バイオマーカーＰＬＧＦを用いてアテローム性動脈硬化負荷を決定する手段及び方法
本発明はアテローム性動脈硬化に関する診断方法を提供することに関する。具体的には、被験体の試料中のPLGF量を測定し、測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し、比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し、比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する、被験体の動脈硬化負荷を診断する方法に関する。本発明は動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法も意図する。さらに、前記方法を実施するための装置及びキットが含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアテローム性動脈硬化に関する診断方法を提供することに関する。具体的には、被験体の試料中のPLGF量を測定し、測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し、比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し、比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する、被験体の動脈硬化負荷を診断する方法に関する。本発明は動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法も意図する。さらに、前記方法を実施するための装置及びキットが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は血管の構造に影響を及ぼす心血管疾患である。それは喫煙、高脂血症、動脈性高血圧、又は糖尿病を含む様々な危険因子に左右される。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、血管の閉塞又は狭窄によって引き起こされる重い合併症を進行期に有する病理過程である。前記血管狭窄又は閉塞によって引き起こされる顕著な合併症は冠動脈疾患、特に狭心症、間欠性跛行、心筋梗塞又は脳卒中である。しかし、これらの合併症は90％以上の血管が閉塞した場合に臨床的に明らかになるに過ぎない。この場合でさえ、大抵運動中にのみ明らかになる。
【０００４】
前述の重い合併症が発症する危険性は、被験体内のアテローム性動脈硬化負荷、すなわち被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの全体量に基本的に左右される。被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの大部分は、前述の合併症のいずれも生じないことは理解されるべきである。しかし、アテローム性動脈硬化プラークの全体量が増加するにつれ、有害なプラークが発生する危険性は高まる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アテローム性動脈硬化負荷は、血管造影法を含む、負担が大きく費用がかかり、及び／又は侵襲的な技術によって現在診断される。これらの技術は調べられる患者にとって不便であり、全体的な健康管理の観点からすると時間及び費用がかかる。さらに、侵襲的血管造影法は患者に重い副作用さえ生じ得る（全てBraunwald´s Heart Disese 第7版 2005 Elevier Publishersに記載のC.J. Davidson, R.O. Bonow Cornorary catherization p 345; D. Pennell Cardiovascular Magnetic Resonance p 335; S. Achenbach, W.G. Daniel Computed tomography of the heart p. 255）。
【０００６】
信頼でき効率のよい、アテローム性動脈硬化負荷の診断を可能にし、上記に言及されるアテローム性動脈硬化の重い合併症が発症する危険性を評価する手段及び方法は、まだ得られていないが強く望まれるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の基底にある技術的な問題は、前述の要求に応じる手段及び方法を提供することだと考えられ得る。その技術的な問題は、特許請求の範囲及び以下本明細書に記述される実施形態によって解決される。
【０００８】
従って、本発明は被験体のアテローム性動脈硬化負荷を診断する方法であって、
a) 被験体の試料中のPLGF量を測定すること；並びに
b) 測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで
(i) 比が1の時、正常なアテローム性動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、アテローム性動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、アテローム性動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法はin vitro法であることが好ましい。さらに、上記に明確に記述された段階の他に段階を含み得る。例えば、さらなる段階は試料の前処理又は本方法によって得られた結果の評価に関し得る。本発明の方法はまた、被験体の観察、確認、及び下位分類のためにも使用され得る。本方法は手作業で実施されてよく、又は自動化によって補助されてよい。好ましくは、段階(a)及び／又は(b)は、全体的又は部分的に自動化によって、例えば、段階(a)の測定又は段階(b)のコンピューターによって実行される計算のために適したロボット感覚装置によって補助されてよい。
【００１０】
本明細書で使用される「診断する」という用語は、被験体においてアテローム性動脈硬化負荷を評価することを意味する。当業者によって理解されるように、そのような評価は通常、調べる全て（すなわち100％）の被験体にとって正確であることを意図しない。しかし、その用語は被験体の統計的に有意な一部を同定することができることを要する（例えばコホート調査におけるコホート）。一部が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計評価手段、例えば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン-ホイットニー検定等を用いて、当業者によって造作なく決定され得る。詳細はDowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%である。p値は0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001であることが好ましい。集団の被験体の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が、本発明の方法によって適切に評価され得ることがより好ましい。
【００１１】
「アテローム性動脈硬化負荷」という用語は、被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの全体量、すなわち前記被験体の全血管系に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの量に関係する。アテローム性動脈硬化負荷の結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症の危険性を診断できることが好ましい。この文脈における動脈硬化負荷の増加が、狭心症、間欠性跛行又は脳卒中を発症する危険性の増加をさらに示唆することがより好ましい。
【００１２】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは人に関する。
【００１３】
「試料」という用語は、体液の試料、分離した細胞の試料、又は組織若しくは器官に由来する試料を指す。体液の試料は周知技術によって得ることができ、血液、血漿、血清、又は尿の試料を含むことが好ましく、血液、血漿又は血清の試料を含むことがより好ましい。組織又は器官試料は、例えば生検によって、任意の組織又は器官から得てよい。分離した細胞は、遠心又は細胞選別等の分離技術によって体液又は組織若しくは器官から得てよい。細胞、組織又は器官試料は、本明細書で言及されるペプチドを発現又は生成する細胞、組織又は器官から得ることが好ましい。
【００１４】
本明細書で使用される「PlGF（胎盤増殖因子）」という用語は、149アミノ酸長のポリペプチドであり、ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）の血小板由来増殖因子様領域に高度に相同（53%同一）である胎盤由来増殖因子を指す。VEGFと同様、PlGFはin vitro及びin vivoで血管形成活性を有する。例えば、トランスフェクトされたCOS-1細胞に由来するPlGFの生化学的及び機能的特性評価によって、PlGFは、in vitroで内皮細胞増殖を促進する能力のあるグリコシル化二量体分泌タンパク質であることが明らかとなった（Maqlione1993, Oncogene 8(4):925-31）。PlGFはヒトPlGFを指すことが好ましく、Genebankアクセション番号P49763、GI: 17380553に示されるアミノ酸配列を有するヒトPlGFを指すことがより好ましい（GenebankはNCBI、米国からwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrezで利用できる）。そのようなバリアントは、該特定のPLGFポリペプチドと少なくとも同じ基本的な生物学的及び免疫学的特性を有する。特に、本明細書で言及される同じ特異的なアッセイによって、例えば前記PLGFポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いたELISAアッセイによって検出される場合は、それらは同じ基本的な生物学的及び免疫学的特性を共有する。好ましいアッセイを下記の実施例に記述する。さらに、本発明に従って言及されるバリアントは、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠損及び／又は付加のために異なるアミノ酸配列であって、そのバリアントのアミノ酸配列が依然として該特定のPLGFポリペプチドのアミノ配列に好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を有するはずであることは理解されるべきである。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は当技術分野で周知なアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウインドウ中のアミノ酸配列のフラグメントが最適なアラインメントにおいて参照配列（付加又は欠損を含まない）と比較すると付加又は欠損（例えばギャップ又はオーバーハング）を含み得る、2つの最適にアラインされ
た配列を比較ウインドウに渡って比較することによって決定されるべきである。パーセンテージは以下によって計算される：両配列に同一アミノ酸残基が出現する位置数を決定し、一致した位置数を得て、一致した位置数を比較ウインドウ中の総位置数で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、及びTFASTA）によって、又は目視検査によって実行され得る。2つの配列が比較のために同定されたら、それらの最適なアラインメント、及びそこから同一性の程度を決定するためにGAP及びBESTFITを用いることが好ましい。ギャップウェイト（gap weight）に5.00及びギャップウェイトレングス（gap weight length）に0.30のデフォルト値を用いることが好ましい。上記に言及されるバリアントは対立遺伝子多型又は他の種に特異的なホモログ、パラログ、若しくはオルソログであってよい。さらに、フラグメントが上記に言及される基本的な免疫学的及び生物学的特性を有する限り、本明細書で言及されるバリアントは該特定のPLGFポリペプチド又は前述した種類のバリアントのフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、例えばPLGFポリペプチドの分解産物又はスプライスバリアントであってよい。リン酸化又はミリスチル化等の翻訳後修飾のために異なるバリアントがさらに含まれる。
【００１５】
本明細書で言及されるポリペプチド（すなわちPLGF）量の測定は、好ましくは半定量的又は定量的に、量又は濃度を測定することに関する。測定は直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、ペプチド又はポリペプチドそれ自体から得られ、その強度が試料中に存在するペプチドの分子数に直接相関するシグナルに基づいて、ペプチド又はポリペプチドの量又は濃度を測定することに関する。そのようなシグナル−時々本明細書で強度シグナルと言われる−は、例えばペプチド又はポリペプチドの特異的な物理的又は化学的特性の強度値を測定することによって得られてよい。間接的な測定は、二次的要素（すなわちペプチド若しくはポリペプチドそれ自体ではない要素）から得られるシグナル、又は生物学的読み出し系（biological read out system）、例えば測定できる細胞性応答、リガンド、標識、若しくは酵素反応生成物の測定を含む。
【００１６】
本発明に従って、ポリペプチド量の測定は、試料中のペプチドの量を測定するあらゆる周知な手段によって達成され得る。前記手段は、様々なサンドイッチ、競合、又はその他のアッセイ形式において標識された分子を利用し得る免疫アッセイ装置及び方法を含む。前記アッセイは、ポリペプチドの存在又は不在を示すシグナルを生じる。さらに、シグナル強度は試料中に存在するポリペプチドの量に直接的に又は間接的に（例えば反比例して）相関し得ることが好ましい。さらなる適した方法は、正確な分子量又はNMRスペクトル等の、ポリペプチドに特異的な物理的又は化学的特性を測定することを含む。前記方法は、バイオセンサー、免疫アッセイと連関した光学装置、バイオチップ、質量分析装置、NMR解析装置、又はクロマトグラフィー装置等の分析装置を含むことが好ましい。さらに、方法は、マイクロプレートELISAを基にした方法、完全自動化又はロボットによる免疫アッセイ（例えばElecsysTM分析計で利用できる）、CBA（酵素的Cobalt Binding Assay、例えばRoche-HitachiTM分析計で利用できる）、及びラテックス凝集アッセイ（例えばRoche-HitachiTM分析計で利用できる）を含む。
【００１７】
ポリペプチド量の測定は、(a) 強度がポリペプチドの量を示唆する細胞性応答を誘発することができる細胞を、前記ペプチド又はポリペプチドと十分な時間接触させる段階、(b) 細胞性応答を測定する段階、を含むことが好ましい。細胞性応答を測定するためには、試料又は処理した試料を細胞培養に添加し、内部又は外部の細胞性応答を測定することが好ましい。細胞性応答は、レポーター遺伝子の測定可能な発現、又は例えばペプチド、別のポリペプチド、若しくは小分子等の物質の分泌を含み得る。その発現又は物質はポリペプチドの量に相関のある強度シグナルを発生させる。
【００１８】
また、ポリペプチド量の測定は、試料中のポリペプチドから得られる特異的な強度シグナルを測定する段階を含むことが好ましい。上記に記述されるように、そのようなシグナルは、マススペクトルで観察されるポリペプチドに特異的な質量対電荷（m/z）変数において、又はペプチド若しくはポリペプチドに特異的なNMRスペクトルにおいて見られるシグナル強度であってよい。
【００１９】
ポリペプチド量の測定は、(a) ポリペプチドを特異的なリガンドと接触させる段階、(b)（任意で）非結合リガンドを除去する段階、(c) 結合したリガンドの量を測定する段階、を含み得ることが好ましい。結合したリガンドは強度シグナルを発生させる。本発明に係る結合は共有結合及び非共有結合の両方を含む。本発明に係るリガンドは、本明細書に記述されるポリペプチドに結合する任意の化合物、例えばペプチド、別のポリペプチド、核酸、又は小分子であり得る。好ましいリガンドは、抗体、核酸、ポリペプチドに対する受容体若しくは結合パートナー及びペプチドに対する結合ドメインを含むそれらのフラグメント等のポリペプチド、並びにアプタマー、例えば核酸若しくはペプチドアプタマーを含む。そのようなリガンドを調製する方法は当技術分野で周知である。例えば、適した抗体又はアプタマーの同定及び生成は民間の業者によっても提供される。当業者は、そのようなリガンドの、より高い親和性又は特異性を有する誘導体を開発する方法に精通している。例えば、ランダム変異を核酸、ペプチド又はポリペプチドに導入することができる。次いで、これらの誘導体について、当技術分野で周知なスクリーニング手法、例えばファージディスプレイに従って結合試験を行うことができる。本明細書で言及される抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル両抗体、並びに抗原若しくはハプテンに結合することができるFv、Fab及びF(ab)2フラグメント等の抗体フラグメントを含む。本発明は、一本鎖抗体、並びに所望の抗原特異性を呈する非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と結合されたヒト化ハイブリッド抗体も含む。ドナー配列は通常、少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、同様に、その他の構造的及び／又は機能的に関連のある、ドナー抗体のアミノ酸残基を含んでよい。そのようなハイブリッドは当技術分野で周知ないくつかの方法によって調製され得る。リガンド又は薬剤がペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。本発明に係る特異的な結合は、リガンド又は薬剤が、分析する試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチド又は物質に実質的に結合（「交差反応」）すべきでないことを意味する。好ましくは、特異的に結合されるペプチド又はポリペプチドは、他の関連するペプチド又はポリペプチドより少なくとも3倍高い、より好ましくは少なくとも10倍高い、さらにより好ましくは少なくとも50倍高い親和性で結合されるべきである。非特異的な結合は、例えばウェスタンブロットにおけるサイズによって、又は試料中に比較的多量に存在することによって、明確に区別され測定され得る場合には許容され得る。リガンドの結合は、当技術分野で周知な任意の方法によって測定することができる。前記方法は半定量的又は定量的であることが好ましい。好適な方法を以下に記述する。
【００２０】
第一に、リガンドの結合は、例えばNMR又は表面プラズモン共鳴によって直接的に測定され得る。
【００２１】
第二に、リガンドが、興味のあるペプチド又はポリペプチドの酵素活性の基質としても機能する場合は、酵素反応生成物が測定され得る（例えばプロテアーゼの量は、例えばウェスタンブロットで、切断された基質の量を測定することによって測定し得る）。或いは、リガンドはそれ自体で酵素的特性を示してよく、並びに、それぞれペプチド又はポリペプチドが結合する「リガンド／ポリペプチド」複合体又はリガンドを、強度シグナルの発生によって検出を可能にする適切な基質と接触させてよい。酵素反応生成物の測定には、基質の量が飽和していることが好ましい。基質はまた、検出できる標識で反応前に標識化されてもよい。試料は基質と十分な時間接触することが好ましい。十分な時間は、検出できる、好ましくは測定できる量の生成物が生成されるのに必要な時間を指す。生成物の量を測定する代わりに、一定の（例えば検出できる）量の生成物の出現に必要な時間を測定することができる。
【００２２】
第三に、リガンドは、リガンドの検出及び測定を可能にする標識に共有結合又は非共有結合で結合され得る。標識化は直接的又は間接的な方法によって行われ得る。直接的な標識化は、標識の直接的な（共有結合又は非共有結合的）リガンドへの結合を含む。間接的な標識化は、二次リガンドの一次リガンドへの（共有結合又は非共有結合的）結合を含む。二次リガンドは一次リガンドへ特異的に結合すべきである。前記二次リガンドは適切な標識と結合されてよく、及び／又は二次リガンドに結合する三次リガンドの標的であってよい。二次、三次又はより高次なリガンドは、シグナルを増強するためにしばしば使用される。適切な二次及びより高次なリガンドは抗体、二次抗体、及び周知なストレプトアビジン-ビオチン系（Vector Laboratories, Inc.）を含み得る。リガンド又は基質はまた、当技術分野で周知な1つ以上のタグで「タグ化」されてもよい。次いで、そのようなタグはより高次なリガンドの標的であってよい。適切なタグは、ビオチン、ジゴキシゲニン、His-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG、GFP、myc-タグ、インフルエンザAウイルス・ヘマグルチニン（HA）、マルトース結合タンパク質等を含む。ペプチド又はポリペプチドの場合に、タグはN末端及び／又はC末端にあることが好ましい。適切な標識は、適当な検出法によって検出できる任意の標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁気標識（「例えば磁気ビーズ」、常磁性及び超常磁性標識を含む）、並びに蛍光標識が含まれる。酵素的に活性な標識は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びそれらの誘導体を含む。検出に適した基質は、ジ-アミノ-ベンジジン（DAB）、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、Roche Diagnosticsから既成のストック溶液として入手できる）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences）、ECFTM（Amersham Biosciences）を含む。適切な酵素−基質の組み合わせは、当技術分野で周知な方法によって（例えば感光膜又は適切なカメラシステムを用いて）測定することができる、色のついた反応生成物、蛍光又は化学発光を生じ得る。酵素反応の測定については、上記基準が同様に適用される。典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（GFP及びその誘導体等）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、並びにAlexa染料（例えばAlexa 568）が含まれる。さらなる蛍光標識は、例えばMolecular Probes（Oregon）から入手できる。また、量子ドットの蛍光標識としての使用も意図される。典型的な放射性標識には35S、125I、32P、33P等が含まれる。放射性標識は、周知で適切な任意の方法、例えば感光膜又はホスホイメージャーによって検出することができる。本発明に係る適切な測定方法は、沈降（特に免疫沈降）、電気化学発光(電気によって発生する化学発光）、RIA（放射免疫測定法）、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法（ECLIA）、解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、比濁法（turbidimetry）、比濁分析法（nephelometry）、ラテックス増強比濁法若しくは比濁分析法、又は固相免疫試験も含む。当技術分野で周知なさらなる方法（ゲル電気泳動、2Dゲル電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、及び質量分析法等）が、単独で又は標識化若しくは上記に記述される他の検出法と組み合わせて使用され得る。
【００２３】
また好ましくは、ポリペプチド量は以下のように測定され得る：(a) 上記に記述されるポリペプチドに対するリガンドを含む固形担体を、ポリペプチドを含む試料と接触させる段階、及び(b) 担体に結合するポリペプチド量を測定する段階。好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びアプタマーからなる群より選択されるリガンドが、固定化された形で固形担体に存在することが好ましい。固形担体を製造するための材料は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンのチップ及び表面、ニトロセルロース片、メンブレン、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレイのウェル及び壁、プラスチックチューブ等を含む。リガンド又は薬剤は多くの様々な担体と結合し得る。周知な担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的に応じて、担体の性質は可溶性又は不溶性のいずれかであり得る。前記リガンドを定着／固定化するための適切な方法は周知であり、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等を含むがこれに限定されない。本発明に係るアレイとして「懸濁アレイ」を使用することも意図される（Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12）。そのような懸濁アレイでは、担体、例えばマイクロビーズ又はマイクロスフェアが懸濁液中に存在する。該アレイは、様々なマイクロビーズ又はマイクロスフェアから、場合により標識され様々なリガンドを含むものから構成される。そのようなアレイの作製方法は、例えば固相化学及び光解離性保護基に基づいて、一般的に知られている（米国特許第5,744,305号）。
【００２４】
本明細書で使用される「量」という用語には、ポリペプチドの絶対量、前記ポリペプチドの相対量又は濃度、並びにそれらと相関のある、又はそれらに由来し得る任意の値又はパラメーターが含まれる。そのような値又はパラメーターは、前記ペプチドから直接的な測定によって得られるあらゆる特異的な物理的又は化学的特性に由来する強度シグナル値、例えばマススペクトル又はNMRスペクトルにおける強度値を含む。さらに、本明細書の他の部分に記述される間接的な測定によって得られるあらゆる値又はパラメーター、例えば、ペプチドに応答して生物学的読み出し系から測定される応答レベル、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナルが含まれる。前述の量又はパラメーターに相関のある値は、あらゆる標準的な数学的手法によっても得られ得ることは理解されるべきである。
【００２５】
被験体の集団におけるPLGFの生理的な量が統計的に変動することは理解されるべきである。従って、前記集団はある範囲に渡るPLGF量を示す。本明細書で使用される「正常上限（upper limit of normal）」又は「ULN」という用語は、外見上健康な被験体の集団において見られるPLGFの平均上限量を意味するPLGF量を指す。該被験体は調べられる被験体と同一種であることが好ましく、同一民族背景であることがさらに好ましい。ULNの決定方法は当技術分野で周知であり、既に様々なポリペプチドについて実施されてきた。特に、ULNの適切な範囲は25〜75パーセンタイル値に見出される量に由来し得る。前記PLGFのULNは7〜10 pg/mlであることがより好ましく、8 pg/mlであることが最も好ましい。ULNが統計によって変動し得ることは理解されるだろう。従って、標準偏差内のULN量の変動も考慮に入れるべきである。
【００２６】
本明細書で使用される「計算する」という用語は、被験体の試料において測定されたPLGF量とULNとの比を算定することを指す。試料において測定されたPLGF量がULNより大きい場合、比は1より大きい。測定されたPLGF量がULNより小さい場合、比は1より小さい。試料において測定されたPLGF量がULNと同じ場合、比は1である。さらに、比が1であることは、アテローム性動脈硬化負荷が正常であり、従ってアテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性が正常であることを示す、ということは理解されるべきである。比が1より小さいことは、アテローム性動脈硬化負荷の減少、そして結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性の減少を示す。比が1より大きいことは、アテローム性動脈硬化負荷の増加、そしてその結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性の増加を示す。
【００２７】
有利なことに、PLGFは、被験体におけるアテローム性動脈硬化負荷、そして従って、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症、好ましくは狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を含む冠動脈性心疾患が発症する危険性を評価するために適したマーカーであることが、本発明に従って見出された。従って、重い副作用を伴う可能性のある血管造影法等の費用及び時間がかかるモニター技術を用いる代わりに、本発明の方法は、アテローム性動脈硬化負荷の、速く、信頼でき、費用効率の良い、安全な評価を可能にする。原則として、被験体において動脈硬化負荷を診断するため、並びに被験体が狭心症、間欠性跛行、若しくは脳卒中を発症する危険性の増加を有するかどうかを予測するために、PLGFが有利に使用され得ることが見出された。PLGFに加えて、本発明の方法においてさらなるバイオマーカーが測定され得ることは理解されるべきである。具体的には、心臓血管との潜在的な関わりについてアテローム性動脈硬化負荷をさらに評価するために、心臓トロポニン、好ましくはトロポニンT若しくはI、並びにナトリウム利尿ペプチド、好ましくはNT-proBNPが測定され得る。血管新生状態の促進を示唆するバイオマーカー、好ましくはエンドグリン、可溶性Flt-1を測定することによって、被験体の血管新生状態も考慮に入れられ得る。
【００２８】
上記用語の定義及び説明は、変更すべき所は変更して、以下に言及される好ましい方法、装置及びキットに適用する。
【００２９】
本発明はさらに、前述の方法の段階並びに動脈硬化負荷の増加に基づいて動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定するさらなる段階を含む、動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法に関する。
【００３０】
「動脈硬化の予防又は治療」という用語は、薬を基にした治療、並びに栄養面での食習慣又は生活様式の提案を指す。好ましい治療は、高血圧に対する薬、脂質低下薬、好ましくはスタチン、アスピリン、ベータ-ブロッカー、ACE阻害剤、抗凝固薬、エストロゲン補充、糖尿病に対する薬である。生活様式の提案は喫煙、体重及び運動における提案を含む。
【００３１】
本発明は被験体の動脈硬化負荷を診断するための装置であって：
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記装置にも関する。
【００３２】
本明細書で使用される「装置」という用語は、予測を可能にするように互いに機能的に連結した前記手段を少なくとも含む手段のシステムに関する。PLGFポリペプチドの量を測定する好ましい手段、及び計算を実行する手段は、本発明の方法と関連して上記に開示される。機能するように手段を連結させる方法は、装置に含まれる手段の種類に依存するだろう。例えば、ポリペプチドの量を自動的に測定する手段が利用される場合、前記自動的に機能する手段によって得られたデータは、所望の結果を得るために、例えばコンピュータープログラムによって処理され得る。そのような場合には、手段は単一の装置で構成されることが好ましい。従って前記装置は、用いた試料中におけるポリペプチド量の測定のための分析ユニット、並びに結果として得られたデータを評価のために処理するコンピューターユニットを含み得る。コンピューターユニットは、本明細書の他の部分で挙げられる、保存されたULN参照量又はその値を含むデータベース、並びに測定されたポリペプチド量とデータベースの保存されたULN参照量との比の計算を実行するための、コンピューターによって実行されるアルゴリズムを含むことが好ましい。本明細書で使用される「コンピューターで実行される」とはコンピューターユニットに実際に含まれる、コンピューターが読めるプログラムコードを指す。当業者は造作なく、手段を連結させる方法を理解するであろう。好ましい装置は、専門的な臨床医の特別な知識なしで作動させることができるものであり、例えば試料の投入しか必要としない電子装置である。臨床医の解釈を必要とする生データの出力として結果が与えられてもよい。しかし、装置の出力は、その解釈に臨床医を必要としない処理された、すなわち評価された生データであることが好ましい。さらに好ましい装置は、分析ユニット／装置（例えばバイオセンサー、アレイ、ポリペプチドを特異的に認識するリガンドに結合された固体担体、プラズモン表面共鳴装置、NMR分析装置、質量分析装置等）及び／又は本発明の方法に従い上記に言及される評価ユニット/装置を含む。
【００３３】
最後に、本発明は前述の方法を実施するのに適したキットであって
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記キットに関する。
【００３４】
本明細書で使用される「キット」という用語は、前述の手段の集合を指し、別々に又は単一容器内で提供されることが好ましい。キットの成分は別々のバイアルで（すなわち別の部分のキットとして）構成され得るか、又は単一バイアルで提供され得る。さらに、本発明のキットは本明細書で上記に言及される方法を実践するために使用されるべきであることは、理解されるべきである。好ましくは、全ての成分は、上記に言及される方法を実践するためにすぐ使える様式で提供されることが予想される。さらに、キットは前記方法を実施するための説明を含むことが好ましい。説明は、紙又は電子形式でユーザー用マニュアルによって提供され得る。例えば、マニュアルは、本発明のキットを用いて前述の方法を実施する際に得られた結果を解釈するための説明を含み得る。
【００３５】
本明細書に引用される全ての参考文献は、全体の開示内容及び本明細書で特に述べられた開示内容に関して、参照により本明細書に援用される。
【００３６】
以下の実施例は本発明を説明するだけのものである。決して、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
アテローム性動脈硬化に随伴する合併症を患っている患者におけるPLGFの測定
安定型冠動脈疾患を患っている296人の患者、末梢動脈閉塞性疾患を患っている51人の患者、並びに臨床的に健康な149人の患者を、血管形成バイオマーカーPLGF、可溶性(s)Flt-1、エンドグリン並びに器官特異的バイオマーカーNT-proBNP及びトロポニンT（感度試験）の血漿レベルについて分析した。
【００３８】
PlGF、sFLT1及びエンドグリンの血漿レベルをR & D Systems、米国から市販の免疫アッセイ「Quantikine」（カタログ番号DVR100B、DPG00及びDNDG00）を用いて測定した。NT-proBNP及び高感度トロポニンTの血漿レベルを、対応する市販のElecsysTMアッセイ（Roche Diagnostics）によって検出した。
【００３９】
PLGFはアテローム性動脈硬化負荷と相関があることが見出された。最も高いPLGF量は、高いアテローム性動脈硬化負荷を有するかなり進行性のアテローム性動脈硬化を示唆する末梢動脈閉塞性疾患を患っている患者に見出された。安定型冠動脈疾患は通常、より進行性の低いアテローム性動脈硬化から生じるが、従って、より低いアテローム性動脈硬化負荷を示す。これらの患者はやや低いPLGF量を示した。生理的なPLGF量は最も低い量であり、臨床的に健康な対照被験体に見出される。結果を以下の表にまとめて示す。
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアテローム性動脈硬化に関する診断方法を提供することに関する。具体的には、被験体の試料中のPLGF量を測定し、測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し、比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し、比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する、被験体の動脈硬化負荷を診断する方法に関する。本発明は動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法も意図する。さらに、前記方法を実施するための装置及びキットが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は血管の構造に影響を及ぼす心血管疾患である。それは喫煙、高脂血症、動脈性高血圧、又は糖尿病を含む様々な危険因子に左右される。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、血管の閉塞又は狭窄によって引き起こされる重い合併症を進行期に有する病理過程である。前記血管狭窄又は閉塞によって引き起こされる顕著な合併症は冠動脈疾患、特に狭心症、間欠性跛行、心筋梗塞又は脳卒中である。しかし、これらの合併症は90％以上の血管が閉塞した場合に臨床的に明らかになるに過ぎない。この場合でさえ、大抵運動中にのみ明らかになる。
【０００４】
前述の重い合併症が発症する危険性は、被験体内のアテローム性動脈硬化負荷、すなわち被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの全体量に基本的に左右される。被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの大部分は、前述の合併症のいずれも生じないことは理解されるべきである。しかし、アテローム性動脈硬化プラークの全体量が増加するにつれ、有害なプラークが発生する危険性は高まる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アテローム性動脈硬化負荷は、血管造影法を含む、負担が大きく費用がかかり、及び／又は侵襲的な技術によって現在診断される。これらの技術は調べられる患者にとって不便であり、全体的な健康管理の観点からすると時間及び費用がかかる。さらに、侵襲的血管造影法は患者に重い副作用さえ生じ得る（全てBraunwald´s Heart Disese 第7版 2005 Elevier Publishersに記載のC.J. Davidson, R.O. Bonow Cornorary catherization p 345; D. Pennell Cardiovascular Magnetic Resonance p 335; S. Achenbach, W.G. Daniel Computed tomography of the heart p. 255）。
【０００６】
信頼でき効率のよい、アテローム性動脈硬化負荷の診断を可能にし、上記に言及されるアテローム性動脈硬化の重い合併症が発症する危険性を評価する手段及び方法は、まだ得られていないが強く望まれるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の基底にある技術的な問題は、前述の要求に応じる手段及び方法を提供することだと考えられ得る。その技術的な問題は、特許請求の範囲及び以下本明細書に記述される実施形態によって解決される。
【０００８】
従って、本発明は被験体のアテローム性動脈硬化負荷を診断する方法であって、
a) 被験体の試料中のPLGF量を測定すること；並びに
b) 測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで
(i) 比が1の時、正常なアテローム性動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、アテローム性動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、アテローム性動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の方法はin vitro法であることが好ましい。さらに、上記に明確に記述された段階の他に段階を含み得る。例えば、さらなる段階は試料の前処理又は本方法によって得られた結果の評価に関し得る。本発明の方法はまた、被験体の観察、確認、及び下位分類のためにも使用され得る。本方法は手作業で実施されてよく、又は自動化によって補助されてよい。好ましくは、段階(a)及び／又は(b)は、全体的又は部分的に自動化によって、例えば、段階(a)の測定又は段階(b)のコンピューターによって実行される計算のために適したロボット感覚装置によって補助されてよい。
【００１０】
本明細書で使用される「診断する」という用語は、被験体においてアテローム性動脈硬化負荷を評価することを意味する。当業者によって理解されるように、そのような評価は通常、調べる全て（すなわち100％）の被験体にとって正確であることを意図しない。しかし、その用語は被験体の統計的に有意な一部を同定することができることを要する（例えばコホート調査におけるコホート）。一部が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計評価手段、例えば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン-ホイットニー検定等を用いて、当業者によって造作なく決定され得る。詳細はDowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%である。p値は0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001であることが好ましい。集団の被験体の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が、本発明の方法によって適切に評価され得ることがより好ましい。
【００１１】
「アテローム性動脈硬化負荷」という用語は、被験体に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの全体量、すなわち前記被験体の全血管系に見出されるアテローム性動脈硬化プラークの量に関係する。アテローム性動脈硬化負荷の結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症の危険性を診断できることが好ましい。この文脈における動脈硬化負荷の増加が、狭心症、間欠性跛行又は脳卒中を発症する危険性の増加をさらに示唆することがより好ましい。
【００１２】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは人に関する。
【００１３】
「試料」という用語は、体液の試料、分離した細胞の試料、又は組織若しくは器官に由来する試料を指す。体液の試料は周知技術によって得ることができ、血液、血漿、血清、又は尿の試料を含むことが好ましく、血液、血漿又は血清の試料を含むことがより好ましい。組織又は器官試料は、例えば生検によって、任意の組織又は器官から得てよい。分離した細胞は、遠心又は細胞選別等の分離技術によって体液又は組織若しくは器官から得てよい。細胞、組織又は器官試料は、本明細書で言及されるペプチドを発現又は生成する細胞、組織又は器官から得ることが好ましい。
【００１４】
本明細書で使用される「PlGF（胎盤増殖因子）」という用語は、149アミノ酸長のポリペプチドであり、ヒト血管内皮増殖因子（VEGF）の血小板由来増殖因子様領域に高度に相同（53%同一）である胎盤由来増殖因子を指す。VEGFと同様、PlGFはin vitro及びin vivoで血管形成活性を有する。例えば、トランスフェクトされたCOS-1細胞に由来するPlGFの生化学的及び機能的特性評価によって、PlGFは、in vitroで内皮細胞増殖を促進する能力のあるグリコシル化二量体分泌タンパク質であることが明らかとなった（Maqlione1993, Oncogene 8(4):925-31）。PlGFはヒトPlGFを指すことが好ましく、Genebankアクセション番号P49763、GI: 17380553に示されるアミノ酸配列を有するヒトPlGFを指すことがより好ましい（GenebankはNCBI、米国からwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrezで利用できる）。そのようなバリアントは、該特定のPLGFポリペプチドと少なくとも同じ基本的な生物学的及び免疫学的特性を有する。特に、本明細書で言及される同じ特異的なアッセイによって、例えば前記PLGFポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いたELISAアッセイによって検出される場合は、それらは同じ基本的な生物学的及び免疫学的特性を共有する。好ましいアッセイを下記の実施例に記述する。さらに、本発明に従って言及されるバリアントは、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠損及び／又は付加のために異なるアミノ酸配列であって、そのバリアントのアミノ酸配列が依然として該特定のPLGFポリペプチドのアミノ配列に好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を有するはずであることは理解されるべきである。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は当技術分野で周知なアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウインドウ中のアミノ酸配列のフラグメントが最適なアラインメントにおいて参照配列（付加又は欠損を含まない）と比較すると付加又は欠損（例えばギャップ又はオーバーハング）を含み得る、2つの最適にアラインされ
た配列を比較ウインドウに渡って比較することによって決定されるべきである。パーセンテージは以下によって計算される：両配列に同一アミノ酸残基が出現する位置数を決定し、一致した位置数を得て、一致した位置数を比較ウインドウ中の総位置数で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、及びTFASTA）によって、又は目視検査によって実行され得る。2つの配列が比較のために同定されたら、それらの最適なアラインメント、及びそこから同一性の程度を決定するためにGAP及びBESTFITを用いることが好ましい。ギャップウェイト（gap weight）に5.00及びギャップウェイトレングス（gap weight length）に0.30のデフォルト値を用いることが好ましい。上記に言及されるバリアントは対立遺伝子多型又は他の種に特異的なホモログ、パラログ、若しくはオルソログであってよい。さらに、フラグメントが上記に言及される基本的な免疫学的及び生物学的特性を有する限り、本明細書で言及されるバリアントは該特定のPLGFポリペプチド又は前述した種類のバリアントのフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、例えばPLGFポリペプチドの分解産物又はスプライスバリアントであってよい。リン酸化又はミリスチル化等の翻訳後修飾のために異なるバリアントがさらに含まれる。
【００１５】
本明細書で言及されるポリペプチド（すなわちPLGF）量の測定は、好ましくは半定量的又は定量的に、量又は濃度を測定することに関する。測定は直接的又は間接的に行うことができる。直接的な測定は、ペプチド又はポリペプチドそれ自体から得られ、その強度が試料中に存在するペプチドの分子数に直接相関するシグナルに基づいて、ペプチド又はポリペプチドの量又は濃度を測定することに関する。そのようなシグナル−時々本明細書で強度シグナルと言われる−は、例えばペプチド又はポリペプチドの特異的な物理的又は化学的特性の強度値を測定することによって得られてよい。間接的な測定は、二次的要素（すなわちペプチド若しくはポリペプチドそれ自体ではない要素）から得られるシグナル、又は生物学的読み出し系（biological read out system）、例えば測定できる細胞性応答、リガンド、標識、若しくは酵素反応生成物の測定を含む。
【００１６】
本発明に従って、ポリペプチド量の測定は、試料中のペプチドの量を測定するあらゆる周知な手段によって達成され得る。前記手段は、様々なサンドイッチ、競合、又はその他のアッセイ形式において標識された分子を利用し得る免疫アッセイ装置及び方法を含む。前記アッセイは、ポリペプチドの存在又は不在を示すシグナルを生じる。さらに、シグナル強度は試料中に存在するポリペプチドの量に直接的に又は間接的に（例えば反比例して）相関し得ることが好ましい。さらなる適した方法は、正確な分子量又はNMRスペクトル等の、ポリペプチドに特異的な物理的又は化学的特性を測定することを含む。前記方法は、バイオセンサー、免疫アッセイと連関した光学装置、バイオチップ、質量分析装置、NMR解析装置、又はクロマトグラフィー装置等の分析装置を含むことが好ましい。さらに、方法は、マイクロプレートELISAを基にした方法、完全自動化又はロボットによる免疫アッセイ（例えばElecsysTM分析計で利用できる）、CBA（酵素的Cobalt Binding Assay、例えばRoche-HitachiTM分析計で利用できる）、及びラテックス凝集アッセイ（例えばRoche-HitachiTM分析計で利用できる）を含む。
【００１７】
ポリペプチド量の測定は、(a) 強度がポリペプチドの量を示唆する細胞性応答を誘発することができる細胞を、前記ペプチド又はポリペプチドと十分な時間接触させる段階、(b) 細胞性応答を測定する段階、を含むことが好ましい。細胞性応答を測定するためには、試料又は処理した試料を細胞培養に添加し、内部又は外部の細胞性応答を測定することが好ましい。細胞性応答は、レポーター遺伝子の測定可能な発現、又は例えばペプチド、別のポリペプチド、若しくは小分子等の物質の分泌を含み得る。その発現又は物質はポリペプチドの量に相関のある強度シグナルを発生させる。
【００１８】
また、ポリペプチド量の測定は、試料中のポリペプチドから得られる特異的な強度シグナルを測定する段階を含むことが好ましい。上記に記述されるように、そのようなシグナルは、マススペクトルで観察されるポリペプチドに特異的な質量対電荷（m/z）変数において、又はペプチド若しくはポリペプチドに特異的なNMRスペクトルにおいて見られるシグナル強度であってよい。
【００１９】
ポリペプチド量の測定は、(a) ポリペプチドを特異的なリガンドと接触させる段階、(b)（任意で）非結合リガンドを除去する段階、(c) 結合したリガンドの量を測定する段階、を含み得ることが好ましい。結合したリガンドは強度シグナルを発生させる。本発明に係る結合は共有結合及び非共有結合の両方を含む。本発明に係るリガンドは、本明細書に記述されるポリペプチドに結合する任意の化合物、例えばペプチド、別のポリペプチド、核酸、又は小分子であり得る。好ましいリガンドは、抗体、核酸、ポリペプチドに対する受容体若しくは結合パートナー及びペプチドに対する結合ドメインを含むそれらのフラグメント等のポリペプチド、並びにアプタマー、例えば核酸若しくはペプチドアプタマーを含む。そのようなリガンドを調製する方法は当技術分野で周知である。例えば、適した抗体又はアプタマーの同定及び生成は民間の業者によっても提供される。当業者は、そのようなリガンドの、より高い親和性又は特異性を有する誘導体を開発する方法に精通している。例えば、ランダム変異を核酸、ペプチド又はポリペプチドに導入することができる。次いで、これらの誘導体について、当技術分野で周知なスクリーニング手法、例えばファージディスプレイに従って結合試験を行うことができる。本明細書で言及される抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル両抗体、並びに抗原若しくはハプテンに結合することができるFv、Fab及びF(ab)2フラグメント等の抗体フラグメントを含む。本発明は、一本鎖抗体、並びに所望の抗原特異性を呈する非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と結合されたヒト化ハイブリッド抗体も含む。ドナー配列は通常、少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、同様に、その他の構造的及び／又は機能的に関連のある、ドナー抗体のアミノ酸残基を含んでよい。そのようなハイブリッドは当技術分野で周知ないくつかの方法によって調製され得る。リガンド又は薬剤がペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。本発明に係る特異的な結合は、リガンド又は薬剤が、分析する試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチド又は物質に実質的に結合（「交差反応」）すべきでないことを意味する。好ましくは、特異的に結合されるペプチド又はポリペプチドは、他の関連するペプチド又はポリペプチドより少なくとも3倍高い、より好ましくは少なくとも10倍高い、さらにより好ましくは少なくとも50倍高い親和性で結合されるべきである。非特異的な結合は、例えばウェスタンブロットにおけるサイズによって、又は試料中に比較的多量に存在することによって、明確に区別され測定され得る場合には許容され得る。リガンドの結合は、当技術分野で周知な任意の方法によって測定することができる。前記方法は半定量的又は定量的であることが好ましい。好適な方法を以下に記述する。
【００２０】
第一に、リガンドの結合は、例えばNMR又は表面プラズモン共鳴によって直接的に測定され得る。
【００２１】
第二に、リガンドが、興味のあるペプチド又はポリペプチドの酵素活性の基質としても機能する場合は、酵素反応生成物が測定され得る（例えばプロテアーゼの量は、例えばウェスタンブロットで、切断された基質の量を測定することによって測定し得る）。或いは、リガンドはそれ自体で酵素的特性を示してよく、並びに、それぞれペプチド又はポリペプチドが結合する「リガンド／ポリペプチド」複合体又はリガンドを、強度シグナルの発生によって検出を可能にする適切な基質と接触させてよい。酵素反応生成物の測定には、基質の量が飽和していることが好ましい。基質はまた、検出できる標識で反応前に標識化されてもよい。試料は基質と十分な時間接触することが好ましい。十分な時間は、検出できる、好ましくは測定できる量の生成物が生成されるのに必要な時間を指す。生成物の量を測定する代わりに、一定の（例えば検出できる）量の生成物の出現に必要な時間を測定することができる。
【００２２】
第三に、リガンドは、リガンドの検出及び測定を可能にする標識に共有結合又は非共有結合で結合され得る。標識化は直接的又は間接的な方法によって行われ得る。直接的な標識化は、標識の直接的な（共有結合又は非共有結合的）リガンドへの結合を含む。間接的な標識化は、二次リガンドの一次リガンドへの（共有結合又は非共有結合的）結合を含む。二次リガンドは一次リガンドへ特異的に結合すべきである。前記二次リガンドは適切な標識と結合されてよく、及び／又は二次リガンドに結合する三次リガンドの標的であってよい。二次、三次又はより高次なリガンドは、シグナルを増強するためにしばしば使用される。適切な二次及びより高次なリガンドは抗体、二次抗体、及び周知なストレプトアビジン-ビオチン系（Vector Laboratories, Inc.）を含み得る。リガンド又は基質はまた、当技術分野で周知な1つ以上のタグで「タグ化」されてもよい。次いで、そのようなタグはより高次なリガンドの標的であってよい。適切なタグは、ビオチン、ジゴキシゲニン、His-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG、GFP、myc-タグ、インフルエンザAウイルス・ヘマグルチニン（HA）、マルトース結合タンパク質等を含む。ペプチド又はポリペプチドの場合に、タグはN末端及び／又はC末端にあることが好ましい。適切な標識は、適当な検出法によって検出できる任意の標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁気標識（「例えば磁気ビーズ」、常磁性及び超常磁性標識を含む）、並びに蛍光標識が含まれる。酵素的に活性な標識は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びそれらの誘導体を含む。検出に適した基質は、ジ-アミノ-ベンジジン（DAB）、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、Roche Diagnosticsから既成のストック溶液として入手できる）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences）、ECFTM（Amersham Biosciences）を含む。適切な酵素−基質の組み合わせは、当技術分野で周知な方法によって（例えば感光膜又は適切なカメラシステムを用いて）測定することができる、色のついた反応生成物、蛍光又は化学発光を生じ得る。酵素反応の測定については、上記基準が同様に適用される。典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（GFP及びその誘導体等）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン、並びにAlexa染料（例えばAlexa 568）が含まれる。さらなる蛍光標識は、例えばMolecular Probes（Oregon）から入手できる。また、量子ドットの蛍光標識としての使用も意図される。典型的な放射性標識には35S、125I、32P、33P等が含まれる。放射性標識は、周知で適切な任意の方法、例えば感光膜又はホスホイメージャーによって検出することができる。本発明に係る適切な測定方法は、沈降（特に免疫沈降）、電気化学発光(電気によって発生する化学発光）、RIA（放射免疫測定法）、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法（ECLIA）、解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、比濁法（turbidimetry）、比濁分析法（nephelometry）、ラテックス増強比濁法若しくは比濁分析法、又は固相免疫試験も含む。当技術分野で周知なさらなる方法（ゲル電気泳動、2Dゲル電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング、及び質量分析法等）が、単独で又は標識化若しくは上記に記述される他の検出法と組み合わせて使用され得る。
【００２３】
また好ましくは、ポリペプチド量は以下のように測定され得る：(a) 上記に記述されるポリペプチドに対するリガンドを含む固形担体を、ポリペプチドを含む試料と接触させる段階、及び(b) 担体に結合するポリペプチド量を測定する段階。好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びアプタマーからなる群より選択されるリガンドが、固定化された形で固形担体に存在することが好ましい。固形担体を製造するための材料は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンのチップ及び表面、ニトロセルロース片、メンブレン、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレイのウェル及び壁、プラスチックチューブ等を含む。リガンド又は薬剤は多くの様々な担体と結合し得る。周知な担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的に応じて、担体の性質は可溶性又は不溶性のいずれかであり得る。前記リガンドを定着／固定化するための適切な方法は周知であり、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等を含むがこれに限定されない。本発明に係るアレイとして「懸濁アレイ」を使用することも意図される（Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12）。そのような懸濁アレイでは、担体、例えばマイクロビーズ又はマイクロスフェアが懸濁液中に存在する。該アレイは、様々なマイクロビーズ又はマイクロスフェアから、場合により標識され様々なリガンドを含むものから構成される。そのようなアレイの作製方法は、例えば固相化学及び光解離性保護基に基づいて、一般的に知られている（米国特許第5,744,305号）。
【００２４】
本明細書で使用される「量」という用語には、ポリペプチドの絶対量、前記ポリペプチドの相対量又は濃度、並びにそれらと相関のある、又はそれらに由来し得る任意の値又はパラメーターが含まれる。そのような値又はパラメーターは、前記ペプチドから直接的な測定によって得られるあらゆる特異的な物理的又は化学的特性に由来する強度シグナル値、例えばマススペクトル又はNMRスペクトルにおける強度値を含む。さらに、本明細書の他の部分に記述される間接的な測定によって得られるあらゆる値又はパラメーター、例えば、ペプチドに応答して生物学的読み出し系から測定される応答レベル、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナルが含まれる。前述の量又はパラメーターに相関のある値は、あらゆる標準的な数学的手法によっても得られ得ることは理解されるべきである。
【００２５】
被験体の集団におけるPLGFの生理的な量が統計的に変動することは理解されるべきである。従って、前記集団はある範囲に渡るPLGF量を示す。本明細書で使用される「正常上限（upper limit of normal）」又は「ULN」という用語は、外見上健康な被験体の集団において見られるPLGFの平均上限量を意味するPLGF量を指す。該被験体は調べられる被験体と同一種であることが好ましく、同一民族背景であることがさらに好ましい。ULNの決定方法は当技術分野で周知であり、既に様々なポリペプチドについて実施されてきた。特に、ULNの適切な範囲は25〜75パーセンタイル値に見出される量に由来し得る。前記PLGFのULNは7〜10 pg/mlであることがより好ましく、8 pg/mlであることが最も好ましい。ULNが統計によって変動し得ることは理解されるだろう。従って、標準偏差内のULN量の変動も考慮に入れるべきである。
【００２６】
本明細書で使用される「計算する」という用語は、被験体の試料において測定されたPLGF量とULNとの比を算定することを指す。試料において測定されたPLGF量がULNより大きい場合、比は1より大きい。測定されたPLGF量がULNより小さい場合、比は1より小さい。試料において測定されたPLGF量がULNと同じ場合、比は1である。さらに、比が1であることは、アテローム性動脈硬化負荷が正常であり、従ってアテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性が正常であることを示す、ということは理解されるべきである。比が1より小さいことは、アテローム性動脈硬化負荷の減少、そして結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性の減少を示す。比が1より大きいことは、アテローム性動脈硬化負荷の増加、そしてその結果として、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症が発症する危険性の増加を示す。
【００２７】
有利なことに、PLGFは、被験体におけるアテローム性動脈硬化負荷、そして従って、アテローム性動脈硬化に随伴する重い合併症、好ましくは狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を含む冠動脈性心疾患が発症する危険性を評価するために適したマーカーであることが、本発明に従って見出された。従って、重い副作用を伴う可能性のある血管造影法等の費用及び時間がかかるモニター技術を用いる代わりに、本発明の方法は、アテローム性動脈硬化負荷の、速く、信頼でき、費用効率の良い、安全な評価を可能にする。原則として、被験体において動脈硬化負荷を診断するため、並びに被験体が狭心症、間欠性跛行、若しくは脳卒中を発症する危険性の増加を有するかどうかを予測するために、PLGFが有利に使用され得ることが見出された。PLGFに加えて、本発明の方法においてさらなるバイオマーカーが測定され得ることは理解されるべきである。具体的には、心臓血管との潜在的な関わりについてアテローム性動脈硬化負荷をさらに評価するために、心臓トロポニン、好ましくはトロポニンT若しくはI、並びにナトリウム利尿ペプチド、好ましくはNT-proBNPが測定され得る。血管新生状態の促進を示唆するバイオマーカー、好ましくはエンドグリン、可溶性Flt-1を測定することによって、被験体の血管新生状態も考慮に入れられ得る。
【００２８】
上記用語の定義及び説明は、変更すべき所は変更して、以下に言及される好ましい方法、装置及びキットに適用する。
【００２９】
本発明はさらに、前述の方法の段階並びに動脈硬化負荷の増加に基づいて動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定するさらなる段階を含む、動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法に関する。
【００３０】
「動脈硬化の予防又は治療」という用語は、薬を基にした治療、並びに栄養面での食習慣又は生活様式の提案を指す。好ましい治療は、高血圧に対する薬、脂質低下薬、好ましくはスタチン、アスピリン、ベータ-ブロッカー、ACE阻害剤、抗凝固薬、エストロゲン補充、糖尿病に対する薬である。生活様式の提案は喫煙、体重及び運動における提案を含む。
【００３１】
本発明は被験体の動脈硬化負荷を診断するための装置であって：
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記装置にも関する。
【００３２】
本明細書で使用される「装置」という用語は、予測を可能にするように互いに機能的に連結した前記手段を少なくとも含む手段のシステムに関する。PLGFポリペプチドの量を測定する好ましい手段、及び計算を実行する手段は、本発明の方法と関連して上記に開示される。機能するように手段を連結させる方法は、装置に含まれる手段の種類に依存するだろう。例えば、ポリペプチドの量を自動的に測定する手段が利用される場合、前記自動的に機能する手段によって得られたデータは、所望の結果を得るために、例えばコンピュータープログラムによって処理され得る。そのような場合には、手段は単一の装置で構成されることが好ましい。従って前記装置は、用いた試料中におけるポリペプチド量の測定のための分析ユニット、並びに結果として得られたデータを評価のために処理するコンピューターユニットを含み得る。コンピューターユニットは、本明細書の他の部分で挙げられる、保存されたULN参照量又はその値を含むデータベース、並びに測定されたポリペプチド量とデータベースの保存されたULN参照量との比の計算を実行するための、コンピューターによって実行されるアルゴリズムを含むことが好ましい。本明細書で使用される「コンピューターで実行される」とはコンピューターユニットに実際に含まれる、コンピューターが読めるプログラムコードを指す。当業者は造作なく、手段を連結させる方法を理解するであろう。好ましい装置は、専門的な臨床医の特別な知識なしで作動させることができるものであり、例えば試料の投入しか必要としない電子装置である。臨床医の解釈を必要とする生データの出力として結果が与えられてもよい。しかし、装置の出力は、その解釈に臨床医を必要としない処理された、すなわち評価された生データであることが好ましい。さらに好ましい装置は、分析ユニット／装置（例えばバイオセンサー、アレイ、ポリペプチドを特異的に認識するリガンドに結合された固体担体、プラズモン表面共鳴装置、NMR分析装置、質量分析装置等）及び／又は本発明の方法に従い上記に言及される評価ユニット/装置を含む。
【００３３】
最後に、本発明は前述の方法を実施するのに適したキットであって
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記キットに関する。
【００３４】
本明細書で使用される「キット」という用語は、前述の手段の集合を指し、別々に又は単一容器内で提供されることが好ましい。キットの成分は別々のバイアルで（すなわち別の部分のキットとして）構成され得るか、又は単一バイアルで提供され得る。さらに、本発明のキットは本明細書で上記に言及される方法を実践するために使用されるべきであることは、理解されるべきである。好ましくは、全ての成分は、上記に言及される方法を実践するためにすぐ使える様式で提供されることが予想される。さらに、キットは前記方法を実施するための説明を含むことが好ましい。説明は、紙又は電子形式でユーザー用マニュアルによって提供され得る。例えば、マニュアルは、本発明のキットを用いて前述の方法を実施する際に得られた結果を解釈するための説明を含み得る。
【００３５】
本明細書に引用される全ての参考文献は、全体の開示内容及び本明細書で特に述べられた開示内容に関して、参照により本明細書に援用される。
【００３６】
以下の実施例は本発明を説明するだけのものである。決して、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
アテローム性動脈硬化に随伴する合併症を患っている患者におけるPLGFの測定
安定型冠動脈疾患を患っている296人の患者、末梢動脈閉塞性疾患を患っている51人の患者、並びに臨床的に健康な149人の患者を、血管形成バイオマーカーPLGF、可溶性(s)Flt-1、エンドグリン並びに器官特異的バイオマーカーNT-proBNP及びトロポニンT（感度試験）の血漿レベルについて分析した。
【００３８】
PlGF、sFLT1及びエンドグリンの血漿レベルをR & D Systems、米国から市販の免疫アッセイ「Quantikine」（カタログ番号DVR100B、DPG00及びDNDG00）を用いて測定した。NT-proBNP及び高感度トロポニンTの血漿レベルを、対応する市販のElecsysTMアッセイ（Roche Diagnostics）によって検出した。
【００３９】
PLGFはアテローム性動脈硬化負荷と相関があることが見出された。最も高いPLGF量は、高いアテローム性動脈硬化負荷を有するかなり進行性のアテローム性動脈硬化を示唆する末梢動脈閉塞性疾患を患っている患者に見出された。安定型冠動脈疾患は通常、より進行性の低いアテローム性動脈硬化から生じるが、従って、より低いアテローム性動脈硬化負荷を示す。これらの患者はやや低いPLGF量を示した。生理的なPLGF量は最も低い量であり、臨床的に健康な対照被験体に見出される。結果を以下の表にまとめて示す。
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の動脈硬化負荷を診断する方法であって：
c) 被験体の試料中のPLGF量を測定すること；並びに
d) 測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記方法。
【請求項２】
前記PLGFの正常上限が7〜10 pg/mlである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
動脈硬化負荷の増加が、狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を発症する危険性の増加をさらに示唆する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が人である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項の方法の段階、並びに動脈硬化負荷の増加に基づいて動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定するさらなる段階を含む、動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法。
【請求項６】
被験体において動脈硬化負荷を診断するためのPLGFの使用。
【請求項７】
被験体が狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を発症する危険性の増加を有するかどうか予測するためのPLGFの使用。
【請求項８】
被験体の動脈硬化負荷を診断するための装置であって：
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記装置。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれか1項の方法を実施するのに適したキットであって、
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記キット。
【請求項１】
被験体の動脈硬化負荷を診断する方法であって：
c) 被験体の試料中のPLGF量を測定すること；並びに
d) 測定された量とPLGFの正常上限との比を計算することを含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記方法。
【請求項２】
前記PLGFの正常上限が7〜10 pg/mlである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
動脈硬化負荷の増加が、狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を発症する危険性の増加をさらに示唆する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が人である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項の方法の段階、並びに動脈硬化負荷の増加に基づいて動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定するさらなる段階を含む、動脈硬化の予防又は治療の必要な被験体を同定する方法。
【請求項６】
被験体において動脈硬化負荷を診断するためのPLGFの使用。
【請求項７】
被験体が狭心症、間欠性跛行、又は脳卒中を発症する危険性の増加を有するかどうか予測するためのPLGFの使用。
【請求項８】
被験体の動脈硬化負荷を診断するための装置であって：
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記装置。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれか1項の方法を実施するのに適したキットであって、
a) 前記被験体の試料中のPLGFを測定する手段；並びに
b) 手段a)から測定された量とPLGFの正常上限との比を計算する手段を含み、ここで
(i) 比が1の時、正常な動脈硬化負荷を示唆し；
(ii) 比が1より小さい時、動脈硬化負荷の減少を示唆し；及び
(iii) 比が1より大きい時、動脈硬化負荷の増加を示唆する
前記キット。
【公表番号】特表２０１１−５１１９４４（Ｐ２０１１−５１１９４４Ａ）
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６２９８（Ｐ２０１０−５４６２９８）
【出願日】平成２１年２月９日（２００９．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５１４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０１０３７
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月９日（２００９．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５１４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０１０３７
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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