不純物による感度低下を抑制する効果を有する場合もある。
【０１１４】
微粒子の平均粒径は、特に制限はないが、０．１〜２０μｍであることが好ましい。０．１μｍ未満では、微粒子が小さすぎるため、本発明の効果が得られない場合がある。また、２０μｍより大きいと、微粒子が沈殿し、電極表面に付着する可能性がある。０．１〜１５μｍであることがより好ましく、０．１〜１０μｍであることがさらに好ましい。
【０１１５】
なお、平均粒径は、例えば、ＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察により測定することができる。上記でいう平均粒径は、粒子の形状が一様でない場合もあるため、絶対最大長で表すものとする。ここで、絶対最大長とは、単結合体の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の長さＬの平均をとるものとする。なお、値は１０個から求めた平均値とする。
【０１１６】
なお、このような微粒子の配合量は、１センサあたり、反応層の溶解性を向上させるという観点から、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．１〜５００μｇであり、特に好ましくは１〜５０μｇである。
【０１１７】
本発明の第２のバイオセンサにおいては、微粒子は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の層に含まれてもよい。例えば、第一の反応層８に膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれず、親水性高分子が含まれ、第二の反応層９に親水性高分子が含まれる場合、両方に含まれることが好ましい。このように、両方の反応層（第一の反応層８、第二の反応層９）に微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。また、第一の反応層８に電子伝達体と膨潤性層状粘度鉱物粒子が含まれ、親水性高分子が含まれず、第二の反応層９に酸化還元酵素と親水性高分子が含まれる場合、好ましくは第二の反応層９にのみ含まれる。それは、微粒子が存在しなくても、膨潤性層状粘度鉱物粒子は、電子伝達体を均一に固定し、且つ均一に溶解させることができるからである。
【０１１８】
＜バイオセンサの製造方法＞
（本発明の第１のバイオセンサ）
本発明の第１のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１１９】
酸化還元酵素と、電子伝達体と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤を含有させてもよい。界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、微粒子など）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。
【０１２０】
（本発明の第２のバイオセンサ）
本発明の第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。
【０１２１】
第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）と、膨潤性層状粘度鉱物粒子（例えば、スメクタイト）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。なお、界面活性剤を含有させてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。
【０１２２】
一方で、第二の反応層９については、例えば酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）と、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）と、親水性高分子（例えば、カルボキシメチルセルロース）と、微粒子（例えば、ポリスチレンビーズ）と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（例えば、γ−シクロデキストリン）と、を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。なお、界面活性剤が含まれてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。
【０１２３】
最後に、第二の反応層９が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第２のバイオセンサを製造することができる。
【０１２４】
＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、全血である。
【０１２５】
なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。
【０１２６】
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
【０１２７】
反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
【０１２８】
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。
【０１２９】
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【０１３０】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【０１３１】
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【０１３２】
本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、
使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人
体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用
できる。
【０１３３】
本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。
【０１３４】
本発明の効果を以下に纏める。
【０１３５】
本発明のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素が含まれる反応層に、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が含有されるため、溶血が有意に抑制・防止され、赤血球に含まれる成分に基づく電子伝達体の還元を抑制・防止し、測定値に正誤差を与えない。加えて、血清中の測定対象物質を希釈しないようにし、測定誤差が生じさせない。そのことによって、バイオセンサの精度がより向上する。
【実施例】
【０１３６】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【０１３７】
＜応答電流値の測定１（全血中の中性脂肪濃度の測定）＞
応答電流値の測定１は、本発明の第２のバイオセンサ（つまり、反応層が２つの形態）を作製し、シクロデキストリンの添加の有無によって、中性脂肪測定用バイオセンサとしての精度を観察した。
【０１３８】
（実施例１）
電極として、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、金からなる作用極作用部分２−１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１を形成した。
【０１３９】
まず、第二の反応層９（酵素層）は以下の手順で形成した。
【０１４０】
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を２．５Ｕ、リポプロテインリパーゼ（天野エンザイム製）を８０Ｕ、粒径０．５μｍのポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を０．６２５％（１２．５μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を１．５％（３０μｇ）、ＣＨＡＰＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ製）を０．０５％（１μｇ）、カルボキシメチルセルロースを０．１％（２μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）になるように混合し酵素溶液を得た。得られた酵素溶液を、ＥＲ−Ｎの作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、および対極作用部分４−１を被覆するように滴下し、４０℃で１０分間乾燥させ、第一の反応層（酵素層）を得た。
【０１４１】
第一の反応層８（電子伝達体層）は以下の手順で形成した。
【０１４２】
１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、フェリシアン化カリウム（和光純薬製）を２００ｍＭ（１３２μｇ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを０．１％（２μｇ）、γ−シクロデキストリン（和光純薬製）を０．１％（２μｇ）、膨潤性層状粘度鉱物粒子ルーセンタイトＳＷＮ（コープケミカル製）を０．０５％（１μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬製）を５０ｍＭ（６．５μｇ）、エタノールを５０％（１ｍｇ）になるように混合し、電子伝達体溶液を得た。得られた電子伝達体溶液を、ＰＥＴからなるカバー７に接着剤（両面テープ）６ａを貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層８（電子伝達体層）を形成した。
【０１４３】
第二の反応層９が形成されている基板と、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａ、６ｂと、を互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚みはそれぞれ５μｍであり、離隔距離は０．１５ｍｍであった。
【０１４４】
試料液（全血）２μｌを吸入させてから５５秒後に、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に５００ｍＶの電位を印加し、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。
【０１４５】
中性脂肪濃度が異なる４人の全血（１２１、１３１、２０４、３３６ｍｇ／ｄｌ）を試料として、４回測定を行った。結果を表１および図５に示す。
【０１４６】
（比較例１）
γ−シクロデキストリンを蒸留水に変更した以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。その結果を、表１および図５に示す。
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
表１および図５からわかるように、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を含んでいる実施例の方が、全体的な電流値が低く、またどの全血においてもばらつきが少ないことがわかる。これは、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方（γ−シクロデキストリン）を加えることにより、血液中の赤血球の溶血反応を防止しているためであると考えられる。
【０１４９】
＜溶血防止効果確認＞
溶血防止効果確認は、γ−シクロデキストリンの添加における溶血防止の程度を測定するため、簡易な測定系（電極反応層内の反応をチューブ内で実施）を用いて評価を行った。なお、本測定系は、実際の電極系にも適用可能である。また、界面活性剤の溶血作用およびγ−シクロデキストリンの溶血防止効果を明確にするため、酸化還元酵素は入れないこととし、試料として全血を使用した。
【０１５０】
（実施例２）
１．５ｍｌのプラスチックチューブに、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を溶媒とした８００ｍＭ フェリシアン化カリウム（和光純薬製）溶液を５μｌ（１３２０μｇ）、３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を２μｌ（６０μｇ）、１０％ γ−シクロデキストリン溶液を２μｌ（２００μｇ）を添加し混合することによって反応溶液（９μｌ）を得た。
【０１５１】
得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、電極（ＥＲ−Ｎ、バイオデバイステクノロジー製）を用いて、電極の各作用部分を覆うように反応溶液３μｌを滴下・塗布し、参照極３を基準にして作用極２と対極４の間に＋５００ｍＶの電位を印加して、５秒後に作用極２と対極４との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち溶血の度合いに対応している。
【０１５２】
溶血測定を行った結果を表２に示す。
【０１５３】
併せて、目視による溶血の評価を行った。
【０１５４】
上記と同様の手順によって反応溶液を調製した。得られた反応溶液に、全血１１μｌを滴下・混合し、６０秒間反応させる。その後、１．５ｍｌプラスチックチューブを１，５００×ｇで５分間遠心し、上清の色を目視により評価した。評価基準として、溶血が見られなかったものを○、若干の溶血が認められたものを△、明らかに溶血していたものを×として評価した。溶血が起こると、赤血球中の成分が溶出して反応液中のフェリシアン化カリウム（酸化型電子伝達体）と反応し、フェロシアン化カリウム（還元型電子伝達体）を生成する。電極にてフェロシアン化カリウムを酸化することによって得られる酸化電流値は、すなわち、反応液中でどれくらい溶血したかの指標になり、電流値の大きさに比例して溶血も多く起こっていると考えることができる。結果を表２に示す。
【０１５５】
（実施例３）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、５％ ＣＨＡＰＳ溶液に変更した以外（１００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５６】
（実施例４）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド溶液に変更した以外（２０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５７】
（実施例５）
３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を、２％ オクチルチオグルコシド溶液に変更した以外（４０μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５８】
（実施例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１５９】
（実施例７）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例３と同様の方法で測定した。
【０１６０】
（実施例８）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例４と同様の方法で測定した。
【０１６１】
（実施例９）
１０％ γ−シクロデキストリンを、１０％ ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−γ−シクロデキストリン）に変更した以外（２００μｇ）は、実施例５と同様の方法で測定した。
【０１６２】
（比較例２）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定した。
【０１６３】
（比較例３）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例３と同様の方法で測定した。
【０１６４】
（比較例４）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例４と同様の方法で測定した。
【０１６５】
（比較例５）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更した以外は、実施例５と同様の方法で測定した。
【０１６６】
（比較例６）
１０％ γ−シクロデキストリンを、ＰＢＳに変更し、３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をＰＢＳに変更した以外は、実施例２と同様の方法で測定し、「ブランク」として示す。ブランクは、溶血していない基準となるサンプルである。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
表２の目視評価および電流値評価より、４種の界面活性剤のみでは溶血が起こり、電流値がブランクより上昇している。しかし、終濃度で１％のγ−シクロデキストリンまたは２−ＨＰ−γ−シクロデキストリンを添加すると、溶血が抑えられることで、電流値の上昇が抑制され、ブランクと同等の値を示している。これらの結果から、γ−シクロデキストリンおよびその誘導体は、溶血を防止する効果があると考えられる。なお、本実施例で用いられた界面活性剤の濃度は、バイオセンサにおいて通常設定される濃度によりも高くされている。換言すれば、バイオセンサ中にそのような高い濃度の界面活性剤が存在すると、容易に溶血が引き起こされる。しかしながら、シクロデキストリンが反応層に含有されていると、そのような高い濃度の界面活性剤の存在下においても、有意に溶血を防止でき、ひいては、バイオセンサの精度が有意に向上する。
【符号の説明】
【０１６９】
１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
Ｓ 空間部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、
前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、
前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサ。
【請求項２】
前記シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が、供給される全血１ｍｌに対して、２〜５０ｍｇ含まれる、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記シクロデキストリンが、γ-シクロデキストリンであり、
前記シクロデキストリン誘導体が、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記シクロデキストリン誘導体が、γ-シクロデキストリン誘導体である、請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記反応層が、界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であり、
前記両性界面活性剤が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である、請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり、
前記アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤が、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドである、請求項７または８に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、
前記第一の反応層が、前記酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、
前記第二の反応層が、他方を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
中性脂肪センサである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサを用い、全血の溶血を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法。
【請求項１】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、
前記試料供給部が、酸化還元酵素と、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方と、電子伝達体と、を含む反応層を有し、
前記試料供給部に供給される試料が、全血である、バイオセンサ。
【請求項２】
前記シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の少なくとも一方が、供給される全血１ｍｌに対して、２〜５０ｍｇ含まれる、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記シクロデキストリンが、γ-シクロデキストリンであり、
前記シクロデキストリン誘導体が、β-シクロデキストリン誘導体またはγ-シクロデキストリン誘導体である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記シクロデキストリン誘導体が、γ-シクロデキストリン誘導体である、請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記反応層が、界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であり、
前記両性界面活性剤が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である、請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ｐ−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり、
前記アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤が、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドである、請求項７または８に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、
前記第一の反応層が、前記酵素および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、
前記第二の反応層が、他方を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
中性脂肪センサである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサを用い、全血の溶血を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２３７１４２（Ｐ２０１０−２３７１４２Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８７４９７（Ｐ２００９−８７４９７）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
[ Back to top ]