本発明は、試料中の１つまたは複数の生体分子などの標的分析物の有無を検出するためのスクリーニング法、組成物およびキットに関する。より詳細には、本発明は、溶液中の複数のタンパク質構造または他の標的分析物を検出するための生化学バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の１つまたは複数の標的分析物、例えばタンパク質、核酸または他の化合物の有無を検出するためのスクリーニング法に関するものである。より詳細には、本発明は溶液中の１つまたは複数の分析物を検出するための生化学バーコードとしてリポーター・オリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析物の検出は、分子生物学研究および医療応用にとって重要である。蛍光、質量分析、ゲル電気泳動法、レーザー走査および電気化学に基づく診断法は現在、様々なタンパク質構造を特定するために使用され得る^１〜４。抗体に基づく反応は、血球の遺伝的タンパク質変異体を特定するため、疾患を診断するため、組織内の分子プローブの位置を特定するため、および分子を精製するかまたは分離工程を実行するために広く使用されている^５。医学上の診断応用（例えばマラリアおよびＨＩＶ）については、酵素免疫測定法、ウエスタンブロッティングおよび間接蛍光抗体法などの抗体検査が、単一の標的タンパク質構造を特定するために極めて有用である^６，７。複数の抗体の存在を検査するための迅速な、且つ同時の試料スクリーニング法は、研究および臨床応用で有益となろう。しかし、前記の関連したプロトコルを使用したアッセイ条件下で、いくつかのタンパク質構造を同時に検出することは困難であり、費用および時間を要する。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の形態の標的増幅法は、研究、法医学および臨床応用のために関心のあるＤＮＡ標的を検出して定量化するための強力な手段の開発において、急速な進歩を可能にした^{２６〜３２}。タンパク質のための比較標的増幅方法の開発は、医学診断学および発展中のプロテオミクスの分野を劇的に改善することができた^{３３〜３６}。タンパク質標的を化学的に複製することは未だに可能ではないが、ＰＣＲでその後に増幅することが可能であるオリゴヌクレオチドマーカーでそのような標的を標識して、その後ＤＮＡ検出を用いて関心のある標的を特定することは可能である^{３７〜４５}。しばしばイムノ−ＰＣＲと称されるこの方法は、様々な異なるフォーマットのＤＮＡ標識でタンパク質を検出することを可能にする（図５）。現在まで、すべてのイムノ−ＰＣＲ方法は異質のアッセイを含み、これには表面への標的分析物の初期固定化と、それ以降のＤＮＡ標識を有する抗体を使用した検出とが含まれる（例えば、米国特許第５，６３５，６０２号および第５，６６５，５３９号を参照）。ＤＮＡ標識は一般的に、抗体に（共有結合性相互作用またはストレプトアビジン−ビオチン結合を通して）強く結合している。これらの方法はタンパク質検出における顕著な進歩であるが、いくつかの欠点を有する：１）検出抗体に対するＤＮＡ同定配列の低い比率のために限定された感度；２）アッセイ時間を増加させてアッセイ感度を低下させる、標的捕捉法の異質の性質による遅い標的結合動態（図５の工程３）；３）抗体およびＤＮＡマーカーを化学的に結び付けるのに要求される複合コンジュゲーション化学（図５の工程４）；および４）ＰＣＲ増幅工程を必要とする^４５。したがって、試料中の標的分析物を検出するため、多重化に適合し、かつ実施することが簡単な感度が高い迅速な方法が必要である。
【０００４】
ＤＮＡ検出法については、放射性標識、分子蛍光団、化学発光スキーム、電気化学的標識、および最近ではナノ構造ベースの標識を使用して多くのアッセイが開発された^{６１〜７０}。一部のナノ構造ベースの方法は感度においてＰＣＲに近づいてきているが、これまでＰＣＲによって提供される１〜１０コピーの感度レベルを達成したものはない。ＰＣＲに伴う複雑性、費用ならびに時間および労力集約的な態様を伴わないＰＣＲ様シグナル増幅を可能にする方法は、そのようなＰＣＲに基づく方法よりもかなり優位な点を提供するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、溶液中の複数の分析物を検出するための生化学バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法、プローブ、組成物およびキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この方法は、ナノ粒子で直接または間接的に官能基化された特異的結合対の認識要素を利用するとともに、金ナノ粒子の集合をもたらすハイブリダイゼーション事象はそれらの物理的性質（例えば光学、電気的、機械的性質）を大幅に変える可能性があるという以前の観察を利用している^８〜１２。一般の考えでは、特異的結合対の各認識要素は、別々であるとともに調整可能なハイブリダイゼーションおよび融解特性を有する異なるオリゴヌクレオチド配列と、ナノ粒子と関連する物理的サインとに関連付けられることができる。別々のハイブリダイゼーションおよび融解特性は、ナノ粒子と関連する物理的サインに変化を引き起こすことによって、あるいはハイブリダイゼーション／デハイブリダイゼーションまたは融解／アニーリング事象を通してオリゴヌクレオチド配列を検出することによって、一連の分析物を多分析物アッセイで解読するために使用され得る。
【０００７】
本発明の一実施形態では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
基質を準備する工程と；特異的標的分析物に対する１つまたは複数の特異的結合相補体を有する粒子および該粒子に結合した１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の粒子プローブを準備する工程であって、該粒子プローブの特異的結合相補体は特定の標的分析物に特異的であり、該粒子プローブのためのＤＮＡバーコードは該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす工程と；
該基質上へ該標的分析物を固定する工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該分析物に対する特異的結合相補体の間の結合を可能にして複合体を形成するのに有効な条件下で、該固定された標的分析物を１種類または数種類の粒子プローブと接触させる工程と；
未結合の粒子プローブを除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードを任意で増幅させる工程と；
該マーカーの有無は試料中の特異的標的分析物の有無を示している該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備えている。
【０００８】
本発明のこの実施形態の一態様では、前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である。
【０００９】
本発明の他の態様では、ＤＮＡバーコードはＰＣＲによって増幅される。
本発明の他の態様では、粒子は少なくとも２つのＤＮＡバーコードで標識される。
本発明の他の態様では、基質は、標的分析物のための１種類または数種類の捕獲プローブで配列される。
【００１０】
本発明の他の実施形態では、試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、各標的分析物が少なくとも２つの結合部位を有する方法が提供され、該方法は、
基質と結合しており、特異的標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を含む１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程と；
検出プローブが、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、該特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料、捕獲プローブおよび検出プローブを接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードの有無の検出は試料中の標的分析物の有無を示している該基質上の集合複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える。
【００１１】
本発明のこの実施形態の一態様では、検出プローブは、（ｉ）特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、（ｉｉ）ナノ粒子と結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定配列を有するＤＮＡバーコードを備え、検出プローブと結合したＤＮＡバーコードは、特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たしている。
【００１２】
この実施形態の他の態様では、前記方法は前記検出工程の前にさらに、
前記集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該複合体を置く工程と；
該検出の前に該ＤＮＡバーコードを増幅させる工程とを備える。
【００１３】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードがＰＣＲによって増幅される。
この実施形態の他の態様では、前記捕獲プローブは磁性粒子のような磁性基質に結合している。
【００１４】
この実施形態の他の態様では、標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、該複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部はＤＮＡバーコードに相補的である配列を有し、該検出プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の第１の部分に相補的である配列を有する第１の標的認識オリゴヌクレオチドを備え、且つ捕獲プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の少なくとも第２の部分に相補的である配列を有する第２の標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
【００１５】
この実施形態の他の態様では、標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、検出プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、ＤＮＡバーコードは、該検出プローブと結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である配列を有し、該特異的結合相補体は、少なくとも第１および第２の部分の配列を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備え、第１の部分は該標的核酸の第１の部分に相補的であり、第２の部分は該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、基質の特異的結合相補体は、該標的核酸の第２の部分に相補的である少なくとも一部を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
【００１６】
この実施形態の他の態様では、検出プローブはデンドリマーを含む。
本発明の他の実施形態では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）磁性粒子；および（ｉｉ）該磁性粒子に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程であって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーは、特異的標的分析物の第１の結合部位と結合する工程と；
各標的分析物のために１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、検出プローブは、（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、該標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である既定の配列を有し、且つ特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たす少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備えている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして該磁性粒子と結合した集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を捕獲プローブおよび検出プローブと接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも該磁性粒子から洗い流す工程と；
該ＤＮＡバーコードの検出は標的分析物の存在を示している該複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える。
【００１７】
この実施形態の他の態様では、前記方法は前記検出工程の前にさらに、
磁場を加えることによって前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体から脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
放出されたＤＮＡバーコードを単離する工程とを備える。
【００１８】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、放出されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程を備える。
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
前記ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有するナノ粒子を準備する工程と；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と、該基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチドおよび該ナノ粒子を接触させる工程とを備える。
【００１９】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードは、検出前にＰＣＲによって増幅される。
この実施形態の他の態様では、前記方法は、前記集合複合体を分析する前に該集合複合体を単離する工程をさらに備える。
【００２０】
この実施形態の他の態様では、前記集合複合体は、磁場を該集合複合体に加えることによって単離される。
この実施形態の他の態様では、前記ナノ粒子は、金ナノ粒子または半導体ナノ粒子などの金属ナノ粒子である。
【００２１】
この実施形態の他の態様では、前記特異的結合対は、抗体および抗原；受容体およびリガンド；酵素および基質；薬剤および標的分子；アプタマーおよびアプタマー標的；少なくとも部分的に相補的な２つのオリゴヌクレオチド鎖である。
【００２２】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードは、ビオチン化、放射性標識、または蛍光標識されてもよい。
本発明の他の実施形態では、試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
プローブに結合した複数のオリゴヌクレオチド、特異的標的分析物の１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類または数種類の粒子複合プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
標的分析物の存在下で該標的分析物および該粒子複合体プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を該粒子複合プローブと接触させる工程と；
集合複合体形成が起こったかどうかを観察する工程とを備える。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、各標的分析物が少なくとも２つの結合部位を有する方法を提供する。前記方法は、使用される各標的分析物のための少なくとも１種類の捕獲プローブおよび少なくとも１種類の検出プローブを備える。これらのプローブは、実際のアッセイを行う前に、またはアッセイを行っている間にｉｎ ｓｉｔｕで生成されてもよい。前記捕獲プローブは第１の特異的結合対の第１の部分を備え、該第１の特異的結合対の第１の部分は標的分析物の第１の結合部位と結合し、且つ該第１の特異的結合対の第１の部分は任意で基質と結合する。好ましい一実施形態では、基質は磁性粒子を備える。前記検出プローブは、（１）ナノ粒子；（２）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１のメンバー；（３）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および（４）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える。標的分析物を含む試料に使用される場合、捕獲プローブ上の第１の特異的結合対の第１のメンバーは該標的分析物の第１の結合部位と結合し、検出プローブ上の第２の特異的結合対の第１のメンバーは該標的分析物の第２の結合部位と結合する。集合は、標的分析物によって捕獲プローブおよび検出プローブが一緒にされるときに起こる。上述したように、複数の標的が存在する特定の標的分析物を特定するために、集合体は、単離されるとともに、更に融解分析され得る。あるいは、前記集合体は、脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出することが可能である。
【００２４】
この実施形態の一態様では、粒子複合体プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を分析して異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を決定する工程とを備える。
【００２５】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
集合複合体を単離する工程と；
前記集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とを備える。
【００２６】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
該単離されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数の増幅されたＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とを備える。
【００２７】
この実施形態の他の態様において、前記標的は３つ以上の結合部位を有し、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが準備され、第１の種類のプローブは標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブはプローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する。プローブが標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合体プローブが準備されてもよい。
【００２８】
この実施形態の他の態様では、前記１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程は、
該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を準備する工程であって、ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有することと；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と、該基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と、該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチドおよび該ナノ粒子を接触させる工程と；
検出可能な変化を観察する工程とを備える。
【００２９】
この実施形態の他の態様では、前記基質は、１つまたは複数の異なる種類のＤＮＡバーコードの検出を可能にする配列で前記基質に結合した数種類のオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
この実施形態の他の態様では、前記検出可能な変化は基質上の暗領域の形成である。
この実施形態の他の態様では、前記検出可能な変化は光学スキャナで観察される。
この実施形態の他の態様では、検出可能な変化をもたらすために、前記基質が銀染色と接触される。
【００３１】
この実施形態の他の態様では、該ＤＮＡバーコードが、前記基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、前記ＤＮＡバーコードが該基質と接触し、その後、該基質と結合した該ＤＮＡバーコードが、前記ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが該基質上のＤＮＡバーコードの配列の一部とハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触する。
【００３２】
この実施形態の他の態様では、該ＤＮＡバーコードが、前記ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、前記ＤＮＡバーコードが、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触し、その後、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードが、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該基質と接触する。
【００３３】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードは、接触工程前に増幅される。
この実施形態の他の態様において、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが準備され、第１の種類のプローブは標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該標的分析物の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する。
【００３４】
本発明の他の実施形態では、粒子複合プローブが提供される。したがって、この実施形態の一態様では、前記粒子複合プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
【００３５】
この実施形態の他の態様では、前記粒子複合プローブは、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する。
【００３６】
この実施形態の他の態様では、前記粒子複合プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体を備え、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子としての機能を果たす。
【００３７】
本発明の他の実施形態では、粒子複合プローブが提供される。したがって、本発明の一実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブが提供され、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
【００３８】
本発明の他の実施形態では、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブが提供され、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する。
【００３９】
本発明の他の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体を備える粒子複合プローブが提供され、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子としての機能を果たす。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、ナノ粒子；該ナノ粒子に結合した特異的結合対のメンバー；該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および既定の配列を有し、該少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える検出プローブが提供される。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、上述の粒子複合プローブを備えるキットが提供される。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明に照らして明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本願で使用されるように、複数のオリゴヌクレオチドが結合したある「種類の」ナノ粒子、複合体、粒子、ラテックスマイクロスフェア等は、同じ種類のオリゴヌクレオチドが結合した複数の物質を指す。「複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子」はまた、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体」、または本発明の検出法の場合、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ」、「ナノ粒子プローブ」もしくは単に「プローブ」とも呼ばれる。
【００４３】
本発明を通して使用されるように、「バーコード」、「生化学バーコード」、「バイオバーコード」、「バーコードＤＮＡ」、「ＤＮＡバーコード」、「リポーターバーコード」、「リポーターバーコードＤＮＡ」等は、すべて互いに交換可能であって同じ意味を有する。ＤＮＡバーコードは、デオキシ核酸またはリボ核酸などの核酸でもよい。好ましくは、ＤＮＡバーコードは、予め定義された配列のオリゴヌクレオチドである。必要に応じて、ＤＮＡバーコードは、例えばビオチン、放射性標識または蛍光標識で標識されてもよい。
【００４４】
用語「ナノ粒子複合体」または「ナノ粒子複合プローブ」は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体、リポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える複合体を指す。
【００４５】
用語「分析物」または「標的分析物」は、検出される化合物または組成物を指し、薬剤、代謝産物、農薬、汚染物質などを含む。分析物は特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーを備え、一価（モノエピトープ性）または多価（ポリエピトープ性）であり、好ましくは抗原性またはハプテンであるリガンドであってもよく、単一化合物または少なくとも１つの共通のエピトープ部位または決定部位を共有する複数の化合物である。分析物は、細菌、またはＡ、Ｂ、Ｄ等のような血液型抗原を有する細胞のような細胞の一部、あるいはＨＬＡ抗原または微生物、例えば細菌、真菌、原生動物もしくはウイルスでもよい。分析物がモノエピトープである場合、分析物はさらに例えば化学的に修飾され、１つまたは複数のさらなる結合部位を提供することが可能である。本発明の実践では、分析物は少なくとも２つの結合部位を有する。
【００４６】
多価のリガンド分析物は通常、ポリペプチドおよびタンパク質、多糖類、核酸ならびにその組合せのようなポリマー性のより大きな有機化合物である。そのような組合せは、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜などの構成要素を含む。
【００４７】
ほとんどの場合、対象発明が適用される可能性があるポリエピトープのリガンド分析物は、少なくとも約５，０００、より好ましくは少なくとも約１０，０００の分子量を有する。ポリマー分子カテゴリーにおいて、関心のあるポリマーは通常、約５，０００から５，０００，０００の分子量、より好ましくは約２０，０００から１，０００，０００の分子量であり；関心のあるホルモンでは、分子量は通常、約５，０００から６０，０００の範囲である。
【００４８】
多種多様なタンパク質が、類似した構造上の特徴を有するタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物、特に疾患を引き起こす微生物に関連したタンパク質などのファミリーに属していると考えられる。そのようなタンパク質としては、例えば免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー、組織特異抗原などが挙げられる。
【００４９】
本発明の関心のあるタンパク質、血液凝血因子、タンパク質ホルモン、抗原性多糖類、微生物および他の病原体の種類は、本願明細書にそのすべてが援用されている米国特許第４，６５０，７７０号で具体的に開示されている。
【００５０】
モノエピトープ性リガンド分析物は通常、約１００から２，０００の分子量、より好ましくは１２５から１，０００の分子量である。
分析物は、宿主からの体液のような試料で直接見られる分子であってもよい。試料は直接調べられてもよいし、分析物の検出をより容易にするために前処理されてもよい。さらに、関心のある分析物は、関心のある分析物が試料内に存在するときだけ存在が検出される関心のある分析物の証拠となる剤、例えば関心のある分析物に相補的な特異的結合対のメンバーを検出することによって決定されてもよい。したがって、分析物の証拠となる剤は、アッセイで検出される分析物になる。体液としては、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液などが挙げられる。
【００５１】
用語「特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバー」は、２つの異なる分子のうち、他の分子の特定の空間組織および／または極性組織と結合し、それと相補的であると定義され得る１つの分子を指す。この特異的結合対のメンバーは、リガンドおよび受容体（アンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ））と称され得る。これらは通常、抗原抗体などの免疫学的な対のメンバーとなるが、ビオチン−アビジン、酵素−基質、酵素−アンタゴニスト、酵素−アゴニスト、薬剤−標的分子、ホルモン−ホルモン受容体、核酸デュプレックス、ＩｇＧ−プロテインＡ／プロテインＧ、ポリヌクレオチド対、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、タンパク質−ＤＮＡ、脂質−ＤＮＡ、脂質−タンパク質、多糖類−脂質、タンパク質−多糖類、核酸アプタマーおよび関連標的リガンド（例えば小さな有機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、ウイルス、細胞、その他）などのような他の特異的結合対は免疫学的な対ではなくても本発明およびｓｂｐのメンバーの定義に含まれる。特異的結合対のメンバーは、分子全体、または該メンバーが標的分析物上の結合部位と特異的に結合して特異的結合対を形成する限り、分子の一部だけであることが可能である。
【００５２】
用語「リガンド」は、受容体が自然に存在するか、または調製されることが可能である任意の有機化合物を指す。用語リガンドはリガンド類似体も含み、該リガンド類似体は修飾されたリガンドのことであり、通常有機ラジカルまたは分析物類似体であり、通常分子量が１００を超え、類似リガンドと受容体をめぐって競合することが可能であり、該修飾はリガンド類似体を他の分子に結合する手段を提供する。リガンド類似体は通常、その必要はないがリガンド類似体をハブまたは標識に結合する結合による水素の置換を上回るリガンドとは異なる。リガンド類似体は、リガンドと類似の方法で受容体と結合することが可能である。この類似体は、例えばリガンドに対する抗体のイディオタイプに向けられた抗体でもよい。
【００５３】
用語「受容体」または「アンチリガンド」は、分子の特定の空間組織および極性組織、例えばエピトープ部位または決定部位を認識することができる任意の化合物または組成物を指す。実例となる受容体としては、天然の受容体、例えばサイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、核酸アプタマー、アビジン、プロテインＡ、バースター（ｂａｒｓｔａｒ）、相補体成分Ｃ１ｑなどが挙げられる。アビジンは、卵白アビジンおよびストレプトアビジンなどの他の供与源からのビオチン結合タンパク質を含む。
【００５４】
用語「特異的結合」は、２つの異なる分子のうちの１つの分子が、他の分子の大幅に低い認識と比較して特異的に認識することを指す。通常、これらの分子は、それらの表面上または空孔内に２つの分子間で特異的な認識を引き起こす領域を有する。特異的な結合の例は、抗体抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。
【００５５】
用語「非特異的結合」は、特異的な表面構造とは比較的無関係にある分子の間の結合を指す。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用を含むいくつかの因子から生じることが可能である。
【００５６】
用語「抗体」は、他の分子の特定の空間組織および極性組織と特異的に結合し、よってそれと相補性があると定義される免疫グロブリンを指す。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、またその調製は当技術分野で公知の手法、例えば宿主の免疫化および血清回収（ポリクローナル）により、または連続したハイブリッド細胞系を調製して分泌されたタンパク質（モノクローナル）を回収することにより、または少なくとも自然抗体の特異的な結合のために必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくはその突然変異バージョンをクローニングおよび発現することによって行われ得る。抗体には完全な免疫グロブリンまたはその断片が含まれてもよく、その免疫グロブリンとしては様々な分類群およびアイソ種類、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭ等が挙げられる。前記断片としては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ’等が挙げられる。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持されている限り、免疫グロブリンまたはそれらの断片の集合体、ポリマーおよび複合体も必要に応じて使用され得る。
【００５７】
本発明は、試料中の複数の分析物を検出するための生化学バーコードとしてオリゴヌクレオチドを利用する方法に関する。この方法は、ナノ粒子で直接または間接的に官能基化された認識要素（例えばタンパク質または核酸）を利用し、金ナノ粒子の集合をもたらすハイブリダイゼーション事象は、それらの物理的性質（例えば光学、電気的、機械的性質）を大幅に変える可能性があるという以前の観察結果を利用している^８〜１２。一般の考えでは、各認識要素は、別々の調整可能なハイブリダイゼーションおよび融解特性を有する異なるオリゴヌクレオチド配列（ＤＮＡバーコード）、ならびに融解すると変化するナノ粒子と関連する物理的サインと関連付けられ、多分析物アッセイにおいて一連の分析物を解読することが可能である。したがって、ＤＮＡに結合した集合体の融点および融解により変化するナノ粒子と関連する物理的性質を使用して、多分析物アッセイで一連の分析物を解読することが可能である。バーコードは、本願ではナノロッド（ｎａｎｏｒｏｄ）^２３、蛍光団標識ビード^２４、および量子ドット^２５のような物理的診断マーカーに基づくものとは、解読情報が予め設計されたオリゴヌクレオチド配列で保存されている化学情報の形態であるという点で異なる。
【００５８】
本発明は、試料中の様々な生体分子、例えば単一または複数の多価タンパク質を検出するために、オリゴヌクレオチドで大きく官能基化されたナノ粒子プローブ（好ましくは金のナノ粒子プローブ）を使用するための適用範囲の広いいくつかの方策を提供する。特に、試料中の複数のタンパク質を検出する公知の方法は複雑であり、しばしば時間を要する高価なアッセイプロトコルを必要とする。この点に関しては、最近、溶液中の複数のタンパク質標的を認識するために、蛍光団標識ペプチド核酸およびＤＮＡマイクロアレイが使用された^{１５〜１７}。しかし、この方法は、オリゴヌクレオチドで標識されたタンパク質のマイクロアレイ表面への結合に依存する。本願で記載されている方法の最終的な工程は、通常のＤＮＡの界面化学だけに基づく。したがって、それは最新技術のナノ粒子ＤＮＡ検出法の高感度態様の多くを取り入れることが可能であるが^９，１１、検出事象の間にタンパク質を存在させることなく、ＤＮＡよりむしろタンパク質などの様々な生体分子の検出を可能にする。表面アッセイについては、タンパク質は固体支持体に対してより大きな非特異性の結合を示す傾向があり、しばしば高いバックグラウンドシグナルを生じることから、一般的に短いオリゴヌクレオチドより扱いが困難である。最後に、均一アッセイについては、これらのナノ粒子構造と関連する非常に鋭い融解プロフィールは、通常の広いＤＮＡ融解挙動を示すプローブで可能なものより多くのバイオバーコードの設計を可能にする。
【００５９】
本発明は、検出アッセイでの使用に適する複数のオリゴヌクレオチドが結合した任意の適切な粒子の使用を意図する。しかし、本発明の実施ではナノ粒子が好まれる。粒子の大きさ、形および化学組成は、得られたＤＮＡバーコードを含むプローブの特性に寄与する。これらの特性としては、光学的性質、光電子特性、電気化学的性質、電子的性質、様々な溶液中の安定性、孔およびチャンネルの大きさの変異、フィルタの役目をする際の生体活性分子を分離する能力等がある。異なる大きさ、形および／または化学組成を有する粒子の混合物の使用、ならびに一様な大きさ、形および化学組成を有するナノ粒子の使用が意図される。適当な粒子の例としては、これに限定されるものではないが、ナノサイズおよびマイクロサイズのコア粒子、集合粒子、等方性粒子（例えば球状粒子）および異方性粒子（非球形ロッド、四面体、プリズム）ならびにコア−シェル粒子、例えば本願明細書でその全体を援用した２００２年１２月２８日に出願された米国特許出願１０／０３４，４５１および２００２年１２月２８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５で記載されているものが挙げられる。本発明の実施では、これらの検出プローブは好ましくは実際のアッセイを行う前に生成される。あるいは、これらの検出プローブは、アッセイを行っている間にｉｎ ｓｉｔｕで生成されてもよい。
【００６０】
したがって、本発明の一実施形態では、ナノ粒子複合体プローブが提供される。本発明の実施において有用なナノ粒子としては、金属（例えば金、銀、銅およびプラチナ）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコーティングされたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）および磁性（例えば強磁性）コロイド状の物質が挙げられる。本発明の実施において有用な他のナノ粒子としては、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ_２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ_２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ_２Ｓ_３、Ｉｎ_２Ｓｅ_３、Ｃｄ_３Ｐ_２、Ｃｄ_３Ａｓ_２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子の大きさは、好ましくは約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均粒径）、より好ましくは約３０から約１００ｎｍ、最も好ましくは約４０から約８０ｎｍである。ナノ粒子の大きさは、それらの特定の使用または用途により必要に応じて変更され得る。大きさの変更は、ナノ粒子の特定の物理的特性、例えば光学的性質または誘導体化が可能である表面積の量を最適化するために、有利に使用され得る。ナノ粒子は、ロッド、プリズムまたは四面体でもよい。
【００６１】
金属、半導体および磁性のナノ粒子の製造方法は、当技術分野で公知である。例えば、シュミット、ジー（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．）（編）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４）；アヤ、エム エー（Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．）（編）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、１９９１）；マサート、アール（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥ Ｔａｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、１７、１２４７頁（１９８１）；アーマジ、ティー エスら（Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２、１９２４頁（１９９６）；ヘングライン、エーら（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９９、１４１２９頁（１９９５）；カーティス、エー シーら（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２７、１５３０頁（１９８８）を参照。
【００６２】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ_２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ_２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ_２Ｓ_３、Ｉｎ_２Ｓｅ_３、Ｃｄ_３Ｐ_２、Ｃｄ_３Ａｓ_２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓのナノ粒子の製造方法も当技術分野で公知である。例えば、ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３２、４１頁（１９９３）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．、１４３、１１３頁（１９８８）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、８９、１８６１頁（１９８９）；ブラス（Ｂｒｕｓ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．、５３、４６５頁（１９９１）；バンクマン（Ｂａｈｎｃｍａｎｎ）、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｓｏｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ（ペリツエッチ（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ）およびシアベロ（Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ）編、１９９１）、２５１頁；ワング（Ｗａｎｇ）およびヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５、５２５頁（１９９１）；オルシャブスキーら（Ｏｌｓｈａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１２、９４３８頁（１９９０）；ウシダら（Ｕｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５、５３８２頁（１９９２）を参照。
【００６３】
適当なナノ粒子は、例えばテッドペラインコーポレイティッド社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）（金）、アマシャムコーポレーション社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）およびナノプローブインコーポレイティッド社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）からも市販されている。
【００６４】
現在核酸を検出するために好まれているのは、金のナノ粒子である。金のコロイド粒子は、それらの美しい色をもたらすバンドのために、高い吸光係数を有する。これらの強烈な色は、粒度、濃度、粒子間距離および集合体の集合程度および形（幾何学）で変わり、これらの物質を比色アッセイのために特に魅力的にしている。例えば、金のナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドおよび核酸とのハイブリダイゼーションは、裸眼で見える変色を直ちにもたらす（例えば実施例を参照）。
【００６５】
ナノ粒子、オリゴヌクレオチドまたはその両方とも、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために官能基化される。このような方法は当技術分野において公知である。例えば、アルカンチオールによって３’末端または５’末端で官能基化されたオリゴヌクレオチドは、金のナノ粒子に容易に結合する。ホワイトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、テキサス州ヒューストン、１０９〜１２１頁（１９９５）を参照。また、ムシクら（Ｍｕｃｉｃ ｅｔ ａｌ．）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５５５〜５５７頁（１９９６）（３’チオールＤＮＡを扁平な金表面へ結合する方法を記載している；この方法は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために使用され得る）も参照。アルカンチオール方法は、オリゴヌクレオチドを、他の金属、半導体および磁性コロイドに、ならびに上述で列挙された他のナノ粒子に結合するためにも使用され得る。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合するための他の官能基としては、ホスホロチオエート基（オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金の表面への結合については、米国特許第５，４７２，８８１号を参照）、置換されたアルキルシロキサン（シリカおよびガラス表面へのオリゴヌクレオチドの結合については、例えばバーウェル（Ｂｕｒｗｅｌｌ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、３７０〜３７７頁（１９７４）、およびマッテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルーテル（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３、３１８５〜３１９１頁（１９８１）、ならびにアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの類似した結合については、グラバーら（Ｇｒａｂａｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６７、７３５〜７４３頁を参照）が挙げられる。末端が５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドのオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを固体表面に結合するために使用されてもよい。以下の参照は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合するために使用され得る他の方法を記載する：ナッツオら（Ｎｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９、２３５８頁（１９８７）（金へのジスルフィド）；アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびナッツオ（Ｎｕｚｚｏ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１、４５頁（１９８５）（アルミニウムへのカルボン酸）；アラーラ（Ａｌｌａｒａ）およびトムキンズ（Ｔｏｍｐｋｉｎｓ）、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．、４９、４１０〜４２１頁（１９７４）（銅へのカルボン酸）；イレール（Ｉｌｅｒ）、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｌｉｃａ、第６章、（ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）１９７９）（シリカへのカルボン酸）；ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）およびジスマン（Ｚｉｓｍａｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、６９、９８４〜９９０頁（１９６５）（プラチナへのカルボン酸）；ソリアガ（Ｓｏｒｉａｇａ）およびハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０４、３９３７頁（１９８２）（プラチナへの環状芳香族化合物）；ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、１３、１７７頁（１９８０）（プラチナへのスルホラン、スルホキシドおよび他の官能基化溶媒）；ヒックマンら（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、７２７１頁（１９８９）（プラチナへのイソニトリル）；マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギブ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、１０４５頁（１９８７）（シリカへのシラン）；マオズ（Ｍａｏｚ）およびサギブ（Ｓａｇｉｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、１０３４頁（１９８７）（シリカへのシラン）；ワッサーマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、５、１０７４頁（１９８９）（シリカへのシラン）；エルテコバ（Ｅｌｔｅｋｏｖａ）およびエルテコブ（Ｅｌｔｅｋｏｖ）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３、９５１頁（１９８７）（二酸化チタンおよびシリカへの芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコール類およびメトキシ基）；レックら（Ｌｅｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９２、２５９７頁（１９８８）（金属への硬質リン酸塩）。
【００６６】
本発明のこの実施形態の一態様では、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドで標識されたデンドリマーでコンジュゲートされたナノ粒子が提供される。樹枝状の分子は複数の分岐単位モノマーからなる構造であり、様々な用途で使用される。例えば、バースら（Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：５８〜６６頁（１９９４）；ギトブ（Ｇｉｔｓｏｖ）およびフレシェ（Ｆｒｅｃｈｅｔ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：６５３６〜６５４６頁（１９９３）；ホーカー（Ｈａｗｋｅｒ）およびフレシェ（Ｆｒｅｃｈｅｔ）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７６３８〜７６４７頁（１９９０ａ）；ホーカー（Ｈａｗｋｅｒ）およびフレシェ（Ｆｒｅｃｈｅｔ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：４７２６〜４７２９頁（１９９０ｂ）；ホーカーら（Ｈａｗｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１２８７〜１２９７頁（１９９３）；ロックマンら（Ｌｏｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：７０４３〜７０４４頁（１９９３）；ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０１８〜１０２５頁（１９９２）；マウジら（Ｍｏｕｓｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５：２４０１〜２４０６頁（１９９２）；ネイラーら（Ｎａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３３９〜２３４１頁（１９８９）；スピンドラー＆フレシェ（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ ＆ Ｆｒｅｃｈｅｔ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：４８０９〜４８１３頁（１９９３）；ターナーら（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：４６１７〜４６２３頁（１９９３）；ウィーナーら（Ｗｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｍｅｄ．３１（１）：１〜８頁（１９９４）；サービス（Ｓｅｒｖｉｃｅ）、２６７：４５８〜４５９頁（１９９５）；トマリア（Ｔｏｍａｌｉａ）、Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．６２〜６６頁（１９９５）；ならびに本願でそのすべてが援用されているトマリア（Ｔｏｍａｌｉａ）への米国特許第４，５５８，１２０号；第４，５０７，４６６号；第４，５６８，７３７号；第４，５８７，３２９号；第４，８５７，５９９号；第５，５２７，５２４号；第５，３３８，５３２号、およびニルセン（Ｎｉｌｓｅｎ）への米国特許第６，２７４，７２３号を参照。樹枝状の分子は他の種類の超分子構造よりも重要な利点を提供し、例えば最小構造単位の最大量を接触させること、大きさ、重量および成長特性をより容易に制御する能力などがあり、また、複数の末端を標識間の空間が明瞭な高度標識分子を生成するために誘導体化すること、またはそれらは他の分子もしくはその混合物のために結合部位を提供することが可能である。一般には、合成方法については米国特許第６，２７４，７２３号および上記の引用文献を参照。
【００６７】
本発明の方法で有用である核酸デンドリマーは、核酸で官能基化され得るか、または核酸／オリゴヌクレオチドから生成され得る当技術分野で公知のもののいずれかである。そのようなデンドリマーは、例えばハドソンら（Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：２１１９〜２１２４頁（１９９３）；カントール（Ｃａｎｔｏｒ）への米国特許第６，２７４，７２３号；および米国特許第５，５６１，０４３号などの開示に従って合成され得る。
【００６８】
本発明のこの実施形態の他の態様では、汎用性のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体が提供される。この汎用性プローブは、少なくとも２つの部分を備える任意の標的核酸のためのアッセイで使用されてもよい。この「汎用性プローブ」は、（ｉ）リポーター・オリゴヌクレオチド（例えばバーコードＤＮＡ）の少なくとも一部および標的認識オリゴヌクレオチドの一部と相補的である単一の「捕獲」配列が結合した複数のオリゴヌクレオチドを含む（汎用性プローブの一実施形態は、図１６Ａおよび１６Ｂで記載されている）。この標的認識オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を有する配列を含む。第１の部分はナノ粒子に結合した捕獲配列に対する相補配列を備え、第２の部分は特定の標的核酸配列の第１の部分に対する相補配列を備える。各種の標的認識オリゴヌクレオチドを汎用性プローブと有利に使用することが可能であり、したがって、特定の試液中の特定の標的核酸配列を選択するために、標的認識オリゴヌクレオチドのライブラリーを変更または交換することが可能である。標的核酸の第２の部分と相補的な配列を含む第２の種類のオリゴヌクレオチドは、支持体表面、例えば磁性粒子またはガラスのスライドに結合する。
【００６９】
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、汎用性プローブを、リポーター・オリゴヌクレオチド（バーコードＤＮＡ）および標的認識オリゴヌクレオチドを含む溶液と接触させると、標的核酸を含んでいるかもしれない溶液との接触のために「活性化された」汎用性プローブが形成される（図１６Ａ、上部反応スキーム）。試液は、「活性化」汎用性プローブまたは支持体に結合している第２の種類のオリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方との、逐次または組合せによるハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触され得る。一旦複合体形成のために十分な時間が与えられると、複合体を形成していない試液構成要素は複合体から除去され、リポーター・オリゴヌクレオチドが検出される。このアッセイの一実施形態を図１６Ｂで示す。
【００７０】
これらの汎用性プローブは、さらに有利にするために操作されることが可能である、これは実施する特定のアッセイに依存する。これらのプローブは、第２の部分が関心のある標的核酸に相補的な配列を含むように標的認識オリゴヌクレオチドを単に置換または交換することによって、様々な単一の標的核酸配列に合わせて「調整」され得る。同様に、複数の標的核酸配列を単一の試液で分析する場合は、リポーター・オリゴヌクレオチドは各標的核酸に特異的である配列を含むことが可能である。したがって、既知の特異的な配列のリポーター・オリゴヌクレオチドの検出は、試液中の特定の標的核酸の存在を示すであろう。
【００７１】
本発明のこの実施形態の他の態様では、オリゴヌクレオチドは、硫黄ベースの官能基を使用してナノ粒子と結合される。米国特許出願０９／７６０，５００および０９／８２０，２７９ならびに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１は、本発明を実施する際に有用である環状ジスルフィドで官能基化されたオリゴヌクレオチドを記載している。環状ジスルフィドは、２つの硫黄原子を含みむとともに好ましくは５つまたは６つの原子を有する。適当な環状ジスルフィドは市販されているが、公知の方法で合成されてもよい。環状ジスルフィドの還元形も使用され得る。
【００７２】
好ましくは、リンカーは、環状ジスルフィドに結合した炭化水素部分をさらに含む。適当な炭化水素は市販されており、環状ジスルフィドに結合される。好ましくは、炭化水素部分はステロイド残基である。環状ジスルフィドに結合しているステロイド残基を含んでいるリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体は、予想外にもチオール（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液で使用されるジチオスレイトール）に対して、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを使用して調製された複合体と比較して著しく安定していた。実際に、本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体は３００倍より安定していた。この予想外の安定性は、各オリゴヌクレオチドが単一の硫黄原子よりむしろ２つの硫黄原子を通してナノ粒子に固定されるという事実のためであろう。特に、環状ジスルフィドの２つの隣接した硫黄原子はオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を安定させる際に有利となるキレート化効果を有するであろうと思われる。リンカーの大きな疎水性のステロイド残基も、ナノ粒子表面への水溶性分子の接近からナノ粒子を遮蔽することによって、複合体の安定性に寄与するようである。
【００７３】
前記を考慮して、環状ジスルフィドの２つの硫黄原子は、それら硫黄原子の両方ともナノ粒子に同時に結合することが可能になるように互いに十分に近いことが好ましい。最も好ましくは、この２つの硫黄原子は互いに隣接している。また、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を遮蔽する大きな疎水性表面を示すように大きくなければならない。
【００７４】
環状ジスルフィドリンカーを使用するオリゴヌクレオチド−環状ナノ粒子複合体は、米国特許出願０９／７６０，５００および０９／８２０，２７９ならびに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１で記載されているように、試料中の標的分析物を検出するための診断検査でプローブとして使用されてもよい。これらの複合体は、それらが使用される診断検査の感度を向上させることがわかった。特に、環状ジスルフィドに結合しているステロイド残基を含んでいるリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を用いるアッセイは、リンカーとしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドを使用して調製された複合体を用いるアッセイよりも約１０倍感度が高いことがわかった。
【００７５】
各ナノ粒子は、それに結合している複数のオリゴヌクレオチドを有する。その結果、各ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体は、相補配列を有する複数のオリゴヌクレオチドまたは核酸と結合することが可能である。
【００７６】
既定の配列のオリゴヌクレオチドは、本発明の実行において様々な目的のために使用される。既定配列のオリゴヌクレオチドの製造方法は公知である。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）、およびエフ エクスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、第１版（オックスフォード大学出版部（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１）を参照。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドのためには固相合成方法が好まれる（公知のＤＮＡを合成する方法もＲＮＡを合成するために有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製され得る。標的分析物に対する特異的結合相補体が結合しているオリゴヌクレオチドについては、タンパク質のような特異的結合相補体をオリゴヌクレオチドに結合するための任意の適切な方法が使用されてもよい。
【００７７】
オリゴヌクレオチドを粒子、ナノ粒子またはナノスフェアの表面へ結合する任意の適切な方法が使用されてもよい。オリゴヌクレオチドを表面へ結合するための特に好ましい方法は、本願明細書でそのすべてを援用している１９９９年６月２５日に出願の米国特許出願０９／３４４，６６７；２０００年６月２６日に出願の０９／６０３，８３０；２００１年１月１２日出願の０９／７６０，５００；２００１年３月２８日出願の０９／８２０，２７９；２００１年８月１０日出願の０９／９２７，７７７；および１９９７年７月２１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３；２０００年６月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７；２００１年１月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０；２００１年３月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１で記載されているエージング工程をベースにしている。エージング工程は、予想外に強化された安定性および選択性を有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を提供する。
【００７８】
この方法は、好ましくはナノ粒子と結合することが可能な官能基を含む部分が共有結合しているオリゴヌクレオチドの準備を含む。これらの部分および官能基は、（すなわち、化学吸着または共有結合による）ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合を可能にするものである。例えば、アルカンチオール、アルカンジスルフィド、またはそれらの５’末端もしくは３’末端に共有結合した環状ジスルフィドを有するオリゴヌクレオチドは、金のナノ粒子を含む様々なナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合するために使用され得る。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、その少なくとも一部が官能基によってナノ粒子と結合することを可能にするのに十分な時間、水の中でナノ粒子と接触する。そのような時間は経験的に決定され得る。例えば、約１２〜２４時間の時間が良い結果を与えることが明らかになっている。オリゴヌクレオチドの結合のための他の適当な条件も経験的に決定され得る。例えば、約１０〜２０ｎＭの濃度のナノ粒子および室温でのインキュベーションは良い結果を与える。
【００８０】
次に、少なくとも１つの塩を水に加えて塩溶液を形成する。この塩は任意の適切な水溶性塩でもよい。例えば、この塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩のうちの２つ以上の組合せ、またはこれらの塩の１つのリン酸緩衝液であってもよい。好ましくは、この塩は濃縮溶液として加えられるが、固体として加えることが可能であった。塩のすべてが一時に水に加えられることが可能であり、または塩は徐々に逐次加えられる。「徐々に逐次」は、塩は少なくとも２つの部分に分けて時間の間隔をあけて加えられることを意味する。適当な時間の間隔は、経験的に決定され得る。
【００８１】
塩溶液のイオン強度は、互いのオリゴヌクレオチドの静電反発力、および正に荷電したナノ粒子に対する負に荷電したオリゴヌクレオチドの静電引力、または負に荷電したナノ粒子からの負に荷電したオリゴヌクレオチドの静電反発力に少なくとも部分的に耐えるのに十分でなければならない。塩を徐々に逐次加えることによって静電引力および反発を徐々に減らすことは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの面密度を最大にすることがわかった。各塩または塩の組合せのための適当なイオン強度は、経験的に決定され得る。塩化ナトリウムのリン酸緩衝液の約０．１Ｍから約１．０Ｍの最終濃度で、好ましくは塩化ナトリウムの濃度を徐々に逐次高くすることが良い結果を生むことがわかった。
【００８２】
塩を加えた後に、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子が、十分なさらなるオリゴヌクレオチドがナノ粒子と結合して安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を形成することを可能にするのに十分な時間、塩溶液中でインキュベートされる。以下に詳細に記載されているように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの増加した面密度は複合体を安定させることがわかった。このインキュベーション時間は経験的に決定され得る。約２４〜４８時間、好ましくは４０時間の総インキュベーション時間がよい結果をもたらすことがわかった（これはインキュベーションの合計時間である；上で指摘したように、塩濃度はこの合計時間内で徐々に高められ得る）。塩溶液内のインキュベーションのこの第２の期間は、本願で「エージング」工程と称される。この「エージング」工程のための他の適当な条件も、経験的に決定され得る。例えば、室温およびｐＨ７．０でのインキュベーションはよい結果をもたらす。
【００８３】
「エージング」工程の使用によって生じた複合体は、「エージング」工程なしで生産されたものよりかなり安定していることがわかった。上述のように、この増加した安定性は、ナノ粒子の表面の「エージング」工程によって達成されたオリゴヌクレオチド密度の上昇によるものである。「エージング」工程によって達成される面密度は、ナノ粒子の大きさおよび種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存する。ナノ粒子を安定させるのに十分な面密度ならびにナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの所望の組合せを得るのに必要な条件は、経験的に決定され得る。通常、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を提供するのに、少なくとも１０ピコモル／ｃｍ^２の面密度で十分である。好ましくは、面密度は少なくとも１５ピコモル／ｃｍ^２である。複合体のオリゴヌクレオチドの核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力は、面密度が大き過ぎると減少する可能性があることから、面密度は好ましくは約３５〜４０ピコモル／ｃｍ^２以下である。
【００８４】
本願で使用されるように、「安定している」は、複合体が作製されてから少なくとも６カ月間は、ほとんどのオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合した状態を維持し、オリゴヌクレオチドは核酸の検出方法およびナノファブリケーションの方法で遭遇する標準条件下で、核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズすることができることを意味する。
【００８５】
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体のハイブリダイゼーション効率は、認識部およびスペーサー部からなる認識オリゴヌクレオチドの使用により劇的に高められることが可能であることがわかっている。「認識オリゴヌクレオチド」は、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部およびスペーサー部を含み、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズするのは認識部である。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、ナノ粒子と結合するように設計される。例えば、スペーサー部はそれと共有結合した部分を有することができ、その部分はナノ粒子と結合することが可能な官能基を含む。これらは、先に述べたものと同じ部分および官能基である。ナノ粒子への認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の結合の結果、認識部はナノ粒子の表面から距離があり、その標的とのハイブリダイゼーションのためにより都合よくなる。ナノ粒子と認識部との距離を十分にするスペーサー部の長さおよび配列は、経験的に決定され得る。少なくとも約１０のヌクレオチド、好ましくは１０〜３０のヌクレオチドを含むスペーサー部がよい結果を与えることがわかっている。スペーサー部は、ナノ粒子または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的に結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を妨げない任意の配列をも有することが可能である。例えば、スペーサー部は、互いに相補的な配列、および認識オリゴヌクレオチドの配列または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列と相補的な配列を有すべきではない。望ましくは、それが上記で指摘された問題の１つを引き起こさない限り、スペーサー部のヌクレオチドの塩基はすべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンである。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてチミンである。最も好ましくは、塩基はすべてチミンである。
【００８６】
認識オリゴヌクレオチドに加えて希釈オリゴヌクレオチドを使用することは、複合体を調整して所望のハイブリダイゼーションレベルをもたらす手段を提供することがさらにわかった。希釈オリゴヌクレオチドおよび認識オリゴヌクレオチドは、複合体を調製するためにナノ粒子と接触させた溶液中の比率とほぼ同じ比率でナノ粒子に結合することがわかった。したがって、ナノ粒子と結合した希釈オリゴヌクレオチドと認識オリゴヌクレオチドとの比率は、その複合体が所望の数のハイブリダイゼーション事象に加わるように調整され得る。希釈オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子または核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的に結合する認識オリゴヌクレオチドの能力を妨げない任意の配列をも有することが可能である。例えば、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列または認識オリゴヌクレオチドの核酸もしくはオリゴヌクレオチド標的の配列と相補的な配列を有すべきではない。また、好ましくは、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがそれらの核酸またはオリゴヌクレオチド標的と結合することが可能なように、認識オリゴヌクレオチドより短い長さである。認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部を含む場合、最も好ましくは、希釈オリゴヌクレオチドはスペーサー部とほぼ同じ長さである。このように、希釈オリゴヌクレオチドは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする認識オリゴヌクレオチドの認識部の能力を妨げない。より好ましくは、希釈オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部の配列と同じ配列を有する。
【００８７】
本発明の他の実施形態では、粒子複合プローブが提供される。粒子複合プローブは、特定の標的分析物のための既定のリポーター・オリゴヌクレオチドまたはバーコードを含む。標的分析物の存在下で、粒子複合体および標的分析物の間の結合相互作用の結果として集合体が生成される。これらの集合体は、１つまたは複数の異なる種類のリポーター・オリゴヌクレオチドの存在を検出するために、熱変性などの任意の適切な手段によっても単離されて分析され得る。本発明の実施では、ナノ粒子複合プローブが好ましい。
【００８８】
したがって、本発明の一態様では、粒子複合プローブは、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
【００８９】
この実施形態の他の態様では、粒子複合プローブは、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する。
【００９０】
この実施形態の他の態様では、粒子複合プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体を備え、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子としての機能を果たす。
【００９１】
本発明の他の実施形態では、粒子複合プローブが提供される。したがって、本発明の一実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブが提供され、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
【００９２】
本発明の他の実施形態では、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブが提供され、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する。
【００９３】
本発明の他の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体を備える粒子複合プローブが提供され、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子としての機能を果たす。
【００９４】
本発明の他の実施形態では、ナノ粒子；該ナノ粒子に結合した特異的結合対のメンバー；該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および既定の配列を有し、該少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える検出プローブが提供される。
【００９５】
好ましくは、前記粒子は、上述したように、金属、半導体、絶縁体または磁性ナノ粒子のようなナノ粒子を含む。好ましくは、前記粒子は金のナノ粒子である。特異的結合相補体または結合対のメンバー、および標的分析物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む特異的結合対のメンバーである。
【００９６】
本発明の他の実施形態では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供される。本発明のこの実施形態の一態様では、
基質を準備する工程と；
特異的標的分析物に対する１つまたは複数の特異的結合相補体を有する粒子および該粒子に結合した１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の粒子プローブを準備する工程であって、該粒子プローブの特異的結合相補体は特定の標的分析物に特異的であり、該粒子プローブのためのＤＮＡバーコードは該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす工程と；
該基質上へ該標的分析物を固定する工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該分析物に対する特異的結合相補体の間の結合を可能にして複合体を形成するのに有効な条件下で、該固定標的分析物を１種類または数種類の粒子プローブと接触させる工程と；
未結合の粒子プローブを除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードを任意で増幅させる工程と；
該マーカーの有無は試料中の特異的標的分析物の有無を示している該増殖されたＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備えている。
【００９７】
本発明のこの実施形態の一態様では、前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である。
本発明の他の態様では、任意の適切な基質が使用されてもよい。基質は、標的分析物のための１種類または数種類の捕獲プローブで配列されてもよい。
【００９８】
本発明のこの態様では、バーコードが単離され得る。分析物は、リポーター・オリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在をＤＮＡチップのような任意の適切な手段で確認することによって、間接的に検出される。
【００９９】
ＤＮＡバーコードは、ＰＣＲ増幅を含む任意の適切な手段で任意に増幅されることができ、次に、任意の適切な検出プローブを使用して任意の適切なＤＮＡ検出システムで検出され得る。粒子は、好ましくは、十分なシグナル増幅を提供してＤＮＡバーコード増幅を不要にするのに十分な量のＤＮＡバーコードで標識される。本発明を実行する際には、ＰＣＲ方法による増幅が好ましい。ＤＮＡバーコードのＰＣＲ増幅（本願ではＢＰＣＲとも称される）は、アトモルレベルでのタンパク質標的の検出を可能にする。図６で図示したアッセイは、標的分析物の前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）を認識するために、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド（バイオバーコード）^３６およびポリクローナル検出抗体で高度に官能基化した新型のナノ粒子を利用している（実施例５）。さらに、磁性酸化鉄コアを有するポリアミン微小粒子（１μｍの直径）は、ＰＳＡモノクローナル抗体で官能基化される（図６および実施例５）。金のナノ粒子およびポリアミン微小粒子はＰＳＡ標的をはさみ、バーコードＤＮＡとタンパク質標的との比率が大きい複合体を生成する（１３ｎｍの粒子では、各粒子は最高２００鎖のＤＮＡを支持することが可能；これはこの大きさの粒子の上限を表す）。磁場を使用すると数秒足らずで反応器の壁に磁性粒子が引っ張られ、反応した微小粒子と未反応の微小粒子との両方、ならびに反応したナノ粒子だけを反応混合物から分離することを可能にする。集合構造をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水（１８Ｍオーム）で洗うと、バーコードＤＮＡはナノ粒子固定化相補体から脱ハイブリダイズされる。磁選機を使用すると、集合体は簡単にアッセイ溶液から取り除かれてバーコードＤＮＡが残り、これはＰＣＲを使用して増幅され、続く標準のＤＮＡ検出法（ｓｃａｎｏｍｅｔｒｉｃ^１１、ゲル電気泳動法または蛍光団標識法）で迅速に特定され得る。ＰＳＡは、米国の男性で最も一般的な癌の１つであり、かつ２番目に重要な癌死の原因である前立腺癌の早期発見の重要性のために、これらの研究の最初の標的として選択された^{４７，４８}。重要なことに、低レベル（数十のコピー数）で存在するＰＳＡをマーカーとして使用して前立腺癌の外科的治療後の疾患再発を確認することは非常に有益であり、治癒的な補助療法の提供を可能にする^{４６，４９}。
【０１００】
実施例５〜６は、ＢＰＣＲが、バックグラウンドタンパク質の存在下でゲル電気泳動法またはスキャノメトリー（ｓｃａｎｏｍｅｔｒｉｃ）マイクロアレイ検出を使用して低いアトモルの濃度のタンパク質分析物、すなわちＰＳＡを検出するための、極めて強力な方法であることを示す。この研究は、現行のタンパク質検出法に勝るいくつかの利点を示す。第１に、アッセイの標的結合タンパク質は均一である。したがって、検出抗体および標的分析物の間の結合動態を促進するために、大量の磁性粒子を反応器に加えることが可能である。これから、不均一系より高速なアッセイがもたらされ、さらに捕獲工程がより効率的であるので感度を増やすことが可能になる。第２に、ナノ粒子バイオバーコードの使用は、ＰＣＲ増幅可能なＤＮＡと標識抗体との高い比率を提供し、実質的にアッセイ感度を高めるのに役立つ。例えば、本願で報告されているＢＰＣＲアッセイは３ａＭ濃度のＰＳＡを検出することが可能であったが、ＰＣＲに基づくイムノアッセイは同じ標的分析物に対して検出限界が３ｆＭであると報告されている^４３。第３に、このアッセイは、ＤＮＡを標識抗体に結合するための複雑なコンジュゲーション化学を不要にする。バーコードＤＮＡは、標識反応の最初にハイブリダイゼーションを通してナノ粒子プローブに結合され、簡単な洗浄工程を使用してＰＣＲ増幅のために遊離させられる。同じ粒子上に標識化抗体およびＤＮＡが存在すると、バーコードＤＮＡのＰＣＲ増幅の前にさらなる抗体またはＤＮＡ−タンパク複合体を付加する必要がない。さらに、バーコードＤＮＡは検出アッセイから取り出され、ＰＳＡを含まないバーコードＤＮＡ、大部分の生体試料、微小粒子およびナノ粒子の試料についてＰＣＲが実行される。これにより、バックグラウンドシグナルが相当減らされる。最後に、このタンパク質検出スキームは、一溶液中での多くの分析物の大量多重化および同時検出の可能性を有する。ＰＳＡ系はプルーフオブコンセプト（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ）のために使用されるが、この方法は結合パートナーが既知のほとんどいかなる標的のために一般化できるはずであり、ナノ粒子ベースのバイオバーコードの方法^３６を使用することにより、実質的にあらゆる関心のある標的のために特有の特定可能なバーコードを調製することが可能である。
【０１０１】
実施例９は、本発明のプローブが試料中の標的分析物の量を検出し、かつ直接測定するために使用され得ることを証明する。したがって、優れた感度および検出限界を達成するためには、バーコードＤＮＡを増幅するためのＢＰＣＲを含む工程は不必要である（図６Ｂ（工程４）、９（インセット）および１２）。
【０１０２】
複合体形成の後に基質表面から未結合のプローブを除去するための、任意の適切な洗浄溶液が使用されてもよい。代表例としてはＰＢＳ（リン酸緩衝液）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
標的分析物の存在下で、ナノ粒子複合プローブおよび標的分析物の間の結合相互作用の結果として、ナノ粒子集合複合体が生成される。これらの集合体が単離され、それらを脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを放出するのに有効な条件下に置かれてもよい。その後、リポーター・オリゴヌクレオチドは単離される。必要に応じて、リポーター・オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅を含む任意の適切な手段で増幅されてもよい。分析物は、リポーター・オリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードの存在をＤＮＡチップなどの任意の適切な手段で確認することによって、間接的に検出される。
【０１０４】
次に、ＤＮＡバーコードまたはリポーター・オリゴヌクレオチドは、任意の適切な手段で検出され得る。通常、ＤＮＡバーコードは検出の前に脱ハイブリダイゼーションを通して複合体から放出される。複合体からＤＮＡバーコードを脱ハイブリダイズして放出する任意の適切な溶液または媒体が用いられ得る。代表的な媒体は水である。
【０１０５】
集合体の脱ハイブリダイゼーションによって放出されるＤＮＡバーコードは、捕獲オリゴヌクレオチドが結合した基質を使用して直接検出され得る。オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的な配列を有する。このＤＮＡバーコードを検出する方法のいくつかの実施形態は、リポーター・オリゴヌクレオチドを捕獲するために、相補的なオリゴヌクレオチドが結合した基質を利用する。これらの捕獲されたリポーター・オリゴヌクレオチドは、次に任意の適切な手段によっても検出される。基質を使用することによって、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイの感度を高くすることが可能である。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドを基質へ結合する任意の適切な方法が使用されてもよい。例えば、クリジーら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４、３０３１〜３０３９頁（１９９６）；クリジーら（Ｃｈｒｉｓｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４、３０４０〜３０４７頁（１９９６）；ムチックら（Ｍｕｃｉｃ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５５５頁（１９９６）；シメルマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）およびコックス（Ｃｏｘ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２、４９２頁（１９９４）；ボトムリーら（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ、１０、５９１頁（１９９２）；およびヘグナーら（Ｈｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３３６、４５２頁（１９９３）などで記載されているように、オリゴヌクレオチドを基質に結合することが可能である。
【０１０７】
基質と結合したオリゴヌクレオチドは、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第１の部分と相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドは、基質上のオリゴヌクレオチドとリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、基質と接触する。このように、リポーター・オリゴヌクレオチドは基質と結合する。好ましくは、未結合のいかなるリポーター・オリゴヌクレオチドをも、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体などの検出プローブを加える前に基質から洗い流される。
【０１０８】
本発明の一態様では、基質上のオリゴヌクレオチドと結合したリポーター・オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが結合した第１の種類のナノ粒子と接触する。オリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの配列の第２の部分と相補的な配列を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとリポーター・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、接触が起こる。このように、第１の種類のナノ粒子は基質と結合する。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体が基質に結合した後に、未結合のいかなるナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体をも除去するために基質が洗浄される。
【０１０９】
第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有してもよく、または、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドが使用されるときは、各ナノ粒子は、該ナノ粒子に結合した異なるオリゴヌクレオチドのすべてを有してもよく、または、好ましくは異なるオリゴヌクレオチドは異なるナノ粒子に結合する。あるいは、各第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくともその１つは、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドのいくつかとハイブリダイズする複数の異なる配列を有してもよい。
【０１１０】
任意で、基質と結合した第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体は、オリゴヌクレオチドが結合した第２の種類のナノ粒子と接触する。これらのオリゴヌクレオチドは、第１の種類のナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと第２の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、接触が起こる。ナノ粒子が結合した後に、好ましくは未結合のいかなるナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を除去するために、基質が洗浄される。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化がもたらされる。複数のハイブリダイゼーションが検出可能な変化の増幅をもたらす点を除いて、この検出可能な変化は上述したものと同じである。特に、各第１の種類のナノ粒子は、該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチド（同じか異なる配列を有する）を有するので、各第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体は複数の第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体とハイブリダイズすることが可能である。また、第１の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体は、検出されるリポーター・オリゴヌクレオチドの複数の部分とハイブリダイズすることもできる。複数のハイブリダイゼーションによってもたらされる増幅は、初めて変化を検出可能にすることができ、または、検出可能な変化の程度を大きくすることもできる。この増幅はアッセイの感度を高くし、少量のリポーター・オリゴヌクレオチドの検出を可能にする。
【０１１２】
必要に応じて、第１および第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体の連続添加によって、さらなるナノ粒子層を確立することが可能である。このように、標的核酸分子当たりの固定ナノ粒子の数は、対応するシグナル強度の増加に従って、さらに増加され得る。
【０１１３】
また、互いに直接ハイブリダイズするようになっている第１および第２の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体を使用する代わりに、結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子の結合に役立つオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子が使用され得る。
【０１１４】
基質が使用されるときは、複数の初期の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体またはオリゴヌクレオチドは、標的リポーター・オリゴヌクレオチドの複数の部分を検出するための配列で、または複数の異なるリポーター・オリゴヌクレオチドもしくは両方を検出するための配列で、基質に結合することが可能である。例えば、標的リポーター・オリゴヌクレオチドのいくつかと結合するようになっている異なる種類のオリゴヌクレオチドを各点が含む点の列を、基質は備えてもよい。１つまたは複数のリポーター・オリゴヌクレオチドを含む試料が各点に加えられ、アッセイの残りは適当なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を使用して上述の方法の一つで実施される。
【０１１５】
他の態様では、直接検出法と同様にＢＰＣＲによる分析物検出方法は、ガラス、金、シリコン、ニッケル、プラスチックなどの基質上での分析物検出を含む方法での使用に応用され得る。これらの方法は、他の生物学的および化学的認識事象、例えばＤＮＡ−タンパク質結合事象、生理学的タンパク質−タンパク質結合または二量体化、および上記他の生体分子相互作用を検出するためにも応用され得る。
【０１１６】
この態様の一実施形態では、前記方法は各標的分析物のための１種類または数種類の捕獲プローブを基質に結合し、この基質を試験液と接触させ、任意で基質から試験液を洗い流し、その後この基質を各標的分析物のための１種類または数種類の検出プローブと接触させ、未結合のいかなる検出プローブを除去し、観察可能なシグナルを検出することを備え、観察可能なシグナルの検出は試験液中の標的分析物の存在を示す。
【０１１７】
本発明のこの態様では、観察可能なシグナルは、本願で記載のいかなる方法でも検出され得る。例えば、バーコードＤＮＡの直接検出、ＢＰＣＲ増幅バーコードＤＮＡの検出、（例えば、目視検査、蛍光法、比色法、電気化学、電子、デンシトメトリー、放射能などによる）１種類または数種類の検出プローブの集合の検出、または、バーコードＤＮＡの少なくとも一部と相補的な配列および検出可能なシグナル部分（例えば蛍光標識）を備えるリポーターヌクレオチドを用いることによる。
【０１１８】
基質が使用されるときは、銀染色または金染色などの染色法によって検出可能な変化をもたらすか、またはさらに強化することが可能である。銀染色は、銀の還元を触媒するいかなる種類のナノ粒子で使用され得る。好ましいのは、貴金属（例えば金および銀）からなるナノ粒子である。バッセルら（Ｂａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２６、８６３〜８７６頁（１９９４）；ブラウン−ハウランドら（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３、９２８〜９３１頁（１９９２）を参照。核酸の検出のために使用されているナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合は、還元を触媒するために銀イオンを核酸と化合させることが可能である。ブラウンら（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、７７５頁（１９９８）を参照。また、核酸上のリン酸基と化学反応することが可能な銀染色も公知である。
【０１１９】
銀染色は、上述のものを含む基質上で実施されるいかなるアッセイにおいても、検出可能な変化をもたらすために、または強化するために使用され得る。特に、銀染色は、単一の種類のナノ粒子を使用しているアッセイの感度を大きく高め、ナノ粒子層の使用がしばしば不要になることがわかった。
【０１２０】
基質上で実施されるリポーター・オリゴヌクレオチドを検出するためのアッセイにおいて、検出可能な変化は、光学式スキャナで観察され得る。適当なスキャナとしては、文書をコンピュータにスキャンするために使用され、反射モードで作動できるもの（例えばフラットベッド・スキャナ）、この機能を実施することができる他の装置、または同じ種類の光学を利用するもの、いかなる種類のグレースケール感受性測定器具、および本発明に従い基質をスキャンするように変更された標準のスキャナ（例えば、基質のためのホルダーを含むように変更されたフラットベッド・スキャナ）（現在まで、透過モードで作動するスキャナを使用することが可能であるとはわかっていない）などが挙げられる。スキャナの分解能は、基質上の反応域がスキャナの単一の画素より大きくなるように十分でなければならない。スキャナはいかなる基質でも使用され得るが、アッセイによってもたらされる検出可能な変化は基質に対して観察されるものとする（例えば、銀染色によって生じるグレースポットは白地に対して観察され得るが、灰色のバックグラウンドに対して観察され得ない）。スキャナは、白黒のスキャナ、または好ましくはカラースキャナでもよい。最も好ましくは、スキャナは文書をコンピュータにスキャンするために使用される種類の標準のカラースキャナである。そのようなスキャナは安価であり、市販品が容易に入手される。例えば、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ Ａｓｔｒａ １２００（３００×３００ｄｐｉ）またはＭｉｃｒｏｔｅｃ １６００（１６００×１６００ｄｐｉ）が使用され得る。スキャナは、基質をスキャンして得た画像を処理するためのソフトウェアをロードしたコンピュータと接続される。ソフトウェアは、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．２およびＣｏｒｅｌ Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ ８．０などの市販品を容易に入手できる標準のソフトウェアでもよい。グレースケール測定値を計算するためにソフトウェアを使用することは、アッセイの結果を定量化するための手段を提供する。ソフトウェアは、着色点の色数を提供し、また、調査して核酸の存在の定性的測定、核酸の量または双方を提供することが可能なスキャン画像（例えばプリントアウト）を生成することも可能である。コンピュータは、市販品を容易に入手できる標準のパーソナルコンピュータでもよい。このように、標準のソフトウェアをロードした標準のコンピュータと接続しれた標準のスキャナの使用は、アッセイが基質上で実施されたときに核酸を検出して定量するのに便利で、簡単かつ安価な手段を提供することが可能である。スキャンは、さらなる参照または使用のために結果の記録を維持するために、コンピュータで保存され得る。当然ながら、より洗練された機器およびソフトウェアが必要に応じて使用され得る。
【０１２１】
本発明の他の実施形態では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
基質と結合しており、特異的標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を含む１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程と；
プローブが、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、該特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料、捕獲プローブおよび検出プローブを接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードの有無の検出は試料中の標的分析物の有無を示している該基質上の任意の集合複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える。
【０１２２】
本発明のこの実施形態の一態様では、検出プローブは、（ｉ）特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、（ｉｉ）ナノ粒子と結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である既定配列を有するＤＮＡバーコードを備え、検出プローブと結合したＤＮＡバーコードは、特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たしている。
【０１２３】
この実施形態の他の態様では、前記方法は前記検出工程の前にさらに、
前記集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該複合体を置く工程と；
該検出の前に該ＤＮＡバーコードを任意で増幅させる工程とを備える。
【０１２４】
本発明の他の態様では、捕獲プローブは、磁性粒子、例えば磁性酸化鉄を有するポリスチレンＭＭＰのような磁性基質に結合している。これは、溶液からの複合体の容易な除去を可能にする。その後、上述の基質ベースの検出技術を使用して直接、または増幅の後に検出技術を実行することによって間接的に、ＤＮＡバーコードが検出され得る。下記の実施例において、オリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子（ＮＰ）、磁性微小粒子（ＭＭＰ）、および続く１つまたは複数の標的核酸配列の増幅体としての機能を果たすバーコードＤＮＡの検出に基づく方法が記載されている。好ましくは、オリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子は、金のナノ粒子からなる。標的ＤＮＡシグナルの有無の（バーコードＤＮＡの検出を通した）検出は、好ましくは上記で示したように基質に基づく検出法を使用して実施される。
【０１２５】
一態様では、本発明は、ＰＣＲ方法に頼らず、オリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子（ＮＰ）、磁性微小粒子（ＭＭＰ）およびバーコードＤＮＡの形での増幅された標的核酸の検出に基づく標的核酸の増幅方法を提供する。この態様の一実施形態では、オリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子（ＮＰ）は、金のナノ粒子からなる。この態様の他の実施形態において、増幅させたＤＮＡシグナル（標的配列に特異的なバーコードＤＮＡ）の検出は、チップに基づく検出法を使用して実施される。この態様の他の実施形態において、バーコードＤＮＡは関心のある各標的核酸分子に特異的な配列を備え、試験溶液中の複数の標的核酸配列の特異的な検出を可能にする。
【０１２６】
本発明の他の態様において、バーコードＤＮＡは試験試料中の関心のある各特定の標的分析物に特異的な配列を備え、単一のアッセイ／試験溶液中の複数の特異的標的の検出を可能にする。実施例で示すように、約５００ゼプトモル（ｚＭ）のように低い検出限界が達成される（「ゼプト」の桁は１０^−２１である；例えば２０μＬの試料全体で１０コピー）。そのような検出限界は、標的核酸分子のＰＣＲによらない検出の感度のかなりの増加を表す。
【０１２７】
この態様において、２種類のプローブが標的ＤＮＡの検出に対して提供される（ＤＮＡ−ＢＣＡ）。ある実施形態において、プローブの第１の種類は磁性酸化鉄コアを有するポリスチレンＭＭＰであり、標的配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドで官能基化されている。ＭＭＰのオリゴヌクレオチドの相補性部分は、特定のアッセイ条件（例えば緩衝系、標的核酸配列、温度、その他）によって様々な長さを有することが可能である。
【０１２８】
他の実施形態では、第２のプローブは２種類のオリゴヌクレオチドで変更されたナノ粒子を備え、このオリゴヌクレオチドの１種類はＭＭＰによって認識される標的上の領域と異なる標的配列の少なくとも一部と相補的である配列を備え；他のオリゴヌクレオチドは、特定の標的配列の特有の認識票となるバーコードＤＮＡの配列の少なくとも一部と相補的な配列を備える。特定の実施形態において、ナノ粒子は金のナノ粒子である。他の実施形態において、金のナノ粒子は、１３、２０または３０ｎｍの金のナノ粒子からなる。
【０１２９】
バーコードＤＮＡとナノ粒子表面の標的結合配列との比率は、個々のアッセイに合わせて変更され得る。バーコードＤＮＡのＰＣＲによらない検出を可能にするために、バーコードＤＮＡと標的結合ＤＮＡとの比率は１：１より大きくなければならず、好ましくは少なくとも約２５：１、より好ましくは少なくとも約５０：１、最も好ましくは少なくとも約１００：１である。ＤＮＡ−ＢＣＡ方法では標的配列ではなくバーコードＤＮＡが特定および検出されるので、より高い比率はＰＣＲによらない標的増幅を可能にする。例えば、金の１３ｎｍのナノ粒子は、粒子当たり少なくとも１００のチオ化されたＤＮＡ鎖を収納することが可能である^７３。２０および３０ｎｍのナノ粒子については、各粒子につき相当するオリゴヌクレオチドのローディングおよび球面形を想定すると、粒子はそれぞれ約２４０および５３０の固定化オリゴヌクレオチドを収納することが可能である。
【０１３０】
本実施形態の他の態様では、ナノ粒子に結合した特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体である。
本実施形態の他の態様では、捕獲プローブに結合した特異的結合相補体はモノクローナル抗体である。
【０１３１】
本実施形態の他の態様では、抗体は抗ＰＳＡ抗体である。
本実施形態の他の態様では、前記方法は前記洗浄工程の前にさらに、
前記磁性粒子に結合した集合複合体を磁場に置くことによって洗浄の前に該集合複合体を単離する工程を含む。
【０１３２】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、前記単離された集合複合体を脱ハイブリダイズして前記ＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程を含む。
【０１３３】
この実施形態の他の態様では、前記放出されたＤＮＡバーコードはＰＣＲなどの任意の適切な手法で増幅される。
本実施形態の他の態様では、前記標的分析物は少なくとも２つの部分を有する核酸である。
【０１３４】
本実施形態の他の態様では、前記標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、前記検出プローブは前記ＤＮＡバーコードに相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子を備え、該検出プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の第１の部分に相補的である配列を有する第１の標的認識オリゴヌクレオチドを備え、前記捕獲プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の少なくとも第２の部分に相補的である配列を有する第２の標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
【０１３５】
本実施形態の他の態様では、前記標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、前記検出プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、前記ＤＮＡバーコードは該検出プローブと結合した該オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに相補的である配列を有し、前記特異的結合相補体は、少なくとも第１および第２の部分の配列を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備え、該第１の部分は該標的核酸の第１の部分に相補的であり、該第２の部分は、該ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかに相補的であり、前記基質の特異的結合相補体は、該標的核酸の第２の部分に相補的である少なくとも一部を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備える。
【０１３６】
この実施形態の他の態様では、上述のように、検出プローブはデンドリマーナノ粒子を備える。
本発明の他の実施形態では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）磁性粒子；および（ｉｉ）該磁性粒子に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程であって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーは特異的標的分析物の第１の結合部位と結合する工程と；
各標的分析物のために１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、検出プローブは、（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該標的分析物の第２の結合部位と結合する、該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である既定の配列を有し、且つ特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たす少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備えている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして該磁性粒子と結合した集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を捕獲プローブおよび検出プローブと接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも該磁性粒子から洗い流す工程と；
該ＤＮＡバーコードの検出は標的分析物の存在を示している該複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える。
【０１３７】
この実施形態の一態様では、前記方法は前記検出工程の前にさらに、
磁場を加えることによって前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体から脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
放出されたＤＮＡバーコードを単離する工程とを備える。
【０１３８】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、放出されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程を備える。
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
前記ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、且つオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
少なくとも一部がＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を準備する工程と；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と該基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と該ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチドおよび該ナノ粒子を接触させる工程とを備える。
【０１３９】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードは、検出前にＰＣＲによって増幅される。
この実施形態の他の態様では、前記方法は、前記集合複合体を分析する前に該集合複合体を単離する工程をさらに備える。
【０１４０】
この実施形態の他の態様では、前記集合複合体は、磁場を該集合複合体に加えることによって単離される。
この実施形態の他の態様では、前記ナノ粒子は、金ナノ粒子または半導体ナノ粒子などの金属ナノ粒子である。
【０１４１】
この実施形態の他の態様では、前記特異的結合対は、抗体と抗原；受容体とリガンド；酵素と基質；薬剤と標的分子；アプタマーとアプタマー標的；少なくとも部分的に相補的な２つのオリゴヌクレオチド鎖である。
【０１４２】
この実施形態の他の態様では、前記ＤＮＡバーコードは、ビオチン化、放射性標識、または蛍光標識されてもよい。
いずれの実施形態においても、少なくとも２種類の粒子複合プローブが準備され、第１の種類のプローブは標的分析物上の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する。標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合プローブが準備される。
【０１４３】
特異的結合相補体および標的分析物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む特異的結合対のメンバーである。
【０１４４】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、ならびに天然および合成の核酸、ならびにアプタマーを含む。
【０１４５】
標的分析物は核酸であり、特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである。あるいは、標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である。あるいは、標的分析物はゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、特異的結合相補体は該ゲノム配列の少なくとも一部と相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである。ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスのＤＮＡでもよい。
【０１４６】
特異的結合相補体および標的分析物は、抗体−リガンド対のメンバーである。
第１の結合部位に加えて、標的分析物は第２の結合部位を含むように変更されている。
これらの方法は、集合複合体を除去する濾過工程をさらに備えてもよく、濾過は、集合複合体を分析する前に行われる。この濾過工程は、ＤＮＡバーコードを含まない試料構成要素を除去する膜を含む。
【０１４７】
本発明の他の実施形態では、試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法が提供され、該方法は、
プローブに結合したオリゴヌクレオチド、特異的標的分析物の１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類または数種類の粒子複合プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、該ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
標的分析物の存在下で該標的分析物および該粒子複合体プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を該粒子複合プローブと接触させる工程と；
集合複合体形成が起こったかどうかを観察する工程とを備える。
【０１４８】
本発明のこの態様では、観察可能なシグナルは、本願で記載のいかなる方法でも検出され得る。例えば、バーコードＤＮＡの直接検出、ＢＰＣＲ増幅バーコードＤＮＡの検出、（例えば、目視検査、蛍光法、比色法、電気化学、電子、デンシトメトリー、放射能などによる）１種類または数種類の検出プローブの集合の検出、または、バーコードＤＮＡの少なくとも一部と相補的な配列および検出可能なシグナル部分（例えば蛍光標識）を備えるリポーターヌクレオチドを用いることによる。
【０１４９】
十分な複合体が存在する場合、複合体は、バックグラウンド基質の有無にかかわらず視覚的に観察され得る。検出可能な変化の観察を可能にする任意の基質が使用され得る。適当な基質としては、透明な固体表面（例えばガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）、不透明な固体表面（例えば、ＴＬＣシリカプレート、濾紙、ガラス繊維フィルタ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などの白い固体表面）、ならびに伝導性固体表面（例えばインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ））などがある。基質は任意の形状または厚みでよいが、通常は扁平で薄い。好ましいのは、ガラス（例えばガラススライド）またはプラスチック（例えばマイクロタイタープレートウェル）などの透明基質である。
【０１５０】
本発明の一態様では、試料中の抗体などの標的分析物の存在を検出するための方法が提供される。下記の実施例で示される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）などの抗体は、前もって適当なハプテン（ＩｇＧ１の場合はビオチンおよびＩｇＥの場合はジニトロフェニル（ＤＮＰ）；図１Ａ）で修飾されたオリゴヌクレオチド鎖でハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド修飾プローブで検出され得る^{１３、１４}。下記の実施例で示される概念実証アッセイにおけるＤＮＡ配列は、ＩｇＧ１およびＩｇＥによるプローブ反応から形成された２つの異なる集合体が異なる温度で溶けるような方法で設計された（図１Ｂ）。ＩｇＧ１のためのプローブは、ＩｇＥに対するものより長い配列および大きなＧ，Ｃ塩基含量を有する。したがって、前者の配列は後者のものより高い温度で融解する。これらの配列の変化は、どの標的がそれらと化学反応してナノ粒子集合体を形成したかを特定するコードとして使用することが可能な、異なった融解サインを有するプローブを調製することを可能にする。３つの異なる系が研究されている：（１）１つの標的抗体が存在する２つのプローブ（ＩｇＧ１またはＩｇＥ）；（２）２つの異なる標的抗体が存在する２つのプローブ、および（３）標的抗体が存在しない対照。
【０１５１】
本発明のこの態様では、試料中の抗体などの標的分析物の存在を検出するための、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子プローブと、標的分析物を含んでいるかもしれない試料とを接触させることを含む方法が提供される。前記ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、ハイブリダイゼーションの結果、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と結合する。リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分は、ハイブリダイゼーションの結果、分析物に対する特異的結合相補体（例えば抗原）が結合したオリゴヌクレオチドに結合している。分析物およびナノ粒子プローブの間の特異的結合相互作用を可能にするのに有効な条件下で、接触が起こる。標的分析物の存在下で、ナノ粒子集合体は生成される。これらの集合体は、任意の適切な手段で検出され得る。
【０１５２】
本発明の他の態様では、粒子複合プローブ、好ましくはナノ粒子複合プローブが使用される。これらの粒子複合体は実際のアッセイを行う前に、またはアッセイを行っている間にｉｎ ｓｉｔｕで生成されてもよい。これらの複合体は、オリゴヌクレオチドが結合した粒子、好ましくはナノ粒子、このナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと結合したリポーター・オリゴヌクレオチド、および標的分析物の特異的結合相補体を備える。特異的結合相補体は、ナノ粒子に直接または間接的に結合してもよい。例えば、特異的結合相補体はリンカーまたはオリゴヌクレオチドに結合することができ、標識化リンカーまたはオリゴヌクレオチドは、次にナノ粒子に結合される。一実施形態では、ＤＮＡバーコードまたはリポーター・オリゴヌクレオチドは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子と、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイゼーションを通して結合する。ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドはリポーター・オリゴヌクレオチドの１つの部分に相補的である配列を有し、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドは少なくとも２つの部分を有し、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子と、特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイゼーションを通して結合する。標的分析物を含む試料で使用された場合、ナノ粒子複合体が標的分析物と結合して集合が起こる。上述のように、複数の標的が存在する特定の標的分析物を特定するために、集合体は、単離されるとともに、更に融解分析され得る。あるいは、集合体は、脱ハイブリダイズしてリポーター・オリゴヌクレオチドを放出することが可能である。これらのリポーター・オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバーコードは、任意で増幅され、次に、任意の適切な検出プローブを使用して任意の適切なＤＮＡ検出システムで検出され得る。
【０１５３】
本発明の実行の際に、ナノ粒子複合プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子と、標的分析物に対する特異的結合相補体で修飾されたオリゴヌクレオチドおよびリポーター・オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズすることによって調製される。ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、リポーター・オリゴヌクレオチドの第１の部分と相補的な配列を有する。特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドは、リポーター・オリゴヌクレオチドの第２の部分と相補的な配列を有する。リポーター・オリゴヌクレオチドは、構成要素間のハイブリダイゼーションを十分可能にする条件下で、ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつか、および特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ナノ粒子複合体プローブを形成する。ナノ粒子複合体溶液の調製の際には、構成要素の十分なハイブリダイゼーションを可能にする任意の適切な溶媒媒体およびハイブリダイゼーション条件が使用されてもよい。好ましくは、構成要素は０．３ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなるリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中において、室温で約２〜３時間でハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション混合液中のナノ粒子−オリゴヌクレオチド複合体の濃度は、約２ｎＭから約５０ｎＭの範囲、好ましくは約１３ｎＭである。ハプテンで修飾されたオリゴヌクレオチドの濃度は通常、約５０から約９００の範囲、好ましくは約３００ｎＭである。リポーター・オリゴヌクレオチドの濃度は、通常、約５０から約９００の範囲、好ましくは約３００ｎＭである。未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびリポーター・オリゴヌクレオチドは、任意で、しかし好ましくは、任意の適切な手段、好ましくはハイブリダイゼーション混合液の遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）と、その後の上清のデカンティングによって除去されてもよい。調製された複合体は、０．３ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）の０．０１％のアジ化合物溶液中で、４〜６℃で保存される。
【０１５４】
試料中の抗体などの標的分析物の存在を検出するための一般的なアッセイは、以下のとおりである。オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチドおよび標的分析物に対する特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチドを備えるナノ粒子複合体プローブを含んでいる溶液を、標的タンパク質を含んでいると思われる試料水溶液と混合する。一般的に、試料水溶液中の総タンパク量は約５から約１００の範囲、通常は約４３μｇ／ｍｌである。一般的に、反応混合液中のナノ粒子の濃度は約２ｎＭから約２０ｎＭの範囲、通常は約１３ｎＭ以下である。得られた混合物の総容積は通常、約１００μＬから約１０００μＬの範囲、好ましくは約４００μＬである。標的分析物を含んでいると思われる試料水溶液を調製する際には、任意の適切な溶媒が使用されてもよいが、好ましくは０．３ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）からなるＰＢＳが使用される。
【０１５５】
得られたアッセイ混合物は、次に約３５から約４０℃の範囲の温度、好ましくは３７℃で約３０分から約６０分、好ましくは約５０分間、特異的結合対、例えばタンパク質−ハプテンの複合化を促進するのに十分な時間インキュベートされる。標的タンパク質が存在する場合は粒子凝集が起こり、沈殿とともに金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトおよび赤から紫への変色がもたらされる。ハイブリダイゼーション生成物は遠心分離（例えば３０００ｒｐｍで２分間）され、未反応要素を含んでいる上清は分析の前に別の容器に静かに移される。
【０１５６】
必要に応じて、ナノ粒子複合体プローブは、オリゴヌクレオチドが結合したすべてのナノ粒子、リポーター・オリゴヌクレオチドおよびハプテン修飾オリゴヌクレオチドを、標的分析物を含むと思われる試料と混合することによって、アッセイ混合液内においてｉｎ ｓｉｔｕで調製されてもよい。すべての構成要素、特に相補ＤＮＡ鎖間の完全なハイブリダイゼーションを確実にすべくハイブリダイゼーションを促進するために、アッセイ混合液は、−１５℃で２０分間インキュベートされて（Ｂｏｅｋｅｌ Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）、４℃で２４時間保存されてもよい。しかし、本発明の実行の際に、ナノ粒子複合体プローブ内のＤＮＡバーコードの量を増加するために、アッセイ反応を行う前にナノ粒子複合体プローブを調製することが好ましい。
【０１５７】
どのタンパク質が存在するかを決定するために、２６０ｎｍでの消滅を温度関数として監視する集合体の融解分析が溶液中で実施されてもよい。例えば、１つまたは２つの既知の標的分析物：ＩｇＧ１およびＩｇＥを含む試料の分析を記載している実施例３の図２を参照。実施例３で議論されているように、ＩｇＧ１が前記のプロトコルを通してプローブで処理される場合、溶液はピンクから青色に変色してナノ粒子集合体の形成を示している。標的は存在しないがバックグラウンドタンパク質が存在する対照実験において、識別できる沈殿は見られない。溶液の融解分析は、５５℃の融点（Ｔｍ）での急激な転移を示す。これは、ＩｇＧ１標的で予想される転移である（図２Ａ（破線））。ＩｇＥを新しいプローブ溶液に加えた場合も同じ変色が観察されるが、融解分析はＴｍが３６℃の曲線、即ち、この標的で予想される転移を示す（図２Ａ（実線））。注目に値するのは、両方のタンパク質標的がプローブ溶液に加えられた場合、溶液は暗紫色に変色し、融解分析は２つの異なった相互作用を示す。この曲線の一次導関数は、３６および５５℃を中心に２つのピークを示す（図２Ｂ）。このことは、２つのタンパク質標的を識別するために、オリゴヌクレオチドバーコードに由来する２つの異なった集合形態および融解特性を使用することが可能であることを示す。
【０１５８】
本発明の他の態様では、前記系の感度を高めるとともに、１つの溶液で調べられ得る標的の数を増加するために、上記の集合方法の戦略の変型が使用され得る。例えば、実施例４の図３を参照。この方策で、タンパク質標的は、特異的な標的分析物に割り当てられたＤＮＡバイオバーコードまたは特有のリポーター・オリゴヌクレオチドを通して、間接的に検出され得る。通常、標的分析物のためのリポーター・オリゴヌクレオチドの適当な長さ、ＧＣ含量、配列および選択は、アッセイの前に決定される。例えば、図１Ａで示すように、１２量体オリゴヌクレオチドは、４^１２の異なる配列を有し、その多くは関心のある多価タンパク質のためのバーコードを調製するために使用され得る。アッセイのこの変型では、形成される集合体の融解特性は溶液中では測定されないが、集合体内のリポーター・オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡバイオバーコードが、遠心分離（例えば３０００ｒｐｍで２分間）を通して反応していないプローブおよび標的分子から分離される。次に、集合体は、リポーター・オリゴヌクレオチドまたはバイオバーコードを遊離させるために、任意の適切な手段、例えば溶液に水を加えることにより変性される。リポーター・オリゴヌクレオチドが少量存在する場合、当技術分野で公知の方法によって増幅されてもい。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）、およびビー デー ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびエス ジェー ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １、（アイアールエルプレス社（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９５）を参照。好ましいのはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅である。粒子およびタンパク質は、任意の適切な手段、例えば遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００、３５００ｒｐｍで２５分間）によってリポーター・オリゴヌクレオチドから切り離され得る。一旦リポーター・オリゴヌクレオチドが単離されると、それはオリゴヌクレオチドアレイ上で捕獲されることができるとともに、多くの適当なＤＮＡ検出アッセイの１つを使用して特定され得る（図３）。本願で記載されているＩｇＧ１およびＩｇＥを含む実施例については、リポーター・オリゴヌクレオチドは、関心のあるバーコードの半分に相補的であるオリゴヌクレオチドで官能基化された顕微鏡スライド上で捕獲される（２５０μｍ直径のスポット）（図１のＡ３およびＢ３）。バーコードがオリゴヌクレオチドアレイによって捕獲される場合、そのバーコードの残りの部分に相補的であるＤＮＡ修飾粒子は、このアレイとハイブリダイズすることが可能である（実施例を参照）。標準のスキャノメトリー法^［１１］（写真現像液による処理を含む）で現像される場合、フラットベッド・スキャナは、結果の定量化に使用され得る（図４）^１１。ＩｇＧ１が存在する場合、ＩｇＧ１のために設計されたスポットだけが測定可能なシグナルを示す。同様に、ＩｇＥが唯一存在するタンパク質である場合、ＩｇＥのために設計されたスポットだけがシグナルを示す。最後に、両方のタンパク質が存在する場合、両方のスポットは強いシグナルを示す。
【０１５９】
この実施形態の一態様では、各種の粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する。
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を分析して異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を決定する工程とを備える。
【０１６０】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とを備える。
【０１６１】
この実施形態の他の態様では、前記方法はさらに、
前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
該単離されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数の増幅されたＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とを備える。
【０１６２】
この実施形態の他の態様において、標的は３つ以上の結合部位を有し、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが準備され、第１の種類のプローブは標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する。プローブが標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合プローブが準備されてもよい。
【０１６３】
この実施形態の他の態様では、特異的結合相補体および標的分析物は、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む特異的結合対のメンバーである。
【０１６４】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、天然および合成の核酸、ならびにアプタマーを含む。
【０１６５】
一態様では、標的分析物は核酸であり、特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドでもよい。あるいは、標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、特異的結合相補体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体でもよい。
【０１６６】
この実施形態の他の態様では、標的分析物はゲノムＤＮＡ試料からの配列でもよく、特異的結合相補体はゲノム配列の少なくとも一部と相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１６７】
この実施形態の他の態様では、ゲノムＤＮＡは、真核生物、細菌、真菌またはウイルスのＤＮＡでもよい。
他の態様では、特異的結合相補体および標的分析物は、抗体−リガンド対のメンバーである。
【０１６８】
この実施形態の他の態様では、１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程は、
ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
オリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を準備する工程であって、ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有することと；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチドおよび該ナノ粒子を接触させる工程と；
検出可能な変化を観察する工程とを備える。
【０１６９】
この実施形態の他の態様では、基質は、１つまたは複数の異なる種類のＤＮＡバーコードの検出を可能にする配列で基質に結合した複数種のオリゴヌクレオチドを含む。
この実施形態の他の態様では、検出可能な変化は基質上の暗領域の形成である。
【０１７０】
この実施形態の他の態様では、検出可能な変化は光学スキャナで観察される。
この実施形態の他の態様では、検出可能な変化をもたらすために、基質が銀染色と接触される。
【０１７１】
この実施形態の他の態様では、ＤＮＡバーコードが、基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードが該基質と接触し、その後、該基質と結合したＤＮＡバーコードが、ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが該基質上のＤＮＡバーコードの配列の一部とハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触する。
【０１７２】
この実施形態の他の態様では、ＤＮＡバーコードが、ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、ＤＮＡバーコードが、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触し、その後、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードが、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該基質と接触する。
【０１７３】
この実施形態の他の態様では、ＤＮＡバーコードは、接触工程前に増幅される。
この実施形態の他の態様において、少なくとも２種類の粒子複合体プローブが準備され、第１の種類のプローブは標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該標的分析物の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する。
【０１７４】
上述のように、核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、天然および合成の核酸、ならびにアプタマーを含む。
【０１７５】
本発明の他の実施形態では、上述の粒子複合プローブを含むキットが提供される。
本実施形態の他の態様では、試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するためのキットが提供される。このキットは：
各標的分析物のための少なくとも１種類の検出プローブであって、（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した特異的結合対のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）該複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有するＤＮＡバーコードを備え、各標的分析物のための少なくとも１種類の検出プローブを含む。
【０１７６】
この実施形態の他の態様では、前記キットは、
（ｉ）基質；（ｉｉ）該基質に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える少なくとも１種類の捕獲プローブであって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーが標的分析物の第１の結合部位と結合する捕獲プローブと；
（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、標的分析物の第２の結合部位と結合する該第２の特異的結合対の第１メンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類の検出プローブとを備える。
【０１７７】
キットでは任意の適切な基質が使用され得る。好ましくは、前記基質は、磁性微小粒子のような磁性体である。
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
（ｉ）磁性粒子；（ｉｉ）該磁性粒子に結合した第１の特異的結合対の第１の構成メンバーを備える少なくとも１種類の捕獲プローブであって、該第１の特異的結合対の第１の構成メンバーが標的分析物の第１の結合部位と結合する捕獲プローブと；
（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１の構成メンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類の検出プローブとを備える。
【０１７８】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
オリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合した複数のオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブであって、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつか、および該特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする粒子複合プローブと、検出可能な変化を観察するための任意の基質を含む少なくとも１つの容器を備える。
【０１７９】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備えるある種の粒子複合プローブを含む少なくとも１つまたは複数の容器を備え、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し、及び（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有し、該キットは検出可能な変化を観察するための基質を任意で含む。
【０１８０】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
少なくとも１組の容器および検出可能な変化を観察するための任意の基質を含み、
該１組の内の第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子および少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを備える粒子プローブを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
該１組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有する。
【０１８１】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
少なくとも２組以上の容器を含み、
各組の内の第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを有する粒子複合プローブを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、少なくとも２つの部分を有するＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
各組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有し、
該粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有し、該キットは検出可能な変化を観察するための基質を任意で含む。
【０１８２】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
第１の容器および少なくとも２組以上の容器を含み、
該第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子を有する粒子複合プローブを含み；
各組の内の第１の容器は、少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
各組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有し、
各組の容器の内の第１の容器に存在するＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての機能を果たし、かつ他の組の容器のＤＮＡバーコードと異なる配列を有し、該キットは検出可能な変化を観察するための基質を任意で含む。
【０１８３】
この実施形態の他の態様では、前記キットは：
特異的標的分析物の存在の識別子としての機能を果たすオリゴヌクレオチド配列を備える。
【０１８４】
上記のキットは、アッセイを組み立てるための、またアッセイを行うための説明書を含むことが可能である。
用語「備える」、「含む」および「有する」は互換性があることに注意されたい。以下の実施例は例示目的のためだけのものであり、いかなる方法であれ本発明の精神および範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：オリゴヌクレオチドが修飾された金ナノ粒子の調製
Ａ．金ナノ粒子の調製
オリゴヌクレオチドで修飾された１３ｎｍのＡｕ粒子を文献の方法（〜１１０オリゴヌクレオチド／粒子）^{ｌ８〜２０}により調製した。金コロイド（直径１３ｎｍ）を、フレンズ（Ｆｒｅｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、２０ページ（１９７３年）およびグラバー（Ｇｒａｂａｒ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６７巻、７３５ページ（１９９５年）に記載のようにクエン酸塩でＨＡｕＣｌ_４を還元することにより調製した。概説すると、全ガラス容器を王水（ＨＣｌ ３部、ＨＮＯ_３ １部）中で洗浄し、ナノピュアＨ_２Ｏですすぎ、次いでオーブンで乾燥して使用する。ＨＡｕＣｌ_４およびクエン酸ナトリウムは、アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ_４の水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を攪拌しながら還流させ、次いで、５０ｍＬの３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム溶液を素早く加えたところ、淡黄色から濃赤色に溶液の色が変化した。変色後、溶液をさらに１５分間還流させて室温に冷却し、続けてマイクロンセパレーションズインコーポレイティッド社製（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）の０．４５ミクロンナイロンフィルタで濾過した。Ａｕコロイドを、ヒューレットパッカード社製（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用いたＵＶ−可視分光法、およびヒタチ社製（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により特徴付けした。典型的な直径１３ｎｍの金粒子の溶液は、５１８〜５２０ｎｍに中心がある特徴的な表面プラズモンバンドを示した。直径１３ｎｍの金粒子は、標的および１０〜７２ヌクレオチドの範囲のプローブオリゴヌクレオチド配列を用いて凝集させた場合、目に見える色の変化を生じる。
【０１８６】
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、フォスフォアミダイト化学を利用して、シングルカラムモードでミリジェン社製（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）ＥｘｐｅｄｉｔｅＤＮＡ合成機を用い、１マイクロモルスケールで合成した。エクシュタイン，エフ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ［ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９１年］。すべての溶液は、ミリジェン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）（ＤＮＡ合成グレード）から購入した。平均カップリング効率は９８から９９．８％まで様々であり、最終的なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基をオリゴヌクレオチドから切断せず、精製に役立てた。
【０１８７】
３’−チオール−オリゴヌクレオチドでは、チオール修飾因子Ｃ３ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ担体をグレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入し、自動合成機で用いた。最終的なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去せず、精製に役立てた。合成後、担持したオリゴヌクレオチドを１６時間、５５℃で１ｍＬの濃水酸化アンモニウムに入れ、オリゴヌクレオチドを固体担体から切断させ、塩基から保護基を除いた。
【０１８８】
アンモニウムの蒸発後、オリゴヌクレオチドを、２５４ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルを観察しながら、ＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用い、０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および１％／分の勾配の９５％ＣＨ_３ＣＮ／５％ ０．０３Ｍ ＴＥＡＡを用いた流速１ｍＬ／分の分取用逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＤＭＴで保護・修飾された１２塩基オリゴマーの保持時間は３０分であった。続けて、精製したオリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬させることによりＤＭＴを切断し、次いで蒸発させた。オリゴヌクレオチドを５００μｌの水に再分散させ、溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチド（１０ＯＤのもの）を、５０℃で一晩１００μＬの０．０４Ｍ ＤＴＴ、０．１７Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）に再分散させ、３’ジスルフィドを切断した。この溶液のアリコート（＜１０ＯＤのもの）を、脱塩するＮＡＰ−５カラムを通して精製した。オリゴヌクレオチドの量を、２６０ｎｍでの吸収により精製した。２５４ｎｍでのＤＮＡのＵＶシグナルを観察しながら、Ｄｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ ＰＡ−１００カラム（２５０×４ｍｍ）を用い、１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）および２％／分の勾配の１０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌを用いた流速１ｍＬ／分のイオン交換ＨＰＬＣにより純度を評価した。１８．５、１８．９および２２分の保持時間（Ｔ_ｒ）の３つのピークが観察された。ジスルフィドに起因したＴ_ｒ＝２２．０分の１本の主ピークは、面積で７９％であった。１８．５および１８．９分の短い保持時間の２つのピークは、それぞれ面積で〜９％および１２％であったが、これらは酸化された不純物および残余のチオールオリゴヌクレオチドに起因していた。
【０１８９】
５’−アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドを、以下のプロトコルを用いて調製した。１）ＣＰＧが結合した脱トリチル化オリゴヌクレオチドを、標準的な手順を用いて自動ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）により合成した。２）ＣＰＧ−カートリッジを除去し、使い捨てのシリンジを端に取り付けた。３）乾燥アセトニトリル中に２０μモルの５−チオール−修飾因子Ｃ６−フォスフォアミダイト［グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）］を含む溶液２００μＬを２００μＬの標準「テトラゾールアクチベータ溶液」と混合し、シリンジの１本を介してオリゴヌクレオチド−ＣＰＧを含むカートリッジに導入した。４）溶液を、カートリッジを通して１０分間ゆっくりポンプで前後させ、次いで排出した後、乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した。５）中間体の亜リン酸エステルを７００μＬの０．０２Ｍヨウ素を含むＴＨＦ／ピリジン／水で酸化させ（３０秒）、次いでアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｉｒｉｌｅ）で洗浄した。次いで、トリチルオリゴヌクレオチド誘導体を、３’−アルキルチオールオリゴヌクレオチドで記載したように単離および精製した。次いで、トリチル保護基を、１５μＬ（１０ＯＤのものに対し）の５０ｍＭ ＡｇＮＯ_３溶液を乾燥オリゴヌクレオチド試料に２０分間加えて切断し、乳白色懸濁液を生じた。過剰の硝酸銀を、２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＤＴＴ溶液（保持時間５分）を加えて除去したところ、すぐに黄色沈殿物を形成し、これを遠心分離により除去した。次いで数アリコートのオリゴヌクレオチド溶液（＜１０ＯＤのもの）を脱塩ＮＡＰ−５カラムに移して精製した。得られた５’アルキルチオールオリゴヌクレオチドの最終的な量および純度を、３’アルキルチオールオリゴヌクレオチドで上述した技術を用いて評価した。２つの主ピークを、１９．８分（チオールのピーク、面積で１６％）および２３．５分（ジスルフィドのピーク、面積で８２％）の保持時間のイオン交換ＨＰＬＣで観察した。
【０１９０】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への結合
金コロイド（１７ｎＭ）の水溶液１ｍＬを、過剰（３．６８μＭ）のチオール−オリゴヌクレオチド（２２塩基長）の水溶液と混合し、この混合物を室温で１２〜２４時間放置した。その後、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に移し、４０時間放置した。この「熟成（ａｇｉｎｇ）」ステップは、チオールオリゴヌクレオチドによる表面被覆率を増加させ、また、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を外すように設計した。次に、この溶液を１４，０００ｒｐｍで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１４により約２５分間遠心分離して、７〜１０％の金コロイド（５２０ｎｍでの吸収により示される）に加えて大半のオリゴヌクレオチド（２６０ｎｍの吸収により示される）を含む非常に薄いピンク色の上澄み液、および凝集した暗色ゲル状の残渣が管の底に得られた。上澄み液を除き、残渣を約２００μＬの緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ）に再懸濁させ、遠心分離した。上澄み液を除去後、残渣を１．０ｍＬの緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ ＮａＮ_３）に溶かした。得られた赤色の主要な溶液は、室温で数カ月間放置した際、シリカ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにスポットした際（実施例４参照）、および１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡを含む溶液に加えた際に安定であった（すなわち、赤色のままで、凝集しなかった）。
【０１９１】
実施例２：ハプテン修飾オリゴヌクレオチドの調製
ハプテンで修飾されたオリゴヌクレオチドを、標準的固相ＤＮＡ合成手順を用いて、Ａ１としてビオチン−トリエチレングリコールフォスフォアミダイトを用い、Ｂ１として２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールフォスフォアミダイト［グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）］を用いて調製した^２１。
【０１９２】
ビオチン修飾オリゴヌクレオチドを、以下のプロトコルを用いて調製した。ＣＰＧが結合した脱トリチル化オリゴヌクレオチドを、標準的な手順^２１を用いて、自動ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）で合成した。次いで、ＣＰＧ−カートリッジを除去し、使い捨てのシリンジを端に取り付けた。次いで、乾燥アセトニトリル中に２０μモルのビオチン−トリエチレングリコールフォスフォアミダイトを含む溶液２００μＬを、２００μＬの標準「テトラゾールアクチベータ溶液」と混合し、シリンジの１本を介してオリゴヌクレオチド−ＣＰＧを含むカートリッジに導入した。次いで、溶液を、カートリッジを通して１０分間ゆっくりポンプで前後させ、次いで排出した後、乾燥アセトニトリル（２×１ｍＬ）で洗浄した。その後、中間体の亜リン酸エステルを７００μＬの０．０２Ｍヨウ素を含むＴＨＦ／ピリジン／水で酸化させ（３０秒）、次いでアセトニトリル／ピリジン（１：１、２×１ｍＬ）および乾燥アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｉｒｉｌｅ）で洗浄し、続けて窒素流でカラムを乾燥した。トリチル保護基を除去せず、これを精製に役立てた。担持されたオリゴヌクレオチドを１ｍＬの濃水酸化アンモニウムに５５℃で１６時間入れて、固体担体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基から保護基を除去した。アンモニアの蒸発後、オリゴヌクレオチドを、２５４ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルを観察しながら、ＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用い、０．０３Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および１％／分の勾配の９５％ＣＨ_３ＣＮ／５％ ０．０３Ｍ ＴＥＡＡを用いた流速１ｍＬ／分の分取用逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＤＭＴで保護されたオリゴヌクレオチドの保持時間は約３２分であった。続けて、精製したオリゴヌクレオチドを８０％酢酸溶液中に３０分間浸漬させることによりＤＭＴを切断し、次いで蒸発させた。オリゴヌクレオチドを５００μｌの水に再分散させ、溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出して乾燥した。同じプロトコルを用い、２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールフォスフォアミダイトを用いて、ＤＮＰで修飾されたオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１９３】
実施例３：ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
オリゴヌクレオチドで修飾された１３ｎｍの金粒子を、実施例１に記載のように調製した。ハプテン修飾オリゴヌクレオチドを、標準的固相ＤＮＡ合成手順^２１を用い、Ａ１としてビオチン−トリエチレングリコールフォスフォアミダイトを用い、Ｂ１として２，４−ジニトロフェニル−トリエチレングリコールフォスフォアミダイト［グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）］を用いて、実施例２に記載したように調製した。この研究で用いられるＰＢＳ緩衝液は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）からなる。ＩｇＥおよびＩｇＧ１は、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）［米国ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）所在］から購入し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（最終濃度：４．３×１０^−８ｂ／μｌ）およびバックグラウンドのタンパク質（１０μｇ／ｍｌのリゾチーム、１％ウシ血清アルブミン、および５．３μｇ／ｍｌの抗ジゴキシン；各１０μＬ）を含む０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液に、使用前に溶解した。
【０１９４】
プローブを調製するために、オリゴヌクレオチド修飾粒子（１３ｎＭ、３００μｌ）をハプテン修飾相補オリゴヌクレオチド（１０μＬの１０μＭ）およびバイオバーコードＤＮＡ（１０μＭの１０μＬ）と室温で２〜３時間ハイブリッド形成させた。配列を図１に示した。ナノ粒子プローブを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、その後の上澄み液をデカントすることにより、未反応のハプテン修飾オリゴヌクレオチドおよびバイオバーコードを除去した。
【０１９５】
ＩｇＥおよび／またはＩｇＧ１の典型的アッセイでは、プローブ（約１３ｎＭ）を含む溶液に標的タンパク質（各々４３μｇ／ｍｌの４０μｌ）を加え、混合物を３７℃で５０分間インキュベートし、タンパク質−ハプテン複合体形成を可能にした。全成分、特に相補ＤＮＡ鎖の間で確実に反応を完了させるために、溶液を−１５℃で２０分間インキュベートしてハイブリッド形成を促進させ（Ｂｏｅｋｅｌ Ｔｒｏｐｉｃｏｏｌｅｒ Ｈｏｔ／Ｃｏｌｄ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）、４℃で２４時間保存した。標的タンパク質が存在すれば、粒子の集合が起きて、金ナノ粒子プラズモンバンドのシフトに影響を与えて、沈殿の他、赤から紫への色の変化が生じる。ハイブリッド形成した生成物を遠心分離し（２分間、３０００ｒｐｍ）、未反応成分を含む上澄み液をデカントして分析した。どのタンパク質が存在するかを決定するために、温度の関数として、２６０ｎｍでの吸収を観察する融解分析を溶液中で実行する（図２）。ＩｇＧ１を前述のプロトコルによりプローブで処理する場合、溶液はピンクがかった青色に変わり、ナノ粒子集合体の形成を示す。標的は存在しないが、バックグラウンドのタンパク質が存在する対照実験では、識別可能な沈殿はない。溶液の融解分析は、５５℃の融点（Ｔｍ）で鋭い遷移を示す。これは、ＩｇＧ１標的物の予想された遷移である［図２Ａ（破線）］。もしＩｇＥを新鮮なプローブ溶液に加えれば、同じ色の変化が観察されるが、融解分析では、３６℃の融点のこの標的で予想される遷移を有する曲線を与える［図２Ａ（実線）］。重要なことに、両方の標的タンパク質がプローブ溶液に加えられる場合、この溶液は暗紫色に変わり、融解分析は２つの明らかな交流を示す。この曲線の一次導関数は、それぞれ３６℃および５５℃に中心がある２つのピークを示す（図２Ｂ）。これは、オリゴヌクレオチドバーコードから誘導される２つの識別可能な集合体および融解特性を利用して、２つの標的タンパク質を区別し得ることを明らかにしている。
【０１９６】
実施例４：ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
この戦略の変形を用いて前述の系の感受性を増大させ、１つの溶液中で調べることが可能な標的の数を増やすことが可能である（図３）。この戦略では、標的タンパク質を、ＤＮＡバイオバーコードを介して間接的に検出することが可能である。１２量体のオリゴヌクレオチドは４^１２個の異なる配列を有しており、これらの多くは、図１Ａにより関心のある多価タンパク質のバーコードを調製するのに用いられ得る。このアッセイの変形では、形成する集合体の融解特性は溶液で測定せず、むしろ集合体内のＤＮＡバイオバーコードを未反応のプローブおよび標的分子から遠心分離（３０００ｒｐｍで２分間）により分離する。その後、この溶液に水を加えることにより、集合体を変性させ、ＤＮＡ複合体を遊離させる。粒子およびタンパク質は、遠心濾過装置［ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００、３５００ｒｐｍ、２５分間］によりＤＮＡバーコードから分離され得る。ＤＮＡバーコードを一旦単離すれば、それをオリゴヌクレオチドアレイで捕獲することが可能であり、また、多くのＤＮＡ検出アッセイのうちの１つを用いて同定することが可能である（図３）。ＩｇＧ１およびＩｇＥに関連する本願に記載の実施例では、バーコードは、関心のあるバーコードの半分と相補的であるオリゴヌクレオチド（直径２５０μｍのスポット）で機能化された顕微鏡用スライド上で捕獲される（図１のＡ３およびＢ３）。もしバーコードをオリゴヌクレオチドアレイで捕獲するなら、バーコードの残りの部位に相補的であるＤＮＡで修飾された粒子はアレイとハイブリッド形成することが可能である（実施例の項参照）。標準的なスキャン法を用いたアプローチ^［１１］を介して開発される場合（写真現像液を用いた処理を伴う）、平台スキャナを用いて結果を定量することが可能である（図４）^１１。ＩｇＧ１が存在する場合、ＩｇＧ１用に設計されたスポットのみが測定可能なシグナルを示す。同様に、もしＩｇＥが唯一存在するタンパク質ならば、それ用に設計したスポットしかシグナルを示さない。最終的に、もし両方のタンパク質が存在すれば、両方のスポットが強いシグナルを示す。
【０１９７】
スキャン法を用いたＤＮＡバイオバーコード検出では、ＤＮＡ／Ａｕナノ粒子集合体を１．５ｍＬのポリスチレン製のバイアル中で遠心分離（３０００ｒｐｍ、２分間）し、上澄み液を除去した。ＰＢＳ緩衝液（７００μｌ）を集合体に加え、この手順を繰り返して未反応のタンパク質およびアッセイ成分から集合体を確実に単離させた。次いで、５００μｌの水を、集合体を含むバイアルに加えてそれを変性させた。マイクロアレイを準備し、文献の方法^{１１，１２}に従ってＤＮＡハイブリッド形成法を用いた。単離したＤＮＡバイオバーコードをＡ２で修飾されたナノ粒子またはＢ２で修飾されたナノ粒子（２ｎＭ）と予め混合し、ＤＮＡマイクロアレイに曝し、ハイブリダイゼーション用チャンバー［グレイスバイオラボ社（ＧＲＡＣＥ ＢＩＯ−ＬＡＢＳ）］中、且つ室温で３時間インキュベートした。次いで、アレイを０．３Ｍ ＮａＮＯ_３および１０ｎＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、銀増感溶液［シグマ社（Ｓｉｇｍａ）］に室温で３分間浸した。スライドを水で洗浄し、次いで平台スキャナで分析した。
【０１９８】
実施例５：ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
バイオバーコードＰＣＲ（ＢＰＣＲ）プロトコルを行い、標的タンパク質である、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を感度３ａＭで検出したが（図６）、これはＰＳＡを検出する現在の通常の臨床アッセイよりも６桁大きい（４６）。ポリクローナル抗ＰＳＡ抗体（７μｇ）を、１３ｎｍのＡｕナノ粒子の水溶液［１０ｍｌの１３ｎＭコロイド懸濁溶液、クエン酸塩（〜３８ｍＭ）安定化］にｐＨ９．０で加えて、ナノ粒子検出プローブを調製した。２０分後、抗ＰＳＡ修飾ナノ粒子を、アルキルチオールで保護したバーコードＤＮＡ捕獲鎖（０．２ＯＤ；５’ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣＧ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＴＧ Ｔ−Ａ_１０−ＳＨ ３’配列番号９）と１２時間反応させ、その後ｐＨ７の０．１Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍリン酸緩衝液に入れて塩で安定化させた。次に、溶液を１ｍｌの１０％ＢＳＡ溶液で２０分間処理して金ナノ粒子を不動態化し、安定化させた。最終的溶液を４℃（２０，０００ｇ）で１時間遠心分離し、上澄み液を除去した。この遠心分離手順を繰り返してさらに精製した。次いで、ＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡ鎖（１ＯＤ；５’ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴＴ Ｇ ３’配列番号１０）を、ナノ粒子に配位されたバーコードＤＮＡ捕獲鎖とハイブリッド形成させ、同様の遠心手順を用いて精製した。
【０１９９】
アミノ官能化された直径１μｍの磁性粒子は、ポリサイエンスインコーポレイティッド社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手した。次いで、これらを市販のグルタルアルデヒド−アミンカップリング化学を用いてタンパク質に結合させた。カップリング効率を測定したところ、ＵＶ−可視分光法でタンパク質が粒子にカップリングする前後での２７０ｎｍの吸収を比較して９０％であった。粒子、すなわち磁性捕獲プローブは、使用前に、４０ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させた。
【０２００】
典型的なＰＳＡ実験（図６Ｂ）では、モノクローナル抗ＰＳＡ抗体（５０μｌの３ｍｇ／ｍｌ磁性プローブ溶液）で機能化された磁性捕獲プローブの水性分散液を、遊離のＰＳＡ（１０μｌのＰＳＡ）の水溶液（０．１Ｍ ＰＢＳ）と混合し、３７℃で３０分間攪拌した（図６Ｂのステップ１）。ＰＳＡ結合磁性検出プローブは、磁界を適用することにより非結合ＰＳＡから容易に分離可能である。磁性分離を達成するために、アッセイ溶液を含む１．５ｍｌのチューブを、室温でＢｉｏＭａｇ（登録商標）微小遠心管分離器［ポリサイエンスインコーポレイティッド社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）］に入れた。１５秒後に、磁性捕獲プローブ−ＰＳＡハイブリッドがチューブの壁に濃縮される。上澄み液（非結合ＰＳＡ分子の溶液）を除き、磁性捕獲プローブ（チューブの側面にペレットの形態となっている）を５０μｌの０．１Ｍ ＰＢＳに再懸濁させる（２回繰り返す）。次いで、ポリクローナル抗ＰＳＡ抗体およびハイブリッドバーコードＤＮＡ鎖で機能化されたナノ粒子検出プローブ（５０μｌ、１ｎＭ）を加える。検出プローブは捕獲プローブに固定化されたＰＳＡと反応し、シグナル増幅およびタンパク質同定（図６Ｂのステップ２）用のＤＮＡ鎖を与える。溶液を３７℃で３０分間激しく攪拌する。次いで、磁性粒子を、磁気選別器を用いて０．３Ｍ ＰＢＳで洗浄し、磁性粒子を単離した。このステップを４回繰り返し、各回は１分間必要とし、磁性捕獲プローブ以外すべてを取り除く（ＰＳＡ結合ナノ粒子検出プローブと共に）。最終的な洗浄ステップ後、磁性捕獲プローブをＮａｎｏｐｕｒｅ（１８Ｍオーム）水（５０μｌ）に再懸濁させ、ナノ粒子検出プローブ表面からバーコードＤＮＡ鎖を２分間脱ハイブリダイズさせた。その後、脱ハイブリダイズしたバーコードＤＮＡは容易に分離され、磁気選別器を用いてプローブから回収される（図６Ｂのステップ３）。
【０２０１】
バーコードＤＮＡ増幅（ステップ４、図６Ｂ）では、単離したバーコードＤＮＡを適当なプライマーを含むＰＣＲ反応混合物に加え（２０μｌ、最終体積）、次いでこの溶液を以下の手順に従って熱サイクルにかける。１アリコートの遊離バーコードＤＮＡ（８．９μｌ）を、適当なプライマー（各２５μＭ、プライマー１：５’ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣ ３’配列番号１１、プライマー２：５’ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣ ３’配列番号１２）０．３μｌ、ＤＭＳＯ（最終濃度２％）０．４μｌ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．１μＬとともに、ＥａｓｙＳｔａｒｔ（商標）Ｍｉｃｒｏ ２０ ＰＣＲ Ｍｉｘ−ｉｎ−ａ−Ｔｕｂｅ［モレキュラーバイオプロダクト社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）所在］］の最上のワックス層に加え、ポリメラーゼは、最終体積２０μｌではＥａｓｙＳｔａｒｔ（商標）システム［５Ｕ／μｌ、フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］に適合することが示されている。ＰＣＲ反応混合物の最終濃度は以下のとおりである。プライマー１および２、０．３７μＭ；ｄＮＴＰ混合物、０．２ｍＭ；ＰＣＲ緩衝液、１Ｘ；およびＭｇＣｌ_２、２ｍＭ。次いで、ＰＣＲチューブをサーマルサイクラー［ＧｅｎｅＡｍｐ９７００、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）］に搭載し、９４℃で７分の「加熱スタート」し、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の２５回のサイクルにかけ、７２℃で７分の最終伸長、その後の４℃の浸漬にかけた。
【０２０２】
対照実験を最初に行い、ＰＣＲ増幅後のプライマー二量体の形成を評価した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて偽ハイブリダイズしたプライマーの融点を下げ、プライマー二量体形成および増幅の可能性を最小にした（図７、レーン１〜５、およびレーン６〜１０で０．５％の増加量で左から右に０から２％）。さらに、温度サイクルの数を２５に設定した。図７に見られるように、バーコードＤＮＡ単位複製配列を有する場合には透明なバンドがあるが（レーン１〜５）、Ｔａｑポリメラーゼの存在下でプライマーのみを熱サイクルにかける場合には、観察可能なバンドはない（レーン６〜１０）。したがって、その濃度では観察可能なバンドの痕跡がないので（図７、レーン１０）２％ＤＭＳＯを全ＢＰＣＲ反応物に加えたが、バーコードＤＮＡでは増幅を持続した。
【０２０３】
バーコードＤＮＡ単位複製配列を臭化エチジウムで染色し、色素を含むゲルと混合した。次いで、ゲル電気泳動法を行って増幅が起きたか否かを測定した（図８、パネルＡおよびＣ）。すべての電気泳動実験において、１アリコート（１５μｌ）のＰＣＲ混合物を臭化エチジウム（１ｍｇ）で染色し、ゲル電気泳動装填用色素［３μｌ、６Ｘ、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）［米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］］と混合し、ゲル電気泳動（２％アガロースゲル、１１０Ｖ、３５分）を１Ｘ ＴＡＥ泳動緩衝液中で行った。標準バイオバーコード（１μｌ、６μＭバイオバーコード２本鎖）を参照用にゲルに加えた。標準バイオバーコード（４０量体）は、バイオバーコードＤＮＡにその相補鎖を含む０．３Ｍ ＰＢＳを加えて調製した。すべてのゲル画像およびバンド強度の測定は、コダック社製（Ｋｏｄａｋ）ＤＣ−１２０デジタルカメラおよびコダック社製（Ｋｏｄａｋ）ＩＤ２．０．２イメージングソフトウェアを用いて行った。ゲルバンドは、臭化エチジウムにゲルを３５分間浸すことにより電気泳動後に臭化エチジウムでも染色し（０．５μｇ／ｍｌの１Ｘ ＴＡＥ泳動緩衝液）、臭化エチジウムを電気泳動前にＰＣＲ反応物に加えたものと同様の定性的結果が得られた。
【０２０４】
臭化エチジウムで染色されたバンドの相対強度を、ＰＳＡの相対濃度の推定に充てた（図８、パネルＢおよびＤ）。染色したＰＣＲ単位複製配列の強度は、それぞれ３００ａＭ、３ｆＭ、３０ｆＭ、３００ｆＭ、３ｐＭ、および３０ｐＭのレーン３〜８でのＰＳＡ濃度を表す。ＰＳＡが存在しなかったときにはＢＰＣＲはわずかのシグナルしか発生しなかったので、ナノ粒子プローブの磁性プローブへの非特異的結合は無視できた（図８、パネルＡ、レーン１および２、ならびにパネルＣ、レーン１）。パネルＢによれば、対照バンドの強度はＰＳＡが存在しているバンドよりも少なくとも８倍少ない。低濃度（図８、パネルＢ、３ａＭから３００ｆＭ、それぞれレーン２〜７）ＰＳＡ検出を表すグラフでは、３ａＭ（レーン２）に対応するゲルバンドは相対的強度が陰性対照よりも２．５倍高い（レーン１）。
【０２０５】
実施例６：ナノ粒子複合プローブを用いたアッセイ
アッセイの結果を分析するのに通常ゲル電気泳動法を用いたが、一般に、スキャン法を用いた方法はより高い感度をもたらし、ゲル系の方法よりも容易に実行され得る。したがって、スキャン法を用いたアッセイの結果を本願では報告する。標的バーコード配列（４０量体）の半分と相補的であるチップに固定されたＤＮＡ２０量体を用いて増幅したバーコードＤＮＡ配列を捕獲し、金ナノ粒子を用いたサンドイッチアッセイ型式で配列の他の半分を標識した。増幅した２本鎖バーコードＤＮＡは、バーコードＤＮＡ、チップ表面、および金ナノ粒子プローブの間でハイブッリド形成させるために、最初に変性される必要がある。したがって、バーコードＤＮＡ単位複製配列を最初のＰＣＲチューブから除き、金ナノ粒子プローブの溶液（５μｌ、０．３Ｍ ＰＢＳ中１０ｎＭ）に加えた（５μｌ）。汚れのない０．２ｍｌのＰＣＲチューブ中で、溶液を０．３Ｍ ＰＢＳ（９０μｌ）で最終体積１００μｌに希釈した。１本鎖バーコードＤＮＡ（４０量体）およびナノ粒子結合相補鎖（２０量体）をハイブリッド形成させるために、ＰＣＲチューブをサーマルサイクラーに加え、９５℃に３分間加熱し、２本鎖バーコードＤＮＡを変性し、その後ハイブリッド温度４５℃に２分間冷却して、ナノ粒子プローブをそれらの相補バーコードＤＮＡ配列に結合させた。この混合物をＰＣＲチューブから除いて、固定した捕獲鎖（２０量体）を有するマイクロアレイ［ＧＭＣ４１７Ａｒｒａｙｅｒ、ジェネティックマイクロシステムズ社（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ）］のチップに加えた。湿度室で４５分間、各実験の試験溶液を１００個のハイブリッド形成ウェルを有するアレイの活性領域［グレイスバイオラボ社（Ｇｒａｃｅ ＢｉｏＬａｂｓ）、米国オレゴン州ベンド（Ｂｅｎｄ）所在］で制限した。ハイブリッド形成後、チップを０．１Ｍ ＮａＮＯ_３／０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で４５℃ですすぎ、過剰の金粒子を除去した（２回繰り返した）。その後、ハイブリッド形成したナノ粒子プローブを有するチップを、銀増感溶液を用いて銀増幅させ［反応時間６分、テッドペラインコーポレイティッド社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州レディング（Ｒｅｄｄｉｎｇ）所在］］、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（１８Ｍオーム）水ですすぎ、ベンチトップ型遠心器を用いて乾燥した。金ナノ粒子の結合後、銀増幅により灰色のスポットが生じるが、これは発生したスポット^{１１、５１}からの光散乱を測定するＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステム［ナノスフィアインコーポレイティッド社（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．）］により解読可能である。３００ｆＭから３ａＭの標的ＰＳＡ濃度は、この方法により容易に検出され得るであろう（図９）。３ａＭの試料は、全サンプル中１８個のタンパク質分子に関連する。非相補捕獲ＤＮＡ（５’ＳＨ−Ｃ６−Ａ１０−ＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡ−３’、配列番号１３）（図９、スポット鋳型）を有する対照スポットからのシグナルの欠如、およびＰＳＡが存在しないときには識別可能なシグナルがほとんどないという知見（図９、対照）により明らかなように、バーコードＤＮＡ配列の選択性は優れている。
【０２０６】
実施例７：ＢＰＣＲを用いたタンパク質検出の理論的限界
ＢＰＣＲを用いたタンパク質検出の理論的な下限を検討するために、ＰＣＲ／ゲル電気泳動を、ＰＣＲ増幅（図１０）の一連の希釈度のバーコードＤＮＡ濃度により行った。バーコードＤＮＡ単位複製配列が存在したときのシグナルは、３０コピーのバーコードＤＮＡしかＰＣＲ反応に加えなかった場合でさえ（レーン９）、対照バンド（レーン１０）と完全に識別可能である。各ナノ粒子プローブが約５０のバーコードＤＮＡ鎖を有すると仮定すると、ＢＰＣＲは理論的にシグナル結合ナノ粒子プローブによる検出シグナルを生じ得る。
【０２０７】
実施例８：複合体培地でのＰＳＡの検出
臨床設定により類似の試料溶液でのＢＰＣＲ増幅方法の適用性を実証するために、実施例５および６に記載のアッセイを、標的ＰＳＡをヤギ血清に溶解することにより行い、バーコードをＢＰＣＲ増幅ステップ後に検出した。続けて、ＰＳＡを０．１Ｍ ＰＢＳに希釈し、次いで、未希釈のヤギ血清［ＩＣＮバイオメディカルズインコーポレイティッド社（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）［米国オハイオ州オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）所在］］に加えた。ヤギ血清は効果的に１×正常な緩衝生理食塩水をまねる（例：イオン強度およびｐＨに関する限りの任意の生体系）。
【０２０８】
データは、本発明の方法により、複合培地中、３０ａＭの同程度に低い濃度で、標的分析物（ここではＰＳＡ）を検出可能であることを示している。この濃度で発生したシグナルは、明らかに対照実験と識別可能である（図１１）。背景雑音は、バーコードＤＮＡ試料を主要な混入成分を除くことが可能なメンブランにより濾過する任意のステップを導入することにより低減することが可能である。この任意の濾過ステップは、例えば、大きさ（分子量）、形、電荷、または疎水性／親水性などの任意の既知の方法によりバーコードＤＮＡを不純物から分離することが可能である。
【０２０９】
実施例９：バーコードＤＮＡ（非ＢＰＣＲ増幅した）の直接検出および測定
金ナノ粒子（ＮＰ）プローブを、実施例５に上述したように本質的に調製した。簡潔には、ＰＳＡ（３．５μｇ）に対するポリクローナル抗体（Ａｂ）を３０ｎｍの金ＮＰ（１ｍｌの４０ｐＭ ＮＰ溶液）の水溶液にｐＨ９．０で加えた。
【０２１０】
２０分後、Ａｂ修飾ＮＰをアルキルチオール・キャップ・バーコードＤＮＡ捕獲鎖（３０ｎｍの金粒子に対して１ＯＤ；５’−ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＡＣＧ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＴＧＴ−Ａ_１０−（ＣＨ_２）_３−ＳＨ ３’）と１６時間反応させ、次いで、０．１Ｍ ＮａＣｌに加えて塩で安定化させた。この溶液を３０分間、０．３ｍｌの１０％ＢＳＡ溶液で処理して不動態化させ、金ＮＰを安定化させる。最終溶液を４℃（２０，０００ｇ）で１時間遠心分離にかけ、上澄み液を除いた。この遠心分離手順を繰り返してさらに精製した。最終的なＮＰプローブを０．１Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝液に再分散させた。次いで、ＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡ鎖（１ＯＤ；５’−ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴＴ Ｇ−３’）をＮＰに配位したバイオバーコードＤＮＡ捕獲鎖とハイブリッド形成させ、同様の遠心分離手順を用いて精製した。オリゴヌクレオチドの含有をＤｅｍｅｒｓらの方法により測定した［Ｌ．Ｍ．Ｄｅｍｅｒｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２、５５３５（２０００）参照］。アミノ官能化された直径１μｍのＭＭＰをポリサイエンスインコーポレイティッド社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手した。ＭＭＰを、市販のグルタルアルデヒドアミンカップリング化学を用いてＰＳＡに対するｍＡｂに結合させた。カップリング効率を測定したところ、ＵＶ−可視分光法でタンパク質がＭＭＰにカップリングする前後での２７０ｎｍの吸収を比較して９０％であった。ＭＭＰを使用前に４０ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させた。
【０２１１】
ＢＣＰＲによる増幅ステップを用いなかった以外は、一般に実施例６に記載のように、チップ型アッセイを用いて溶液中のバーコードＤＮＡの量を直接測定した。ＰＣＲを用いないので、この方法はＰＣＲ増幅の間に形成される２本鎖ＤＮＡを変性する必要がない。したがって、タンパク質検出およびバーコードＤＮＡの単離後に、アリコートの単離バーコード試料（１０μｌ）を０．６Ｍ ＰＢＳ（８５μｌ）および１３ｎｍの金検出プローブ（５μｌ、最終濃度５００ｐＭ、上記と同じ配列）と混合した。この混合物をＶｅｒｉｇｅｎｅオン・チップハイブリダイゼーションチャンバーのウェルに加え、この下で適当な捕獲鎖を上述したように配列した。試料を４２℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を除き、チップを０．５Ｍ ＮａＮＯ_３／０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄して、過剰の金ナノ粒子を除いた。すべて上述したように、表面に固定化された金粒子を銀増感溶液で６分間染色し［テッドペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）］、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で洗浄し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムで画像化した。
【０２１２】
この例では３０ｎｍの金ＮＰを用いたが、この手順では１３ｎｍの金ＮＰをバーコードＤＮＡの直接検出のために使用することを企図している。それにもかかわらず、タンパク質検出ステップのＮＰプローブの大きさを増大させることにより、各ＮＰごとのＤＮＡ鎖の数を有意に増加させることができ、これにより直接検出を補助することができる（理論上、１００本のＤＮＡ鎖が１３ｎｍの金ＮＰに付着されていると仮定すれば、各３０ｎｍの金ＮＰ上の５３２本のＤＮＡ鎖と同じ多さにすることが可能であろう）。特定のナノ粒子プローブのサイズを調整して特定のアスペクトに最適化することが可能である。
【０２１３】
結果（図１２）は、ＢＰＣＲ増幅することなく３０ｎｍの金ＮＰ（２０ｐＭで）を用いて、標的ＰＳＡを３０アトモルまでに低い濃度で直接検出可能であったことを示している。このことはＢＰＣＲ増幅法に比較して大規模な感度の欠損を示しているが、この方法は、ＰＣＲステップを排除することにより、依然として優れた感度を有し、コスト、労力および時間を著しく低減させる。
【０２１４】
実施例１０：ゼプトモル濃度の標的核酸配列の直接検出
この配列はバイオテロ行為や生物戦争用途に重要であり、文献でもよく研究されているので、この実施例では、炭疽菌致死因子（５’−ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１４）に関連するＤＮＡ配列を最初の標的として選択した^{６３、６７〜６９}。各２０μＬの試験試料に、２つの対照ＤＮＡ配列を加えた［１μＬの１０ｐＭ（５’−ＣＴＡ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＣＡ−３’；配列番号１５）および１μＬの対照用の１０ｐＭ ２（５’−ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＡＧ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＣＴ ＡＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１６）］。使用前に、ハイブリッド形成によりナノ粒子プローブにバーコードＤＮＡを取り込んだ（４００ｐＭで２０ｎｍのプローブ；２００ｐＭで３０ｎｍのプローブ）。バーコードＤＮＡを濃度１０μＭで導入し、適当なハイブリダイゼーション用緩衝液でハイブリッド形成させた。続けて粒子を遠心分離にかけ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、プローブを適当な貯蔵用緩衝液に懸濁させ、使用するまで保存した。
【０２１５】
ＭＭＰでは、ＭＭＰ上の第一級アミンおよび標的配列の特異的認識結合部位を形成するオリゴヌクレオチド上のチオール基と反応する、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホＳＭＰＢ）二官能リンカーとこれらを反応させることにより、ポリアミン官能化ポリスチレン粒子をアルキルチオール保護ＤＮＡと結合させた。使用前に１０％ＢＳＡを、ウシ血清アルブミンを含む溶液に加えることによりＭＭＰを不動態化させた。次いで、プローブを遠心分離にかけ、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２ｍｇ／ｍＬで再懸濁させて活性なプローブを生じた（図１３Ａ）。
【０２１６】
５０μＬのＭＭＰプローブ（２ｍｇ／ｍＬで）を１本鎖型の標的ＤＮＡを含む溶液に加えることによりアッセイを行った。この系を室温で１０分間放置した。１０分の放置期間後、５０μｌのＮＰプローブ［４００ｐＭで５０μＬ（２０ｎｍのＮＰプローブ溶液）または２００ｐＭで５０μｌ（３０ｎｍのＮＰプローブ溶液）］をこの溶液に加えて、５０分間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成後、磁界を反応溶液に適用し［ＢｉｏＭａｇマルチ６マイクロ遠心チューブ用セパレーター、ポリサイエンスインコーポレイティッド社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）［米国ペンシルベニア州ワーリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）所在］］、ＭＭＰおよびＮＰでサンドイッチされた標的ＤＮＡ鎖の他に未反応のＭＭＰも反応容器の壁に引き寄せた。残ったすべての未反応の反応溶液成分、特に、ＭＭＰに特異的にハイブリダイズしないＮＰを数回のＰＢＳ緩衝液による洗浄により洗浄した。次いで、磁界を除き、５０μｌのＮＡＮＯｐｕｒｅ水［ブランステッドインターナショナル社（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）［米国アイオワ州デュバク（Ｄｕｂｕｑｕｅ）所在］］を反応容器に加え、系を５５℃に３分間加熱して、バーコードＤＮＡを離した。磁界を再導入してすべてのＭＭＰを溶液から除き、検出用のバーコードＤＮＡを残した。
【０２１７】
最終反応溶液中でバーコードＤＮＡの量および本質を分析するために、スキャン法を用いた^６７。スキャン法は、オリゴヌクレオチドで修飾した金ＮＰプローブ（５’−ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＣＴ−Ａ_１０−ＳＨ−３’−Ａｕ；配列番号１７）およびＮＰで促進されたシグナル増幅用の銀（Ｉ）の低下に基づくチップ型ＤＮＡ検出法を利用する。この特定のアッセイでは、マレイミドで修飾したガラスチップを、ＤＮＡマイクロアレイヤーを用いて５’捕獲ＤＮＡ鎖（５’−ＳＨ−Ａ_１０−ＣＧＴ ＣＧＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ−３’；配列番号１８）でスポットした［スポット径は１７５μｍであり、２つのスポット間距離は３７５μｍである。ＧＭＳ ４１７アレイヤー、ジェネティックマイクロシステム社（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ）［米国マサチューセッツ州ウォーバン（Ｗｏｂｕｒｎ）所在］］。表面の非スポット領域をＡ_１０配列で一晩不動態化させた（１０μＭの５’−ＳＨ−ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ Ａ−３’；配列番号１９）。チップ表面をバーコードＤＮＡ溶液と接触させてすぐに、標的配列溶液と混合したＮＰプローブをバーコード／捕獲ＤＮＡで修飾したチップに加えた。チップ上のスポットをＮＰプローブおよび標的ＤＮＡ鎖でラベルした。次いで、スポットしたチップを、銀増感溶液［テッドペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）［米国カリフォルニア州レディング（Ｒｅｄｄｉｎｇ）所在］］に曝して、さらに銀増感させた。次いで、発生したスポットをＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤ（同定）システム［ナノスフィアインコーポレイティッド社（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．）［米国イリノイ州ノースブルック（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ）所在］］により解読した。Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムは、発生したスポットから散乱された光を測定し、アッセイの永久記録を提供する。図１４Ａは、「増幅した」バーコードＤＮＡの検出に用いられる２０ｎｍのＮＰプローブを説明する。５ｆＭから５０ａＭの標的ＤＮＡ濃度のスポット強度は、対照スポットよりも明らかに強い。各濃度のスポット強度を測定するために、３つのスポットをチップ上でパターン化し、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムで画像化した。灰色レベルのスポットをグラフィックソフトウェア［アドビフォトショップ（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）］で計算し、スポット強度のグラフを図１５に示す。このグラフは、２０ｎｍのＮＰプローブが、約５０ａＭの標的ＤＮＡを明らかに検出し得るが、５ａＭの濃度のバックグラウンドのシグナルと区別することはできないことを示している。
【０２１８】
３０ｎｍのＮＰプローブをＤＮＡ−ＢＣＡ検出に用いた場合、５００ｚＭと同程度に低い標的ＤＮＡ濃度が検出された（図１４Ｂ）。２０および３０ｎｍのＮＰプローブでの検出限界のこの差は、異なる表面領域のＮＰプローブ上のバーコードＤＮＡ鎖の絶対数の差のためであろう。強度のグラフは、全試料濃度で３０ｎｍのＮＰプローブシステムが２０ｎｍのＮＰプローブシステムよりも強いスポットシグナルをもたらすことを示唆している（図１５）。５００ｚＭの試料体積２０μＬは、全試料数の約１０本の標的ＤＮＡ鎖を表し、分子蛍光プローブと合わせたＰＣＲ型の方法を採用するアッセイに匹敵する感度をもたらす。
【０２１９】
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【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】ＤＮＡ／Ａｕナノ粒子型のタンパク質検出スキームを示す図。（Ａ）ハプテン修飾ナノ粒子プローブの調製。（Ｂ）タンパク質結合プローブを用いたタンパク質検出。配列Ａには９個のＧ、Ｃ対があり、配列ＢにはＧ、Ｃ対が２つしかないことに留意する。
【図２】ＤＮＡおよびタンパク質により連結されたＡｕナノ粒子集合体の熱変性プロファイルを示すグラフ。２６０ｎｍでの吸収を上昇温度の関数として観察した（１℃／分、保持時間１分）。絶えず攪拌して集合体を懸濁させながら、各ＵＶ−可視スペクトルを測定した。全集合体を１ｍｌの０．３Ｍ ＰＢＳに懸濁させ、融解分析を行った。Ａ）１つの標的抗体を有する２つのプローブが存在する（ＩｇＥ（実線）、ＩｇＧ１（破線））。全データを正規化した。（Ｂ）両方の標的抗体を有する２つのプローブが存在する。差込図は、最初の誘導体の熱変性曲線である。
【図３】タンパク質のバイオバーコードとしてＤＮＡを用いたアレイ型タンパク質検出スキームを示す図。
【図４】ＤＮＡバイオバーコードのスキャン法を用いた（ｓｃａｎｏｍｅｔｒｉｃ）ＤＮＡアレイ検出を示す図。左欄はＩｇＧ１に関連するバイオバーコードの検出用のためのものであり、右欄はＩｇＥに関連するバイオバーコードのためのものである。捕獲オリゴヌクレオチドは、ＩｇＧ１系では５’−チオール修飾ａｔａａｃｔａｇａａｃｔｔｇａ（配列番号１）であり、ＩｇＥ系では５’−チオール修飾ｔｔａｔｃｔａｔｔａｔｔ（配列番号２）である。各スポットは、直径が約２５０μｍであり、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １６４０ＸＬフラットベッド・スキャナ［エプソンアメリカ社（Ｅｐｓｏｎ Ａｍｅｒｉｃａ）［米国カリフォルニア州ロングビーチ（Ｌｏｎｇｂｅａｃｈ）所在］］を用いてグレースケールで解読する。これらのアッセイは、２０ｎＭから７００ｎＭの標的濃度範囲で研究されており、よく比較できるほど役立つ。
【図５】共通の種類の免疫−ＰＣＲ型の分析物検出スキームを示す図。
【図６Ａ】標的分析物である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出するためのバーコードＰＣＲ（ＢＰＣＲ）プロトコルの使用を示す図。プローブの設計および調製を図示する。
【図６Ｂ】標的分析物である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出するためのバーコードＰＣＲ（ＢＰＣＲ）プロトコルの使用を示す図。ＰＳＡ検出とバーコードＤＮＡ増幅および同定とについて図示する。
【図７】プライマー−ダイマー形成、ＤＮＡバーコード増幅、および２５回の熱サイクルを用いたＤＭＳＯ濃度の上昇の影響を評価する対照実験を示す図。レーン１から５は、ＰＣＲ反応混合物中にＤＮＡバーコードが存在するものであるが、レーン６から１０にはＤＮＡバーコードはない。レーン１から５および６から１０ではＤＭＳＯが増えていることに留意する（０．５％の増加量で０から２％）。
【図８】ＰＳＡ検出後のＰＣＲで増幅されたバーコードＤＮＡのゲル電気泳動の画像および相対バンド強度を示すグラフ。パネルＡのレーン１および２は対照実験である（レーン１：ＰＳＡを含まないとともに、バックグラウンドタンパク質である抗ジニトロフェニルおよびβ−ガラクトシダーゼを含む、レーン２：タンパク質なし）。レーン３から８において、試料（１０μｌ）中のＰＳＡ濃度は、それぞれ３００ａＭ、３ｆＭ、３０ｆＭ、３００ｆＭ、３ｐＭ、および３０ｐＭである。ＰＳＡの標準バイオバーコードＤＮＡ４０量体が、ＰＣＲ後の他のゲルバンドと比較するためにレーン９に流される。パネルＢは、ＢＰＣＲ後の相対的ゲル電気泳動バンド強度グラフである。パネルＣは、ＰＳＡの低濃度検出である。濃度は、レーン２（３ａＭ）からレーン７（３００ｆＭ）の１０×希釈で、３ａＭから３００ｆＭである。バックグラウンドタンパク質のみを有する陰性対照をレーン１に示し、標準バイオバーコード４０量体（６μＭ２本鎖バイオバーコード）を最初のレーンに示す（レーンＣ）。パネルＤは、ＢＰＣＲ後の相対的ゲル電気泳動バンド強度である。
【図９】スキャン法を用いたＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡの検出を示す図。ＰＳＡ濃度（試料体積１０ｍｌ）を３００ｆＭから３ａＭに変化させ、ＰＳＡを加えない（対照）陰性対照試料を示す。全７つの試料において、２ｍｌの抗ジニトロフェニル（１０ｐＭ）および２ｍｌの□−ガラクトシダーゼ（１０ｐＭ）をバックグラウンドタンパク質として加えた。３０ｎｍのＮＰプローブを用いたＰＳＡ（３０ａＭおよび対照）のＰＣＲなしでの検出も示す（差込図）。チップをＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムで画像化した。
【図１０】ＢＰＣＲの理論的検出限界を示す図。左のパネルのゲル画像は、出発バーコードＤＮＡ濃度を減少させたＰＣＲ後のバンドを示す。レーン１：３×１０^９コピー、レーン２：３×１０^８コピー、レーン３：３×１０^７コピー、レーン４：３×１０^６コピー、レーン５：３×１０^５コピー、レーン６：３×１０^４コピー、レーン７：３×１０^３コピー、レーン８：３×１０^２コピー、レーン９：３×１０^１コピー、およびレーン１０：バーコードＤＮＡなし。右のパネルは、相対的ゲル電気で移動バンド強度のグラフである。
【図１１】ＰＳＡを複合ヤギ血清培地に溶解した場合のＰＳＡ特異的バーコードＤＮＡの検出を示す図。各パネルは、様々な分析物の濃度（３ｐＭから３ａＭ）でＢＰＣＲによって増幅されたバーコードＤＮＡにより生じたシグナルを示す。
【図１２】３０ｎｍのＮＰプローブを用いたＰＣＲなしのＰＳＡ検出を示す図。各パネルおよび棒グラフの関連する相対強度値は、様々な濃度（３０ａＭから３ｐＭ、および対照）でバーコードＤＮＡ（すなわち、非ＢＰＣＲ増幅させたもの）の直接検出により生じたシグナルを示す。チップをＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステム［ナノスフィアインコーポレイティッド社（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．）、米国イリノイ州ノースブルック（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ）所在］で画像化した。
【図１３Ａ】ＤＮＡ−ＢＣＡアッセイを示す図。ナノ粒子および磁性微粒子の調製。
【図１３Ｂ】ＤＮＡ−ＢＣＡアッセイを示す図。ナノ粒子型ＰＣＲなしのＤＮＡ増幅スキーム。
【図１４Ａ】Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムを用いた増幅した炭疽菌のバーコードＤＮＡ検出を示す図。２０ｎｍのＮＰプローブを用いた炭疽菌のバーコードＤＮＡ検出。
【図１４Ｂ】Ｖｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤシステムを用いた増幅した炭疽菌のバーコードＤＮＡ検出を示す図。３０ｎｍのＮＰプローブを用いた炭疽菌のバーコードＤＮＡ検出。
【図１５】２０ｎｍおよび３０ｎｍのＮＰプローブで銀増感後のバーコードＤＮＡおよびＮＰプローブでサンドイッチしたスポットを示す強度グラフ。
【図１６Ａ】「ユニバーサル」ナノ粒子プローブ検出スキームの一実施態様を示す図。１以上の標的核酸配列のユニバーサルプローブを合成する。標的認識ＤＮＡを用いて標的に対するプローブの特異性を制御することが可能である。与えられた試験溶液中に１つまたは複数の標的核酸配列が存在する場合に、プローブをアッセイ系で用いることができる。
【図１６Ｂ】「ユニバーサル」ナノ粒子プローブ検出スキームの一実施態様を示す図。ユニバーサルプローブは、磁性粒子またはガラススライドなどの基質に結合した第２の種類の認識オリゴヌクレオチドを用いた結合に用いられる。第２の種類の認識オリゴヌクレオチド、ユニバーサルプローブ、および標的核酸を含むと思われる試験溶液を混合し、ハイブリッド形成および複合体形成が可能な条件下で反応させる。複合体は、未反応のユニバーサルプローブおよび試験溶液成分と区別され、レポーターオリゴヌクレオチドが検出される。
【図１７】デンドリマープローブ、増幅デンドリマープローブ、およびデンドリマー−ナノ粒子ハイブリッドプローブを有するユニバーサルナノ粒子プローブの他の実施形態を示す図。第１の種類のデンドリマープローブは、バーコードＤＮＡなどの、認識オリゴヌクレオチド配列およびレポーターオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。第１の種類のデンドリマープローブ上の認識オリゴヌクレオチド配列は、第２の種類のデンドリマープローブにハイブリダイズすることが可能である。ハイブリッド形成条件下で、これは所望により伸長され得るデンドリマープローブ複合体（またはマトリックス）を生じる。第２の種類のデンドリマープローブは、複数のデンドリマープローブに結合することができ、全マトリックス内に含まれるレポーターオリゴヌクレオチドの量を増幅するように機能する。同様に、第２の種類のデンドリマーとのより多くの複合部位を提供し、またはより多くのレポーターオリゴヌクレオチドを提供するために、第１の種類のデンドリマーでの認識オリゴヌクレオチドの存在量が増加または減少され得る。特定のアッセイで必要とされるようなハイブリッドプローブ複合（またはマトリックス）系を生じるために、第１または第２の種類のデンドリマープローブが、金ナノ粒子プローブまたは磁性粒子プローブなどの他の粒子プローブとともに用いられ得る。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
基質を準備する工程と；
特異的標的分析物に対する１つまたは複数の特異的結合相補体を有する粒子および該粒子に結合した１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の粒子プローブを準備する工程であって、該粒子プローブの特異的結合相補体は特定の標的分析物に特異的であり、該粒子プローブのためのＤＮＡバーコードは該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす工程と；
該基質上へ該標的分析物を固定する工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該分析物に対する特異的結合相補体の間の結合を可能にして複合体を形成するのに有効な条件下で、該固定された標的分析物を１種類または数種類の粒子プローブと接触させる工程と；
未結合の粒子プローブを除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードを任意で増幅させる工程と；
該マーカーの有無は試料中の特異的標的分析物の有無を示している該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える方法。
【請求項２】
前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、その特異的結合相補体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡバーコードがＰＣＲで増幅される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が少なくとも２つのＤＮＡバーコードで標識される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が、前記標的分析物のための１種類または数種類の捕獲プローブで配列される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、各標的分析物が少なくとも２つの結合部位を有し、
基質と結合しており、特異的標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を含む１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程と；
検出プローブが、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子、該特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が、該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料、捕獲プローブおよび検出プローブを接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも除去するために該基質を洗浄する工程と；
該ＤＮＡバーコードの有無の検出は試料中の標的分析物の有無を示している該基質上の任意の集合複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える方法。
【請求項７】
前記検出プローブは、（ｉ）特異的標的分析物の第２の結合部位に対する１つまたは複数の特異的結合相補体、（ｉｉ）ナノ粒子と結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定配列を有するＤＮＡバーコードを備え、検出プローブと結合したＤＮＡバーコードは、特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たしている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程の前にさらに、
前記集合複合体を脱ハイブリダイズして前記ＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該複合体を置く工程と；
前記検出の前に該ＤＮＡバーコードを増幅させる工程とを備える請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡバーコードがＰＣＲで増幅される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕獲プローブは磁性基質に結合している請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質は磁性粒子である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子に結合した特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体である請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は抗ＰＳＡ抗体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記洗浄工程の前にさらに、
前記磁性粒子に結合した集合複合体を磁場に置くことによって洗浄の前に該集合複合体を単離する工程を備える請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離された集合複合体を脱ハイブリダイズして前記ＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程をさらに備える請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放出されたＤＮＡバーコードが増幅される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記放出されたＤＮＡバーコードがＰＣＲで増幅される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的分析物は、少なくとも２つの部分を有する核酸である請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、前記検出プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、該ナノ粒子に結合した該複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は前記ＤＮＡバーコードに相補的である配列を有し、該検出プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の第１の部分に相補的である配列を有する第１の標的認識オリゴヌクレオチドを備え、且つ前記捕獲プローブの特異的結合相補体は、該標的核酸の少なくとも第２の部分に相補的である配列を有する第２の標的認識オリゴヌクレオチドを備える請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的分析物は少なくとも２つの部分の配列を有する標的核酸であり、前記検出プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を備え、前記ＤＮＡバーコードは、該検出プローブと結合した該複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である配列を有し、前記特異的結合相補体は、少なくとも第１および第２の部分の配列を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備え、該第１の部分は該標的核酸の第１の部分に相補的であり、該第２の部分は該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、前記基質の特異的結合相補体は、該標的核酸の第２の部分に相補的である少なくとも一部を有する標的認識オリゴヌクレオチドを備える請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出プローブはデンドリマーを備える請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
（ｉ）磁性粒子；および（ｉｉ）該磁性粒子に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える１種類または数種類の捕獲プローブを準備する工程であって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーは、特異的標的分析物の第１の結合部位と結合する工程と；
各標的分析物のための１種類または数種類の検出プローブを準備する工程であって、検出プローブは、（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、該標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的である既定の配列を有し、且つ特異的標的分析物のマーカーとしての機能を果たす少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備えている工程と；
該標的分析物の存在下で該標的分析物および該プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして該磁性粒子と結合した集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を該捕獲プローブおよび該検出プローブと接触させる工程と；
未結合のいかなる検出プローブをも該磁性粒子から洗い流す工程と；
該ＤＮＡバーコードの検出は該標的分析物の存在を示している該複合体内の該ＤＮＡバーコードの有無を検出する工程とを備える方法。
【請求項２３】
前記検出工程の前にさらに、
磁場を加えることによって前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体から脱ハイブリダイズしてＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
放出されたＤＮＡバーコードを単離する工程とを備える請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
放出されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程をさらに備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子であって、該ナノ粒子と結合した該複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有するナノ粒子を準備する工程と；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と、該基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチドおよび該ナノ粒子を接触させる工程とをさらに備える請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡバーコードが検出前にＰＣＲで増幅される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記集合複合体を分析する前に該集合複合体を単離する工程をさらに備える請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記集合複合体は、磁場を該集合複合体に加えることによって単離される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子である請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記特異的結合対は、抗体および抗原である請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記特異的結合対は、受容体およびリガンドである請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記特異的結合対は、酵素および基質である請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記特異的結合対は、薬剤および標的分子である請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記特異的結合対は、少なくとも部分的に相補的な２つのオリゴヌクレオチド鎖である請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡバーコードがビオチン化されている請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡバーコードが放射標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡバーコードが蛍光標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的は３つ以上の結合部位を有する請求項１、６および２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも２種類の粒子複合プローブが準備され、第１の種類のプローブは前記標的分析物上の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合プローブが準備される請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記特異的結合相補体および標的分析物が特異的結合対のメンバーである請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
特異的結合対のメンバーは、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、ならびに天然および合成の核酸を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的分析物は核酸であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、前記特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体を含む抗体である請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的分析物はゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体は、該ゲノム配列の少なくとも一部と相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスのＤＮＡである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記特異的結合相補体および標的分析物は抗体−リガンド対のメンバーである請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
第１の結合部位に加えて、前記標的分析物は第２の結合部位を含むように変更されている請求項１、６または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記集合複合体を分析する前に濾過が行われる濾過工程をさらに備える請求項２２に記載の方法。
【請求項５２】
前記濾過工程はＤＮＡバーコードを含まない試料構成要素を除去する膜を備える請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
試料中の１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
プローブに結合した複数のオリゴヌクレオチド、特異的標的分析物の１つまたは複数の特異的結合相補体、および該特定の標的分析物のマーカーとしての機能を果たす１つまたは複数のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類または数種類の粒子複合プローブを準備する工程であって、該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部は、該ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズしている工程と；
標的分析物の存在下で該標的分析物および該粒子複合プローブの間の特異的結合相互作用を可能にして集合複合体を形成するのに有効な条件下で、該試料を該粒子複合プローブと接触させる工程と；
集合複合体形成が起こったかどうかを観察する工程とを備える方法。
【請求項５４】
前記粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を分析して異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を決定する工程とをさらに備える請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を脱ハイブリダイズして前記ＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とをさらに備える請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記集合複合体を単離する工程と；
該集合複合体を脱ハイブリダイズして前記ＤＮＡバーコードを放出するのに有効な条件下に該集合複合体を置く工程と；
該ＤＮＡバーコードを単離する工程と；
該単離されたＤＮＡバーコードを増幅させる工程と；
各ＤＮＡバーコードは試料中の特異的標的分析物の存在の指標となる異なる配列を有する１つまたは複数の増幅されたＤＮＡバーコードの存在を検出する工程とをさらに備える請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的は少なくとも２つの結合部位を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも２種類の粒子複合プローブが準備され、第１の種類のプローブは前記標的分析物上の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合プローブが準備される請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記特異的結合相補体および標的分析物は特異的結合対のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
特異的結合対のメンバーは、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、ならびに天然および合成の核酸を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記標的分析物は核酸であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、前記特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む抗体である請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的分析物はゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体は、該ゲノム配列の少なくとも一部と相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスのＤＮＡである請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記特異的結合相補体および前記標的分析物は抗体−リガンド対のメンバーである請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
第１の結合部位に加えて、前記標的分析物は第２の結合部位を含むように変更されている請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
前記粒子はナノ粒子を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項７１】
前記粒子は、金属、半導体、絶縁体または磁性のナノ粒子を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記粒子は金ナノ粒子を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記１つまたは複数のＤＮＡバーコードの存在を検出する工程は、
該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する複数のオリゴヌクレオチドが結合した基質を準備する工程と；
複数のオリゴヌクレオチドが結合したナノ粒子を準備する工程であって、該ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的な配列を有する工程と；
該ＤＮＡバーコードの少なくとも第１の部分と、該基質に結合した相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡバーコードの第２の部分と該ナノ粒子と結合したオリゴヌクレオチドのいくつかとのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、該ＤＮＡバーコード、該基質と結合したオリゴヌクレオチド、および該ナノ粒子を接触させる工程と；
検出可能な変化を観察する工程とを備える請求項５８または５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記基質は、１つまたは複数の異なる種類のＤＮＡバーコードの検出を可能にする配列で前記基質に結合した数種類のオリゴヌクレオチドを備える請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記検出可能な変化は前記基質上の暗領域の形成である請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記検出可能な変化が光学スキャナで観察される請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記検出可能な変化をもたらすために前記基質を銀染色と接触させる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＤＮＡバーコードが、前記基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、前記ＤＮＡバーコードが該基質と接触し、その後、該基質と結合した該ＤＮＡバーコードが、前記ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが該基質上のＤＮＡバーコードの配列の一部とハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触する請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＤＮＡバーコードが、前記ナノ粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、前記ＤＮＡバーコードが、該オリゴヌクレオチドが結合した該ナノ粒子と接触し、その後、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードが、該ナノ粒子と結合した該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部が該基質と結合した相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするのに有効な条件下で、該基質と接触する請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＮＡバーコードが接触工程前に増幅される請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的分析物は少なくとも２つの結合部位を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも２種類の粒子複合プローブが準備され、第１の種類のプローブは前記標的分析物の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該標的分析物の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記粒子複合プローブは、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項８４】
前記粒子複合プローブは、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備え、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項８５】
前記粒子複合プローブは、それに結合したオリゴヌクレオチドを有する粒子、１つまたは複数のＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体からなり、該粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子の役目を果たす、請求項５３に記載の方法。
【請求項８６】
複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブであって、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し；（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し；（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し；（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有する粒子複合プローブ。
【請求項８７】
少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブであって、該プローブに結合した第１の種類のオリゴヌクレオチドは、該ＤＮＡバーコードの少なくとも一部と相補的である配列を有し、該プローブに結合した第２の種類のオリゴヌクレオチドは、特異的結合相補体を有するオリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する粒子複合プローブ。
【請求項８８】
複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体を備える粒子複合プローブであって、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは該ＤＮＡバーコードの配列の少なくとも一部と相補的である配列を有し、該ＤＮＡバーコードは特異的標的分析物の識別子としての機能を果たす粒子複合プローブ。
【請求項８９】
（ａ）ナノ粒子；
（ｂ）該ナノ粒子に結合した特異的結合対のメンバー；
（ｃ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；
（ｄ）既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備え、
各ＤＮＡバーコードは、該少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズしている検出プローブ。
【請求項９０】
前記粒子はナノ粒子を含む請求項８６から８８のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９１】
前記ナノ粒子は、金属、半導体、絶縁体または磁性のナノ粒子である請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９２】
前記粒子は金ナノ粒子である請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９３】
前記標的は少なくとも２つの結合部位を有する請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９４】
少なくとも２種類の粒子複合プローブが提供され、第１の種類のプローブは前記標的分析物上の第１の結合部位に対する特異的結合相補体を有し、第２の種類のプローブは該プローブ上の第２の結合部位に対する特異的結合相補体を有する請求項９３に記載のプローブ。
【請求項９５】
前記標的分析物上の異なる結合部位に対する特異的結合相補体を有する複数の粒子複合プローブが提供される請求項９３に記載のプローブ。
【請求項９６】
前記特異的結合相補体および標的分析物は特異的結合対のメンバーである請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９７】
特異的結合対のメンバーは、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質、リポ多糖体、糖タンパク質、リポ蛋白質、核蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質のホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異性エピトープを含むペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部、構成要素または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかの代謝産物または抗体を含む請求項９６に記載のプローブ。
【請求項９８】
核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、糸状菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、ならびに天然および合成の核酸を含む請求項９７に記載のプローブ。
【請求項９９】
前記標的分析物は核酸であり、前記特異的結合相補体はオリゴヌクレオチドである請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１００】
前記標的分析物はタンパク質またはハプテンであり、前記特異的結合相補体は、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体を含む抗体である請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０１】
前記標的分析物はゲノムＤＮＡ試料からの配列であり、前記特異的結合相補体は、該ゲノム配列の少なくとも一部と相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０２】
前記ゲノムＤＮＡは、真核、細菌、真菌またはウイルスのＤＮＡである請求項１００に記載のプローブ。
【請求項１０３】
前記特異的結合相補体および標的分析物は抗体−リガンド対のメンバーである請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０４】
前記第１の結合部位に加えて、前記標的分析物は第２の結合部位を含むように変更されている請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１０５】
請求項８６から８９のいずれか１項に記載のプローブを備えるキット。
【請求項１０６】
試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するためのキットであって、
各標的分析物のための少なくとも１種類の検出プローブであって、（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した特異的結合対のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）該複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有するＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類の検出プローブを含むキット。
【請求項１０７】
試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するためのキットであって、
（ｉ）基質；（ｉｉ）該基質に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える少なくとも１種類の捕獲プローブであって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーは該標的分析物の第１の結合部位と結合する捕獲プローブと；
（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１の構成メンバーであって、該標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１の構成メンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類の検出プローブを含むキット。
【請求項１０８】
前記基質は磁性粒子である請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
試料中の少なくとも２つの結合部位を有する１つまたは複数の標的分析物の有無を検出するためのキットであって、
（ｉ）磁性粒子；（ｉｉ）該磁性粒子に結合した第１の特異的結合対の第１のメンバーを備える少なくとも１種類の捕獲プローブであって、該第１の特異的結合対の第１のメンバーは該標的分析物の第１の結合部位と結合する捕獲プローブと；
（ｉ）ナノ粒子；（ｉｉ）該ナノ粒子に結合した第２の特異的結合対の第１のメンバーであって、該標的分析物の第２の結合部位と結合する第２の特異的結合対の第１のメンバー；（ｉｉｉ）該ナノ粒子に結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）特定の種類のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかと相補的である既定の配列を有する少なくとも１種類のＤＮＡバーコードを備える少なくとも１種類の検出プローブを含むキット。
【請求項１１０】
試料中の標的分析物を検出するためのキットであって、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブを含む少なくとも１つの容器を備え、該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し、該ＤＮＡバーコードは、該粒子と結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつか、および該特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、且つ検出可能な変化を観察するための任意の基質を含むキット。
【請求項１１１】
試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出するためのキットであって、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、ＤＮＡバーコード、および特異的標的分析物に対する特異的結合相補体が結合したオリゴヌクレオチドを備える粒子複合プローブを含む少なくとも１つまたは複数の容器を備え、（ｉ）該ＤＮＡバーコードは少なくとも２つの部分を有する配列を有し、（ｉｉ）該粒子と結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分と相補的な配列を有し、（ｉｉｉ）特異的結合相補体が結合した該オリゴヌクレオチドはＤＮＡバーコードの第２の部分と相補的な配列を有し、及び（ｉｖ）粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、特定の標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有し、且つ検出可能な変化を観察するための基質を任意で含むキット。
【請求項１１２】
少なくとも１組の容器および検出可能な変化を観察するための任意の基質を含む標的分析物の検出のためのキットであって、
該１組の内の第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子および少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを備える粒子プローブを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかはＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
該１組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有するキット。
【請求項１１３】
少なくとも２組以上の容器を含む、試料中の複数の標的分析物の検出のためのキットであって、
各組の内の第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子、および少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを有する粒子複合プローブを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、少なくとも２つの部分を有するＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
各組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有し、
該粒子複合プローブのＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての機能を果たす異なる配列を有し、且つ検出可能な変化を観察するための基質を任意で含むキット。
【請求項１１４】
第１の容器および少なくとも２組以上の容器を含む、試料中の複数の標的分析物の検出のためのキットであって、
該第１の容器は、複数のオリゴヌクレオチドが結合した粒子を有する粒子複合プローブを含み；
各組の内の第１の容器は、少なくとも２つの部分の配列を有するＤＮＡバーコードを含み、該粒子に結合した複数のオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかは、該ＤＮＡバーコードの第１の部分に相補的な配列を有し；
各組の内の第２の容器は、該ＤＮＡバーコードの第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、標的分析物の特異的結合対相補体と共有結合するために使用され得る部分を有し、
各組の容器の内の第１の容器に存在するＤＮＡバーコードは、標的分析物の識別子としての機能を果たし、かつ他の組の容器のＤＮＡバーコードと異なる配列を有し、ならびに検出可能な変化を観察するための基質を任意で含むキット。
【請求項１１５】
前記ＤＮＡバーコードは、特異的標的分析物の存在の識別子としての機能を果たすオリゴヌクレオチド配列を備える請求項１０６に記載のキット。
【請求項１１６】
前記特異的標的分析物は抗体である請求項１０６に記載のキット。
【請求項１１７】
前記特異的結合対のメンバーは、抗体または抗原を備える請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１８】
前記特異的結合対のメンバーは、受容体またはリガンドを備える請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１９】
前記特異的結合対のメンバーは、酵素または基質を備える請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２０】
前記特異的結合対のメンバーは、薬剤または標的分子を備える請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２１】
前記特異的結合対のメンバーは、少なくとも部分的に相補的な２つのオリゴヌクレオチド鎖を備える請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２２】
前記ＤＮＡバーコードがビオチン化されている請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２３】
前記ＤＮＡバーコードが放射標識されている請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２４】
前記ＤＮＡバーコードが蛍光標識されている請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２５】
前記粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、該粒子の表面に少なくとも１０ピコモル／ｃｍ^２の密度で存在する請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２６】
前記粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、該粒子の表面に少なくとも１５ピコモル／ｃｍ^２の密度で存在する請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２７】
前記粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、該粒子の表面に少なくとも約１５ピコモル／ｃｍ^２から約４０ピコモル／ｃｍ^２の密度で存在する請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２８】
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子である、請求項１１５に記載のキット。
【請求項１２９】
前記ナノ粒子は金ナノ粒子である請求項１１５に記載のキット。
【請求項１３０】
前記半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）からなる請求項１１５に記載のキット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【公表番号】特表２００７−５２５９７０（Ｐ２００７−５２５９７０Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７６８５（Ｐ２００６−５１７６８５）
【出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０４９３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３９４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０１２１６０１２）ナノスフェアー　インコーポレイテッド (15)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥ　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】