バクテリオファージを使用した微生物を検出するための装置および方法
原試料中の１つ以上の標的細菌を検出する方法であり、各標的細菌に特異的なバクテリオファージを原試料に添加し、この試験試料をインキュベートし、試験試料を、当該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質が存在すると色が変化する基板に塗布する。基板は各ファージに特異的に結合する抗体を含む。試験試料中の細菌は、バクテリオファージに曝露されたサンプルに微生物リゾチームを加えることによって溶菌してもよい。親ファージを、検出プロセスに先立って子孫ファージから分離できるような様式で標識する。ファージは、インキュベーションプロセス後に解離させて、試料に対して、個々のカプシドタンパク質またはファージ核酸の存在について調べることもできる。本発明は、兵家器細菌の抗生物質耐性を調べるために用いることもができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、一般には微生物の検出の分野に関し、より詳細にはバクテリオファージを利用した細菌の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．問題の記載）
微生物の検出に対する標準的な微生物学的方法は、特異的細菌病原体の有無を調べるための基板に基づくアッセイに依拠している。Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｂｏｒｄｎｅｒ，Ｊｏｈｎ Ａ．ＷｉｎｔｅｒおよびＰａｓｑｕａｌｅ Ｓｃａｒｐｉｎｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＥＰＡ報告書Ｎｏ．ＥＰＡ−６００／８−７８−０１７，Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ，オハイオ州シンシナティ４５２６８番地，１９７８年１２月を参照のこと。これらの技術は、一般に実施し易く、高額な備品または研究設備を必要とせず、高いレベルの選択性を与える。しかしながら、上記方法は遅い。基板に基づいたアッセイの障壁となるのは、最初に標的とする生物の純粋培養物を増殖または培養しなければならず、これには２４時間以上を要する場合もあることである。この時間的制約が、微生物の毒性株の存在に対する迅速な応答を与えるための有効性を大幅に限定してしまうことになる。
【０００３】
分子生物学技術は、標準的な微生物学的試験に代わるものとして急速に受け入れられるようになってきている。標的とする微生物に対するマトリックスの宿主を評価するために、血清学的方法が広く利用されるようになってきている。Ｄａｖｉｄ Ｔ．ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＳｔａｎｌｅｙ Ｆａｌｋｏｗ，Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９８５年およびＧ．Ｍ．Ｗｙａｔｔ，Ｈ．Ａ．ＬｅｅおよびＭ．Ｒ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，ニューヨーク、１９９２年を参照のこと。これらの試験は、複合生物混合物中の他の構成要素から、標的とする生物を最初に捕捉し、その後、分離するために、抗体を用いることに焦点を当てている。一旦単離されると、捕捉された有機物は、生物検体の培養を必要としない様々な方法によって濃縮および検出することができる。そのような手法の一つ「免疫磁気分離法（ＩＭＳ）」と呼ばれる手法は、抗体を球体の微小な磁性または常磁性ビーズに固定化し、これらのビーズを用いて液体媒体から標的とする微生物を捕捉することを含む。これらのビーズは、標的とする生物の回収と濃縮を容易にする磁界の影響下で簡単に操作される。さらに、ビーズはその小さいサイズと形状のために、試料中に均一に分散することができ、ビーズと標的の間の相互作用を加速することになる。これらの好ましい特徴により、アッセイ時間を短縮し、分析手順の能率化の一助となり、より高い試料処理能力と自動化に適したものになる。
【０００４】
ＩＭＳとともに以前に用いられていた下流検出法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｋｏｆｉｔｓｙｏ Ｓ．Ｃｕｄｊｏｅ，Ｔｈｅｒｅｓｅ Ｈａｇｔｖｅｄｔ，およびＲｉｃｈａｒｄ Ｄａｉｎｔｙ，“Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｆｒｏｍ Ｆｏｏｄｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２７１（９９５）１１−２５）、ドットブロットアッセイ（Ｅｙｓｔｅｉｎ Ｓｋｊｅｒｖｅ，Ｌｉｖ Ｍａｒｉｔ Ｒｏｒｖｉｋ，およびＯｒｊａｎ Ｏｌｓｖｉｃｋ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｆｏｏｄｓ Ｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０年１１月，３４７８〜３４８１頁）、電気化学発光（ＨａｏＹｕおよびＪｏｈｎ Ｇ．Ｂｒｕｎｏ，“Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ−Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１５７ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｗａｔｅｒ Ｓａｍｐｌｅｓ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６年２月，５８７〜５６２頁）、およびフローサイトメトリー（Ｂａｒｒｙ Ｈ．Ｐｙｌｅ，Ｓｕｓａｎ Ｃ．Ｂｒｏａｄｗａｙ，およびＧｏｒｄｏｎ Ａ．ＭｃＦｅｔｅｒｓ，“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１５７： Ｈ７ Ｉｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｌａｓｅｒ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９年５月、１９６６〜１９７２頁）があげられる。これらの試験は満足な結果を与えるものの、実施に労力がかかり、標的以外の検体との交差反応により、擬陽性結果に対して影響を受けやすい二重反応（ｙｅｓ／ｎｏ）を与える。全細胞微生物を同定するための別の方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）（Ｈｏｌｌａｎｄら，１９９６；ｖａｎ Ｂａｒｒ，２０００；Ｍａｄｏｎｎａら，２０００）を用いる。
【０００５】
これらの新しい手法のすべては、従来の微生物方法に比べて迅速に結果を与えることができる。しかしながら、これらは、基板に基づくアッセイで達成される感度レベルを達成することができず、また費用もかかり、典型的には古典的な基板に基づく方法の場合よりも熟練した技術者が必要となる。
【０００６】
近年、大きな注目を浴びている他の分子生物学的技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がある。試料中の特定の微生物のＰＣＲ検出には、試料中の遺伝物質（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の抽出と、関心微生物に特異的な標的遺伝配列の増幅と、増幅された遺伝物質の検出とが含まれる。ＰＣＲ技術は、検出される遺伝物質の独自性による高い選択性と、標的遺伝物質の実質的増幅による高い感度と、潜在的に迅速な増幅プロセスによる迅速な結果を与える。しかしながら、ＰＣＲ機器および試薬は相当に高額であり、試験を行うには高度に熟練した技術者が必要である。いまのところ、ＰＣＲ機器は、期待されている感度または特異性を与えていない。
【０００７】
バクテリオファージ感染および／または増幅を用いて、基板に基づく古典的な細菌検出の向上を図ろうとするいくつかの試みがなされている。バクテリオファージは、自らの複製の手段として細菌を用いるように自然界で進化してきたウィルスである。バクテリオファージ（またはファージ）は、このことを、自身を細菌に付着させ、自身の遺伝物質を該細菌に注入して、数十から数千倍のファージ複製を誘発することによって行う。溶菌バクテリオファージと呼ばれるいくつかのバクテリオファージは、宿主細菌を破裂させて、他の細菌を探し出すように、子孫ファージを環境中に放出する。細菌のファージ感染、細菌中でのファージ複製（増幅）、および溶菌後の子孫ファージの放出のための全インキュベーション時間は、ファージ、細菌および環境条件によってはわずかに１時間しかかからない。微生物学者達は、細菌を種レベルまたは株レベルで特異的に標的とする多くのものを含む５，０００種を超えるファージを単離およびキャラクタライズしている。米国特許第５，９８５，５９６号および第６，４６１，８３３号（Ｗｉｌｓｏｎ）は、そのようなファージに基づくアッセイ法を開示している。この方法は、関心細菌を含む可能性のある試料に溶菌ファージを感染させることを含む。その後、遊離のファージを試料から除去し、標的細菌を溶菌し、子孫ファージを第２の細菌に感染させるが、この第２の細菌は標的細菌よりも短い倍加時間を有している。調製した試料を基板上で培養する。プラークが形成されると、元の試料中に標的細菌が存在することがわかる。この方法では、培養インキュベーション時間が必要であるために、まだなお時間または日数がかかるものの、伝統的な基板に基づいたアッセイのアッセイ時間を短縮することができる。この方法に伴う他の問題点としては、標的細菌よりもより迅速に倍加する細菌にも感染する非特異的ファージが存在するような細菌を検出するためにしか適用できないことである。非特異的ファージの使用は、試験試料中の少なくとも第２の細菌に対する交差反応性の可能性に繋がるものである。したがって、このファージに基づいたプラークアッセイ法は、迅速ではなく、適当な非特異的ファージが利用できる場合にのみ適用可能であり、交差反応の問題を起こしやすく、実験室設備において行わなければならない。
【０００８】
他の細菌病原体の検出では、基板に基づくプアラーク検出方法を完全に放棄している。これらの方法の多くは、試料中に標的細菌が存在する場合にのみ発現され、修飾ファージが感染するｌｕｘ遺伝子で遺伝的に修飾されたバクテリオファージを使用する。米国特許第４，８６１，７０９号（Ｕｌｉｔｚｕｒ）は典型的な例である。標的病原体に特異的に感染するファージは、ｌｕｘ遺伝子を含むように修飾される。修飾されたファージが標的細菌を含んだ試料に添加されると、該ファージは細菌に感染して、細菌中でルシフェラーゼが生産され、発光が起こる。米国特許第５，８２４，４６８号（Ｓｃｈｅｒｅｒら）は、類似した方法を記載している。ルシフェラーゼ生産遺伝子マーカーに加えて、Ｓｃｈｅｒｅｒらは、検出可能のタンパク質または核酸として発現される遺伝子マーカーを記載している。米国特許第５，６５６，４２４号（Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら）は、ルシフェラーゼ（またはβ−ガラクトシダーゼ）レポータファージを利用してミコバクテリアを検出する方法を開示している。該特許では、さらに抗生物質感受性の試験についても記載している。米国特許第６，３００，０６１号（Ｊａｃｏｂｓ Ｊｒ．ら）は、細菌感染後にルシフェラーゼを含むいくつかのレポータ分子のうちの１つを生産する、遺伝的に修飾されたファージを用いたミコバクテリア検出のためのさらに別の方法を記載している。米国特許第６，５５５，３１２Ｂ１号（Ｎａｋａｙａｍａ）は、発光性のものではなく蛍光性のタンパク質マーカーを生産する遺伝子を利用する方法を記載している。これらのすべての方法は、感染細菌内でのファージ増幅の潜在的利点を利用したものである。試料中の感染した各標的細菌に対して、子孫ファージが生産されていく間にマーカー遺伝子が何度も発現される。米国特許第６，５４４，７２９号（Ｓａｙｌｅｒら）は、さらに別の増幅プロセスを付け加えている。ファージのＤＮＡをｌｕｘ遺伝子を含むように修飾する。バイオレポータ細胞もｌｕｘ遺伝子を含むように修飾する。上記遺伝的に修飾されたファージおよびバイオレポータ細胞を試料に加える。ファージが標的細菌に感染すると、標的細菌が誘導されて、ルシフェラーゼだけでなくアシルエンホモセリンラクトンＮ−（３−オキソヘキサノイル）ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を生産する。ＡＨＬは、バイオレポータ細胞に進路を見いだし、さらなる光およびさらなるＡＨＬの生産を刺激し、これがさらなるバイオレポータ細胞に進路を見いだし、さらなる光が生産されることになる。このようにして、標的細菌のファージ感染が引き金となって、光シグナルが増幅される。原理上は、遺伝的に修飾されたファージを利用するこれらの方法のすべてが、１）選択的に感染するファージを利用するために高い選択性と、２）マーカー遺伝子産物を亭レベルで検出できるために高い感度と、３）シグナルを１または２ファージ感染サイクル以内に検出できることから基板に基づく方法に比べて迅速な結果を可能にする。これらは２つの大きな欠点を有する。第一に、被験病原体ごとに適切なファージを遺伝的に修飾しなければならないために、費用がかかるとともに実施が難しい。第２に、マーカーシグナル（光）を検出するための機器を必要とすることが多く、これが遺伝的に修飾されたファージを利用する試験の費用を引き上げることになる。
【０００９】
米国特許第５，８８８，７２５号（Ｓａｎｄｅｒｓ）は、試料中の標的細菌への感染のために、修飾されていない高度に特異的な溶菌ファージを利用する方法を記載している。ファージに誘導される溶菌により、細菌細胞から、既知の技術によって検出可能なＡＴＰなどの特定のヌクレオチドが放出される。ファージ感染後に試料中ヌクレオチド濃度の上昇が検出されれば、該試料中に標的細菌が存在すると判定できる。米国特許第６，４３６，６６１Ｂ１号（Ａｄａｍｓら）は、ファージを用いて、試料中の標的細菌に感染して溶菌させて、細胞内酵素を放出し、これが固定化酵素基板と反応して、検出可能なシグナルを発生する方法を記載している。これらの方法は、非修飾ファージを使用するという利点を有するが、ファージ増幅から何の恩恵も引き出していない。検出されたマーカー（ヌクレオチドまたは酵素）の濃度は、試料中の標的細菌の濃度に正比例する。
【００１０】
米国特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）は、非修飾ファージと、検出可能なシグナルを増大させるためのファージ増幅とを使用した病原体検出方法を記載している。この方法は、試料に高濃度の溶菌ファージを添加することを請求している。試料はファージが試料中の標的細菌に感染するのに十分な時間インキュベートする。溶菌が起こる前に、試料を処理して、感染細菌内で複製される子孫ファージに影響を及ぼすことなく試料中の遊離ファージを除去、破壊またはいずれにせよ不活性化させる。必要であれば、続いて、前もって試料に添加したあらゆる抗ウィルス剤を中和するための処理を行う。溶菌によって放出された子孫ファージは、子孫ファージの直接アッセイを用いて、または試料中に子孫ファージが存在することを示すシグナルを発生する遺伝的に修飾されたバイオレポータ細菌を用いることによって、検出する。いずれの場合も、測定されたシグナルは、試料中の標的細菌の数ではなく、子孫ファージの数に比例するので、ファージ増幅の結果として強くなる。この方法の主たる欠点は、処理試料中の遊離ファージを破壊、除去または不活性化した後に、子孫ファージが溶菌後に生存できるように殺ウィルス条件の逆転を行わねばならないことである。これらの追加のプロセスが、本方法を用いたアッセイを複雑にし、高額化させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
基板に基づくアッセイの感度、簡潔性、および／または低コストと、分子生物学診断テストによって与えられる迅速な結果とを組み合わせた、検出方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ファージ増幅の原理を用いた、生きた微生物を検出するための方法および装置を提供することにより、上記の問題ならびに先行技術の他の問題を解決する。好ましい実施形態において、標的微生物に特異的なファージを、サンプルに導入する。導入されたファージの量は、好ましくはファージの検出限界未満の量である。標的微生物が存在すれば、ファージは感染し、微生物内で増殖する。好ましくは、微生物は、ファージ増殖の結果として自然に、または、微生物が細菌であれば細菌リゾチームなどの能動的溶菌プロセスのいずれかによって溶菌される。好ましい実施形態において、ファージは、好ましくは、バクテリオファージ解離剤を加えることにより、解離される。別の実施形態において、検出プロセスに先立って、親ファージに対して、子孫ファージから物理的に除去または分離可能なように標識を行い、これにより、潜在的感受性を増大するか、および／または方法の全分析時間を短縮する。次に試料中のファージまたはバクテリオファージに付随する生物物質を検定する。何らかのファージまたは生物物質が検出されると、標的微生物の存在が証明される。ファージまたは生物物質が検出されなければ、標的とする微生物は存在しないことになる。感染、複製、および溶菌からなる全インキュベーションプロセスには数分しかかからない。前述の実施形態のすべては、細菌および他の微生物の抗生物質耐性または感受性を判定するために用いることができる。バクテリオファージまたは生物物質は、ラテラルフローストリップ、ＳＩＬＡＳ表面、またはＭＡＬＤＩ質量分析などを用いた任意の適切な様式で検出することができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明はサンプル中の微生物の有無を検出する方法を提供し、該方法は、試料を、標的微生物に感染できる親バクテリオファージと組み合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程と；バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、バクテリオファージが標的微生物に感染して、該標的微生物中で増幅して、子孫バクテリオファージを産生するとともに、アッセイで利用できる解離したバクテリオファージ物質を産生するのに十分な条件を与える工程と；バクテリオファージに曝露されたサンプルの検定を行って、試料中の標的微生物の有無の指標となる、バクテリオファージ物質の有無を判定する工程とを含む。上記の要約において、バクテリオファージ物質とは、解離したバクテリオファージ物質であると同時に、バクテリオファージに関連したものであると理解すべきである。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の微生物の有無の検出方法を提供し、該方法は、（ａ）試料を、標的微生物に感染できる親バクテリオファージと組み合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程と；（ｂ）バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、バクテリオファージが標的微生物に感染して、該標的微生物中で増幅して、検出可能な量のバクテリオファージまたは該バクテリオファージに曝露されたサンプル中のバクテリオファージに関連する生物物質のいずれかを産生するのに十分な条件を与える工程と；（ｃ）微生物を能動的に溶菌する工程と、（ｄ）バクテリオファージに曝露されたサンプルの検定を行って、バクテリオファージまたは該バクテリオファージに曝露されたサンプル中のバクテリオファージに関連する生物物質の有無を検出し、標的微生物の有無を判定する工程とを含む。好ましくは、前記能動的に溶菌する工程は、バクテリオファージに曝露されたサンプルに微生物リゾチームを添加することを含む。好ましくは、前記能動的に溶菌する工程は、バクテリオファージに曝露されたサンプルへのクロロホルムの添加、酸によるバクテリオファージに曝露されたサンプルの処理、およびバクテリオファージに曝露されたサンプルの物理的プロセシングからなる群より選択される方法を含む。
【００１５】
好ましくは、前記プロセスは、増幅されたファージが基板における色変化を誘導するような装置および方法を用いて実現される。好ましい実施形態において、本発明は、標的微生物を検出するための装置を提供し、該装置は、基板と、基板上の固定化ゾーンであって、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質を固定化するための固定化剤を含んだ固定化ゾーンと、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質と相互作用するように設計された色調節剤とを含み、これにより、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質の存在が、固定化ゾーンの色の変化をもたらすようにしている。好ましくは、固定化ゾーンは抗体を含む。好ましくは色調節剤は着色ビーズを含む。別の実施形態において、色調節剤は、反応剤と、反応すると沈殿剤を形成する酵素とを含む。当該方法の好ましい実施形態において、バクテリオファージに曝露されたサンプルを基板に塗布し、前記バクテリオファージに曝露されたサンプル中にバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質が存在するとその少なくとも一部の色が変わるようにする。
【００１６】
本発明は、サンプル中の標的微生物の有無を判定するためのキットも提供し、該キットは、標的微生物に感染可能なバクテリオファージを収容した第１の容器と、少なくとも一部の色が、バクテリオファージに曝露されたサンプル中にバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質のいずれかが存在する場合に変化する基板とを含む。好ましくは前記キットは、緩衝溶液を収容した第２の容器をさらに含む。好ましくは、基板は、ラテラルフローストリップまたはＳＩＬＡＳ表面からなる。好ましくは、第１の容器は、所定の大きさの液滴を放出するように設計された点滴器（ｄｒｏｐｐｅｒ）を含む。
【００１７】
本発明は、微生物、好ましくは細菌の試験基板を製造する方法も提供し、該方法は、基板と、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質に付着しうる生物物質とを提供する工程と、基板上に生物物質のラインを形成する工程と、基板を前記ラインと略垂直な方向に裁断する工程とを含む。好ましくは、基板は多孔性膜である。好ましくは生物物質は抗体である。
【００１８】
本発明の目的は、バクテリオファージに曝露されたサンプル中において親ファージの破壊、除去、中和または不活性化を行わない、微生物を検出するファージ増幅方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、特異性の高い細菌検出方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、広スペクトル細菌検出方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、低濃度の細菌を検出するために用いることができる細菌検出方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、広範囲の濃度にわたって細菌を検出することのできる細菌検出方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、大半の既存の検出方法に比べて迅速な結果を与える細菌検出方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、既存の細菌検出方法に比べて低価格な細菌検出方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、実施が容易で、高度に熟練した技術者または複雑な装置を必要としない細菌検出方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、野外または看護地点において実施しうる細菌検出方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、複数の細菌が試験試料中で検出されるように、迅速に倍加する細菌検出方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、試料中に存在する標的細菌を検出するための代用物として特異的ファージ生物マーカーの検出を用いる細菌検出方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、試料中の前記標的細菌の存在を特異的に検出する手段として、標的細菌の高度に特異的なファージ感染を利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、適切なファージが存在する任意の細菌を検出するために、使用しうる細菌検出方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、遺伝的に修飾されていないファージを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、遺伝的に修飾されたバクテリオファージを利用する微生物検出方法を提供することである。たとえば、バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を強化するように、検出可能な生物マーカーを過剰発現させるように、酵素を発現するように、またはカプシドタンパク質上で標的を発現するように、遺伝的に修飾することができる。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、高い感度を達成する手段としてファージ増幅を使用する細菌検出方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、ファージのカプシド鞘などのファージに関連する特異的生物マーカーを検出することにより、ファージを検出する細菌検出方法を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、ファージ生物マーカーが、ファージからの別個の解離タンパク質である細菌検出方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、ファージ生物マーカーがファージ核酸である細菌検出方法を提供することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、検出プロセスの前に、ファージを解離させることからなる第２の増幅プロセスを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、ファージ増幅によって生産される子孫ファージとは区別できる標識された親ファージを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、抗体−ファージ複合体を生産するファージ生物マーカーに結合する抗体を使用する細菌検出方法を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、抗体−ファージ複合体を検出するための手段としての特異的抗体−抗原結合事象を検出するために既存の免疫学的検定技術を使用し、これにより、試料中の標的細菌の存在を検出する細菌検出方法を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、ファージを検出するためにラテラルフローストリップを利用し、これにより、試料中の標的細菌の存在を検出する細菌検出方法を提供することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、細菌の抗生物質耐性株を検出する方法を提供することである。
【００４３】
上記の要約は、本発明を理解しやくするために、本発明の目的、特徴および利点のいくつかの例を説明することを目的としている。本発明のいくつかの実施形態において、上記目的のただ１つだけが実現される場合もあるし、他の例では、上記目的の複数が実現される場合もある。しかしながら、上記の目的はすべてが包括的ではなく例示を目的としており、ある特定の実施形態においては上記の目的のいずれも実現されていない場合もある。たとえば、本発明の方法および装置は、細菌以外の微生物、例えば、真菌、マイコプラズマ、原生動物、および他の微生物を検出するために用いることもできる。しがたって、上記目的における用語「細菌」をより広義の用語「微生物」と置き換えると、本発明に有効な目的が表現される。本発明の数多くの他の特徴、目的、利点が、以下の説明を添付の図面とともに読むことにより、明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（１．序論）
本発明の方法は、試料中の細菌などの標的微生物（微生物）の存在を検出するために、バクテリオファージ、あるいは単にファージを使用することに依存する。本開示において、バクテリオファージおよびファージという用語は、バクテリオファージ、ファージ、ミコバクテリオファージ（ＴＢおよびパラＴＢに対するものなど）、ミコファージ（真菌に対するものなど）、ミコプラズマファージまたはミコプラズマのファージ、ならびに、生きた細菌、真菌、ミコプラズマ、原生生物および他の微生物に侵入して、これらを使って自身を複製することのできるウィルスのことをいう他の任意の用語を含んでいる。ここで、「微視的」とは、最大寸法が１ミリメートル以下のものを意味する。バクテリオファージは、細菌を自身の複製の手段として使用するように自然界において進化してきたウィルスである。ファージはこのことを、自身を細菌に付着し、自身のＤＮＡを細菌に注入し、該細菌に該ファージを何百倍、または何千倍にも複製させるように誘導することによって行う。溶菌バクテリオファージと呼ばれるバクテリオファージでは、宿主細菌を破裂させ、他の細菌に進路を見いだすために子孫ファージを環境中に放出する。細菌の溶菌のための、細菌のファージ感染、ファージ増殖または細菌中における増殖のため全インキュベーション時間は、いずれの場合でも、当該ファージおよび細菌ならびに環境条件によって数十分から数時間である。
【００４５】
開示した検出方法は、現在知られているどの微生物検出方法よりも優れた特異性、感度、簡便性、速度、および／または費用を併せて提供する。ここで教示する方法は、試料中の１つ以上の標的細菌の存在を間接的に検出するために、バクテリオファージを使用することに依存している。典型的なバクテリオファージ７０、この場合ＭＳ２−Ｅ．ｃｏｌｉを図５に示す。構造的には、バクテリオファージ７０は、ウィルス核酸７４、すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡを封入する、ヘッドと呼ばれることもあるタンパク質殻またはカプシド７２を含む。バクテリオファージは、内部タンパク質７５、ネック７６、尾部鞘７７、尾部繊維７８、および端板７９、およびピン８０をさらに含んでいてももよい。カプシド７２は、１つ以上のタンパク質の反復コピーから構成される。図１０を参照して、ファージ１５０が細菌１５２に感染すると、該ファージは自身が細菌壁または膜１５１の適当部位に付着し、その核酸１５４を細菌中に注入して、ファージが数十から数千コピーに複製されるように誘導する。このプロセスを図１０に概略的に示す。ＤＮＡは初期ｍＲＮＡＳ１５５および初期タンパク質１５６に展開し、そのうちのいくつかがライン１５７に沿って膜成分となり、他のものが宿主の染色体１５９からの細菌ヌクレアーゼを利用してライン１６４に沿ってＤＮＡ前駆体になる。他のものは方向１７０に沿って移動し、ライン１６６に沿ったＤＮＡを取り込むヘッド前駆体になる。膜成分は、経路１６０に沿って発達して、鞘、端板、およびピンを形成する。他のタンパク質は経路１７２に沿って発達し、尾部繊維を形成する。ヘッドは形成されると、膜１５１から遊離し、経路１７４に沿った尾部鞘を接合し、尾部鞘とヘッドが１７６において尾部繊維と接合して、バクテリオファージ７０を形成する。溶菌バクテリオファージとよばれるある種のバクテリオファージは、１８０で示される宿主細菌を破壊し、他の細菌への進路を見いだすために、子孫ファージを環境中に放出する。本願で開示する方法においては溶菌ファージを典型的に使用する。しかしながら、特に、子孫ファージが宿主細菌に感染した後に子孫ファージまたは子孫ファージの一部を放出するように非溶菌ファージまたは細菌を活性化することができる場合には、非溶菌ファージを用いることもできる。
【００４６】
細菌の溶菌のための、細菌のファージ感染、ファージ増殖または細菌中における増殖のための合計周期時間は、いずれの場合でも、当該ファージおよび細菌ならびに環境条件によって数十分から数時間である。一例として、ＭＳ２バクテリオファージは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株に感染し、標的細胞への付着後４０分以内に、自身のコピーを１０，０００から２０，０００個産生することができる。ＭＳ２ファージのカプシドは、１８０コピーの同一のタンパク質を含む。このことは、ＭＳ２に感染した各Ｅ．ｃｏｌｉに対して、１．８×１０６個以上の個別のカプシドタンパク質が産生されることを意味する。感染事象毎に多数のファージ、ならびにさらに多くのカプシドタンパク質が生産されるファージ感染のプロセスは、ファージ増幅と呼ばれる。
【００４７】
微生物学者達は、たいていのヒト細菌病原体に対する特異的ファージを含む、何千ものファージ種を単離し、キャラクタライズしてきた。バクテリオファージ種には、細菌ファミリーに感染するもの、個々の種に感染するもの、または特定の株に感染するものがある。表１は、そのようなファージのいくつかと、該ファージが感染する細菌をあげている。
【００４８】
【表１−１】
【００４９】
【表１−２】
本発明は、高度に特異的なファージ−細菌感染、ファージ増幅、および短いインキュベーション時間などのバクテリオファージの既存の特性を利用しており、標的細菌に高度に特異的で、非常に感度が高く、迅速で、実施が容易であり、および／または相当に経済的である細菌検出方法を編み出している。さらに、他のファージに基づく細菌検出方法とは違って、本願に記載する好ましい方法は、バイオレポータまたはインデューサ遺伝子を含むような遺伝的修飾を受けていないファージを利用している。このことにより、本発明を使用した特異的細菌試験の開発に伴う時間および費用が大幅に削減される。
【００５０】
（２．詳細な説明）
図１は、試料中の特定の細菌を検出するための方法の第１の実施形態１０を示す。第１の「ファージの添加」プロセス１２において、標的細菌１４に感染することになる親バクテリオファージ１８を、細菌１４の原試料１１と混合する。好ましい実施形態において、好ましくは懸濁液または溶液１６中のバクテリオファージを、所定の濃度で細菌１４の原試料１１に添加する。ここで、「原試料」という用語は、ファージを添加する前の試料のことをいう。原試料／ファージ混合物は、ここでは「試験試料２４」または「バクテリオファージに曝露されたサンプル２４」とよぶ。方法の目的が、種または株レベルで特定の細菌を検出することであれば、これに応じた特定のファージを該方法において用いる。たとえば、Ｙ．Ｐｅｓｔｉｓ．を特異的に検出するためには、φＡ１１２２ファージを用いることができる。これに対し、試料中のより広範な細菌を検出するためには、より特異性の低いファージを用いるとよい。ファージＭＳ２は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉだけでなく多くの異なるＥ．ｃｏｌｉ種に感染するので、水中の糞便汚染を検出するのに非常に適している。
【００５１】
複数の細菌を検出するためには、各標的細菌に対して１つの種のバクテリオファージを原試料に加え、すべての標的細菌と関連するファージを含む１つの試料を与える。簡略化のために、本方法については、１つの細菌の検出に適用するものとして、下記に記述する。当業者であれば、各標的細菌を検出するために、唯一の細菌／ファージ組み合わせを用いた１つの試験試料と、方法の各プロセスをどのようにして同期して実施するかが明らかであろう。
【００５２】
標的細菌１４を含んだ原試料１１は、一般には液体であるが、固体または粉体であることもある。原試料は、多くの異なる有機および無機化合物を含んだ混合物または懸濁液であることもある。原試料は、試験用に調製するために、様々な方法で前処理されていてもよい。たとえば、原試料は、不要な成分を除去するために、または標的細菌を濃縮するために精製またはろ過されていてもよい。また、標的細菌のインキュベーションをもたらすように、または標的細菌をより見やすい状態にするような培地中で培養したものであってもよい。原試料は、相対的に未処理の状態、例えば、唾液、血液、または水試料のようなものであってもよい。当業者にとっては、前試験試料調製物が広範は適切なプロセスの任意のものを含んでいてもよく、原試料が多種多様な形態をとってよいことが明らかであろう。
【００５３】
ファージ自体を様々な形態の試料に添加してもよい。乾燥状態で加えてもよい。ファージは、液体試薬混合物中に混合または懸濁してもよい。ファージは、原試料を添加するバイアル中で懸濁してもよい。ファージは、任意の他の適切な形態をとってもよい。原試料に添加するファージを、ここでは「親ファージ」と呼ぶ。
【００５４】
図１に戻って、試験試料２４を好ましくは所定時間インキュベートする。本方法に対しては、試験試料は、好ましくは、インキュベーションプロセス前に、標的細菌のファージ感染を助けるような条件におくべきである。このことは、当業者によって知られる様々な方法によって達成できる。たとえば、親ファージは、原試料に添加されると感染を助ける試験試料をもたらす試薬中に混合してもよい。試験試料は、ファージ感染を助ける条件を確立するための様々な方法によって調製してもよい。
【００５５】
「インキュベート」プロセス２０を図２に示す。親ファージ１８は、自身を標的の細胞壁に付着させることにより、標的細菌１４に感染し（３２）、ウィルス核酸を注入して、感染細菌２３を作り出す。そして、図１０に示すような子孫ファージの複製３４が、宿主細菌内で進む。溶菌ファージを用いる場合には、宿主は溶菌プロセス３６において破裂し、子孫ファージ３７を試験試料中に放出し、ここで他の標的細菌に感染することもある。このインキュベーションプロセスは、１回以上の感染、増幅、および溶菌のサイクルのあいだに進行させてもよい。原試料中に標的細菌が存在すると想定すると、試験試料は、インキュベーションプロセスの間に感染された個々の細菌に対して多数の子孫ファージを含むであろう。
【００５６】
「インキュベート」プロセスの最後で、感染標的細菌のうちのいくらかが溶菌されていないかもしれない。そうした状況において、多くのまたはすべての子孫ファージがまだ宿主細菌内に保持されており、これは直接検出することができないかもしれない。この潜在的問題に取り組むために、２１において、試験試料に特定の微生物に対する微生物リゾチーム２２を加えて、プロセス２５において、試験試料２４中に存在する細菌などの本質的にすべての個々の微生物の細胞壁を破壊して、そこに含まれる本質的にすべての子孫ファージを放出させることにより、図１で示すようにオプションのプロセス２１および２５「細菌の溶菌」を行う。微生物の、またはより詳細には細菌のリゾチームを使用することで、本願に教示する方法を実施するのに必要な時間を短縮することができる。これは、標的細菌のすべてが自ら溶菌するのを待つ必要がなくなるからである。ゆっくり溶菌するファージに対しては、このことは、実質的な違いをもたらしうる。本発明の目的のために、「リゾチーム」という用語は、微生物宿主の破壊を誘導して、試料中への子孫ファージを放出させる任意の材料、装置、またはプロセスのことをいい、限定はされないが、従来のリゾチームやクロロホルムなどの化学的手段、または酸処理または物理的プロセス、たとえば、浸透圧の付加などが含まれる。
【００５７】
図１に示す実施形態のプロセス２８「ファージの検出」は、ファージに関連する生物マーカーを検出することを含む。この生物マーカーが検出されると、これは、原試料中に標的細菌が存在することを間接的に示すものである。これから記載する方法の実施形態に対して、原試料に添加される親ファージと子孫ファージとは、インキュベーションプロセスのあいだに産生されたならば、同一である。このことは、試験試料中に標的細菌が存在しないとしても、関連するバックグラウンドシグナルを上昇させうるファージが検出プロセス２８のあいだに存在することを意味している。この問題を解決するための方法は、試験試料中の親ファージの初期濃度を、それらが与えるバックグラウンドシグナルが検出プロセス２８において検出不能となるように制御することである。したがって、ファージ増幅が起こっていないなど、試験試料に標的細菌が存在しない場合には、試験の最後にシグナルは検出されない。バックグラウンドシグナルを親プラス子孫ファージからのシグナル上昇と区別できる場合に限り、より高濃度の親ファージを用いることもできる。プロセス２８において得られるシグナルがバックグラウンドシグナルあら区別できるような最低の細菌濃度が、本方法の感度限界を表す。これを行う簡単な方法は、細菌が存在しないことがわかっている対照試料に対して試験を行うことである。これにより、試験試料からの対応する結果と比較できる対照結果を作製することができる。試験試料からの試験結果が、はっきりと対照試料よりも高いシグナルレベルを示す場合には、標的細菌が存在することがわかる。
【００５８】
本発明の目的のために、ファージに関連する任意の生物マーカーを、原試料中の標的細菌の間接的検出手段として用いることができる。これには、図５および図１０に示すファージの任意の部分が含まれる。たとえば、図１１は、バクテリオファージＴ４に対して、質量に対する強度百分率を表したＭＡＬＤＩスペクトル２００を示している。スペクトル２００は、溶菌ホリンタンパク質に対する顕著なピーク２０１と、ヘッドタンパク質に対する顕著なピーク２０４と、ｈｏｃ外部カプシドタンパク質に対する顕著なピーク２０６と、フィブリチンに対する顕著なピーク２０８を示している。これらの大きなピークは、これらのファージ部分のいずれも、後で検討するＭＡＬＤＩ検出法における生物マーカーとして使用可能であることを示している。非常に有用なファージ生物マーカーは、ファージカプシド７２である。このカプシドは、たいていは、１００コピーを超える多くのコピーの１つ以上のタンパク質を含んでいる。したがって、検出目的で使用できる複数の同一の結合部位が個々のファージ粒子のそれぞれの周囲に存在する。これにより、試験試料中に含まれる各ファージ粒子から得られる潜在的シグナルレベルが上昇する。溶菌した標的細菌に関連する生物マーカーを直接検出することに対する、ファージまたはファージ関連生物マーカーを検出することの利点は、感度が劇的に上昇することである。インキュベートされた試験試料中のファージ濃度は、ファージ増幅のために、標的細菌原試料中の標的細菌の濃度よりもはるかに高くなっている。ファージ増幅は、原試料中に存在する個々の細菌のそれぞれに関連するシグナルを、何桁倍、たとえば、１０倍に増強することができる。したがって、ファージ増幅プロセスを用いない他の方法よりも低い濃度の細菌を、この方法では検出することができる。
【００５９】
ファージに関連する何らかの生物マーカーを検出するどの検出方法または装置も、この方法２８には十分である。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、アプタマーに基づくアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法、およびラテラルフローイムノクロマトグラフィー（ＬＦＩ）を含む、検出可能なシグナルを発生するために抗体結合事象を利用する免疫検定法である。他の方法としては、本明細書ではＭＡＬＤＩと呼ぶ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、ならびに、検出指標として色が変化するＳＩＬＡＳ表面を用いることがあげられる。１つの免疫検定であるＬＦＩについては、図３、５および１９と関連して以下に詳細に検討し、ＳＩＬＡＳ色指標法については、図１２〜１８と関連して以下に詳細に検討し、ＭＡＬＤＩ法については、図１１および図２４〜２７に関連して以下に詳細に検討する。
【００６０】
図３は、試験試料中のファージの存在を検出するためのＬＦＩを、ラテラルフローストリップ４０を用いてどのように具現できるかを説明するものである。ラテラルフローストリップ４０の断面図を図４に示す。ラテラルフローストリップ４０は好ましくは、試料塗布パッド４１と、共役物パッド４３と、検出ライン４６および内部標準ライン４８が形成された基板６４と、吸収パッド５２とを含み、これらのすべては、好ましくはプラスチックである裏張り６２上に搭載されている。基板６４は好ましくは多孔性の網または膜である。これは、ライン４３、４６、および随意でライン４８を前記基板の長いシート上に形成し、基板をこれらのラインと垂直な方向に裁断して、複数の基板６４を形成することによって作製する。接合物パッド４３は、それぞれが、ここでは第１抗体−ビーズ共役物を形成する第１の抗体とよぶ、第１の抗体４４に接合されたカラービーズ４５を含んでいる。第１の抗体４４は、試験試料中のファージ５１に選択的に結合する。検出ライン４６および対照ライン４８は、いずれも試薬ラインであり、それぞれが固定化ゾーンを形成している。すなわち、バクテリオファージまたは他の生物マーカーと適切な様式で相互作用する材料を含んでいる。好ましい実施形態において、相互作用は、バクテリオファージまたは他の生物マーカーを固定化するようなものである。検出ライン４６は、固定化された第２の抗体４７を含み、抗体ライン４６が、ストリップに沿った流れ方向に垂直となり、流れ中のファージの有意な部分を捕捉するのに十分な密度を有している。第２の抗体４７もまた、ファージ５１に特異的に結合する。第１の抗体４４および第２の抗体４７は、同一であってもなくてもよい。いずれかがポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。随意で、ストリップ４０は、第３の抗体４９を含む第２の試薬ライン４８を含んでいてもよい。第３の抗体４９は、第１および第２の抗体の１つ以上と同一であってもなくてもよい。第２の試薬ライン４８は、アッセイが適切に機能するかどうかを調べるための内部標準ゾーンとして機能させてもよい。
【００６１】
１滴以上の試験試料５０を、図３Ａに示すように試料パッドに加える。試験試料５０は好ましくは、元の原試料に標的が存在する場合には、親ファージならびに子孫ファージを含んでいる。試験試料は、ストリップの対向端部にある吸収パッド５２に向けてラテラルフローストリップ４０に沿って流れる。ファージ粒子は共役物パッドに沿って膜に向けて流れる際に、図３Ｂに示すように、ファージ−ビーズ複合体５４を形成する第１の抗体−ビーズ共役物４２の１つ以上を取り込む。ファージ−ビーズ複合体は第２抗体４７の列４６上を移動する際に、図３Ｃに示すように、固定化され、濃縮された第１の抗体−ビーズ−ファージ−第２の抗体複合体５８を形成する。十分なファージ−ビーズ複合体が固定化された第２抗体の列４６に結合すると、着色されたライン５９が裸眼で視認できるようになる。可視ライン５９は、標的細菌が原試料中に存在したことを示す。ラインが形成されない場合には、標的細菌は原試料中に存在しなかったか、あるいはラテラルフローストリップ４０で検出できないほど低濃度でしか存在しなかったことになる。この試験の信頼性を得るために、原試料に加える親ファージの濃度は、親ファージ単独では、ラテラルフローストリップ上の可視ラインを形成できるほどの量が存在しないように、十分に低くすべきである。抗体−ビーズ共役物４５は、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質に相互作用するように設計された調色剤である。抗体−ビーズ共役物４５は、固定化ゾーン４６に固定化されると、固定化ゾーンに色の変化をもたらす。
【００６２】
図６は、本発明に従う標的細菌を検出するための方法の第２の実施形態９０を示し、該方法９０は感度が向上している。「ファージの添加」、「インキュベート」および「細菌の溶菌」からなるプロセス１２，２０、およびオプションのプロセス２１は、図１に関して記載した対応するプロセスと同じである。オプションプロセス２１の後、原試料中に標的細菌に存在する場合には、試験試料はファージ粒子を豊富に含んでいる。
【００６３】
図６に示すように、第２実施形態９０のプロセス９４、「ファージの解離」は、ファージ解離剤９２を試験試料に添加することを含む。ファージ解離剤９２は、ファージ粒子を、個々のカプシドタンパク質およびウィルス核酸を含むそれらの構成成分９７に分解する。ファージ解離剤の例としては、酸処理、尿素、変性剤および酵素があげられる。任意の適切なファージ解離剤を用いることができる。このプロセスにおいて、解離されたバクテリオファージ物質９７が生産される。
【００６４】
図６に示す実施形態のプロセス９９「ファージ小成分の検出」は、生物マーカー、すなわち、解離したファージ小成分に関連する解離されたバクテリオファージ物質９７を検出することを含む。上記の議論に関して、バクテリオファージ物質は、解離したバクテリオファージ物質と同時に、バクテリオファージに結合したものの両方でありうることを理解すべきである。すなわち、「解離したバクテリオファージ物質」という用語は、もはや全バクテリオファージの一部ではないものをさし、「バクテリオファージに関連した」という用語は、該物質はある時点ではバクテリオファージの一部であったか、バクテリオファージ複製の過程で生産されたものである。プロセス９４においてファージ解離剤を使用することによって、プロセス９９において検出可能な豊富な個々のカプシドタンパク質９７が存在する。第１実施形態と同様に、これらは、確立された抗原−抗体に基づく免疫検定技術を用いて検出することができる。さらに、露出したウィルス遺伝物質は、ＰＣＲ、遺伝的プローブバイオセンサー、光アプタマー、分子ビーコン、またはゲル電気泳動を含む他の確立された技術を用いて検出することができる。任意の適切なファージ生物マーカー検出方法または装置を用いることができる。
【００６５】
試験試料の親ファージの濃度をバックグラウンド検出限界未満に保持することにより、原試料にファージを加え、インキュベートし、ファージ生物マーカーを検出するだけの簡単な方法にすることができる。しかしながら、潜在的な欠点もある。潜在的に低濃度の親ファージは、試験試料における標的細菌に対する親ファージの比が１未満になる条件、すなわち、感染多重度（ＭＯＩ）が低い条件を生み出してしまう。試験試料中のすべての標的細菌が、高確率で感染されるようにするために、プロセス２０におけるインキュベーション時間はたとえば、感染および溶菌のサイクル２回以上と同等の時間など長くすることができる。このように、試験の簡潔性を潜在的に長い試験時間によって埋め合わせる。この潜在的限界は、親ファージに関連するシグナルを排除できるか、より高濃度の親ファージを利用できる（ＭＯＩが５を超える）ように著しく減少させることができれば、克服することができる。上記の限界は、生物マーカーとしてカプシドタンパク質を使用するなどして、子孫ファージによるシグナルを増強するか、遺伝的に増強されたファージを用いることによっても、克服することができ、そのいずれも本願で詳細に検討する。
【００６６】
図７は、試料中の標的細菌を検出するための本発明の第３実施形態１００を示し、この実施形態ではより迅速な結果を達成可能である。本願の本実施形態において、原試料と混合する親ファージ１０２を標識して、タグ印１０４で示して、試験試料からあとで除去することができ、バクテリオファージを検出する試験試料の部分から単離できるようにするか、さもなくば最初にタグを外した子孫ファージが検出されるシグナルに寄与するように分析に先立って中和する。たとえば、１実施形態において、ビオチン化ファージを親ファージとして使用する。ビオチン化バクテリオファージは、ストレプトアビジンに強力に引きつけられる。この強力な親和性を用いて、以下に検討するように、試験試料から標識した親ファージを後に分離した。標識した親ファージは、たとえば、プローブまたは網目構造物を親バクテリオファージでコーティングするか、またはファージを基板に科学的に結合することにより、物理的基板に付着させることもできる。標識したバクテリオファージは、試験試料から基板を除去することにより、あるいは、基板より分離された試験試料中の部分中のバクテリオファージを検出することにより、子孫バクテリオファージから分離することができる。
【００６７】
本実施形態のプロセス１０５，１０７および１０８，「ファージの添加」、「インキュベート」および「細菌の溶菌」は、それぞれ、プロセス１０５において原試料に加える親ファージ１０３の溶液が、標識されたファージ１０２を含み、したがって、バクテリオファージに曝露されたサンプル１０９が、細菌外の標識されたファージ１０２と、細菌内の、非標識子孫ファージ１０６との両方を含むということ以外は、図１および６のプロセス１２，２０および２１と同じである。したがって、溶菌溶液１１２は、標識ファージと非標識ファージの両方を含むことになる。プロセス１１４、「標識したファージの抽出」において、標識された親ファージは、該ファージを試験試料から抽出または実質的に除去する、もしくは親ファージを子孫ファージから単離して、それらが分析されるシグナルに寄与しないようにすることにより、子孫バクテリオファージから分離される。プロセス１０５において原試料に添加される際に標識された親ファージが物理的基板に付加されている場合には、基板および付随する親ファージは、プロセス１１４において試験試料から物理的に分離することが好ましい。物理的基板に付加されていないビオチン化ファージもまた、試験試料から迅速に分離または除去することができる。一実施形態において、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを試験試料に添加し、ここで、ビオチン化親ファージを急速に回収するようにした。その後、磁気を用いて、磁気ビーズを結合した親ファージとともに試験試料から分離および除去する。下記図２８に関連する磁気抽出の検討を参照のこと。同様に、別の実施形態において、ストレプトアビジンでコートした網を試験試料を通して攪拌し、試験試料からビオチン化親ファージの実質的に全部を回収する。網以外の他の物理的基板またはプローブを用いてもよい。別の実施形態において、ラテラルフロー装置を用いた。抗体ストリップ４６の前の網基板６４の部分６６（図４）にストレプトアビジンを含浸させ、網の遷移をコーティングする。ストレプトアビジンでコートした網を回収し、抗体ストリップ４６に到達する前に親ファージを部分６６に結合させることにより標識した親ファージを固定化する。子孫ファージは、ストレプトアビジンに結合せず、したがって、ストリップを自由に流下し、視覚的に検出された。同様に、試験試料を滴下する試料パッド４１のように、ラテラルフロー装置の他の部分もストレプトアビジンでコーティングまたは含浸させることができる。
【００６８】
ここに記載する方法は、親ファージを標識し、その後、試験試料中からこれを除去するか、該試験試料内で分離するという上記の例に限定されることはない。
【００６９】
図７に示す実施形態のプロセス１１６、「ファージの検出」は、原試料中に存在する標的細菌に対する代理マーカーとしての子孫ファージに関連する生物マーカーを検出するために、試験試料を分析するためのものである。本実施形態で使用する検出手段は、それぞれ図１および６に図示する実施形態１０および９０のプロセス２８および２９に関して記載したものと同じである。先の実施形態と同様に、任意の適切な検出方法または装置を用いることができる。
【００７０】
図８は、試料中の標的細菌を測定するための方法の第４実施形態１２０を示し、該方法１２０においては、より迅速な結果を達成でき、感度が向上している。実施形態１２０は、実施形態９０および１００で教示した方法の組み合わせである。プロセス１０５、１０７、１０８および１１４は、実施形態１００で教示し、図７に図示したもの、すなわち「ファージの添加」、「インキュベート」、随意で「細菌の溶菌」および「標識したファージの検出」とそれぞれ同じである。具体的には、実施形態１２０は、プロセス１０５における標識した親ファージとプロセス１１４における親ファージ除去または分離を組み合わせたものである。
【００７１】
プロセス１２１、「ファージの解離」において、実施形態９０のプロセス９４に教示され、図６に図示されるようにして、ファージ解離剤１２２を、試験試料１２４に添加する。好ましい実施形態において、標識した親ファージを、プロセス１２１においてファージ解離剤に暴露されないように単に分離するのではなく、プロセス１１４において試験試料から物理的に除去する。このようにして、試験試料１２４は、子孫ファージだけを含み、解離された試験試料１２６は、子孫ファージのみからのカプシドタンパク質１２８などの生物マーカー物質を含むことになる。このようにして、ファージカプシドタンパク質１２８の解離に関連する増幅が、プロセス１０７のファージ増幅と合わさって、全増幅が大幅に増大する。たとえば、ファージ増幅プロセスが、細菌あたり１０００の増幅を与え、ファージが、１００コピーの特定のカプシドタンパク質を有する場合には、組み合わせ増幅は、試験試料中で感染した標的細菌あたり１０３×１０２または１０５となる。親ファージを除去しない場合には、全増幅は、プロセス１０７でおこるファージ増幅だけ、すなわち、１０３になるが、これは、ファージの解離によっておこる増幅が、親ファージと子孫ファージの両方にたいして起こり、第２の増幅プロセスを相殺するためである。
【００７２】
図６に示す実施形態１２０の「ファージ小成分の検出」プロセス１３０は、好ましくは、前出の実施形態のプロセス２８，９９および１１６のいずれかと同一である。
【００７３】
図９は、標的細菌を検出し、存在する場合にはそれが１つ以上の抗生物質に耐性をもつかどうかを判定するために本発明の任意の実施形態を用いることができる、方法１４０を示す。標的細菌を含有する可能性のある試料１４２を、１４４で示す第１試料Ａと、１４５で示す第２試料Ｂの２つに分ける。第１の抗生物質１４６を試料Ｂに加え、ここで、試料Ｂ中の標的細菌は、第１の抗生物質に耐性が無ければ殺される。試料ＡおよびＢを１４８および１４９において分析し、それぞれの生きた標的細菌の存在を検出し、結果Ａおよび結果Ｂを与える。本発明において教示するいずれの方法も、これらの分析のために用いることができる。結果Ａが陽性であれば、標的細菌が元の試料に存在することを示す。結果Ｂも陽性であれば、標的細菌が第１の抗生物質に耐性であることを示す。一方、結果Ｂが陰性であれば、標的細菌は第１の抗生物質に耐性でないことを示す。ある範囲の抗生物質のいずれかに対する抗生物質耐性を同時にスクリーニングするために、標的細菌に対する分析に先立って、試料Ｂにすべての関心のある抗生物質を矩泡得る。標的細菌が純粋試料と抗生物質で処理した試料の両方で検出されると、試料中の標的細菌が加えた抗生物質の１つの耐性であることを示す。このプロセスは、細菌の抗生物質または他の除染装置に対する感受性を判定するために用いることもできる。また、細菌除染プロセスが成功したかどうかを調べるために用いることもできる。試料を対照部分と試験部分に分けることにより、細菌学的方法および物質の有効性を調べることができる。当業者であれば、生きた細菌が存在するかどうかを判定することが望ましいほぼすべての場合において、本発明のプロセスを用いることができることを理解するであろう。
【００７４】
図１２〜図１８は、検出プロセス２８，９９，１１６および１３０の別の実施形態を示す。このプロセスは、ＳＩＬＡＳ表面２２０を用いる。ＳＩＬＡＳ表面２２０は、随意で付加ポリマー２２４で覆ったコーティング２２２を有していてもよい半導体または絶縁体ウェハ２２１からなる。技術上周知のように、ＳＩＬＡＳ表面は、特定の光波長を反射し、干渉により別のものを減衰するように設計されている。これらの表面は、光と、表面上に形成されたフィルムとの直接相互作用によって可視シグナルを発生する。薄いフィルムは、光学コーティングを含むか、および／または表面への特定の標的分子の結合によって創出される生物フィルムである。光の光路が表面上に蓄積した生物量によって延長されるために、陽性の結果は通常は、金色から紫色への色変化として認められる。フィルムの厚みと屈折率によって、観察される個々の色および陰影が決まる。一般に、入射光と同位相の表面上から反射した光の波長が加わるか、建設的干渉を受けて、視認できるようになる。入射光とは異なる位相の表面から反射する波長は、相殺的干渉によって減衰されて、フィルムから浮上することはない。好ましくは、ウェハ２２１はケイ素からなり、光学コーティングは窒化ケイ素からなり、付加ポリマーは疎水性ポリマーからなる。図１３〜図１６は、付加ポリマー２２４の表面上の実質的に均一に分配された多数の抗体／ファージ／抗体共役物２３１を示す、単一の大きく拡大された該構造物を利用して、ＳＩＬＡＳ表面をいかにして、ファージマーカーの存在を示すために用いるかを示した図である。図１３において、カプシドタンパク質などのファージマーカーに特異的な第１抗体２２８を、付加ポリマーに付加して、該ポリマーの表面２２５を固定化ゾーンにする。試料溶液を表面２２４に接触させる。指定のファージ生物マーカー２３０が存在すれば、該マーカーは図１４に示すように第１抗体２２８に付加する。図１５において、生物マーカーが存在すれば、第２検出抗体２３２が表面２２４に接触されて、生物マーカー２３０に付加する。第２抗体２３２を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼなどの反応試薬で標識する。そして、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの酵素を表面に塗布し（２３６）、該酵素はＨＲＰと反応して沈殿２３８を形成し、これが被膜層２４０（図１６）を形成して、表面の色を変える。図１６に示すように、表面２４５上に衝突した光２４２は、被膜層２４０が存在するか否かによって、２４４および２４６に示すように様々に反射する。このようにして、反応試薬で標識された第２抗体２３２と、酵素と、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質と相互作用する調光剤２３５に対する光学コーティング２２２との組み合わせ、すなわちバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質の存在によって、固定化ゾーン２２５の色変化がもたらされる。
【００７５】
図１７および図１８は、陰性の結果に対する被膜層２４０なしのＳＩＬＡＳ表面（図１７）と、陽性の結果に対する被膜層２４０ありのＳＩＬＡＳ表面（図１８）との間の反射率の違いを示したものである。反射率は、陰性結果に対しては橙色から赤色の波長において高くなって金色をもたらし、陽性結果に対しては、深青波長において高くなって紫色をもたらした。ＳＩＬＡＳ表面は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８１Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ０２４５４−９０４６より入手可能である。ＳＩＬＡＳプロセスの説明については、インターネット上のＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏ．ｃｏｍ．などで入手できる。
【００７６】
図１９は、微生物を検出するための例示的試験キット２５４を、試験キットを用いるための典型的な説明書とともに示したものである。図２０も参照のこと。試験キット２５４は好ましくは、緩衝溶液２５８の容器２５６と、反応容器２６０と、保護ケース２６３に封入された１つ以上の検出要素２６６（図２０）と、該キットを使用するための説明書２７０と、前出のキット部品を保持するための容器２７２とを含む。保護ケース２６３は、細菌が存在しない場合に予想される結果２６７を示す対照検出要素２７６を含んでいてもよい。たとえば、検出要素がラテラルフローストリップであれば、対照検出要素は、細菌が全く存在しないバクテリオファージの対照試料が塗布された同じラテラルフローストリップとするとよい。反応容器２６０は、容器本体２６７と、容器蓋２６４とを含む。好ましくは、反応容器本体は、瓶２６７であり、反応容器蓋は瓶キャップ２６４である。反応容器２６０はファージ２６８を含む。ファージ２６８は、好ましくは反応容器本体２６７の内壁２６９に付加された所定量のファージからなる。キャップ２６４は、好ましくは、瓶２６７の上部のネジと螺合する内ネジ２６２を有するネジ式キャップである。キャップ２６４は、好ましくは、所定の大きさの液滴を放出するように設計された滴下ヘッドである、ディスペンサ２６５を含むことが好ましい。本実施形態において、検出要素２６６はラテラルフローストリップ２６６であるが、図１２〜１６に関して説明したように、ＳＩＬＡＳ表面要素であってもよい。フローストリップ２６６は、試料パッド２７４（図２０）と、検出ウィンドウ２７８とを含む。好ましくは、容器２７２は、試験キット部品の保持と試験終了後の便利な処分容器の２つの役割をはたすプラスチックバッグ２７２からなる。
【００７７】
図２０は、試験キット２５４を使用するための例示的説明書組２７０を示す。説明書２７０は、好ましくは、試験手順を示す文字および図を印刷した紙のシートからなる。説明書２７０は、微生物を検出するための例示的方法２８０も説明する。方法２８０は、プロセス２８１，２８２，２８４および２８６を含む。第１プロセス２８１において、キャップ２６４および滴下ヘッド２６５を外すことにより、反応瓶２６７をあけ、５ミリリットル（ｍＬ）の試料を加える。次に緩衝溶液２５８を加える。プロセス２８２において、滴下ヘッド２６５および瓶２６７上のキャップ２６４を戻し、蓋をした反応容器２６０を好ましくは例えば１分間などの所定時間だけ攪拌した後、好ましくは例えば１時間などの所定の時間量だけ放置することにより溶液をインキュベートする。キャップ２６４を取り外し、所定量のインキュベート後の試料を試料パッド２７８上に放出する。そして使用者は例えば３分間などの所定の時間量だけ待つ。プロセス２８６において、使用者は検出ウィンドウ２７８を覗いて結果を見る。先に検討したように、試料が試験キットが特定する細菌を含んでいれば、青などの第１の色の第１ライン２８８が現れる。第１の色のラインが現れない場合には、試験結果は陰性である。随意で、試験が有効であることを示すように、第２の色の第２ライン２９０が出現することが好ましい。第１ライン２８８は、図３の試薬ライン４６に相当し、第２ライン２９０は、図３の内部標準ゾーン４８に相当する。対照検出要素２７６（図１９）を用いて、第１ライン２８８を対照ライン２７７と比較して試験が陽性または陰性のいずれであるかを判定するようにしてもよい。たとえば、第１ライン２８８が対照ライン２７７よりも明らかに深い青色であれば、陽性結果であることがわかる。
【００７８】
図２１は、感染プロセスの所望の特性を強化するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージ３０２を用いた、本発明に従う例示的アッセイ３００を示す。ここで「遺伝的に修飾されたバクテリオファージ」とは、ＤＮＡが何らかの方法で修飾または操作されたバクテリオファージと、特定の特性を増強するように選択的に繁殖されたバクテリオファージの両方を含む。所望の特性としては、バースト容積、バースト時間、および感染性などがあげられる。バースト容積とは、複製されるファージの量であり、バースト時間とは、ファージが標的細菌を破裂させるまでの時間であり、感染性とは、感染細菌におけるファージの有効性、すなわち、所定量のファージによって感染される利用可能な細菌の百分率である。ファージは、上記所望の特性および／または他の所望の特性の１つ以上を強化するように遺伝的に修飾されていてもよいし。図２１に示すように、遺伝的に修飾されたファージ３０２を用いて、非修飾ファージの場合と同様に微生物の検出を行う。すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３０２を、宿主微生物３０４の試料に加え（３０３）、感染させ、インキュベートし（３０５）、ファージ子孫を発生させ（３０６）、これを検出する（３０７）。親ファージ３０２は、感染プロセスの特性を強化するように遺伝的に改変されているので、検出は、より迅速に、より感度よく、および／またはより信頼性高くすることができる。
【００７９】
図２２は、タンパク質などの検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージ３１２を用いた、本発明に従う例示的アッセイ３１０を示したものである。図２２に示すように、遺伝的に修飾されたファージ３１２を用いて、非修飾ファージの場合と同様に微生物の検出を行う。すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３１２を、宿主微生物３１４の試料に加え（３１３）、感染させ、インキュベートし（３１５）、ファージ子孫を発生させ（３１６）、これを検出する（３１７）。親ファージ３０２は、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されているので、この生物マーカーはより容易に検出され、したがって、検出は、より迅速に、より感度よく進み、すなわち、より低いレベルの細菌を検出することができる。あるいは、これにより親ファージの使用量を少なくすることができる。
【００８０】
図２３は、酵素を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージバクテリオファージを用いた、本発明に従う例示的アッセイ３３１を示したものである。図２３に示すように、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３２２を、宿主微生物３２４の試料に加え（３２３）、感染させ、インキュベートし（３２５）、酵素を発生させる（３２６）。細菌は溶菌してもしなくてもよい。基板３２８を加え（３２７）、これが酵素と反応して（３２９）、酵素生成物３３０また他の酵素作用を与えるので、これを検出する。この遺伝的修飾により、より容易に実施でき、より迅速および／または高感度で進行できるか、親ファージの使用量を少なくできる代替検出方法を与えることができる。
【００８１】
図２４は、カプシドタンパク質上に標的を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージバクテリオファージを用いた、本発明に従う例示的アッセイを示したものである。図２４に示すように、すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３３２を、宿主微生物３３４の試料に加え（３３３）、感染させ、インキュベートし（３５５）、カプシドタンパク質３３５の表面上に生物マーカー３３６を含んだファージ子孫を発生させ（３３８）る。生物マーカーは、カプシドの外側にあるので、他のマーカーよりも容易に検出しうるか、および／またはファージ解離プロセスなしで検出することができ、検出速度の向上を図れる。
【実施例】
【００８２】
（３．実施例）
（Ａ．ラテラルフロー実施例）
以下の実施例において、図１のプロセスにおけるＥ．ｃｏｌｉの検出のためにＭＳ２ファージを用いる。図３および４に示すようなラテラルフローストリップを、ＭＳ２ファージに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いて調製する。
【００８３】
ラテラルフローストリップのＭＳ２検出限界の決定−バクテリオファージＭＳ２（ＡＴＣＣ１５５９７−Ｂ１）は、コンフルーエントプレート上の感染Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１５５９７）細胞から調製した。この調製からの生きたＭＳ２の濃度は、プラークアッセイによって２×１０７ｐｆｕ／ｍＬであった。このＭＳ２ストックを、１×１０７ｐｆｕ／ｍＬから１×１０５ｐｆｕ／ｍＬの範囲を与えるように系列希釈した。ＭＳ２は、ラテラルフローストリップを用いて検出した。結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
線強度は、試料をラテラルフローストリップに流してから１５分後に目視で判定した。線強度は、最大線強度を示す「＋＋」から、線を検出できない「−」までの尺度範囲上でランク付けした。「＋／−」は、かろうじて検出可能な線を示す。このアッセイの結果は、上記試験のために調製したラテラルフローストリップ上でのＭＳ２の検出限界が、１×１０６ｐｆｕ／ｍＬであることを示している。
【００８５】
Ｅ．ｃｏｌｉ検出限界と全試験時間の決定−飽和培養からのＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１５５９７）を希釈して、１×１０８，１×１０７，１×１０６，１×１０５，１×１０４，１×１０３，および１×１０２細胞／ｍＬの濃度を有する原試料を作製した。各原試料にＭＳ２を加えて、１×１０６ｐｆｕ／ｍＬのＭＳ２濃度を有する試験試料を与えた。試験試料を、３７°Ｃで１時間から５時間インキュベートした。インキュベーション後、試験試料を、親ＭＳ２濃度が確立された検出限界未満の１×１０５ｐｆｕ／ｍＬとなるように１０：１希釈した。次に、ラテラルフローストリップを用いて試験試料を分析した。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
これらの結果は、開示した発明を用いて、４時間後に１００個のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出できたことを示す。より高いレベルのＥ．ｃｏｌｉ（１×１０５細胞以上）が１時間後に検出可能である。
【００８７】
同様に、上述のラテラルフローストリッププロセスは、ＰＲＤ−１バクテリオファージを用いて豚コレラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）を、ガンマファージを用いて炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を、また、Ｂ−３０バクテリオファージを用いて第８群ストレプトコッカスを検出するためにもうまく使用できた。
【００８８】
（Ｂ．ＳＩＬＡＳ表面実施例）
方法：Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８１ Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ０２４５４−９０４６において開発された標準的な方法を用いて、コーティングされた表面と、ＨＲＰ共役抗体を調製した。簡単に説明すると、表面を４ｕｇ／ｍｌウサギ抗ＭＳ２抗体を含むＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．８）の溶液中で、４８時間コーティングした。コーティング後、ウェハを洗浄し、糖：タンパク質保存剤でオーバーコートし、７ｍｍ四方のチップに分離した。
【００８９】
共役化は、Ｎａｋａｅの方法のＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎに従って進めた。過酸化ナトリウムを用いてＨＲＰを活性かして、無水物をタンパク質の炭水化物部分上に導入した。活性化したＨＲＰとウサギ抗ＭＳ２抗体を混合し、インキュベートした。共役物は、ホウ化水素ナトリウムを加えて、Ｓｃｉｆｆ塩基を減らすことにより安定化した。
【００９０】
与えられたＭＳ２の検出能力を調べるための試験を行った。最初の形式では、同期および連続形式の両方を含んでいた。同期形式は、試料と共役物（共役物希釈物中１：１００に希釈）を混合することと、コーティングされたＯＩＡチップの表面に試料を加えることで構成した。インキュベーションに続いて、表面を洗浄して乾燥させた後、酵素基板（ＴＭＢ）を加えた。１回目および２回目のインキュベーションは、５分間または１０分間、平衡に保った。連続アッセイは、試料と共役物を混合せずに、個別にチップに加えたこと以外は、同期形式と同様に行った。インキュベーション工程は、洗浄とブロッティング工程に分割した。連続アッセイは、すべての工程に対して１０分間のインキュベーションを用いた。
【００９１】
結果：ここに記載する非最適化方法は、明らかに１０７においてＭＳ２試料を検出することができたが、結果は１０４に対して混合していた。すべての場合における色変化は、深金橙から深紫であった。同時形式を用いて、弱く、かろうじて視認できる結果が、２回の１０分間インキュベーションを用いて非希釈試料において検出された。連続方法を用いて、検出されるシグナルは１０７においてより強かった。３回の１０分間インキュベーションによって、１０７シグナルは明確になり、１０４シグナルが視認できるようになったが、非常に弱かった。系列希釈は、１０７試料を、２倍希釈を用いて生理食塩水中に希釈することによって行った。陽性の結果が、１０７試料の１：１６希釈まで検出された。これは、６．２５×１０５と略等しい。
【００９２】
（Ｃ．抗生物質耐性）
この実施例においては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）における抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたバクテリオファージ増幅によって迅速に判定した。ＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの特定の株の増殖を阻害する最低の抗生物質濃度である。当該株が、検定濃度の抗生物質に感受性があれば、バクテリオファージ 生物マーカーシグナルは、抗生物質阻害、ひいてはファージ増幅の抑制のために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって検出されることはない。一方、ファージ生物マーカーシグナルが検出される場合は、ＭＩＣが達成されておらず、抗生物質が有効でない点を表すことになる。本研究に対するＭＩＣを判定するためには、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンを選択した。
【００９３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２７７０９，Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）の２４時間培養を、抗生物質（ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン）の存在および非存在下、ＢＨＩブロスにおいて行った。ファージ１８７およびＳ．ａｕｒｅｕｓ試料を、ＭＡＬＤＩの検出限界未満に希釈した後、ファージを宿主中に感染させ、該宿主中で細胞が破裂するまでバクテリオファージの増幅を行った。次に試料を清浄化し、分析のために濃縮した。乾燥液滴（ｄｒｉｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）法を用いて、試料を、ギ酸、アセトニトリルおよびＨＰＬＣグレード水の溶液中に混合した１５ｍｇ／ｍＬフェルラサンマトリックスを有する疎水性標的プレート上に分析のためにプレーティングした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて、線形モードの質量スペクトルを得た。
【００９４】
抗生物質中でＳ．ａｕｒｅｕｓを培養することにより、その抗生物質の濃度が、細菌細胞を破壊するのに十分であるか否かがわかる。細菌細胞が生きていれば、それらは構成物質によって影響を受けておらず、細胞が感染された場合にファージ増幅が起こることを示す。バクテリオファージに対するタンパク質マーカーが、質量スペクトル中に見られるという結果が得られる。一方、生物マーカーが質量スペクトル中に見られない場合には、最小阻害濃度に達しているかこれを超えていることを示す。結論として、細胞が破壊され、したがって、バクテリオファージ増幅が全く起こりえないことになる。
【００９５】
ＭＡＬＤＩ上での分析に先立って、半精製技術を用いて、試料をろ過および濃縮した。機器が塩に不耐性のために、試料を１００ｋＤａカットオフを用いてスピンろ過した。ファージ１８７からの質量スペクトルは、１５，２４５Ｄａの位置に、はっきりと区別できるタンパク質生物マーカーを示した。ファージ１８７も、超遠心分離および塩化セシウム勾配によって精製し、半精製ろ過技術によって生物マーカーが同定されることを確かめた。検出のＭＡＬＤＩ ＭＳ限界を、細菌およびファージの両者について確立したところ、それぞれ、１０６細胞／ｍＬおよび１０８ファージ／ｍＬであった。シグナルが増幅ファージに由来するものであることを確認するために、実験のあいだ、細菌およびファージの濃度をＭＡＬＤＩの検出限界未満に保った。抗生物質の濃度が低い場合には、ファージからのタンパク質ピークがＭＡＬＤＩスペクトル中に存在し、細菌の増殖とファージの複製が未だ起こっていることが示された。濃度が高くなると、スペクトルはタンパク質ピークを欠き、ＭＩＣに達したか超えたことが示された。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態の特徴は、バクテリオファージに曝露されたサンプルで親ファージが破壊、除去、中和または不活性化されないことである。従来の方法においては、細胞外バクテリオファージ、すなわち細菌または他の感染されている微生物の外のバクテリオファージがどこかの時点で破壊、除去、中和または不活性化される。このことが本発明では必要ない。特に、バクテリオファージを殺す薬剤の添加による細胞外バクテリオファージの破壊、中和または不活性化は、行わないことが好ましい。これは、これが方法を不要に複雑にし、薬剤が除去または中和されないと子孫バクテリオファージに影響を及ぼしかねないからである。
【００９７】
選択された生物に特異的で、感度が良く、単純で、迅速で、および／または経済的であり、数々の新しい特徴を有する微生物検出方法について記載してきた。本発明は、ヒト臨床診断、獣医診断、食品病原体検出、環境試験および生物戦争検出を含む幅広い用途に用いることができる。図面に示しおよび本明細書中に記載する特定の実施形態は、例示を目的とし、本発明を限定するものと解釈すべきでない。本発明は以下の請求項において記載する。さらに、当業者であれば、本発明の概念から逸脱しない限りで、記載した特定の実施形態の多くの用途および変形を作り出すことができよう。均等な構造およびプロセスを、記載した様々な構造およびプロセスに置き換えてもよく、本発明の方法のサブプロセスは、いくつかの例において、異なる順序で実施してもよく、あるいは様々な異なる材料および要素を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ファージを試料に添加して、検出限界未満の初期濃度を与える本発明の第１の実施形態を示している。
【図２】図２は、ファージ感染、増幅、および細胞溶菌のインキュベーションプロセスを説明する。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、試験試料中のファージを検出するためのラテラルフロー装置の使用を説明する。
【図４】図４は、図３Ａのフロー装置の側断面図である。
【図５】図５は、バクテリオファージの説明図である。
【図６】図６は、ファージを試料に添加して、検出限界未満の初期濃度を与える本発明の第２の実施形態を示しており、ここではファージは、ファージの小成分である生物マーカーが検出されるように解離されている。
【図７】図７は、標識されたファージが試料に添加される第３の実施形態を示す。
【図８】図８は、標識した親ファージを試料に加え、ファージ小成分である生物マーカーが検出されるように子孫ファージが解離されている本発明の第４の実施形態を示す。
【図９】図９は、本発明を用いた抗生物質耐性細菌の検出を示す。
【図１０】図１０はファージ増幅プロセスを示す。
【図１１】図１１は、いくつかの可能な生物マーカーを示すバクテリオファージＴ４に対する質量対強度を示すＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１２】図１２は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１３】図１３は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１４】図１４は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１５】図１５は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１６】図１６は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１７】図１７は、図１２〜１６のアッセイからの陰性の結果を示す。
【図１８】図１８は、図１２〜１６のアッセイからの陽性の結果を示す。
【図１９】図１９は、本発明に従う試験キットを示す。
【図２０】図２０は、図１９の試験キットを用いるための例示的指針を示すとともに、該試験キットの試料を説明する。
【図２１】図２１は、感染プロセスの所望の特性を強化するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いた本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２２】図２２は、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いる本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２３】図２３は、酵素を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いる本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２４】図２４は、カプシドタンパク質上で標的を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを利用した本発明に従う例示的アッセイを示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、一般には微生物の検出の分野に関し、より詳細にはバクテリオファージを利用した細菌の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．問題の記載）
微生物の検出に対する標準的な微生物学的方法は、特異的細菌病原体の有無を調べるための基板に基づくアッセイに依拠している。Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｂｏｒｄｎｅｒ，Ｊｏｈｎ Ａ．ＷｉｎｔｅｒおよびＰａｓｑｕａｌｅ Ｓｃａｒｐｉｎｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＥＰＡ報告書Ｎｏ．ＥＰＡ−６００／８−７８−０１７，Ｕ．Ｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ，オハイオ州シンシナティ４５２６８番地，１９７８年１２月を参照のこと。これらの技術は、一般に実施し易く、高額な備品または研究設備を必要とせず、高いレベルの選択性を与える。しかしながら、上記方法は遅い。基板に基づいたアッセイの障壁となるのは、最初に標的とする生物の純粋培養物を増殖または培養しなければならず、これには２４時間以上を要する場合もあることである。この時間的制約が、微生物の毒性株の存在に対する迅速な応答を与えるための有効性を大幅に限定してしまうことになる。
【０００３】
分子生物学技術は、標準的な微生物学的試験に代わるものとして急速に受け入れられるようになってきている。標的とする微生物に対するマトリックスの宿主を評価するために、血清学的方法が広く利用されるようになってきている。Ｄａｖｉｄ Ｔ．ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＳｔａｎｌｅｙ Ｆａｌｋｏｗ，Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９８５年およびＧ．Ｍ．Ｗｙａｔｔ，Ｈ．Ａ．ＬｅｅおよびＭ．Ｒ．Ａ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，ニューヨーク、１９９２年を参照のこと。これらの試験は、複合生物混合物中の他の構成要素から、標的とする生物を最初に捕捉し、その後、分離するために、抗体を用いることに焦点を当てている。一旦単離されると、捕捉された有機物は、生物検体の培養を必要としない様々な方法によって濃縮および検出することができる。そのような手法の一つ「免疫磁気分離法（ＩＭＳ）」と呼ばれる手法は、抗体を球体の微小な磁性または常磁性ビーズに固定化し、これらのビーズを用いて液体媒体から標的とする微生物を捕捉することを含む。これらのビーズは、標的とする生物の回収と濃縮を容易にする磁界の影響下で簡単に操作される。さらに、ビーズはその小さいサイズと形状のために、試料中に均一に分散することができ、ビーズと標的の間の相互作用を加速することになる。これらの好ましい特徴により、アッセイ時間を短縮し、分析手順の能率化の一助となり、より高い試料処理能力と自動化に適したものになる。
【０００４】
ＩＭＳとともに以前に用いられていた下流検出法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｋｏｆｉｔｓｙｏ Ｓ．Ｃｕｄｊｏｅ，Ｔｈｅｒｅｓｅ Ｈａｇｔｖｅｄｔ，およびＲｉｃｈａｒｄ Ｄａｉｎｔｙ，“Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｆｒｏｍ Ｆｏｏｄｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２７１（９９５）１１−２５）、ドットブロットアッセイ（Ｅｙｓｔｅｉｎ Ｓｋｊｅｒｖｅ，Ｌｉｖ Ｍａｒｉｔ Ｒｏｒｖｉｋ，およびＯｒｊａｎ Ｏｌｓｖｉｃｋ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｆｏｏｄｓ Ｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０年１１月，３４７８〜３４８１頁）、電気化学発光（ＨａｏＹｕおよびＪｏｈｎ Ｇ．Ｂｒｕｎｏ，“Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ−Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１５７ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｗａｔｅｒ Ｓａｍｐｌｅｓ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６年２月，５８７〜５６２頁）、およびフローサイトメトリー（Ｂａｒｒｙ Ｈ．Ｐｙｌｅ，Ｓｕｓａｎ Ｃ．Ｂｒｏａｄｗａｙ，およびＧｏｒｄｏｎ Ａ．ＭｃＦｅｔｅｒｓ，“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１５７： Ｈ７ Ｉｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｌａｓｅｒ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９年５月、１９６６〜１９７２頁）があげられる。これらの試験は満足な結果を与えるものの、実施に労力がかかり、標的以外の検体との交差反応により、擬陽性結果に対して影響を受けやすい二重反応（ｙｅｓ／ｎｏ）を与える。全細胞微生物を同定するための別の方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）（Ｈｏｌｌａｎｄら，１９９６；ｖａｎ Ｂａｒｒ，２０００；Ｍａｄｏｎｎａら，２０００）を用いる。
【０００５】
これらの新しい手法のすべては、従来の微生物方法に比べて迅速に結果を与えることができる。しかしながら、これらは、基板に基づくアッセイで達成される感度レベルを達成することができず、また費用もかかり、典型的には古典的な基板に基づく方法の場合よりも熟練した技術者が必要となる。
【０００６】
近年、大きな注目を浴びている他の分子生物学的技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がある。試料中の特定の微生物のＰＣＲ検出には、試料中の遺伝物質（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の抽出と、関心微生物に特異的な標的遺伝配列の増幅と、増幅された遺伝物質の検出とが含まれる。ＰＣＲ技術は、検出される遺伝物質の独自性による高い選択性と、標的遺伝物質の実質的増幅による高い感度と、潜在的に迅速な増幅プロセスによる迅速な結果を与える。しかしながら、ＰＣＲ機器および試薬は相当に高額であり、試験を行うには高度に熟練した技術者が必要である。いまのところ、ＰＣＲ機器は、期待されている感度または特異性を与えていない。
【０００７】
バクテリオファージ感染および／または増幅を用いて、基板に基づく古典的な細菌検出の向上を図ろうとするいくつかの試みがなされている。バクテリオファージは、自らの複製の手段として細菌を用いるように自然界で進化してきたウィルスである。バクテリオファージ（またはファージ）は、このことを、自身を細菌に付着させ、自身の遺伝物質を該細菌に注入して、数十から数千倍のファージ複製を誘発することによって行う。溶菌バクテリオファージと呼ばれるいくつかのバクテリオファージは、宿主細菌を破裂させて、他の細菌を探し出すように、子孫ファージを環境中に放出する。細菌のファージ感染、細菌中でのファージ複製（増幅）、および溶菌後の子孫ファージの放出のための全インキュベーション時間は、ファージ、細菌および環境条件によってはわずかに１時間しかかからない。微生物学者達は、細菌を種レベルまたは株レベルで特異的に標的とする多くのものを含む５，０００種を超えるファージを単離およびキャラクタライズしている。米国特許第５，９８５，５９６号および第６，４６１，８３３号（Ｗｉｌｓｏｎ）は、そのようなファージに基づくアッセイ法を開示している。この方法は、関心細菌を含む可能性のある試料に溶菌ファージを感染させることを含む。その後、遊離のファージを試料から除去し、標的細菌を溶菌し、子孫ファージを第２の細菌に感染させるが、この第２の細菌は標的細菌よりも短い倍加時間を有している。調製した試料を基板上で培養する。プラークが形成されると、元の試料中に標的細菌が存在することがわかる。この方法では、培養インキュベーション時間が必要であるために、まだなお時間または日数がかかるものの、伝統的な基板に基づいたアッセイのアッセイ時間を短縮することができる。この方法に伴う他の問題点としては、標的細菌よりもより迅速に倍加する細菌にも感染する非特異的ファージが存在するような細菌を検出するためにしか適用できないことである。非特異的ファージの使用は、試験試料中の少なくとも第２の細菌に対する交差反応性の可能性に繋がるものである。したがって、このファージに基づいたプラークアッセイ法は、迅速ではなく、適当な非特異的ファージが利用できる場合にのみ適用可能であり、交差反応の問題を起こしやすく、実験室設備において行わなければならない。
【０００８】
他の細菌病原体の検出では、基板に基づくプアラーク検出方法を完全に放棄している。これらの方法の多くは、試料中に標的細菌が存在する場合にのみ発現され、修飾ファージが感染するｌｕｘ遺伝子で遺伝的に修飾されたバクテリオファージを使用する。米国特許第４，８６１，７０９号（Ｕｌｉｔｚｕｒ）は典型的な例である。標的病原体に特異的に感染するファージは、ｌｕｘ遺伝子を含むように修飾される。修飾されたファージが標的細菌を含んだ試料に添加されると、該ファージは細菌に感染して、細菌中でルシフェラーゼが生産され、発光が起こる。米国特許第５，８２４，４６８号（Ｓｃｈｅｒｅｒら）は、類似した方法を記載している。ルシフェラーゼ生産遺伝子マーカーに加えて、Ｓｃｈｅｒｅｒらは、検出可能のタンパク質または核酸として発現される遺伝子マーカーを記載している。米国特許第５，６５６，４２４号（Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら）は、ルシフェラーゼ（またはβ−ガラクトシダーゼ）レポータファージを利用してミコバクテリアを検出する方法を開示している。該特許では、さらに抗生物質感受性の試験についても記載している。米国特許第６，３００，０６１号（Ｊａｃｏｂｓ Ｊｒ．ら）は、細菌感染後にルシフェラーゼを含むいくつかのレポータ分子のうちの１つを生産する、遺伝的に修飾されたファージを用いたミコバクテリア検出のためのさらに別の方法を記載している。米国特許第６，５５５，３１２Ｂ１号（Ｎａｋａｙａｍａ）は、発光性のものではなく蛍光性のタンパク質マーカーを生産する遺伝子を利用する方法を記載している。これらのすべての方法は、感染細菌内でのファージ増幅の潜在的利点を利用したものである。試料中の感染した各標的細菌に対して、子孫ファージが生産されていく間にマーカー遺伝子が何度も発現される。米国特許第６，５４４，７２９号（Ｓａｙｌｅｒら）は、さらに別の増幅プロセスを付け加えている。ファージのＤＮＡをｌｕｘ遺伝子を含むように修飾する。バイオレポータ細胞もｌｕｘ遺伝子を含むように修飾する。上記遺伝的に修飾されたファージおよびバイオレポータ細胞を試料に加える。ファージが標的細菌に感染すると、標的細菌が誘導されて、ルシフェラーゼだけでなくアシルエンホモセリンラクトンＮ−（３−オキソヘキサノイル）ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を生産する。ＡＨＬは、バイオレポータ細胞に進路を見いだし、さらなる光およびさらなるＡＨＬの生産を刺激し、これがさらなるバイオレポータ細胞に進路を見いだし、さらなる光が生産されることになる。このようにして、標的細菌のファージ感染が引き金となって、光シグナルが増幅される。原理上は、遺伝的に修飾されたファージを利用するこれらの方法のすべてが、１）選択的に感染するファージを利用するために高い選択性と、２）マーカー遺伝子産物を亭レベルで検出できるために高い感度と、３）シグナルを１または２ファージ感染サイクル以内に検出できることから基板に基づく方法に比べて迅速な結果を可能にする。これらは２つの大きな欠点を有する。第一に、被験病原体ごとに適切なファージを遺伝的に修飾しなければならないために、費用がかかるとともに実施が難しい。第２に、マーカーシグナル（光）を検出するための機器を必要とすることが多く、これが遺伝的に修飾されたファージを利用する試験の費用を引き上げることになる。
【０００９】
米国特許第５，８８８，７２５号（Ｓａｎｄｅｒｓ）は、試料中の標的細菌への感染のために、修飾されていない高度に特異的な溶菌ファージを利用する方法を記載している。ファージに誘導される溶菌により、細菌細胞から、既知の技術によって検出可能なＡＴＰなどの特定のヌクレオチドが放出される。ファージ感染後に試料中ヌクレオチド濃度の上昇が検出されれば、該試料中に標的細菌が存在すると判定できる。米国特許第６，４３６，６６１Ｂ１号（Ａｄａｍｓら）は、ファージを用いて、試料中の標的細菌に感染して溶菌させて、細胞内酵素を放出し、これが固定化酵素基板と反応して、検出可能なシグナルを発生する方法を記載している。これらの方法は、非修飾ファージを使用するという利点を有するが、ファージ増幅から何の恩恵も引き出していない。検出されたマーカー（ヌクレオチドまたは酵素）の濃度は、試料中の標的細菌の濃度に正比例する。
【００１０】
米国特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）は、非修飾ファージと、検出可能なシグナルを増大させるためのファージ増幅とを使用した病原体検出方法を記載している。この方法は、試料に高濃度の溶菌ファージを添加することを請求している。試料はファージが試料中の標的細菌に感染するのに十分な時間インキュベートする。溶菌が起こる前に、試料を処理して、感染細菌内で複製される子孫ファージに影響を及ぼすことなく試料中の遊離ファージを除去、破壊またはいずれにせよ不活性化させる。必要であれば、続いて、前もって試料に添加したあらゆる抗ウィルス剤を中和するための処理を行う。溶菌によって放出された子孫ファージは、子孫ファージの直接アッセイを用いて、または試料中に子孫ファージが存在することを示すシグナルを発生する遺伝的に修飾されたバイオレポータ細菌を用いることによって、検出する。いずれの場合も、測定されたシグナルは、試料中の標的細菌の数ではなく、子孫ファージの数に比例するので、ファージ増幅の結果として強くなる。この方法の主たる欠点は、処理試料中の遊離ファージを破壊、除去または不活性化した後に、子孫ファージが溶菌後に生存できるように殺ウィルス条件の逆転を行わねばならないことである。これらの追加のプロセスが、本方法を用いたアッセイを複雑にし、高額化させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
基板に基づくアッセイの感度、簡潔性、および／または低コストと、分子生物学診断テストによって与えられる迅速な結果とを組み合わせた、検出方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ファージ増幅の原理を用いた、生きた微生物を検出するための方法および装置を提供することにより、上記の問題ならびに先行技術の他の問題を解決する。好ましい実施形態において、標的微生物に特異的なファージを、サンプルに導入する。導入されたファージの量は、好ましくはファージの検出限界未満の量である。標的微生物が存在すれば、ファージは感染し、微生物内で増殖する。好ましくは、微生物は、ファージ増殖の結果として自然に、または、微生物が細菌であれば細菌リゾチームなどの能動的溶菌プロセスのいずれかによって溶菌される。好ましい実施形態において、ファージは、好ましくは、バクテリオファージ解離剤を加えることにより、解離される。別の実施形態において、検出プロセスに先立って、親ファージに対して、子孫ファージから物理的に除去または分離可能なように標識を行い、これにより、潜在的感受性を増大するか、および／または方法の全分析時間を短縮する。次に試料中のファージまたはバクテリオファージに付随する生物物質を検定する。何らかのファージまたは生物物質が検出されると、標的微生物の存在が証明される。ファージまたは生物物質が検出されなければ、標的とする微生物は存在しないことになる。感染、複製、および溶菌からなる全インキュベーションプロセスには数分しかかからない。前述の実施形態のすべては、細菌および他の微生物の抗生物質耐性または感受性を判定するために用いることができる。バクテリオファージまたは生物物質は、ラテラルフローストリップ、ＳＩＬＡＳ表面、またはＭＡＬＤＩ質量分析などを用いた任意の適切な様式で検出することができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明はサンプル中の微生物の有無を検出する方法を提供し、該方法は、試料を、標的微生物に感染できる親バクテリオファージと組み合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程と；バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、バクテリオファージが標的微生物に感染して、該標的微生物中で増幅して、子孫バクテリオファージを産生するとともに、アッセイで利用できる解離したバクテリオファージ物質を産生するのに十分な条件を与える工程と；バクテリオファージに曝露されたサンプルの検定を行って、試料中の標的微生物の有無の指標となる、バクテリオファージ物質の有無を判定する工程とを含む。上記の要約において、バクテリオファージ物質とは、解離したバクテリオファージ物質であると同時に、バクテリオファージに関連したものであると理解すべきである。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の微生物の有無の検出方法を提供し、該方法は、（ａ）試料を、標的微生物に感染できる親バクテリオファージと組み合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程と；（ｂ）バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、バクテリオファージが標的微生物に感染して、該標的微生物中で増幅して、検出可能な量のバクテリオファージまたは該バクテリオファージに曝露されたサンプル中のバクテリオファージに関連する生物物質のいずれかを産生するのに十分な条件を与える工程と；（ｃ）微生物を能動的に溶菌する工程と、（ｄ）バクテリオファージに曝露されたサンプルの検定を行って、バクテリオファージまたは該バクテリオファージに曝露されたサンプル中のバクテリオファージに関連する生物物質の有無を検出し、標的微生物の有無を判定する工程とを含む。好ましくは、前記能動的に溶菌する工程は、バクテリオファージに曝露されたサンプルに微生物リゾチームを添加することを含む。好ましくは、前記能動的に溶菌する工程は、バクテリオファージに曝露されたサンプルへのクロロホルムの添加、酸によるバクテリオファージに曝露されたサンプルの処理、およびバクテリオファージに曝露されたサンプルの物理的プロセシングからなる群より選択される方法を含む。
【００１５】
好ましくは、前記プロセスは、増幅されたファージが基板における色変化を誘導するような装置および方法を用いて実現される。好ましい実施形態において、本発明は、標的微生物を検出するための装置を提供し、該装置は、基板と、基板上の固定化ゾーンであって、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質を固定化するための固定化剤を含んだ固定化ゾーンと、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質と相互作用するように設計された色調節剤とを含み、これにより、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質の存在が、固定化ゾーンの色の変化をもたらすようにしている。好ましくは、固定化ゾーンは抗体を含む。好ましくは色調節剤は着色ビーズを含む。別の実施形態において、色調節剤は、反応剤と、反応すると沈殿剤を形成する酵素とを含む。当該方法の好ましい実施形態において、バクテリオファージに曝露されたサンプルを基板に塗布し、前記バクテリオファージに曝露されたサンプル中にバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質が存在するとその少なくとも一部の色が変わるようにする。
【００１６】
本発明は、サンプル中の標的微生物の有無を判定するためのキットも提供し、該キットは、標的微生物に感染可能なバクテリオファージを収容した第１の容器と、少なくとも一部の色が、バクテリオファージに曝露されたサンプル中にバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質のいずれかが存在する場合に変化する基板とを含む。好ましくは前記キットは、緩衝溶液を収容した第２の容器をさらに含む。好ましくは、基板は、ラテラルフローストリップまたはＳＩＬＡＳ表面からなる。好ましくは、第１の容器は、所定の大きさの液滴を放出するように設計された点滴器（ｄｒｏｐｐｅｒ）を含む。
【００１７】
本発明は、微生物、好ましくは細菌の試験基板を製造する方法も提供し、該方法は、基板と、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質に付着しうる生物物質とを提供する工程と、基板上に生物物質のラインを形成する工程と、基板を前記ラインと略垂直な方向に裁断する工程とを含む。好ましくは、基板は多孔性膜である。好ましくは生物物質は抗体である。
【００１８】
本発明の目的は、バクテリオファージに曝露されたサンプル中において親ファージの破壊、除去、中和または不活性化を行わない、微生物を検出するファージ増幅方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、特異性の高い細菌検出方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、広スペクトル細菌検出方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、低濃度の細菌を検出するために用いることができる細菌検出方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、広範囲の濃度にわたって細菌を検出することのできる細菌検出方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、大半の既存の検出方法に比べて迅速な結果を与える細菌検出方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、既存の細菌検出方法に比べて低価格な細菌検出方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、実施が容易で、高度に熟練した技術者または複雑な装置を必要としない細菌検出方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、野外または看護地点において実施しうる細菌検出方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、複数の細菌が試験試料中で検出されるように、迅速に倍加する細菌検出方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、試料中に存在する標的細菌を検出するための代用物として特異的ファージ生物マーカーの検出を用いる細菌検出方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、試料中の前記標的細菌の存在を特異的に検出する手段として、標的細菌の高度に特異的なファージ感染を利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、適切なファージが存在する任意の細菌を検出するために、使用しうる細菌検出方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、遺伝的に修飾されていないファージを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、遺伝的に修飾されたバクテリオファージを利用する微生物検出方法を提供することである。たとえば、バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を強化するように、検出可能な生物マーカーを過剰発現させるように、酵素を発現するように、またはカプシドタンパク質上で標的を発現するように、遺伝的に修飾することができる。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、高い感度を達成する手段としてファージ増幅を使用する細菌検出方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、ファージのカプシド鞘などのファージに関連する特異的生物マーカーを検出することにより、ファージを検出する細菌検出方法を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、ファージ生物マーカーが、ファージからの別個の解離タンパク質である細菌検出方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、ファージ生物マーカーがファージ核酸である細菌検出方法を提供することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、検出プロセスの前に、ファージを解離させることからなる第２の増幅プロセスを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、ファージ増幅によって生産される子孫ファージとは区別できる標識された親ファージを利用する細菌検出方法を提供することである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、抗体−ファージ複合体を生産するファージ生物マーカーに結合する抗体を使用する細菌検出方法を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、抗体−ファージ複合体を検出するための手段としての特異的抗体−抗原結合事象を検出するために既存の免疫学的検定技術を使用し、これにより、試料中の標的細菌の存在を検出する細菌検出方法を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、ファージを検出するためにラテラルフローストリップを利用し、これにより、試料中の標的細菌の存在を検出する細菌検出方法を提供することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、細菌の抗生物質耐性株を検出する方法を提供することである。
【００４３】
上記の要約は、本発明を理解しやくするために、本発明の目的、特徴および利点のいくつかの例を説明することを目的としている。本発明のいくつかの実施形態において、上記目的のただ１つだけが実現される場合もあるし、他の例では、上記目的の複数が実現される場合もある。しかしながら、上記の目的はすべてが包括的ではなく例示を目的としており、ある特定の実施形態においては上記の目的のいずれも実現されていない場合もある。たとえば、本発明の方法および装置は、細菌以外の微生物、例えば、真菌、マイコプラズマ、原生動物、および他の微生物を検出するために用いることもできる。しがたって、上記目的における用語「細菌」をより広義の用語「微生物」と置き換えると、本発明に有効な目的が表現される。本発明の数多くの他の特徴、目的、利点が、以下の説明を添付の図面とともに読むことにより、明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（１．序論）
本発明の方法は、試料中の細菌などの標的微生物（微生物）の存在を検出するために、バクテリオファージ、あるいは単にファージを使用することに依存する。本開示において、バクテリオファージおよびファージという用語は、バクテリオファージ、ファージ、ミコバクテリオファージ（ＴＢおよびパラＴＢに対するものなど）、ミコファージ（真菌に対するものなど）、ミコプラズマファージまたはミコプラズマのファージ、ならびに、生きた細菌、真菌、ミコプラズマ、原生生物および他の微生物に侵入して、これらを使って自身を複製することのできるウィルスのことをいう他の任意の用語を含んでいる。ここで、「微視的」とは、最大寸法が１ミリメートル以下のものを意味する。バクテリオファージは、細菌を自身の複製の手段として使用するように自然界において進化してきたウィルスである。ファージはこのことを、自身を細菌に付着し、自身のＤＮＡを細菌に注入し、該細菌に該ファージを何百倍、または何千倍にも複製させるように誘導することによって行う。溶菌バクテリオファージと呼ばれるバクテリオファージでは、宿主細菌を破裂させ、他の細菌に進路を見いだすために子孫ファージを環境中に放出する。細菌の溶菌のための、細菌のファージ感染、ファージ増殖または細菌中における増殖のため全インキュベーション時間は、いずれの場合でも、当該ファージおよび細菌ならびに環境条件によって数十分から数時間である。
【００４５】
開示した検出方法は、現在知られているどの微生物検出方法よりも優れた特異性、感度、簡便性、速度、および／または費用を併せて提供する。ここで教示する方法は、試料中の１つ以上の標的細菌の存在を間接的に検出するために、バクテリオファージを使用することに依存している。典型的なバクテリオファージ７０、この場合ＭＳ２−Ｅ．ｃｏｌｉを図５に示す。構造的には、バクテリオファージ７０は、ウィルス核酸７４、すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡを封入する、ヘッドと呼ばれることもあるタンパク質殻またはカプシド７２を含む。バクテリオファージは、内部タンパク質７５、ネック７６、尾部鞘７７、尾部繊維７８、および端板７９、およびピン８０をさらに含んでいてももよい。カプシド７２は、１つ以上のタンパク質の反復コピーから構成される。図１０を参照して、ファージ１５０が細菌１５２に感染すると、該ファージは自身が細菌壁または膜１５１の適当部位に付着し、その核酸１５４を細菌中に注入して、ファージが数十から数千コピーに複製されるように誘導する。このプロセスを図１０に概略的に示す。ＤＮＡは初期ｍＲＮＡＳ１５５および初期タンパク質１５６に展開し、そのうちのいくつかがライン１５７に沿って膜成分となり、他のものが宿主の染色体１５９からの細菌ヌクレアーゼを利用してライン１６４に沿ってＤＮＡ前駆体になる。他のものは方向１７０に沿って移動し、ライン１６６に沿ったＤＮＡを取り込むヘッド前駆体になる。膜成分は、経路１６０に沿って発達して、鞘、端板、およびピンを形成する。他のタンパク質は経路１７２に沿って発達し、尾部繊維を形成する。ヘッドは形成されると、膜１５１から遊離し、経路１７４に沿った尾部鞘を接合し、尾部鞘とヘッドが１７６において尾部繊維と接合して、バクテリオファージ７０を形成する。溶菌バクテリオファージとよばれるある種のバクテリオファージは、１８０で示される宿主細菌を破壊し、他の細菌への進路を見いだすために、子孫ファージを環境中に放出する。本願で開示する方法においては溶菌ファージを典型的に使用する。しかしながら、特に、子孫ファージが宿主細菌に感染した後に子孫ファージまたは子孫ファージの一部を放出するように非溶菌ファージまたは細菌を活性化することができる場合には、非溶菌ファージを用いることもできる。
【００４６】
細菌の溶菌のための、細菌のファージ感染、ファージ増殖または細菌中における増殖のための合計周期時間は、いずれの場合でも、当該ファージおよび細菌ならびに環境条件によって数十分から数時間である。一例として、ＭＳ２バクテリオファージは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株に感染し、標的細胞への付着後４０分以内に、自身のコピーを１０，０００から２０，０００個産生することができる。ＭＳ２ファージのカプシドは、１８０コピーの同一のタンパク質を含む。このことは、ＭＳ２に感染した各Ｅ．ｃｏｌｉに対して、１．８×１０６個以上の個別のカプシドタンパク質が産生されることを意味する。感染事象毎に多数のファージ、ならびにさらに多くのカプシドタンパク質が生産されるファージ感染のプロセスは、ファージ増幅と呼ばれる。
【００４７】
微生物学者達は、たいていのヒト細菌病原体に対する特異的ファージを含む、何千ものファージ種を単離し、キャラクタライズしてきた。バクテリオファージ種には、細菌ファミリーに感染するもの、個々の種に感染するもの、または特定の株に感染するものがある。表１は、そのようなファージのいくつかと、該ファージが感染する細菌をあげている。
【００４８】
【表１−１】
【００４９】
【表１−２】
本発明は、高度に特異的なファージ−細菌感染、ファージ増幅、および短いインキュベーション時間などのバクテリオファージの既存の特性を利用しており、標的細菌に高度に特異的で、非常に感度が高く、迅速で、実施が容易であり、および／または相当に経済的である細菌検出方法を編み出している。さらに、他のファージに基づく細菌検出方法とは違って、本願に記載する好ましい方法は、バイオレポータまたはインデューサ遺伝子を含むような遺伝的修飾を受けていないファージを利用している。このことにより、本発明を使用した特異的細菌試験の開発に伴う時間および費用が大幅に削減される。
【００５０】
（２．詳細な説明）
図１は、試料中の特定の細菌を検出するための方法の第１の実施形態１０を示す。第１の「ファージの添加」プロセス１２において、標的細菌１４に感染することになる親バクテリオファージ１８を、細菌１４の原試料１１と混合する。好ましい実施形態において、好ましくは懸濁液または溶液１６中のバクテリオファージを、所定の濃度で細菌１４の原試料１１に添加する。ここで、「原試料」という用語は、ファージを添加する前の試料のことをいう。原試料／ファージ混合物は、ここでは「試験試料２４」または「バクテリオファージに曝露されたサンプル２４」とよぶ。方法の目的が、種または株レベルで特定の細菌を検出することであれば、これに応じた特定のファージを該方法において用いる。たとえば、Ｙ．Ｐｅｓｔｉｓ．を特異的に検出するためには、φＡ１１２２ファージを用いることができる。これに対し、試料中のより広範な細菌を検出するためには、より特異性の低いファージを用いるとよい。ファージＭＳ２は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉだけでなく多くの異なるＥ．ｃｏｌｉ種に感染するので、水中の糞便汚染を検出するのに非常に適している。
【００５１】
複数の細菌を検出するためには、各標的細菌に対して１つの種のバクテリオファージを原試料に加え、すべての標的細菌と関連するファージを含む１つの試料を与える。簡略化のために、本方法については、１つの細菌の検出に適用するものとして、下記に記述する。当業者であれば、各標的細菌を検出するために、唯一の細菌／ファージ組み合わせを用いた１つの試験試料と、方法の各プロセスをどのようにして同期して実施するかが明らかであろう。
【００５２】
標的細菌１４を含んだ原試料１１は、一般には液体であるが、固体または粉体であることもある。原試料は、多くの異なる有機および無機化合物を含んだ混合物または懸濁液であることもある。原試料は、試験用に調製するために、様々な方法で前処理されていてもよい。たとえば、原試料は、不要な成分を除去するために、または標的細菌を濃縮するために精製またはろ過されていてもよい。また、標的細菌のインキュベーションをもたらすように、または標的細菌をより見やすい状態にするような培地中で培養したものであってもよい。原試料は、相対的に未処理の状態、例えば、唾液、血液、または水試料のようなものであってもよい。当業者にとっては、前試験試料調製物が広範は適切なプロセスの任意のものを含んでいてもよく、原試料が多種多様な形態をとってよいことが明らかであろう。
【００５３】
ファージ自体を様々な形態の試料に添加してもよい。乾燥状態で加えてもよい。ファージは、液体試薬混合物中に混合または懸濁してもよい。ファージは、原試料を添加するバイアル中で懸濁してもよい。ファージは、任意の他の適切な形態をとってもよい。原試料に添加するファージを、ここでは「親ファージ」と呼ぶ。
【００５４】
図１に戻って、試験試料２４を好ましくは所定時間インキュベートする。本方法に対しては、試験試料は、好ましくは、インキュベーションプロセス前に、標的細菌のファージ感染を助けるような条件におくべきである。このことは、当業者によって知られる様々な方法によって達成できる。たとえば、親ファージは、原試料に添加されると感染を助ける試験試料をもたらす試薬中に混合してもよい。試験試料は、ファージ感染を助ける条件を確立するための様々な方法によって調製してもよい。
【００５５】
「インキュベート」プロセス２０を図２に示す。親ファージ１８は、自身を標的の細胞壁に付着させることにより、標的細菌１４に感染し（３２）、ウィルス核酸を注入して、感染細菌２３を作り出す。そして、図１０に示すような子孫ファージの複製３４が、宿主細菌内で進む。溶菌ファージを用いる場合には、宿主は溶菌プロセス３６において破裂し、子孫ファージ３７を試験試料中に放出し、ここで他の標的細菌に感染することもある。このインキュベーションプロセスは、１回以上の感染、増幅、および溶菌のサイクルのあいだに進行させてもよい。原試料中に標的細菌が存在すると想定すると、試験試料は、インキュベーションプロセスの間に感染された個々の細菌に対して多数の子孫ファージを含むであろう。
【００５６】
「インキュベート」プロセスの最後で、感染標的細菌のうちのいくらかが溶菌されていないかもしれない。そうした状況において、多くのまたはすべての子孫ファージがまだ宿主細菌内に保持されており、これは直接検出することができないかもしれない。この潜在的問題に取り組むために、２１において、試験試料に特定の微生物に対する微生物リゾチーム２２を加えて、プロセス２５において、試験試料２４中に存在する細菌などの本質的にすべての個々の微生物の細胞壁を破壊して、そこに含まれる本質的にすべての子孫ファージを放出させることにより、図１で示すようにオプションのプロセス２１および２５「細菌の溶菌」を行う。微生物の、またはより詳細には細菌のリゾチームを使用することで、本願に教示する方法を実施するのに必要な時間を短縮することができる。これは、標的細菌のすべてが自ら溶菌するのを待つ必要がなくなるからである。ゆっくり溶菌するファージに対しては、このことは、実質的な違いをもたらしうる。本発明の目的のために、「リゾチーム」という用語は、微生物宿主の破壊を誘導して、試料中への子孫ファージを放出させる任意の材料、装置、またはプロセスのことをいい、限定はされないが、従来のリゾチームやクロロホルムなどの化学的手段、または酸処理または物理的プロセス、たとえば、浸透圧の付加などが含まれる。
【００５７】
図１に示す実施形態のプロセス２８「ファージの検出」は、ファージに関連する生物マーカーを検出することを含む。この生物マーカーが検出されると、これは、原試料中に標的細菌が存在することを間接的に示すものである。これから記載する方法の実施形態に対して、原試料に添加される親ファージと子孫ファージとは、インキュベーションプロセスのあいだに産生されたならば、同一である。このことは、試験試料中に標的細菌が存在しないとしても、関連するバックグラウンドシグナルを上昇させうるファージが検出プロセス２８のあいだに存在することを意味している。この問題を解決するための方法は、試験試料中の親ファージの初期濃度を、それらが与えるバックグラウンドシグナルが検出プロセス２８において検出不能となるように制御することである。したがって、ファージ増幅が起こっていないなど、試験試料に標的細菌が存在しない場合には、試験の最後にシグナルは検出されない。バックグラウンドシグナルを親プラス子孫ファージからのシグナル上昇と区別できる場合に限り、より高濃度の親ファージを用いることもできる。プロセス２８において得られるシグナルがバックグラウンドシグナルあら区別できるような最低の細菌濃度が、本方法の感度限界を表す。これを行う簡単な方法は、細菌が存在しないことがわかっている対照試料に対して試験を行うことである。これにより、試験試料からの対応する結果と比較できる対照結果を作製することができる。試験試料からの試験結果が、はっきりと対照試料よりも高いシグナルレベルを示す場合には、標的細菌が存在することがわかる。
【００５８】
本発明の目的のために、ファージに関連する任意の生物マーカーを、原試料中の標的細菌の間接的検出手段として用いることができる。これには、図５および図１０に示すファージの任意の部分が含まれる。たとえば、図１１は、バクテリオファージＴ４に対して、質量に対する強度百分率を表したＭＡＬＤＩスペクトル２００を示している。スペクトル２００は、溶菌ホリンタンパク質に対する顕著なピーク２０１と、ヘッドタンパク質に対する顕著なピーク２０４と、ｈｏｃ外部カプシドタンパク質に対する顕著なピーク２０６と、フィブリチンに対する顕著なピーク２０８を示している。これらの大きなピークは、これらのファージ部分のいずれも、後で検討するＭＡＬＤＩ検出法における生物マーカーとして使用可能であることを示している。非常に有用なファージ生物マーカーは、ファージカプシド７２である。このカプシドは、たいていは、１００コピーを超える多くのコピーの１つ以上のタンパク質を含んでいる。したがって、検出目的で使用できる複数の同一の結合部位が個々のファージ粒子のそれぞれの周囲に存在する。これにより、試験試料中に含まれる各ファージ粒子から得られる潜在的シグナルレベルが上昇する。溶菌した標的細菌に関連する生物マーカーを直接検出することに対する、ファージまたはファージ関連生物マーカーを検出することの利点は、感度が劇的に上昇することである。インキュベートされた試験試料中のファージ濃度は、ファージ増幅のために、標的細菌原試料中の標的細菌の濃度よりもはるかに高くなっている。ファージ増幅は、原試料中に存在する個々の細菌のそれぞれに関連するシグナルを、何桁倍、たとえば、１０倍に増強することができる。したがって、ファージ増幅プロセスを用いない他の方法よりも低い濃度の細菌を、この方法では検出することができる。
【００５９】
ファージに関連する何らかの生物マーカーを検出するどの検出方法または装置も、この方法２８には十分である。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、アプタマーに基づくアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法、およびラテラルフローイムノクロマトグラフィー（ＬＦＩ）を含む、検出可能なシグナルを発生するために抗体結合事象を利用する免疫検定法である。他の方法としては、本明細書ではＭＡＬＤＩと呼ぶ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、ならびに、検出指標として色が変化するＳＩＬＡＳ表面を用いることがあげられる。１つの免疫検定であるＬＦＩについては、図３、５および１９と関連して以下に詳細に検討し、ＳＩＬＡＳ色指標法については、図１２〜１８と関連して以下に詳細に検討し、ＭＡＬＤＩ法については、図１１および図２４〜２７に関連して以下に詳細に検討する。
【００６０】
図３は、試験試料中のファージの存在を検出するためのＬＦＩを、ラテラルフローストリップ４０を用いてどのように具現できるかを説明するものである。ラテラルフローストリップ４０の断面図を図４に示す。ラテラルフローストリップ４０は好ましくは、試料塗布パッド４１と、共役物パッド４３と、検出ライン４６および内部標準ライン４８が形成された基板６４と、吸収パッド５２とを含み、これらのすべては、好ましくはプラスチックである裏張り６２上に搭載されている。基板６４は好ましくは多孔性の網または膜である。これは、ライン４３、４６、および随意でライン４８を前記基板の長いシート上に形成し、基板をこれらのラインと垂直な方向に裁断して、複数の基板６４を形成することによって作製する。接合物パッド４３は、それぞれが、ここでは第１抗体−ビーズ共役物を形成する第１の抗体とよぶ、第１の抗体４４に接合されたカラービーズ４５を含んでいる。第１の抗体４４は、試験試料中のファージ５１に選択的に結合する。検出ライン４６および対照ライン４８は、いずれも試薬ラインであり、それぞれが固定化ゾーンを形成している。すなわち、バクテリオファージまたは他の生物マーカーと適切な様式で相互作用する材料を含んでいる。好ましい実施形態において、相互作用は、バクテリオファージまたは他の生物マーカーを固定化するようなものである。検出ライン４６は、固定化された第２の抗体４７を含み、抗体ライン４６が、ストリップに沿った流れ方向に垂直となり、流れ中のファージの有意な部分を捕捉するのに十分な密度を有している。第２の抗体４７もまた、ファージ５１に特異的に結合する。第１の抗体４４および第２の抗体４７は、同一であってもなくてもよい。いずれかがポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。随意で、ストリップ４０は、第３の抗体４９を含む第２の試薬ライン４８を含んでいてもよい。第３の抗体４９は、第１および第２の抗体の１つ以上と同一であってもなくてもよい。第２の試薬ライン４８は、アッセイが適切に機能するかどうかを調べるための内部標準ゾーンとして機能させてもよい。
【００６１】
１滴以上の試験試料５０を、図３Ａに示すように試料パッドに加える。試験試料５０は好ましくは、元の原試料に標的が存在する場合には、親ファージならびに子孫ファージを含んでいる。試験試料は、ストリップの対向端部にある吸収パッド５２に向けてラテラルフローストリップ４０に沿って流れる。ファージ粒子は共役物パッドに沿って膜に向けて流れる際に、図３Ｂに示すように、ファージ−ビーズ複合体５４を形成する第１の抗体−ビーズ共役物４２の１つ以上を取り込む。ファージ−ビーズ複合体は第２抗体４７の列４６上を移動する際に、図３Ｃに示すように、固定化され、濃縮された第１の抗体−ビーズ−ファージ−第２の抗体複合体５８を形成する。十分なファージ−ビーズ複合体が固定化された第２抗体の列４６に結合すると、着色されたライン５９が裸眼で視認できるようになる。可視ライン５９は、標的細菌が原試料中に存在したことを示す。ラインが形成されない場合には、標的細菌は原試料中に存在しなかったか、あるいはラテラルフローストリップ４０で検出できないほど低濃度でしか存在しなかったことになる。この試験の信頼性を得るために、原試料に加える親ファージの濃度は、親ファージ単独では、ラテラルフローストリップ上の可視ラインを形成できるほどの量が存在しないように、十分に低くすべきである。抗体−ビーズ共役物４５は、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質に相互作用するように設計された調色剤である。抗体−ビーズ共役物４５は、固定化ゾーン４６に固定化されると、固定化ゾーンに色の変化をもたらす。
【００６２】
図６は、本発明に従う標的細菌を検出するための方法の第２の実施形態９０を示し、該方法９０は感度が向上している。「ファージの添加」、「インキュベート」および「細菌の溶菌」からなるプロセス１２，２０、およびオプションのプロセス２１は、図１に関して記載した対応するプロセスと同じである。オプションプロセス２１の後、原試料中に標的細菌に存在する場合には、試験試料はファージ粒子を豊富に含んでいる。
【００６３】
図６に示すように、第２実施形態９０のプロセス９４、「ファージの解離」は、ファージ解離剤９２を試験試料に添加することを含む。ファージ解離剤９２は、ファージ粒子を、個々のカプシドタンパク質およびウィルス核酸を含むそれらの構成成分９７に分解する。ファージ解離剤の例としては、酸処理、尿素、変性剤および酵素があげられる。任意の適切なファージ解離剤を用いることができる。このプロセスにおいて、解離されたバクテリオファージ物質９７が生産される。
【００６４】
図６に示す実施形態のプロセス９９「ファージ小成分の検出」は、生物マーカー、すなわち、解離したファージ小成分に関連する解離されたバクテリオファージ物質９７を検出することを含む。上記の議論に関して、バクテリオファージ物質は、解離したバクテリオファージ物質と同時に、バクテリオファージに結合したものの両方でありうることを理解すべきである。すなわち、「解離したバクテリオファージ物質」という用語は、もはや全バクテリオファージの一部ではないものをさし、「バクテリオファージに関連した」という用語は、該物質はある時点ではバクテリオファージの一部であったか、バクテリオファージ複製の過程で生産されたものである。プロセス９４においてファージ解離剤を使用することによって、プロセス９９において検出可能な豊富な個々のカプシドタンパク質９７が存在する。第１実施形態と同様に、これらは、確立された抗原−抗体に基づく免疫検定技術を用いて検出することができる。さらに、露出したウィルス遺伝物質は、ＰＣＲ、遺伝的プローブバイオセンサー、光アプタマー、分子ビーコン、またはゲル電気泳動を含む他の確立された技術を用いて検出することができる。任意の適切なファージ生物マーカー検出方法または装置を用いることができる。
【００６５】
試験試料の親ファージの濃度をバックグラウンド検出限界未満に保持することにより、原試料にファージを加え、インキュベートし、ファージ生物マーカーを検出するだけの簡単な方法にすることができる。しかしながら、潜在的な欠点もある。潜在的に低濃度の親ファージは、試験試料における標的細菌に対する親ファージの比が１未満になる条件、すなわち、感染多重度（ＭＯＩ）が低い条件を生み出してしまう。試験試料中のすべての標的細菌が、高確率で感染されるようにするために、プロセス２０におけるインキュベーション時間はたとえば、感染および溶菌のサイクル２回以上と同等の時間など長くすることができる。このように、試験の簡潔性を潜在的に長い試験時間によって埋め合わせる。この潜在的限界は、親ファージに関連するシグナルを排除できるか、より高濃度の親ファージを利用できる（ＭＯＩが５を超える）ように著しく減少させることができれば、克服することができる。上記の限界は、生物マーカーとしてカプシドタンパク質を使用するなどして、子孫ファージによるシグナルを増強するか、遺伝的に増強されたファージを用いることによっても、克服することができ、そのいずれも本願で詳細に検討する。
【００６６】
図７は、試料中の標的細菌を検出するための本発明の第３実施形態１００を示し、この実施形態ではより迅速な結果を達成可能である。本願の本実施形態において、原試料と混合する親ファージ１０２を標識して、タグ印１０４で示して、試験試料からあとで除去することができ、バクテリオファージを検出する試験試料の部分から単離できるようにするか、さもなくば最初にタグを外した子孫ファージが検出されるシグナルに寄与するように分析に先立って中和する。たとえば、１実施形態において、ビオチン化ファージを親ファージとして使用する。ビオチン化バクテリオファージは、ストレプトアビジンに強力に引きつけられる。この強力な親和性を用いて、以下に検討するように、試験試料から標識した親ファージを後に分離した。標識した親ファージは、たとえば、プローブまたは網目構造物を親バクテリオファージでコーティングするか、またはファージを基板に科学的に結合することにより、物理的基板に付着させることもできる。標識したバクテリオファージは、試験試料から基板を除去することにより、あるいは、基板より分離された試験試料中の部分中のバクテリオファージを検出することにより、子孫バクテリオファージから分離することができる。
【００６７】
本実施形態のプロセス１０５，１０７および１０８，「ファージの添加」、「インキュベート」および「細菌の溶菌」は、それぞれ、プロセス１０５において原試料に加える親ファージ１０３の溶液が、標識されたファージ１０２を含み、したがって、バクテリオファージに曝露されたサンプル１０９が、細菌外の標識されたファージ１０２と、細菌内の、非標識子孫ファージ１０６との両方を含むということ以外は、図１および６のプロセス１２，２０および２１と同じである。したがって、溶菌溶液１１２は、標識ファージと非標識ファージの両方を含むことになる。プロセス１１４、「標識したファージの抽出」において、標識された親ファージは、該ファージを試験試料から抽出または実質的に除去する、もしくは親ファージを子孫ファージから単離して、それらが分析されるシグナルに寄与しないようにすることにより、子孫バクテリオファージから分離される。プロセス１０５において原試料に添加される際に標識された親ファージが物理的基板に付加されている場合には、基板および付随する親ファージは、プロセス１１４において試験試料から物理的に分離することが好ましい。物理的基板に付加されていないビオチン化ファージもまた、試験試料から迅速に分離または除去することができる。一実施形態において、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを試験試料に添加し、ここで、ビオチン化親ファージを急速に回収するようにした。その後、磁気を用いて、磁気ビーズを結合した親ファージとともに試験試料から分離および除去する。下記図２８に関連する磁気抽出の検討を参照のこと。同様に、別の実施形態において、ストレプトアビジンでコートした網を試験試料を通して攪拌し、試験試料からビオチン化親ファージの実質的に全部を回収する。網以外の他の物理的基板またはプローブを用いてもよい。別の実施形態において、ラテラルフロー装置を用いた。抗体ストリップ４６の前の網基板６４の部分６６（図４）にストレプトアビジンを含浸させ、網の遷移をコーティングする。ストレプトアビジンでコートした網を回収し、抗体ストリップ４６に到達する前に親ファージを部分６６に結合させることにより標識した親ファージを固定化する。子孫ファージは、ストレプトアビジンに結合せず、したがって、ストリップを自由に流下し、視覚的に検出された。同様に、試験試料を滴下する試料パッド４１のように、ラテラルフロー装置の他の部分もストレプトアビジンでコーティングまたは含浸させることができる。
【００６８】
ここに記載する方法は、親ファージを標識し、その後、試験試料中からこれを除去するか、該試験試料内で分離するという上記の例に限定されることはない。
【００６９】
図７に示す実施形態のプロセス１１６、「ファージの検出」は、原試料中に存在する標的細菌に対する代理マーカーとしての子孫ファージに関連する生物マーカーを検出するために、試験試料を分析するためのものである。本実施形態で使用する検出手段は、それぞれ図１および６に図示する実施形態１０および９０のプロセス２８および２９に関して記載したものと同じである。先の実施形態と同様に、任意の適切な検出方法または装置を用いることができる。
【００７０】
図８は、試料中の標的細菌を測定するための方法の第４実施形態１２０を示し、該方法１２０においては、より迅速な結果を達成でき、感度が向上している。実施形態１２０は、実施形態９０および１００で教示した方法の組み合わせである。プロセス１０５、１０７、１０８および１１４は、実施形態１００で教示し、図７に図示したもの、すなわち「ファージの添加」、「インキュベート」、随意で「細菌の溶菌」および「標識したファージの検出」とそれぞれ同じである。具体的には、実施形態１２０は、プロセス１０５における標識した親ファージとプロセス１１４における親ファージ除去または分離を組み合わせたものである。
【００７１】
プロセス１２１、「ファージの解離」において、実施形態９０のプロセス９４に教示され、図６に図示されるようにして、ファージ解離剤１２２を、試験試料１２４に添加する。好ましい実施形態において、標識した親ファージを、プロセス１２１においてファージ解離剤に暴露されないように単に分離するのではなく、プロセス１１４において試験試料から物理的に除去する。このようにして、試験試料１２４は、子孫ファージだけを含み、解離された試験試料１２６は、子孫ファージのみからのカプシドタンパク質１２８などの生物マーカー物質を含むことになる。このようにして、ファージカプシドタンパク質１２８の解離に関連する増幅が、プロセス１０７のファージ増幅と合わさって、全増幅が大幅に増大する。たとえば、ファージ増幅プロセスが、細菌あたり１０００の増幅を与え、ファージが、１００コピーの特定のカプシドタンパク質を有する場合には、組み合わせ増幅は、試験試料中で感染した標的細菌あたり１０３×１０２または１０５となる。親ファージを除去しない場合には、全増幅は、プロセス１０７でおこるファージ増幅だけ、すなわち、１０３になるが、これは、ファージの解離によっておこる増幅が、親ファージと子孫ファージの両方にたいして起こり、第２の増幅プロセスを相殺するためである。
【００７２】
図６に示す実施形態１２０の「ファージ小成分の検出」プロセス１３０は、好ましくは、前出の実施形態のプロセス２８，９９および１１６のいずれかと同一である。
【００７３】
図９は、標的細菌を検出し、存在する場合にはそれが１つ以上の抗生物質に耐性をもつかどうかを判定するために本発明の任意の実施形態を用いることができる、方法１４０を示す。標的細菌を含有する可能性のある試料１４２を、１４４で示す第１試料Ａと、１４５で示す第２試料Ｂの２つに分ける。第１の抗生物質１４６を試料Ｂに加え、ここで、試料Ｂ中の標的細菌は、第１の抗生物質に耐性が無ければ殺される。試料ＡおよびＢを１４８および１４９において分析し、それぞれの生きた標的細菌の存在を検出し、結果Ａおよび結果Ｂを与える。本発明において教示するいずれの方法も、これらの分析のために用いることができる。結果Ａが陽性であれば、標的細菌が元の試料に存在することを示す。結果Ｂも陽性であれば、標的細菌が第１の抗生物質に耐性であることを示す。一方、結果Ｂが陰性であれば、標的細菌は第１の抗生物質に耐性でないことを示す。ある範囲の抗生物質のいずれかに対する抗生物質耐性を同時にスクリーニングするために、標的細菌に対する分析に先立って、試料Ｂにすべての関心のある抗生物質を矩泡得る。標的細菌が純粋試料と抗生物質で処理した試料の両方で検出されると、試料中の標的細菌が加えた抗生物質の１つの耐性であることを示す。このプロセスは、細菌の抗生物質または他の除染装置に対する感受性を判定するために用いることもできる。また、細菌除染プロセスが成功したかどうかを調べるために用いることもできる。試料を対照部分と試験部分に分けることにより、細菌学的方法および物質の有効性を調べることができる。当業者であれば、生きた細菌が存在するかどうかを判定することが望ましいほぼすべての場合において、本発明のプロセスを用いることができることを理解するであろう。
【００７４】
図１２〜図１８は、検出プロセス２８，９９，１１６および１３０の別の実施形態を示す。このプロセスは、ＳＩＬＡＳ表面２２０を用いる。ＳＩＬＡＳ表面２２０は、随意で付加ポリマー２２４で覆ったコーティング２２２を有していてもよい半導体または絶縁体ウェハ２２１からなる。技術上周知のように、ＳＩＬＡＳ表面は、特定の光波長を反射し、干渉により別のものを減衰するように設計されている。これらの表面は、光と、表面上に形成されたフィルムとの直接相互作用によって可視シグナルを発生する。薄いフィルムは、光学コーティングを含むか、および／または表面への特定の標的分子の結合によって創出される生物フィルムである。光の光路が表面上に蓄積した生物量によって延長されるために、陽性の結果は通常は、金色から紫色への色変化として認められる。フィルムの厚みと屈折率によって、観察される個々の色および陰影が決まる。一般に、入射光と同位相の表面上から反射した光の波長が加わるか、建設的干渉を受けて、視認できるようになる。入射光とは異なる位相の表面から反射する波長は、相殺的干渉によって減衰されて、フィルムから浮上することはない。好ましくは、ウェハ２２１はケイ素からなり、光学コーティングは窒化ケイ素からなり、付加ポリマーは疎水性ポリマーからなる。図１３〜図１６は、付加ポリマー２２４の表面上の実質的に均一に分配された多数の抗体／ファージ／抗体共役物２３１を示す、単一の大きく拡大された該構造物を利用して、ＳＩＬＡＳ表面をいかにして、ファージマーカーの存在を示すために用いるかを示した図である。図１３において、カプシドタンパク質などのファージマーカーに特異的な第１抗体２２８を、付加ポリマーに付加して、該ポリマーの表面２２５を固定化ゾーンにする。試料溶液を表面２２４に接触させる。指定のファージ生物マーカー２３０が存在すれば、該マーカーは図１４に示すように第１抗体２２８に付加する。図１５において、生物マーカーが存在すれば、第２検出抗体２３２が表面２２４に接触されて、生物マーカー２３０に付加する。第２抗体２３２を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼなどの反応試薬で標識する。そして、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの酵素を表面に塗布し（２３６）、該酵素はＨＲＰと反応して沈殿２３８を形成し、これが被膜層２４０（図１６）を形成して、表面の色を変える。図１６に示すように、表面２４５上に衝突した光２４２は、被膜層２４０が存在するか否かによって、２４４および２４６に示すように様々に反射する。このようにして、反応試薬で標識された第２抗体２３２と、酵素と、バクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質と相互作用する調光剤２３５に対する光学コーティング２２２との組み合わせ、すなわちバクテリオファージまたはバクテリオファージに関連する生物物質の存在によって、固定化ゾーン２２５の色変化がもたらされる。
【００７５】
図１７および図１８は、陰性の結果に対する被膜層２４０なしのＳＩＬＡＳ表面（図１７）と、陽性の結果に対する被膜層２４０ありのＳＩＬＡＳ表面（図１８）との間の反射率の違いを示したものである。反射率は、陰性結果に対しては橙色から赤色の波長において高くなって金色をもたらし、陽性結果に対しては、深青波長において高くなって紫色をもたらした。ＳＩＬＡＳ表面は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８１Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ０２４５４−９０４６より入手可能である。ＳＩＬＡＳプロセスの説明については、インターネット上のＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏ．ｃｏｍ．などで入手できる。
【００７６】
図１９は、微生物を検出するための例示的試験キット２５４を、試験キットを用いるための典型的な説明書とともに示したものである。図２０も参照のこと。試験キット２５４は好ましくは、緩衝溶液２５８の容器２５６と、反応容器２６０と、保護ケース２６３に封入された１つ以上の検出要素２６６（図２０）と、該キットを使用するための説明書２７０と、前出のキット部品を保持するための容器２７２とを含む。保護ケース２６３は、細菌が存在しない場合に予想される結果２６７を示す対照検出要素２７６を含んでいてもよい。たとえば、検出要素がラテラルフローストリップであれば、対照検出要素は、細菌が全く存在しないバクテリオファージの対照試料が塗布された同じラテラルフローストリップとするとよい。反応容器２６０は、容器本体２６７と、容器蓋２６４とを含む。好ましくは、反応容器本体は、瓶２６７であり、反応容器蓋は瓶キャップ２６４である。反応容器２６０はファージ２６８を含む。ファージ２６８は、好ましくは反応容器本体２６７の内壁２６９に付加された所定量のファージからなる。キャップ２６４は、好ましくは、瓶２６７の上部のネジと螺合する内ネジ２６２を有するネジ式キャップである。キャップ２６４は、好ましくは、所定の大きさの液滴を放出するように設計された滴下ヘッドである、ディスペンサ２６５を含むことが好ましい。本実施形態において、検出要素２６６はラテラルフローストリップ２６６であるが、図１２〜１６に関して説明したように、ＳＩＬＡＳ表面要素であってもよい。フローストリップ２６６は、試料パッド２７４（図２０）と、検出ウィンドウ２７８とを含む。好ましくは、容器２７２は、試験キット部品の保持と試験終了後の便利な処分容器の２つの役割をはたすプラスチックバッグ２７２からなる。
【００７７】
図２０は、試験キット２５４を使用するための例示的説明書組２７０を示す。説明書２７０は、好ましくは、試験手順を示す文字および図を印刷した紙のシートからなる。説明書２７０は、微生物を検出するための例示的方法２８０も説明する。方法２８０は、プロセス２８１，２８２，２８４および２８６を含む。第１プロセス２８１において、キャップ２６４および滴下ヘッド２６５を外すことにより、反応瓶２６７をあけ、５ミリリットル（ｍＬ）の試料を加える。次に緩衝溶液２５８を加える。プロセス２８２において、滴下ヘッド２６５および瓶２６７上のキャップ２６４を戻し、蓋をした反応容器２６０を好ましくは例えば１分間などの所定時間だけ攪拌した後、好ましくは例えば１時間などの所定の時間量だけ放置することにより溶液をインキュベートする。キャップ２６４を取り外し、所定量のインキュベート後の試料を試料パッド２７８上に放出する。そして使用者は例えば３分間などの所定の時間量だけ待つ。プロセス２８６において、使用者は検出ウィンドウ２７８を覗いて結果を見る。先に検討したように、試料が試験キットが特定する細菌を含んでいれば、青などの第１の色の第１ライン２８８が現れる。第１の色のラインが現れない場合には、試験結果は陰性である。随意で、試験が有効であることを示すように、第２の色の第２ライン２９０が出現することが好ましい。第１ライン２８８は、図３の試薬ライン４６に相当し、第２ライン２９０は、図３の内部標準ゾーン４８に相当する。対照検出要素２７６（図１９）を用いて、第１ライン２８８を対照ライン２７７と比較して試験が陽性または陰性のいずれであるかを判定するようにしてもよい。たとえば、第１ライン２８８が対照ライン２７７よりも明らかに深い青色であれば、陽性結果であることがわかる。
【００７８】
図２１は、感染プロセスの所望の特性を強化するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージ３０２を用いた、本発明に従う例示的アッセイ３００を示す。ここで「遺伝的に修飾されたバクテリオファージ」とは、ＤＮＡが何らかの方法で修飾または操作されたバクテリオファージと、特定の特性を増強するように選択的に繁殖されたバクテリオファージの両方を含む。所望の特性としては、バースト容積、バースト時間、および感染性などがあげられる。バースト容積とは、複製されるファージの量であり、バースト時間とは、ファージが標的細菌を破裂させるまでの時間であり、感染性とは、感染細菌におけるファージの有効性、すなわち、所定量のファージによって感染される利用可能な細菌の百分率である。ファージは、上記所望の特性および／または他の所望の特性の１つ以上を強化するように遺伝的に修飾されていてもよいし。図２１に示すように、遺伝的に修飾されたファージ３０２を用いて、非修飾ファージの場合と同様に微生物の検出を行う。すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３０２を、宿主微生物３０４の試料に加え（３０３）、感染させ、インキュベートし（３０５）、ファージ子孫を発生させ（３０６）、これを検出する（３０７）。親ファージ３０２は、感染プロセスの特性を強化するように遺伝的に改変されているので、検出は、より迅速に、より感度よく、および／またはより信頼性高くすることができる。
【００７９】
図２２は、タンパク質などの検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージ３１２を用いた、本発明に従う例示的アッセイ３１０を示したものである。図２２に示すように、遺伝的に修飾されたファージ３１２を用いて、非修飾ファージの場合と同様に微生物の検出を行う。すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３１２を、宿主微生物３１４の試料に加え（３１３）、感染させ、インキュベートし（３１５）、ファージ子孫を発生させ（３１６）、これを検出する（３１７）。親ファージ３０２は、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されているので、この生物マーカーはより容易に検出され、したがって、検出は、より迅速に、より感度よく進み、すなわち、より低いレベルの細菌を検出することができる。あるいは、これにより親ファージの使用量を少なくすることができる。
【００８０】
図２３は、酵素を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージバクテリオファージを用いた、本発明に従う例示的アッセイ３３１を示したものである。図２３に示すように、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３２２を、宿主微生物３２４の試料に加え（３２３）、感染させ、インキュベートし（３２５）、酵素を発生させる（３２６）。細菌は溶菌してもしなくてもよい。基板３２８を加え（３２７）、これが酵素と反応して（３２９）、酵素生成物３３０また他の酵素作用を与えるので、これを検出する。この遺伝的修飾により、より容易に実施でき、より迅速および／または高感度で進行できるか、親ファージの使用量を少なくできる代替検出方法を与えることができる。
【００８１】
図２４は、カプシドタンパク質上に標的を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージバクテリオファージを用いた、本発明に従う例示的アッセイを示したものである。図２４に示すように、すなわち、ある量、好ましくは検出限界未満の遺伝的に修飾されたファージ３３２を、宿主微生物３３４の試料に加え（３３３）、感染させ、インキュベートし（３５５）、カプシドタンパク質３３５の表面上に生物マーカー３３６を含んだファージ子孫を発生させ（３３８）る。生物マーカーは、カプシドの外側にあるので、他のマーカーよりも容易に検出しうるか、および／またはファージ解離プロセスなしで検出することができ、検出速度の向上を図れる。
【実施例】
【００８２】
（３．実施例）
（Ａ．ラテラルフロー実施例）
以下の実施例において、図１のプロセスにおけるＥ．ｃｏｌｉの検出のためにＭＳ２ファージを用いる。図３および４に示すようなラテラルフローストリップを、ＭＳ２ファージに特異的に結合するポリクローナル抗体を用いて調製する。
【００８３】
ラテラルフローストリップのＭＳ２検出限界の決定−バクテリオファージＭＳ２（ＡＴＣＣ１５５９７−Ｂ１）は、コンフルーエントプレート上の感染Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１５５９７）細胞から調製した。この調製からの生きたＭＳ２の濃度は、プラークアッセイによって２×１０７ｐｆｕ／ｍＬであった。このＭＳ２ストックを、１×１０７ｐｆｕ／ｍＬから１×１０５ｐｆｕ／ｍＬの範囲を与えるように系列希釈した。ＭＳ２は、ラテラルフローストリップを用いて検出した。結果を表２に示す。
【００８４】
【表２】
線強度は、試料をラテラルフローストリップに流してから１５分後に目視で判定した。線強度は、最大線強度を示す「＋＋」から、線を検出できない「−」までの尺度範囲上でランク付けした。「＋／−」は、かろうじて検出可能な線を示す。このアッセイの結果は、上記試験のために調製したラテラルフローストリップ上でのＭＳ２の検出限界が、１×１０６ｐｆｕ／ｍＬであることを示している。
【００８５】
Ｅ．ｃｏｌｉ検出限界と全試験時間の決定−飽和培養からのＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ１５５９７）を希釈して、１×１０８，１×１０７，１×１０６，１×１０５，１×１０４，１×１０３，および１×１０２細胞／ｍＬの濃度を有する原試料を作製した。各原試料にＭＳ２を加えて、１×１０６ｐｆｕ／ｍＬのＭＳ２濃度を有する試験試料を与えた。試験試料を、３７°Ｃで１時間から５時間インキュベートした。インキュベーション後、試験試料を、親ＭＳ２濃度が確立された検出限界未満の１×１０５ｐｆｕ／ｍＬとなるように１０：１希釈した。次に、ラテラルフローストリップを用いて試験試料を分析した。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
これらの結果は、開示した発明を用いて、４時間後に１００個のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出できたことを示す。より高いレベルのＥ．ｃｏｌｉ（１×１０５細胞以上）が１時間後に検出可能である。
【００８７】
同様に、上述のラテラルフローストリッププロセスは、ＰＲＤ−１バクテリオファージを用いて豚コレラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）を、ガンマファージを用いて炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を、また、Ｂ−３０バクテリオファージを用いて第８群ストレプトコッカスを検出するためにもうまく使用できた。
【００８８】
（Ｂ．ＳＩＬＡＳ表面実施例）
方法：Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，８１ Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ０２４５４−９０４６において開発された標準的な方法を用いて、コーティングされた表面と、ＨＲＰ共役抗体を調製した。簡単に説明すると、表面を４ｕｇ／ｍｌウサギ抗ＭＳ２抗体を含むＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．８）の溶液中で、４８時間コーティングした。コーティング後、ウェハを洗浄し、糖：タンパク質保存剤でオーバーコートし、７ｍｍ四方のチップに分離した。
【００８９】
共役化は、Ｎａｋａｅの方法のＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎに従って進めた。過酸化ナトリウムを用いてＨＲＰを活性かして、無水物をタンパク質の炭水化物部分上に導入した。活性化したＨＲＰとウサギ抗ＭＳ２抗体を混合し、インキュベートした。共役物は、ホウ化水素ナトリウムを加えて、Ｓｃｉｆｆ塩基を減らすことにより安定化した。
【００９０】
与えられたＭＳ２の検出能力を調べるための試験を行った。最初の形式では、同期および連続形式の両方を含んでいた。同期形式は、試料と共役物（共役物希釈物中１：１００に希釈）を混合することと、コーティングされたＯＩＡチップの表面に試料を加えることで構成した。インキュベーションに続いて、表面を洗浄して乾燥させた後、酵素基板（ＴＭＢ）を加えた。１回目および２回目のインキュベーションは、５分間または１０分間、平衡に保った。連続アッセイは、試料と共役物を混合せずに、個別にチップに加えたこと以外は、同期形式と同様に行った。インキュベーション工程は、洗浄とブロッティング工程に分割した。連続アッセイは、すべての工程に対して１０分間のインキュベーションを用いた。
【００９１】
結果：ここに記載する非最適化方法は、明らかに１０７においてＭＳ２試料を検出することができたが、結果は１０４に対して混合していた。すべての場合における色変化は、深金橙から深紫であった。同時形式を用いて、弱く、かろうじて視認できる結果が、２回の１０分間インキュベーションを用いて非希釈試料において検出された。連続方法を用いて、検出されるシグナルは１０７においてより強かった。３回の１０分間インキュベーションによって、１０７シグナルは明確になり、１０４シグナルが視認できるようになったが、非常に弱かった。系列希釈は、１０７試料を、２倍希釈を用いて生理食塩水中に希釈することによって行った。陽性の結果が、１０７試料の１：１６希釈まで検出された。これは、６．２５×１０５と略等しい。
【００９２】
（Ｃ．抗生物質耐性）
この実施例においては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）における抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いたバクテリオファージ増幅によって迅速に判定した。ＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの特定の株の増殖を阻害する最低の抗生物質濃度である。当該株が、検定濃度の抗生物質に感受性があれば、バクテリオファージ 生物マーカーシグナルは、抗生物質阻害、ひいてはファージ増幅の抑制のために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって検出されることはない。一方、ファージ生物マーカーシグナルが検出される場合は、ＭＩＣが達成されておらず、抗生物質が有効でない点を表すことになる。本研究に対するＭＩＣを判定するためには、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンを選択した。
【００９３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２７７０９，Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）の２４時間培養を、抗生物質（ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン）の存在および非存在下、ＢＨＩブロスにおいて行った。ファージ１８７およびＳ．ａｕｒｅｕｓ試料を、ＭＡＬＤＩの検出限界未満に希釈した後、ファージを宿主中に感染させ、該宿主中で細胞が破裂するまでバクテリオファージの増幅を行った。次に試料を清浄化し、分析のために濃縮した。乾燥液滴（ｄｒｉｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）法を用いて、試料を、ギ酸、アセトニトリルおよびＨＰＬＣグレード水の溶液中に混合した１５ｍｇ／ｍＬフェルラサンマトリックスを有する疎水性標的プレート上に分析のためにプレーティングした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて、線形モードの質量スペクトルを得た。
【００９４】
抗生物質中でＳ．ａｕｒｅｕｓを培養することにより、その抗生物質の濃度が、細菌細胞を破壊するのに十分であるか否かがわかる。細菌細胞が生きていれば、それらは構成物質によって影響を受けておらず、細胞が感染された場合にファージ増幅が起こることを示す。バクテリオファージに対するタンパク質マーカーが、質量スペクトル中に見られるという結果が得られる。一方、生物マーカーが質量スペクトル中に見られない場合には、最小阻害濃度に達しているかこれを超えていることを示す。結論として、細胞が破壊され、したがって、バクテリオファージ増幅が全く起こりえないことになる。
【００９５】
ＭＡＬＤＩ上での分析に先立って、半精製技術を用いて、試料をろ過および濃縮した。機器が塩に不耐性のために、試料を１００ｋＤａカットオフを用いてスピンろ過した。ファージ１８７からの質量スペクトルは、１５，２４５Ｄａの位置に、はっきりと区別できるタンパク質生物マーカーを示した。ファージ１８７も、超遠心分離および塩化セシウム勾配によって精製し、半精製ろ過技術によって生物マーカーが同定されることを確かめた。検出のＭＡＬＤＩ ＭＳ限界を、細菌およびファージの両者について確立したところ、それぞれ、１０６細胞／ｍＬおよび１０８ファージ／ｍＬであった。シグナルが増幅ファージに由来するものであることを確認するために、実験のあいだ、細菌およびファージの濃度をＭＡＬＤＩの検出限界未満に保った。抗生物質の濃度が低い場合には、ファージからのタンパク質ピークがＭＡＬＤＩスペクトル中に存在し、細菌の増殖とファージの複製が未だ起こっていることが示された。濃度が高くなると、スペクトルはタンパク質ピークを欠き、ＭＩＣに達したか超えたことが示された。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態の特徴は、バクテリオファージに曝露されたサンプルで親ファージが破壊、除去、中和または不活性化されないことである。従来の方法においては、細胞外バクテリオファージ、すなわち細菌または他の感染されている微生物の外のバクテリオファージがどこかの時点で破壊、除去、中和または不活性化される。このことが本発明では必要ない。特に、バクテリオファージを殺す薬剤の添加による細胞外バクテリオファージの破壊、中和または不活性化は、行わないことが好ましい。これは、これが方法を不要に複雑にし、薬剤が除去または中和されないと子孫バクテリオファージに影響を及ぼしかねないからである。
【００９７】
選択された生物に特異的で、感度が良く、単純で、迅速で、および／または経済的であり、数々の新しい特徴を有する微生物検出方法について記載してきた。本発明は、ヒト臨床診断、獣医診断、食品病原体検出、環境試験および生物戦争検出を含む幅広い用途に用いることができる。図面に示しおよび本明細書中に記載する特定の実施形態は、例示を目的とし、本発明を限定するものと解釈すべきでない。本発明は以下の請求項において記載する。さらに、当業者であれば、本発明の概念から逸脱しない限りで、記載した特定の実施形態の多くの用途および変形を作り出すことができよう。均等な構造およびプロセスを、記載した様々な構造およびプロセスに置き換えてもよく、本発明の方法のサブプロセスは、いくつかの例において、異なる順序で実施してもよく、あるいは様々な異なる材料および要素を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ファージを試料に添加して、検出限界未満の初期濃度を与える本発明の第１の実施形態を示している。
【図２】図２は、ファージ感染、増幅、および細胞溶菌のインキュベーションプロセスを説明する。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、試験試料中のファージを検出するためのラテラルフロー装置の使用を説明する。
【図４】図４は、図３Ａのフロー装置の側断面図である。
【図５】図５は、バクテリオファージの説明図である。
【図６】図６は、ファージを試料に添加して、検出限界未満の初期濃度を与える本発明の第２の実施形態を示しており、ここではファージは、ファージの小成分である生物マーカーが検出されるように解離されている。
【図７】図７は、標識されたファージが試料に添加される第３の実施形態を示す。
【図８】図８は、標識した親ファージを試料に加え、ファージ小成分である生物マーカーが検出されるように子孫ファージが解離されている本発明の第４の実施形態を示す。
【図９】図９は、本発明を用いた抗生物質耐性細菌の検出を示す。
【図１０】図１０はファージ増幅プロセスを示す。
【図１１】図１１は、いくつかの可能な生物マーカーを示すバクテリオファージＴ４に対する質量対強度を示すＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１２】図１２は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１３】図１３は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１４】図１４は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１５】図１５は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１６】図１６は、ＳＩＬＡＳ表面を用いたファージに基づくアッセイプロセスを示す。
【図１７】図１７は、図１２〜１６のアッセイからの陰性の結果を示す。
【図１８】図１８は、図１２〜１６のアッセイからの陽性の結果を示す。
【図１９】図１９は、本発明に従う試験キットを示す。
【図２０】図２０は、図１９の試験キットを用いるための例示的指針を示すとともに、該試験キットの試料を説明する。
【図２１】図２１は、感染プロセスの所望の特性を強化するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いた本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２２】図２２は、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いる本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２３】図２３は、酵素を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを用いる本発明に従う例示的アッセイを示す。
【図２４】図２４は、カプシドタンパク質上で標的を発現するように遺伝的に修飾されたバクテリオファージを利用した本発明に従う例示的アッセイを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験されるサンプル中の標的微生物（１４）の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージ（１８）を該サンプルと合わせて（１２）、バクテリオファージに暴露されたサンプル（１６）を作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量（３７）の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質（９７）のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する（２０）工程を包含し、該方法は、以下：
該バクテリオファージ、または該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかが、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に存在する場合、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、その少なくとも一部（４６，２４０）が色を変える基板（６４，２２０）に塗布する工程、および
該標的微生物の有無の指標として、該色変化の有無を決定する工程、
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記塗布工程は、前記バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ラテラルフローストリップ（４０）に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塗布工程は、前記バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バクテリオファージ（７０）は、遺伝的に改変されている（３００，３１０，３２０，３３１）、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を増強するように遺伝的に改変されている（３００）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バクテリオファージは、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されている（３１０）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バクテリオファージは、酵素を発現するように遺伝的に改変されている（３２０）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリオファージは、カプシドタンパク質（７２）上に標的を発現するように遺伝的に改変されている（３３１）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
微生物試験基板（４０）の製造方法であって、該方法は、以下：
基板（６４）およびバクテリオファージ（５１）に付加できる生物物質（４７）または該バクテリオファージに関連する生物物質を提供する工程；
該基板上に該生物物質のライン（４６）を形成する工程；ならびに
該基板を、該ラインに本質的に垂直な方向に切断して、該試験基板を形成する工程、
を特徴とする方法。
【請求項１０】
前記基板は、多孔性膜（６４）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物物質は、抗体（４７）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記提供する工程は、第１生物物質および第２生物物質を提供する工程を包含し、前記形成する工程は、該第１生物物質を有する第１ライン（４６）および該第２生物物質を有する第２ライン（４８）を形成する工程を包含し、該第１ラインおよび該第２ラインは実質的に平行であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記提供する工程は、第３生物物質を提供する工程をさらに包含し、前記形成する工程は、該第３生物物質を有する第３ライン（６６）を形成する工程を包含し、該第３ラインは、第１ラインおよび第２ラインと実質的に平行であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細菌学試験基板（２２０）の製造方法であって、該方法は、以下：基板（２２１）を提供する工程；および該基板上に光学コーティング（２２２）を形成する工程を包含し；該方法は、生物物質（２２８）を該光学コーティング上に固定する工程を特徴とし、該生物物質は、バクテリオファージ（２３０）または該バクテリオファージに関連する生物物質に付加することができる、方法。
【請求項１５】
前記固定する工程は、付加ポリマー（２２４）を、前記光学コーティングに塗布する工程、および前記生物物質を該付加ポリマー上に蒸着する工程を包含することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物物質（２３０）は、抗体であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる一定量の親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する工程を包含し；該方法は、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ラテラルフローストリップに塗布して、該標的微生物の有無を決定する工程を特徴とする方法。
【請求項１８】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を、前記サンプル中に該標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる一定量の親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する工程を包含し、該方法は、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ＳＩＬＡＳ表面に塗布して、該標的微生物の有無を決定する工程を特徴とする方法。
【請求項２０】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を前記サンプル中に該標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的微生物（１４）を検出するための装置（４０，２２０）であって、該装置は、基板（６４，２２１）；および該基板上の固定化ゾーン（４６，２２５）を備え、該固定化ゾーンは、バクテリオファージ（５１，２３０）またはバクテリオファージに関連する生物物質を固定化するように設計された固定化剤（４７，２２８）を含み、該装置は、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかと相互作用するように設計された色調剤（４５，２３５）を特徴とし、これにより該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの存在が、該固定化ゾーンの色変化を引き起こすことを特徴とする装置。
【請求項２２】
前記固定化ゾーンは、抗体（４７，２３０）を含むことを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記色調剤は、着色したビーズ（４５）を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記色調剤は、反応した場合、沈殿剤（２３８）を形成する反応剤（２３２）および酵素（２３６）を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記反応剤は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される物質を含み、前記酵素は、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むことを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板は、ラテラルフローストリップ（４０）を備えることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２７】
前記基板は、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）を備えることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２８】
前記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２９】
試験されるサンプル（１１）中の標的微生物（１４）の有無を決定するためのキット（２５４）であって、該キットは、該標的微生物に感染させることのできるバクテリオファージ（２６８）を収容した第１の容器（２６０）を備え、該キットは、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかが存在する場合、少なくとも一部（２８８）の色が変化する基板（２６６）を特徴とするキット。
【請求項３０】
緩衝溶液（２５８）を収容する第２の容器（２５６）をさらに特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記基板は、ラテラルフローストリップ（４０，２６６）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記基板は、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
前記第１容器は、所定の大きさの液滴を放出するように設計された点滴器（２６５）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
前記標的微生物は、細菌であることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３５】
試験されるサンプル中の微生物の有無を検出する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、子孫バクテリオファージを作製する工程を可能にするのに十分な条件を提供する工程；および該バクテリオファージに暴露されたサンプルをアッセイして、該サンプル中の該標的微生物の有無の指標としての該バクテリオファージ物質の有無を決定する工程を包含し；該方法は、該条件を提供する工程が、該アッセイに利用可能な解離したバクテリオファージ物質を生産するための条件を提供する工程をさらに包含することを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージ物質を、前記サンプル中に前記標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記提供する工程は、前記微生物を溶解して、前記バクテリオファージを放出する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶解する工程は、微生物リゾチームを前記バクテリオファージに暴露されたサンプルに添加する工程を包含することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶解する工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルにクロロホルムを添加する工程、該バクテリオファージに曝露されたサンプルを酸で処理する工程、および該バクテリオファージに曝露されたサンプルを物理的に加工する工程からなる群より選択される方法を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記提供する工程は、バクテリオファージ解離剤を、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルに添加する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記添加する工程は、酸、尿素、変性剤および酵素からなる群より選択される物質を添加する工程を包含することを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記合わせる工程は、前記親バクテリオファージを標識する工程を包含し、前記提供する工程は、該標識した親バクテリオファージを分離する工程、および次いで該バクテリオファージを解離させて、解離したバクテリオファージ物質を生成する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程および該親バクテリオファージを物理的基板へ付加させる工程からなる群より選択されるプロセスを包含することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルをラテラルフローストリップに塗布する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルをＳＩＬＡＳ表面に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルの少なくとも一部を、ＭＡＬＤＩ質量分析計でアッセイする工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物物質は、カプシドタンパク質であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記バクテリオファージは、遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を増強するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記バクテリオファージは、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記バクテリオファージは、酵素を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記バクテリオファージは、カプシドタンパク質上に標的を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできるバクテリオファージを提供する工程；該バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程；該バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて子孫バクテリオファージを作製するのに十分な条件を提供する工程；および、該バクテリオファージに曝露されたサンプルのアッセイを行って、該子孫バクテリオファージまたは該子孫バクテリオファージに関連する生物物質の有無を検出して、該標的微生物の有無を決定する工程を包含し、該方法は、
該標的微生物を感染させることのできるバクテリオファージの該サンプルを標識する工程；および
該アッセイの前に、該標識したバクテリオファージを該子孫バクテリオフージから分離する工程、
を特徴とする方法。
【請求項５４】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程および該親バクテリオファージを物理的基板へ付加する工程からなる群より選択されるプロセスを包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程を包含し、前記分離する工程は、該ビオチン化バクテリオファージをストレプトアビジンに引きつける工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記アッセイする工程は、以下：サンプル塗布パッドおよび検出ラインを有するラテラルフローストリップを提供する工程、ならびに前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを前記サンプル塗布パッドに塗布する工程を包含し；そして、
前記分離工程は、前記ビオチン化親バクテリオファージを、前記検出ラインの前の前記ラテラルストリップのストレプトアビジンでコーティングした部分に結合させる工程を包含することを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージを物理的基板に接触させる工程を包含し、前記分離工程は、前記物理的基板を前記サンプル中の検出すべき前記バクテリオファージから単離する工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記単離工程は、前記物理的基板を前記試験サンプルから除去する工程を包含することを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記分離工程は、前記標識したバクテリオファージを前記バクテリオファージに曝露されたサンプルから除去する工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記除去工程は、前記標識したバクテリオファージを除去するために磁気ビーズを使用する工程を包含することを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
標的微生物の抗生物質に対する耐性または感受性を決定する方法であって、該方法は、該標的微生物を含むサンプルを提供する工程を包含し、該方法は、以下：
（ｂ）該サンプルを第１サンプルおよび第２サンプルに分割する工程；
（ｃ）該抗生物質を該第２サンプルに添加する工程；
（ｄ）該第１サンプルおよび該第２サンプルのそれぞれを、該標的微生物に感染することのできるバクテリオファージと合わせて、第１のバクテリオファージに曝露されたサンプルおよび第２のバクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程；
（ｅ）該バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させ、検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを、該バクテリオファージに曝露されたサンプル中で産生するのに十分な条件を提供する工程；
（ｆ）該バクテリオファージに曝露されたサンプルをアッセイして、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの有無を検出し、該第１サンプルおよび該第２サンプル中の該標的微生物の有無を決定する工程；ならびに、
（ｇ）該第１サンプルおよび該第２サンプルに対する該アッセイの結果を比較し、該抗生物質に対する該標的微生物の耐性または感受性を決定する工程、
を特徴とする方法。
【請求項６２】
前記アッセイする工程は、前記第１サンプルを第１ラテラルフローストリップに塗布し、前記第２サンプルを第２ラテラルフローストリップに塗布する工程を包含することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アッセイする工程は、前記第１サンプルを第１ＳＩＬＡＳ表面に塗布し、前記第２サンプルを第２ＳＩＬＡＳ表面に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記添加する工程は、複数の前記抗生物質を添加する工程を包含することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
試験されるサンプル中の微生物の有無を検出する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを、該バクテリオファージに曝露されたサンプルで作製するのに十分な条件を提供する工程；および該バクテリオファージに曝露されたサンプルをアッセイして、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの有無を検出し、該標的微生物の有無を決定する工程を包含し、該方法は、該アッセイの前に能動的に該微生物を溶解する工程を特徴とする方法。
【請求項６６】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を、前記サンプル中に前記標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記生物物質は、カプシドタンパク質であることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記能動的溶解工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルに微生物リゾチームを添加する工程を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記能動的溶解工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルにクロロホルムを添加する工程、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを酸で処理する工程、および前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを物理的に加工する工程からなる群より選択される方法を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項１】
試験されるサンプル中の標的微生物（１４）の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージ（１８）を該サンプルと合わせて（１２）、バクテリオファージに暴露されたサンプル（１６）を作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量（３７）の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質（９７）のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する（２０）工程を包含し、該方法は、以下：
該バクテリオファージ、または該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかが、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に存在する場合、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、その少なくとも一部（４６，２４０）が色を変える基板（６４，２２０）に塗布する工程、および
該標的微生物の有無の指標として、該色変化の有無を決定する工程、
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記塗布工程は、前記バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ラテラルフローストリップ（４０）に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塗布工程は、前記バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バクテリオファージ（７０）は、遺伝的に改変されている（３００，３１０，３２０，３３１）、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を増強するように遺伝的に改変されている（３００）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バクテリオファージは、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されている（３１０）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バクテリオファージは、酵素を発現するように遺伝的に改変されている（３２０）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリオファージは、カプシドタンパク質（７２）上に標的を発現するように遺伝的に改変されている（３３１）ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
微生物試験基板（４０）の製造方法であって、該方法は、以下：
基板（６４）およびバクテリオファージ（５１）に付加できる生物物質（４７）または該バクテリオファージに関連する生物物質を提供する工程；
該基板上に該生物物質のライン（４６）を形成する工程；ならびに
該基板を、該ラインに本質的に垂直な方向に切断して、該試験基板を形成する工程、
を特徴とする方法。
【請求項１０】
前記基板は、多孔性膜（６４）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物物質は、抗体（４７）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記提供する工程は、第１生物物質および第２生物物質を提供する工程を包含し、前記形成する工程は、該第１生物物質を有する第１ライン（４６）および該第２生物物質を有する第２ライン（４８）を形成する工程を包含し、該第１ラインおよび該第２ラインは実質的に平行であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記提供する工程は、第３生物物質を提供する工程をさらに包含し、前記形成する工程は、該第３生物物質を有する第３ライン（６６）を形成する工程を包含し、該第３ラインは、第１ラインおよび第２ラインと実質的に平行であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細菌学試験基板（２２０）の製造方法であって、該方法は、以下：基板（２２１）を提供する工程；および該基板上に光学コーティング（２２２）を形成する工程を包含し；該方法は、生物物質（２２８）を該光学コーティング上に固定する工程を特徴とし、該生物物質は、バクテリオファージ（２３０）または該バクテリオファージに関連する生物物質に付加することができる、方法。
【請求項１５】
前記固定する工程は、付加ポリマー（２２４）を、前記光学コーティングに塗布する工程、および前記生物物質を該付加ポリマー上に蒸着する工程を包含することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物物質（２３０）は、抗体であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる一定量の親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する工程を包含し；該方法は、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ラテラルフローストリップに塗布して、該標的微生物の有無を決定する工程を特徴とする方法。
【請求項１８】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を、前記サンプル中に該標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる一定量の親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを産生するのに十分な条件を提供する工程を包含し、該方法は、該バクテリオファージに暴露されたサンプルを、ＳＩＬＡＳ表面に塗布して、該標的微生物の有無を決定する工程を特徴とする方法。
【請求項２０】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を前記サンプル中に該標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的微生物（１４）を検出するための装置（４０，２２０）であって、該装置は、基板（６４，２２１）；および該基板上の固定化ゾーン（４６，２２５）を備え、該固定化ゾーンは、バクテリオファージ（５１，２３０）またはバクテリオファージに関連する生物物質を固定化するように設計された固定化剤（４７，２２８）を含み、該装置は、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかと相互作用するように設計された色調剤（４５，２３５）を特徴とし、これにより該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの存在が、該固定化ゾーンの色変化を引き起こすことを特徴とする装置。
【請求項２２】
前記固定化ゾーンは、抗体（４７，２３０）を含むことを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記色調剤は、着色したビーズ（４５）を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記色調剤は、反応した場合、沈殿剤（２３８）を形成する反応剤（２３２）および酵素（２３６）を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記反応剤は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される物質を含み、前記酵素は、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含むことを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板は、ラテラルフローストリップ（４０）を備えることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２７】
前記基板は、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）を備えることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２８】
前記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２９】
試験されるサンプル（１１）中の標的微生物（１４）の有無を決定するためのキット（２５４）であって、該キットは、該標的微生物に感染させることのできるバクテリオファージ（２６８）を収容した第１の容器（２６０）を備え、該キットは、該バクテリオファージに暴露されたサンプル中に該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかが存在する場合、少なくとも一部（２８８）の色が変化する基板（２６６）を特徴とするキット。
【請求項３０】
緩衝溶液（２５８）を収容する第２の容器（２５６）をさらに特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記基板は、ラテラルフローストリップ（４０，２６６）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記基板は、ＳＩＬＡＳ表面（２２０）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
前記第１容器は、所定の大きさの液滴を放出するように設計された点滴器（２６５）を備えることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
前記標的微生物は、細菌であることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３５】
試験されるサンプル中の微生物の有無を検出する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；および、該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、子孫バクテリオファージを作製する工程を可能にするのに十分な条件を提供する工程；および該バクテリオファージに暴露されたサンプルをアッセイして、該サンプル中の該標的微生物の有無の指標としての該バクテリオファージ物質の有無を決定する工程を包含し；該方法は、該条件を提供する工程が、該アッセイに利用可能な解離したバクテリオファージ物質を生産するための条件を提供する工程をさらに包含することを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージ物質を、前記サンプル中に前記標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記提供する工程は、前記微生物を溶解して、前記バクテリオファージを放出する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶解する工程は、微生物リゾチームを前記バクテリオファージに暴露されたサンプルに添加する工程を包含することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶解する工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルにクロロホルムを添加する工程、該バクテリオファージに曝露されたサンプルを酸で処理する工程、および該バクテリオファージに曝露されたサンプルを物理的に加工する工程からなる群より選択される方法を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記提供する工程は、バクテリオファージ解離剤を、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルに添加する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記添加する工程は、酸、尿素、変性剤および酵素からなる群より選択される物質を添加する工程を包含することを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記合わせる工程は、前記親バクテリオファージを標識する工程を包含し、前記提供する工程は、該標識した親バクテリオファージを分離する工程、および次いで該バクテリオファージを解離させて、解離したバクテリオファージ物質を生成する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程および該親バクテリオファージを物理的基板へ付加させる工程からなる群より選択されるプロセスを包含することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルをラテラルフローストリップに塗布する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルをＳＩＬＡＳ表面に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルの少なくとも一部を、ＭＡＬＤＩ質量分析計でアッセイする工程を包含することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物物質は、カプシドタンパク質であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記バクテリオファージは、遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記バクテリオファージは、感染プロセスの所望の特性を増強するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記バクテリオファージは、検出可能な生物マーカーを過剰発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記バクテリオファージは、酵素を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記バクテリオファージは、カプシドタンパク質上に標的を発現するように遺伝的に改変されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
試験されるサンプル中の標的微生物の有無を決定する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできるバクテリオファージを提供する工程；該バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程；該バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて子孫バクテリオファージを作製するのに十分な条件を提供する工程；および、該バクテリオファージに曝露されたサンプルのアッセイを行って、該子孫バクテリオファージまたは該子孫バクテリオファージに関連する生物物質の有無を検出して、該標的微生物の有無を決定する工程を包含し、該方法は、
該標的微生物を感染させることのできるバクテリオファージの該サンプルを標識する工程；および
該アッセイの前に、該標識したバクテリオファージを該子孫バクテリオフージから分離する工程、
を特徴とする方法。
【請求項５４】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程および該親バクテリオファージを物理的基板へ付加する工程からなる群より選択されるプロセスを包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージをビオチン化する工程を包含し、前記分離する工程は、該ビオチン化バクテリオファージをストレプトアビジンに引きつける工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記アッセイする工程は、以下：サンプル塗布パッドおよび検出ラインを有するラテラルフローストリップを提供する工程、ならびに前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを前記サンプル塗布パッドに塗布する工程を包含し；そして、
前記分離工程は、前記ビオチン化親バクテリオファージを、前記検出ラインの前の前記ラテラルストリップのストレプトアビジンでコーティングした部分に結合させる工程を包含することを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標識する工程は、前記親バクテリオファージを物理的基板に接触させる工程を包含し、前記分離工程は、前記物理的基板を前記サンプル中の検出すべき前記バクテリオファージから単離する工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記単離工程は、前記物理的基板を前記試験サンプルから除去する工程を包含することを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記分離工程は、前記標識したバクテリオファージを前記バクテリオファージに曝露されたサンプルから除去する工程を包含することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記除去工程は、前記標識したバクテリオファージを除去するために磁気ビーズを使用する工程を包含することを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
標的微生物の抗生物質に対する耐性または感受性を決定する方法であって、該方法は、該標的微生物を含むサンプルを提供する工程を包含し、該方法は、以下：
（ｂ）該サンプルを第１サンプルおよび第２サンプルに分割する工程；
（ｃ）該抗生物質を該第２サンプルに添加する工程；
（ｄ）該第１サンプルおよび該第２サンプルのそれぞれを、該標的微生物に感染することのできるバクテリオファージと合わせて、第１のバクテリオファージに曝露されたサンプルおよび第２のバクテリオファージに曝露されたサンプルを作製する工程；
（ｅ）該バクテリオファージに曝露されたサンプルに対して、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させ、検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを、該バクテリオファージに曝露されたサンプル中で産生するのに十分な条件を提供する工程；
（ｆ）該バクテリオファージに曝露されたサンプルをアッセイして、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの有無を検出し、該第１サンプルおよび該第２サンプル中の該標的微生物の有無を決定する工程；ならびに、
（ｇ）該第１サンプルおよび該第２サンプルに対する該アッセイの結果を比較し、該抗生物質に対する該標的微生物の耐性または感受性を決定する工程、
を特徴とする方法。
【請求項６２】
前記アッセイする工程は、前記第１サンプルを第１ラテラルフローストリップに塗布し、前記第２サンプルを第２ラテラルフローストリップに塗布する工程を包含することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アッセイする工程は、前記第１サンプルを第１ＳＩＬＡＳ表面に塗布し、前記第２サンプルを第２ＳＩＬＡＳ表面に塗布する工程を包含することを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記添加する工程は、複数の前記抗生物質を添加する工程を包含することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
試験されるサンプル中の微生物の有無を検出する方法であって、該方法は、以下：該標的微生物を感染させることのできる親バクテリオファージを該サンプルと合わせて、バクテリオファージに暴露されたサンプルを作製する工程；該バクテリオファージに暴露されたサンプルに、該バクテリオファージを該標的微生物に感染させて、該標的微生物中で複製させて、検出可能な量の、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかを、該バクテリオファージに曝露されたサンプルで作製するのに十分な条件を提供する工程；および該バクテリオファージに曝露されたサンプルをアッセイして、該バクテリオファージまたは該バクテリオファージに関連する生物物質のどちらかの有無を検出し、該標的微生物の有無を決定する工程を包含し、該方法は、該アッセイの前に能動的に該微生物を溶解する工程を特徴とする方法。
【請求項６６】
前記微生物は細菌であり、前記アッセイする工程は、前記バクテリオファージまたは前記バクテリオファージに関連する生物物質を、前記サンプル中に前記標的細菌が存在することの指標として検出する工程を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記生物物質は、カプシドタンパク質であることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記能動的溶解工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルに微生物リゾチームを添加する工程を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記能動的溶解工程は、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルにクロロホルムを添加する工程、前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを酸で処理する工程、および前記バクテリオファージに曝露されたサンプルを物理的に加工する工程からなる群より選択される方法を包含することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２００７−５２３６２８（Ｐ２００７−５２３６２８Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２４０５（Ｐ２００６−５３２４０５）
【出願日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１２８５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１４７５
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５０５３７５６８７）
【出願人】（５０５３７５７０２）
【出願人】（５０５３７５７２４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１２８５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１４７５
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５０５３７５６８７）
【出願人】（５０５３７５７０２）
【出願人】（５０５３７５７２４）
【Ｆターム（参考）】
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