バイオ物質の検出方法
【課題】バイオ物質の検出のためのサンドイッチ法のうち、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子に他の磁性粒子を結合させてから光学的に観察する方法を、検出領域面上にマーカーを設けることなく実施できるように改良する。
【解決手段】バイオ物質の検出のためのサンドイッチ法で、検出の対象となる抗体２を抗原で挟みこみ、一方の抗原が基板６の検出領域７に結合し、他方の抗原が第１磁性粒子１と結合した状態を作る（図４（ａ））。その後、第１磁性粒子１よりも大きな第２磁性粒子９を含む第２溶液を基板６に供給して（図４（ｂ））から磁場をかけて、第２磁性粒子９を第１磁性粒子１に結合させる（図４（ｃ））。その後、第１磁性粒子１に結合していない第２磁性粒子９を洗い流してから（図４（ｄ））、基板６の光学的な観察を行う。
【解決手段】バイオ物質の検出のためのサンドイッチ法で、検出の対象となる抗体２を抗原で挟みこみ、一方の抗原が基板６の検出領域７に結合し、他方の抗原が第１磁性粒子１と結合した状態を作る（図４（ａ））。その後、第１磁性粒子１よりも大きな第２磁性粒子９を含む第２溶液を基板６に供給して（図４（ｂ））から磁場をかけて、第２磁性粒子９を第１磁性粒子１に結合させる（図４（ｃ））。その後、第１磁性粒子１に結合していない第２磁性粒子９を洗い流してから（図４（ｄ））、基板６の光学的な観察を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ物質の検出のための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質、酵素といった生体分子の検出が、必要となる場合がある。
【０００３】
生体分子を検出する方法としては、例えば、特異性の高い生体分子反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いるＥＬＩＳＡ測定法が知られている。
しかし、この方法は、感度が不十分な場合が多く、他方、感度を高めるためには生体物質の増幅が必要となるため生体物質の検出に要する時間が長く、また、この方法は装置のコストが高い。そのため、この方法は、救急車内での緊急検査や在宅診断、学校や職場での定期検診、飛行場での検査等といった研究室、病院等の専門機関外で用いるには課題がある。
【０００４】
そこで、近年、磁性粒子を用いたバイオ物質の検出方法が注目されている。これは、検出の対象となる生体分子（以下、「バイオ物質」という。）である第１バイオ物質（例えば、抗原）とこれに特異的に結合する性質を持つバイオ物質である第２バイオ物質、及び第３バイオ物質（第２バイオ物質、及び第３バイオ物質は、例えば、抗体である。）が互いに結合することを利用するものである。
具体的には、この検出法では、まず、ポリマーで覆われた磁性粒子の表面を第２バイオ物質で修飾したものの当該第２バイオ物質を、第１バイオ物質が含まれる可能性のある溶液に投入する。もし、その溶液に第１バイオ物質が含まれれば第１バイオ物質は磁性粒子の表面を修飾する第２バイオ物質と結合する。そして、第３バイオ物質（もっとも第３バイオ物質は第２バイオ物質と同じ物である場合もあり得る。）で、その表面の少なくとも一部が修飾された検出領域面（例えば、プレパラートの表面）に、第２バイオ物質を介してその表面に第１バイオ物質が結合した上述の磁性粒子を供給し、当該磁性粒子と結合した第１バイオ物質を、検出領域面を修飾する第３バイオ物質と結合させる。これにより、第１バイオ物質は、検出領域面上で第２バイオ物質、及び第３バイオ物質とに挟まれた状態となり、検出領域面側から、検出領域面、第３バイオ物質、第１バイオ物質、第２バイオ物質、磁性粒子という並びができあがる。そして、この磁性粒子が第１バイオ物質の検出のための標識として用いられる。なお、この方法は、第１バイオ物質を第２バイオ物質、及び第３バイオ物質とで挟んだ状態を作るため、サンドイッチ法と呼ばれる場合がある。
ここで、磁性粒子を標識として用いるというのは、磁性粒子の存在を検出することにより、間接的に第１バイオ物質の検出を行うということを意味する。例えば、上述の方法を実施した後に、検出領域面上に存在する磁性粒子を、その存在によって発生する磁場、或いは電場の変化などを例えば磁気センサ、或いは電界センサを用いて検出することにより、間接的に第１バイオ物質の検出を行うという技術が知られている。
【０００５】
しかしながら、上述のような磁場、電場の変化などによる磁性粒子の検出は、磁性粒子が小さいこともあり、それほど簡単ではない。磁性粒子には、それに第２バイオ物質を介して固定された第１バイオ物質が検出領域面を修飾する第３バイオ物質と高確率で結合できるようにするための移動のし易さが必要であり、また、そのような結合が生じた後でもその結合が壊されないことが必要となるため、その径が小さいことが必要とされる。磁性粒子を修飾する第２バイオ物質と結合した第１バイオ物質と第３バイオ物質とを結合させるには両者を遭遇させないとならないが、それは磁性粒子を含む液体中の分子のブラウン運動による磁性粒子の移動によって引き起こされるため、磁性粒子は小さく、軽い方が有利である。実際、上述の磁性粒子の径は、一般的には、ｎｍのオーダーである。磁性粒子の検出における誤差は、そのまま、第１バイオ物質の検出精度を落とすことにつながるため好ましくない。
【０００６】
このような点に鑑みて、本願の発明者の一人は、以下のような発明をなした。
この発明では、上述の方法によって検出領域面に磁性粒子を固定した後、検出領域面に、多数の他の磁性粒子を含む溶液を供給する。そして、検出領域面に磁場をかけることにより、後から供給した上述の他の磁性粒子を検出領域面に固定された磁性粒子に結合させる。磁性粒子に後から供給した他の磁性粒子を結合させることにより２つの第２バイオ物質とその間の第１バイオ物質とを介して検出領域面に結合している磁性粒子は、他の磁性粒子が多数結合した場合には、それを含む大きな磁性粒子の塊（球形に近い形状に限定されず、磁性粒子が一列に配列されるような場合も含む。）を作る。そしてこの塊は、後から供給する他の磁性粒子の径を検出領域面に固定されている磁性粒子の径よりも大きくした場合には特に、一般的な顕微鏡を用いて観察することのできる程度の大きさとすることが容易なため、結果としてその存在を光学的な観察により検出できるようになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１１５５９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
光学的な観察により磁性粒子の存在を検知し、それにより第１バイオ物質の存在を確認する上述の技術は、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を、それと結合させる多数の他の磁性粒子によって、いわばその大きさについて増幅するものであるが、それに要する時間が極めて短く、また、電場或いは磁場の変化を検出するための手段を用いずに実行できるため装置も安いという利点がある。
しかし、この技術にも改良すべき点がある。
この技術における光学的な観察は、検出領域面を略垂直方向から観察することにより行われる。上述したように、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定された塊を作った他の磁性粒子は、例えば一般的な顕微鏡を用いて光学的に観察可能である。しかしながら、検出領域面上には、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子も存在する。そして、これら第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子も磁場の存在により、塊を作りうる。
つまり、この技術では、磁性粒子の塊が発見されたということが直ちには第２バイオ物質で修飾された磁性粒子が検出領域面上に固定されているということを意味せず、また、第１バイオ物質が検出されたということも意味しない。
そのような点を考慮し、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定された塊を作った他の磁性粒子と、塊を作ったものの第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子とを区別するために、第１バイオ物質と結合する第３バイオ物質が存在する位置を検出領域面上で特定するためのマーカーを検出領域面上に設けるということが行われている。
つまり、光学的な観察により、このマーカー上、或いはその近傍に磁性粒子の塊が発見された場合には、その塊を構成する磁性粒子をは第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面上に固定されていると判断できるから、そのような磁性粒子の塊が発見された場合には、それを、第１バイオ物質の検出と意味付けることができるようになる。
【０００９】
しかしながら、従来のマーカーは、検出領域面上に金を真空蒸着させるなどして作られているが、検出領域面上にマーカーを設けるのは煩雑でコストがかかる。
本発明は、以上の点に鑑みてなされたものであり、バイオ物質の検出のためのサンドイッチ法のうち、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子に他の磁性粒子を結合させてから光学的に観察する方法を、検出領域面上にマーカーを設けることなく実施できるように改良することを、その課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、上述の課題を解決するために、以下のようなバイオ物質の検出方法を提案する。
【００１１】
本発明のバイオ物質の検出方法は、以下のようなものである。
すなわち、本発明は、検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して、前記第２バイオ物質で修飾された、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子と結合しているとともに、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質を介して、前記第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面に結合している状態で実行されるバイオ物質の検出方法である。
そして、このバイオ物質の検出方法は、磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す過程と、前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、を含む。
このバイオ物質の検出方法は、光学的な観察を行う前に、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す。したがって、光学的な観察を行うことで発見される第１磁性粒子と結合した第２磁性粒子の塊は、それに含まれる第１磁性粒子を修飾する第２バイオ物質、当該第２バイオ物質と結合した第１バイオ物質、当該第１バイオ物質と結合した検出領域面を修飾する第３バイオ物質、を介して検出領域面に固定されている。つまり、このバイオ物質の検出方法で行われる光学的な観察により、第１磁性粒子と結合した第２磁性粒子の塊が発見された場合には、上述の如きマーカーがなくとも、その塊の発見を、第１バイオ物質が検出されたと意味付けることができる。
なお、本願発明では、前記第１磁性粒子よりも大きい前記第２磁性粒子を用いることができる。このようにした場合には、第２磁性粒子の塊の光学的な検出が容易になる一方で、第１バイオ物質検出に役立たないノイズとしての第２磁性粒子の塊も目立ちやすくなるので、第１バイオ物質検出のために不要な第２磁性粒子を流し去ることの意味が大きくなる。
なお、本願における第２バイオ物質と第３バイオ物質とは同じものである場合もあるし、そうでない場合もあり得る。
【００１２】
本発明のバイオ物質の検出方法は、以下のようなものとしてもよい。このバイオ物質の検出方法でも、光学的な観察により、第１磁性粒子と第２磁性粒子による塊が発見された場合には、上述の如きマーカーがなくとも、その塊の発見を、第１バイオ物質が検出されたと意味付けることができるという作用効果を得られる。
その方法は、検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、その表面を修飾する前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して結合した、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子を含む溶液である第１溶液を、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面上に供給する過程と、前記第１磁性粒子を修飾する前記第３バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第２バイオ物質と結合させる過程と、磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程と、前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、を含む、バイオ物質の検出方法である。
なお、この方法の場合には、前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる前記過程の後に、その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が、前記第１検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程、を行ってもよい。
このようにすると、その表面を修飾する第２バイオ物質に結合した第１バイオ物質が検出領域面上を修飾する第３バイオ物質に結合していない第１磁性粒子、換言すれば検出領域面に固定されていない第１磁性粒子も光学的な観察を行うときには存在しなくなっているので、光学的な観察を更に行い易くなる。
【００１３】
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程は、どのようにして行ってもよい。例えば、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することによりこれを行うことができる。
その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が前記第１磁性粒子を修飾した前記第２バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程も同様に、例えば、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することによりを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態で用いる第１磁性粒子を抗体で修飾した状態を示す図。
【図２】前処理溶液に図１で示した第１磁性粒子を供給した後の処理を示す図。
【図３】抗原と抗体を介して結合した第１磁性粒子を基板の上に供給した状態を示す図。
【図４】本発明の実施形態に係る状態保存方法を説明するための図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
この実施形態のバイオ物質の検出方法では、本発明の第１バイオ物質にあたる適当な抗原を検出対象とし、これを、サンドイッチ法を用いて検出することとする。この実施形態のサンドイッチ法では、抗原を挟む本発明の第２バイオ物質、及び第３バイオ物質としてともに、当該抗原と特異的に結合する性質を有する抗体を用いることとする。また、この実施形態のバイオ物質の検出は、光学的な観察によるものとする。
なお、抗体と抗原は互いに入れ替えても構わないし、第１バイオ物質と、第２バイオ物質及び第３バイオ物質は、それらが互いに特異的に結合するものである限り、抗体、抗原の一方と他方である必要もない。
【００１７】
この実施形態では、まず、図１に示したように、第１磁性粒子１の表面に、抗体２Ａを修飾する。
第１磁性粒子１は、それに固定される本発明でいう第２バイオ物質（この実施形態では抗体２Ａ）に対して相対的に大き過ぎない程度の大きさのものとするのが好ましい。例えば単分子ＤＮＡに相当する程度の大きさ、具体的には粒径１００ｎｍ以下のものが利用可能である。この程度の大きさとすることで、第１磁性粒子１と抗体２Ａとの大きさの差異が大きくならないから、これらの結合が容易となり、また第１磁性粒子１の移動も生じやすくなる。つまり、第１磁性粒子１よりも大きいマイクロサイズの磁性粒子と比較して、ナノサイズの第１磁性粒子１は、バイオ物質との反応効率がよく、サンドイッチ法への応用に向いている。
第１磁性粒子１に用いることのできる磁性粒子は、公知であり、市販もされているのでそれを利用することができる。この実施形態における第１磁性粒子１は、必ずしもこの限りではないが、本体３を備えており、その表面を官能基を持つ物質によるレイヤー層４で覆った構造となっている。レイヤー層４に含まれる官能基は、上述の抗体２Ａと結合させるために用いられる。本体３の中には、第１磁性粒子１を磁性粒子として機能させるためのマグネタイト５が含まれている。マグネタイト５は、小さな磁界を与えるだけで大きく磁化され、また、磁界が消えた場合の残留磁化が小さい方が好ましく、この点を考慮して、超常磁性の性質を持つものを用いるのが好ましい。この実施形態のマグネタイト５は、必ずしもその限りではないが、その径が数ｎｍ程度の酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）である。
第１磁性粒子１のレイヤー層４に、抗体２Ａを固定する方法は、公知の適当な技術を用いればよい。例えば、抗体２Ａは、第１磁性粒子１の表面に直接固定されてもよく、或いは抗体２Ａを他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定してもよい。前者の例としては、第１磁性粒子１のレイヤー層４に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基の一部を修飾することによって抗体２Ａを第１磁性粒子１に固定する方法を挙げられる。後者における他のタンパク質の例としては、アルブミンを挙げることができる。
なお、図１においては第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ａは１つとなっているが、これが１つに限られないことは当然である。
【００１８】
次いで、図２に示したように、検出対象となる抗原が含まれる可能性のある溶液である前処理溶液Ｘに、抗体２Ａで修飾された図１に示した第１磁性粒子１を加える（図２（ａ））。なお、この実施形態における前処理溶液Ｘは、例えば血液であり、それに血液の凝固を防止する薬剤である凝固防止剤を添加する等したものである。次いで、その前処理溶液Ｘを攪拌するなどする。これにより、第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ａは、前処理溶液Ｘ中にそれが存在すればではあるが、前処理溶液Ｘ中の抗体２Ａと特異的に結合する性質を有する抗原８と結合する（図２（ｂ））。この実施形態における前処理溶液Ｘは試験管Ｙ内に入れられており、この実施形態では、必ずしもこの限りではないが、試験管Ｙを振ることで上述の攪拌を行う。
次いで、第１磁性粒子１を磁気回収する。磁気回収の原理は、図２（ｃ）に示したように、例えば磁石Ｚを試験管Ｙの外面に当て、磁化した第１磁性粒子１を試験管Ｙ越しに磁石Ｚに吸着させてから試験管Ｙ外に取出すというものである。
これにより、抗原８と抗体２Ａを介して結合したものを含むかもしれない第１磁性粒子１を得る。
【００１９】
次いで、上述のようにして得た、抗原８と抗体２Ａを介して結合したものを含むかもしれない第１磁性粒子１を、この実施形態では純水である溶媒に混入させて、第１溶液とする。
そして、この第１溶液を、図３（ａ）に示したようにして、基板６上に供給する。第１溶液の基板６上への供給は、例えば、ピペットなどの公知の器具を用いて行うことができる。
基板６の図３（ａ）、（ｂ）における上側の面が検出領域面であり、その表面の所定の部分は、抗体２Ｂで修飾されている。
【００２０】
基板６は、この実施形態ではシリコンで形成され、基板６の一部を酸化させることにより検出領域７が形成されている。検出領域７は、この実施形態では、１つとされているが、所定の間隔で、基板６上に点々と設ける等して複数設けられていても構わない。なお、検出領域７を特定のパターンで基板６上に設けるには、フォトレジストなどの公知の手法を用いればよい。検出領域７は、本願でいう第３バイオ物質である抗体２Ｂで修飾されている。検出領域７を修飾する抗体２Ｂはこの実施形態では第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ｂと同じものであるが、必ずしも両者は同じものである必要はない。なお、複数の検出領域７を基板６に設けた場合には、検出領域７のそれぞれに、異なる種類の本発明でいう第３バイオ物質を固定することもできる。そうすることにより、複数種類のバイオ物質の検出を一つの基板６で行えるようになる。なお、基板６の上には、特にマーカーは設けられていない。
基板６を抗体２Ｂで修飾する方法は、これも公知のものでよい。この実施形態では、検出領域７を抗体２Ｂで修飾するものとする。この実施形態では、シランカップリング剤を用いて生じさせたシランカップリング反応を利用して、検出領域７に抗体２Ｂを固定することとしている。なお、図３（ａ）、（ｂ）では、検出領域７に固定された抗体２Ｂは２つとなっているが、実際にはより多くの、例えば数百程度の抗体２Ｂが検出領域７に固定される。
【００２１】
そのまましばらく放置すると、第１磁性粒子１は第１溶液中を、第１溶液中の水分子のブラウン運動によって生じる振動に押されて泳動し、ある程度の時間放置すると、一定の確率で、基板６を修飾する抗体２Ｂに近づく。すると、第１磁性粒子１に抗体２Ａを介して固定されている抗原８は、基板６を修飾する抗体２Ｂと結合する。
このようにして、基板６上には、検出領域７、抗体２Ｂ、抗原８、抗体２Ａ、第１磁性粒子１という並びができあがる（図３（ｂ））。
【００２２】
なお、この状態では、検出領域面上に、その表面を修飾している抗体２Ａに結合した抗原８が基板６を修飾する抗体２Ｂと結合していない第１磁性粒子１が存在している。この実施形態では省略するが、それらを、例えばピペットで純水を検出領域面上に適当な量供給するなどして、検出領域面上から外部に流し出してしまっても構わない。
【００２３】
図４（ａ）は、図３（ｂ）を引いて見た状態である。
次いで、図４（ａ）に示した基板６の上に、第２磁性粒子９を供給する（図４（ｂ））。より詳細には、第２磁性粒子９を含む溶液である第２溶液を基板６上に供給する。かかる第２溶液の供給は、ピペット等の公知の器具を用いて行うことができる。なお、第２溶液の溶媒は、この実施形態では、純水であり、第２溶液は純水に第２磁性粒子9を加えたものとなっている。
第２磁性粒子９は、大きさを除けばその構成は第１磁性粒子１と特に変わらないものとすることができ、この実施形態ではそうされている。第２磁性粒子９は、バイオ物質での修飾は特に行われていない。
この実施形態では、抗原８や第１磁性粒子１の大きさがナノサイズであるのに対して、第２磁性粒子９の大きさは、これらより大きいマイクロサイズとなっている。第２磁性粒子９は、マイクロサイズであるため、後述するように光学的に観察を行った場合に、その確認が容易になる。
【００２４】
次いで、図４（ｃ）に示すように、基板６周辺に磁場を発生させることにより、第１磁性粒子１および第２磁性粒子９を磁化させる。磁場を発生させる方法は、磁場が発生すればどのようなものでもよく、この実施形態では、一般的な磁石を基板６の近くに置くことにより、磁場を検出領域７に対してほぼ垂直な方向に発生させている。
第１磁性粒子１および第２磁性粒子９を磁化させることにより、図４（ｃ）のように、磁性粒子１および第２磁性粒子９が磁場の磁力線Ｈとほぼ同じ方向に結合する。
【００２５】
この状態では、検出領域面上の第２磁性粒子９には、他の第２磁性粒子９や第１磁性粒子１と結合しておらず単独で存在しているものと、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っているものの第１磁性粒子１と直接的にもまた他の第２磁性粒子９を介して間接的にも結合していないものと、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているもの、の３種類がある。これらのうち、最後のもののみが、検出領域７に固定されている。
この実施形態では、この状態で、例えばピペットを用いて、検出領域面に例えば純水である液体を供給し、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているもの以外の第２磁性粒子９を検出領域面上から洗い流す。それにより、他の第２磁性粒子９や第１磁性粒子１と結合しておらず単独で存在している第２磁性粒子９と、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っているものの第１磁性粒子１と直接的にもまた他の第２磁性粒子９を介して間接的にも結合していない第２磁性粒子９とを検出領域面から洗い流す。なお、この場合、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているものが洗い流されないように注意する。
【００２６】
その後、この基板６の検出領域面を顕微鏡で観察する。その結果、検出領域７の上に複数の第２磁性粒子９が結合したものが観察されれば、当該検出領域７の上に配された抗体２と特異的に結合する抗原８が前処理溶液Ｘに含まれていたと結論づけることができる。
【符号の説明】
【００２７】
１ 第１磁性粒子
２Ａ 抗体
２Ｂ 抗体
３ 本体
４ レイヤー層
５ マグネタイト
６ 基板
７ 検出領域
８ 抗原
９ 第２磁性粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ物質の検出のための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質、酵素といった生体分子の検出が、必要となる場合がある。
【０００３】
生体分子を検出する方法としては、例えば、特異性の高い生体分子反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いるＥＬＩＳＡ測定法が知られている。
しかし、この方法は、感度が不十分な場合が多く、他方、感度を高めるためには生体物質の増幅が必要となるため生体物質の検出に要する時間が長く、また、この方法は装置のコストが高い。そのため、この方法は、救急車内での緊急検査や在宅診断、学校や職場での定期検診、飛行場での検査等といった研究室、病院等の専門機関外で用いるには課題がある。
【０００４】
そこで、近年、磁性粒子を用いたバイオ物質の検出方法が注目されている。これは、検出の対象となる生体分子（以下、「バイオ物質」という。）である第１バイオ物質（例えば、抗原）とこれに特異的に結合する性質を持つバイオ物質である第２バイオ物質、及び第３バイオ物質（第２バイオ物質、及び第３バイオ物質は、例えば、抗体である。）が互いに結合することを利用するものである。
具体的には、この検出法では、まず、ポリマーで覆われた磁性粒子の表面を第２バイオ物質で修飾したものの当該第２バイオ物質を、第１バイオ物質が含まれる可能性のある溶液に投入する。もし、その溶液に第１バイオ物質が含まれれば第１バイオ物質は磁性粒子の表面を修飾する第２バイオ物質と結合する。そして、第３バイオ物質（もっとも第３バイオ物質は第２バイオ物質と同じ物である場合もあり得る。）で、その表面の少なくとも一部が修飾された検出領域面（例えば、プレパラートの表面）に、第２バイオ物質を介してその表面に第１バイオ物質が結合した上述の磁性粒子を供給し、当該磁性粒子と結合した第１バイオ物質を、検出領域面を修飾する第３バイオ物質と結合させる。これにより、第１バイオ物質は、検出領域面上で第２バイオ物質、及び第３バイオ物質とに挟まれた状態となり、検出領域面側から、検出領域面、第３バイオ物質、第１バイオ物質、第２バイオ物質、磁性粒子という並びができあがる。そして、この磁性粒子が第１バイオ物質の検出のための標識として用いられる。なお、この方法は、第１バイオ物質を第２バイオ物質、及び第３バイオ物質とで挟んだ状態を作るため、サンドイッチ法と呼ばれる場合がある。
ここで、磁性粒子を標識として用いるというのは、磁性粒子の存在を検出することにより、間接的に第１バイオ物質の検出を行うということを意味する。例えば、上述の方法を実施した後に、検出領域面上に存在する磁性粒子を、その存在によって発生する磁場、或いは電場の変化などを例えば磁気センサ、或いは電界センサを用いて検出することにより、間接的に第１バイオ物質の検出を行うという技術が知られている。
【０００５】
しかしながら、上述のような磁場、電場の変化などによる磁性粒子の検出は、磁性粒子が小さいこともあり、それほど簡単ではない。磁性粒子には、それに第２バイオ物質を介して固定された第１バイオ物質が検出領域面を修飾する第３バイオ物質と高確率で結合できるようにするための移動のし易さが必要であり、また、そのような結合が生じた後でもその結合が壊されないことが必要となるため、その径が小さいことが必要とされる。磁性粒子を修飾する第２バイオ物質と結合した第１バイオ物質と第３バイオ物質とを結合させるには両者を遭遇させないとならないが、それは磁性粒子を含む液体中の分子のブラウン運動による磁性粒子の移動によって引き起こされるため、磁性粒子は小さく、軽い方が有利である。実際、上述の磁性粒子の径は、一般的には、ｎｍのオーダーである。磁性粒子の検出における誤差は、そのまま、第１バイオ物質の検出精度を落とすことにつながるため好ましくない。
【０００６】
このような点に鑑みて、本願の発明者の一人は、以下のような発明をなした。
この発明では、上述の方法によって検出領域面に磁性粒子を固定した後、検出領域面に、多数の他の磁性粒子を含む溶液を供給する。そして、検出領域面に磁場をかけることにより、後から供給した上述の他の磁性粒子を検出領域面に固定された磁性粒子に結合させる。磁性粒子に後から供給した他の磁性粒子を結合させることにより２つの第２バイオ物質とその間の第１バイオ物質とを介して検出領域面に結合している磁性粒子は、他の磁性粒子が多数結合した場合には、それを含む大きな磁性粒子の塊（球形に近い形状に限定されず、磁性粒子が一列に配列されるような場合も含む。）を作る。そしてこの塊は、後から供給する他の磁性粒子の径を検出領域面に固定されている磁性粒子の径よりも大きくした場合には特に、一般的な顕微鏡を用いて観察することのできる程度の大きさとすることが容易なため、結果としてその存在を光学的な観察により検出できるようになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１１５５９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
光学的な観察により磁性粒子の存在を検知し、それにより第１バイオ物質の存在を確認する上述の技術は、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を、それと結合させる多数の他の磁性粒子によって、いわばその大きさについて増幅するものであるが、それに要する時間が極めて短く、また、電場或いは磁場の変化を検出するための手段を用いずに実行できるため装置も安いという利点がある。
しかし、この技術にも改良すべき点がある。
この技術における光学的な観察は、検出領域面を略垂直方向から観察することにより行われる。上述したように、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定された塊を作った他の磁性粒子は、例えば一般的な顕微鏡を用いて光学的に観察可能である。しかしながら、検出領域面上には、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子も存在する。そして、これら第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子も磁場の存在により、塊を作りうる。
つまり、この技術では、磁性粒子の塊が発見されたということが直ちには第２バイオ物質で修飾された磁性粒子が検出領域面上に固定されているということを意味せず、また、第１バイオ物質が検出されたということも意味しない。
そのような点を考慮し、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定された塊を作った他の磁性粒子と、塊を作ったものの第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面に固定されていない他の磁性粒子とを区別するために、第１バイオ物質と結合する第３バイオ物質が存在する位置を検出領域面上で特定するためのマーカーを検出領域面上に設けるということが行われている。
つまり、光学的な観察により、このマーカー上、或いはその近傍に磁性粒子の塊が発見された場合には、その塊を構成する磁性粒子をは第２バイオ物質で修飾された磁性粒子を介して検出領域面上に固定されていると判断できるから、そのような磁性粒子の塊が発見された場合には、それを、第１バイオ物質の検出と意味付けることができるようになる。
【０００９】
しかしながら、従来のマーカーは、検出領域面上に金を真空蒸着させるなどして作られているが、検出領域面上にマーカーを設けるのは煩雑でコストがかかる。
本発明は、以上の点に鑑みてなされたものであり、バイオ物質の検出のためのサンドイッチ法のうち、第２バイオ物質で修飾された磁性粒子に他の磁性粒子を結合させてから光学的に観察する方法を、検出領域面上にマーカーを設けることなく実施できるように改良することを、その課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、上述の課題を解決するために、以下のようなバイオ物質の検出方法を提案する。
【００１１】
本発明のバイオ物質の検出方法は、以下のようなものである。
すなわち、本発明は、検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して、前記第２バイオ物質で修飾された、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子と結合しているとともに、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質を介して、前記第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面に結合している状態で実行されるバイオ物質の検出方法である。
そして、このバイオ物質の検出方法は、磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す過程と、前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、を含む。
このバイオ物質の検出方法は、光学的な観察を行う前に、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す。したがって、光学的な観察を行うことで発見される第１磁性粒子と結合した第２磁性粒子の塊は、それに含まれる第１磁性粒子を修飾する第２バイオ物質、当該第２バイオ物質と結合した第１バイオ物質、当該第１バイオ物質と結合した検出領域面を修飾する第３バイオ物質、を介して検出領域面に固定されている。つまり、このバイオ物質の検出方法で行われる光学的な観察により、第１磁性粒子と結合した第２磁性粒子の塊が発見された場合には、上述の如きマーカーがなくとも、その塊の発見を、第１バイオ物質が検出されたと意味付けることができる。
なお、本願発明では、前記第１磁性粒子よりも大きい前記第２磁性粒子を用いることができる。このようにした場合には、第２磁性粒子の塊の光学的な検出が容易になる一方で、第１バイオ物質検出に役立たないノイズとしての第２磁性粒子の塊も目立ちやすくなるので、第１バイオ物質検出のために不要な第２磁性粒子を流し去ることの意味が大きくなる。
なお、本願における第２バイオ物質と第３バイオ物質とは同じものである場合もあるし、そうでない場合もあり得る。
【００１２】
本発明のバイオ物質の検出方法は、以下のようなものとしてもよい。このバイオ物質の検出方法でも、光学的な観察により、第１磁性粒子と第２磁性粒子による塊が発見された場合には、上述の如きマーカーがなくとも、その塊の発見を、第１バイオ物質が検出されたと意味付けることができるという作用効果を得られる。
その方法は、検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、その表面を修飾する前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して結合した、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子を含む溶液である第１溶液を、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面上に供給する過程と、前記第１磁性粒子を修飾する前記第３バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第２バイオ物質と結合させる過程と、磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程と、前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、を含む、バイオ物質の検出方法である。
なお、この方法の場合には、前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる前記過程の後に、その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が、前記第１検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程、を行ってもよい。
このようにすると、その表面を修飾する第２バイオ物質に結合した第１バイオ物質が検出領域面上を修飾する第３バイオ物質に結合していない第１磁性粒子、換言すれば検出領域面に固定されていない第１磁性粒子も光学的な観察を行うときには存在しなくなっているので、光学的な観察を更に行い易くなる。
【００１３】
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程は、どのようにして行ってもよい。例えば、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することによりこれを行うことができる。
その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が前記第１磁性粒子を修飾した前記第２バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程も同様に、例えば、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することによりを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態で用いる第１磁性粒子を抗体で修飾した状態を示す図。
【図２】前処理溶液に図１で示した第１磁性粒子を供給した後の処理を示す図。
【図３】抗原と抗体を介して結合した第１磁性粒子を基板の上に供給した状態を示す図。
【図４】本発明の実施形態に係る状態保存方法を説明するための図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
この実施形態のバイオ物質の検出方法では、本発明の第１バイオ物質にあたる適当な抗原を検出対象とし、これを、サンドイッチ法を用いて検出することとする。この実施形態のサンドイッチ法では、抗原を挟む本発明の第２バイオ物質、及び第３バイオ物質としてともに、当該抗原と特異的に結合する性質を有する抗体を用いることとする。また、この実施形態のバイオ物質の検出は、光学的な観察によるものとする。
なお、抗体と抗原は互いに入れ替えても構わないし、第１バイオ物質と、第２バイオ物質及び第３バイオ物質は、それらが互いに特異的に結合するものである限り、抗体、抗原の一方と他方である必要もない。
【００１７】
この実施形態では、まず、図１に示したように、第１磁性粒子１の表面に、抗体２Ａを修飾する。
第１磁性粒子１は、それに固定される本発明でいう第２バイオ物質（この実施形態では抗体２Ａ）に対して相対的に大き過ぎない程度の大きさのものとするのが好ましい。例えば単分子ＤＮＡに相当する程度の大きさ、具体的には粒径１００ｎｍ以下のものが利用可能である。この程度の大きさとすることで、第１磁性粒子１と抗体２Ａとの大きさの差異が大きくならないから、これらの結合が容易となり、また第１磁性粒子１の移動も生じやすくなる。つまり、第１磁性粒子１よりも大きいマイクロサイズの磁性粒子と比較して、ナノサイズの第１磁性粒子１は、バイオ物質との反応効率がよく、サンドイッチ法への応用に向いている。
第１磁性粒子１に用いることのできる磁性粒子は、公知であり、市販もされているのでそれを利用することができる。この実施形態における第１磁性粒子１は、必ずしもこの限りではないが、本体３を備えており、その表面を官能基を持つ物質によるレイヤー層４で覆った構造となっている。レイヤー層４に含まれる官能基は、上述の抗体２Ａと結合させるために用いられる。本体３の中には、第１磁性粒子１を磁性粒子として機能させるためのマグネタイト５が含まれている。マグネタイト５は、小さな磁界を与えるだけで大きく磁化され、また、磁界が消えた場合の残留磁化が小さい方が好ましく、この点を考慮して、超常磁性の性質を持つものを用いるのが好ましい。この実施形態のマグネタイト５は、必ずしもその限りではないが、その径が数ｎｍ程度の酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）である。
第１磁性粒子１のレイヤー層４に、抗体２Ａを固定する方法は、公知の適当な技術を用いればよい。例えば、抗体２Ａは、第１磁性粒子１の表面に直接固定されてもよく、或いは抗体２Ａを他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定してもよい。前者の例としては、第１磁性粒子１のレイヤー層４に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基の一部を修飾することによって抗体２Ａを第１磁性粒子１に固定する方法を挙げられる。後者における他のタンパク質の例としては、アルブミンを挙げることができる。
なお、図１においては第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ａは１つとなっているが、これが１つに限られないことは当然である。
【００１８】
次いで、図２に示したように、検出対象となる抗原が含まれる可能性のある溶液である前処理溶液Ｘに、抗体２Ａで修飾された図１に示した第１磁性粒子１を加える（図２（ａ））。なお、この実施形態における前処理溶液Ｘは、例えば血液であり、それに血液の凝固を防止する薬剤である凝固防止剤を添加する等したものである。次いで、その前処理溶液Ｘを攪拌するなどする。これにより、第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ａは、前処理溶液Ｘ中にそれが存在すればではあるが、前処理溶液Ｘ中の抗体２Ａと特異的に結合する性質を有する抗原８と結合する（図２（ｂ））。この実施形態における前処理溶液Ｘは試験管Ｙ内に入れられており、この実施形態では、必ずしもこの限りではないが、試験管Ｙを振ることで上述の攪拌を行う。
次いで、第１磁性粒子１を磁気回収する。磁気回収の原理は、図２（ｃ）に示したように、例えば磁石Ｚを試験管Ｙの外面に当て、磁化した第１磁性粒子１を試験管Ｙ越しに磁石Ｚに吸着させてから試験管Ｙ外に取出すというものである。
これにより、抗原８と抗体２Ａを介して結合したものを含むかもしれない第１磁性粒子１を得る。
【００１９】
次いで、上述のようにして得た、抗原８と抗体２Ａを介して結合したものを含むかもしれない第１磁性粒子１を、この実施形態では純水である溶媒に混入させて、第１溶液とする。
そして、この第１溶液を、図３（ａ）に示したようにして、基板６上に供給する。第１溶液の基板６上への供給は、例えば、ピペットなどの公知の器具を用いて行うことができる。
基板６の図３（ａ）、（ｂ）における上側の面が検出領域面であり、その表面の所定の部分は、抗体２Ｂで修飾されている。
【００２０】
基板６は、この実施形態ではシリコンで形成され、基板６の一部を酸化させることにより検出領域７が形成されている。検出領域７は、この実施形態では、１つとされているが、所定の間隔で、基板６上に点々と設ける等して複数設けられていても構わない。なお、検出領域７を特定のパターンで基板６上に設けるには、フォトレジストなどの公知の手法を用いればよい。検出領域７は、本願でいう第３バイオ物質である抗体２Ｂで修飾されている。検出領域７を修飾する抗体２Ｂはこの実施形態では第１磁性粒子１を修飾する抗体２Ｂと同じものであるが、必ずしも両者は同じものである必要はない。なお、複数の検出領域７を基板６に設けた場合には、検出領域７のそれぞれに、異なる種類の本発明でいう第３バイオ物質を固定することもできる。そうすることにより、複数種類のバイオ物質の検出を一つの基板６で行えるようになる。なお、基板６の上には、特にマーカーは設けられていない。
基板６を抗体２Ｂで修飾する方法は、これも公知のものでよい。この実施形態では、検出領域７を抗体２Ｂで修飾するものとする。この実施形態では、シランカップリング剤を用いて生じさせたシランカップリング反応を利用して、検出領域７に抗体２Ｂを固定することとしている。なお、図３（ａ）、（ｂ）では、検出領域７に固定された抗体２Ｂは２つとなっているが、実際にはより多くの、例えば数百程度の抗体２Ｂが検出領域７に固定される。
【００２１】
そのまましばらく放置すると、第１磁性粒子１は第１溶液中を、第１溶液中の水分子のブラウン運動によって生じる振動に押されて泳動し、ある程度の時間放置すると、一定の確率で、基板６を修飾する抗体２Ｂに近づく。すると、第１磁性粒子１に抗体２Ａを介して固定されている抗原８は、基板６を修飾する抗体２Ｂと結合する。
このようにして、基板６上には、検出領域７、抗体２Ｂ、抗原８、抗体２Ａ、第１磁性粒子１という並びができあがる（図３（ｂ））。
【００２２】
なお、この状態では、検出領域面上に、その表面を修飾している抗体２Ａに結合した抗原８が基板６を修飾する抗体２Ｂと結合していない第１磁性粒子１が存在している。この実施形態では省略するが、それらを、例えばピペットで純水を検出領域面上に適当な量供給するなどして、検出領域面上から外部に流し出してしまっても構わない。
【００２３】
図４（ａ）は、図３（ｂ）を引いて見た状態である。
次いで、図４（ａ）に示した基板６の上に、第２磁性粒子９を供給する（図４（ｂ））。より詳細には、第２磁性粒子９を含む溶液である第２溶液を基板６上に供給する。かかる第２溶液の供給は、ピペット等の公知の器具を用いて行うことができる。なお、第２溶液の溶媒は、この実施形態では、純水であり、第２溶液は純水に第２磁性粒子9を加えたものとなっている。
第２磁性粒子９は、大きさを除けばその構成は第１磁性粒子１と特に変わらないものとすることができ、この実施形態ではそうされている。第２磁性粒子９は、バイオ物質での修飾は特に行われていない。
この実施形態では、抗原８や第１磁性粒子１の大きさがナノサイズであるのに対して、第２磁性粒子９の大きさは、これらより大きいマイクロサイズとなっている。第２磁性粒子９は、マイクロサイズであるため、後述するように光学的に観察を行った場合に、その確認が容易になる。
【００２４】
次いで、図４（ｃ）に示すように、基板６周辺に磁場を発生させることにより、第１磁性粒子１および第２磁性粒子９を磁化させる。磁場を発生させる方法は、磁場が発生すればどのようなものでもよく、この実施形態では、一般的な磁石を基板６の近くに置くことにより、磁場を検出領域７に対してほぼ垂直な方向に発生させている。
第１磁性粒子１および第２磁性粒子９を磁化させることにより、図４（ｃ）のように、磁性粒子１および第２磁性粒子９が磁場の磁力線Ｈとほぼ同じ方向に結合する。
【００２５】
この状態では、検出領域面上の第２磁性粒子９には、他の第２磁性粒子９や第１磁性粒子１と結合しておらず単独で存在しているものと、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っているものの第１磁性粒子１と直接的にもまた他の第２磁性粒子９を介して間接的にも結合していないものと、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているもの、の３種類がある。これらのうち、最後のもののみが、検出領域７に固定されている。
この実施形態では、この状態で、例えばピペットを用いて、検出領域面に例えば純水である液体を供給し、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているもの以外の第２磁性粒子９を検出領域面上から洗い流す。それにより、他の第２磁性粒子９や第１磁性粒子１と結合しておらず単独で存在している第２磁性粒子９と、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っているものの第１磁性粒子１と直接的にもまた他の第２磁性粒子９を介して間接的にも結合していない第２磁性粒子９とを検出領域面から洗い流す。なお、この場合、他の第２磁性粒子９と結合して塊を作っており且つ第１磁性粒子１と直接的に或いは他の第２磁性粒子９を介して間接的に結合しているものが洗い流されないように注意する。
【００２６】
その後、この基板６の検出領域面を顕微鏡で観察する。その結果、検出領域７の上に複数の第２磁性粒子９が結合したものが観察されれば、当該検出領域７の上に配された抗体２と特異的に結合する抗原８が前処理溶液Ｘに含まれていたと結論づけることができる。
【符号の説明】
【００２７】
１ 第１磁性粒子
２Ａ 抗体
２Ｂ 抗体
３ 本体
４ レイヤー層
５ マグネタイト
６ 基板
７ 検出領域
８ 抗原
９ 第２磁性粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して、前記第２バイオ物質で修飾された、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子と結合しているとともに、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質を介して、前記第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面に結合している状態で実行される方法であって、
磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、
前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す過程と、
前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、
を含む、バイオ物質の検出方法。
【請求項２】
検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、その表面を修飾する前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して結合した、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子を含む溶液である第１溶液を、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面上に供給する過程と、
前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる過程と、
磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、
前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程と、
前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、
を含む、
バイオ物質の検出方法。
【請求項３】
前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる前記過程の後に、
その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が、前記第１検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程、
を行う、請求項２記載のバイオ物質の検出方法。
【請求項４】
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程は、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することにより行う、
請求項１又は２記載のバイオ物質の検出方法。
【請求項５】
前記第１磁性粒子よりも大きい前記第２磁性粒子を用いる、
請求項１又は２記載のバイオ物質の検出方法。
【請求項１】
検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して、前記第２バイオ物質で修飾された、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子と結合しているとともに、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質を介して、前記第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面に結合している状態で実行される方法であって、
磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、
前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面から洗い流す過程と、
前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、
を含む、バイオ物質の検出方法。
【請求項２】
検出の対象となるバイオ物質である第１バイオ物質が、その表面を修飾する前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第２バイオ物質を介して結合した、磁場を印加することにより磁化可能な磁性粒子である第１磁性粒子を含む溶液である第１溶液を、前記第１バイオ物質と特異的に結合する性質を有する第３バイオ物質でその表面の一部が修飾された検出領域面上に供給する過程と、
前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる過程と、
磁場を印加することにより磁化可能であり、磁場内で前記第１磁性粒子と磁力により結合可能な磁性粒子である第２磁性粒子を多数含む溶液である第２溶液を、前記検出領域面上に供給する過程と、
前記検出領域面上に磁場を印加することにより、前記第１磁性粒子に前記第２磁性粒子を磁力により結合させる過程と、
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程と、
前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す前記過程の後、前記検出領域面を光学的に観察する過程と、
を含む、
バイオ物質の検出方法。
【請求項３】
前記第１磁性粒子を修飾する前記第２バイオ物質を介して前記第１磁性粒子に結合した前記第１バイオ物質を、前記検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合させる前記過程の後に、
その表面を修飾した前記第２バイオ物質を介して結合した前記第１バイオ物質が、前記第１検出領域面を修飾した前記第３バイオ物質と結合していない第１磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程、
を行う、請求項２記載のバイオ物質の検出方法。
【請求項４】
磁場を印加した状態で、前記第１磁性粒子に直接又は他の第２磁性粒子を介して間接的に結合していない前記第２磁性粒子を前記検出領域面上から洗い流す過程は、ピペットで前記検出領域面上に液体を供給することにより行う、
請求項１又は２記載のバイオ物質の検出方法。
【請求項５】
前記第１磁性粒子よりも大きい前記第２磁性粒子を用いる、
請求項１又は２記載のバイオ物質の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−９２５０１（Ｐ２０１３−９２５０１Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３６０６１（Ｐ２０１１−２３６０６１）
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（３０４０２７３４９）国立大学法人豊橋技術科学大学 (391)
【出願人】（３０００５３５５３）スカラ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【出願人】（３０４０２７３４９）国立大学法人豊橋技術科学大学 (391)
【出願人】（３０００５３５５３）スカラ株式会社 (41)
【Ｆターム（参考）】
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