バラ科植物抽出物等およびそれらを利用した免疫細胞活性化剤
【課題】 天然の産物を原料とした、食品あるいは補助食品等として摂取することができる免疫細胞活性化剤を提供すること。
【解決手段】 バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤。
【解決手段】 バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科植物の抽出物またはその画分を有効成分とする免疫細胞活性化剤、抗炎症剤等に関する。また、本発明は、バラ科植物の抽出物の画分にも関する。
【背景技術】
【０００２】
正常動物の免疫系は外来から侵入する多様な異物に応答し、生体から除去する一方、自己抗原に対しては反応を起こさない。免疫系は自己・非自己を識別するシステムであり、その特徴は、Ｔ、Ｂ細胞抗原受容体の多様性である。この多様性こそが多様な異物に対してきわめて特異的な認識を可能にしている。
【０００３】
しかしながら、免疫系は常に自己構成成分に対する免疫応答、自己免疫というリスクを負っている。異常免疫応答・過剰免疫応答の結果は自己免疫疾患、アレルギー等につながることになる。したがって、免疫応答の負の制御もまた、生体の恒常性維持には重要である。免疫系は、こうした自己免疫疾患やアレルギー等、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制するために、免疫応答における負の制御機構を備えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年の研究では、制御性Ｔ細胞が、この免疫応答における負の制御機構に深く関与し、自己反応性Ｔ細胞の活動を抑制することにより、免疫自己寛容を維持し、自己免疫疾患の発症を阻止していることが解明されており、さらに慢性感染症において病原微生物に対する免疫応答を抑制している可能性が示唆されている。（非特許文献１等参照）
【０００５】
したがって、免疫細胞を活性化することにより、異物を認識・排除する免疫応答を惹起しつつ、制御性Ｔ細胞をも活性化して自己免疫疾患につながる自己反応性Ｔ細胞の活動を抑制することができれば、異常免疫疾患の改善及び健康維持に役立つことが期待される。
【０００６】
一方、これら免疫細胞の活性化のためには、通常数週間から数ヶ月等の、ある程度の長期間を要することから、免疫細胞の活性化のために服用あるいは投与等するものは、副作用がないことが好ましく、天然の産物を食事として、あるいは補助食品として摂取することが望ましい。
【０００７】
従来、バラ科植物の抽出物における成分については、カロチノイドにカロテン（登録商標）、リコペン、クリプトキサンチン（登録商標）、ルビキサンチン、ゼアキサンチン及びルテインが含まれていることが知られているが（非特許文献２等参照）、免疫細胞に対する作用については詳細には調べられていない。
【０００８】
【非特許文献１】坂口志文著「免疫応答の負の制御」細胞工学Vol.21 No.11、2002年、p.1278−1279
【非特許文献２】Hodisan, T., Socaciu, C, Ropan, I, Neamtu, G. Carotenoid composition of Rosa canina fruits determined by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 16(3); 521-528; 1997.
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、鋭意検討した結果、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物に免疫細胞を活性化する能力があることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明は、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤、抗炎症剤及びリウマチ治療剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする抗アレルギー剤に関する。
【００１２】
本発明において、好ましいバラ科植物は、バラ亜科に属する植物、すなわちバラ属、シモツケソウ属、キイチゴ属、シロヤマブキ属、ヤマブキ属、ポテンティラ、オランダイチゴ属（イチゴ）、ダイコンソウ属、チョウノスケソウ属、コキンバイ属、キンミズヒキ属、ワレモコウ属、アカエナ属、アルケミラであり、さらに好ましくは、バラ属に属する植物であり、ナニワイバラ（Rosa laevigata）、モッコウバラ（Rosa.banksiae）、ノイバラ（Rosa multiflora）、ハマナス（Rosa rugosa）、ヤマイバラ（Rosa sambucina）、ロサ ポミフェラ（Rosa pomifera）、ロサ モスカータ（Rosa moschata）、イヌバラ（Rosa canina）等を挙げることができる。そして、これらの中で更に好ましくは、ハマナス及びイヌバラであり、最も好ましくはハマナスである。
【００１３】
本発明において、バラ科植物の果実及び／または種子は、好ましくは、乾燥させた果実及び／または種子であり、特に好ましくは、乾燥させた、粉末状態の果実または種子である。粉末とした場合は液体との接触面積が増加して成分が溶出しやすくなるからである。
【００１４】
本発明のバラ科植物の抽出物において、抽出に使用する溶媒としては、好ましくは水もしくは水蒸気または有機溶媒であり、これらを単独であるいは適当割合で混合して用いることができる。これらの水または有機溶媒は、常温または加熱した状態で、もしくは冷却した状態で用いることができる。有機溶媒としては、好ましくはエタノール、メタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ベンゼン等のフェノール類、ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類、を挙げることができる。有機溶媒として更に好ましいのは、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ヘキサンまたはフェノールであり、この中で更に好ましくはエタノールまたはメタノールであり、最も好ましくはメタノールである。なお、これらの抽出物は、溶媒である水もしくは水蒸気または有機溶媒を除去してその残留物のみを用いてもよい。
【００１５】
また、本発明のバラ科植物の抽出物において、抽出に使用する溶媒は、油であってもよく、本発明のバラ科植物の抽出物は、この油抽出物と上記水もしくは水蒸気または有機溶媒の抽出物を単独であるいは適当割合で混合して用いることができる。油抽出物における油は、経口摂取あるいは外用剤等の用途に応じて人体に安全な油を適宜用いることができ、天然及び合成の植物系若しくは動物系の油、例えば、ピーナッツ油、ヒマワリ種油、オリーブ油、トウモロコシ油、綿実油、紅花油、米ぬか油、アボカド油、アルモンド油、ゴマ油、サフラー油、大豆油、ナタネ油、パーシック油、パーム油、ヒマシ油、ヤシ油、馬油、ミンク油、卵黄脂肪油及び豚脂等を用いることができるが、好ましくはピーナッツ油、ヒマワリ種油、オリーブ油、トウモロコシ油、綿実油、紅花油、米ぬか油等の天然植物油を用いることができる。その他の植物油としては、レモングラス精油、ヒバ精油、ユーカリ精油、ラベンダー精油、ローズマリー精油、ヒノキ精油、サンダルウッド精油、カモミール精油、クラリセージ精油、グレープフルーツ精油、クローブ精油、サイプレス精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジュニパー精油、ゼラニウム精油、タイム精油、ティートリー精油、パイン精油、パチュリ精油、フェンネル精油、ペパーミント精油、マジョラム精油、メリッサ精油、ローズウッド精油、バジル精油、バテ精油、パルマローザ精油及びヒソップ精油があり、主に外用剤等の用途には、場合によりロウ類や被膜形成剤と共に、これらの１種またはそれ以上を使用することができる。
【００１６】
さらに、本発明のバラ科植物の抽出物は、ＨＰＬＣによって作成された画分であってもよい。この明細書において、画分はバラ科植物の果実及び／または種子の乾燥粉末をメタノールで抽出し、以下に述べる方法によって得られたものをいうが、含まれる成分が同等のものである限り、この方法によって得られる画分には限定されない。
【００１７】
画分の取得方法
バラ科植物の果実及び／または種子の乾燥粉末１ｇにメタノール１０mlを添加し１５分間音波処理してアリコートを抽出する。この混合物を３５００rpmで１０分間遠心分離して上清を除去し、窒素ガス流下で乾燥状態まで減量する。残渣をメタノール５mlで音波処理して再度抽出し、最初の抽出物と第二の抽出物を合わせる。
【００１８】
分画
残渣をＨＰＬＣ移動相（アセトニトリル：水＝５０：５０）に再溶解し、試料を遠心分離する。沈殿した不溶残渣を計量し分離画分とする。透明の上清については画分コレクターを用いて収穫する。無脂抽出物を分取カラムを用い、１０％−９５％のアセトニトリル勾配を用いて２０分間、毎分２５mlで流す。画分を１分間隔で採取し、ＨＰＬＣ検出器のＵＶ／ＶＩＳプロファイルを基準に９画分（沈殿を含めて１０画分）にプールする。以下に、ハマナス（表１）及びイヌバラ（表２）の場合についてそれぞれの画分及び含まれる化合物量及び含まれる成分の具体例を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
本発明において、バラ科植物の抽出物における好ましい画分は、Ｆ１〜Ｆ５及びＦ１０であり、さらに好ましくはＦ１〜Ｆ５であり、最も好ましくはＦ２、Ｆ４及びＦ５である。また、ハマナスにおける好ましい画分は、画分Ｆ１〜Ｆ８及びＦ１０であり、さらに好ましくは画分Ｆ２、Ｆ４〜Ｆ８及びＦ１０であり、さらに好ましくはＦ４〜Ｆ６であり、最も好ましくはＦ５である。また、イヌバラにおいて好ましい画分は画分Ｆ１〜Ｆ５及びＦ１０であり、さらに好ましくは画分Ｆ２、Ｆ４及びＦ５であり、最も好ましくはＦ２である。
【００２２】
また、油を溶媒とする抽出物について、ＨＰＬＣは、移動相をＡ＝水及びＢ＝エタノール／アセトニトリル＝３０／７０溶液とし、Ｂ％＝９５→１００（１０分で直線勾配）としてカラム温度４０℃で１．０ml／分の流量（注入量２０μｌ）にてＨＰＬＣ分析を行う。本発明のバラ科植物の抽出物における、油抽出物として特に好ましい画分は、ＨＰＬＣにおいてビタミンＥ（α−トコフェロール）溶出位置近傍に現れる、ビタミンＥ類似体を含む画分である（図９参照）。
【００２３】
本発明において、免疫細胞は、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を含むリンパ球であり、さらに好ましくは、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞及び制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞であり、最も好ましくは制御性Ｔ細胞である。
【００２４】
本発明の免疫細胞活性化剤、抗炎症剤またはリウマチ治療剤等の各種の剤は、散剤、顆粒剤、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態であってよく、これらを経口的に用いることができる。また、他の形態としては、水またはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との溶液、または懸濁液剤等の注射用剤の形で経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に、あるいは単離した細胞に対して直接に、投与することができる。さらに他の形態としては、オイルパック剤等として経皮的に用いることも可能である。
【発明の効果】
【００２５】
以上述べたように、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子およびその抽出物またはその画分は免疫細胞を活性化する効果を有する。
【００２６】
さらに各種疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、反復性髄膜炎など）における異常リンパ球の、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物との培養による変化を観察したところ、培養７２時間後には低下していた制御性Ｔ細胞の数が正常値まで回復し、異常に亢進したＣＤ２６、また異常に低下したＣＤ２５及びＩＬ１０が正常状態に戻ったことが確認された（ＣＤ２６：異常に冗進したＣＤ２６発現Ｔ細胞の割合（培養24時間後で全Ｔ細胞の約４５％〜約５５％）が、培養72時間後には正常状態である約１５％〜約２５％に回復した（n=33）。；ＣＤ２５：ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞の割合が、培養１２時間後で全Ｔ細胞の約２％〜約９％であったものが、７２時間後には約５％〜約３３％にまで増加した（n=33）、ＩＬ１０：ＩＬ１０発現Ｔ細胞の数が、培養２４時間後で全Ｔ細胞の約３％〜約１０％であったものが、７２時間後には約２０％〜約４５％にまで増加した（n=33））。さらに、過剰な活性酸素を低減し、細胞機能を活性化させる能力があることがわかった。
【００２７】
加えて、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及び反復性髄膜炎等の免疫異常疾患に対し、インビトロ及びインビボの両面で抗炎症及び免疫細胞の正常化の効果が認められている（リウマチ（６１歳患者）、移動性リウマチ、変形性リウマチ等で改善例少なくとも５例）。さらに、本発明の免疫活性化剤等を併用することにより、ステロイド剤や消炎鎮痛剤など副作用の強い薬剤の用量を減らすことができることが確認されている。
【００２８】
ここで、抗炎症活性やリウマチ治療効果と免疫細胞の活性化の関係について説明すると、免疫細胞が分裂促進物質により活性化される場合において、さらに免疫細胞の増殖率が刺激されることが観察される。この免疫系の活性化に対する刺激は、傷害や異物等の攻撃に対する通常の炎症性応答の一部として頻繁に観察されるものである。抗炎症活性の増強と免疫応答の増強は、多くの場合結びついて起こる。すなわち、免疫細胞の活性化は、抗炎症活性やリウマチ治療等の効果に直接結びつくものであるといえる。
【００２９】
さらに、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物は、上記の他、各種のアレルギー症状、すなわち、花粉症、喘息、アトピー、じんま疹等の症状を著しく軽減する効果があることがわかり、すなわち抗アレルギー剤としての効果も確認されている（アトピー：１４歳患者（腕部及び脚部）、３４歳患者（両手部）が改善した例の他、少なくとも４例；喘息：２歳、３歳、４２歳患者にて改善例少なくとも３件；花粉症：２４歳、２７歳及び４２歳患者にて改善例少なくとも３件）。また、加齢による動脈硬化はコレステロールのみならず血管の慢性炎症も原因として指摘されているが、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物の服用後に、血管の炎症指標の一つである高感度ＣＲＰを比較してみると、大幅に改善し、炎症が治まっていくことが確認された。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例を挙げてより具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
バラ科植物の材料
以下の実施例における材料としては、バラ科植物であるハマナス及びイヌバラの種子及び果実を乾燥・粉砕して得られた粉末を用いた。具体的には、ハマナス粉末としては、ワイルドローズフォルテTM（アメリカンバイオロジックスジャパン株式会社）を、イヌバラ粉末としてはHybena（Hybena Natural Products社（デンマーク））を用いた（以下それぞれ「ハマナス粉末」、及び「イヌバラ粉末」という。）ワイルドローズフォルテTMは、デンマークユトランド半島最北端にあるウッレ薔薇園で採取されたハマナスの実から作られている。
【００３２】
実施例１ バラ科植物の種子及び果実の抗炎症・リウマチ治療作用の検証
材料及び方法
バラ科植物の種子及び果実の抗炎症作用を調べるため、アジュバント誘発性関節炎モデルを用いた。メスのラット（Dark Agouti）の尾付け根部分にMycobacterium tuberculosisを含むフロイント完全アジュバントを皮内注射することにより、疾病を誘発した(Zhang, Lee et al, J. Immunol., vol.145 (1990) , pp2489-2493)。
【００３３】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末の効果を調べるため２群のラットを準備した。各群は６匹のメスのラット（Dark Agouti、実験開始時に生後７〜８週）からなる。
【００３４】
ラットの餌にハマナス粉末及びイヌバラ粉末をそれぞれ餌に対して２．４mg/gの割合で添加した。食餌補給開始２週間後に足容積測定装置にて後ろ足及び足首の容積変化を測定した。続いて、Zhang et al. の方法(Thompson & Staines Clinical and Experimental Immunology, vol.64(1986), pp.581-586; Zhang, Lee et al. (1990))に基づいてフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）をそれぞれのラットに注射した。ＣＦＡ中のMycobacterium tuberculosis成分は７．５mg/mlの濃度で懸濁させ、それぞれの動物の尾付け根部分に皮内投与（２×１００μl）した。
【００３５】
無処理対照群及び陽性対照群も設定した。陽性対照群には、Meloxicamを水に溶解し、毎日０．１２mg/kg体重の用量で経口にて強制投与した。この投与はアジュバントを注射し始めたのと同じ日に開始した。
【００３６】
消費された餌及び水の量を毎日測定した。それぞれの個体について受け入れられた用量を計算した。それぞれのラットを実験開始からＣＦＡ注射後１２日まで毎週計量した。ＣＦＡ投与後１３日目からそれぞれの後ろ足及び足首の容積を測定し、腫れを計算した。これを１８日目まで毎日繰り返した。各群の腫れの平均を計算し、無処理対照群と比較した。統計的有意性は、スチューデントのｔ−検定（有意水準５％）で決定した。
【００３７】
結果
食餌消費
ラットの異なる集団による1日の平均食餌消費量を表３に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
種々の集団において、食餌への添加は食餌消費量には悪影響を及ぼさなかったことが明らかになった。１日食餌消費量は無処理対照群に対して約５．５％（ハマナス）及び５％（イヌバラ)の減少量であった。
【００４０】
添加物の１日消費量を表４に示した。
【表４】
実験集団の消費量と用量には有意な差は見られなかった。
【００４１】
体重変化
炎症状態が形成されるにつれ、対照、ハマナス粉末、イヌバラ粉末、Meloxicamの全ての処理群の動物が体重を減らしたが、各群での相違はほとんどなかった。具体的には、イヌバラ粉末添加の集団と対照集団の差異はなく、両者とも１７．４％の体重減少がみられ、Meloxicam投与群では１８％、ハマナス粉末添加を受けた集団については１９．０％の体重減少が見られた。
【００４２】
フットスコア
炎症は米国リウマチ協会スコアリングシステム（The American Rheumatism Association scoring system (Cremer et al., J Molec. Med, 76(1998): 275-288）に従って時間点数（time points）でスコアリングした（表５）。
【００４３】
【表５】
【００４４】
この表からわかるように、Meloxicamで処理した動物は最も低い値を示し、抗炎症効果が最も高い。ハマナス粉末においては炎症を１７％低減している。イヌバラについては、２．５％の低減が見られた。
【００４５】
食餌の消費量は、全ての集団が同じような値であった。したがって、集団の比較においては添加した粉末の消費量も同様である。したがって、ハマナス及びイヌバラの用量はほぼ同じことになる。
【００４６】
実施例２ Ｔ細胞活性化効果の検証
抽出
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末にそれぞれメタノール１０mlを添加し１５分間音波処理して成分を抽出した。この抽出物を３５００rpmで１０分間遠心分離して上清を除去し、窒素ガス流下で乾燥状態まで減量した。残渣をメタノール５mlで音波処理して再度抽出し、最初の抽出物と第二の抽出物を合わせた。
【００４７】
分画
抽出された残渣をHPLC移動相（アセトニトリル：水＝５０：５０）に再溶解し、試料を遠心分離した。沈殿した不溶残渣を計量し分離画分として含んだ。透明の上清はGilson322バイナリポンプシステム及びGilson156UV／vis マルチ波長検出器を用い、画分はUnipoint v3.1ソフトウエアで制御されたGilson204画分コレクターを用いて収穫した。無脂抽出物を、Phenomex Luna 5μ C18 １５０mm×２１．２mmの分取カラムを用い、１０％−９５％のアセトニトリル勾配を用いて20分間、毎分２５mlで流した。画分を１分間隔で採取し、ＨＰＬＣ検出器のUV/VISプロファイルを基準に９画分にプールした。画分を乾燥し重量を記録した。
【００４８】
ＬＣ‐ＭＳ解析
ＬＣ−ＭＳデータをＡｇｉｌｅｎｔ１１００SL ＬＣ−ＭＳＤを用いて得た。ＬＣはＡｑｕａC18 125A, 5μ，１５０×４．６mmのｉｄ ｃｏｌｕｍｎ（Phenomenex)で、カラム温度40℃に合わせた。移動相は、Ａ：ＭｉｌｌｉＱ水中の０．００５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；Ｂ：アセトニトリル中の０．００５％ＴＦＡからなり、以下の勾配及び流量を用いた（表６）。
【００４９】
【表６】
【００５０】
フォトダイオードアレイ検出器（PDA)を、２１０nm及び２８０nmを検出し、スペクトルデータ（１９０‐６００nm）を０ピーク幅＞０．１分でスキャンするようにセットした。
【００５１】
ＳＬ１１００シリーズマススペクトロメーター検出器（ＭＳＤ）をスキャンモード（１００−１３５０amu）で、以下の化学的イオン化を行った：イオン化電圧：１５０ｖ（＋veモード）；キャピラリー電圧：２０００ｖ；コロナ電流：８uA；乾燥ガス流量：５．０L／分；乾燥ガス温度：３５０℃；気化器温度：４００℃；噴霧器圧：６０psig. システムデータはAgilent Chemstationソフトウエアで制御した。
【００５２】
ＨＰＬＣによって作成した画分のＬＣ−ＭＳ解析は、上記条件を用いて以下のより急勾配の条件で解析した（表７）。
【００５３】
【表７】
【００５４】
脂質可溶性沈殿のＬＣ−ＭＳ解析は上記の系で行った。
しかしながら、溶媒系、カラム及び流量等は以下のように改変した。
【００５５】
カラムＡ：Luna Ｃ１８（２）５０×４．６mm３μカラム（Phenomenex）;
溶媒Ａ：メタノール
溶媒Ｂ：イソプロパノール
【００５６】
【表８】
【００５７】
脾臓Ｔ細胞アッセイ
脾臓をラットから単離しＴ細胞が豊富な画分(赤血球細胞なし)を密度勾配遠心分離によって調製した。
【００５８】
細胞調製物をＲＰＭＩ培地で細胞約１．２×１０6個／mlに希釈し、細胞約２．４×１０5個を96穴培養プレートの各ウェルに添加した（ハマナス及びイヌバラについてそれぞれ３ウエルずつ）。
【００５９】
試験される試料について培養の最初から試料を添加した。プレートは５％ＣＯ2／９５％ 空気において３７℃で７２時間培養した。培養はＭＴＴ溶液（５mg/ml）１５μｌを各ウェルに添加することによって終了し、２時間後に１００μlの１０％ドデシル硫酸ナトリウム／４５％ジメチルホルムアミドｐＨ４．７で溶解した。
【００６０】
５７０nmでの吸収を読む前にホルマザン結晶を３７℃オーバーナイトでインキュベートして溶解した。それぞれ３つずつのウエルの吸光度の平均値を決定しこの値を対照ウェルから得られた値と比較した。
【００６１】
結果
分離及び分画
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末から得られた画分ごとの収率を表９に示す。
【００６２】
【表９】
【００６３】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末のメタノール抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを図１及び図２に示す。また、ハマナス粉末及びイヌバラ粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを図３及び図４に示す。
【００６４】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末の無脂抽出物のＨＰＬＣ分画に基づいてそれぞれについて９つの画分を得た。それらを以下の表１０、表１１及び図５〜図８にまとめて示す（Ｆ１０は脂肪親和性残渣の画分である。）。
【００６５】
【表１０】
【００６６】
【表１１】
【００６７】
Ｔ細胞活性
ハマナス粉末およびイヌバラ粉末それぞれの抽出物のほぼすべての画分（無脂質）について、ラットＴ細胞増殖に対する効果を調べた。（ハマナス粉末抽出物の画分１及び画分３については、それらの特徴が画分２のものと同一であるので省略する。イヌバラの画分１は画分２と、画分３は画分４とそれぞれ特徴が同一であるので、同様に省略する）
表１２及び１３に結果を示す。（対照を１００％とする）
【００６８】
【表１２】
【００６９】
【表１３】
【００７０】
結果から明らかなように、ハマナス粉末抽出物は画分９を除くすべての画分が、もともとの増殖速度を明らかに刺激している。イヌバラ粉末抽出物については画分１〜５まで及び１０について増殖割合が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ハマナス粉末抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図２】イヌバラ粉末抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図３】ハマナス粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図４】イヌバラ粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図５】ハマナス粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図６】ハマナス粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ５〜Ｆ９）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図７】イヌバラ粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図８】イヌバラ粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図９】ハマナス粉末の油抽出物のビタミンＥ類似体を含む抽出画分のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。（縦軸は時間（分）を表す。横軸は吸光度（Ex＝290nm、Em＝320nm）を表す）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科植物の抽出物またはその画分を有効成分とする免疫細胞活性化剤、抗炎症剤等に関する。また、本発明は、バラ科植物の抽出物の画分にも関する。
【背景技術】
【０００２】
正常動物の免疫系は外来から侵入する多様な異物に応答し、生体から除去する一方、自己抗原に対しては反応を起こさない。免疫系は自己・非自己を識別するシステムであり、その特徴は、Ｔ、Ｂ細胞抗原受容体の多様性である。この多様性こそが多様な異物に対してきわめて特異的な認識を可能にしている。
【０００３】
しかしながら、免疫系は常に自己構成成分に対する免疫応答、自己免疫というリスクを負っている。異常免疫応答・過剰免疫応答の結果は自己免疫疾患、アレルギー等につながることになる。したがって、免疫応答の負の制御もまた、生体の恒常性維持には重要である。免疫系は、こうした自己免疫疾患やアレルギー等、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制するために、免疫応答における負の制御機構を備えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年の研究では、制御性Ｔ細胞が、この免疫応答における負の制御機構に深く関与し、自己反応性Ｔ細胞の活動を抑制することにより、免疫自己寛容を維持し、自己免疫疾患の発症を阻止していることが解明されており、さらに慢性感染症において病原微生物に対する免疫応答を抑制している可能性が示唆されている。（非特許文献１等参照）
【０００５】
したがって、免疫細胞を活性化することにより、異物を認識・排除する免疫応答を惹起しつつ、制御性Ｔ細胞をも活性化して自己免疫疾患につながる自己反応性Ｔ細胞の活動を抑制することができれば、異常免疫疾患の改善及び健康維持に役立つことが期待される。
【０００６】
一方、これら免疫細胞の活性化のためには、通常数週間から数ヶ月等の、ある程度の長期間を要することから、免疫細胞の活性化のために服用あるいは投与等するものは、副作用がないことが好ましく、天然の産物を食事として、あるいは補助食品として摂取することが望ましい。
【０００７】
従来、バラ科植物の抽出物における成分については、カロチノイドにカロテン（登録商標）、リコペン、クリプトキサンチン（登録商標）、ルビキサンチン、ゼアキサンチン及びルテインが含まれていることが知られているが（非特許文献２等参照）、免疫細胞に対する作用については詳細には調べられていない。
【０００８】
【非特許文献１】坂口志文著「免疫応答の負の制御」細胞工学Vol.21 No.11、2002年、p.1278−1279
【非特許文献２】Hodisan, T., Socaciu, C, Ropan, I, Neamtu, G. Carotenoid composition of Rosa canina fruits determined by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 16(3); 521-528; 1997.
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、鋭意検討した結果、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物に免疫細胞を活性化する能力があることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明は、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤、抗炎症剤及びリウマチ治療剤に関する。
【００１１】
また、本発明は、バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする抗アレルギー剤に関する。
【００１２】
本発明において、好ましいバラ科植物は、バラ亜科に属する植物、すなわちバラ属、シモツケソウ属、キイチゴ属、シロヤマブキ属、ヤマブキ属、ポテンティラ、オランダイチゴ属（イチゴ）、ダイコンソウ属、チョウノスケソウ属、コキンバイ属、キンミズヒキ属、ワレモコウ属、アカエナ属、アルケミラであり、さらに好ましくは、バラ属に属する植物であり、ナニワイバラ（Rosa laevigata）、モッコウバラ（Rosa.banksiae）、ノイバラ（Rosa multiflora）、ハマナス（Rosa rugosa）、ヤマイバラ（Rosa sambucina）、ロサ ポミフェラ（Rosa pomifera）、ロサ モスカータ（Rosa moschata）、イヌバラ（Rosa canina）等を挙げることができる。そして、これらの中で更に好ましくは、ハマナス及びイヌバラであり、最も好ましくはハマナスである。
【００１３】
本発明において、バラ科植物の果実及び／または種子は、好ましくは、乾燥させた果実及び／または種子であり、特に好ましくは、乾燥させた、粉末状態の果実または種子である。粉末とした場合は液体との接触面積が増加して成分が溶出しやすくなるからである。
【００１４】
本発明のバラ科植物の抽出物において、抽出に使用する溶媒としては、好ましくは水もしくは水蒸気または有機溶媒であり、これらを単独であるいは適当割合で混合して用いることができる。これらの水または有機溶媒は、常温または加熱した状態で、もしくは冷却した状態で用いることができる。有機溶媒としては、好ましくはエタノール、メタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ベンゼン等のフェノール類、ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン、スクワラン等の炭化水素類、を挙げることができる。有機溶媒として更に好ましいのは、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ヘキサンまたはフェノールであり、この中で更に好ましくはエタノールまたはメタノールであり、最も好ましくはメタノールである。なお、これらの抽出物は、溶媒である水もしくは水蒸気または有機溶媒を除去してその残留物のみを用いてもよい。
【００１５】
また、本発明のバラ科植物の抽出物において、抽出に使用する溶媒は、油であってもよく、本発明のバラ科植物の抽出物は、この油抽出物と上記水もしくは水蒸気または有機溶媒の抽出物を単独であるいは適当割合で混合して用いることができる。油抽出物における油は、経口摂取あるいは外用剤等の用途に応じて人体に安全な油を適宜用いることができ、天然及び合成の植物系若しくは動物系の油、例えば、ピーナッツ油、ヒマワリ種油、オリーブ油、トウモロコシ油、綿実油、紅花油、米ぬか油、アボカド油、アルモンド油、ゴマ油、サフラー油、大豆油、ナタネ油、パーシック油、パーム油、ヒマシ油、ヤシ油、馬油、ミンク油、卵黄脂肪油及び豚脂等を用いることができるが、好ましくはピーナッツ油、ヒマワリ種油、オリーブ油、トウモロコシ油、綿実油、紅花油、米ぬか油等の天然植物油を用いることができる。その他の植物油としては、レモングラス精油、ヒバ精油、ユーカリ精油、ラベンダー精油、ローズマリー精油、ヒノキ精油、サンダルウッド精油、カモミール精油、クラリセージ精油、グレープフルーツ精油、クローブ精油、サイプレス精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジュニパー精油、ゼラニウム精油、タイム精油、ティートリー精油、パイン精油、パチュリ精油、フェンネル精油、ペパーミント精油、マジョラム精油、メリッサ精油、ローズウッド精油、バジル精油、バテ精油、パルマローザ精油及びヒソップ精油があり、主に外用剤等の用途には、場合によりロウ類や被膜形成剤と共に、これらの１種またはそれ以上を使用することができる。
【００１６】
さらに、本発明のバラ科植物の抽出物は、ＨＰＬＣによって作成された画分であってもよい。この明細書において、画分はバラ科植物の果実及び／または種子の乾燥粉末をメタノールで抽出し、以下に述べる方法によって得られたものをいうが、含まれる成分が同等のものである限り、この方法によって得られる画分には限定されない。
【００１７】
画分の取得方法
バラ科植物の果実及び／または種子の乾燥粉末１ｇにメタノール１０mlを添加し１５分間音波処理してアリコートを抽出する。この混合物を３５００rpmで１０分間遠心分離して上清を除去し、窒素ガス流下で乾燥状態まで減量する。残渣をメタノール５mlで音波処理して再度抽出し、最初の抽出物と第二の抽出物を合わせる。
【００１８】
分画
残渣をＨＰＬＣ移動相（アセトニトリル：水＝５０：５０）に再溶解し、試料を遠心分離する。沈殿した不溶残渣を計量し分離画分とする。透明の上清については画分コレクターを用いて収穫する。無脂抽出物を分取カラムを用い、１０％−９５％のアセトニトリル勾配を用いて２０分間、毎分２５mlで流す。画分を１分間隔で採取し、ＨＰＬＣ検出器のＵＶ／ＶＩＳプロファイルを基準に９画分（沈殿を含めて１０画分）にプールする。以下に、ハマナス（表１）及びイヌバラ（表２）の場合についてそれぞれの画分及び含まれる化合物量及び含まれる成分の具体例を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
本発明において、バラ科植物の抽出物における好ましい画分は、Ｆ１〜Ｆ５及びＦ１０であり、さらに好ましくはＦ１〜Ｆ５であり、最も好ましくはＦ２、Ｆ４及びＦ５である。また、ハマナスにおける好ましい画分は、画分Ｆ１〜Ｆ８及びＦ１０であり、さらに好ましくは画分Ｆ２、Ｆ４〜Ｆ８及びＦ１０であり、さらに好ましくはＦ４〜Ｆ６であり、最も好ましくはＦ５である。また、イヌバラにおいて好ましい画分は画分Ｆ１〜Ｆ５及びＦ１０であり、さらに好ましくは画分Ｆ２、Ｆ４及びＦ５であり、最も好ましくはＦ２である。
【００２２】
また、油を溶媒とする抽出物について、ＨＰＬＣは、移動相をＡ＝水及びＢ＝エタノール／アセトニトリル＝３０／７０溶液とし、Ｂ％＝９５→１００（１０分で直線勾配）としてカラム温度４０℃で１．０ml／分の流量（注入量２０μｌ）にてＨＰＬＣ分析を行う。本発明のバラ科植物の抽出物における、油抽出物として特に好ましい画分は、ＨＰＬＣにおいてビタミンＥ（α−トコフェロール）溶出位置近傍に現れる、ビタミンＥ類似体を含む画分である（図９参照）。
【００２３】
本発明において、免疫細胞は、好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を含むリンパ球であり、さらに好ましくは、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞及び制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞であり、最も好ましくは制御性Ｔ細胞である。
【００２４】
本発明の免疫細胞活性化剤、抗炎症剤またはリウマチ治療剤等の各種の剤は、散剤、顆粒剤、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態であってよく、これらを経口的に用いることができる。また、他の形態としては、水またはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との溶液、または懸濁液剤等の注射用剤の形で経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に、あるいは単離した細胞に対して直接に、投与することができる。さらに他の形態としては、オイルパック剤等として経皮的に用いることも可能である。
【発明の効果】
【００２５】
以上述べたように、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子およびその抽出物またはその画分は免疫細胞を活性化する効果を有する。
【００２６】
さらに各種疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、反復性髄膜炎など）における異常リンパ球の、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物との培養による変化を観察したところ、培養７２時間後には低下していた制御性Ｔ細胞の数が正常値まで回復し、異常に亢進したＣＤ２６、また異常に低下したＣＤ２５及びＩＬ１０が正常状態に戻ったことが確認された（ＣＤ２６：異常に冗進したＣＤ２６発現Ｔ細胞の割合（培養24時間後で全Ｔ細胞の約４５％〜約５５％）が、培養72時間後には正常状態である約１５％〜約２５％に回復した（n=33）。；ＣＤ２５：ＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞の割合が、培養１２時間後で全Ｔ細胞の約２％〜約９％であったものが、７２時間後には約５％〜約３３％にまで増加した（n=33）、ＩＬ１０：ＩＬ１０発現Ｔ細胞の数が、培養２４時間後で全Ｔ細胞の約３％〜約１０％であったものが、７２時間後には約２０％〜約４５％にまで増加した（n=33））。さらに、過剰な活性酸素を低減し、細胞機能を活性化させる能力があることがわかった。
【００２７】
加えて、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及び反復性髄膜炎等の免疫異常疾患に対し、インビトロ及びインビボの両面で抗炎症及び免疫細胞の正常化の効果が認められている（リウマチ（６１歳患者）、移動性リウマチ、変形性リウマチ等で改善例少なくとも５例）。さらに、本発明の免疫活性化剤等を併用することにより、ステロイド剤や消炎鎮痛剤など副作用の強い薬剤の用量を減らすことができることが確認されている。
【００２８】
ここで、抗炎症活性やリウマチ治療効果と免疫細胞の活性化の関係について説明すると、免疫細胞が分裂促進物質により活性化される場合において、さらに免疫細胞の増殖率が刺激されることが観察される。この免疫系の活性化に対する刺激は、傷害や異物等の攻撃に対する通常の炎症性応答の一部として頻繁に観察されるものである。抗炎症活性の増強と免疫応答の増強は、多くの場合結びついて起こる。すなわち、免疫細胞の活性化は、抗炎症活性やリウマチ治療等の効果に直接結びつくものであるといえる。
【００２９】
さらに、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物は、上記の他、各種のアレルギー症状、すなわち、花粉症、喘息、アトピー、じんま疹等の症状を著しく軽減する効果があることがわかり、すなわち抗アレルギー剤としての効果も確認されている（アトピー：１４歳患者（腕部及び脚部）、３４歳患者（両手部）が改善した例の他、少なくとも４例；喘息：２歳、３歳、４２歳患者にて改善例少なくとも３件；花粉症：２４歳、２７歳及び４２歳患者にて改善例少なくとも３件）。また、加齢による動脈硬化はコレステロールのみならず血管の慢性炎症も原因として指摘されているが、本発明のバラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物の服用後に、血管の炎症指標の一つである高感度ＣＲＰを比較してみると、大幅に改善し、炎症が治まっていくことが確認された。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例を挙げてより具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
バラ科植物の材料
以下の実施例における材料としては、バラ科植物であるハマナス及びイヌバラの種子及び果実を乾燥・粉砕して得られた粉末を用いた。具体的には、ハマナス粉末としては、ワイルドローズフォルテTM（アメリカンバイオロジックスジャパン株式会社）を、イヌバラ粉末としてはHybena（Hybena Natural Products社（デンマーク））を用いた（以下それぞれ「ハマナス粉末」、及び「イヌバラ粉末」という。）ワイルドローズフォルテTMは、デンマークユトランド半島最北端にあるウッレ薔薇園で採取されたハマナスの実から作られている。
【００３２】
実施例１ バラ科植物の種子及び果実の抗炎症・リウマチ治療作用の検証
材料及び方法
バラ科植物の種子及び果実の抗炎症作用を調べるため、アジュバント誘発性関節炎モデルを用いた。メスのラット（Dark Agouti）の尾付け根部分にMycobacterium tuberculosisを含むフロイント完全アジュバントを皮内注射することにより、疾病を誘発した(Zhang, Lee et al, J. Immunol., vol.145 (1990) , pp2489-2493)。
【００３３】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末の効果を調べるため２群のラットを準備した。各群は６匹のメスのラット（Dark Agouti、実験開始時に生後７〜８週）からなる。
【００３４】
ラットの餌にハマナス粉末及びイヌバラ粉末をそれぞれ餌に対して２．４mg/gの割合で添加した。食餌補給開始２週間後に足容積測定装置にて後ろ足及び足首の容積変化を測定した。続いて、Zhang et al. の方法(Thompson & Staines Clinical and Experimental Immunology, vol.64(1986), pp.581-586; Zhang, Lee et al. (1990))に基づいてフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）をそれぞれのラットに注射した。ＣＦＡ中のMycobacterium tuberculosis成分は７．５mg/mlの濃度で懸濁させ、それぞれの動物の尾付け根部分に皮内投与（２×１００μl）した。
【００３５】
無処理対照群及び陽性対照群も設定した。陽性対照群には、Meloxicamを水に溶解し、毎日０．１２mg/kg体重の用量で経口にて強制投与した。この投与はアジュバントを注射し始めたのと同じ日に開始した。
【００３６】
消費された餌及び水の量を毎日測定した。それぞれの個体について受け入れられた用量を計算した。それぞれのラットを実験開始からＣＦＡ注射後１２日まで毎週計量した。ＣＦＡ投与後１３日目からそれぞれの後ろ足及び足首の容積を測定し、腫れを計算した。これを１８日目まで毎日繰り返した。各群の腫れの平均を計算し、無処理対照群と比較した。統計的有意性は、スチューデントのｔ−検定（有意水準５％）で決定した。
【００３７】
結果
食餌消費
ラットの異なる集団による1日の平均食餌消費量を表３に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
種々の集団において、食餌への添加は食餌消費量には悪影響を及ぼさなかったことが明らかになった。１日食餌消費量は無処理対照群に対して約５．５％（ハマナス）及び５％（イヌバラ)の減少量であった。
【００４０】
添加物の１日消費量を表４に示した。
【表４】
実験集団の消費量と用量には有意な差は見られなかった。
【００４１】
体重変化
炎症状態が形成されるにつれ、対照、ハマナス粉末、イヌバラ粉末、Meloxicamの全ての処理群の動物が体重を減らしたが、各群での相違はほとんどなかった。具体的には、イヌバラ粉末添加の集団と対照集団の差異はなく、両者とも１７．４％の体重減少がみられ、Meloxicam投与群では１８％、ハマナス粉末添加を受けた集団については１９．０％の体重減少が見られた。
【００４２】
フットスコア
炎症は米国リウマチ協会スコアリングシステム（The American Rheumatism Association scoring system (Cremer et al., J Molec. Med, 76(1998): 275-288）に従って時間点数（time points）でスコアリングした（表５）。
【００４３】
【表５】
【００４４】
この表からわかるように、Meloxicamで処理した動物は最も低い値を示し、抗炎症効果が最も高い。ハマナス粉末においては炎症を１７％低減している。イヌバラについては、２．５％の低減が見られた。
【００４５】
食餌の消費量は、全ての集団が同じような値であった。したがって、集団の比較においては添加した粉末の消費量も同様である。したがって、ハマナス及びイヌバラの用量はほぼ同じことになる。
【００４６】
実施例２ Ｔ細胞活性化効果の検証
抽出
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末にそれぞれメタノール１０mlを添加し１５分間音波処理して成分を抽出した。この抽出物を３５００rpmで１０分間遠心分離して上清を除去し、窒素ガス流下で乾燥状態まで減量した。残渣をメタノール５mlで音波処理して再度抽出し、最初の抽出物と第二の抽出物を合わせた。
【００４７】
分画
抽出された残渣をHPLC移動相（アセトニトリル：水＝５０：５０）に再溶解し、試料を遠心分離した。沈殿した不溶残渣を計量し分離画分として含んだ。透明の上清はGilson322バイナリポンプシステム及びGilson156UV／vis マルチ波長検出器を用い、画分はUnipoint v3.1ソフトウエアで制御されたGilson204画分コレクターを用いて収穫した。無脂抽出物を、Phenomex Luna 5μ C18 １５０mm×２１．２mmの分取カラムを用い、１０％−９５％のアセトニトリル勾配を用いて20分間、毎分２５mlで流した。画分を１分間隔で採取し、ＨＰＬＣ検出器のUV/VISプロファイルを基準に９画分にプールした。画分を乾燥し重量を記録した。
【００４８】
ＬＣ‐ＭＳ解析
ＬＣ−ＭＳデータをＡｇｉｌｅｎｔ１１００SL ＬＣ−ＭＳＤを用いて得た。ＬＣはＡｑｕａC18 125A, 5μ，１５０×４．６mmのｉｄ ｃｏｌｕｍｎ（Phenomenex)で、カラム温度40℃に合わせた。移動相は、Ａ：ＭｉｌｌｉＱ水中の０．００５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；Ｂ：アセトニトリル中の０．００５％ＴＦＡからなり、以下の勾配及び流量を用いた（表６）。
【００４９】
【表６】
【００５０】
フォトダイオードアレイ検出器（PDA)を、２１０nm及び２８０nmを検出し、スペクトルデータ（１９０‐６００nm）を０ピーク幅＞０．１分でスキャンするようにセットした。
【００５１】
ＳＬ１１００シリーズマススペクトロメーター検出器（ＭＳＤ）をスキャンモード（１００−１３５０amu）で、以下の化学的イオン化を行った：イオン化電圧：１５０ｖ（＋veモード）；キャピラリー電圧：２０００ｖ；コロナ電流：８uA；乾燥ガス流量：５．０L／分；乾燥ガス温度：３５０℃；気化器温度：４００℃；噴霧器圧：６０psig. システムデータはAgilent Chemstationソフトウエアで制御した。
【００５２】
ＨＰＬＣによって作成した画分のＬＣ−ＭＳ解析は、上記条件を用いて以下のより急勾配の条件で解析した（表７）。
【００５３】
【表７】
【００５４】
脂質可溶性沈殿のＬＣ−ＭＳ解析は上記の系で行った。
しかしながら、溶媒系、カラム及び流量等は以下のように改変した。
【００５５】
カラムＡ：Luna Ｃ１８（２）５０×４．６mm３μカラム（Phenomenex）;
溶媒Ａ：メタノール
溶媒Ｂ：イソプロパノール
【００５６】
【表８】
【００５７】
脾臓Ｔ細胞アッセイ
脾臓をラットから単離しＴ細胞が豊富な画分(赤血球細胞なし)を密度勾配遠心分離によって調製した。
【００５８】
細胞調製物をＲＰＭＩ培地で細胞約１．２×１０6個／mlに希釈し、細胞約２．４×１０5個を96穴培養プレートの各ウェルに添加した（ハマナス及びイヌバラについてそれぞれ３ウエルずつ）。
【００５９】
試験される試料について培養の最初から試料を添加した。プレートは５％ＣＯ2／９５％ 空気において３７℃で７２時間培養した。培養はＭＴＴ溶液（５mg/ml）１５μｌを各ウェルに添加することによって終了し、２時間後に１００μlの１０％ドデシル硫酸ナトリウム／４５％ジメチルホルムアミドｐＨ４．７で溶解した。
【００６０】
５７０nmでの吸収を読む前にホルマザン結晶を３７℃オーバーナイトでインキュベートして溶解した。それぞれ３つずつのウエルの吸光度の平均値を決定しこの値を対照ウェルから得られた値と比較した。
【００６１】
結果
分離及び分画
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末から得られた画分ごとの収率を表９に示す。
【００６２】
【表９】
【００６３】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末のメタノール抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを図１及び図２に示す。また、ハマナス粉末及びイヌバラ粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを図３及び図４に示す。
【００６４】
ハマナス粉末及びイヌバラ粉末の無脂抽出物のＨＰＬＣ分画に基づいてそれぞれについて９つの画分を得た。それらを以下の表１０、表１１及び図５〜図８にまとめて示す（Ｆ１０は脂肪親和性残渣の画分である。）。
【００６５】
【表１０】
【００６６】
【表１１】
【００６７】
Ｔ細胞活性
ハマナス粉末およびイヌバラ粉末それぞれの抽出物のほぼすべての画分（無脂質）について、ラットＴ細胞増殖に対する効果を調べた。（ハマナス粉末抽出物の画分１及び画分３については、それらの特徴が画分２のものと同一であるので省略する。イヌバラの画分１は画分２と、画分３は画分４とそれぞれ特徴が同一であるので、同様に省略する）
表１２及び１３に結果を示す。（対照を１００％とする）
【００６８】
【表１２】
【００６９】
【表１３】
【００７０】
結果から明らかなように、ハマナス粉末抽出物は画分９を除くすべての画分が、もともとの増殖速度を明らかに刺激している。イヌバラ粉末抽出物については画分１〜５まで及び１０について増殖割合が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ハマナス粉末抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図２】イヌバラ粉末抽出物についてのＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図３】ハマナス粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図４】イヌバラ粉末抽出物の脂肪親和性残渣のＬＣ−ＭＳプロファイルを表した図である。（上段は２１０nmにおける吸光度、下段は分子量を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図５】ハマナス粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図６】ハマナス粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ５〜Ｆ９）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図７】イヌバラ粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図８】イヌバラ粉末抽出物の各画分の蓄積ＬＣ−ＭＳプロファイルデータ（Ｆ１〜Ｆ５）を表した図である。（縦軸は２１０nmにおける吸光度を表す。横軸は時間（分）を表す。）
【図９】ハマナス粉末の油抽出物のビタミンＥ類似体を含む抽出画分のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。（縦軸は時間（分）を表す。横軸は吸光度（Ex＝290nm、Em＝320nm）を表す）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤。
【請求項２】
バラ科植物がバラ科バラ属の植物である、請求項１記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項３】
バラ科植物がハマナス（Rosa Rugosa)である、請求項１又は２記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項４】
バラ科植物がイヌバラ（Rosa canina）である、請求項１又は２記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項５】
バラ科植物の抽出物が、画分Ｆ１〜Ｆ５及び画分Ｆ１０の一つ又はこれらの組合わせである、請求項１〜４のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項６】
バラ科植物の抽出物が、画分Ｆ１〜Ｆ８及び画分Ｆ１０の一つ又はこれらの組合わせである、請求項１〜３のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項７】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項８】
免疫細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項７記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項９】
ハマナスの抽出物の画分Ｆ１〜Ｆ８及びＦ１０の一つ又はこれらの組合わせ。
【請求項１０】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項１１】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とするリウマチ治療剤。
【請求項１】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする免疫細胞活性化剤。
【請求項２】
バラ科植物がバラ科バラ属の植物である、請求項１記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項３】
バラ科植物がハマナス（Rosa Rugosa)である、請求項１又は２記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項４】
バラ科植物がイヌバラ（Rosa canina）である、請求項１又は２記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項５】
バラ科植物の抽出物が、画分Ｆ１〜Ｆ５及び画分Ｆ１０の一つ又はこれらの組合わせである、請求項１〜４のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項６】
バラ科植物の抽出物が、画分Ｆ１〜Ｆ８及び画分Ｆ１０の一つ又はこれらの組合わせである、請求項１〜３のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項７】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか1項記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項８】
免疫細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項７記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項９】
ハマナスの抽出物の画分Ｆ１〜Ｆ８及びＦ１０の一つ又はこれらの組合わせ。
【請求項１０】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項１１】
バラ科植物の果実及び／又は種子またはそれらの抽出物を有効成分とするリウマチ治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−３１６０２６（Ｐ２００６−３１６０２６Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４２８４２（Ｐ２００５−１４２８４２）
【出願日】平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【出願人】（５０１２５４３３５）アメリカンバイオロジックスジャパン株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【出願人】（５０１２５４３３５）アメリカンバイオロジックスジャパン株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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