バイオチップのための解析ツールとしての原子間力顕微鏡の使用
本願は、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法であって、（ｉ）流体媒体を、その表面上にデンドロンのアレイを含む固体基板と接触させる工程であって、デンドロンの各々が、中心原子、任意にリンカーを介して、中心原子と結合しているプローブ、及び中心原子と結合しているベース部分であって固体支持体の表面と結合している複数の末端を有するベース部分を含む、接触させる工程と、（ｉｉ）結合したリガンドと原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針につなぎ留められた検出分子との間の結合力を測定することによりプローブ−標的リガンド複合体の存在を決定する工程であって、検出分子はリガンドに対する親和性を有し、ＡＦＭによるプローブ−標的リガンド複合体と検出分子との間の力の増大の測定がプローブ−標的リガンド複合体の存在を示す、決定する工程とを含む、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的に、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）と、チップ上でこれを使用する、装置、及び生体分子間の分子間相互作用を測定する方法とに関する。本発明は、チップ上での生体分子間の相互作用力の測定における、デンドロンでコーティングしたバイオ−ＡＦＭ探針の使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年６月１４日付けで出願された米国仮特許出願第６０／９４４０５６号明細書に係る出願を基礎とする優先権を主張し、該出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
生物分析科学及び生体工学における最近の進歩は、ＤＮＡチップ非特許文献１，非特許文献２、小型バイオセンサー非特許文献３，非特許文献４及び微小流体素子（例えば微小電気機械システム又はバイオＭＥＭＳ）非特許文献５−７の発達をもたらした。特に、このＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子解析を大幅に加速させるので、重要性が増大しているツールである。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子発現と、変異検出と、単一ヌクレオチド多型解析と、他の多くの用途とのモニタリングに使用されてきた非特許文献８。しかし従来のマイクロアレイは、柔軟性、速度、費用及び感度に限界がある。加えて、生体分子は直接的な高感度検出に有用な固有の特性を欠くので、ほとんどの生化学的アッセイは、標識の二次的検出を必要とする。生物学的診断において最も一般的に使用される標識は、有機蛍光色素である。しかし、それでもなお、有機色素には多くの用途におけるその使用を妨げる光退色及び離散励起バンド等の制約がある非特許文献９。
【０００４】
単一分子の受容体／リガンド対の解離速度論を研究するための、また単一の生体高分子の機械的特性を探索するための、超高感度の力の測定方法の能力を実証する研究の数が増大している非特許文献１０−１３。かかる研究は、生物学的プロセスの領域における（例えば、細胞接着における、タンパク質アンフォールディングにおける、及びＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖の解離に対する）力の役割に対して多くの見識をもたらした非特許文献１４−１６。しかしこれらの発達の多くは、表面の機能性及び／又は均一性が高度に規定された表面及び機器を作り出すことがまだ普通のことでないという点において、利用可能な生体分子表面結合方法により現在妨げられている。本発明者らは、デンドロンアレイの形成に基づき、かかる問題に対処する新しいアプローチを報告した。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドで官能化したデンドロン表面の間の力の測定を通じて、本発明者らは、このアプローチにより修飾した表面の幾つかの独特な特性を観察した非特許文献１７。
【０００５】
その繰り返し単位が１つのコアから直接伸びている錐形分子であるデンドロンは、均一なサイズ及び分子量と、十分に規定された構造とを有する高分枝ポリマーである。表面上での効果的な自己集合のために、そのサイズを正確に制御すること、及びその反応性末端を利用することが可能であるので、デンドロンは、その表面の特徴を分子レベルで精密に調整した新しい材料を作り出すための理想的な構成要素であると考えられる非特許文献１８。錐形によりもたらされるメソ空間形成（mesospacing）は、表面に固定化した捕捉プローブＤＮＡの各々に、入ってきた標的ＤＮＡとの結合のための十分な空間を提供し、溶液（１００：１）中で観察されたのと同様の動力学及び選択性の増強をもたらし、ＤＮＡマイクロアレイの有効性を顕著に向上させることが見出された。さらに、観察された高いハイブリダイゼーション量は、隣接するＤＮＡプローブとの間に十分な空間形成がなされたＤＮＡプローブが、ハイブリダイゼーション時に隣接するプローブ又は標的によって最小限度の立体障害しか被っていないことを実証する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】(1) Fodor, S. P. A. Science 1991, 251, 161-113.
【非特許文献２】(2) Schena, M.; Shalon, D.; Davis, R. W.; Brown, P. O. Science 1995, 270, 467-470.
【非特許文献３】(3) Clark, H. A.; Hoyer, M.; Philbert, M. A.; Kopelman, R. Anal. Chem. 1999, 71, 4831-4836.
【非特許文献４】(4) Dickinson, T. A.; Michael, K. L.; Kauer, J. S.; Walt, D. R. Anal. Chem. 1999, 71, 2192-2198.
【非特許文献５】(5) Harrison, D. J. Science 1993, 261, 895-897.
【非特許文献６】(6) Ramsey, J. M.; Jacobson, S. C; Knapp, M. R. Nat. Med. 1995, 1, 1093-1096.
【非特許文献７】(7) Woolley, A. T.; Mathies, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11348- 11352.
【非特許文献８】(8) Christof M. Niemeyer, D. B. Angewandte Chemie International Edition 1999, 38, 2865-2869.
【非特許文献９】(9) Gerion, D.; Chen, F.; Kannan, B.; Fu, A.; Parak, W. J.; Chen, D. J.; Majumdar, A.; Alivisatos, A. P. Anal. Chem. 2003, 75, 4766-4772.
【非特許文献１０】(10) Allen, S. R.-S., S. M.; Harris, H.; Davies, M. C; O'Shea, P. Biochemical Society Transactions 2003, 31, 1052-1057. .
【非特許文献１１】(11) Clausen-Schaumann, H.; Seitz, M.; Krautbauer, R.; Gaub, H. E. Current Opinion in Chemical Biology 2000, 4, 524-530.
【非特許文献１２】(12) Kellermayer, M. S. AA .; Smith, S. B.; Granzier, H. L.; Bustamante, C. Science1997, 276, 1112-1116.
【非特許文献１３】(13) Hummer, G.; Szabo, A. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 504-513.
【非特許文献１４】(14) Bayas, M. V.; Leung, A.; Evans, E.; Leckband, D. Biophys. J. 2006, 90, 1385- 1395.
【非特許文献１５】(15) Evans, E.; Leung, A.; Heinrich, V.; Zhu, C. Proceedings of the National Academy of Sciences 2004, 101, 11281-11286.
【非特許文献１６】(16) Benoit, M.; Gabriel, D.; Gerisch, G.; Gaub, H. E. Nat Cell Biol 2000, 2, 313-317.
【非特許文献１７】(17) Jung, Y. J.; Hong, B. J.; Zhang, W.; Tendler, S. J. B.; Williams, P. M.; Allen, S.; Park, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9349-9355.
【非特許文献１８】(18) Hong, B. J.; Oh, S. J.; Youn, T. O.; Kwon, S. H.; Park, J. W. Langmuir 2005, 21, 4257-4261.
【非特許文献１９】(19) Schweitzer, B.; Kingsmore, S. Current Opinion in Biotechnology 2001, 12, 21-27 '.
【非特許文献２０】(20) Zhao, X.; Tapec-Dytioco, R.; Tan, W. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11474-11475.
【非特許文献２１】(21) Nygaard, V.; Holden, M.; Loland, A.; Langaas, M.; Myklebost, O.; Hovig, E. BMC Genomics 2005, 6.
【非特許文献２２】(22) Eastman, P. S.; Ruan, W.; Doctolero, M.; Nuttall, R.; deFeo, G.; Park, J. S.; Chu, J. S. F.; Cooke, P.; Gray, J. W.; Li, S.; Chen, F. F. Nano Lett. 2006, 6, 1059-1064.
【発明の概要】
【０００７】
本願では、出願人は、遺伝子型決定及び遺伝子発現を研究することができる、単純且つ標識不要だが高感度の、力基準の原子間力顕微鏡を使用する本発明のアプローチを説明する。この仕事において本発明者らは、力基準のＡＦＭにより、デンドロンで修飾した表面上のプローブＤＮＡとハイブリダイズした標的ＤＮＡと、ＡＦＭ探針上の検出ＤＮＡとの間の力を測定することにより、遺伝子型決定及び遺伝子発現プロファイリングを試験した。デンドロンで修飾した表面、及びＡＦＭ探針と組み合わせた本検出方法により、その感度は、蛍光標識法を必要とする従来のＤＮＡマイクロアレイの感度よりも優れていた。
【０００８】
本発明の一態様では、標識するプロセスを有しない、遺伝子型決定及び遺伝子発現プロファイリングのための解析ツールとしての力基準の原子間力顕微鏡を対象とする。本発明は、ハイブリダイゼーション／結合の事象に関して十分に測定可能な力をもたらす、ＤＮＡを固定化するためのナノスケールで操作したデンドロン表面にも関する。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ遺伝子型決定研究のための定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的ＤＮＡを標識することなく検出可能な感度を示す。バイオＡＦＭ測定の感度は、遺伝子発現プロファイリングのための従来のマイクロアレイに対して１０５倍増大した。デンドロンで修飾した表面の側方空間形成は、高度に予測可能な大きさであり得る。力基準のＡＦＭは、他のバイオチップシステムと容易に適合させることが可能である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法であって、（ｉ）流体媒体を固体基板と接触させることであって、固体基板がその表面上にデンドロンのアレイを含み、デンドロンの各々が、中心原子、任意にリンカーを介して、中心原子と結合しているプローブ、及び中心原子と結合しているベース部分であって、固体支持体の表面と結合している複数の末端を有するベース部分を含む、並びに（ｉｉ）結合したリガンドとリガンドに対する親和性を有する検出分子との間の結合力を測定することによりプローブ−標的リガンド複合体の存在を決定することであって、検出分子が原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針の表面につなぎ留められており、プローブ−標的リガンド複合体と検出分子との間の力の増大の測定が該プローブ−標的リガンド複合体の存在を示す、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法を対象とする。
【００１０】
好ましい一実施形態では、プローブ−標的リガンド複合体は、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体である。プローブ−標的リガンド複合体は、低濃度の標的リガンドの存在下で検出されてもよく、該リガンドは少なくとも約１ａＭ、又は約１ａＭ〜約１０００ａＭの濃度である。上記方法は、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体における単一ヌクレオチド多型を識別することができる。
【００１１】
検出分子は、検出核酸であり得る。検出分子は、ＲＮＡのポリ−ｄＡセクションと十分に相補的なポリ−ｄＴオリゴマーを含み得る。固体基板は、無孔性の固体支持体であり得る。固体基板は、シリカを含むがこれに限定されない、平面的な無孔性の固体支持体であり得る。原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針は、デンドロンでコーティングされていてもよい。別の実施形態では、標的リガンドは、標識されていなくてもよい。本方法は、架橋結合したプローブ−リガンド複合体をさらに含み得る。又は、プローブ−リガンド複合体は、親和性分子と共有結合していてもよく、且つ検出分子は、親和性分子と特異的に結合する。親和性分子は、抗原又は抗体であり得る。検出分子は、二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質であり得る。又は、プローブ−リガンド複合体は、検出分子と三重らせん構造を形成し得る。検出分子は、ＤＮＡ挿入剤であり得る。検出分子は、二本鎖ＤＮＡのミスマッチセクションと選択的に結合するタンパク質でもあり得る。また、アレイは、チップ上で表示され得る。
【００１２】
本発明は、標的核酸を検出するシステムであって、（ｉ）プローブ分子を固定化したチップと、（ｉｉ）その上に検出分子をつなぎ留めた探針を含む原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）とを含む、標的核酸を検出するシステムも対象とする。該チップは、その上にプローブ分子をつなぎ留めたデンドロンでコーティングされていてもよい。また、ＡＦＭの探針は、その上に検出分子を固定化したデンドロンでコーティングされていてもよい。
【００１３】
本発明のこれらの、及び他の目的は、以下の本発明の説明と、ここで添付した参照図面と、ここで添付した特許請求の範囲とにより、より十分に理解されるであろう。
【００１４】
本発明は、以下に提供する詳細な説明と、添付した図面とからより十分に理解されるであろう。この詳細な説明と図面とは、例示として与えられているにすぎず、したがって本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ａ：本研究の範囲内で説明する測定のために採用した実験設定の概要を示す図である。標的ＤＮＡを、デンドロンで修飾した表面上に固定化したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせた後、検出ＤＮＡをつなぎ留めているＡＦＭ探針と、基板とを離接させることにより、力の測定値を記録した。 ｂ：典型的な測定（挿入図：出力の減少（retract traces）（青色の曲線））、及び相補的な１５ｍｅｒの配列に対して記録した接着力の分布を示す図である。
【図２】ａ：成熟真核生物ｍＲＮＡの構造を示す図である。十分にプロセシングされたｍＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含む。 ｂ：デンドロン表面上に固定化した６４種類のプローブＤＮＡと、ユニバーサルヒト基準全ＲＮＡ（ＵＨＲＲ）から調製したｃＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイ実験の蛍光画像を示す図である。白い矢印は、プローブ番号６２のＤＮＡを示す。 ｃ：０．６２ｆｇ／μｌのＵＨＲＲとのハイブリダイゼーション後の力のマッピング画像を示す図である。
【図３】ａ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である。 ｂ：バイオ−ＡＦＭを使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図４】ａ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である（標的ＤＮＡ １ｐＭ）。 ｂ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である（標的ＤＮＡ １００ｆＭ）。
【図５】ａ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １ｐＭ）。 ｂ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １０ｆＭ）。 ｃ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １００ａＭ）。 ｄ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １ａＭ）。
【図６】標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力−距離測定結果を示す図である。
【図７】標的ＤＮＡ濃度と検出感度との間の直線関係を示す図である。
【図８】バイオ−ＡＦＭを使用する非相補的な標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である。
【図９】架橋結合したプローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡのＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１０】ストレプトアビジン−ビオチン結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１１】抗原−抗体結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１２】タンパク質−ＤＮＡ結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１３】三本鎖ＤＮＡ構造のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１４】挿入したＤＮＡのＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１５】ＭｕｔＳタンパク質を使用する一塩基変異のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１６】ＤＮＡ間の力の測定を使用するデンドロン表面のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１７】バイオ−ＡＦＭを使用する遺伝子発現決定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願において「a」及び「an」は、単数及び複数の両方の対象を表すために使用される。
【００１７】
本明細書で用いられるところの「アプタマー」は、一本鎖の、部分的に一本鎖の、部分的に二本鎖の、又は二本鎖のヌクレオチド配列、有利には複製可能なヌクレオチド配列であって、ワトソン−クリック塩基対形成又は三本鎖形成以外のメカニズムにより、選択された非オリゴヌクレオチド分子又は分子群を特異的に認識することができるヌクレオチド配列を意味する。
【００１８】
本明細書で用いられるところの「親和性分子」は、プローブ／標的リガンド複合体と結合している分子を表す。親和性分子は、プローブ、標的リガンド又は両方と結合することができ、このプローブ、標的リガンド又は両方は、プローブ／標的リガンド複合体の存在を検出するために、後に検出分子により検出される。親和性分子は、いずれかのタイプの生体分子であり得る。かかる親和性分子の例は抗原であり、これは上記複合体と結合し、原子間力顕微鏡の探針の表面に取り付けられた検出抗体により検出される。別の例は、ストレプトアビジンと結合したプローブ／標的リガンド複合体を含む。原子間力顕微鏡の探針の表面につなぎ留められた「検出ビオチン」は、間接的にプローブ／リガンド複合体の存在を示すストレプトアビジンの存在を検出するために使用される。
【００１９】
本明細書で用いられるところの「アレイ」及び「ライブラリ」は、本明細書では交換可能な用語として使用され、無作為又は無作為でない、分子、材料、表面、構造的形状、表面特徴、又は任意に且つ非限定的に、様々な化学的部分（chemical entities）、モノマー、ポリマー、構造、前駆体、生成物、修正物（modifications）、誘導体、物質、立体構造、形状若しくは特徴の、混合物、収集物又は組合せ（assortment）を表す。「アレイ」又は「固体支持体上の領域のアレイ」は、固体支持体の表面に形成される、各々が有限の面積を有する好ましくは分離した領域の、線形アレイ又は二次元アレイを表す。
【００２０】
本明細書で用いられるところの「アレイライブラリ（arrayed library）」は、固体基板上のマイクロタイター（マルチウェル）ディッシュ又はプレートにおける二次元アレイに設置される個々のプローブ分子を表す。プレートの同一性と、そのプレート上のクローンの位置（行及び列）とが重要である。クローンのアレイライブラリは、特定の遺伝子又は目的の遺伝子領域についてのスクリーニング、及び物理地図の作成、遺伝子型決定、ＳＮＰの同定、遺伝子発現プロファイリング等を含む、多くの用途のために使用され得る。
【００２１】
本明細書で用いられるところの「二官能性」、「三官能性」及び「多官能性」は、合成ポリマー又は多価ホモポリマー性若しくはヘテロポリマー性ハイブリッド構造に関して使用される場合には、２つ、３つ若しくは複数の特異的認識要素、規定された配列セグメント、若しくは結合部位であり得るか、又はそれらを含む場合のように、二価、三価又は多価を意味する。
【００２２】
本明細書で用いられるところの「バイオチップ」又は「チップ」は、より高いスループット及び速度を実現するために、多くの試験を同時に行うことを可能にする、固体基板上に配置した小型試験部位の収集物（マイクロアレイ又はナノアレイ）である。バイオチップは、伝統的に大きな検知ツールをさらに小さい空間に詰め込むために使用される。これらのチップは、本質的に、何百又は何千もの生化学反応を同時に行うことができる小型の実験室である。バイオチップは、研究者が、疾患診断からバイオテロ剤の検出までの様々な目的のために多数の生物学的分析対象を迅速にスクリーニングすることを可能にする。実際の検知用構成部分（すなわち「チップ」）は、分析システム全体のほんの一部分である。実際の検知事象（ＤＮＡ結合、酸化／還元等）をコンピュータが理解可能な形式（力、電圧、光強度、質量等の測定値）に翻訳するために、変換が行われる必要があり、それによりその後、付加的な分析とヒトが読むことができる最終的な出力をもたらすための処理とが可能となる。チップは、典型的には、集積回路を製作するために伝統的に使用されるマイクロリソグラフィー法を使用して製造される。
【００２３】
本明細書で用いられるところの「生体模倣（biomimetic）」は、生物学的な分子、分子群、構造を模倣する分子、基、多分子構造又は方法を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられるところの、基板上に固定化したプローブライブラリに関して使用される「ｃＤＮＡライブラリ」は、標的リガンドに特異的であり得るプローブ分子から構成されるライブラリを表す。
【００２５】
本明細書で用いられるところの「樹枝状分子」は、コアまで又はコアから分枝した層の連続付加又は段階付加（generationaladdition）により形成される規則的な樹枝状分枝を示す分子である。
【００２６】
「デンドロン」という用語は、コアまで又はコアから分枝した層の連続付加又は段階付加により形成される規則的な樹枝状分枝を示すポリマーを表す。樹枝状ポリマーという用語は、コアと、少なくとも１つの内部分枝層と、表面分枝層とを特徴とする「デンドリマー」を包含する（例えば、Petar et al. Pages 641-645 In Chem. in Britain、（August 1994）を参照されたい）。「デンドロン」は、焦点又は中心原子から分枝が出ているデンドリマーの一種であり、直接的に、又は連結部分を介してコアに連結されており、又は連結されることがあり、デンドリマーを形成する。多くのデンドリマーは、共通のコアに連結された２つ以上のデンドロンを含む。
【００２７】
デンドロンは、対称的及び非対称的な分枝デンドリマー、カスケード分子、アルボロール（arborol）等を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、分枝アームは、長さが等しい。しかし、非対称的なデンドリマーも使用され得ることも意図される。
【００２８】
さらに、分枝層の規則的な連続付加により形成されるのではない場合であっても、高分枝ポリマー、例えば高分枝ポリオールは、分枝パターンがデンドリマーの分枝パターンに近い程度の規則性を示す樹枝状ポリマーと均等であり得ることが理解される。
【００２９】
本明細書で用いられるところの、「検出ＤＮＡ」、「検出リガンド」、「検出オリゴマー」等の「検出分子」は、プローブ／標的複合体における結合力を決定するために使用されるＡＦＭの探針と結合している分子を表す。
【００３０】
本明細書で用いられるところの、巨大分子又はデンドロン構造を説明するために使用される「高分枝」又は「分枝」は、基板と共有結合又はイオン結合することができる複数の末端を有する複数のポリマーを表すことを意味する。一実施形態では、分枝構造又は高分枝構造を含む巨大分子は、「予め作製され（pre-made）」、次に基板と結合する。したがって、本発明の巨大分子は、米国特許第５，６２４，７１１号明細書（Sundberg et al.）に開示される架橋結合法によるポリマーを除く。
【００３１】
本明細書で用いられるところの「固定化した」は、不溶化したこと、又は不溶性の、部分的に不溶性の、コロイド性の、粒子性の、分散した、懸濁した及び／又は脱水した物質、若しくは固体支持体を含む若しくは固体支持体と結合している分子若しくは固相を含むこと、これと結合していること若しくはこれと操作可能に関連することを意味する。
【００３２】
本明細書で用いられるところの「リンカー分子」及び「リンカー」は、分枝／直鎖ポリマー等の大きさを制御した巨大分子の分枝部分を保護基又はリガンドに連結する分子に関して使用され得る。リンカーは、例えばスペーサ分子、例えばリガンドをデンドロンと結合することができる選択された分子を含み得るが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で用いられるところの、標的リガンドが検出可能であるように必要とされる「低濃度」の標的リガンドは、本発明の標的リガンド検出方法の強力な感度を示すために、本明細書において使用される。この標的リガンドの検出可能な量の濃度のかかる下限は、１ａＭ〜１００００ａＭ、１ａＭ〜１０００ａＭ、１ａＭ〜１００ａＭ、又は１ａＭ〜１０ａＭの濃度を含み得る。
【００３４】
本明細書で用いられるところの「低密度」は、１ｎｍ２当たり約０．００５〜約０．５のプローブ、好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０１〜約０．２のプローブ、より好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０１〜約０．１のプローブ、及び最も好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０５のプローブを表す。
【００３５】
本明細書で用いられるところの「マイクロアレイ」は、分離した領域の密度が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２である、領域のアレイを表す。マイクロアレイにおける領域は、例えば約１０μｍ〜２５０μｍの範囲の直径のような典型的な寸法を有し、アレイ中においておよそ同じ距離で他の領域と分離され得る。マイクロアレイは、転写の発現、又は一連の細胞における発現した遺伝子のプロファイル、又は遺伝子中における変異の検出を試験するために採用することができる、選択された一連のプローブ分子を含み得る。
【００３６】
本明細書で用いられるところの「ナノアレイ」は、分離した領域の密度が少なくとも約１０００／ｍｍ２、好ましくは少なくとも約１０００００／ｍｍ２である、領域のアレイを表す。ナノアレイにおける領域は、例えば約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の直径のような典型的な寸法を有し、アレイ中においておよそ同じ距離で他の領域と分離され得る。ナノアレイは、転写の発現、又は一連の細胞における発現した遺伝子のプロファイル、又は遺伝子中における変異の検出を試験するために採用することができる、選択された一連のプローブ分子を含み得る。
【００３７】
本明細書で用いられるところの「分子模倣体（molecular mimics）」及び「模倣体（mimetics）」は、例えば天然分子、生物学的分子又は選択性分子のような別の分子又は分子群の構造又は機能と同等又は類似の構造又は機能を有するように設計、選択、製造、修飾又は操作された（engineered）天然又は合成のヌクレオチド分子又は非ヌクレオチド分子又は分子群である。分子模倣体は、天然分子、合成分子、選択性分子又は生物学的分子の置換形態（replacements）、代替形態、改良形態（upgrades）、改善形態（improvements）、構造的類似体又は機能的類似体として機能することができる分子及び多分子構造を含む。
【００３８】
本明細書で用いられるところの「ヌクレオチド類似体」は、核酸合成及び加工、好ましくは酵素的及び化学的な合成及び加工において天然の塩基の代わりに使用することができる分子、特に塩基対形成が可能な修飾ヌクレオチドと、任意にアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル又は微量塩基を含まない合成塩基とを表す。この用語は、修飾プリン及びピリミジンと、微量塩基と、変換可能なヌクレオシドと、プリン及びピリミジンの構造的類似体と、標識、誘導体化及び修飾したヌクレオシド及びヌクレオチドと、複合体形成したヌクレオシド及びヌクレオチドと、配列修飾剤と、末端修飾剤と、スペーサ修飾剤と、骨格を修飾したヌクレオチドとを含むがこれらに限定されず、該骨格を修飾したヌクレオチドは、リボース修飾ヌクレオチドと、ホスホロアミデートと、ホスホロチオエートと、ホスホンアミダイト（phosphonamidites）と、メチルホスホネートと、メチルホスホラミダイトと、メチルホスホンアミダイト（methylphosphonamidites）と、５’−β−シアノエチルホスホラミダイトと、メチレンホスホネートと、ホスホロジチオエートと、ペプチド核酸と、アキラル及び中性ヌクレオチド間結合と、ポリエチレングリコール、芳香族ポリアミド及び脂質等の非ヌクレオチド架橋とを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で用いられるところの「ポリマー」又は「分枝ポリマー／直鎖ポリマー」は、分枝部分が基板と結合し直鎖部分がリガンド、プローブ又は保護基と結合するように、分子の１つの端に分枝構造を、及び他の端に直鎖部分を有する分子を表す。
【００４０】
本明細書で用いられるところの「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書では交換可能な用語として使用される。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。この用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸を連結する伝統的なペプチド結合についての変異体も含み得る。
【００４１】
本明細書で用いられるところの「保護基」は、分子上の反応基（例えばヒドロキシル又はアミン）と連結した基を表す。保護基は、化学反応の１つ又は複数の工程時における特定の遊離基の反応を防止するために選択される。一般的に特定の保護基は、分子中に存在する他の反応基を変化させずに反応基を復元するために後で除去することができるように、選択される。保護基の選択は、保護すべき特定の遊離基と、該遊離基が曝露される化合物とに応じて決まる。保護基の選択は、当業者に既知である。例えば、Greene etal., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons,Inc. Somerset, N.J. (1991)（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００４２】
本明細書で用いられるところの「保護されたアミン」は、アミノ保護基と反応したアミンを表す。アミノ保護基は、直鎖の先端の官能基がアミノ基である状況において、固体支持体への分枝末端の結合時におけるアミド機能の反応を防止する。アミノ保護基は、後で除去し、分子中に存在する他の反応基を変化させずにアミノ基を復元することができる。例えば、環外アミンを、ジメチルホルムアミドジエチルアセタールと反応させ、ジメチルアミノメチレンアミノ（dimethylaminomethylenamino）機能を形成することができる。アミノ保護基は一般に、カルバメートと、ベンジルラジカルと、イミデートと、当業者に既知の他のものとを含む。好ましいアミノ保護基は、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル又はジメチルアミノメチレンアミノを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いられるところの「規則的な間隔」は、大きさを制御した巨大分子の先端の間の空間形成を表し、それは、実質的に立体障害なしに標的特異的リガンドと標的との間で相互作用する空間をもたらすための、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの距離である。したがって、基板上の巨大分子の層の密度は高すぎないため、特異的な分子相互作用が生じ得る。
【００４４】
本明細書で用いられるところの「固体支持体」は固定化マトリクスを含む組成物を表し、該固定化マトリクスは、不溶化した物質、固相、表面、基板、層、コーティング、織り繊維若しくは不織繊維、マトリクス、結晶、膜、不溶性ポリマー、プラスチック、ガラス、生物学的若しくは生体適合性若しくは生体侵食性（bioerodible）若しくは生分解性のポリマー若しくはマトリクス、マイクロ粒子又はナノ粒子を含むがこれらに限定されない。固体支持体は、例えば、単一層、二重層、商業的膜、樹脂、マトリクス、繊維、分離媒体、クロマトグラフィー支持体、ポリマー、プラスチック、ガラス、雲母、金、ビーズ、マイクロスフェア、ナノスフェア、シリコン、ヒ化ガリウム、有機金属及び無機金属、半導体、絶縁体、マイクロ構造並びにナノ構造を含むがこれらに限定されない。マイクロ構造及びナノ構造は、超小型、ナノメートルスケール且つ超分子のプローブ、探針、バー、ペグ、プラグ、棒、スリーブ、ワイヤ、フィラメント及びチューブを含み得るが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で用いられるところの「特異的結合」は、リガンドとその特異的結合パートナーとの間の、又は規定の配列セグメントと選択された分子又は選択された核酸配列との間の、測定可能であり且つ再現性がある程度の引力を表す。引力の程度は、最適であるために最大である必要はない。弱い、中程度の又は強い引力が、様々な用途にとって適当であり得る。これらの相互作用において起こる特異的結合は、当業者に既知である。規定の合成配列セグメントと、合成アプタマーと、合成ヘテロポリマーと、ヌクレオチドリガンドと、ヌクレオチド受容体と、形状認識要素と、特異的に引力を有する表面とに関して使用され得る。「特異的結合」という用語は、構造的形状及び表面特徴の特異的認識を含み得る。その他、特異的結合は、いずれかの特異的結合パートナーとの化学的同一性（すなわち、１つ又は複数の同一の化学的な群）又は分子認識特性（すなわち、分子結合特異性）を共有する第３の分子（すなわち、競合体）により競合的に阻害され得る２つの分子（すなわち、特異的結合パートナー）の間の特異的、飽和的及び非共有的な相互作用を明確に表す。競合体は、例えば交差反応体、又は抗体若しくはその抗原の類似体、リガンド若しくはその受容体、又はアプタマー若しくはその標的であり得る。抗体とその抗原との間の特異的結合は、例えば、交差反応する抗体により、又は交差反応する抗原により、競合的に阻害され得る。「特異的結合」という用語は、特異的結合及び構造的形状認識の両方を含む特異的認識のサブセットの概略を示す又はそれを省略するために、便宜的に使用され得る。
【００４６】
本明細書で用いられるところの「基板」は、物質、構造、表面又は材料に関して使用される場合には、特異的結合、ハイブリダイゼーション若しくは触媒認識部位、又は複数の様々な認識部位、又は表面、構造若しくは材料を含む様々な分子種の数を超える多数の様々な認識部位を含むことが今までに知られていない非生物学的な、合成的な、無生物の、平面的な、球形の、又は扁平な表面を含む組成物を意味する。基板は、例えば半導体、合成（有機）金属、合成半導体、絶縁体及びドーパント；金属、合金、要素、化合物及びミネラル；合成の、切断した、エッチングした、リソグラフした、プリンティングした、機械加工した、及び微細加工したスライド、素子、構造及び表面；工業的ポリマー、プラスチック、膜；シリコン、ケイ酸塩、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、段ボール紙、綿、羊毛、衣類、織り繊維若しくは不織繊維、材料及び布；分枝／直鎖ポリマーを介するプローブ分子の固定化により修飾されていないナノ構造及びマイクロ構造を含み得るが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられるところの、アレイシステムとの関連での「標的（target）」又は「標的化すること（targeting）」は、プローブを使用することによりその同一性又は存在量を検出しようとする遊離の核酸転写産物又はそのｃＤＮＡを表し、そのためにプローブ分子が作製される個々の遺伝子を特に表す。或る特定の文脈では、「標的化すること」は、プローブ分子を内因的に発現した転写産物又はそのｃＤＮＡと結合すること、又は結合させることを意味する。標的ヌクレオチド配列は、限定されることなく、いずれかの遺伝子から選択され得る。
【００４８】
本明細書で用いられるところの、標的ライブラリに関して使用される「標的ｃＤＮＡライブラリ」は、逆転写酵素により全てがｃＤＮＡ分子に変換された、細胞又は生物中に存在するｍＲＮＡ分子の全ての収集物を表すので、ライブラリは目的の特異的なｃＤＮＡ（及びしたがってｍＲＮＡ）に対して探索され得る。
【００４９】
本明細書で用いられるところの「標的−プローブ結合」は、少なくとも１つが選択された分子である２つ以上の分子であって、特異的な様式で互いに結合している、２つ以上の分子を意味する。典型的には、第１の選択された分子は、第２の分子と、間接的に、例えばスペーサアーム、基、分子、架橋、担体若しくは特異的認識パートナーを介して、又は直接的に、すなわち、スペーサアーム、基、分子、架橋、担体若しくは特異的認識パートナーを介さずに、有利には直接の結合により、結合し得る。選択された分子は、ハイブリダイゼーションを介してヌクレオチドと特異的に結合し得る。ヌクレオチド及び非ヌクレオチド分子の複合体形成のための他の非共有的結合の手段は、例えばイオン結合、疎水的相互作用、リガンド−ヌクレオチド結合、キレート剤／金属イオン対形成、又はアビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体／ＤＮＰ、抗ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン、若しくはより一般的には受容体／リガンド等の特異的結合対形成を含む。例えば標識する目的でアビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗ＤＮＰ抗体／ＤＮＰ、抗ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン若しくは受容体／リガンドを使用して、（すなわち、直接的結合又は共有的結合しているのではなく）選択された分子若しくは選択された核酸配列と結合している、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、ローダミン、フルオレセイン、フィコエリトリン、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、又は蛍光マイクロスフェア等のレポーター分子は、特異的結合対により、選択された分子若しくは選択された核酸配列と複合体を形成し得る。
【００５０】
文脈上他に必要な場合以外は、「リガンド」という用語は、プローブと選択的に結合することができるいずれかの物質を表す。リガンドは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモン等を含む）、酵素、基質、薬剤、薬剤−受容体、細胞表面、受容体アゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト、アンタゴニスト、応答誘発性若しくは刺激性分子、薬剤、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、増殖因子、サイトカイン、補欠分子族、補酵素、補因子、基質、前駆体、ビタミン、毒素、調節因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子模倣体、構造分子、エフェクター分子、選択性分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、交差反応体、類似体、競合体、又はこれらの分子の誘導体と、選択された標的と特異的に結合することができるライブラリで選択された非オリゴヌクレオチド分子と、これらの分子のいずれかを第２の分子と結合させることにより形成される複合体と、対応プローブに選択的に結合するいずれかの他の分子とであり得る。
【００５１】
文脈上他に必要な場合以外は、「プローブ」という用語は、基板表面に結合しており、対応リガンドと選択的に結合することができるいずれかの物質を表す。プローブは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモン等を含む）、酵素、基質、薬剤、薬剤−受容体、細胞表面、及び対応リガンドに選択的に結合するいずれかの他の分子であり得る。
【００５２】
「リガンド」及び「プローブ」という用語は、いずれかの特定の物質又は大きさの関係を表さないことが理解されるべきである。これらの用語は、リガンドと対応プローブとの間の選択的な結合を示す操作上の用語であるにすぎず、基板表面に結合する部分をプローブと称し、プローブと選択的に結合するいずれかの物質をリガンドと称する。したがって抗体が基板表面に結合している場合には、抗体がプローブであり、対応する抗原がリガンドである。しかし、抗原が基板表面に結合している場合には、抗原がプローブであり対応する抗体がリガンドである。
【００５３】
基板表面上におけるプローブの濃度は、固定化したプローブとその対応リガンドとの間の相互作用に影響を及ぼす、鍵となる要因の１つである。幾つかの利点にも関わらず、高密度で固定化したプローブは、自然環境に存在する同一のプローブの特性と実質的に異なる化学的及び生物学的特性を有することが多い。さらに、不活性でない高密度のプローブは、非特異的なプローブ−リガンド相互作用を促進し得る。表面材料を立体障害から解放する一方で、バイオセンサー及びバイオチップ等の用途に十分なシグナル強度と、特異性と、見かけの結合容量とを維持するためにも、表面に結合したプローブの密度を変化させることが望ましい。
【００５４】
従来から、薄膜の官能基密度は、不活性な吸着質と官能化した吸着質との両方の同時成膜により、通常調整される。しかし、特に基間の強い相互作用が存在する場合には、相異なる官能基を有するマイクロスケール又はナノスケールの微視的領域への相分離を防止することは困難である。
【００５５】
本発明の組成物及び方法は、相分離を顕著に低減するプローブ密度を提供する。本発明の幾つかの実施形態は、その表面上に複数の錐形のデンドリマーを含む基板を提供する。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では各デンドリマーの末端は基板表面と結合することができ、各デンドリマーの先端はプローブの固定化に対して反応性である。
【００５６】
遺伝子型決定のための、バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡの検出
ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子についてのハイスループットの多重解析のための革命的なツールである。微量の遺伝物質しか入手できないことがあるため、マイクロアレイに基づく解析のための高感度の検出方法を開発することが重要である。典型的にはシグナル出力は、２つの分類、すなわち標的増幅とシグナル増幅とに分類される増幅方法により増強される非特許文献１９。遺伝子発現解析における標的増幅の利点及び欠点が、最近レビューされた非特許文献２０。広範な利用可能性に関わらず、ＰＣＲによる標的増幅は、単位複製配列のキャリーオーバーによる材料の汚染、多重化のための能力の制限、増幅効率の変動等の欠点を有する。小量のコピーの試料からのｍＲＮＡの増幅も、初期ＲＮＡ比の歪みと、ノイズ比の増大との問題を有する非特許文献２１。
【００５７】
加えて、生体分子は直接的な高感度検出に有用な固有の特性を欠くので、ほとんどの生化学的アッセイは、標識の二次的検出を必要とする。生物学的診断において最も一般的に使用される標識は、有機蛍光色素である。しかし、それでもなお、有機色素には多くの用途におけるその使用を妨げる光退色及び離散励起バンド等の制約がある。
【００５８】
過去の研究において、本発明者らは、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアレイを含むナノスケールで操作したデンドロン表面がどのようにしてハイブリダイゼーションの事象に関する測定可能な引力及び接着力をもたらすことができるのかを示した。重要なことに、本発明者らは、１０の塩基対の差異を有するＤＮＡ二本鎖間を識別することができる引力及び接着力を検出するためにこのシステムを使用することができ、この測定方法も１つ及び２つの塩基対のミスマッチを検出する感度を有することを示した非特許文献１７。
【００５９】
以下の実施例１〜実施例４で説明するように、１ａＭの標的ＤＮＡ（３５オリゴマー）をデンドロンで修飾した表面上のプローブＤＮＡ（１５オリゴマー）とハイブリダイズすると、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の特定の力（ヒストグラム曲線においてガウスフィッティングにより２６±０．６ｐＮ）を測定する確率は８０％であり、２０％の力−距離曲線では力は観察されなかった（図１（ｂ））。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的分子を標識することなく検出可能な感度を示す。
【００６０】
したがって、デンドロンで修飾した表面は一塩基変異さえも検出するプラットホームとして使用することができるので、本発明のＡＦＭシステムは、遺伝子型決定だけでなく標的ＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出にも適用することができる。一塩基がミスマッチを生じている標的ＤＮＡについては、表面上のプローブＤＮＡと結合する標的ＤＮＡの数は、相補的標的ＤＮＡの結合数よりも小さい。したがって、表面に結合した標的ＤＮＡの数の減少を測定することにより、一塩基がミスマッチを生じている標的ＤＮＡと相補的標的ＤＮＡとを識別することができる。
【００６１】
遺伝子発現プロファイリング研究のための、バイオ−ＡＦＭを使用するｃＤＮＡ標的の検出
発現プロファイリング研究は、実験条件を変化させたときに、統計的に有意な差異を示した遺伝子を報告することが一般的である。ＤＮＡマイクロアレイとｑＰＣＲとの両方が、相補的核酸配列の選択的（preferential）結合又は「塩基対形成」を利用し、両方が遺伝子発現プロファイリングにおいて、しばしば連続的に、使用される。ハイスループットＤＮＡマイクロアレイはｑＰＣＲの定量精度を欠くが、ｑＰＣＲにより数十の遺伝子の遺伝子発現を測定するには、ＤＮＡマイクロアレイを使用して全ゲノムを測定するのに必要な時間とほぼ同じ時間がかかる。したがって、候補遺伝子を同定するために半定量ＤＮＡマイクロアレイ解析実験を行い、その後、最も関心のある候補遺伝子の幾つかに対してｑＰＣＲを行いマイクロアレイの結果を有効にすることが意味をなすことが多い。しかし、本発明のバイオ−ＡＦＭは、ＤＮＡマイクロアレイ及びｑＰＣＲの幾つかの利点を組み合わせることができる。
【００６２】
ポリアデニル化は、核におけるＤＮＡからＲＮＡへの転写後に起こる。ポリアデニル化のシグナルが転写された後、ＲＮＡポリメラーゼと関連したエンドヌクレアーゼ複合体の作用によりｍＲＮＡ鎖は切断される。切断部位は、該切断部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、５０個〜２５０個のアデニン残基を、切断部位で非結合の３’末端に付加する。この反応は、ポリアデニル酸ポリメラーゼにより触媒される（図２（ａ））。以下の実施例１〜実施例４で示すように、バイオ−ＡＦＭ測定の感度は、マイクロアレイの１０５倍増大した（図２（ｃ））。
【００６３】
マイクロアレイシステム
プローブ分子を含む様々なタイプの特定のアレイが、多様な動物、植物及び微生物の細胞又は組織において差示的に発現した遺伝子を同定するために、本発明により提供される。これらのタイプのアレイは、発生アレイ、癌アレイ、アポトーシスアレイ、発癌遺伝子及び腫瘍抑制因子アレイ、細胞周期遺伝子アレイ、サイトカイン及びサイトカイン受容体アレイ、増殖因子及び増殖因子受容体アレイ、神経アレイ（neuroarray）等を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
本発明のアレイは、他の用途の中でも、差示的な遺伝子発現アッセイにおいて使用することができる。例えばアレイは、（ａ）疾患状態（例えば新生物又は正常）、（ｂ）様々な組織のタイプ、（ｃ）発生段階、（ｄ）外的又は内的刺激への応答、（ｅ）治療への応答、等の差示的な発現解析において有用であり得る。アレイはまた、薬剤の発見及び研究のための大規模の発現スクリーニングにおいて、有用であり得る。加えて、遺伝子発現に対する特定の細胞タイプにおける活性作用物質の効果を研究することにより、薬剤毒性、発癌性、環境モニタリング等についての情報を取得及び解析することができる。
【００６５】
一態様では、本発明は、約１ｃｍ２未満の表面積において少なくとも１０３の相異なるプローブ分子のマイクロアレイを有する表面を有する基板を含む。各々の相異なるプローブ分子は、（ｉ）アレイにおける別々の、規定の位置に配置されており、且つ（ｉｉ）約０．１フェムトモル〜１００ナノモルの規定量で存在する。
【００６６】
標的ｃＤＮＡが取得される細胞は、正常細胞等の目的の細胞から、又は肝臓癌、肺癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、直腸癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌及び皮膚癌等の様々なタイプの癌細胞、並びに肥満症、毛包、自己免疫疾患及び代謝障害の細胞から選択され得る。
【００６７】
好ましい一実施形態では、各マイクロアレイは、約１ｃｍ２未満の表面積当たり少なくとも１０３種類の相異なるプローブ分子を含有する。マイクロアレイは、約１６ｍｍ２の面積中に少なくとも約４００の領域、又は１ｃｍ２当たり２．５×１０３の領域を含有し得る。また、好ましい一実施形態では、各マイクロアレイ領域におけるプローブ分子は、ポリヌクレオチドの場合においては、約０．１フェムトモル〜１００ナノモルの規定量で存在し得る。
【００６８】
また、好ましい一実施形態では、プローブ（proble）ポリヌクレオチドは、少なくともヌクレオチド数約１０の長さを有し、様々なｉｎ ｓｉｔｕでの合成スキームにより、高密度アレイにおいて形成され得る。
【００６９】
デンドロン
本発明の幾つかの態様は、デンドロンのアレイを提供する。一般的には、アレイは、少なくとも第１の表面を有する固体支持体と、固体支持体の第１の表面と結合している複数のデンドロンとを含む。各デンドロンが、典型的には、中心原子と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基又は保護された形態の官能基と、中心原子と結合しているベース部分であって、固体支持体の第１の表面と結合している複数の末端を有するベース部分とを含む。本明細書で用いられるところの「中心原子」という用語は、分枝が出ている焦点原子を表す。例えば中心原子は、以下の式Ｉにおいて、Ｑ１として表わされる。デンドロンを表すときの「ベース部分」という用語は、中心原子から出ている複数の分枝を含む部分を表す。幾つかの実施形態では、デンドロンは、固体支持体表面と結合している錐体のベース部分を有する錐形として記載され、又は概略的に示され得る。
【００７０】
官能基（又は部分）は、化学反応に関与する分子内の原子又は原子群を表す。一般的には、官能基はヘテロ原子（ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン（phosphorous）等）又は不飽和（例えば、炭素−炭素二重結合又は三重結合）を含む。代表的な官能基は、アシルハロゲン化物、アルコール、ケトン、アルデヒド、炭酸酸（エステルを含む）、カルボン酸塩、カルボン酸、エーテル、ヒドロペルオキシド、過酸化物、ハロゲン化物、オレフィン、アルキン、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアン酸塩、イソシアン酸塩、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ、ニトロソ、ホスフィン、ホスホジエステル、ホスホン酸、ホスホン酸塩、硫化物、チオエーテル、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、チオール、チオシアン酸塩、二硫化物、チオアミド、チオエステル、チオケトンを含むがこれらに限定されない。官能基は、求核反応又は求電子反応の対象となることが多い。幾つかの実施形態では、デンドロンの官能基は、求核反応に参加することができる。したがって官能基は、求核試薬又は求電子試薬であり得る。官能基は、プローブを結合するようになっていることが多い。特定の一例では、官能基は求核置換反応によりプローブと結合を形成することができる。
【００７１】
官能基は広範なプローブを結合するために使用され、その後該プローブを流体媒体における対応リガンドの存在を検出するために使用することができる。典型的には、官能基がプローブと結合している場合には、プローブの識別効率（例えば、非特異的結合と比較したときの標的特異的結合の量）は、少なくとも約５０％、多くの場合少なくとも約７０％、より多くの場合少なくとも約８０％、最も多くの場合少なくとも約９０％である。特定の一実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、溶液中におけるヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチド標的が使用される場合には、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）識別効率は、少なくとも約８０％（１：０．２）、多くの場合少なくとも約９０％（１：０．１）、より多くの場合少なくとも約９５％（１：０．０５）、より多くの場合少なくとも９９％（１：０．０１）である。
【００７２】
プローブの識別効率は、様々な方法のいずれかにより、例えば、実質的に同様の反応条件下でのプローブ−リガンド複合体形成の効率及び／又は選択性の比較により、決定することができる。ＳＮＰ識別効率も、同様に決定することができる。識別効率を測定する代表的な１つの方法は、基板表面に結合した標的特異的プローブのシグナル強度を、基板に結合した標的非特異的プローブのシグナル強度とを比較することである。例えば、基板表面と結合した標的特異的プローブが１０ｎＭの標的濃度で１００のシグナル強度をもたらし、基板表面と結合した標的非特異的プローブが同じ標的濃度で３０のシグナル強度をもたらす場合には、基板表面上におけるプローブの識別効率は、（１００−３０）／１００、すなわち７０％（１：０．３）である。
【００７３】
幾つかの実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５〜２１のオリゴヌクレオチドプローブと結合している場合には、基板と結合した標的非特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブと、少なくとも１個、多くの場合少なくとも２個、より多くの場合少なくとも３個のヌクレオチドが異なるオリゴヌクレオチドプローブ）のシグナル強度は、基板と結合した標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、標的ＤＮＡの全体又は一部分と完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ）のシグナル強度と比較して、少なくとも約７０％、多くの場合少なくとも約８０％、より多くの場合少なくとも約９５％、さらにより多くの場合少なくとも約９９％低減する。一般的に、異なるオリゴヌクレオチドプローブは、異なる識別効率を有し得る。
【００７４】
特定の一実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチドプローブと結合している場合には、特異的結合の量に対する非特異的結合の相対量は、非デンドロンと結合しているオリゴヌクレオチドプローブと比較して、少なくとも約５０％、多くの場合少なくとも約６０％、より多くの場合少なくとも８０％、さらにより多くの場合少なくとも約９０％低減する。さらに、非特異的結合を測定する１つの方法は、実施例の節における方法を含む本明細書で説明される方法である。非特異的結合の相対量の低減を決定する特定の方法の１つは、以下の式で与えられる。
【００７５】
［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００％
【００７６】
式中、Ａは非デンドロン分子（例えば、ＡＰＤＥＳ修飾表面）を使用する非特異的結合の相対量であり、Ｂはデンドロンで修飾した表面を使用する非特異的結合の相対量である。Ｃ：Ｔのミスマッチに対する特異的結合の量に対する非特異的結合の相対量は、少なくとも９５％［（０．１２−０．００６）／０．１２×１００％＝９５％］低減し得る。
【００７７】
さらに他の実施形態では、デンドロンの先端と結合している官能基又は任意のリンカーは、α−ヘリックスを形成しない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、α−ヘリックスの存在が識別効率を低減し、及び／又は非特異的結合を増大させ、それによりデンドロンの有用性を低減すると考えられる。
【００７８】
本発明の幾つかの態様では、デンドロンは以下の式を有する。
【００７９】
Ｚ−［Ｒ１］ｍ−Ｑ１−｛［Ｒ２−Ｑ２］ａ−｛（Ｒ３−Ｑ３）ｂ−［（Ｒ４−Ｑ４）ｃ−（Ｒ５−Ｙ）ｘ］ｙ｝ｚ｝ｎ
式Ｉ
【００８０】
式中、
ｍ、ａ、ｂ及びｃの各々は独立して０又は１であり、
ｃが０の場合にはｘは１であり、又はｃが１の場合にはｘは１からＱ４の酸化状態−１までの整数であり、
ｂが０の場合にはｙは１であり、又はｂが１の場合にはｙは１からＱ３の酸化状態−１までの整数であり、
ａが０の場合にはｚは１であり、又はａが１の場合にはｚは１からＱ２の酸化状態−１までの整数であり、
ｎは１からＱ１の酸化状態−１までの整数であり、
Ｑ１は酸化状態が少なくとも３の中心原子であり、
Ｑ２、Ｑ３及びＱ４の各々は独立して酸化状態が少なくとも３の分枝原子であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々は独立してリンカーであり、Ｚは任意に保護される官能基であり、
Ｙの各々は独立して上記ベース部分の末端上における官能基であり、複数のＹが上記固体支持体の上記第１の表面と結合しており、
ただしｎ、ｘ、ｙ及びｚの積は少なくとも３である。
【００８１】
ａ、ｂ又はｃが１であり、且つ対応するｚ、ｙ又はｘがそれぞれＱ２の酸化状態−１、Ｑ３の酸化状態−１又はＱ４の酸化状態−１未満である場合には、Ｑ２、Ｑ３又はＱ４と結合している残りの原子はそれぞれ水素であることが理解されるべきである。本明細書で用いられるところの「Ｑ」は、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４のいずれか１つ又は全てを表す。典型的には、Ｑは、周期表のＩＶＡ群又はＶＡ群の任意の原子である。Ｑについての代表的な原子は、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｓｉ、Ｇｅ等を含むがこれらに限定されない。ＱはＮ、Ｐ、Ｃ又はＳｉであることが多い。
【００８２】
式Ｉに見られるように、Ｚは、任意にリンカーＲ１を介して、中心原子に結合している。ｍは１であり、その結果ＺはリンカーＲ１を介して中心原子に結合していることが多い。さらに、Ｚ又はその非保護形態（すなわち、Ｚが保護された官能基である場合）は、プローブを結合するようになっている。幾つかの実施形態では、Ｚは求核試薬である。求核試薬は、結合している電子の両方を供与することによりその反応パートナー（すなわち、求電子試薬）と化学結合を形成する原子又は原子群である。典型的には、求核試薬は、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳ等のヘテロ原子、又はカルボアニオン、特に共鳴により、及び／又は近くの電子求引基（複数可）の存在により安定化するカルボアニオンである。有機化学分野の当業者は、式Ｉのデンドロンに適切な求核試薬を容易に認識することができる。代表的な求核試薬の幾つかは、代表的な官能基において上で開示されている。
【００８３】
他の実施形態では、Ｚは求電子試薬である。求電子試薬は、電子に引きつけられ、求核試薬と結合するために電子対を受容することにより化学反応に参加する原子又は原子群である。たいていの求電子試薬は、正に荷電しているか、部分的な正の電荷を保有する原子を有するか、又は電子のオクテットを有しない原子を有する。典型的には、求電子試薬は、求電子中心と結合している、又は求電子中心の近くにある１つ又は複数の電気陰性原子（例えば、ハロゲン化物又は他のヘテロ原子）のために、少なくとも正の双極子モーメントを有する炭素原子である。有機化学分野の当業者は、式Ｉのデンドロンに適切な求電子試薬を容易に認識することができる。代表的な求電子試薬の幾つかは、代表的な官能基において上で開示されている。
【００８４】
さらに他の実施形態では、Ｚは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐから成る群から選択されるヘテロ原子と、それらの組合せとを含む。
【００８５】
各々のＹは、独立して官能基であり得る。すなわち、各々のＹは、他のＹの群と無関係であり得る。しかし、Ｙの全てが同じ官能基であることが多い。しかし、概してＺ及びＹは異なる官能基である。幾つかの例では、Ｚ及びＹは同じ官能基であり得るが、一方又は他方が保護された形態である。官能基、及び／又は保護基の存在におけるかかる差異は、Ｚ及びＹの反応性を識別することを可能にし、それにより複数のＹを介してデンドロンを固体支持体と結合させることを可能にし、Ｚ上へのプローブの結合を可能にする。
【００８６】
リンカー
再び式Ｉを参照すると、デンドロンは、一般的に様々なリンカー、例えばＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５を含む。各リンカーは、分枝原子Ｑ２、Ｑ３又はＱ４により別のリンカーと連結されている。末端のリンカーは官能基Ｙを含み、それにより固体支持体と結合することができる。
【００８７】
各リンカーの長さは、固体支持体と結合している分枝官能基の数、固体支持体との結合の強度、所望の空間形成等を含む様々な因子により決定され得る。したがって、リンカーはいずれかの特定の長さのいずれかの特定のタイプの鎖又はポリマーに限定されないことが理解される。しかし、一般的な指針として、リンカーの長さは、約０．５ｎｍ〜約２０ｎｍ、典型的には約０．５ｎｍ〜約１０ｎｍ、多くの場合約０．５ｎｍ〜約５ｎｍであり得る。代替的に、各リンカーは、独立して、約１個〜約１００個の原子、典型的には約１個〜約５０個の原子、多くの場合約１個〜約２５個の原子、より多くの場合約３個〜約１０個の原子の鎖長を有する鎖である。リンカーの化学的構成は、例えば置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル、ポリアルケニルグリコール等を含むがこれらに限定されない直鎖又は分枝の有機的部分を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
リンカーＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同じであり得る又は異なり得る。典型的には、各リンカーは、繰り返し単位、直鎖又は分枝の有機的部分である。しかし、全てのリンカーが同じ繰り返し単位でなければならないわけではないことも理解される。また、リンカーについての全ての結合価の位置が繰り返し単位で充たされなければならないわけでもない。例えば、Ｒ２の全てが同じ繰り返し単位であり得る。又は、１つ又は複数のＲ２が繰り返し単位であってもよく、残りのＲ２はＨ又は他の化学的部分であり得る。同様に、１つ又は複数の各々のＲ３、Ｒ４又はＲ５が、独立して、繰り返し単位、Ｈ、又はいずれかの他の化学的部分であり得る。したがって、様々なポリマーの形状がこのように作製され得る。したがって、デンドロンは約３個〜約８１個の官能基Ｙを有し得ると考え得る。典型的にはデンドロンは、約６個〜約８１個の官能基Ｙを、約６個〜約５４個の官能基Ｙを、約６個〜約２７個の官能基Ｙを、約８個〜約２７個の官能基Ｙを、約９個〜約２７個の官能基Ｙを、約９個〜約１８個の官能基Ｙを、又は約９個〜約１２個の官能基Ｙを有する。
【００８９】
官能基Ｙ
各官能基Ｙは、付加反応又は置換反応の対象となるのに十分な反応性を有する。官能基（又は部分）は、化学反応に関与する分子内の原子又は原子群を表す。一般的には、官能基はヘテロ原子（ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン等）又は不飽和（例えば、炭素−炭素二重結合又は三重結合）を含む。代表的な官能基は、アシルハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、炭酸酸（エステルを含む）、カルボン酸塩、カルボン酸、尿素、エーテル、ヒドロペルオキシド、過酸化物、オキシラニル、ハロゲン化物、オレフィン、アルキン、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アジリジニル、アゾ、シアン酸塩、イソシアン酸塩、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ、ニトロソ、オキサゾリニル、イミダゾリニル、ホスフィン、ホスホジエステル、ホスホン酸、ホスホン酸塩、硫化物、チオエーテル、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、チオール、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、二硫化物、チオアミド、チオエステル、チオケトン、シラニル（silanyl）と、化学反応の対象となることが知られている他の基とを含むがこれらに限定されない。官能基は、求核反応又は求電子反応の対象となることが多い。
【００９０】
保護基
存在する場合、保護基の選択は、多数の因子に依存する。したがって、本発明は、その官能基と別の化学的部分との反応を防止する機能をもたらし、且つ所望の特定の条件下で除去することができる限りにおいては、いかなる特定の保護基にも限定されない。典型的には、使用される保護基は、比較的容易に除去することができる。
【００９１】
代表的な適切な保護基は、以下のものを含むがこれらに限定されない：
【００９２】
アミノ酸保護基：メチル、ホルミル、エチル、アセチル、ｔ−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、４−メチルベンジル、チオアニジル（Thioanizyl）、チオクレシル（Thiocresyl）、ベンジルオキシメチル、４−ニトロフェニル、ベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンゾイル、２−ニトロフェニルスルフェニル（2-Nitrophenylsulphenyl）、４−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル、フタロイル、３−ニトロフタロイル、４，５−ジクロロフタロイル、テトラブロモフタロイル及びテトラクロロフタロイル。
【００９３】
ヒドロキシ保護基：ｐ−アニシルオキシメチル（ｐ−ＡＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ），ｔ−ブトキシメチル、２−クロロテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、（１Ｒ）−メントキシメチル（Menthoxymethyl）（ＭＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ｏ−ニトロベンジルオキシメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）及び２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）。
【００９４】
ＤＮＡ、ＲＮＡ保護試薬：２’−ＯＭｅ−Ａｃ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、２’−ＯＭｅ−Ａｃ−ＲＮＡ ＣＰＧ、２’−ＯＭｅ−Ｉ−ＣＥ ホスホラミダイト、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＲＮＡ ５００、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＥ ホスホラミダイト、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＰＧ ５００及び２−アミノ−ｄＡ−ＣＥ ホスホラミダイト。
【００９５】
様々な官能基に対する他の適切な保護基が、当業者に既知である。例えば、T.W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in OrganicSynthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999と、Harrisonand Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (JohnWiley and Sons, 1971-1996)とを参照されたい。
【００９６】
下記の表１は、様々なタイプの代表的な化合物を列挙している。しかし、Ｘ、Ｒ１、Ｑ、Ｒ及びＹにおける変形形態が本発明に包含されることが理解されるべきである。
【００９７】
表１−代表的且つ例示的な巨大分子化合物
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００９８】
本発明の幾つかの態様では、固体支持体は無孔性の固体基板である。適切な無孔性の固体基板は、金属、金属合金、セラミックス、プラスチック、シリコン及びケイ酸塩（ガラス及び半導体ウェハ等）を含むがこれらに限定されない。固体支持体は、スライド、粒子、ビーズ又はマイクロウェル（micro-well）の形態であり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は無孔性の固体基板である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では固体支持体はガラスである。
【００９９】
本発明の他の態様では、固体支持体は多孔性の固体基板である。代表的な多孔性材料は、膜、ビーズ（制御孔ビーズを含む）、ゼラチン及びハイドロゲルを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
本発明の別の態様は、その表面に複数のデンドロンを含む固体支持体を製造する方法を提供する。固体支持体は、デンドロンと結合を形成するための表面官能基を含む第１の表面を少なくとも含む。デンドロンは、中心原子と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基と、中心原子と結合しており複数の末端を有するベース部分とを含み、ベース部分の各末端は官能基を含む。この方法は概して、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間の結合を形成するのに十分な条件下で、複数のデンドロンを固体支持体表面と接触させることであって、その結果、デンドロンのベース部分と固体支持体の第１の表面との間に複数の結合が形成される、接触させることを含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間に形成される結合は、共有結合である。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間の結合は、求核置換反応により形成される。適切な求核置換反応のための反応条件は、当業者に既知である。例えば、Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic OrganicMethods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996)を参照されたい。
【０１０３】
様々な固体支持体が、本発明の方法において使用され得る。適切な固体支持体が、本明細書で論じられ、無孔性固体支持体と多孔性固体支持体とを含む。使用され得る代表的な固体支持体は、上述したものを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体は無孔性固体支持体である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では、固体支持体は無孔性固体支持体である。特定の一実施形態では、無孔性固体支持体はガラスである。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基は、その反応性を低減又は防止するために、デンドロンを固体支持体表面と結合する前に保護される。このようにして、ベース部分の末端上の官能基が固体支持体上の表面官能基との結合形成反応の対象となるのに対して、中心原子と結合している官能基（又はデンドロンの先端に存在する官能基）は反応条件下で相対的に不活性な状態を維持する。特定の官能基の反応性を低減又は防止するための保護基の使用は、当業者に既知である。例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in OrganicSynthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999と、Harrisonand Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (JohnWiley and Sons, 1971-1996)とを参照されたい（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。代表的なヒドロキシ保護基は、アシル基、ベンジル及びトリチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル及びアリルエーテルを含む。代表的なアミノ保護基は、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチル基及び置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）等を含む。しかし、幾つかの例ではベース部分の末端上の官能基の反応性と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基（すなわち「先端官能基」）の反応性とは、先端官能基を保護する必要なく固体基板表面上へのデンドロンの結合を可能にする程度に十分に異なることが理解されるべきである。
【０１０５】
デンドロンが固体支持体と結合すれば、保護基が存在する場合には、その保護基を先端官能基から除去することができる。その後目的のプローブを、適切な反応条件を使用して、先端官能基と結合させることができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、デンドロンは、固体支持体の所定の領域と結合している。かかる結合は、当業者に既知の様々な方法のいずれかを使用して、例えば湿式又は乾式コーティング技術を使用することにより、実現することができる。
【０１０７】
本発明の他の態様は、その表面上にデンドロンのアレイを含む固体支持体を使用して流体媒体中におけるリガンドの存在を検出する方法を提供する。デンドロンのベース部分は固体支持体と結合しており、先端官能基は所与のリガンドに対して選択的なプローブを含む。この方法は概して、リガンドが流体媒体中に存在する場合にプローブ−リガンド複合体を選択的に形成するのに十分な条件下で流体媒体を固体基板と接触させること、及び目的のプローブ−リガンド複合体の存在を決定することを含む。目的のプローブ−リガンド複合体の存在は、その流体媒体がリガンドを含むことの指標である。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、目的のプローブ−リガンド複合体は、オリゴヌクレオチド−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはオリゴヌクレオチド−相補的ポリヌクレオチド複合体、オリゴペプチド−結合性オリゴペプチド複合体若しくはオリゴペプチド−結合性ポリペプチド複合体、ＰＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはＰＮＡ−相補的ポリヌクレオチド複合体、ＬＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはＬＮＡ−相補的ポリヌクレオチド複合体、又は受容体−基質複合体である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では、受容体−基質複合体は、薬剤−薬剤受容体複合体、酵素−酵素基質複合体、抗体−抗原複合体、又はアプタマー−タンパク質複合体を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプローブ−相補的ＤＮＡ複合体（ここで、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチド数が少なくとも約７５のヌクレオチド配列を有し、多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約５０のヌクレオチド配列を有し、より多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約３０のヌクレオチド配列を有し、最も多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約１５のヌクレオチド配列を有する）における単一ヌクレオチド多型を識別することができる。かかる選択性を決定するための１つの方法は、モデル系、及び／又は実施例の節において開示されるｐ５３遺伝子における７つのホットスポットのコドン１７５を有するＤＮＡマイクロアレイを解析することである。
【０１１０】
さらに幾つかの実施形態では、本発明の方法はオリゴペプチドプローブ−特異的ペプチド標的複合体（ここで、オリゴペプチドプローブは、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、又は少なくとも約１０個のアミノ酸を有する）における単一アミノ酸のミスマッチを識別することができる。
【０１１１】
固体支持体上の複数のデンドロン間のプローブ間の距離は、約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２ｎｍ〜約３０ｎｍ、又は約２ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲であり得る。
【０１１２】
標的特異的リガンドすなわちプローブ
ポリマーと結合していることがある、プローブとしても知られる標的特異的リガンドは、化学物質、生化学的物質、生物活性化合物等を含む様々な化合物を含む。これに関して、プローブは、核酸、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、アプタマー、抗原、抗体等であり得る。オリゴヌクレオチドは、天然核酸又はその類似体であり得る。したがって、プローブは、天然アミノ酸又は合成アミノ酸から構成されるポリペプチドであり得る。プローブは、ポリマーの官能基と結合することができる限りにおいて、核酸、アミノ酸、炭水化物、又は他の任意の化学物質の組合せであり得る。特にプローブは、トリアジン骨格に基づく化学物質等の、化学物質であってもよく、コンビナトリアル化学ライブラリ、特にトリアジンタグ化ライブラリの成分として使用され得る。
【０１１３】
固体支持体
固体支持体は、ポリマーを結合していることがあるいずれかの固体材料であり得る。典型的には、ポリマーは、共有結合又はイオン結合を介して固体支持体表面と結合する。固体支持体は官能化してもよく、それにより、ポリマーのベース部分上に存在する官能基との結合が生ずる。固体支持体の表面は、当業者の必要性に応じて様々な表面であり得る。マイクロアレイ又はバイオチップの形式が望まれる場合には、典型的には酸化型シリコンウェハ、溶融シリカ又はガラスが、基板であり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体はスライドガラスである。他の代表的な固体支持体は、ニトロセルロース又はナイロンを含むがこれらに限定されないメンブレンフィルターを含む。固体支持体は、親水性又は極性であり得るし、コーティングの前後において負電荷又は正電荷を有し得る。
【０１１４】
マイクロアレイ
マイクロアレイの性能を向上させるために、プローブ設計、スポッティング時の反応条件、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件、非特異的結合の抑制、生体分子と表面との間の距離、及び／又は固定化した生体分子間の空間等の様々な問題を考慮するべきである。これらの因子のほとんどはマイクロアレイ表面の性質と関連するので、表面の最適化は、マイクロアレイ研究における主要な目的の１つとなっている。本発明の幾つかの態様は、表面に結合したデンドロンを含む固体支持体を提供する。幾つかの実施形態ではデンドロンは、錐形であり、溶液の値（１：０．０１）に近い単一ヌクレオチド多型（すなわちＳＮＰ）の識別効率を有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供するか、非特異的結合を低減するか、又はその両方の効果をもたらす。
【０１１５】
固体支持体の表面は、当業者に既知の様々な方法のいずれかを使用して調製され得る。例えば、ヒドロキシル化したガラスの表面は、Maskis et al. in Nucleic Acids Res., 1992, 20, 1679-1684により開示される方法を使用することにより調製され得る。酸化型シリコンウェハ、溶融シリカ及びスライドガラスを含め、固体支持体は、（３−グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）及びエチレングリコール（ＥＧ）で修飾され得る。典型的には、デンドロンの先端官能基（例えば、カルボン酸基）と固体支持体表面上の官能基（例えば、ヒドロキシル基）との間のカップリング反応を使用して、例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用することにより、デンドロンを固体支持体表面と結合させた。
【０１１６】
幾つかの例では、デンドロンを結合した後における厚みの増大は１１±２Åであったが、これはイオン結合と同程度である。固定化後、デンドロンのアントラセン部分に起因するＵＶ吸収ピークは、２５７ｎｍで観察された。分子層は十分に安定であり、ジメチルホルムアミド中での１日間の撹拌に対して、厚み及び吸収特性に関して変化を示さなかった。タッピングモード原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により得られる組織分布画像も、得られた層が、顕著な凝集物又は穴を有さず非常に滑らか且つ実質的に均質であることを示した。化合物を固体支持体表面上に結合するためのいずれかの従来から知られる方法が、本発明のマイクロアレイを製造するために使用され得る。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイの調製は、先端官能基を脱保護することを含む。先端官能基が保護形態である場合には、かかる工程しか必要でないことが理解されるべきである。先端官能基が保護されていない場合には、かかる工程は必要でない。従来から、表面の反応性アミン基を有する固体支持体については、チオールテザー（thiol-tethered）オリゴヌクレオチドと、サクシニミジル ４−マレイミドブチレート（ＳＭＢ）又はスルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＳＭＣＣ）等のヘテロ二官能性リンカーとが利用される。対照的に、本発明の幾つかの実施形態は、ＤＳＣ等のリンカーを使用し、これはアミンテザー（amine-tethered）オリゴヌクレオチドのスポッティングを可能にする。したがって、本発明の方法及び組成物の幾つかの利点は、費用対効果に優れていること、及び容易に酸化されるチオールテザーオリゴヌクレオチドの使用を回避できることである。しかし、チオールテザーオリゴヌクレオチドは或る特定の条件下で有用であり得ることが理解されるべきである。
【０１１８】
本発明は、本明細書で説明した特定の実施形態によりその範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書で説明した実施形態に加えて本発明の様々な修正形態が、上述の説明と添付した図面とから当業者に明らかとなるであろう。かかる修正形態は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることを意図している。以下の実施例は、限定としてでなく本発明の例示として提供される。
【実施例】
【０１１９】
実施例１−材料及び方法
総則。シランカップリング剤Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＴＰＵ）は、Gelest Inc.から購入した。他の全ての化学物質は、Sigma-Aldrichから入手した試薬グレードのものである。ＵＶグレード溶融シリカプレートは、CVILaser Co.から購入した。研磨加工プライムＳｉ（１００）ウェハ（ドーパント、リン；抵抗率、１．５Ω・ｃｍ〜２．１Ω・ｃｍ）は、MEMCElectronic Materials Inc.から購入した。脱イオン水（１８ＭΩ・ｃｍ）は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｅ−ｐｕｒｅ ３−モジュールシステムに蒸留水を通過させることにより得た。
【０１２０】
実施例２−試料調製。
実施例２．１−基板の洗浄。シリコンウェハ（及び、デンドロン表面被覆度分析のための溶融シリカプレート；支援情報を参照されたい）を、ピラニア溶液（濃硫酸／３０％Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ））中で４時間超音波処理した（注意：ピラニア溶液は、有機材料を爆発的に酸化し得る。酸化しやすい材料と接触させてはならない）。超音波処理後、基板を脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。その後、Ｔｅｆｌｏｎビーカー中に容れた脱イオン水、濃縮アンモニア溶液及び３０％過酸化水素の混合物（５：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））中に、基板を浸漬した。ビーカーをウォーターバス中に置き、８０℃で１０分間加熱した。基板を溶液から取り出し、脱イオン水で十分にリンスした。さらに、脱イオン水、濃塩酸及び３０％過酸化水素の混合物（６：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））を含有するＴｅｆｌｏｎビーカー中に基板を置いた。ビーカーを８０℃で１０分間（or）加熱した。基板を溶液から取り出し、大量の脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。きれいな基板を真空チャンバー（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）中で約２０分間乾燥し、直ぐに次の工程に使用した。
【０１２１】
実施例２．２．−ＡＦＭプローブの前処理。
錐体の先端を有する標準Ｖ型シリコン窒化物カンチレバー（ＭＬＣＴ−ＡＵＮＭ）（Veeco Instruments；ｋ＝１０ｐＮ／ｎｍ）を、初めに、１０％の硝酸中に浸漬すること、及び８０℃で２０分間加熱することにより酸化した。カンチレバーを溶液から取り出し、大量の脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。きれいなカンチレバーを真空チャンバー（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）中で約２０分間乾燥し、直ぐに次の工程に使用した。
【０１２２】
実施例２．３．−シリル化。薄シリカ最上層を用意するために、シリコン／シリカ基板と、上述のように前処理したカンチレバーとを、窒素雰囲気下でカップリング剤（０．２０ｍＬ）を含有する無水トルエン（２０ｍＬ）中に浸漬し、溶液中に６時間置いた。シリル化後、基板及びカンチレバーをトルエンで洗浄し、その後１１０℃で３０分間焼いた。基板を、トルエンと、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））と、メタノールとに連続的に浸漬し、各洗浄溶液中で３分間超音波処理した。カンチレバーを、トルエンとメタノールとで連続的に十分にリンスした。最後に、基板及びカンチレバーを真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。ＧＰＤＥＳでのシリル化のための実験手順と、その後のエチレングリコールでのエポキシドの開環とは、他非特許文献１８で説明する。
【０１２３】
実施例２．４．−デンドロンで修飾した表面の調製。上記のヒドロキシル化した基板及びカンチレバーを、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２．７ｍＭ）の存在下で、デンドロン（１．０ｍＭ）を溶解している小量のＤＭＦと、カップリング剤である１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２７ｍＭ）とを有する塩化メチレン溶液中に４時間浸漬した。この仕事で使用したデンドロンである９−アントリルメチル−３−（｛［トリス（｛［（１−｛トリス［（２−｛［（トリス｛［２−カルボキシエトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］−２−エトキシ｝メチル）メチル］アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメートを、このグループで調製した。反応後、基板を、塩化メチレンと、メタノールと、水とに連続的に浸漬し、各洗浄工程で３分間超音波処理した。カンチレバーを、塩化メチレンと、メタノールと、水とで連続的に十分にリンスした。最後に、基板及びカンチレバーをメタノールで洗浄し、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２４】
実施例２．５．− ９−アントリルメトキシカルボニル基の脱保護。デンドロンで修飾した基板及びカンチレバーを、１．０Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する塩化メチレン溶液中に浸漬し、２時間撹拌した。反応後、２０％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を有する塩化メチレン溶液中に１０分間浸漬した。基板を塩化メチレン及びメタノール中で各３分間超音波処理し、カンチレバーを塩化メチレンとメタノールとで連続的に十分にリンスした。基板及びカンチレバーを真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２５】
実施例２．６．−ＮＨＳで修飾した基板の調製。上記脱保護した基板及びカンチレバーを、窒素雰囲気下で、ジ（Ｎ−サクシニミジル）カーボネート（ＤＳＣ）（２５ｍＭ）及びＤＩＰＥＡ（１．０ｍＭ）を有するアセトニトリル溶液中に４時間浸漬した。反応後、基板及びカンチレバーを撹拌したジメチルホルムアミド中に３０分間置き、メタノールで洗浄した。基板及びカンチレバーを、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２６】
実施例２．７．−プローブ／検出ＤＮＡの固定化。上記ＮＨＳで修飾した基板及びカンチレバーを、ＤＮＡ溶液（５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する２５ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中において、２０μＭ）中に４時間浸漬した。反応後、基板及びカンチレバーを、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において３７℃で３０分間、及び水中において１分間撹拌し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。最後に基板及びカンチレバーを、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２７】
実施例２．８．−標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション。上記のプローブＤＮＡをつなぎ留めた基板を、標的ＤＮＡ溶液（２０μＭ）中に１時間浸漬した。反応後、基板を３７℃で３０秒間撹拌し、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において１分間浸漬し、さらに繰り返した（repeat）。基板を、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３．０ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含有する０．２×ＳＳＣ緩衝液により１分間洗浄し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。
【０１２８】
実施例２．９．−遺伝子発現プロファイリングのためのプローブＤＮＡの固定化。対照実験のために、９６種類の１０μＭのプローブＤＮＡ（Operon companyから入手したホモ・サピエンス（ヒト）試料ｖ４．０．１）を、マイクロアレイヤー（Genetixから入手したＱＡｒｒａｙｍｉｎｉ）を４時間用いて、スポッティング緩衝溶液（５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する２５ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５））中において、デンドロンで修飾したスライドガラス上に固定化した。反応後、基板を、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において３７℃で３０分間、及び水中において１分間撹拌し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。最後に基板を、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２９】
実施例２．１０．−基準全ＲＮＡからのｃＤＮＡ調製。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ標識キット（Invitrogen）での逆転写により、５μｌ当たり１０μｇのユニバーサルヒト基準ＲＮＡ（ＵＨＲＲ、Statagene）から（form）調製した。QIAGENから入手したＭＩＮＥＬｕｔｅ精製キットで、精製プロセスを実施した。NanoDropTechnologies, Inc. から入手したＮＤ−１０００分光光度計により、２６０ｎｍでのＵＶの吸光度を用いて、ｃＤＮＡ濃度を算出した。
【０１３０】
実施例２．１１．−ｃＤＮＡハイブリダイゼーション／蛍光分析。９５℃でのアニーリングの後、３．５×ＳＳＣ及び０．３％ＳＤＳ緩衝液中におけるＣｙ５標識ｃＤＮＡを、Agilentのハイブリダイゼーションキットで、デンドロンで修飾したスライドガラス上における９６種類のプローブＤＮＡと、４５℃で１２時間ハイブリダイズさせた。反応後、基板を３７℃で３０秒間撹拌し、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中で１分間浸漬し、それを繰り返した。基板を、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３．０ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含有する０．２×ＳＳＣ緩衝液で１分間洗浄し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。ｃＤＮＡの蛍光強度を、MolecularDevicesから入手したＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａにより測定した。
【０１３１】
実施例３−ＡＦＭ力測定。全ての力測定は、Ｎａｎｏ Ｗｉｚａｒｄ ＡＦＭ（JPK Instrument）で行った。各実験の前に、各ＡＦＭ探針のばね定数を、熱変動法により、溶液中で較正した。採用したカンチレバーのばね定数は、１ｎｍ当たり１２ｐＮ〜１５ｐＮの間で変動した。全ての測定は、新たなＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中において室温で実施した。力曲線を、基板上の１０μｍ×１０μｍの領域中における１００ピクセルの１つの位置で、２０回より多数回、常に記録し、且つ同じ表面に対して少なくとも３つの他の領域を試験した。様々な探針及び試料を使用して実験を多数回繰り返したこと、及び報告される力のデータは一貫して再現性を有していたことも留意されるべきである。
【０１３２】
実施例４−結果
遺伝子型決定−本発明者らは、表面上のプローブＤＮＡとハイブリダイズした標的ＤＮＡと、ＡＦＭ−探針上の検出ＤＮＡとの間の力を、力基準のＡＦＭにより測定することにより、標的ＤＮＡを検出する感度を試験した（図１（ａ））。全ての実験において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、先に説明したデンドロンに基づく表面官能化方法の修正方法を使用して、シリコン基板又はシリコン窒化物ＡＦＭ探針と共有結合した（表２）。
【０１３３】
表２．遺伝子型決定実験に使用したＤＮＡの名称及び配列
【表２】
【０１３４】
３５ｍｅｒの標的ＤＮＡをデンドロンで修飾した基板上に固定化した１５ｍｅｒのプローブＤＮＡとハイブリダイズさせた後、次に力対距離の測定値を、ＡＦＭ探針上の官能化した１５ｍｅｒの検出ＤＮＡとハイブリダイゼーション事象に関与しない残りの１５ｍｅｒの標的ＤＮＡの表面とを離接しながら記録した。ＡＦＭ力実験を、１０μｍ×１０μｍの面積の１００個の位置で、実施した。力の測定を、１つの位置当たり２０回実施した。１ａＭの標的ＤＮＡをプローブＤＮＡとハイブリダイズさせると、標的ＤＮＡが存在する２つの位置でＤＮＡ間の力が観察された。標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の特定の力（ヒストグラム曲線においてガウスフィッティングにより２６±０．６ｐＮ）を測定する確率は８０％であり、ＤＮＡが見出された１つの位置において２０％の力−距離曲線では力は観察されなかった（図１（ｂ））。かかる極めて低い量の生物学的試料の検出は、臨床的診断及び検出にとっての重要な挑戦である。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的分子を標識することなく検出可能な感度を示す２２。
【０１３５】
このシステムは、遺伝子型決定だけでなく標的ＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）にも適用することができる。過去の仕事において、デンドロンの表面は、一塩基変異を検出する高いＳＮＰ能力を示した。一塩基変異を有する標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの場合においては、基板上に二本鎖として存在する標的ＤＮＡの数は、相対的により相補的な標的ＤＮＡ（完全に相補的なＤＮＡ等）とハイブリダイズするプローブＤＮＡの数より小さい。したがって、結合した標的ＤＮＡを観察する確率は、点変異を含有する標的ＤＮＡの場合には減少した。この方法は、単一ヌクレオチド多型から相対的により相補的な標的ＤＮＡを識別することができる。
【０１３６】
遺伝子発現プロファイリング−ｃＤＮＡは、逆転写によりｍＲＮＡから調製したので、５’末端に５０個〜２５０個のチミン残基を有する。したがって、３０個のアデニン残基から成る検出ＤＮＡを使用した場合には、バイオ−ＡＦＭ測定によりｃＤＮＡの存在を確認することが可能である（表３）。バイオ−ＡＦＭを使用する方法の検出限界の向上を確認するために、ＤＮＡマイクロアレイ実験を実施し、高い蛍光強度を有するプローブＤＮＡを選択した。標準的な蛍光に基づくマイクロアレイ実験の検出限界は、６２ｐｇ／μｌであった。ｃＤＮＡが検出された２個のスポットは、使用するｃＤＮＡ濃度を０．６２ｆｇ／μｌとした場合に、バイオ−ＡＦＭ実験で見出され得る。換言すれば、バイオ−ＡＦＭ測定の感度は、マイクロアレイの１０５倍増大した（図２（ｃ））。
【０１３７】
表３．遺伝子発現プロファイリング実験で使用したＤＮＡの名称及び配列
【表３】
【０１３８】
検出ＤＮＡとしてポリチミン残基を使用した場合には、このシステムは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する複雑なプロセスなしに、ｍＲＮＡの直接検出に適用され得る。たいていのｍＲＮＡは３’末端にポリアデニン残基を有するので、検出ＤＮＡの配列を変更することなく、１つのＡＦＭ探針が複数の標的ｍＲＮＡを検出することができる。すなわち、バイオ−ＡＦＭ法は、ｑＰＣＲと同様の感度を有し、標識することなくＤＮＡマイクロアレイ同様の並行検出を実施することができる。
【０１３９】
デンドロンにより実現される広範なウィンドウの側方空間形成は、別の顕著な利点である。３ｎｍより大きい、推定では最大１０ｎｍの空間形成が意図される。より大きい空間形成は、側方立体障害を最小としながら、より大きな生体分子を固定化するのに有効である。したがって、本発明のシステムは、遺伝子型決定又は遺伝子発現プロファイリングだけでなく、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、及びタンパク質−タンパク質相互作用を決定するためのバイオチップにも適用される。
【０１４０】
実施例５
蛍光標識を使用する従来のＤＮＡチップアッセイ技法の限界を決定するために、本発明者らは、図３（ａ）に示すように、チップ表面上に塩基数２０のＤＮＡプローブを結合し、５’末端にＣｙ３蛍光標識を含有する塩基数３５の標識ＤＮＡとハイブリダイズさせた。
【０１４１】
本発明者らが高レベルから低レベルまで標的ＤＮＡの濃度を変化させて蛍光スキャナーを使用してＤＮＡチップを試験すると、図４に示すように、１ｐＭもの低さでＤＮＡ検出がなされた。
【０１４２】
蛍光法との比較でバイオ−ＡＦＭを使用して、本発明者らは、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定することにより、図５に示すように、１０μｍ×１０μｍの面積中に１００個のスポットを有する力の地図を取得することができた。検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの両方を、ＧＣ部分が６０％となるように調整した。本発明者らは、プローブＤＮＡが検出ＤＮＡよりも塩基を５個多く含有するものとすることにより、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相互作用力を、検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相互作用力よりも増大させた。このことが、標的ＤＮＡがＡＦＭ探針に引きつけられるのを防止するため、連続的な力の測定が可能である。
【０１４３】
図５に示すように、標的ＤＮＡが存在しないと想定される場合には相互作用力は検出されず、標的ＤＮＡが図６でハイブリダイズした場合には標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間に２７ｐＮの相互作用力が測定された。加えて、バイオ−ＡＦＭ法は、蛍光法よりもさらに増強した１ａＭもの低さの標的ＤＮＡを検出することができた。この濃度レベルでもＰＣＲなしでＤＮＡアッセイを行うことができ、このことは本発明の方法が有する蛍光アッセイ等の光学アッセイより優れた別の利点である。さらに図７は、標的ＤＮＡの濃度と検出感度との間の直線関係を示す。
【０１４４】
上述したように、ＰＣＲによる増幅はバイオ−ＡＦＭ法に必要とされないので、標的ＤＮＡが存在するかどうかは、前処理なしでの単純なバイオ−ＡＦＭ実験により試験され得る。これまで、ナノ粒子、銀液（silver liquid）添加及び電気的特性を使用することによりＤＮＡ検出限界を減少させるために多くの努力がなされてきた。しかし、それらは、複雑な前処理手順を必要とし、再現性が低いという点において、不利益を有する。バイオ−ＡＦＭは、再現性のあるデータを提供し、標的ＤＮＡの前操作を必要としない。
【０１４５】
実施例５．１−非特異的ＤＮＡ力測定
本発明者らは、標的ＤＮＡが存在しない場合には、検出ＤＮＡとプローブＤＮＡとの間の相互作用力は全く検出されないことを確認した。本発明者らは、検出ＤＮＡと結合する標的ＤＮＡの領域を非相補的なものとなるように修飾し、プローブＤＮＡと結合する標的ＤＮＡを相補的なものとなるように設計した。この実験において、本発明者らは、図８に示すように、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間に非特異的結合が生じないことを観察した。
【０１４６】
実施例５．２−一塩基変異検出実験
ＤＮＡチップ上での一塩基変異に対するバイオ−ＡＦＭの検出能力を決定する。この実験からは、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で一塩基が異なるという結果が観察される。プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で一塩基変異が存在する場合には、ハイブリダイゼーション率は減少し、検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の力測定率が同様に減少する。
【０１４７】
実施例５．３−プローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡの架橋結合を使用するＤＮＡチップアッセイ
プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとをハイブリダイズした後、ハイブリダイズしたＤＮＡを、化学的方法を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して架橋結合し、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定する（is measure）。図９に示すように、様々な種類の標的ＤＮＡが、プローブＤＮＡの塩基長にかかわらず、検出され得る。
【０１４８】
実施例５．４−ストレプトアビジン−ビオチン結合を使用する、検出感度の向上
上述した架橋結合方法を使用したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの結合の後、標的ＤＮＡの末端でストレプトアビジンと結合を形成する場合には、標的ＤＮＡは、ビオチンと結合しているＡＦＭ探針を使用してストレプトアビジンとビオチンとの間の結合強度を測定することにより、検出することができる。特に、塩基数１５のＤＮＡの間のハイブリダイゼーション強度は、約２７ｐＮである。これは実際のノイズと大きさにおいてさほど変わらず、差異を識別するのは困難である。ストレプトアビジンとビオチンとの間の結合強度は１００ｐＮより大きいので、図１０に示すように、シグナル対ノイズの比は向上する。
【０１４９】
実施例５．５−抗原−抗体結合を使用する検出感度の向上
プローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡを架橋結合した後、抗原を標的ＤＮＡの末端に結合する。抗体と結合しているＡＦＭ探針を使用して抗原−抗体結合の強度を測定することにより、図１１に示すように標的ＤＮＡを検出することができる。
【０１５０】
実施例５．６−タンパク質−ＤＮＡ結合のＤＮＡチップアッセイ
一本鎖ＤＮＡと、ＡＦＭ探針表面上のＤＮＡと選択的に結合することができるタンパク質とを結合した後、ＤＮＡチップアッセイを実施することができる。タンパク質と一本鎖ＤＮＡとの間の力の測定率は、標的ＤＮＡが高濃度で存在する場合には、減少する。標的ＤＮＡの濃度レベルをより低い程度まで低下させると、力の測定率は増大するであろうし、その場合、これをＤＮＡチップアッセイとして使用することができる。タンパク質−ＤＮＡ結合を検出する条件を最適化することは、当業者の技能の範囲内であるであろう。
【０１５１】
一方で、二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質が、ＡＦＭ探針表面に結合している。ＤＮＡチップアッセイを実施する。低濃度の標的ＤＮＡ中でハイブリダイズさせた後でタンパク質と標的ＤＮＡとの間の力を測定する実験を行った場合、二本鎖ＤＮＡが存在する確率は減少するであろう。標的ＤＮＡの濃度を増大させることにより、二本鎖ＤＮＡを検出する確率は増大し、タンパク質と二本鎖ＤＮＡとの間の力の測定率も増大する（図１２）。
【０１５２】
実施例５．７−三本鎖ＤＮＡ構造に対するＤＮＡチップアッセイ
特定の塩基配列を有する検出ＤＮＡをＡＦＭ探針上に結合し、三本鎖形成を誘発する化学物質又はタンパク質を添加した後に、ＤＮＡチップアッセイを実施する。標的ＤＮＡとプローブＤＮＡとがハイブリダイズする領域では、三本鎖ＤＮＡが形成される。三本鎖ＤＮＡが形成されると、バイオ−ＡＦＭは力を測定することができ、標的ＤＮＡの存在を確認することができる（図１３）。
【０１５３】
実施例５．８−挿入したＤＮＡのＤＮＡチップアッセイ
ＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド）等の二本鎖核酸挿入剤が、ＡＦＭ探針と結合している。標的ＤＮＡとプローブＤＮＡとがハイブリダイズする二本鎖領域での力を測定することによりＤＮＡアッセイを実施することができる（図１４）。
【０１５４】
実施例５．９−ＭｕｔＳタンパク質を使用する一塩基変異アッセイのためのＤＮＡアッセイチップ開発
ＭｕｔＳタンパク質は、完全に相補的なＤＮＡよりもむしろ一塩基変異を有する二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する。ＡＦＭ探針上にＭｕｔＳタンパク質を結合させること、及びＤＮＡとタンパク質との間の結合力を測定することにより、ＤＮＡアッセイを実施する。相補的ＤＮＡ二本鎖が存在する領域においては、力は測定されない。一塩基変異が存在する領域においては、力が測定される。一塩基変異に対するＤＮＡチップアッセイは、検出率が観察される間接的な方法としてではなく、直接的に力を測定することにより実施される（図１５）。
【０１５５】
実施例５．１０−ＤＮＡ間の力測定を使用するデンドロン表面上におけるＤＮＡチップアッセイ
制御されたメソ空間を有するデンドロン固体基板が開示される。表面上の分子種間の空間は、望ましくない立体障害を低減するために維持され、分子種間の相互作用を検出するための環境をもたらす。分子種は、タンパク質、抗原、抗体、シグナルペプチド、膜タンパク質、小分子、ステロイド、グルコース、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含むがこれらに限定されない。したがって、例えば、バイオ−ＡＦＭにより標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定するためにデンドロンの表面を使用することは、非特異的結合を生じないので、分子種間の空間が制御されない環境、又は空間を制御するために混合的な自己集合が使用される環境と比較して性能を向上させるであろう。特に、ストレプトアビジン−ビオチン法又は抗原−抗体法により検出感度を増大させる方法はＤＮＡより大きなタンパク質を含み、デンドロンの拡張的生成は、潜在的な立体障害の問題を解決するであろう。
【０１５６】
デンドロンを調製する方法と、デンドロンで表面又は基板をコーティングする方法と、及びデンドロンの末端に分子種を結合する方法とは、国際公開第２００５／０２６１９１号パンフレット及び国際公開第２００６／０１６７８７号パンフレットで説明され、その内容は、デンドロンを作製する方法と、表面又は基板をコーティングする際におけるデンドロンの使用と、デンドロンの先端への分子種の設置とのために、その全体が参照により本明細書に援用される。ナノレベル又はマイクロレベルのプローブＤＮＡプリンティングのためのディップペン法又はマイクロコンタクトプリンティング法は、前処理したガラス若しくはシリコン表面又は基板上で実施される。分子種が結合し、アレイが作製される。その後標的ＤＮＡをハイブリダイズし、上述のバイオ−ＡＦＭを使用して、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力が測定される（図１６）。アッセイは、架橋結合を使用するストレプトアビジン−ビオチン法、又は抗原−抗体力測定法等の、上述の様々な他の修正した方法により、実施することができる。
【０１５７】
実施例５．１１−ＤＮＡ間の力の測定による、遺伝子発現研究
ＤＮＡチップでの従来の遺伝子発現決定では、組織又は細胞から抽出したｍＲＮＡを逆転写し、蛍光色素を付加し、様々な種類のプローブＤＮＡが結合しているチップ上でハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡを作製する。スポットの蛍光強度を解析する。或る特定の遺伝子の発現レベルをモニタリングすることができる。バイオ−ＡＦＭによる力測定を、このシステムにおいて適用し、遺伝子発現研究の新しい概念を見出すことができる。バイオ−ＡＦＭによる力測定は、ＤＮＡ間の力を測定するための上述の方法、又は架橋結合を使用するストレプトアビジン−ビオチン法、又は抗原−抗体間の力測定法であり得る。
【０１５８】
バイオ−ＡＦＭ力測定法を使用する遺伝子発現決定の例は、以下の通りである。ｍＲＮＡの３’末端は２０個〜２５０個のポリＡを有するので、逆転写によりｃＤＮＡを作製すると、該ｃＤＮＡは相補的なポリＴを含有する。ｃＤＮＡ上のポリＴを検出ＤＮＡに対する結合領域とし、ＡＦＭ探針上のポリＡ検出ＤＮＡ配列を結合させる。力は、次にＡ−Ｔハイブリダイゼーションにより測定される。したがって、ｃＤＮＡと様々なプローブＤＮＡとの間の結合強度の力を測定し、検出率を決定することにより、他と比較してより強く発現している遺伝子が発見される（図１７）。
【０１５９】
加えて、組織又は細胞から抽出されるｍＲＮＡがアッセイには小量であるので、この遺伝子発現研究においては、逆転写によりｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡの量は、遺伝子発現研究には概して十分でない。このため、ｃＤＮＡの量を、線形増幅等の増幅方法により増大させる。しかし、バイオ−ＡＦＭ実験では、検出限界をアトモルレベルまで低減することができる。したがって、ｍＲＮＡ発現レベルの差異についてのアッセイは、逆転写又は増幅を行うことなく直接にプローブＤＮＡを使用して実施することができる。例として、ＡＦＭと結合しているポリＴオリゴヌクレオチド検出ＤＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡと直接結合する。付加的な処理手順なしに、力を測定し、直接ｍＲＮＡを検出する。
【０１６０】
実施例５．１２−ＤＮＡナノアレイの実施
従来のＤＮＡマイクロアレイシステムでは、プローブのアレイをスポットする基板表面は、約１ｍｍ２の面積を含む。対照的に、ナノアレイは、約１０ｎｍ２〜１００ｎｍ２の面積を含む。かかるナノアレイは機器の小型化に有用であり、ケア製品、ＭＥＭＳ及びＮＥＭＳの点において適用される。ＤＮＡアレイは、ディップペン法又はマイクロコンタクトプリンティング法を使用することにより、ナノレベルで製造される。直接的な標的ＤＮＡ検出は、溶液中において、約１ｎｍ２〜１０ｎｍ２の面積を有する基板表面上で、実施される。
【０１６１】
本明細書で引用された全ての引用文献は、その全体が参照により援用される。
【０１６２】
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書で具体的に説明した本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識するだろう、又は確認することができるであろう。かかる均等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的に、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）と、チップ上でこれを使用する、装置、及び生体分子間の分子間相互作用を測定する方法とに関する。本発明は、チップ上での生体分子間の相互作用力の測定における、デンドロンでコーティングしたバイオ−ＡＦＭ探針の使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年６月１４日付けで出願された米国仮特許出願第６０／９４４０５６号明細書に係る出願を基礎とする優先権を主張し、該出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
生物分析科学及び生体工学における最近の進歩は、ＤＮＡチップ非特許文献１，非特許文献２、小型バイオセンサー非特許文献３，非特許文献４及び微小流体素子（例えば微小電気機械システム又はバイオＭＥＭＳ）非特許文献５−７の発達をもたらした。特に、このＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子解析を大幅に加速させるので、重要性が増大しているツールである。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子発現と、変異検出と、単一ヌクレオチド多型解析と、他の多くの用途とのモニタリングに使用されてきた非特許文献８。しかし従来のマイクロアレイは、柔軟性、速度、費用及び感度に限界がある。加えて、生体分子は直接的な高感度検出に有用な固有の特性を欠くので、ほとんどの生化学的アッセイは、標識の二次的検出を必要とする。生物学的診断において最も一般的に使用される標識は、有機蛍光色素である。しかし、それでもなお、有機色素には多くの用途におけるその使用を妨げる光退色及び離散励起バンド等の制約がある非特許文献９。
【０００４】
単一分子の受容体／リガンド対の解離速度論を研究するための、また単一の生体高分子の機械的特性を探索するための、超高感度の力の測定方法の能力を実証する研究の数が増大している非特許文献１０−１３。かかる研究は、生物学的プロセスの領域における（例えば、細胞接着における、タンパク質アンフォールディングにおける、及びＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖の解離に対する）力の役割に対して多くの見識をもたらした非特許文献１４−１６。しかしこれらの発達の多くは、表面の機能性及び／又は均一性が高度に規定された表面及び機器を作り出すことがまだ普通のことでないという点において、利用可能な生体分子表面結合方法により現在妨げられている。本発明者らは、デンドロンアレイの形成に基づき、かかる問題に対処する新しいアプローチを報告した。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドで官能化したデンドロン表面の間の力の測定を通じて、本発明者らは、このアプローチにより修飾した表面の幾つかの独特な特性を観察した非特許文献１７。
【０００５】
その繰り返し単位が１つのコアから直接伸びている錐形分子であるデンドロンは、均一なサイズ及び分子量と、十分に規定された構造とを有する高分枝ポリマーである。表面上での効果的な自己集合のために、そのサイズを正確に制御すること、及びその反応性末端を利用することが可能であるので、デンドロンは、その表面の特徴を分子レベルで精密に調整した新しい材料を作り出すための理想的な構成要素であると考えられる非特許文献１８。錐形によりもたらされるメソ空間形成（mesospacing）は、表面に固定化した捕捉プローブＤＮＡの各々に、入ってきた標的ＤＮＡとの結合のための十分な空間を提供し、溶液（１００：１）中で観察されたのと同様の動力学及び選択性の増強をもたらし、ＤＮＡマイクロアレイの有効性を顕著に向上させることが見出された。さらに、観察された高いハイブリダイゼーション量は、隣接するＤＮＡプローブとの間に十分な空間形成がなされたＤＮＡプローブが、ハイブリダイゼーション時に隣接するプローブ又は標的によって最小限度の立体障害しか被っていないことを実証する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】(1) Fodor, S. P. A. Science 1991, 251, 161-113.
【非特許文献２】(2) Schena, M.; Shalon, D.; Davis, R. W.; Brown, P. O. Science 1995, 270, 467-470.
【非特許文献３】(3) Clark, H. A.; Hoyer, M.; Philbert, M. A.; Kopelman, R. Anal. Chem. 1999, 71, 4831-4836.
【非特許文献４】(4) Dickinson, T. A.; Michael, K. L.; Kauer, J. S.; Walt, D. R. Anal. Chem. 1999, 71, 2192-2198.
【非特許文献５】(5) Harrison, D. J. Science 1993, 261, 895-897.
【非特許文献６】(6) Ramsey, J. M.; Jacobson, S. C; Knapp, M. R. Nat. Med. 1995, 1, 1093-1096.
【非特許文献７】(7) Woolley, A. T.; Mathies, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11348- 11352.
【非特許文献８】(8) Christof M. Niemeyer, D. B. Angewandte Chemie International Edition 1999, 38, 2865-2869.
【非特許文献９】(9) Gerion, D.; Chen, F.; Kannan, B.; Fu, A.; Parak, W. J.; Chen, D. J.; Majumdar, A.; Alivisatos, A. P. Anal. Chem. 2003, 75, 4766-4772.
【非特許文献１０】(10) Allen, S. R.-S., S. M.; Harris, H.; Davies, M. C; O'Shea, P. Biochemical Society Transactions 2003, 31, 1052-1057. .
【非特許文献１１】(11) Clausen-Schaumann, H.; Seitz, M.; Krautbauer, R.; Gaub, H. E. Current Opinion in Chemical Biology 2000, 4, 524-530.
【非特許文献１２】(12) Kellermayer, M. S. AA .; Smith, S. B.; Granzier, H. L.; Bustamante, C. Science1997, 276, 1112-1116.
【非特許文献１３】(13) Hummer, G.; Szabo, A. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 504-513.
【非特許文献１４】(14) Bayas, M. V.; Leung, A.; Evans, E.; Leckband, D. Biophys. J. 2006, 90, 1385- 1395.
【非特許文献１５】(15) Evans, E.; Leung, A.; Heinrich, V.; Zhu, C. Proceedings of the National Academy of Sciences 2004, 101, 11281-11286.
【非特許文献１６】(16) Benoit, M.; Gabriel, D.; Gerisch, G.; Gaub, H. E. Nat Cell Biol 2000, 2, 313-317.
【非特許文献１７】(17) Jung, Y. J.; Hong, B. J.; Zhang, W.; Tendler, S. J. B.; Williams, P. M.; Allen, S.; Park, J. W. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9349-9355.
【非特許文献１８】(18) Hong, B. J.; Oh, S. J.; Youn, T. O.; Kwon, S. H.; Park, J. W. Langmuir 2005, 21, 4257-4261.
【非特許文献１９】(19) Schweitzer, B.; Kingsmore, S. Current Opinion in Biotechnology 2001, 12, 21-27 '.
【非特許文献２０】(20) Zhao, X.; Tapec-Dytioco, R.; Tan, W. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11474-11475.
【非特許文献２１】(21) Nygaard, V.; Holden, M.; Loland, A.; Langaas, M.; Myklebost, O.; Hovig, E. BMC Genomics 2005, 6.
【非特許文献２２】(22) Eastman, P. S.; Ruan, W.; Doctolero, M.; Nuttall, R.; deFeo, G.; Park, J. S.; Chu, J. S. F.; Cooke, P.; Gray, J. W.; Li, S.; Chen, F. F. Nano Lett. 2006, 6, 1059-1064.
【発明の概要】
【０００７】
本願では、出願人は、遺伝子型決定及び遺伝子発現を研究することができる、単純且つ標識不要だが高感度の、力基準の原子間力顕微鏡を使用する本発明のアプローチを説明する。この仕事において本発明者らは、力基準のＡＦＭにより、デンドロンで修飾した表面上のプローブＤＮＡとハイブリダイズした標的ＤＮＡと、ＡＦＭ探針上の検出ＤＮＡとの間の力を測定することにより、遺伝子型決定及び遺伝子発現プロファイリングを試験した。デンドロンで修飾した表面、及びＡＦＭ探針と組み合わせた本検出方法により、その感度は、蛍光標識法を必要とする従来のＤＮＡマイクロアレイの感度よりも優れていた。
【０００８】
本発明の一態様では、標識するプロセスを有しない、遺伝子型決定及び遺伝子発現プロファイリングのための解析ツールとしての力基準の原子間力顕微鏡を対象とする。本発明は、ハイブリダイゼーション／結合の事象に関して十分に測定可能な力をもたらす、ＤＮＡを固定化するためのナノスケールで操作したデンドロン表面にも関する。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ遺伝子型決定研究のための定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的ＤＮＡを標識することなく検出可能な感度を示す。バイオＡＦＭ測定の感度は、遺伝子発現プロファイリングのための従来のマイクロアレイに対して１０５倍増大した。デンドロンで修飾した表面の側方空間形成は、高度に予測可能な大きさであり得る。力基準のＡＦＭは、他のバイオチップシステムと容易に適合させることが可能である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法であって、（ｉ）流体媒体を固体基板と接触させることであって、固体基板がその表面上にデンドロンのアレイを含み、デンドロンの各々が、中心原子、任意にリンカーを介して、中心原子と結合しているプローブ、及び中心原子と結合しているベース部分であって、固体支持体の表面と結合している複数の末端を有するベース部分を含む、並びに（ｉｉ）結合したリガンドとリガンドに対する親和性を有する検出分子との間の結合力を測定することによりプローブ−標的リガンド複合体の存在を決定することであって、検出分子が原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針の表面につなぎ留められており、プローブ−標的リガンド複合体と検出分子との間の力の増大の測定が該プローブ−標的リガンド複合体の存在を示す、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法を対象とする。
【００１０】
好ましい一実施形態では、プローブ−標的リガンド複合体は、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体である。プローブ−標的リガンド複合体は、低濃度の標的リガンドの存在下で検出されてもよく、該リガンドは少なくとも約１ａＭ、又は約１ａＭ〜約１０００ａＭの濃度である。上記方法は、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体における単一ヌクレオチド多型を識別することができる。
【００１１】
検出分子は、検出核酸であり得る。検出分子は、ＲＮＡのポリ−ｄＡセクションと十分に相補的なポリ−ｄＴオリゴマーを含み得る。固体基板は、無孔性の固体支持体であり得る。固体基板は、シリカを含むがこれに限定されない、平面的な無孔性の固体支持体であり得る。原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針は、デンドロンでコーティングされていてもよい。別の実施形態では、標的リガンドは、標識されていなくてもよい。本方法は、架橋結合したプローブ−リガンド複合体をさらに含み得る。又は、プローブ−リガンド複合体は、親和性分子と共有結合していてもよく、且つ検出分子は、親和性分子と特異的に結合する。親和性分子は、抗原又は抗体であり得る。検出分子は、二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質であり得る。又は、プローブ−リガンド複合体は、検出分子と三重らせん構造を形成し得る。検出分子は、ＤＮＡ挿入剤であり得る。検出分子は、二本鎖ＤＮＡのミスマッチセクションと選択的に結合するタンパク質でもあり得る。また、アレイは、チップ上で表示され得る。
【００１２】
本発明は、標的核酸を検出するシステムであって、（ｉ）プローブ分子を固定化したチップと、（ｉｉ）その上に検出分子をつなぎ留めた探針を含む原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）とを含む、標的核酸を検出するシステムも対象とする。該チップは、その上にプローブ分子をつなぎ留めたデンドロンでコーティングされていてもよい。また、ＡＦＭの探針は、その上に検出分子を固定化したデンドロンでコーティングされていてもよい。
【００１３】
本発明のこれらの、及び他の目的は、以下の本発明の説明と、ここで添付した参照図面と、ここで添付した特許請求の範囲とにより、より十分に理解されるであろう。
【００１４】
本発明は、以下に提供する詳細な説明と、添付した図面とからより十分に理解されるであろう。この詳細な説明と図面とは、例示として与えられているにすぎず、したがって本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ａ：本研究の範囲内で説明する測定のために採用した実験設定の概要を示す図である。標的ＤＮＡを、デンドロンで修飾した表面上に固定化したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせた後、検出ＤＮＡをつなぎ留めているＡＦＭ探針と、基板とを離接させることにより、力の測定値を記録した。 ｂ：典型的な測定（挿入図：出力の減少（retract traces）（青色の曲線））、及び相補的な１５ｍｅｒの配列に対して記録した接着力の分布を示す図である。
【図２】ａ：成熟真核生物ｍＲＮＡの構造を示す図である。十分にプロセシングされたｍＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含む。 ｂ：デンドロン表面上に固定化した６４種類のプローブＤＮＡと、ユニバーサルヒト基準全ＲＮＡ（ＵＨＲＲ）から調製したｃＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイ実験の蛍光画像を示す図である。白い矢印は、プローブ番号６２のＤＮＡを示す。 ｃ：０．６２ｆｇ／μｌのＵＨＲＲとのハイブリダイゼーション後の力のマッピング画像を示す図である。
【図３】ａ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である。 ｂ：バイオ−ＡＦＭを使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図４】ａ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である（標的ＤＮＡ １ｐＭ）。 ｂ：蛍光標識を使用するＤＮＡチップアッセイを示す図である（標的ＤＮＡ １００ｆＭ）。
【図５】ａ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １ｐＭ）。 ｂ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １０ｆＭ）。 ｃ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １００ａＭ）。 ｄ：バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である（標的ＤＮＡ １ａＭ）。
【図６】標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力−距離測定結果を示す図である。
【図７】標的ＤＮＡ濃度と検出感度との間の直線関係を示す図である。
【図８】バイオ−ＡＦＭを使用する非相補的な標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力の地図を示す図である。
【図９】架橋結合したプローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡのＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１０】ストレプトアビジン−ビオチン結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１１】抗原−抗体結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１２】タンパク質−ＤＮＡ結合のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１３】三本鎖ＤＮＡ構造のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１４】挿入したＤＮＡのＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１５】ＭｕｔＳタンパク質を使用する一塩基変異のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１６】ＤＮＡ間の力の測定を使用するデンドロン表面のＤＮＡチップアッセイを示す図である。
【図１７】バイオ−ＡＦＭを使用する遺伝子発現決定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願において「a」及び「an」は、単数及び複数の両方の対象を表すために使用される。
【００１７】
本明細書で用いられるところの「アプタマー」は、一本鎖の、部分的に一本鎖の、部分的に二本鎖の、又は二本鎖のヌクレオチド配列、有利には複製可能なヌクレオチド配列であって、ワトソン−クリック塩基対形成又は三本鎖形成以外のメカニズムにより、選択された非オリゴヌクレオチド分子又は分子群を特異的に認識することができるヌクレオチド配列を意味する。
【００１８】
本明細書で用いられるところの「親和性分子」は、プローブ／標的リガンド複合体と結合している分子を表す。親和性分子は、プローブ、標的リガンド又は両方と結合することができ、このプローブ、標的リガンド又は両方は、プローブ／標的リガンド複合体の存在を検出するために、後に検出分子により検出される。親和性分子は、いずれかのタイプの生体分子であり得る。かかる親和性分子の例は抗原であり、これは上記複合体と結合し、原子間力顕微鏡の探針の表面に取り付けられた検出抗体により検出される。別の例は、ストレプトアビジンと結合したプローブ／標的リガンド複合体を含む。原子間力顕微鏡の探針の表面につなぎ留められた「検出ビオチン」は、間接的にプローブ／リガンド複合体の存在を示すストレプトアビジンの存在を検出するために使用される。
【００１９】
本明細書で用いられるところの「アレイ」及び「ライブラリ」は、本明細書では交換可能な用語として使用され、無作為又は無作為でない、分子、材料、表面、構造的形状、表面特徴、又は任意に且つ非限定的に、様々な化学的部分（chemical entities）、モノマー、ポリマー、構造、前駆体、生成物、修正物（modifications）、誘導体、物質、立体構造、形状若しくは特徴の、混合物、収集物又は組合せ（assortment）を表す。「アレイ」又は「固体支持体上の領域のアレイ」は、固体支持体の表面に形成される、各々が有限の面積を有する好ましくは分離した領域の、線形アレイ又は二次元アレイを表す。
【００２０】
本明細書で用いられるところの「アレイライブラリ（arrayed library）」は、固体基板上のマイクロタイター（マルチウェル）ディッシュ又はプレートにおける二次元アレイに設置される個々のプローブ分子を表す。プレートの同一性と、そのプレート上のクローンの位置（行及び列）とが重要である。クローンのアレイライブラリは、特定の遺伝子又は目的の遺伝子領域についてのスクリーニング、及び物理地図の作成、遺伝子型決定、ＳＮＰの同定、遺伝子発現プロファイリング等を含む、多くの用途のために使用され得る。
【００２１】
本明細書で用いられるところの「二官能性」、「三官能性」及び「多官能性」は、合成ポリマー又は多価ホモポリマー性若しくはヘテロポリマー性ハイブリッド構造に関して使用される場合には、２つ、３つ若しくは複数の特異的認識要素、規定された配列セグメント、若しくは結合部位であり得るか、又はそれらを含む場合のように、二価、三価又は多価を意味する。
【００２２】
本明細書で用いられるところの「バイオチップ」又は「チップ」は、より高いスループット及び速度を実現するために、多くの試験を同時に行うことを可能にする、固体基板上に配置した小型試験部位の収集物（マイクロアレイ又はナノアレイ）である。バイオチップは、伝統的に大きな検知ツールをさらに小さい空間に詰め込むために使用される。これらのチップは、本質的に、何百又は何千もの生化学反応を同時に行うことができる小型の実験室である。バイオチップは、研究者が、疾患診断からバイオテロ剤の検出までの様々な目的のために多数の生物学的分析対象を迅速にスクリーニングすることを可能にする。実際の検知用構成部分（すなわち「チップ」）は、分析システム全体のほんの一部分である。実際の検知事象（ＤＮＡ結合、酸化／還元等）をコンピュータが理解可能な形式（力、電圧、光強度、質量等の測定値）に翻訳するために、変換が行われる必要があり、それによりその後、付加的な分析とヒトが読むことができる最終的な出力をもたらすための処理とが可能となる。チップは、典型的には、集積回路を製作するために伝統的に使用されるマイクロリソグラフィー法を使用して製造される。
【００２３】
本明細書で用いられるところの「生体模倣（biomimetic）」は、生物学的な分子、分子群、構造を模倣する分子、基、多分子構造又は方法を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられるところの、基板上に固定化したプローブライブラリに関して使用される「ｃＤＮＡライブラリ」は、標的リガンドに特異的であり得るプローブ分子から構成されるライブラリを表す。
【００２５】
本明細書で用いられるところの「樹枝状分子」は、コアまで又はコアから分枝した層の連続付加又は段階付加（generationaladdition）により形成される規則的な樹枝状分枝を示す分子である。
【００２６】
「デンドロン」という用語は、コアまで又はコアから分枝した層の連続付加又は段階付加により形成される規則的な樹枝状分枝を示すポリマーを表す。樹枝状ポリマーという用語は、コアと、少なくとも１つの内部分枝層と、表面分枝層とを特徴とする「デンドリマー」を包含する（例えば、Petar et al. Pages 641-645 In Chem. in Britain、（August 1994）を参照されたい）。「デンドロン」は、焦点又は中心原子から分枝が出ているデンドリマーの一種であり、直接的に、又は連結部分を介してコアに連結されており、又は連結されることがあり、デンドリマーを形成する。多くのデンドリマーは、共通のコアに連結された２つ以上のデンドロンを含む。
【００２７】
デンドロンは、対称的及び非対称的な分枝デンドリマー、カスケード分子、アルボロール（arborol）等を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、分枝アームは、長さが等しい。しかし、非対称的なデンドリマーも使用され得ることも意図される。
【００２８】
さらに、分枝層の規則的な連続付加により形成されるのではない場合であっても、高分枝ポリマー、例えば高分枝ポリオールは、分枝パターンがデンドリマーの分枝パターンに近い程度の規則性を示す樹枝状ポリマーと均等であり得ることが理解される。
【００２９】
本明細書で用いられるところの、「検出ＤＮＡ」、「検出リガンド」、「検出オリゴマー」等の「検出分子」は、プローブ／標的複合体における結合力を決定するために使用されるＡＦＭの探針と結合している分子を表す。
【００３０】
本明細書で用いられるところの、巨大分子又はデンドロン構造を説明するために使用される「高分枝」又は「分枝」は、基板と共有結合又はイオン結合することができる複数の末端を有する複数のポリマーを表すことを意味する。一実施形態では、分枝構造又は高分枝構造を含む巨大分子は、「予め作製され（pre-made）」、次に基板と結合する。したがって、本発明の巨大分子は、米国特許第５，６２４，７１１号明細書（Sundberg et al.）に開示される架橋結合法によるポリマーを除く。
【００３１】
本明細書で用いられるところの「固定化した」は、不溶化したこと、又は不溶性の、部分的に不溶性の、コロイド性の、粒子性の、分散した、懸濁した及び／又は脱水した物質、若しくは固体支持体を含む若しくは固体支持体と結合している分子若しくは固相を含むこと、これと結合していること若しくはこれと操作可能に関連することを意味する。
【００３２】
本明細書で用いられるところの「リンカー分子」及び「リンカー」は、分枝／直鎖ポリマー等の大きさを制御した巨大分子の分枝部分を保護基又はリガンドに連結する分子に関して使用され得る。リンカーは、例えばスペーサ分子、例えばリガンドをデンドロンと結合することができる選択された分子を含み得るが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で用いられるところの、標的リガンドが検出可能であるように必要とされる「低濃度」の標的リガンドは、本発明の標的リガンド検出方法の強力な感度を示すために、本明細書において使用される。この標的リガンドの検出可能な量の濃度のかかる下限は、１ａＭ〜１００００ａＭ、１ａＭ〜１０００ａＭ、１ａＭ〜１００ａＭ、又は１ａＭ〜１０ａＭの濃度を含み得る。
【００３４】
本明細書で用いられるところの「低密度」は、１ｎｍ２当たり約０．００５〜約０．５のプローブ、好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０１〜約０．２のプローブ、より好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０１〜約０．１のプローブ、及び最も好ましくは１ｎｍ２当たり約０．０５のプローブを表す。
【００３５】
本明細書で用いられるところの「マイクロアレイ」は、分離した領域の密度が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２である、領域のアレイを表す。マイクロアレイにおける領域は、例えば約１０μｍ〜２５０μｍの範囲の直径のような典型的な寸法を有し、アレイ中においておよそ同じ距離で他の領域と分離され得る。マイクロアレイは、転写の発現、又は一連の細胞における発現した遺伝子のプロファイル、又は遺伝子中における変異の検出を試験するために採用することができる、選択された一連のプローブ分子を含み得る。
【００３６】
本明細書で用いられるところの「ナノアレイ」は、分離した領域の密度が少なくとも約１０００／ｍｍ２、好ましくは少なくとも約１０００００／ｍｍ２である、領域のアレイを表す。ナノアレイにおける領域は、例えば約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の直径のような典型的な寸法を有し、アレイ中においておよそ同じ距離で他の領域と分離され得る。ナノアレイは、転写の発現、又は一連の細胞における発現した遺伝子のプロファイル、又は遺伝子中における変異の検出を試験するために採用することができる、選択された一連のプローブ分子を含み得る。
【００３７】
本明細書で用いられるところの「分子模倣体（molecular mimics）」及び「模倣体（mimetics）」は、例えば天然分子、生物学的分子又は選択性分子のような別の分子又は分子群の構造又は機能と同等又は類似の構造又は機能を有するように設計、選択、製造、修飾又は操作された（engineered）天然又は合成のヌクレオチド分子又は非ヌクレオチド分子又は分子群である。分子模倣体は、天然分子、合成分子、選択性分子又は生物学的分子の置換形態（replacements）、代替形態、改良形態（upgrades）、改善形態（improvements）、構造的類似体又は機能的類似体として機能することができる分子及び多分子構造を含む。
【００３８】
本明細書で用いられるところの「ヌクレオチド類似体」は、核酸合成及び加工、好ましくは酵素的及び化学的な合成及び加工において天然の塩基の代わりに使用することができる分子、特に塩基対形成が可能な修飾ヌクレオチドと、任意にアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル又は微量塩基を含まない合成塩基とを表す。この用語は、修飾プリン及びピリミジンと、微量塩基と、変換可能なヌクレオシドと、プリン及びピリミジンの構造的類似体と、標識、誘導体化及び修飾したヌクレオシド及びヌクレオチドと、複合体形成したヌクレオシド及びヌクレオチドと、配列修飾剤と、末端修飾剤と、スペーサ修飾剤と、骨格を修飾したヌクレオチドとを含むがこれらに限定されず、該骨格を修飾したヌクレオチドは、リボース修飾ヌクレオチドと、ホスホロアミデートと、ホスホロチオエートと、ホスホンアミダイト（phosphonamidites）と、メチルホスホネートと、メチルホスホラミダイトと、メチルホスホンアミダイト（methylphosphonamidites）と、５’−β−シアノエチルホスホラミダイトと、メチレンホスホネートと、ホスホロジチオエートと、ペプチド核酸と、アキラル及び中性ヌクレオチド間結合と、ポリエチレングリコール、芳香族ポリアミド及び脂質等の非ヌクレオチド架橋とを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で用いられるところの「ポリマー」又は「分枝ポリマー／直鎖ポリマー」は、分枝部分が基板と結合し直鎖部分がリガンド、プローブ又は保護基と結合するように、分子の１つの端に分枝構造を、及び他の端に直鎖部分を有する分子を表す。
【００４０】
本明細書で用いられるところの「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために、本明細書では交換可能な用語として使用される。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。この用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸を連結する伝統的なペプチド結合についての変異体も含み得る。
【００４１】
本明細書で用いられるところの「保護基」は、分子上の反応基（例えばヒドロキシル又はアミン）と連結した基を表す。保護基は、化学反応の１つ又は複数の工程時における特定の遊離基の反応を防止するために選択される。一般的に特定の保護基は、分子中に存在する他の反応基を変化させずに反応基を復元するために後で除去することができるように、選択される。保護基の選択は、保護すべき特定の遊離基と、該遊離基が曝露される化合物とに応じて決まる。保護基の選択は、当業者に既知である。例えば、Greene etal., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons,Inc. Somerset, N.J. (1991)（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００４２】
本明細書で用いられるところの「保護されたアミン」は、アミノ保護基と反応したアミンを表す。アミノ保護基は、直鎖の先端の官能基がアミノ基である状況において、固体支持体への分枝末端の結合時におけるアミド機能の反応を防止する。アミノ保護基は、後で除去し、分子中に存在する他の反応基を変化させずにアミノ基を復元することができる。例えば、環外アミンを、ジメチルホルムアミドジエチルアセタールと反応させ、ジメチルアミノメチレンアミノ（dimethylaminomethylenamino）機能を形成することができる。アミノ保護基は一般に、カルバメートと、ベンジルラジカルと、イミデートと、当業者に既知の他のものとを含む。好ましいアミノ保護基は、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル又はジメチルアミノメチレンアミノを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で用いられるところの「規則的な間隔」は、大きさを制御した巨大分子の先端の間の空間形成を表し、それは、実質的に立体障害なしに標的特異的リガンドと標的との間で相互作用する空間をもたらすための、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの距離である。したがって、基板上の巨大分子の層の密度は高すぎないため、特異的な分子相互作用が生じ得る。
【００４４】
本明細書で用いられるところの「固体支持体」は固定化マトリクスを含む組成物を表し、該固定化マトリクスは、不溶化した物質、固相、表面、基板、層、コーティング、織り繊維若しくは不織繊維、マトリクス、結晶、膜、不溶性ポリマー、プラスチック、ガラス、生物学的若しくは生体適合性若しくは生体侵食性（bioerodible）若しくは生分解性のポリマー若しくはマトリクス、マイクロ粒子又はナノ粒子を含むがこれらに限定されない。固体支持体は、例えば、単一層、二重層、商業的膜、樹脂、マトリクス、繊維、分離媒体、クロマトグラフィー支持体、ポリマー、プラスチック、ガラス、雲母、金、ビーズ、マイクロスフェア、ナノスフェア、シリコン、ヒ化ガリウム、有機金属及び無機金属、半導体、絶縁体、マイクロ構造並びにナノ構造を含むがこれらに限定されない。マイクロ構造及びナノ構造は、超小型、ナノメートルスケール且つ超分子のプローブ、探針、バー、ペグ、プラグ、棒、スリーブ、ワイヤ、フィラメント及びチューブを含み得るが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で用いられるところの「特異的結合」は、リガンドとその特異的結合パートナーとの間の、又は規定の配列セグメントと選択された分子又は選択された核酸配列との間の、測定可能であり且つ再現性がある程度の引力を表す。引力の程度は、最適であるために最大である必要はない。弱い、中程度の又は強い引力が、様々な用途にとって適当であり得る。これらの相互作用において起こる特異的結合は、当業者に既知である。規定の合成配列セグメントと、合成アプタマーと、合成ヘテロポリマーと、ヌクレオチドリガンドと、ヌクレオチド受容体と、形状認識要素と、特異的に引力を有する表面とに関して使用され得る。「特異的結合」という用語は、構造的形状及び表面特徴の特異的認識を含み得る。その他、特異的結合は、いずれかの特異的結合パートナーとの化学的同一性（すなわち、１つ又は複数の同一の化学的な群）又は分子認識特性（すなわち、分子結合特異性）を共有する第３の分子（すなわち、競合体）により競合的に阻害され得る２つの分子（すなわち、特異的結合パートナー）の間の特異的、飽和的及び非共有的な相互作用を明確に表す。競合体は、例えば交差反応体、又は抗体若しくはその抗原の類似体、リガンド若しくはその受容体、又はアプタマー若しくはその標的であり得る。抗体とその抗原との間の特異的結合は、例えば、交差反応する抗体により、又は交差反応する抗原により、競合的に阻害され得る。「特異的結合」という用語は、特異的結合及び構造的形状認識の両方を含む特異的認識のサブセットの概略を示す又はそれを省略するために、便宜的に使用され得る。
【００４６】
本明細書で用いられるところの「基板」は、物質、構造、表面又は材料に関して使用される場合には、特異的結合、ハイブリダイゼーション若しくは触媒認識部位、又は複数の様々な認識部位、又は表面、構造若しくは材料を含む様々な分子種の数を超える多数の様々な認識部位を含むことが今までに知られていない非生物学的な、合成的な、無生物の、平面的な、球形の、又は扁平な表面を含む組成物を意味する。基板は、例えば半導体、合成（有機）金属、合成半導体、絶縁体及びドーパント；金属、合金、要素、化合物及びミネラル；合成の、切断した、エッチングした、リソグラフした、プリンティングした、機械加工した、及び微細加工したスライド、素子、構造及び表面；工業的ポリマー、プラスチック、膜；シリコン、ケイ酸塩、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、段ボール紙、綿、羊毛、衣類、織り繊維若しくは不織繊維、材料及び布；分枝／直鎖ポリマーを介するプローブ分子の固定化により修飾されていないナノ構造及びマイクロ構造を含み得るが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられるところの、アレイシステムとの関連での「標的（target）」又は「標的化すること（targeting）」は、プローブを使用することによりその同一性又は存在量を検出しようとする遊離の核酸転写産物又はそのｃＤＮＡを表し、そのためにプローブ分子が作製される個々の遺伝子を特に表す。或る特定の文脈では、「標的化すること」は、プローブ分子を内因的に発現した転写産物又はそのｃＤＮＡと結合すること、又は結合させることを意味する。標的ヌクレオチド配列は、限定されることなく、いずれかの遺伝子から選択され得る。
【００４８】
本明細書で用いられるところの、標的ライブラリに関して使用される「標的ｃＤＮＡライブラリ」は、逆転写酵素により全てがｃＤＮＡ分子に変換された、細胞又は生物中に存在するｍＲＮＡ分子の全ての収集物を表すので、ライブラリは目的の特異的なｃＤＮＡ（及びしたがってｍＲＮＡ）に対して探索され得る。
【００４９】
本明細書で用いられるところの「標的−プローブ結合」は、少なくとも１つが選択された分子である２つ以上の分子であって、特異的な様式で互いに結合している、２つ以上の分子を意味する。典型的には、第１の選択された分子は、第２の分子と、間接的に、例えばスペーサアーム、基、分子、架橋、担体若しくは特異的認識パートナーを介して、又は直接的に、すなわち、スペーサアーム、基、分子、架橋、担体若しくは特異的認識パートナーを介さずに、有利には直接の結合により、結合し得る。選択された分子は、ハイブリダイゼーションを介してヌクレオチドと特異的に結合し得る。ヌクレオチド及び非ヌクレオチド分子の複合体形成のための他の非共有的結合の手段は、例えばイオン結合、疎水的相互作用、リガンド−ヌクレオチド結合、キレート剤／金属イオン対形成、又はアビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）抗体／ＤＮＰ、抗ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン、若しくはより一般的には受容体／リガンド等の特異的結合対形成を含む。例えば標識する目的でアビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、抗フルオレセイン抗体／フルオレセイン、抗ペルオキシダーゼ抗体／ペルオキシダーゼ、抗ＤＮＰ抗体／ＤＮＰ、抗ジゴキシゲニン抗体／ジゴキシゲニン若しくは受容体／リガンドを使用して、（すなわち、直接的結合又は共有的結合しているのではなく）選択された分子若しくは選択された核酸配列と結合している、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、ローダミン、フルオレセイン、フィコエリトリン、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、又は蛍光マイクロスフェア等のレポーター分子は、特異的結合対により、選択された分子若しくは選択された核酸配列と複合体を形成し得る。
【００５０】
文脈上他に必要な場合以外は、「リガンド」という用語は、プローブと選択的に結合することができるいずれかの物質を表す。リガンドは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモン等を含む）、酵素、基質、薬剤、薬剤−受容体、細胞表面、受容体アゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト、アンタゴニスト、応答誘発性若しくは刺激性分子、薬剤、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、増殖因子、サイトカイン、補欠分子族、補酵素、補因子、基質、前駆体、ビタミン、毒素、調節因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子模倣体、構造分子、エフェクター分子、選択性分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、交差反応体、類似体、競合体、又はこれらの分子の誘導体と、選択された標的と特異的に結合することができるライブラリで選択された非オリゴヌクレオチド分子と、これらの分子のいずれかを第２の分子と結合させることにより形成される複合体と、対応プローブに選択的に結合するいずれかの他の分子とであり得る。
【００５１】
文脈上他に必要な場合以外は、「プローブ」という用語は、基板表面に結合しており、対応リガンドと選択的に結合することができるいずれかの物質を表す。プローブは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモン等を含む）、酵素、基質、薬剤、薬剤−受容体、細胞表面、及び対応リガンドに選択的に結合するいずれかの他の分子であり得る。
【００５２】
「リガンド」及び「プローブ」という用語は、いずれかの特定の物質又は大きさの関係を表さないことが理解されるべきである。これらの用語は、リガンドと対応プローブとの間の選択的な結合を示す操作上の用語であるにすぎず、基板表面に結合する部分をプローブと称し、プローブと選択的に結合するいずれかの物質をリガンドと称する。したがって抗体が基板表面に結合している場合には、抗体がプローブであり、対応する抗原がリガンドである。しかし、抗原が基板表面に結合している場合には、抗原がプローブであり対応する抗体がリガンドである。
【００５３】
基板表面上におけるプローブの濃度は、固定化したプローブとその対応リガンドとの間の相互作用に影響を及ぼす、鍵となる要因の１つである。幾つかの利点にも関わらず、高密度で固定化したプローブは、自然環境に存在する同一のプローブの特性と実質的に異なる化学的及び生物学的特性を有することが多い。さらに、不活性でない高密度のプローブは、非特異的なプローブ−リガンド相互作用を促進し得る。表面材料を立体障害から解放する一方で、バイオセンサー及びバイオチップ等の用途に十分なシグナル強度と、特異性と、見かけの結合容量とを維持するためにも、表面に結合したプローブの密度を変化させることが望ましい。
【００５４】
従来から、薄膜の官能基密度は、不活性な吸着質と官能化した吸着質との両方の同時成膜により、通常調整される。しかし、特に基間の強い相互作用が存在する場合には、相異なる官能基を有するマイクロスケール又はナノスケールの微視的領域への相分離を防止することは困難である。
【００５５】
本発明の組成物及び方法は、相分離を顕著に低減するプローブ密度を提供する。本発明の幾つかの実施形態は、その表面上に複数の錐形のデンドリマーを含む基板を提供する。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では各デンドリマーの末端は基板表面と結合することができ、各デンドリマーの先端はプローブの固定化に対して反応性である。
【００５６】
遺伝子型決定のための、バイオ−ＡＦＭを使用する標的ＤＮＡの検出
ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子についてのハイスループットの多重解析のための革命的なツールである。微量の遺伝物質しか入手できないことがあるため、マイクロアレイに基づく解析のための高感度の検出方法を開発することが重要である。典型的にはシグナル出力は、２つの分類、すなわち標的増幅とシグナル増幅とに分類される増幅方法により増強される非特許文献１９。遺伝子発現解析における標的増幅の利点及び欠点が、最近レビューされた非特許文献２０。広範な利用可能性に関わらず、ＰＣＲによる標的増幅は、単位複製配列のキャリーオーバーによる材料の汚染、多重化のための能力の制限、増幅効率の変動等の欠点を有する。小量のコピーの試料からのｍＲＮＡの増幅も、初期ＲＮＡ比の歪みと、ノイズ比の増大との問題を有する非特許文献２１。
【００５７】
加えて、生体分子は直接的な高感度検出に有用な固有の特性を欠くので、ほとんどの生化学的アッセイは、標識の二次的検出を必要とする。生物学的診断において最も一般的に使用される標識は、有機蛍光色素である。しかし、それでもなお、有機色素には多くの用途におけるその使用を妨げる光退色及び離散励起バンド等の制約がある。
【００５８】
過去の研究において、本発明者らは、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアレイを含むナノスケールで操作したデンドロン表面がどのようにしてハイブリダイゼーションの事象に関する測定可能な引力及び接着力をもたらすことができるのかを示した。重要なことに、本発明者らは、１０の塩基対の差異を有するＤＮＡ二本鎖間を識別することができる引力及び接着力を検出するためにこのシステムを使用することができ、この測定方法も１つ及び２つの塩基対のミスマッチを検出する感度を有することを示した非特許文献１７。
【００５９】
以下の実施例１〜実施例４で説明するように、１ａＭの標的ＤＮＡ（３５オリゴマー）をデンドロンで修飾した表面上のプローブＤＮＡ（１５オリゴマー）とハイブリダイズすると、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の特定の力（ヒストグラム曲線においてガウスフィッティングにより２６±０．６ｐＮ）を測定する確率は８０％であり、２０％の力−距離曲線では力は観察されなかった（図１（ｂ））。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的分子を標識することなく検出可能な感度を示す。
【００６０】
したがって、デンドロンで修飾した表面は一塩基変異さえも検出するプラットホームとして使用することができるので、本発明のＡＦＭシステムは、遺伝子型決定だけでなく標的ＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出にも適用することができる。一塩基がミスマッチを生じている標的ＤＮＡについては、表面上のプローブＤＮＡと結合する標的ＤＮＡの数は、相補的標的ＤＮＡの結合数よりも小さい。したがって、表面に結合した標的ＤＮＡの数の減少を測定することにより、一塩基がミスマッチを生じている標的ＤＮＡと相補的標的ＤＮＡとを識別することができる。
【００６１】
遺伝子発現プロファイリング研究のための、バイオ−ＡＦＭを使用するｃＤＮＡ標的の検出
発現プロファイリング研究は、実験条件を変化させたときに、統計的に有意な差異を示した遺伝子を報告することが一般的である。ＤＮＡマイクロアレイとｑＰＣＲとの両方が、相補的核酸配列の選択的（preferential）結合又は「塩基対形成」を利用し、両方が遺伝子発現プロファイリングにおいて、しばしば連続的に、使用される。ハイスループットＤＮＡマイクロアレイはｑＰＣＲの定量精度を欠くが、ｑＰＣＲにより数十の遺伝子の遺伝子発現を測定するには、ＤＮＡマイクロアレイを使用して全ゲノムを測定するのに必要な時間とほぼ同じ時間がかかる。したがって、候補遺伝子を同定するために半定量ＤＮＡマイクロアレイ解析実験を行い、その後、最も関心のある候補遺伝子の幾つかに対してｑＰＣＲを行いマイクロアレイの結果を有効にすることが意味をなすことが多い。しかし、本発明のバイオ−ＡＦＭは、ＤＮＡマイクロアレイ及びｑＰＣＲの幾つかの利点を組み合わせることができる。
【００６２】
ポリアデニル化は、核におけるＤＮＡからＲＮＡへの転写後に起こる。ポリアデニル化のシグナルが転写された後、ＲＮＡポリメラーゼと関連したエンドヌクレアーゼ複合体の作用によりｍＲＮＡ鎖は切断される。切断部位は、該切断部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、５０個〜２５０個のアデニン残基を、切断部位で非結合の３’末端に付加する。この反応は、ポリアデニル酸ポリメラーゼにより触媒される（図２（ａ））。以下の実施例１〜実施例４で示すように、バイオ−ＡＦＭ測定の感度は、マイクロアレイの１０５倍増大した（図２（ｃ））。
【００６３】
マイクロアレイシステム
プローブ分子を含む様々なタイプの特定のアレイが、多様な動物、植物及び微生物の細胞又は組織において差示的に発現した遺伝子を同定するために、本発明により提供される。これらのタイプのアレイは、発生アレイ、癌アレイ、アポトーシスアレイ、発癌遺伝子及び腫瘍抑制因子アレイ、細胞周期遺伝子アレイ、サイトカイン及びサイトカイン受容体アレイ、増殖因子及び増殖因子受容体アレイ、神経アレイ（neuroarray）等を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
本発明のアレイは、他の用途の中でも、差示的な遺伝子発現アッセイにおいて使用することができる。例えばアレイは、（ａ）疾患状態（例えば新生物又は正常）、（ｂ）様々な組織のタイプ、（ｃ）発生段階、（ｄ）外的又は内的刺激への応答、（ｅ）治療への応答、等の差示的な発現解析において有用であり得る。アレイはまた、薬剤の発見及び研究のための大規模の発現スクリーニングにおいて、有用であり得る。加えて、遺伝子発現に対する特定の細胞タイプにおける活性作用物質の効果を研究することにより、薬剤毒性、発癌性、環境モニタリング等についての情報を取得及び解析することができる。
【００６５】
一態様では、本発明は、約１ｃｍ２未満の表面積において少なくとも１０３の相異なるプローブ分子のマイクロアレイを有する表面を有する基板を含む。各々の相異なるプローブ分子は、（ｉ）アレイにおける別々の、規定の位置に配置されており、且つ（ｉｉ）約０．１フェムトモル〜１００ナノモルの規定量で存在する。
【００６６】
標的ｃＤＮＡが取得される細胞は、正常細胞等の目的の細胞から、又は肝臓癌、肺癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、直腸癌、大腸癌、前立腺癌、甲状腺癌及び皮膚癌等の様々なタイプの癌細胞、並びに肥満症、毛包、自己免疫疾患及び代謝障害の細胞から選択され得る。
【００６７】
好ましい一実施形態では、各マイクロアレイは、約１ｃｍ２未満の表面積当たり少なくとも１０３種類の相異なるプローブ分子を含有する。マイクロアレイは、約１６ｍｍ２の面積中に少なくとも約４００の領域、又は１ｃｍ２当たり２．５×１０３の領域を含有し得る。また、好ましい一実施形態では、各マイクロアレイ領域におけるプローブ分子は、ポリヌクレオチドの場合においては、約０．１フェムトモル〜１００ナノモルの規定量で存在し得る。
【００６８】
また、好ましい一実施形態では、プローブ（proble）ポリヌクレオチドは、少なくともヌクレオチド数約１０の長さを有し、様々なｉｎ ｓｉｔｕでの合成スキームにより、高密度アレイにおいて形成され得る。
【００６９】
デンドロン
本発明の幾つかの態様は、デンドロンのアレイを提供する。一般的には、アレイは、少なくとも第１の表面を有する固体支持体と、固体支持体の第１の表面と結合している複数のデンドロンとを含む。各デンドロンが、典型的には、中心原子と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基又は保護された形態の官能基と、中心原子と結合しているベース部分であって、固体支持体の第１の表面と結合している複数の末端を有するベース部分とを含む。本明細書で用いられるところの「中心原子」という用語は、分枝が出ている焦点原子を表す。例えば中心原子は、以下の式Ｉにおいて、Ｑ１として表わされる。デンドロンを表すときの「ベース部分」という用語は、中心原子から出ている複数の分枝を含む部分を表す。幾つかの実施形態では、デンドロンは、固体支持体表面と結合している錐体のベース部分を有する錐形として記載され、又は概略的に示され得る。
【００７０】
官能基（又は部分）は、化学反応に関与する分子内の原子又は原子群を表す。一般的には、官能基はヘテロ原子（ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン（phosphorous）等）又は不飽和（例えば、炭素−炭素二重結合又は三重結合）を含む。代表的な官能基は、アシルハロゲン化物、アルコール、ケトン、アルデヒド、炭酸酸（エステルを含む）、カルボン酸塩、カルボン酸、エーテル、ヒドロペルオキシド、過酸化物、ハロゲン化物、オレフィン、アルキン、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアン酸塩、イソシアン酸塩、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ、ニトロソ、ホスフィン、ホスホジエステル、ホスホン酸、ホスホン酸塩、硫化物、チオエーテル、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、チオール、チオシアン酸塩、二硫化物、チオアミド、チオエステル、チオケトンを含むがこれらに限定されない。官能基は、求核反応又は求電子反応の対象となることが多い。幾つかの実施形態では、デンドロンの官能基は、求核反応に参加することができる。したがって官能基は、求核試薬又は求電子試薬であり得る。官能基は、プローブを結合するようになっていることが多い。特定の一例では、官能基は求核置換反応によりプローブと結合を形成することができる。
【００７１】
官能基は広範なプローブを結合するために使用され、その後該プローブを流体媒体における対応リガンドの存在を検出するために使用することができる。典型的には、官能基がプローブと結合している場合には、プローブの識別効率（例えば、非特異的結合と比較したときの標的特異的結合の量）は、少なくとも約５０％、多くの場合少なくとも約７０％、より多くの場合少なくとも約８０％、最も多くの場合少なくとも約９０％である。特定の一実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチドプローブと結合しており、溶液中におけるヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチド標的が使用される場合には、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）識別効率は、少なくとも約８０％（１：０．２）、多くの場合少なくとも約９０％（１：０．１）、より多くの場合少なくとも約９５％（１：０．０５）、より多くの場合少なくとも９９％（１：０．０１）である。
【００７２】
プローブの識別効率は、様々な方法のいずれかにより、例えば、実質的に同様の反応条件下でのプローブ−リガンド複合体形成の効率及び／又は選択性の比較により、決定することができる。ＳＮＰ識別効率も、同様に決定することができる。識別効率を測定する代表的な１つの方法は、基板表面に結合した標的特異的プローブのシグナル強度を、基板に結合した標的非特異的プローブのシグナル強度とを比較することである。例えば、基板表面と結合した標的特異的プローブが１０ｎＭの標的濃度で１００のシグナル強度をもたらし、基板表面と結合した標的非特異的プローブが同じ標的濃度で３０のシグナル強度をもたらす場合には、基板表面上におけるプローブの識別効率は、（１００−３０）／１００、すなわち７０％（１：０．３）である。
【００７３】
幾つかの実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５〜２１のオリゴヌクレオチドプローブと結合している場合には、基板と結合した標的非特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブと、少なくとも１個、多くの場合少なくとも２個、より多くの場合少なくとも３個のヌクレオチドが異なるオリゴヌクレオチドプローブ）のシグナル強度は、基板と結合した標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、標的ＤＮＡの全体又は一部分と完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ）のシグナル強度と比較して、少なくとも約７０％、多くの場合少なくとも約８０％、より多くの場合少なくとも約９５％、さらにより多くの場合少なくとも約９９％低減する。一般的に、異なるオリゴヌクレオチドプローブは、異なる識別効率を有し得る。
【００７４】
特定の一実施形態では、官能基がヌクレオチド数１５のオリゴヌクレオチドプローブと結合している場合には、特異的結合の量に対する非特異的結合の相対量は、非デンドロンと結合しているオリゴヌクレオチドプローブと比較して、少なくとも約５０％、多くの場合少なくとも約６０％、より多くの場合少なくとも８０％、さらにより多くの場合少なくとも約９０％低減する。さらに、非特異的結合を測定する１つの方法は、実施例の節における方法を含む本明細書で説明される方法である。非特異的結合の相対量の低減を決定する特定の方法の１つは、以下の式で与えられる。
【００７５】
［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００％
【００７６】
式中、Ａは非デンドロン分子（例えば、ＡＰＤＥＳ修飾表面）を使用する非特異的結合の相対量であり、Ｂはデンドロンで修飾した表面を使用する非特異的結合の相対量である。Ｃ：Ｔのミスマッチに対する特異的結合の量に対する非特異的結合の相対量は、少なくとも９５％［（０．１２−０．００６）／０．１２×１００％＝９５％］低減し得る。
【００７７】
さらに他の実施形態では、デンドロンの先端と結合している官能基又は任意のリンカーは、α−ヘリックスを形成しない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、α−ヘリックスの存在が識別効率を低減し、及び／又は非特異的結合を増大させ、それによりデンドロンの有用性を低減すると考えられる。
【００７８】
本発明の幾つかの態様では、デンドロンは以下の式を有する。
【００７９】
Ｚ−［Ｒ１］ｍ−Ｑ１−｛［Ｒ２−Ｑ２］ａ−｛（Ｒ３−Ｑ３）ｂ−［（Ｒ４−Ｑ４）ｃ−（Ｒ５−Ｙ）ｘ］ｙ｝ｚ｝ｎ
式Ｉ
【００８０】
式中、
ｍ、ａ、ｂ及びｃの各々は独立して０又は１であり、
ｃが０の場合にはｘは１であり、又はｃが１の場合にはｘは１からＱ４の酸化状態−１までの整数であり、
ｂが０の場合にはｙは１であり、又はｂが１の場合にはｙは１からＱ３の酸化状態−１までの整数であり、
ａが０の場合にはｚは１であり、又はａが１の場合にはｚは１からＱ２の酸化状態−１までの整数であり、
ｎは１からＱ１の酸化状態−１までの整数であり、
Ｑ１は酸化状態が少なくとも３の中心原子であり、
Ｑ２、Ｑ３及びＱ４の各々は独立して酸化状態が少なくとも３の分枝原子であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の各々は独立してリンカーであり、Ｚは任意に保護される官能基であり、
Ｙの各々は独立して上記ベース部分の末端上における官能基であり、複数のＹが上記固体支持体の上記第１の表面と結合しており、
ただしｎ、ｘ、ｙ及びｚの積は少なくとも３である。
【００８１】
ａ、ｂ又はｃが１であり、且つ対応するｚ、ｙ又はｘがそれぞれＱ２の酸化状態−１、Ｑ３の酸化状態−１又はＱ４の酸化状態−１未満である場合には、Ｑ２、Ｑ３又はＱ４と結合している残りの原子はそれぞれ水素であることが理解されるべきである。本明細書で用いられるところの「Ｑ」は、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４のいずれか１つ又は全てを表す。典型的には、Ｑは、周期表のＩＶＡ群又はＶＡ群の任意の原子である。Ｑについての代表的な原子は、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｓｉ、Ｇｅ等を含むがこれらに限定されない。ＱはＮ、Ｐ、Ｃ又はＳｉであることが多い。
【００８２】
式Ｉに見られるように、Ｚは、任意にリンカーＲ１を介して、中心原子に結合している。ｍは１であり、その結果ＺはリンカーＲ１を介して中心原子に結合していることが多い。さらに、Ｚ又はその非保護形態（すなわち、Ｚが保護された官能基である場合）は、プローブを結合するようになっている。幾つかの実施形態では、Ｚは求核試薬である。求核試薬は、結合している電子の両方を供与することによりその反応パートナー（すなわち、求電子試薬）と化学結合を形成する原子又は原子群である。典型的には、求核試薬は、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳ等のヘテロ原子、又はカルボアニオン、特に共鳴により、及び／又は近くの電子求引基（複数可）の存在により安定化するカルボアニオンである。有機化学分野の当業者は、式Ｉのデンドロンに適切な求核試薬を容易に認識することができる。代表的な求核試薬の幾つかは、代表的な官能基において上で開示されている。
【００８３】
他の実施形態では、Ｚは求電子試薬である。求電子試薬は、電子に引きつけられ、求核試薬と結合するために電子対を受容することにより化学反応に参加する原子又は原子群である。たいていの求電子試薬は、正に荷電しているか、部分的な正の電荷を保有する原子を有するか、又は電子のオクテットを有しない原子を有する。典型的には、求電子試薬は、求電子中心と結合している、又は求電子中心の近くにある１つ又は複数の電気陰性原子（例えば、ハロゲン化物又は他のヘテロ原子）のために、少なくとも正の双極子モーメントを有する炭素原子である。有機化学分野の当業者は、式Ｉのデンドロンに適切な求電子試薬を容易に認識することができる。代表的な求電子試薬の幾つかは、代表的な官能基において上で開示されている。
【００８４】
さらに他の実施形態では、Ｚは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐから成る群から選択されるヘテロ原子と、それらの組合せとを含む。
【００８５】
各々のＹは、独立して官能基であり得る。すなわち、各々のＹは、他のＹの群と無関係であり得る。しかし、Ｙの全てが同じ官能基であることが多い。しかし、概してＺ及びＹは異なる官能基である。幾つかの例では、Ｚ及びＹは同じ官能基であり得るが、一方又は他方が保護された形態である。官能基、及び／又は保護基の存在におけるかかる差異は、Ｚ及びＹの反応性を識別することを可能にし、それにより複数のＹを介してデンドロンを固体支持体と結合させることを可能にし、Ｚ上へのプローブの結合を可能にする。
【００８６】
リンカー
再び式Ｉを参照すると、デンドロンは、一般的に様々なリンカー、例えばＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５を含む。各リンカーは、分枝原子Ｑ２、Ｑ３又はＱ４により別のリンカーと連結されている。末端のリンカーは官能基Ｙを含み、それにより固体支持体と結合することができる。
【００８７】
各リンカーの長さは、固体支持体と結合している分枝官能基の数、固体支持体との結合の強度、所望の空間形成等を含む様々な因子により決定され得る。したがって、リンカーはいずれかの特定の長さのいずれかの特定のタイプの鎖又はポリマーに限定されないことが理解される。しかし、一般的な指針として、リンカーの長さは、約０．５ｎｍ〜約２０ｎｍ、典型的には約０．５ｎｍ〜約１０ｎｍ、多くの場合約０．５ｎｍ〜約５ｎｍであり得る。代替的に、各リンカーは、独立して、約１個〜約１００個の原子、典型的には約１個〜約５０個の原子、多くの場合約１個〜約２５個の原子、より多くの場合約３個〜約１０個の原子の鎖長を有する鎖である。リンカーの化学的構成は、例えば置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、エーテル、ポリエーテル、エステル、アミノアルキル、ポリアルケニルグリコール等を含むがこれらに限定されない直鎖又は分枝の有機的部分を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
リンカーＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、同じであり得る又は異なり得る。典型的には、各リンカーは、繰り返し単位、直鎖又は分枝の有機的部分である。しかし、全てのリンカーが同じ繰り返し単位でなければならないわけではないことも理解される。また、リンカーについての全ての結合価の位置が繰り返し単位で充たされなければならないわけでもない。例えば、Ｒ２の全てが同じ繰り返し単位であり得る。又は、１つ又は複数のＲ２が繰り返し単位であってもよく、残りのＲ２はＨ又は他の化学的部分であり得る。同様に、１つ又は複数の各々のＲ３、Ｒ４又はＲ５が、独立して、繰り返し単位、Ｈ、又はいずれかの他の化学的部分であり得る。したがって、様々なポリマーの形状がこのように作製され得る。したがって、デンドロンは約３個〜約８１個の官能基Ｙを有し得ると考え得る。典型的にはデンドロンは、約６個〜約８１個の官能基Ｙを、約６個〜約５４個の官能基Ｙを、約６個〜約２７個の官能基Ｙを、約８個〜約２７個の官能基Ｙを、約９個〜約２７個の官能基Ｙを、約９個〜約１８個の官能基Ｙを、又は約９個〜約１２個の官能基Ｙを有する。
【００８９】
官能基Ｙ
各官能基Ｙは、付加反応又は置換反応の対象となるのに十分な反応性を有する。官能基（又は部分）は、化学反応に関与する分子内の原子又は原子群を表す。一般的には、官能基はヘテロ原子（ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、リン等）又は不飽和（例えば、炭素−炭素二重結合又は三重結合）を含む。代表的な官能基は、アシルハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、炭酸酸（エステルを含む）、カルボン酸塩、カルボン酸、尿素、エーテル、ヒドロペルオキシド、過酸化物、オキシラニル、ハロゲン化物、オレフィン、アルキン、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アジリジニル、アゾ、シアン酸塩、イソシアン酸塩、硝酸塩、ニトリル、亜硝酸塩、ニトロ、ニトロソ、オキサゾリニル、イミダゾリニル、ホスフィン、ホスホジエステル、ホスホン酸、ホスホン酸塩、硫化物、チオエーテル、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、チオール、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、二硫化物、チオアミド、チオエステル、チオケトン、シラニル（silanyl）と、化学反応の対象となることが知られている他の基とを含むがこれらに限定されない。官能基は、求核反応又は求電子反応の対象となることが多い。
【００９０】
保護基
存在する場合、保護基の選択は、多数の因子に依存する。したがって、本発明は、その官能基と別の化学的部分との反応を防止する機能をもたらし、且つ所望の特定の条件下で除去することができる限りにおいては、いかなる特定の保護基にも限定されない。典型的には、使用される保護基は、比較的容易に除去することができる。
【００９１】
代表的な適切な保護基は、以下のものを含むがこれらに限定されない：
【００９２】
アミノ酸保護基：メチル、ホルミル、エチル、アセチル、ｔ−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、４−メチルベンジル、チオアニジル（Thioanizyl）、チオクレシル（Thiocresyl）、ベンジルオキシメチル、４−ニトロフェニル、ベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンゾイル、２−ニトロフェニルスルフェニル（2-Nitrophenylsulphenyl）、４−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル、フタロイル、３−ニトロフタロイル、４，５−ジクロロフタロイル、テトラブロモフタロイル及びテトラクロロフタロイル。
【００９３】
ヒドロキシ保護基：ｐ−アニシルオキシメチル（ｐ−ＡＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ），ｔ−ブトキシメチル、２−クロロテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、（１Ｒ）−メントキシメチル（Menthoxymethyl）（ＭＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ｏ−ニトロベンジルオキシメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）及び２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）。
【００９４】
ＤＮＡ、ＲＮＡ保護試薬：２’−ＯＭｅ−Ａｃ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、２’−ＯＭｅ−Ａｃ−ＲＮＡ ＣＰＧ、２’−ＯＭｅ−Ｉ−ＣＥ ホスホラミダイト、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＣＥ ホスホラミダイト、Ａｃ−Ｃ−ＲＮＡ ５００、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＥ ホスホラミダイト、ｄｍｆ−ｄＧ−ＣＰＧ ５００及び２−アミノ−ｄＡ−ＣＥ ホスホラミダイト。
【００９５】
様々な官能基に対する他の適切な保護基が、当業者に既知である。例えば、T.W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in OrganicSynthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999と、Harrisonand Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (JohnWiley and Sons, 1971-1996)とを参照されたい。
【００９６】
下記の表１は、様々なタイプの代表的な化合物を列挙している。しかし、Ｘ、Ｒ１、Ｑ、Ｒ及びＹにおける変形形態が本発明に包含されることが理解されるべきである。
【００９７】
表１−代表的且つ例示的な巨大分子化合物
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００９８】
本発明の幾つかの態様では、固体支持体は無孔性の固体基板である。適切な無孔性の固体基板は、金属、金属合金、セラミックス、プラスチック、シリコン及びケイ酸塩（ガラス及び半導体ウェハ等）を含むがこれらに限定されない。固体支持体は、スライド、粒子、ビーズ又はマイクロウェル（micro-well）の形態であり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は無孔性の固体基板である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では固体支持体はガラスである。
【００９９】
本発明の他の態様では、固体支持体は多孔性の固体基板である。代表的な多孔性材料は、膜、ビーズ（制御孔ビーズを含む）、ゼラチン及びハイドロゲルを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
本発明の別の態様は、その表面に複数のデンドロンを含む固体支持体を製造する方法を提供する。固体支持体は、デンドロンと結合を形成するための表面官能基を含む第１の表面を少なくとも含む。デンドロンは、中心原子と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基と、中心原子と結合しており複数の末端を有するベース部分とを含み、ベース部分の各末端は官能基を含む。この方法は概して、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間の結合を形成するのに十分な条件下で、複数のデンドロンを固体支持体表面と接触させることであって、その結果、デンドロンのベース部分と固体支持体の第１の表面との間に複数の結合が形成される、接触させることを含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間に形成される結合は、共有結合である。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、固体支持体の第１の表面上の表面官能基とベース部分の末端上の官能基との間の結合は、求核置換反応により形成される。適切な求核置換反応のための反応条件は、当業者に既知である。例えば、Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic OrganicMethods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996)を参照されたい。
【０１０３】
様々な固体支持体が、本発明の方法において使用され得る。適切な固体支持体が、本明細書で論じられ、無孔性固体支持体と多孔性固体支持体とを含む。使用され得る代表的な固体支持体は、上述したものを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体は無孔性固体支持体である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では、固体支持体は無孔性固体支持体である。特定の一実施形態では、無孔性固体支持体はガラスである。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基は、その反応性を低減又は防止するために、デンドロンを固体支持体表面と結合する前に保護される。このようにして、ベース部分の末端上の官能基が固体支持体上の表面官能基との結合形成反応の対象となるのに対して、中心原子と結合している官能基（又はデンドロンの先端に存在する官能基）は反応条件下で相対的に不活性な状態を維持する。特定の官能基の反応性を低減又は防止するための保護基の使用は、当業者に既知である。例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in OrganicSynthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999と、Harrisonand Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (JohnWiley and Sons, 1971-1996)とを参照されたい（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。代表的なヒドロキシ保護基は、アシル基、ベンジル及びトリチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル及びアリルエーテルを含む。代表的なアミノ保護基は、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチル基及び置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）等を含む。しかし、幾つかの例ではベース部分の末端上の官能基の反応性と、任意にリンカーを介して中心原子と結合している官能基（すなわち「先端官能基」）の反応性とは、先端官能基を保護する必要なく固体基板表面上へのデンドロンの結合を可能にする程度に十分に異なることが理解されるべきである。
【０１０５】
デンドロンが固体支持体と結合すれば、保護基が存在する場合には、その保護基を先端官能基から除去することができる。その後目的のプローブを、適切な反応条件を使用して、先端官能基と結合させることができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、デンドロンは、固体支持体の所定の領域と結合している。かかる結合は、当業者に既知の様々な方法のいずれかを使用して、例えば湿式又は乾式コーティング技術を使用することにより、実現することができる。
【０１０７】
本発明の他の態様は、その表面上にデンドロンのアレイを含む固体支持体を使用して流体媒体中におけるリガンドの存在を検出する方法を提供する。デンドロンのベース部分は固体支持体と結合しており、先端官能基は所与のリガンドに対して選択的なプローブを含む。この方法は概して、リガンドが流体媒体中に存在する場合にプローブ−リガンド複合体を選択的に形成するのに十分な条件下で流体媒体を固体基板と接触させること、及び目的のプローブ−リガンド複合体の存在を決定することを含む。目的のプローブ−リガンド複合体の存在は、その流体媒体がリガンドを含むことの指標である。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、目的のプローブ−リガンド複合体は、オリゴヌクレオチド−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはオリゴヌクレオチド−相補的ポリヌクレオチド複合体、オリゴペプチド−結合性オリゴペプチド複合体若しくはオリゴペプチド−結合性ポリペプチド複合体、ＰＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはＰＮＡ−相補的ポリヌクレオチド複合体、ＬＮＡ−相補的オリゴヌクレオチド複合体若しくはＬＮＡ−相補的ポリヌクレオチド複合体、又は受容体−基質複合体である。これらの実施形態の範囲内において、幾つかの例では、受容体−基質複合体は、薬剤−薬剤受容体複合体、酵素−酵素基質複合体、抗体−抗原複合体、又はアプタマー−タンパク質複合体を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプローブ−相補的ＤＮＡ複合体（ここで、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチド数が少なくとも約７５のヌクレオチド配列を有し、多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約５０のヌクレオチド配列を有し、より多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約３０のヌクレオチド配列を有し、最も多くの場合ヌクレオチド数が少なくとも約１５のヌクレオチド配列を有する）における単一ヌクレオチド多型を識別することができる。かかる選択性を決定するための１つの方法は、モデル系、及び／又は実施例の節において開示されるｐ５３遺伝子における７つのホットスポットのコドン１７５を有するＤＮＡマイクロアレイを解析することである。
【０１１０】
さらに幾つかの実施形態では、本発明の方法はオリゴペプチドプローブ−特異的ペプチド標的複合体（ここで、オリゴペプチドプローブは、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、又は少なくとも約１０個のアミノ酸を有する）における単一アミノ酸のミスマッチを識別することができる。
【０１１１】
固体支持体上の複数のデンドロン間のプローブ間の距離は、約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２ｎｍ〜約３０ｎｍ、又は約２ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲であり得る。
【０１１２】
標的特異的リガンドすなわちプローブ
ポリマーと結合していることがある、プローブとしても知られる標的特異的リガンドは、化学物質、生化学的物質、生物活性化合物等を含む様々な化合物を含む。これに関して、プローブは、核酸、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、アプタマー、抗原、抗体等であり得る。オリゴヌクレオチドは、天然核酸又はその類似体であり得る。したがって、プローブは、天然アミノ酸又は合成アミノ酸から構成されるポリペプチドであり得る。プローブは、ポリマーの官能基と結合することができる限りにおいて、核酸、アミノ酸、炭水化物、又は他の任意の化学物質の組合せであり得る。特にプローブは、トリアジン骨格に基づく化学物質等の、化学物質であってもよく、コンビナトリアル化学ライブラリ、特にトリアジンタグ化ライブラリの成分として使用され得る。
【０１１３】
固体支持体
固体支持体は、ポリマーを結合していることがあるいずれかの固体材料であり得る。典型的には、ポリマーは、共有結合又はイオン結合を介して固体支持体表面と結合する。固体支持体は官能化してもよく、それにより、ポリマーのベース部分上に存在する官能基との結合が生ずる。固体支持体の表面は、当業者の必要性に応じて様々な表面であり得る。マイクロアレイ又はバイオチップの形式が望まれる場合には、典型的には酸化型シリコンウェハ、溶融シリカ又はガラスが、基板であり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体はスライドガラスである。他の代表的な固体支持体は、ニトロセルロース又はナイロンを含むがこれらに限定されないメンブレンフィルターを含む。固体支持体は、親水性又は極性であり得るし、コーティングの前後において負電荷又は正電荷を有し得る。
【０１１４】
マイクロアレイ
マイクロアレイの性能を向上させるために、プローブ設計、スポッティング時の反応条件、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件、非特異的結合の抑制、生体分子と表面との間の距離、及び／又は固定化した生体分子間の空間等の様々な問題を考慮するべきである。これらの因子のほとんどはマイクロアレイ表面の性質と関連するので、表面の最適化は、マイクロアレイ研究における主要な目的の１つとなっている。本発明の幾つかの態様は、表面に結合したデンドロンを含む固体支持体を提供する。幾つかの実施形態ではデンドロンは、錐形であり、溶液の値（１：０．０１）に近い単一ヌクレオチド多型（すなわちＳＮＰ）の識別効率を有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイを提供するか、非特異的結合を低減するか、又はその両方の効果をもたらす。
【０１１５】
固体支持体の表面は、当業者に既知の様々な方法のいずれかを使用して調製され得る。例えば、ヒドロキシル化したガラスの表面は、Maskis et al. in Nucleic Acids Res., 1992, 20, 1679-1684により開示される方法を使用することにより調製され得る。酸化型シリコンウェハ、溶融シリカ及びスライドガラスを含め、固体支持体は、（３−グリシドキシプロピル）メチルジエトキシシラン（ＧＰＤＥＳ）及びエチレングリコール（ＥＧ）で修飾され得る。典型的には、デンドロンの先端官能基（例えば、カルボン酸基）と固体支持体表面上の官能基（例えば、ヒドロキシル基）との間のカップリング反応を使用して、例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用することにより、デンドロンを固体支持体表面と結合させた。
【０１１６】
幾つかの例では、デンドロンを結合した後における厚みの増大は１１±２Åであったが、これはイオン結合と同程度である。固定化後、デンドロンのアントラセン部分に起因するＵＶ吸収ピークは、２５７ｎｍで観察された。分子層は十分に安定であり、ジメチルホルムアミド中での１日間の撹拌に対して、厚み及び吸収特性に関して変化を示さなかった。タッピングモード原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により得られる組織分布画像も、得られた層が、顕著な凝集物又は穴を有さず非常に滑らか且つ実質的に均質であることを示した。化合物を固体支持体表面上に結合するためのいずれかの従来から知られる方法が、本発明のマイクロアレイを製造するために使用され得る。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドマイクロアレイの調製は、先端官能基を脱保護することを含む。先端官能基が保護形態である場合には、かかる工程しか必要でないことが理解されるべきである。先端官能基が保護されていない場合には、かかる工程は必要でない。従来から、表面の反応性アミン基を有する固体支持体については、チオールテザー（thiol-tethered）オリゴヌクレオチドと、サクシニミジル ４−マレイミドブチレート（ＳＭＢ）又はスルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＳＭＣＣ）等のヘテロ二官能性リンカーとが利用される。対照的に、本発明の幾つかの実施形態は、ＤＳＣ等のリンカーを使用し、これはアミンテザー（amine-tethered）オリゴヌクレオチドのスポッティングを可能にする。したがって、本発明の方法及び組成物の幾つかの利点は、費用対効果に優れていること、及び容易に酸化されるチオールテザーオリゴヌクレオチドの使用を回避できることである。しかし、チオールテザーオリゴヌクレオチドは或る特定の条件下で有用であり得ることが理解されるべきである。
【０１１８】
本発明は、本明細書で説明した特定の実施形態によりその範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書で説明した実施形態に加えて本発明の様々な修正形態が、上述の説明と添付した図面とから当業者に明らかとなるであろう。かかる修正形態は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることを意図している。以下の実施例は、限定としてでなく本発明の例示として提供される。
【実施例】
【０１１９】
実施例１−材料及び方法
総則。シランカップリング剤Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＴＰＵ）は、Gelest Inc.から購入した。他の全ての化学物質は、Sigma-Aldrichから入手した試薬グレードのものである。ＵＶグレード溶融シリカプレートは、CVILaser Co.から購入した。研磨加工プライムＳｉ（１００）ウェハ（ドーパント、リン；抵抗率、１．５Ω・ｃｍ〜２．１Ω・ｃｍ）は、MEMCElectronic Materials Inc.から購入した。脱イオン水（１８ＭΩ・ｃｍ）は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｅ−ｐｕｒｅ ３−モジュールシステムに蒸留水を通過させることにより得た。
【０１２０】
実施例２−試料調製。
実施例２．１−基板の洗浄。シリコンウェハ（及び、デンドロン表面被覆度分析のための溶融シリカプレート；支援情報を参照されたい）を、ピラニア溶液（濃硫酸／３０％Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ））中で４時間超音波処理した（注意：ピラニア溶液は、有機材料を爆発的に酸化し得る。酸化しやすい材料と接触させてはならない）。超音波処理後、基板を脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。その後、Ｔｅｆｌｏｎビーカー中に容れた脱イオン水、濃縮アンモニア溶液及び３０％過酸化水素の混合物（５：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））中に、基板を浸漬した。ビーカーをウォーターバス中に置き、８０℃で１０分間加熱した。基板を溶液から取り出し、脱イオン水で十分にリンスした。さらに、脱イオン水、濃塩酸及び３０％過酸化水素の混合物（６：１：１（ｖ／ｖ／ｖ））を含有するＴｅｆｌｏｎビーカー中に基板を置いた。ビーカーを８０℃で１０分間（or）加熱した。基板を溶液から取り出し、大量の脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。きれいな基板を真空チャンバー（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）中で約２０分間乾燥し、直ぐに次の工程に使用した。
【０１２１】
実施例２．２．−ＡＦＭプローブの前処理。
錐体の先端を有する標準Ｖ型シリコン窒化物カンチレバー（ＭＬＣＴ−ＡＵＮＭ）（Veeco Instruments；ｋ＝１０ｐＮ／ｎｍ）を、初めに、１０％の硝酸中に浸漬すること、及び８０℃で２０分間加熱することにより酸化した。カンチレバーを溶液から取り出し、大量の脱イオン水で十分に洗浄及びリンスした。きれいなカンチレバーを真空チャンバー（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）中で約２０分間乾燥し、直ぐに次の工程に使用した。
【０１２２】
実施例２．３．−シリル化。薄シリカ最上層を用意するために、シリコン／シリカ基板と、上述のように前処理したカンチレバーとを、窒素雰囲気下でカップリング剤（０．２０ｍＬ）を含有する無水トルエン（２０ｍＬ）中に浸漬し、溶液中に６時間置いた。シリル化後、基板及びカンチレバーをトルエンで洗浄し、その後１１０℃で３０分間焼いた。基板を、トルエンと、トルエン−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））と、メタノールとに連続的に浸漬し、各洗浄溶液中で３分間超音波処理した。カンチレバーを、トルエンとメタノールとで連続的に十分にリンスした。最後に、基板及びカンチレバーを真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。ＧＰＤＥＳでのシリル化のための実験手順と、その後のエチレングリコールでのエポキシドの開環とは、他非特許文献１８で説明する。
【０１２３】
実施例２．４．−デンドロンで修飾した表面の調製。上記のヒドロキシル化した基板及びカンチレバーを、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２．７ｍＭ）の存在下で、デンドロン（１．０ｍＭ）を溶解している小量のＤＭＦと、カップリング剤である１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２７ｍＭ）とを有する塩化メチレン溶液中に４時間浸漬した。この仕事で使用したデンドロンである９−アントリルメチル−３−（｛［トリス（｛［（１−｛トリス［（２−｛［（トリス｛［２−カルボキシエトキシ］メチル｝メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］−２−エトキシ｝メチル）メチル］アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメートを、このグループで調製した。反応後、基板を、塩化メチレンと、メタノールと、水とに連続的に浸漬し、各洗浄工程で３分間超音波処理した。カンチレバーを、塩化メチレンと、メタノールと、水とで連続的に十分にリンスした。最後に、基板及びカンチレバーをメタノールで洗浄し、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２４】
実施例２．５．− ９−アントリルメトキシカルボニル基の脱保護。デンドロンで修飾した基板及びカンチレバーを、１．０Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する塩化メチレン溶液中に浸漬し、２時間撹拌した。反応後、２０％（ｖ／ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を有する塩化メチレン溶液中に１０分間浸漬した。基板を塩化メチレン及びメタノール中で各３分間超音波処理し、カンチレバーを塩化メチレンとメタノールとで連続的に十分にリンスした。基板及びカンチレバーを真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２５】
実施例２．６．−ＮＨＳで修飾した基板の調製。上記脱保護した基板及びカンチレバーを、窒素雰囲気下で、ジ（Ｎ−サクシニミジル）カーボネート（ＤＳＣ）（２５ｍＭ）及びＤＩＰＥＡ（１．０ｍＭ）を有するアセトニトリル溶液中に４時間浸漬した。反応後、基板及びカンチレバーを撹拌したジメチルホルムアミド中に３０分間置き、メタノールで洗浄した。基板及びカンチレバーを、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２６】
実施例２．７．−プローブ／検出ＤＮＡの固定化。上記ＮＨＳで修飾した基板及びカンチレバーを、ＤＮＡ溶液（５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する２５ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中において、２０μＭ）中に４時間浸漬した。反応後、基板及びカンチレバーを、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において３７℃で３０分間、及び水中において１分間撹拌し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。最後に基板及びカンチレバーを、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２７】
実施例２．８．−標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション。上記のプローブＤＮＡをつなぎ留めた基板を、標的ＤＮＡ溶液（２０μＭ）中に１時間浸漬した。反応後、基板を３７℃で３０秒間撹拌し、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において１分間浸漬し、さらに繰り返した（repeat）。基板を、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３．０ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含有する０．２×ＳＳＣ緩衝液により１分間洗浄し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。
【０１２８】
実施例２．９．−遺伝子発現プロファイリングのためのプローブＤＮＡの固定化。対照実験のために、９６種類の１０μＭのプローブＤＮＡ（Operon companyから入手したホモ・サピエンス（ヒト）試料ｖ４．０．１）を、マイクロアレイヤー（Genetixから入手したＱＡｒｒａｙｍｉｎｉ）を４時間用いて、スポッティング緩衝溶液（５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する２５ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５））中において、デンドロンで修飾したスライドガラス上に固定化した。反応後、基板を、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中において３７℃で３０分間、及び水中において１分間撹拌し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。最後に基板を、真空（３０ｍＴｏｒｒ〜４０ｍＴｏｒｒ）下で乾燥した。
【０１２９】
実施例２．１０．−基準全ＲＮＡからのｃＤＮＡ調製。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ標識キット（Invitrogen）での逆転写により、５μｌ当たり１０μｇのユニバーサルヒト基準ＲＮＡ（ＵＨＲＲ、Statagene）から（form）調製した。QIAGENから入手したＭＩＮＥＬｕｔｅ精製キットで、精製プロセスを実施した。NanoDropTechnologies, Inc. から入手したＮＤ−１０００分光光度計により、２６０ｎｍでのＵＶの吸光度を用いて、ｃＤＮＡ濃度を算出した。
【０１３０】
実施例２．１１．−ｃＤＮＡハイブリダイゼーション／蛍光分析。９５℃でのアニーリングの後、３．５×ＳＳＣ及び０．３％ＳＤＳ緩衝液中におけるＣｙ５標識ｃＤＮＡを、Agilentのハイブリダイゼーションキットで、デンドロンで修飾したスライドガラス上における９６種類のプローブＤＮＡと、４５℃で１２時間ハイブリダイズさせた。反応後、基板を３７℃で３０秒間撹拌し、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（７．０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４））中で１分間浸漬し、それを繰り返した。基板を、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３．０ｍＭのクエン酸ナトリウムとを含有する０．２×ＳＳＣ緩衝液で１分間洗浄し、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。ｃＤＮＡの蛍光強度を、MolecularDevicesから入手したＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌ ４１００Ａにより測定した。
【０１３１】
実施例３−ＡＦＭ力測定。全ての力測定は、Ｎａｎｏ Ｗｉｚａｒｄ ＡＦＭ（JPK Instrument）で行った。各実験の前に、各ＡＦＭ探針のばね定数を、熱変動法により、溶液中で較正した。採用したカンチレバーのばね定数は、１ｎｍ当たり１２ｐＮ〜１５ｐＮの間で変動した。全ての測定は、新たなＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中において室温で実施した。力曲線を、基板上の１０μｍ×１０μｍの領域中における１００ピクセルの１つの位置で、２０回より多数回、常に記録し、且つ同じ表面に対して少なくとも３つの他の領域を試験した。様々な探針及び試料を使用して実験を多数回繰り返したこと、及び報告される力のデータは一貫して再現性を有していたことも留意されるべきである。
【０１３２】
実施例４−結果
遺伝子型決定−本発明者らは、表面上のプローブＤＮＡとハイブリダイズした標的ＤＮＡと、ＡＦＭ−探針上の検出ＤＮＡとの間の力を、力基準のＡＦＭにより測定することにより、標的ＤＮＡを検出する感度を試験した（図１（ａ））。全ての実験において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、先に説明したデンドロンに基づく表面官能化方法の修正方法を使用して、シリコン基板又はシリコン窒化物ＡＦＭ探針と共有結合した（表２）。
【０１３３】
表２．遺伝子型決定実験に使用したＤＮＡの名称及び配列
【表２】
【０１３４】
３５ｍｅｒの標的ＤＮＡをデンドロンで修飾した基板上に固定化した１５ｍｅｒのプローブＤＮＡとハイブリダイズさせた後、次に力対距離の測定値を、ＡＦＭ探針上の官能化した１５ｍｅｒの検出ＤＮＡとハイブリダイゼーション事象に関与しない残りの１５ｍｅｒの標的ＤＮＡの表面とを離接しながら記録した。ＡＦＭ力実験を、１０μｍ×１０μｍの面積の１００個の位置で、実施した。力の測定を、１つの位置当たり２０回実施した。１ａＭの標的ＤＮＡをプローブＤＮＡとハイブリダイズさせると、標的ＤＮＡが存在する２つの位置でＤＮＡ間の力が観察された。標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の特定の力（ヒストグラム曲線においてガウスフィッティングにより２６±０．６ｐＮ）を測定する確率は８０％であり、ＤＮＡが見出された１つの位置において２０％の力−距離曲線では力は観察されなかった（図１（ｂ））。かかる極めて低い量の生物学的試料の検出は、臨床的診断及び検出にとっての重要な挑戦である。本発明の方法は、高密度マイクロアレイシステムで実現可能な１０５という数字よりも良好であり、且つ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して通常観察される１０３〜１０４のレベルに接近するレベルである、≦１０３の標的分子を標識することなく検出可能な感度を示す２２。
【０１３５】
このシステムは、遺伝子型決定だけでなく標的ＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）にも適用することができる。過去の仕事において、デンドロンの表面は、一塩基変異を検出する高いＳＮＰ能力を示した。一塩基変異を有する標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの場合においては、基板上に二本鎖として存在する標的ＤＮＡの数は、相対的により相補的な標的ＤＮＡ（完全に相補的なＤＮＡ等）とハイブリダイズするプローブＤＮＡの数より小さい。したがって、結合した標的ＤＮＡを観察する確率は、点変異を含有する標的ＤＮＡの場合には減少した。この方法は、単一ヌクレオチド多型から相対的により相補的な標的ＤＮＡを識別することができる。
【０１３６】
遺伝子発現プロファイリング−ｃＤＮＡは、逆転写によりｍＲＮＡから調製したので、５’末端に５０個〜２５０個のチミン残基を有する。したがって、３０個のアデニン残基から成る検出ＤＮＡを使用した場合には、バイオ−ＡＦＭ測定によりｃＤＮＡの存在を確認することが可能である（表３）。バイオ−ＡＦＭを使用する方法の検出限界の向上を確認するために、ＤＮＡマイクロアレイ実験を実施し、高い蛍光強度を有するプローブＤＮＡを選択した。標準的な蛍光に基づくマイクロアレイ実験の検出限界は、６２ｐｇ／μｌであった。ｃＤＮＡが検出された２個のスポットは、使用するｃＤＮＡ濃度を０．６２ｆｇ／μｌとした場合に、バイオ−ＡＦＭ実験で見出され得る。換言すれば、バイオ−ＡＦＭ測定の感度は、マイクロアレイの１０５倍増大した（図２（ｃ））。
【０１３７】
表３．遺伝子発現プロファイリング実験で使用したＤＮＡの名称及び配列
【表３】
【０１３８】
検出ＤＮＡとしてポリチミン残基を使用した場合には、このシステムは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する複雑なプロセスなしに、ｍＲＮＡの直接検出に適用され得る。たいていのｍＲＮＡは３’末端にポリアデニン残基を有するので、検出ＤＮＡの配列を変更することなく、１つのＡＦＭ探針が複数の標的ｍＲＮＡを検出することができる。すなわち、バイオ−ＡＦＭ法は、ｑＰＣＲと同様の感度を有し、標識することなくＤＮＡマイクロアレイ同様の並行検出を実施することができる。
【０１３９】
デンドロンにより実現される広範なウィンドウの側方空間形成は、別の顕著な利点である。３ｎｍより大きい、推定では最大１０ｎｍの空間形成が意図される。より大きい空間形成は、側方立体障害を最小としながら、より大きな生体分子を固定化するのに有効である。したがって、本発明のシステムは、遺伝子型決定又は遺伝子発現プロファイリングだけでなく、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、及びタンパク質−タンパク質相互作用を決定するためのバイオチップにも適用される。
【０１４０】
実施例５
蛍光標識を使用する従来のＤＮＡチップアッセイ技法の限界を決定するために、本発明者らは、図３（ａ）に示すように、チップ表面上に塩基数２０のＤＮＡプローブを結合し、５’末端にＣｙ３蛍光標識を含有する塩基数３５の標識ＤＮＡとハイブリダイズさせた。
【０１４１】
本発明者らが高レベルから低レベルまで標的ＤＮＡの濃度を変化させて蛍光スキャナーを使用してＤＮＡチップを試験すると、図４に示すように、１ｐＭもの低さでＤＮＡ検出がなされた。
【０１４２】
蛍光法との比較でバイオ−ＡＦＭを使用して、本発明者らは、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定することにより、図５に示すように、１０μｍ×１０μｍの面積中に１００個のスポットを有する力の地図を取得することができた。検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの両方を、ＧＣ部分が６０％となるように調整した。本発明者らは、プローブＤＮＡが検出ＤＮＡよりも塩基を５個多く含有するものとすることにより、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相互作用力を、検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の相互作用力よりも増大させた。このことが、標的ＤＮＡがＡＦＭ探針に引きつけられるのを防止するため、連続的な力の測定が可能である。
【０１４３】
図５に示すように、標的ＤＮＡが存在しないと想定される場合には相互作用力は検出されず、標的ＤＮＡが図６でハイブリダイズした場合には標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間に２７ｐＮの相互作用力が測定された。加えて、バイオ−ＡＦＭ法は、蛍光法よりもさらに増強した１ａＭもの低さの標的ＤＮＡを検出することができた。この濃度レベルでもＰＣＲなしでＤＮＡアッセイを行うことができ、このことは本発明の方法が有する蛍光アッセイ等の光学アッセイより優れた別の利点である。さらに図７は、標的ＤＮＡの濃度と検出感度との間の直線関係を示す。
【０１４４】
上述したように、ＰＣＲによる増幅はバイオ−ＡＦＭ法に必要とされないので、標的ＤＮＡが存在するかどうかは、前処理なしでの単純なバイオ−ＡＦＭ実験により試験され得る。これまで、ナノ粒子、銀液（silver liquid）添加及び電気的特性を使用することによりＤＮＡ検出限界を減少させるために多くの努力がなされてきた。しかし、それらは、複雑な前処理手順を必要とし、再現性が低いという点において、不利益を有する。バイオ−ＡＦＭは、再現性のあるデータを提供し、標的ＤＮＡの前操作を必要としない。
【０１４５】
実施例５．１−非特異的ＤＮＡ力測定
本発明者らは、標的ＤＮＡが存在しない場合には、検出ＤＮＡとプローブＤＮＡとの間の相互作用力は全く検出されないことを確認した。本発明者らは、検出ＤＮＡと結合する標的ＤＮＡの領域を非相補的なものとなるように修飾し、プローブＤＮＡと結合する標的ＤＮＡを相補的なものとなるように設計した。この実験において、本発明者らは、図８に示すように、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間に非特異的結合が生じないことを観察した。
【０１４６】
実施例５．２−一塩基変異検出実験
ＤＮＡチップ上での一塩基変異に対するバイオ−ＡＦＭの検出能力を決定する。この実験からは、プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で一塩基が異なるという結果が観察される。プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの間で一塩基変異が存在する場合には、ハイブリダイゼーション率は減少し、検出ＤＮＡと標的ＤＮＡとの間の力測定率が同様に減少する。
【０１４７】
実施例５．３−プローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡの架橋結合を使用するＤＮＡチップアッセイ
プローブＤＮＡと標的ＤＮＡとをハイブリダイズした後、ハイブリダイズしたＤＮＡを、化学的方法を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して架橋結合し、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定する（is measure）。図９に示すように、様々な種類の標的ＤＮＡが、プローブＤＮＡの塩基長にかかわらず、検出され得る。
【０１４８】
実施例５．４−ストレプトアビジン−ビオチン結合を使用する、検出感度の向上
上述した架橋結合方法を使用したプローブＤＮＡと標的ＤＮＡとの結合の後、標的ＤＮＡの末端でストレプトアビジンと結合を形成する場合には、標的ＤＮＡは、ビオチンと結合しているＡＦＭ探針を使用してストレプトアビジンとビオチンとの間の結合強度を測定することにより、検出することができる。特に、塩基数１５のＤＮＡの間のハイブリダイゼーション強度は、約２７ｐＮである。これは実際のノイズと大きさにおいてさほど変わらず、差異を識別するのは困難である。ストレプトアビジンとビオチンとの間の結合強度は１００ｐＮより大きいので、図１０に示すように、シグナル対ノイズの比は向上する。
【０１４９】
実施例５．５−抗原−抗体結合を使用する検出感度の向上
プローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡを架橋結合した後、抗原を標的ＤＮＡの末端に結合する。抗体と結合しているＡＦＭ探針を使用して抗原−抗体結合の強度を測定することにより、図１１に示すように標的ＤＮＡを検出することができる。
【０１５０】
実施例５．６−タンパク質−ＤＮＡ結合のＤＮＡチップアッセイ
一本鎖ＤＮＡと、ＡＦＭ探針表面上のＤＮＡと選択的に結合することができるタンパク質とを結合した後、ＤＮＡチップアッセイを実施することができる。タンパク質と一本鎖ＤＮＡとの間の力の測定率は、標的ＤＮＡが高濃度で存在する場合には、減少する。標的ＤＮＡの濃度レベルをより低い程度まで低下させると、力の測定率は増大するであろうし、その場合、これをＤＮＡチップアッセイとして使用することができる。タンパク質−ＤＮＡ結合を検出する条件を最適化することは、当業者の技能の範囲内であるであろう。
【０１５１】
一方で、二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質が、ＡＦＭ探針表面に結合している。ＤＮＡチップアッセイを実施する。低濃度の標的ＤＮＡ中でハイブリダイズさせた後でタンパク質と標的ＤＮＡとの間の力を測定する実験を行った場合、二本鎖ＤＮＡが存在する確率は減少するであろう。標的ＤＮＡの濃度を増大させることにより、二本鎖ＤＮＡを検出する確率は増大し、タンパク質と二本鎖ＤＮＡとの間の力の測定率も増大する（図１２）。
【０１５２】
実施例５．７−三本鎖ＤＮＡ構造に対するＤＮＡチップアッセイ
特定の塩基配列を有する検出ＤＮＡをＡＦＭ探針上に結合し、三本鎖形成を誘発する化学物質又はタンパク質を添加した後に、ＤＮＡチップアッセイを実施する。標的ＤＮＡとプローブＤＮＡとがハイブリダイズする領域では、三本鎖ＤＮＡが形成される。三本鎖ＤＮＡが形成されると、バイオ−ＡＦＭは力を測定することができ、標的ＤＮＡの存在を確認することができる（図１３）。
【０１５３】
実施例５．８−挿入したＤＮＡのＤＮＡチップアッセイ
ＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド）等の二本鎖核酸挿入剤が、ＡＦＭ探針と結合している。標的ＤＮＡとプローブＤＮＡとがハイブリダイズする二本鎖領域での力を測定することによりＤＮＡアッセイを実施することができる（図１４）。
【０１５４】
実施例５．９−ＭｕｔＳタンパク質を使用する一塩基変異アッセイのためのＤＮＡアッセイチップ開発
ＭｕｔＳタンパク質は、完全に相補的なＤＮＡよりもむしろ一塩基変異を有する二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する。ＡＦＭ探針上にＭｕｔＳタンパク質を結合させること、及びＤＮＡとタンパク質との間の結合力を測定することにより、ＤＮＡアッセイを実施する。相補的ＤＮＡ二本鎖が存在する領域においては、力は測定されない。一塩基変異が存在する領域においては、力が測定される。一塩基変異に対するＤＮＡチップアッセイは、検出率が観察される間接的な方法としてではなく、直接的に力を測定することにより実施される（図１５）。
【０１５５】
実施例５．１０−ＤＮＡ間の力測定を使用するデンドロン表面上におけるＤＮＡチップアッセイ
制御されたメソ空間を有するデンドロン固体基板が開示される。表面上の分子種間の空間は、望ましくない立体障害を低減するために維持され、分子種間の相互作用を検出するための環境をもたらす。分子種は、タンパク質、抗原、抗体、シグナルペプチド、膜タンパク質、小分子、ステロイド、グルコース、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含むがこれらに限定されない。したがって、例えば、バイオ−ＡＦＭにより標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力を測定するためにデンドロンの表面を使用することは、非特異的結合を生じないので、分子種間の空間が制御されない環境、又は空間を制御するために混合的な自己集合が使用される環境と比較して性能を向上させるであろう。特に、ストレプトアビジン−ビオチン法又は抗原−抗体法により検出感度を増大させる方法はＤＮＡより大きなタンパク質を含み、デンドロンの拡張的生成は、潜在的な立体障害の問題を解決するであろう。
【０１５６】
デンドロンを調製する方法と、デンドロンで表面又は基板をコーティングする方法と、及びデンドロンの末端に分子種を結合する方法とは、国際公開第２００５／０２６１９１号パンフレット及び国際公開第２００６／０１６７８７号パンフレットで説明され、その内容は、デンドロンを作製する方法と、表面又は基板をコーティングする際におけるデンドロンの使用と、デンドロンの先端への分子種の設置とのために、その全体が参照により本明細書に援用される。ナノレベル又はマイクロレベルのプローブＤＮＡプリンティングのためのディップペン法又はマイクロコンタクトプリンティング法は、前処理したガラス若しくはシリコン表面又は基板上で実施される。分子種が結合し、アレイが作製される。その後標的ＤＮＡをハイブリダイズし、上述のバイオ−ＡＦＭを使用して、標的ＤＮＡと検出ＤＮＡとの間の力が測定される（図１６）。アッセイは、架橋結合を使用するストレプトアビジン−ビオチン法、又は抗原−抗体力測定法等の、上述の様々な他の修正した方法により、実施することができる。
【０１５７】
実施例５．１１−ＤＮＡ間の力の測定による、遺伝子発現研究
ＤＮＡチップでの従来の遺伝子発現決定では、組織又は細胞から抽出したｍＲＮＡを逆転写し、蛍光色素を付加し、様々な種類のプローブＤＮＡが結合しているチップ上でハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡを作製する。スポットの蛍光強度を解析する。或る特定の遺伝子の発現レベルをモニタリングすることができる。バイオ−ＡＦＭによる力測定を、このシステムにおいて適用し、遺伝子発現研究の新しい概念を見出すことができる。バイオ−ＡＦＭによる力測定は、ＤＮＡ間の力を測定するための上述の方法、又は架橋結合を使用するストレプトアビジン−ビオチン法、又は抗原−抗体間の力測定法であり得る。
【０１５８】
バイオ−ＡＦＭ力測定法を使用する遺伝子発現決定の例は、以下の通りである。ｍＲＮＡの３’末端は２０個〜２５０個のポリＡを有するので、逆転写によりｃＤＮＡを作製すると、該ｃＤＮＡは相補的なポリＴを含有する。ｃＤＮＡ上のポリＴを検出ＤＮＡに対する結合領域とし、ＡＦＭ探針上のポリＡ検出ＤＮＡ配列を結合させる。力は、次にＡ−Ｔハイブリダイゼーションにより測定される。したがって、ｃＤＮＡと様々なプローブＤＮＡとの間の結合強度の力を測定し、検出率を決定することにより、他と比較してより強く発現している遺伝子が発見される（図１７）。
【０１５９】
加えて、組織又は細胞から抽出されるｍＲＮＡがアッセイには小量であるので、この遺伝子発現研究においては、逆転写によりｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡの量は、遺伝子発現研究には概して十分でない。このため、ｃＤＮＡの量を、線形増幅等の増幅方法により増大させる。しかし、バイオ−ＡＦＭ実験では、検出限界をアトモルレベルまで低減することができる。したがって、ｍＲＮＡ発現レベルの差異についてのアッセイは、逆転写又は増幅を行うことなく直接にプローブＤＮＡを使用して実施することができる。例として、ＡＦＭと結合しているポリＴオリゴヌクレオチド検出ＤＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡと直接結合する。付加的な処理手順なしに、力を測定し、直接ｍＲＮＡを検出する。
【０１６０】
実施例５．１２−ＤＮＡナノアレイの実施
従来のＤＮＡマイクロアレイシステムでは、プローブのアレイをスポットする基板表面は、約１ｍｍ２の面積を含む。対照的に、ナノアレイは、約１０ｎｍ２〜１００ｎｍ２の面積を含む。かかるナノアレイは機器の小型化に有用であり、ケア製品、ＭＥＭＳ及びＮＥＭＳの点において適用される。ＤＮＡアレイは、ディップペン法又はマイクロコンタクトプリンティング法を使用することにより、ナノレベルで製造される。直接的な標的ＤＮＡ検出は、溶液中において、約１ｎｍ２〜１０ｎｍ２の面積を有する基板表面上で、実施される。
【０１６１】
本明細書で引用された全ての引用文献は、その全体が参照により援用される。
【０１６２】
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書で具体的に説明した本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識するだろう、又は確認することができるであろう。かかる均等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法であって、
（ｉ）該流体媒体を固体基板と接触させることであって、該固体基板が、
その表面上にデンドロンのアレイを含み、前記デンドロンの各々が、
中心原子、
任意にリンカーを介して、該中心原子と結合しているプローブ、及び
該中心原子と結合しているベース部分であって該固体支持体の表面と結合している複数の末端を有するベース部分、
を含む、並びに
（ｉｉ）該結合したリガンドと該リガンドに対する親和性を有する検出分子との間の結合力を測定することによりプローブ−標的リガンド複合体の存在を決定することであって、該検出分子が原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針の表面につなぎ留められており、該プローブ−標的リガンド複合体と該検出分子との間の力の増大の測定が該プローブ−標的リガンド複合体の存在を示す、
を含む、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法。
【請求項２】
該プローブ−標的リガンド複合体がオリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該プローブ−標的リガンド複合体が低濃度の該標的リガンドの存在下で検出され、該標的リガンドは少なくとも約１ａＭの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該標的リガンドが約１ａＭ〜約１０００ａＭの濃度である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体における単一ヌクレオチド多型を識別することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該検出分子が検出核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該検出分子がＲＮＡのポリ−ｄＡセクションと十分に相補的なポリ−ｄＴオリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該固体基板が無孔性の固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該固体基板が平面的な無孔性の固体支持体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該固体基板がバイオチップである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の該探針がデンドロンでコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該標的リガンドが標識されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
架橋結合した該プローブ−リガンド複合体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該プローブ−リガンド複合体が親和性分子と共有結合しており、且つ検出分子が該親和性分子と特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該親和性分子が抗原又は抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該検出分子が二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該プローブ−リガンド複合体が、該検出分子と三重らせん構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該検出分子がＤＮＡ挿入剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該検出分子が、二本鎖ＤＮＡのミスマッチセクションと選択的に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸を検出するシステムであって、（ｉ）プローブ分子を固定化したバイオチップと、（ｉｉ）その上に検出分子をつなぎ留めた探針を含む原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）とを含む、標的核酸を検出するシステム。
【請求項２１】
該バイオチップが、その上にプローブ分子をつなぎ留めたデンドロンでコーティングされている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
該ＡＦＭの該探針が、その上に検出分子を固定化したデンドロンでコーティングされている、請求項２１に記載のシステム。
【請求項１】
流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法であって、
（ｉ）該流体媒体を固体基板と接触させることであって、該固体基板が、
その表面上にデンドロンのアレイを含み、前記デンドロンの各々が、
中心原子、
任意にリンカーを介して、該中心原子と結合しているプローブ、及び
該中心原子と結合しているベース部分であって該固体支持体の表面と結合している複数の末端を有するベース部分、
を含む、並びに
（ｉｉ）該結合したリガンドと該リガンドに対する親和性を有する検出分子との間の結合力を測定することによりプローブ−標的リガンド複合体の存在を決定することであって、該検出分子が原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の探針の表面につなぎ留められており、該プローブ−標的リガンド複合体と該検出分子との間の力の増大の測定が該プローブ−標的リガンド複合体の存在を示す、
を含む、流体媒体中における標的リガンドの存在を検出する方法。
【請求項２】
該プローブ−標的リガンド複合体がオリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該プローブ−標的リガンド複合体が低濃度の該標的リガンドの存在下で検出され、該標的リガンドは少なくとも約１ａＭの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該標的リガンドが約１ａＭ〜約１０００ａＭの濃度である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、オリゴヌクレオチド−相補的核酸複合体における単一ヌクレオチド多型を識別することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該検出分子が検出核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該検出分子がＲＮＡのポリ−ｄＡセクションと十分に相補的なポリ−ｄＴオリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該固体基板が無孔性の固体支持体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該固体基板が平面的な無孔性の固体支持体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該固体基板がバイオチップである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）の該探針がデンドロンでコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該標的リガンドが標識されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
架橋結合した該プローブ−リガンド複合体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該プローブ−リガンド複合体が親和性分子と共有結合しており、且つ検出分子が該親和性分子と特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該親和性分子が抗原又は抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該検出分子が二本鎖ＤＮＡと選択的に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該プローブ−リガンド複合体が、該検出分子と三重らせん構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該検出分子がＤＮＡ挿入剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該検出分子が、二本鎖ＤＮＡのミスマッチセクションと選択的に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸を検出するシステムであって、（ｉ）プローブ分子を固定化したバイオチップと、（ｉｉ）その上に検出分子をつなぎ留めた探針を含む原子間力顕微鏡（「ＡＦＭ」）とを含む、標的核酸を検出するシステム。
【請求項２１】
該バイオチップが、その上にプローブ分子をつなぎ留めたデンドロンでコーティングされている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
該ＡＦＭの該探針が、その上に検出分子を固定化したデンドロンでコーティングされている、請求項２１に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５２９４７４（Ｐ２０１０−５２９４７４Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１７４７（Ｐ２０１０−５１１７４７）
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３９５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０９８０９
【国際公開日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０５２８２０４２）ポステック・アカデミー‐インダストリー・ファウンデーション (34)
【出願人】（５０２２５８４１７）ポスコ (73)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３９５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０９８０９
【国際公開日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０５２８２０４２）ポステック・アカデミー‐インダストリー・ファウンデーション (34)
【出願人】（５０２２５８４１７）ポスコ (73)
【Ｆターム（参考）】
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