パラコッカス属細菌を用いた水酸基含有芳香族化合物の製造方法
【課題】
好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得る方法を提供することである。
【解決手段】
好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含むことを特徴とする水酸基含有芳香族化合物の製造方法を用いる。水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得る方法を提供することである。
【解決手段】
好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含むことを特徴とする水酸基含有芳香族化合物の製造方法を用いる。水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパラコッカス属細菌を用いた水酸基含有芳香族化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物によるリグニンの分解技術として、単離したリグニン分解菌により嫌気的条件下でリグニンを分解することを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１８５９０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の微生物によるリグニンの分解技術では、嫌気性条件下で培養するため、微生物の増殖速度が低く、リグニンの分解速度も遅いという問題があり、さらに、嫌気性の微生物を用いるため、微生物のハンドリングが容易ではないという問題がある。
本発明の目的は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法の特徴は、好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含む点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得ることができる。
得られる有機化合物には水酸基含有芳香族化合物を含み、これらは化粧品、医薬品、食品添加物、建材等の原料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図２】実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の分子量測定結果、実施例４（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（４）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図３】実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の経日的に測定した濁度、実施例４（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（４）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図４】実施例５（培養ｐＨ８．９、培養温度２４℃）で得た培養液（５）の分子量測定結果、実施例６（培養ｐＨ８．９、培養温度３０℃）で得た培養液（６）の分子量測定結果、実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図５】実施例５（培養ｐＨ８．９、培養温度２４℃）で得た培養液（５）の経日的に測定した濁度、実施例６（培養ｐＨ８．９、培養温度３０℃）で得た培養液（６）の経日的に測定した濁度、実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図６】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及び実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の分子量測定結果を示すチャートである。
【図７】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の経日的に測定した濁度、実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図８】実施例７（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（７）〜（９）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図９】実施例７（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（７）〜（９）の分子量測定結果に関して、ピークの分子量と培地量との関係を表すグラフである。
【図１０】実施例８（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（１０）〜（１３）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図１１】実施例８（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（１０）〜（１３）の分子量測定結果に関して、ピークの分子量と培養液（ＰＣ）の接種量との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
リグニンは、セルロース及びヘミセルロース等と共に木材等の主な成分の一つとして存在し、植物が合成するフェニルプロパノイド（リグノイド）が高度に重合した三次元網目構造を持つ高分子であるが、その化学構造は複雑であるため、必ずしも明らかにされていない。
【０００９】
リグニンは、木材チップからパルプを製造するための蒸解・洗浄工程（主にクラフトパルプ製造工程）で発生する黒液から主に回収され、国内外の製紙会社｛たとえば、日本製紙ケミカル株式会社、リグノブースト社（スウェーデン）等｝等から供給されている。
【００１０】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法において、リグニンとしては、国内外の製紙会社や試薬会社｛たとえば、東京化成工業株式会社等｝等から供給される黒液や粉末状にしたリグニン等が使用できる。
【００１１】
培地は、リグニンを含有し、好気性条件下で、パラコッカス属細菌を培養できるものであれば、天然培地でも合成培地でもよく、また、固体培地、液体培地のいずれでもよい。培地には、炭素源、窒素源及び無機物等が含まれる。炭素源としては、リグニン以外に、炭水化物（グルコース等）等を追加してもよい。窒素源としては、有機窒素（酵母エキス、肉エキス、ペプトン及び各種アミノ酸等）及び無機窒素（硝酸アンモニウム及び硫酸アンモニウム等）等が挙げられる。窒素源、炭素源は、いずれも単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物として、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等が含有できる。基本培地として、リグニン含有ＬＢ培地及びリグニン含有ＭＳＭ培地が好ましく、さらに好ましくはリグニン含有ＭＳＭ培地である。
【００１２】
培地には、リグニンの他に、硫酸アンモニウムを含有することが好ましい。
また、培地には、リグニンの他に、グリセリンを含有することが好ましく、さらに好ましくは硫酸アンモニウム及びグリセリンを含有することである。
【００１３】
パラコッカス属細菌としては、好気性条件下でリグニンを含有する培地内でを培養できれば制限なく使用でき、土壌や生物学的排水処理施設からの活性汚泥等から容易に単離できる。このようなパラコッカス属細菌は、リグニンを含有する培地を使用してスクリーニング（集積培養）することにより単離することができ、たとえば、活性汚泥に黒液をリグニン濃度が３００ｍｇ／Ｌから３０００ｍｇ／Ｌになるまで徐々に加えながら、約１ヶ月間集積培養を行った後、ＭＳＭ培地に５００ｍｇ／Ｌのリグニン及び５０ｍｇ／Ｌの低分子リグニン芳香族化合物（バニリン、グアイヤコール、ケイヒ酸、シリンガ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸）を加えた選択固体培地に塗布して、３０℃で１０日間培養し、コロニーを形成したものを単離することにより得ることができる。単離した菌は、再び、選択固体培地に塗布・培養することによりコンタミネーションがないことを確認できる。
【００１４】
単離した菌がパラコッカス属細菌であることは、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子全長をターゲットとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０）により塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ検索により相同性検索を行うことにより同定できる。
【００１５】
培養方法としては、通常の微生物の培養方法と同様の方法でよく、培養ｐＨは５〜１０が好ましく、さらに好ましくは６〜９、特に好ましくは７〜９である。また、培養温度は２０〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは２４〜３０℃、特に好ましくは２４〜２７℃である。また、好気条件下であれば、振盪培養又は通気攪拌培養等のいずれでもよい。また、培養日数は、リグニン濃度、培養温度等によって適宜決定できるが、２〜１４日間が好ましく、さらに好ましくは３〜１０日間、特に好ましくは３〜７日間である。
【００１６】
リグニンを分解して得られる水酸基含有芳香族化合物としては、サリチル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテキュ酸）、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。これらのうち、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００１７】
従来、リグニンを分解する微生物として、担子菌（白色腐朽菌、落葉分解菌）が知られているが、これは、リグニンを完全に分解して二酸化炭素にまでしてしまうため、有用な有機化合物を得ることが困難である。一方、本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法によれば、通常の培養方法であれば、多少培養期間を長くしても有用な有機化合物（水酸基含有芳香族化合物）を十分に得ることができる。
【００１８】
水酸基含有芳香族化合物のうち、サリチル酸は解熱・鎮痛作用の他、抗リウマチ作用や尿結石生成防止作用等（アスピリンと同様の作用）を有する。また、サリチル酸の誘導体であるパラアミノサリチル酸は結核の治療薬として使用できる。また、バニリンは香料（天然物はバニラビーンズから単離されるため高価である）として使用できる。また、２，３−ジヒドロキシ安息香酸は感光用現像剤の添加物として使用できるほか、２，３−ジヒドキシ安息香酸を含有するウンカリア・トメントーサ樹皮抽出物にアルツハイマー病のアミロイド阻害作用があることが知られている。また、バニリン酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、３，４−ジヒドロキシ安息香酸は抗酸価機能活性を持ち、エステル体は食品添加物として利用できる。また、シリンガ酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、シリンガアルデヒドは抗アレルギー成分や食品添加物等への利用が期待される。
【実施例】
【００１９】
以下、特記しない限り、％は重量％を意味する。
＜リグニン含有培地を用いた集積培養によるパラコッカス属細菌の単離＞
イビデン株式会社の生物処理施設から採取した活性汚泥分散液（固形分濃度４０００ｍｇ／Ｌ）２７ｍＬに、黒液（広葉樹、固形分濃度７５ｇ／Ｌ；以下同じ）をリグニン濃度が３００ｍｇ／Ｌから３０００ｍｇ／Ｌとなるまで徐々に添加しながら、約１ヶ月間集積培養した。
ついで、黒液（酸不溶性リグニン）を５００ｍｇ／Ｌとなるように、低分子リグニン芳香族化合物（バニリン、グアイヤコール、ケイヒ酸、シリンガ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸）を最終濃度５０ｍｇ／Ｌとなるように、それぞれＭＳＭ培地に加えて選択固体培地を調製し、これに、集積培養して得た微生物を塗布し、３０℃にて１０日間培養して、コロニーを形成したものをリグニン分解菌として単離した。単離した菌を再び選択固体培地塗布してコンタミネーションがないことを確認した。
なお、固形分濃度は１０５℃で加熱乾燥して恒量値を求め、加熱前後の重量から算出した。
【００２０】
単離したリグニン分解菌は、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子全長をターゲットとしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザ）により塩基配列を決定した（塩基配列１）。そして、この塩基配列をアポロンＤＢ−ＢＡ ＢＬＡＳＴ及び国際塩基配列データベースＢＬＡＳＴで相同性検索したところ、パラコッカス属細菌であることを同定した｛Paracoccus versutus（ATCC25364株、アクセッション番号AY014174）に対して相同率９９．７％であった。｝。
【００２１】
単離したリグニン分解菌をＬＢ寒天培地で、３０℃、４８時間培養して、形態観察したところ、運動性を持たないグラム陰性の短桿菌（０．８〜０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ）で、ＬＢ寒天平板状でのコロニー色は黄色を呈し（コロニー直径２．０〜３．０ｍｍ）、グルコールを酸化せず、カラターゼ反応及びオキシターゼ反応は共に陽性を示した。また、育成温度試験では、３７℃で陽性、４５℃で陰性を示し、嫌気性条件下では育成せず、メタノール、エタノール、グリセリン及びガラクトースを資化し、ラクトースを資化しなかった。また、硝酸塩を還元せず、グルコースやＤ−マンノース等を資化せず、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール及びグルコン酸カリウム等を資化した。
【００２２】
単離したリグニン分解菌をＬＢ液体培地に接種し、２７℃で１日振盪培養して、サチュレートした培養液（ＰＣ）を得た。
【００２３】
＜実施例１＞
５００ｍｌバッフル付き三角フラスコに入ったＭＳＭ培地２５０ｍｌに、リグニン（品名：アルカリリグニン、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を５００ｍｇ／Ｌとなるように加え、さらに、グリセリンを１０ｍｌ／Ｌ、硫酸アンモニウムを２ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ加えたリグニン含有ＭＳＭ培地を調製し、このリグニン含有ＭＳＭ培地に、上記の培養液（ＰＣ）が１体積％となるように接種して、培養温度２７℃、培養ｐＨ８．９で、７日間振盪培養して、培養液（１）を得た。
なお、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００２４】
その後、培養液（１）を０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．４に調整した後、遠心分離（１万Ｇ、１０分間）して固形物を取り除き、さらに０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過した濾液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム、溶離液：０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、検出器：ＵＶ２８０ｎｍ）により、分子量を測定した結果を図１に示した（ピークの分子量：１４９４）。
また、リグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）についても、分子量の測定結果を図１に併せて示す（ピークの分子量：６７５２）。
【００２５】
培養液（１）を６Ｎ塩酸にてｐＨ１〜２に調整した後、酢酸エチルで抽出した抽出液を蒸発乾固してから、トリメチルシリル化して、ＧＣ−ＭＳ分析（ＳＨＩＭＡＺＵ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０、カラム：ＤＢ−１、Φ０．３２、長さ３０ｍ）したところ、サリチル酸（０．９１４→２．３３３ｍｇ／Ｌ）、バニリン（０．７５０→１．８０５ｍｇ／Ｌ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（１．００５→２．７７７ｍｇ／Ｌ）、バニリン酸（１．０６７→３．１９４ｍｇ／Ｌ）の含有量が増加することを確認した｛カッコ内の数字は培養前の培地中の濃度→培養後の培地中の濃度を表す｝。これにより、リグニンを分解して、水酸基含有芳香族化合物が得られたことを確認した。
【００２６】
また、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、酸が生じたと考えられることは、上記のＧＣ−ＭＳ分析結果からも裏付けられる。
【００２７】
＜実施例２＞
「リグニン（品名：アルカリリグニン、シグマアルドリッチ社製）」を「黒液に７２％硫酸を加えてｐＨ３．０に調整し、リグニンを沈殿させ、１２００Ｇ（重力の１２００倍）で１０分間遠心分離した後、上澄み液を捨てて得た沈殿物を少量の蒸留水に懸濁させＧＳ−２５ガラスフィルターで濾過し、乾燥して得たリグニン」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（２）を得た。そして、培養液（２）について、実施例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳ分析したところ、水酸基含有芳香族化合物（サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル）の存在を確認した。
なお、リグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）について、同様にＧＣ−ＭＳ分析したところ、水酸基含有芳香族化合物は検出できなかった。これにより、リグニンを分解して、水酸基含有芳香族化合物が得られたことを確認した。
【００２８】
＜実施例３＞
「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（３）を得た。そして、培養液（３）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：１５５７）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：５１６９）と共に図２に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００２９】
＜実施例４＞
「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（４）を得た。そして、培養液（４）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：２０３５）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：５１６９）と共に図２に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは６．５であった。
【００３０】
実施例３及び４の結果から、ｐＨ７．６の場合、培養温度が３０℃よりも２７℃の方が低分子化が進行することがわかった。
【００３１】
実施例３及び４において、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、共に酸が生じたと考えられる。また、培養温度が３０℃よりも２７℃の方がよりｐＨが低いことから、培養温度が３０℃よりも２７℃の方がより酸の生成量が多いと考えられる。
【００３２】
実施例３及び４において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図３に示した。これらの結果から、ｐＨ７．６の場合、培養温度が３０℃よりも２７℃の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００３３】
＜実施例５＞
「培養温度２７℃」を「培養温度２４℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（５）を得た。そして、培養液（５）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：１６６１）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：６７５２）及び実施例１のデータ（培養温度２７℃、ピークの分子量：１４９４）と共に図４に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００３４】
＜実施例６＞
「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（６）を得た。そして、培養液（６）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：３１３４）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：６７５２）及び実施例１のデータ（培養温度２７℃、ピークの分子量：１４９４）と共に図４に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは６．１であった。
【００３５】
実施例１、５及び６の結果から、ｐＨ８．９の場合、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方が低分子化が進行することがわかった。
【００３６】
実施例１、５及び６において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図５に示した。これらの結果から、ｐＨ８．９の場合、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００３７】
実施例１、５及び６において、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、共に酸が生じたと考えられる。また、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方がよりｐＨが低いことから、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方がより酸の生成量が多いと考えられる。
【００３８】
実施例１（ピークの分子量：１４９４）及び実施例３（ピークの分子量：１５５７）の結果（図６）から、培養温度２７℃の場合、培養ｐＨが相違しても、低分子化の進行に余り影響がしないことがわかった。
【００３９】
実施例１及び３において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図７に示した。これらの結果から、培養温度２７℃の場合、培養ｐＨが７．６よりも８．９の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００４０】
実施例１及び３において、培養後のｐＨに差異が認められないため（共に、５．２）、培養ｐＨが相違しても、酸の生成量に余り影響がしないことがわかった。
【００４１】
＜実施例７＞
「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」を「ＭＳＭ培地５０ｍｌ」、「ＭＳＭ培地１００ｍｌ」又は「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」に変更したこと、「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」を「培養液（ＰＣ）の接種した量１０体積％」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（７）〜（９）を得た。そして、培養液（７）〜（９）について、実施例１と同様にして分子量を測定し、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータと共に図８に示した。
【００４２】
ピークの分子量は、下表の通りであった。ＭＳＭ培地の量とピークの分子量との間には高い相関が認められた（相関関数０．９９７７、図９）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
これらの結果から、ＭＳＭ培地の量が多いほど、低分子化が進行することがわかった。
【００４５】
＜実施例８＞
「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」を「ＭＳＭ培地１００ｍｌ」に変更したこと、「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」を「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」、「培養液（ＰＣ）の接種した量５体積％」、「培養液（ＰＣ）の接種した量１０体積％」又は「培養液（ＰＣ）の接種した量２０体積％」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（１０）〜（１３）を得た。そして、培養液（１０）〜（１３）について、実施例１と同様にして分子量を測定し、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータと共に図９に示した。
【００４６】
ピークの分子量は、下表の通りであった。これらの関係を図１１に示した。
【表２】
【００４７】
これらの結果から、培養液（ＰＣ）の接種した量が５〜２０体積％の場合、培養後の分子量に大きな差異は認められず、１体積％のとき、より低分子化が進行することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得ることができる。好気性条件下で培養できるため、嫌気性条件下での培養に比べて、微生物の増殖速度が格段に早く、リグニンの分解をより促進することができる。そして、得られる有機化合物には水酸基含有芳香族化合物を含み、これらは化粧品、医薬品、食品添加物、建材等の原料として利用できる。
【００４９】
水酸基含有芳香族化合物のうち、サリチル酸は解熱・鎮痛作用の他、抗リウマチ作用や尿結石生成防止作用等（アスピリンと同様の作用）を有する。また、サリチル酸の誘導体であるパラアミノサリチル酸は結核の治療薬として使用できる。また、バニリンは香料（天然物はバニラビーンズから単離されるため高価である）として使用できる。また、２，３−ジヒドロキシ安息香酸は感光用現像剤の添加物として使用できるほか、２，３−ジヒドキシ安息香酸を含有するウンカリア・トメントーサ樹皮抽出物にアルツハイマー病のアミロイド阻害作用があることが知られている。また、バニリン酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、３，４−ジヒドロキシ安息香酸は抗酸価機能活性を持ち、エステル体は食品添加物として利用できる。また、シリンガ酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、シリンガアルデヒドは抗アレルギー成分や食品添加物等への利用が期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明はパラコッカス属細菌を用いた水酸基含有芳香族化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物によるリグニンの分解技術として、単離したリグニン分解菌により嫌気的条件下でリグニンを分解することを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１８５９０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の微生物によるリグニンの分解技術では、嫌気性条件下で培養するため、微生物の増殖速度が低く、リグニンの分解速度も遅いという問題があり、さらに、嫌気性の微生物を用いるため、微生物のハンドリングが容易ではないという問題がある。
本発明の目的は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法の特徴は、好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含む点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得ることができる。
得られる有機化合物には水酸基含有芳香族化合物を含み、これらは化粧品、医薬品、食品添加物、建材等の原料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図２】実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の分子量測定結果、実施例４（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（４）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図３】実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の経日的に測定した濁度、実施例４（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（４）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図４】実施例５（培養ｐＨ８．９、培養温度２４℃）で得た培養液（５）の分子量測定結果、実施例６（培養ｐＨ８．９、培養温度３０℃）で得た培養液（６）の分子量測定結果、実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図５】実施例５（培養ｐＨ８．９、培養温度２４℃）で得た培養液（５）の経日的に測定した濁度、実施例６（培養ｐＨ８．９、培養温度３０℃）で得た培養液（６）の経日的に測定した濁度、実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図６】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の分子量測定結果及び実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の分子量測定結果を示すチャートである。
【図７】実施例１（培養ｐＨ８．９、培養温度２７℃）で得た培養液（１）の経日的に測定した濁度、実施例３（培養ｐＨ７．６、培養温度２７℃）で得た培養液（３）の経日的に測定した濁度及びブランクの濁度を示すグラフである。
【図８】実施例７（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（７）〜（９）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図９】実施例７（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（７）〜（９）の分子量測定結果に関して、ピークの分子量と培地量との関係を表すグラフである。
【図１０】実施例８（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（１０）〜（１３）の分子量測定結果及びブランクの分子量測定結果を示すチャートである。
【図１１】実施例８（培養ｐＨ７．６、培養温度３０℃）で得た培養液（１０）〜（１３）の分子量測定結果に関して、ピークの分子量と培養液（ＰＣ）の接種量との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
リグニンは、セルロース及びヘミセルロース等と共に木材等の主な成分の一つとして存在し、植物が合成するフェニルプロパノイド（リグノイド）が高度に重合した三次元網目構造を持つ高分子であるが、その化学構造は複雑であるため、必ずしも明らかにされていない。
【０００９】
リグニンは、木材チップからパルプを製造するための蒸解・洗浄工程（主にクラフトパルプ製造工程）で発生する黒液から主に回収され、国内外の製紙会社｛たとえば、日本製紙ケミカル株式会社、リグノブースト社（スウェーデン）等｝等から供給されている。
【００１０】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法において、リグニンとしては、国内外の製紙会社や試薬会社｛たとえば、東京化成工業株式会社等｝等から供給される黒液や粉末状にしたリグニン等が使用できる。
【００１１】
培地は、リグニンを含有し、好気性条件下で、パラコッカス属細菌を培養できるものであれば、天然培地でも合成培地でもよく、また、固体培地、液体培地のいずれでもよい。培地には、炭素源、窒素源及び無機物等が含まれる。炭素源としては、リグニン以外に、炭水化物（グルコース等）等を追加してもよい。窒素源としては、有機窒素（酵母エキス、肉エキス、ペプトン及び各種アミノ酸等）及び無機窒素（硝酸アンモニウム及び硫酸アンモニウム等）等が挙げられる。窒素源、炭素源は、いずれも単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物として、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等が含有できる。基本培地として、リグニン含有ＬＢ培地及びリグニン含有ＭＳＭ培地が好ましく、さらに好ましくはリグニン含有ＭＳＭ培地である。
【００１２】
培地には、リグニンの他に、硫酸アンモニウムを含有することが好ましい。
また、培地には、リグニンの他に、グリセリンを含有することが好ましく、さらに好ましくは硫酸アンモニウム及びグリセリンを含有することである。
【００１３】
パラコッカス属細菌としては、好気性条件下でリグニンを含有する培地内でを培養できれば制限なく使用でき、土壌や生物学的排水処理施設からの活性汚泥等から容易に単離できる。このようなパラコッカス属細菌は、リグニンを含有する培地を使用してスクリーニング（集積培養）することにより単離することができ、たとえば、活性汚泥に黒液をリグニン濃度が３００ｍｇ／Ｌから３０００ｍｇ／Ｌになるまで徐々に加えながら、約１ヶ月間集積培養を行った後、ＭＳＭ培地に５００ｍｇ／Ｌのリグニン及び５０ｍｇ／Ｌの低分子リグニン芳香族化合物（バニリン、グアイヤコール、ケイヒ酸、シリンガ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸）を加えた選択固体培地に塗布して、３０℃で１０日間培養し、コロニーを形成したものを単離することにより得ることができる。単離した菌は、再び、選択固体培地に塗布・培養することによりコンタミネーションがないことを確認できる。
【００１４】
単離した菌がパラコッカス属細菌であることは、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子全長をターゲットとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０）により塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ検索により相同性検索を行うことにより同定できる。
【００１５】
培養方法としては、通常の微生物の培養方法と同様の方法でよく、培養ｐＨは５〜１０が好ましく、さらに好ましくは６〜９、特に好ましくは７〜９である。また、培養温度は２０〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは２４〜３０℃、特に好ましくは２４〜２７℃である。また、好気条件下であれば、振盪培養又は通気攪拌培養等のいずれでもよい。また、培養日数は、リグニン濃度、培養温度等によって適宜決定できるが、２〜１４日間が好ましく、さらに好ましくは３〜１０日間、特に好ましくは３〜７日間である。
【００１６】
リグニンを分解して得られる水酸基含有芳香族化合物としては、サリチル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテキュ酸）、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。これらのうち、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００１７】
従来、リグニンを分解する微生物として、担子菌（白色腐朽菌、落葉分解菌）が知られているが、これは、リグニンを完全に分解して二酸化炭素にまでしてしまうため、有用な有機化合物を得ることが困難である。一方、本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法によれば、通常の培養方法であれば、多少培養期間を長くしても有用な有機化合物（水酸基含有芳香族化合物）を十分に得ることができる。
【００１８】
水酸基含有芳香族化合物のうち、サリチル酸は解熱・鎮痛作用の他、抗リウマチ作用や尿結石生成防止作用等（アスピリンと同様の作用）を有する。また、サリチル酸の誘導体であるパラアミノサリチル酸は結核の治療薬として使用できる。また、バニリンは香料（天然物はバニラビーンズから単離されるため高価である）として使用できる。また、２，３−ジヒドロキシ安息香酸は感光用現像剤の添加物として使用できるほか、２，３−ジヒドキシ安息香酸を含有するウンカリア・トメントーサ樹皮抽出物にアルツハイマー病のアミロイド阻害作用があることが知られている。また、バニリン酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、３，４−ジヒドロキシ安息香酸は抗酸価機能活性を持ち、エステル体は食品添加物として利用できる。また、シリンガ酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、シリンガアルデヒドは抗アレルギー成分や食品添加物等への利用が期待される。
【実施例】
【００１９】
以下、特記しない限り、％は重量％を意味する。
＜リグニン含有培地を用いた集積培養によるパラコッカス属細菌の単離＞
イビデン株式会社の生物処理施設から採取した活性汚泥分散液（固形分濃度４０００ｍｇ／Ｌ）２７ｍＬに、黒液（広葉樹、固形分濃度７５ｇ／Ｌ；以下同じ）をリグニン濃度が３００ｍｇ／Ｌから３０００ｍｇ／Ｌとなるまで徐々に添加しながら、約１ヶ月間集積培養した。
ついで、黒液（酸不溶性リグニン）を５００ｍｇ／Ｌとなるように、低分子リグニン芳香族化合物（バニリン、グアイヤコール、ケイヒ酸、シリンガ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸）を最終濃度５０ｍｇ／Ｌとなるように、それぞれＭＳＭ培地に加えて選択固体培地を調製し、これに、集積培養して得た微生物を塗布し、３０℃にて１０日間培養して、コロニーを形成したものをリグニン分解菌として単離した。単離した菌を再び選択固体培地塗布してコンタミネーションがないことを確認した。
なお、固形分濃度は１０５℃で加熱乾燥して恒量値を求め、加熱前後の重量から算出した。
【００２０】
単離したリグニン分解菌は、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子全長をターゲットとしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザ）により塩基配列を決定した（塩基配列１）。そして、この塩基配列をアポロンＤＢ−ＢＡ ＢＬＡＳＴ及び国際塩基配列データベースＢＬＡＳＴで相同性検索したところ、パラコッカス属細菌であることを同定した｛Paracoccus versutus（ATCC25364株、アクセッション番号AY014174）に対して相同率９９．７％であった。｝。
【００２１】
単離したリグニン分解菌をＬＢ寒天培地で、３０℃、４８時間培養して、形態観察したところ、運動性を持たないグラム陰性の短桿菌（０．８〜０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ）で、ＬＢ寒天平板状でのコロニー色は黄色を呈し（コロニー直径２．０〜３．０ｍｍ）、グルコールを酸化せず、カラターゼ反応及びオキシターゼ反応は共に陽性を示した。また、育成温度試験では、３７℃で陽性、４５℃で陰性を示し、嫌気性条件下では育成せず、メタノール、エタノール、グリセリン及びガラクトースを資化し、ラクトースを資化しなかった。また、硝酸塩を還元せず、グルコースやＤ−マンノース等を資化せず、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール及びグルコン酸カリウム等を資化した。
【００２２】
単離したリグニン分解菌をＬＢ液体培地に接種し、２７℃で１日振盪培養して、サチュレートした培養液（ＰＣ）を得た。
【００２３】
＜実施例１＞
５００ｍｌバッフル付き三角フラスコに入ったＭＳＭ培地２５０ｍｌに、リグニン（品名：アルカリリグニン、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を５００ｍｇ／Ｌとなるように加え、さらに、グリセリンを１０ｍｌ／Ｌ、硫酸アンモニウムを２ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ加えたリグニン含有ＭＳＭ培地を調製し、このリグニン含有ＭＳＭ培地に、上記の培養液（ＰＣ）が１体積％となるように接種して、培養温度２７℃、培養ｐＨ８．９で、７日間振盪培養して、培養液（１）を得た。
なお、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００２４】
その後、培養液（１）を０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．４に調整した後、遠心分離（１万Ｇ、１０分間）して固形物を取り除き、さらに０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過した濾液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム、溶離液：０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、検出器：ＵＶ２８０ｎｍ）により、分子量を測定した結果を図１に示した（ピークの分子量：１４９４）。
また、リグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）についても、分子量の測定結果を図１に併せて示す（ピークの分子量：６７５２）。
【００２５】
培養液（１）を６Ｎ塩酸にてｐＨ１〜２に調整した後、酢酸エチルで抽出した抽出液を蒸発乾固してから、トリメチルシリル化して、ＧＣ−ＭＳ分析（ＳＨＩＭＡＺＵ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０、カラム：ＤＢ−１、Φ０．３２、長さ３０ｍ）したところ、サリチル酸（０．９１４→２．３３３ｍｇ／Ｌ）、バニリン（０．７５０→１．８０５ｍｇ／Ｌ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（１．００５→２．７７７ｍｇ／Ｌ）、バニリン酸（１．０６７→３．１９４ｍｇ／Ｌ）の含有量が増加することを確認した｛カッコ内の数字は培養前の培地中の濃度→培養後の培地中の濃度を表す｝。これにより、リグニンを分解して、水酸基含有芳香族化合物が得られたことを確認した。
【００２６】
また、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、酸が生じたと考えられることは、上記のＧＣ−ＭＳ分析結果からも裏付けられる。
【００２７】
＜実施例２＞
「リグニン（品名：アルカリリグニン、シグマアルドリッチ社製）」を「黒液に７２％硫酸を加えてｐＨ３．０に調整し、リグニンを沈殿させ、１２００Ｇ（重力の１２００倍）で１０分間遠心分離した後、上澄み液を捨てて得た沈殿物を少量の蒸留水に懸濁させＧＳ−２５ガラスフィルターで濾過し、乾燥して得たリグニン」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（２）を得た。そして、培養液（２）について、実施例１と同様にして、ＧＣ−ＭＳ分析したところ、水酸基含有芳香族化合物（サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル）の存在を確認した。
なお、リグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）について、同様にＧＣ−ＭＳ分析したところ、水酸基含有芳香族化合物は検出できなかった。これにより、リグニンを分解して、水酸基含有芳香族化合物が得られたことを確認した。
【００２８】
＜実施例３＞
「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（３）を得た。そして、培養液（３）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：１５５７）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：５１６９）と共に図２に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００２９】
＜実施例４＞
「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（４）を得た。そして、培養液（４）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：２０３５）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：５１６９）と共に図２に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは６．５であった。
【００３０】
実施例３及び４の結果から、ｐＨ７．６の場合、培養温度が３０℃よりも２７℃の方が低分子化が進行することがわかった。
【００３１】
実施例３及び４において、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、共に酸が生じたと考えられる。また、培養温度が３０℃よりも２７℃の方がよりｐＨが低いことから、培養温度が３０℃よりも２７℃の方がより酸の生成量が多いと考えられる。
【００３２】
実施例３及び４において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図３に示した。これらの結果から、ｐＨ７．６の場合、培養温度が３０℃よりも２７℃の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００３３】
＜実施例５＞
「培養温度２７℃」を「培養温度２４℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（５）を得た。そして、培養液（５）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：１６６１）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：６７５２）及び実施例１のデータ（培養温度２７℃、ピークの分子量：１４９４）と共に図４に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは５．２であった。
【００３４】
＜実施例６＞
「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（６）を得た。そして、培養液（６）について、実施例１と同様にして分子量を測定し（ピークの分子量：３１３４）、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータ（ピークの分子量：６７５２）及び実施例１のデータ（培養温度２７℃、ピークの分子量：１４９４）と共に図４に示した。
また、培養終了後（７日後）、ｐＨは６．１であった。
【００３５】
実施例１、５及び６の結果から、ｐＨ８．９の場合、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方が低分子化が進行することがわかった。
【００３６】
実施例１、５及び６において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図５に示した。これらの結果から、ｐＨ８．９の場合、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００３７】
実施例１、５及び６において、培養終了後（７日後）のｐＨが培養前のｐＨよりも低くなっていることから、共に酸が生じたと考えられる。また、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方がよりｐＨが低いことから、培養温度が３０℃よりも２４℃、２７℃の方がより酸の生成量が多いと考えられる。
【００３８】
実施例１（ピークの分子量：１４９４）及び実施例３（ピークの分子量：１５５７）の結果（図６）から、培養温度２７℃の場合、培養ｐＨが相違しても、低分子化の進行に余り影響がしないことがわかった。
【００３９】
実施例１及び３において、培養開始後、１日ごとに培養液の濁度（日本分光株式会社製分光光度計Ｖ−５３０）を測定し、測定結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）の測定結果と共に図７に示した。これらの結果から、培養温度２７℃の場合、培養ｐＨが７．６よりも８．９の方が微生物の増殖が活発であることがわかった。
【００４０】
実施例１及び３において、培養後のｐＨに差異が認められないため（共に、５．２）、培養ｐＨが相違しても、酸の生成量に余り影響がしないことがわかった。
【００４１】
＜実施例７＞
「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」を「ＭＳＭ培地５０ｍｌ」、「ＭＳＭ培地１００ｍｌ」又は「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」に変更したこと、「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」を「培養液（ＰＣ）の接種した量１０体積％」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（７）〜（９）を得た。そして、培養液（７）〜（９）について、実施例１と同様にして分子量を測定し、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータと共に図８に示した。
【００４２】
ピークの分子量は、下表の通りであった。ＭＳＭ培地の量とピークの分子量との間には高い相関が認められた（相関関数０．９９７７、図９）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
これらの結果から、ＭＳＭ培地の量が多いほど、低分子化が進行することがわかった。
【００４５】
＜実施例８＞
「ＭＳＭ培地２５０ｍｌ」を「ＭＳＭ培地１００ｍｌ」に変更したこと、「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」を「培養液（ＰＣ）の接種した量１体積％」、「培養液（ＰＣ）の接種した量５体積％」、「培養液（ＰＣ）の接種した量１０体積％」又は「培養液（ＰＣ）の接種した量２０体積％」に変更したこと、「培養温度２７℃」を「培養温度３０℃」に変更したこと、「培養ｐＨ８．９」を「培養ｐＨ７．６（６Ｎ塩酸を用いて調整した）」に変更したこと以外、実施例１と同様にして、培養液（１０）〜（１３）を得た。そして、培養液（１０）〜（１３）について、実施例１と同様にして分子量を測定し、その結果をリグニン含有ＭＳＭ培地（ブランク）のデータと共に図９に示した。
【００４６】
ピークの分子量は、下表の通りであった。これらの関係を図１１に示した。
【表２】
【００４７】
これらの結果から、培養液（ＰＣ）の接種した量が５〜２０体積％の場合、培養後の分子量に大きな差異は認められず、１体積％のとき、より低分子化が進行することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の水酸基含有芳香族化合物の製造方法は、好気性条件下でリグニンを分解して有用な有機化合物を得ることができる。好気性条件下で培養できるため、嫌気性条件下での培養に比べて、微生物の増殖速度が格段に早く、リグニンの分解をより促進することができる。そして、得られる有機化合物には水酸基含有芳香族化合物を含み、これらは化粧品、医薬品、食品添加物、建材等の原料として利用できる。
【００４９】
水酸基含有芳香族化合物のうち、サリチル酸は解熱・鎮痛作用の他、抗リウマチ作用や尿結石生成防止作用等（アスピリンと同様の作用）を有する。また、サリチル酸の誘導体であるパラアミノサリチル酸は結核の治療薬として使用できる。また、バニリンは香料（天然物はバニラビーンズから単離されるため高価である）として使用できる。また、２，３−ジヒドロキシ安息香酸は感光用現像剤の添加物として使用できるほか、２，３−ジヒドキシ安息香酸を含有するウンカリア・トメントーサ樹皮抽出物にアルツハイマー病のアミロイド阻害作用があることが知られている。また、バニリン酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、３，４−ジヒドロキシ安息香酸は抗酸価機能活性を持ち、エステル体は食品添加物として利用できる。また、シリンガ酸はポリフェノールの一種として抗酸化作用を持つ。また、シリンガアルデヒドは抗アレルギー成分や食品添加物等への利用が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含むことを特徴とする水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項２】
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項３】
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項４】
培養ｐＨが６〜９である請求項１〜３のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項５】
培養温度が２４〜３０℃である請求項１〜４のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項６】
培養日数が３〜１０日間である請求項１〜５のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項７】
培地がリグニンを含有するＭＳＭ培地である請求項１〜６のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項８】
培地が、グリセリンを含有する培地である請求項１〜７のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項９】
培地が、硫酸アンモニウムを含有する培地である請求項１〜８のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項１】
好気性条件下で、リグニンを含有する培地内でパラコッカス属細菌を培養することにより、リグニンを分解して水酸基含有芳香族化合物を得る工程を含むことを特徴とする水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項２】
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、３，４−ジメトキシ−α−ヒドロキシベンゼン酢酸メチル及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項３】
水酸基含有芳香族化合物が、サリチル酸、バニリン、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項４】
培養ｐＨが６〜９である請求項１〜３のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項５】
培養温度が２４〜３０℃である請求項１〜４のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項６】
培養日数が３〜１０日間である請求項１〜５のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項７】
培地がリグニンを含有するＭＳＭ培地である請求項１〜６のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項８】
培地が、グリセリンを含有する培地である請求項１〜７のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【請求項９】
培地が、硫酸アンモニウムを含有する培地である請求項１〜８のいずれかに記載の水酸基含有芳香族化合物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−２２３８８１（Ｐ２０１１−２２３８８１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９３６３８（Ｐ２０１０−９３６３８）
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名：第５４回リグニン討論会事務局（社団法人 高分子学会 共催） 刊行物名：第５４回リグニン討論会 講演集 発行年月日：２００９年１０月１５日
【出願人】（００００００１５８）イビデン株式会社 (856)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名：第５４回リグニン討論会事務局（社団法人 高分子学会 共催） 刊行物名：第５４回リグニン討論会 講演集 発行年月日：２００９年１０月１５日
【出願人】（００００００１５８）イビデン株式会社 (856)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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