パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体又は可溶性Ｎタンパク質の調製及びそれらのワクチンとしての使用
本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法、このように調製した複合体、及び当該複合体から単離し得る可溶性Ｎタンパク質に関する。本発明はさらに、このパラミクソウイルス科のＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体又はＮタンパク質を含むワクチン組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法、こうして調製した複合体、さらにこの複合体から単離することが可能な可溶性Ｎタンパク質に関する。また、本発明はパラミクソウイルス科のこのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体又はＮタンパク質を含むワクチン組成物に関する。好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【背景技術】
【０００２】
フランスでは、大部分の国と同様、ウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が、７０％以上の農場内の仔牛における、また約７０％の生後一年までの仔牛における重い呼吸器疾患（細気管支炎、肺炎）の主要な原因となる因子となっている（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９、 Ａｍｅｓ， １９９３、 Ｅｌｖａｎｄｅｒ， １９９６）。死亡率は２０％に達する（Ｗｅｌｌｅｍａｎｓ， １９９２）。これは、毎年冬のこの疾患の定期的な発生を止める術がない飼育業者にとって大きな悩みの種である。したがって、有効な予防法の開発という課題に対して牧畜業者の強い要求がある。ワクチンは市販されているが、実際、効果は少ないか、または効果が見られない。
【０００３】
ヒトにおいても同じ疾患が存在する。それは新生児の細気管支炎の原因となる因子である（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ、第７巻、２００３年１０月特別号、ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｅｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｅ参照）。このヒトの疾患についてのデータは極めて詳細である。ウシと同様、フランスでは、ヒトにおいて、それは冬に流行する疾患である。生後一年の間に、乳児の７０％がＲＳＶに感染し、生後二年の間に１００％が感染する。これは、フランスでは毎年５００，０００人の小児が感染していることを意味する。感染した乳児の２０％で下気道の疾患（細気管支炎）が生じ、フランスにおいては入院率が２〜５％であり、それは８〜９日間にわたり、未熟児の１０〜２５％、肺異形成の場合では１４〜４５％、先天性心異常の場合では１５〜２５％で下気道の疾患が生じる。入院患者の約１０％が集中治療室で治療されなければならない。死亡率は０．１％に近い。世界保健機関の最近の報告によれば、毎年世界で６４００万人が感染し１６０，０００人がＲＳＶにより死亡すると推定されている。アメリカでは毎年１８，０００〜７５，０００人が入院し、２，０００人近くが直接的に、１７，０００人が間接的に死亡している（Ｍａｇｏｎ ａｎｄ Ｂａｒｉｋ，２００４）。ＲＳＶはまた、成人におけるインフルエンザ症状の原因の３分の１を占める。実際、ＲＳＶにより小児の４倍の高齢者が死亡すると推定されている。全体では、ＲＳＶにより年間３００万〜５００万人が死亡する。さらに、極めて若い年齢（生後４か月前）で罹患した成人において、まだ明らかでない複雑な免疫機構により、この疾患はぜんそくを起こすリスクを増加させると考えられる。
【０００４】
たとえヒトＲＳＶ及びウシＲＳＶが異なる二種のウイルスであるとしても、構造的、分子的、抗原的側面、またそれらが誘発する疾患（臨床像、感染の季節性、若年者の感染）が等しいこと、そして、非常に高価であるため稀にしか使用されないモノクローナル抗体と、効果が弱く細胞内で実際にＡＴＰを消費してしまい毒性が強い抗ウイルス剤の他には有効なワクチンも抗ウイルス剤も存在しないという事実から、それらは極めて近いものである。
【０００５】
１９６０年代に、ホルマリンで固定したウイルスを用いた、幼い小児に対するワクチン接種の試験がアメリカで行われた。結果は悲惨なものであり、ワクチン接種を受けた小児は数ヵ月後のウイルスの自然感染の際に激しい症状を発し、しかもそのうちの数人は死亡する結果となった。
【０００６】
この不幸な試験の後、この疾患に対するヒト用のワクチンは未だ存在しておらず、また、たとえフランスにおいてこの課題について本格的な研究がなされていなくても、ウシ用の市販ワクチンの効果は極めて疑わしい。しかし、複数のワクチンが、ウシにおけるワクチン接種後の事故の後に市場からなくなった。
【０００７】
ＲＳＶに対するワクチンの開発の困難性は、次のような理由により説明することができる。
（１）ＲＳＶに対する局所的免疫記憶が短期的であるため、自然感染は再感染に対する防御免疫を付与しないこと、
（２）強い細胞性免疫及び液性免疫の誘導が、疾患の重篤さの増大と関連すること（ワクチン接種による感作）、
（３）経粘膜投与で効果的なワクチン接種を可能にする、アジュバント又はワクチン戦略が存在しないこと、
（４）新生児（生後２ヵ月以内）がワクチン接種の主要な対象であるが、彼らの免疫系は従来のワクチンに対する反応が悪いこと、
（５）感染を防がない移行抗体が血液中に存在すること、
（６）流行しているウイルス株が変化すること。
【０００８】
サブユニットワクチンが開発されつつあり、そのいくつかはＧ表面タンパク質に基づいている。新しいタイプのワクチンは逆遺伝学によって（すなわち遺伝的修飾による株の弱毒化によって）得られ、ＢＲＳＶと同様ＨＲＳＶに対しても数年前から開発されている。目下のところ、ヒトに対する弱毒株の使用は確認されていない。これはおそらく弱毒株の免疫応答が弱いためであろう。
【０００９】
仔牛に対するものも含めて、ＨＲＳＶ又はＢＲＳＶのＦ膜タンパク質及びＧ膜タンパク質に基づくＤＮＡワクチンが開発中である（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． ２００５、 Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ． １９９９）。このタイプのワクチンはいくつかの免疫病理学的研究に関連する防御免疫を付与する。このワクチンの効果は改良の余地がある。
【００１０】
ＲＳＶは、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムを有するエンベロープウイルスである。このＲＮＡは１１個のタンパク質をコードし、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質によりカプシドに包まれ、Ｌ（ラージ）つまりポリメラーゼとコファクターＰ（リンタンパク質）の二つのタンパク質から成る、ポリメラーゼ複合体と関連する（図１）。この分子は、ＰによりＬがゲノムＲＮＡを認識することが可能になるという、ポリメラーゼの機能における重要な役割を有する。さらにＲＳＶには二つのコファクターＭ２−１及びＭ２−２が存在し、これらはプロセシング（Ｍ２−１）及び転写／複製バランスの調節（Ｍ２−２）において役割を有する。
【００１１】
ウイルス粒子の表面上には二つの主要なＦタンパク質及びＧタンパク質がある。Ｆタンパク質はウイルスのエンベロープと細胞膜の融合を可能にし、合胞体の形成に関与する。Ｇタンパク質はウイルスが細胞の表面に付着することを可能にする。Ｍタンパク質（マトリックス）はウイルスのエンベロープとポリメラーゼ／ゲノム複合体の仲介をする。Ｆ表面タンパク質及びＧ表面タンパク質の二つのタンパク質は、中和抗体の標的であるため、ＲＳＶの主要な免疫原性タンパク質である。
【００１２】
しかし、マウスについてなされた研究は、Ｇタンパク質がＴｈ２型の免疫病理学的ワクチン反応（ＩＬ−４とＩＬ−５の産生及び好酸球の集合）の誘発に関与することを示した（Ｓｐａｒｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。それに対して、ウシの場合には、これら二つのタンパク質のいずれも免疫病理学的応答に関与せず、これらの二つのタンパク質は防御応答の確立を可能にする（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。
【００１３】
現在、新規なワクチン候補の研究は、多数がＦタンパク質及びＧタンパク質に関するものである。
【００１４】
しかし、ヒト及びウシにおいては、細胞を介する免疫、特に細胞傷害性Ｔ細胞の応答は、ＲＳＶに対する防御の不可欠な構成要素である。ウシの場合と同様ヒトの場合以外では、Ｎタンパク質が細胞傷害性Ｔ細胞の応答の主要な基礎である（Ｇｏｕｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。仔牛がＲＳＶに対するワクチン接種に適切なモデルである。ＲＳＶのＮタンパク質を発現する組換えワクチンを使用すると、免疫応答のバランスの回復を可能にする細胞型（Ｔｈ１）の応答が生じることが示されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｇａｄｄｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、現在の研究全体が、複数のタンパク質、特にＦ表面タンパク質及びＧ表面タンパク質並びに内部のＮタンパク質の組み合わせで構成される抗ＲＳＶワクチンに有利に働く。
【００１５】
Ｎタンパク質は、感染細胞で最も多く発現するタンパク質であり、ウイルス粒子中で量的観点から最も重要なタンパク質の一つである（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。それは、一本鎖ＲＮＡから構成されるウイルスゲノムを包囲し、大きなサイズのらせん構造を形成している。それが組換え体の形で単独で発現した時、Ｎタンパク質は非特異的に細胞ＲＮＡ上に重合する。それらはそこで極めて巨大な、不溶性で精製不可能な、感染細胞で見られるヌクレオカプシドに似たらせん構造（ＲＮＡ／Ｎ）を形成する（Ｍｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９４、 Ｂｈｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。
【００１６】
このＮタンパク質は、ウイルスポリメラーゼＬのコファクターであるＲＳＶのＰタンパク質と相互作用することができる。ツーハイブリッド法と免疫沈降法を主として使用する相互作用ドメインの位置決定の研究が、様々なグループにより行われたが、スクリーニングの結果は否定的（相互作用は認められない）であった。ヒトウイルス又はウシウイルスのＰタンパク質のＣ末端ドメインはＮタンパク質との相互作用において重要な役割を有する疑いがあった（Ｇａｒｃｉａ Ｂａｒｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６、 Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６、 Ｓｌａｃｋ ａｎｄ Ｅａｓｔｏｎ， １９９８、 Ｋｈａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１ａ， ２００１ｂ）。しかし、ツーハイブリッドシステムはＮタンパク質とＰタンパク質との間の相互作用の実際の性質を反映しないことが分かった（Ｋｈａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１ａ）。その上、Ｐ−Ｎ複合体の正確な性質（各分子の数又は化学量、構造）は報告されておらず、相互作用のドメインは明示されても特徴を明らかにされてもいない。
【００１７】
パラミクソウイルス科に属する近縁のウイルス（センダイウイルス、麻疹ウイルス）についてなされた研究から、Ｐタンパク質は、Ｎタンパク質と共にＮ°Ｐと呼ばれる可溶性複合体を形成し、細胞ＲＮＡに自身が非特異的に固定することを防ぐとの考えが導かれた（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。Ｐタンパク質は、ＰがＬのコファクターとして作用してＬがその基質を「発見する」ことを可能にするため、Ｎタンパク質によりカプシドに包まれたＲＮＡから形成されるヌクレオカプシドを認識することもできる。
【００１８】
パラミクソウイルス科については、二つの相互作用ドメインがＰ上に発見されている。一方は、タンパク質のＣ末端の位置にあり、Ｎ−ＲＮＡ複合体を認識するドメインを構成し、もう一方は、Ｎ末端の位置にあり、Ｎ°Ｐ複合体の形成を可能にする（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＲＳＶについては、これらの複合体は明確に同定されておらず、Ｎと相互作用するＰタンパク質のＣ末端ドメインの役割は明確に定義されていない。
【００１９】
現在まで、Ｎタンパク質に基づくサブユニットワクチンの開発は、可溶性の形でＮタンパク質を単離することが困難なため不可能であった。
【００２０】
最近、本発明者は、細菌におけるＰタンパク質及びＮタンパク質の同時発現系を開発し、これをパラミクソウイルス科のＲＳＶのモデルとして選んだ（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。Ｐタンパク質は、アンピシリン耐性を有するプラスミドにおいてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させ、Ｎタンパク質はカナマイシン耐性を有するプラスミド中にクローニングした。同じ細菌中におけるこれらプラスミドの同時発現により、融合タンパク質ＧＳＴ−Ｐを精製すること及びＮタンパク質を伴わせることが可能になった。
【非特許文献１】Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ Ｄ， Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｐ， Ｉｓｅｎｉ Ｆ， Ｇａｒｃｉｎ Ｄ． ２００４． Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｙｍｎａｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； ３１８（２）：４６３−７３． Ｒｅｖｉｅｗ．
【非特許文献２】Ｃａｓｔａｇｎｅ， Ｎ．， Ａ． Ｂａｒｂｉｅｒ， Ｊ． Ｂｅｒｎａｒｄ， Ｈ． Ｒｅｚａｅｉ， Ｊ．−Ｃ． Ｈｕｅｔ， Ｃ． Ｈｅｎｒｙ， Ｂ． Ｄａ Ｃｏｓｔａ， ａｎｄ Ｊ．−Ｆ． Ｅｌｅｏｕｅｔ． ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｐ−Ｐ ａｎｄ Ｐ−Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ； ８５： １６４３−１６５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、依然として溶解性の問題が間違いなく存在するため、可溶性の形でのＮタンパク質の生産量が、工業的規模におけるこの系の実施を検討するには依然として著しく不十分である。その上、こうして生産されたＮタンパク質の性質も明らかにされなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、Ｐタンパク質のＮ末端が欠失した突然変異体とＲＳＶのＮタンパク質との同時発現により、完全なＰタンパク質で得られる場合と比較して格段に多い量のＮタンパク質を精製することが可能になるということを明らかにした。
【００２３】
定義
「パラミクソウイルス科」なる科は、パラミクソウイルス亜科とニューモウイルス亜科に再分類される。パラミクソウイルス亜科は、プロトタイプがセンダイウイルスであるレスピロウイルス属、そして、ルブラウイルス属（特に流行性耳下腺炎ウイルス）、及び麻疹ウイルスのようなモービリウイルス属を含む。レスピロウイルス属とルブラウイルス属の各属は、パラインフルエンザウイルス株を構成する。ニューモウイルス亜科は、ニューモウイルス属とメタニューモウイルス属の二つの属に再分類され、後者はヒトメタニューモウイルスを含む。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、ニューモウイルス亜科に属するニューモウイルス属のプロトタイプのウイルスを構成する。ニューモウイルス属はまた、ウシＲＳＶ株及びマウスＲＳＶ株を含む。
【００２４】
他に明言しない限り、「呼吸器合胞体ウイルス」は通常、考えられるあらゆる形態（ヒト、ウシ・・・）、サブグループ（例えばヒトＲＳＶで同定されているサブグループＡ、Ｂ及びＳ）又は株であるＲＳＶを指す。
【００２５】
「Ｐタンパク質」という記載は、パラミクソウイルス科ウイルスのポリメラーゼ複合体から得られるリンタンパク質すなわちＰタンパク質を指す。Ｐタンパク質はウイルスポリメラーゼ（レプリカーゼ／トランスクリプターゼ）のコファクターであり、リン酸化され得る。パラミクソウイルス科のＰタンパク質の配列は当業者に知られている。例えば、ヒトＲＳＶのＬｏｎｇ株のＰタンパク質は２４１個のアミノ酸からなる配列を有し、これは受託番号Ｐ１２５７９でＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに寄託されている。この配列は、配列番号１に示されている。ウシＲＳＶのＰタンパク質も同様に２４１個のアミノ酸からなる（配列番号２３）。センダイウイルス（Ｈａｒｒｉｓ株）、麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）、流行性耳下腺炎ウイルス（ＳＢＬ−１株）、及びヒトメタニューモウイルス（００−１株）のＰタンパク質も同様に、受託番号Ｐ０４８５９（配列番号２）、ＣＡＡ９１３６４（配列番号３）、Ｐ１９７１７（配列番号４）、及びＱ９１ＫＺ５（配列番号５）でそれぞれＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに登録されている。「Ｐタンパク質」という記載は、完全なＰタンパク質、トランケート型Ｐタンパク質、又はＰタンパク質の断片を示し得る。
【００２６】
パラミクソウイルス科のＰタンパク質は、例えばセンダイウイルス又はＲＳＶの場合、ホモオリゴマー特にホモテトラマーを形成する。ＲＳＶについては、オリゴマー化（Ｐ−Ｐオリゴマー化）することが可能なＰタンパク質のドメインは、このタンパク質の１２０〜１５０番アミノ酸のところに位置決定されている（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。したがって、例えば、ＲＳＶのＰタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸で構成される断片はオリゴマーを形成しない。センダイウイルスのＰタンパク質のオリゴマー化ドメインは、Ｔａｒｂｏｕｒｉｅｃｈら（２０００）により、Ｐタンパク質の３２０〜４４６番残基で構成されるものとして報告されている。他方、麻疹ウイルスのＰタンパク質については、Ｐタンパク質のオリゴマー化領域は３０４〜３７６番アミノ酸のところに同定されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。
【００２７】
「トランケート型Ｐタンパク質」という記載は、連続する一つ又は複数のアミノ酸配列が欠失したＰタンパク質を指す。それらの欠失は、Ｐタンパク質の一次配列に関する、Ｃ末端配列、Ｎ末端配列、及び「内側」配列のトランケーション、又はこれらのトランケーションの組み合わせであり得る。
【００２８】
本発明によるトランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まず、Ｎタンパク質と相互作用することができる。パラミクソウイルス科のＰタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインがＣ末端のところに位置決定されたので、トランケート型Ｐタンパク質の例は好ましくは、Ｐタンパク質のＣ末端断片、又はＰタンパク質のＣ末端断片（Ｎタンパク質と相互作用することができる）とＰタンパク質の連続する少なくとも一つの他のアミノ酸配列との融合により構成された「キメラ」Ｐタンパク質を含む。前記Ｃ末端断片と前記Ｐタンパク質の他の配列は、それ自体は天然に連続しておらず、その中に配列のオーバーラップは存在しない。例えば、ＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は天然Ｐタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸から構成される配列を有し得る。参照ポリペプチドの「断片」は、参照ポリペプチド配列中に見られるあらゆる連続したアミノ酸配列を指す。
【００２９】
「Ｐタンパク質の断片」又は「ＰΔ」は、配列がＰタンパク質のアミノ酸鎖からなり、Ｐタンパク質の連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端及び／又はＣ末端の末端から欠失しているポリペプチドを指す。
【００３０】
「Ｐタンパク質のＣ末端断片」又は「ＰΔＮ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を指す。好ましくは、Ｐタンパク質のＣ末端断片はＰタンパク質の一次配列のＣ末端側の半分にあるアミノ酸鎖を指す（配列のアミノ酸の数が奇数の場合には、Ｎ末端側の半分との兼ね合いで、一個の追加のアミノ酸をタンパク質のＣ末端側の半分に任意に加えることができる）。例えば、２４１個のアミノ酸を含むＲＳＶのＰタンパク質では、ＰΔ１６１ＮはＰタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸により構成されるＣ末端断片を指す。同様に、例えば、５０７個のアミノ酸からなる麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）のＰタンパク質では、ＰΔ３８６ＮはＰタンパク質の３８６〜５０７番アミノ酸により構成されるＣ末端断片を指す。
【００３１】
「Ｐタンパク質のＮ末端断片」又は「ＰΔＣ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＣ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を意味する。
【００３２】
「Ｐタンパク質の内側断片」又は「ＰΔＮＣ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端の末端から欠失し、かつ連続する一つ又は複数のアミノ酸がＣ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を意味する。
【００３３】
「Ｎタンパク質」は、ウイルスゲノムを囲むためにらせん構造を形成している、パラミクソウイルス科のヌクレオカプシドタンパク質を指す。ヒトＲＳＶのＬｏｎｇ株のＮタンパク質は、３９１個のアミノ酸からなる配列を有し、これは配列番号６に示されている。ウシＲＳＶのＮタンパク質も同様に３９１個のアミノ酸からなる（配列番号２４参照）。センダイウイルス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ株）、麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）、流行性耳下腺炎ウイルス（ＳＢＬ−１株）、及びヒトメタニューモウイルス（００−１株）のＮタンパク質も同様に、受託番号Ｑ９ＤＵＥ３（配列番号７）、受託番号Ｑ８９９３３（配列番号８）、受託番号Ｐ２１２７７（配列番号９）、及び受託番号Ｑ９１Ｆ５７（配列番号１０）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにそれぞれ登録されている。
【００３４】
上記Ｐタンパク質及びＮタンパク質の配列は例示的な特徴を有し、これらの配列は所与のウイルスについて考えられる特定の株に応じて変化する可能性がある。このように、本出願の明細書の以下に記載されるアミノ酸の位置はこれらの参照配列について示したものである。当業者は、これらの例示以外のウイルス株における対応するドメインを完全に同定することが可能である。
【００３５】
パラミクソウイルス科ウイルスのこれらのＮタンパク質及びＰタンパク質をコードする配列も当業者に知られている。
【００３６】
「タグタンパク質」とも呼ばれる「標識タンパク質」は、関心のあるタンパク質と融合して精製を容易にするために使用されるタンパク質を指す。標識タンパク質は当業者に知られている。標識タンパク質の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又は４〜１０個のヒスチジン残基鎖を通常含む配列であるヒスチジンタグが挙げられる。
【００３７】
本発明の内容においては、「相同」という語は、同じ進化上の起源を有するタンパク質間、例えば異なる種、又はウイルスの場合では異なるウイルス株が有する相同タンパク質間に存在する関係に関するものである。このようなタンパク質（及びそれをコードする遺伝子）は配列の相同性を示すものであるが、その相同性は、それらタンパク質の配列の類似性に、つまり、類似の割合、すなわち保存された位置における特定の残基又はモチーフの存在に関して反映される。
【００３８】
「配列の類似性」という表現は、同じ進化上の起源を共有し得るか又はそうでない核酸配列間又はタンパク質のアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。通常、相同と類似性という語は区別なく使用される。二つのアミノ酸が少なくとも８０％同一又は少なくとも９０％類似（すなわち機能的に同一）の際、それら二つのアミノ酸の配列は「基本的に相同」である。類似又は相同の配列は、例えばＢＬＡＳＴプログラム又はＦＡＳＴＡプログラムを使用して、アラインメントにより同定することができる。
【００３９】
本発明によるタンパク質又は複合体の溶解度は、１×ＰＢＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを加えた１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）、０．２×ＴＢＥ、さらに例えば、６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加えた５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を含む細菌溶解緩衝液のような、緩衝化水性溶媒に対して定義される。
【００４０】
可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法
本発明者は、Ｐタンパク質とＧＳＴとの融合物及びパラミクソウイルス科のＮタンパク質をそれぞれコードするプラスミドの同時発現により、Ｎタンパク質を伴う融合タンパク質ＧＳＴ−Ｐを得ることが可能になることを先に示した（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。しかし、Ｎ−Ｐ複合体の生産量は少ないので、この複合体の工業的規模における生産と相容れない。
【００４１】
本発明者は、Ｐタンパク質の欠失突然変異体の特徴を明らかにし、Ｎタンパク質と相互作用するその能力を判定した。そして、この突然変異体のいくつかもまたＲＮＡ−Ｎ複合体すなわちリボヌクレオカプシド（ＲＮＰ）の形のＮタンパク質と相互作用することができること、また同時に、完全なＰタンパク質で得られるものよりも極めて顕著に多い収量のＮ−Ｐ複合体の調製を可能にすることを明らかにした。この特定の突然変異体は、分子のＣ末端部分を含みＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを欠くＰタンパク質の断片に相当する。
【００４２】
したがって、これらＰタンパク質の突然変異体とＮタンパク質との同時発現は、大量の、可溶性ＲＮＰの形、特にＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、特にＮタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体の形でのＮタンパク質の調製を可能にする。
【００４３】
したがって、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法に関するものであって、前記方法は、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を、パラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質と同時発現させること、及び
ｂ）こうして形成された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を回収すること
から成る過程を含む。
【００４４】
トランケート型Ｐタンパク質は、好ましくはＰタンパク質のＣ末端断片からなる。パラミクソウイルス科のＰタンパク質と、場合によりＮ−ＲＮＡ複合体の形であるＮタンパク質との相互作用ドメインは、実際、Ｐタンパク質のＣ末端側に位置する。
【００４５】
トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片とＰタンパク質の連続する少なくとも一つの他のアミノ酸配列との融合により構成された、上に定義したような「キメラ」Ｐタンパク質であり得る。
【００４６】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００４７】
従って、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）を調製する方法に関するものであって、前記方法は、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とパラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、Ｐタンパク質のＣ末端断片とを同時発現させること、
ｂ）こうして形成されたＮ−ＰΔＮ可溶性複合体を回収すること
から成る過程を含むものである。
【００４８】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスはヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００４９】
当業者は、Ｎタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質、又はさらに具体的にはＰタンパク質のＣ末端断片を知っているか又は決定することができる。
【００５０】
例えば、ＲＳＶの場合、本発明者はＰタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインの位置決定をするために、先に報告された、大腸菌におけるＮタンパク質及びＰタンパク質の同時発現手段（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を使用した。そのために、Ｎタンパク質を、ＧＳＴと融合したＰタンパク質の欠失突然変異体と同時発現させた。本発明者はまた、Ｐタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインがＰタンパク質のＣ末端の末端のところに位置していることを明らかにした（図１）。本発明者は、特に、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の９個のアミノ酸から構成されるオリゴペプチド（２３３〜２４１番アミノ酸）までのＰタンパク質のＣ末端断片が、Ｎタンパク質と相互作用することができることを示した。
【００５１】
他方で、例えば、センダイウイルスのＰタンパク質の、「Ｘドメイン」又はＸＤと呼ばれる、ＲＮＡ−Ｎ複合体すなわちＲＮＰの形のＮタンパク質との相互作用ドメインが、４７３〜５６８番アミノ酸に該当することが報告されている（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【００５２】
それ以外のパラミクソウイルス科については、必要に応じて、当業者は本発明者が報告した手段を使用して、ヌクレオカプシドの形のＮタンパク質と相互作用するドメインをＰタンパク質に同定することができる。
【００５３】
本発明者はまた、ＲＳＶのＰタンパク質の特定のＣ末端断片、とりわけＰΔ１６１Ｎ断片（１６１〜２４１番アミノ酸）が、実際には工業的規模に充分な収量を得ることができない完全なＰタンパク質の場合と比較して、大量のＮタンパク質の調製を可能にすることを明らかにした。非常に小さな、９個のアミノ酸しか有さないＰΔ２３３Ｎ（２３３〜２４１番アミノ酸）までの欠失突然変異体が、ＰΔ１６１Ｎの場合の収量に匹敵する収量を得ることを可能にする。
【００５４】
ＰΔ１６１Ｎよりも小さいこれらの断片は、Ｎタンパク質と相互作用することはできるがもはやオリゴマー化することができない、すなわちもはやＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まない、ＲＳＶタンパク質の断片に対応する。ＲＳＶのＰタンパク質の最小のオリゴマー化ドメインは、実際、Ｐタンパク質の１２０〜１５０番アミノ酸付近で定義される。
【００５５】
この同じ手段により、本発明者は、３８６〜５０７番アミノ酸残基から構成される麻疹ウイルスのＰタンパク質のＣ末端断片（ＰΔ３８６Ｎ）が、このウイルスのＮタンパク質と相互作用し、その精製を可能にするということを示すことができた。一方、Ｐタンパク質のＮ末端部分において４５６番残基までが欠失していると（ＰΔ４５７Ｎ断片を含む）、Ｎタンパク質の精製はできない。リボヌクレオカプシドと相互作用するＰタンパク質のＣ末端領域の構造は、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）により特定されている。Ｐタンパク質のオリゴマー化領域は、３０４〜３７６番アミノ酸で定義されたような推定と欠失により特定された。
【００５６】
したがって、ＲＮＰの形のＮタンパク質と相互作用するドメインを含むがＰタンパク質のオリゴマー化ドメインが欠失している、Ｐタンパク質のＣ末端断片を使用すると、Ｐタンパク質断片とＮタンパク質との相互作用、可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体の形成、及び高収量でのこの複合体の生産が同時に可能になる。特定のメカニズムに結びつけることはしないが、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインが存在しないと、この複合体のＰタンパク質同士間の相互作用に関連したＮ−ＰΔＮ複合体の不溶性の問題が回避されると推定される。
【００５７】
さらに、一実施形態によると、Ｎ−ＰΔＮ複合体を調製する方法は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠失する、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を発現させることを含む。
【００５８】
さらに具体的には、本発明による方法では、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を、ＲＳＶのＮタンパク質と同時発現させることができる。
【００５９】
ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片は、例えば、ＰΔ１２０Ｎ（Ｐタンパク質の１２０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１５０Ｎ（Ｐタンパク質の１５０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１６１Ｎ（Ｐタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１８０Ｎ（Ｐタンパク質の１８０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２００Ｎ（Ｐタンパク質の２００〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２２０Ｎ（Ｐタンパク質の２２０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２３０Ｎ（Ｐタンパク質の２３０〜２４１番アミノ酸）、及びＰΔ２３３Ｎ（Ｐタンパク質の２３３〜２４１番アミノ酸）から構成される群から選択され得る。
【００６０】
本発明はまた、ＲＳＶのＮタンパク質と、上記のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、トランケート型Ｐタンパク質とを同時発現させる方法に関するものである。
【００６１】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合から構成され得る。それは例えば、配列番号１に示すようなヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸と１６１〜２４１番アミノ酸との連結から構成され得る。
【００６２】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科は麻疹ウイルスであり、Ｎ−ＰΔＮ複合体を調製する方法は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか、又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成される、麻疹ウイルスのＰタンパク質のＣ末端断片を発現させることを含む。それらの断片は、特に、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５０７番アミノ酸から構成されるＣ末端断片（ＰΔ３８６Ｎ）、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【００６３】
本発明による方法を利用するに当たり、分子生物学、微生物学、又は組換えＤＮＡにおける通常のあらゆる技術を使用することができる。このような技術は当業者に既知であり、特に次のものに記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９」）。ＤＮＡクローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻及び第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）。オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）。核酸のハイブリダイゼーション［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］。転写及び翻訳［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］。動物細胞の培養［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］。固定化細胞及び固定化酵素［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］。Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００６４】
「発現する」又は「発現」は、遺伝子又はＤＮＡ配列に含まれる情報が現れることを可能にすること又は現れるようにすること、例えば、対応する遺伝子配列又はＤＮＡ配列の転写と翻訳に関与する細胞の機能を活性化することによるタンパク質の産生を意味する。二つの遺伝子又はＤＮＡ配列に含まれる情報が同じ宿主細胞内で発現することを「同時発現」という。
【００６５】
「コード配列」は、それが発現するとＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質等が生成するヌクレオチド配列を意味する。タンパク質をコードする配列は一般に開始コドン（ＡＴＧ）と終止コドンを含む。
【００６６】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡ、特にｍＲＮＡに転写し、次いでそれがイントロンを含む場合にはスプライシングされ、コードする配列によりコードされているタンパク質に翻訳されるとき、転写及び翻訳の制御配列「の制御下にある」か又はそれら「と機能的に関連している」。
【００６７】
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という記載は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば異種遺伝子）を宿主細胞に導入し、その結果、宿主細胞を形質転換し、導入された配列を発現させることができる担体を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、ファージ、ウイルスが挙げられる。もっとも一般的なベクターは、通常は細菌に由来する、自己複製ユニットである、二本鎖ＤＮＡの形態であり得るプラスミドである。プラスミドは外来ＤＮＡ配列を容易に組み込むことができ、それを適当な宿主内に容易に導入することができる。一つのプラスミドベクターは通常、一つのコードＤＮＡ配列、一つのプロモーターＤＮＡ配列を含み、外来ＤＮＡの導入が可能な一つ又は複数の制限部位を有する。プラスミドの非制限的な例としては、ｐＫＫ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣ及びｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン州）、ｐＲＳＥＴ及びｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）、又はｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のプラスミドが挙げられる。
【００６８】
「宿主細胞」は、細胞による物質の生産、例えば、細胞による、遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列、タンパク質又は酵素の発現のために選択され、修飾され、培養され又は操作される、あらゆる細胞又は生物を意味する。
【００６９】
「発現系」は、ベクターにより担持され宿主細胞内に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の生産に適した条件下で使用される、宿主細胞及び適当なベクターを指す。通常の発現系は、大腸菌宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫細胞、及びバキュロウイルスベクター、またさらには哺乳類細胞及びベクターを含む。
【００７０】
本発明の方法による発現系は、有利には、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ−３のようなベクターを有する、細菌特に大腸菌の発現系である。細菌の発現系は実際、一般にきわめて高い生産量が得られることを可能にする発現系である。
【００７１】
有利には、トランケート型Ｐタンパク質及び特にＰタンパク質のＣ末端断片は、Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の精製を容易にするタンパク質と融合した形、とりわけアフィニティークロマトグラフィーに使用できるタンパク質と融合した形で発現する。それらのタンパク質は、トランケート型Ｐタンパク質−ＧＳＴ融合タンパク質が、グルタチオンを結合した固体支持体上でのクロマトグラフィーにより単離できる場合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような標識タンパク質であり得る。ポリヒスチジンすなわち「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」のような他の標識又は「タグ」も使用することができる。
【００７２】
こうして、Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質−標識タンパク質複合体（トランケート型Ｐタンパク質、特にＰΔＮ断片と融合したＧＳＴ又は他の標識タンパク質）が得られ、標識タンパク質は酵素切断により除去することができる。例えば、ＧＳＴはトロンビンによる切断により、又は融合体がＧＳＴ以外のタンパク質を含む場合は他の全ての適当な酵素により除去することができる。
【００７３】
本発明による方法の利用を可能にするベクター構築物の具体例を以下の実施例に示す。
【００７４】
可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体
【００７５】
上述したような、可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、特に可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体の調製方法により、単離又は精製された形でＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を容易に得ることを可能にする。
【００７６】
したがって、本発明はまた、本発明の調製方法により得ることが可能な、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体に関するものである。
【００７７】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むか、又はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００７８】
本発明は、さらに具体的には、本発明の調製方法により得ることが可能な、パラミクソウイルス科のウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）に関するものである。
【００７９】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスは、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００８０】
一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている。
【００８１】
さらに具体的には、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びているか、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片を含む
ことができる。
【００８２】
それらの断片は、特に、ＰΔ１２０Ｎ、ＰΔ１５０Ｎ、ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１８０Ｎ、ＰΔ２００Ｎ、ＰΔ２２０Ｎ、ＰΔ２３０Ｎ、及びＰΔ２３３Ｎから構成される群から選択されるＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【００８３】
また、本発明は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、上記に記載のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質を含む、可溶性の複合体に関する。
【００８４】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合により構成され得る。それは、例えば配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸との連結により構成され得る。
【００８５】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは麻疹ウイルスであり、前記Ｐタンパク質の断片は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成されている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である。さらに具体的には、麻疹ウイルスのＰタンパク質の前記Ｃ末端断片は、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５１４番アミノ酸（ＰΔ３８６Ｎ）から構成されていてもよく、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であってもよい。
【００８６】
Ｎ−ＰΔＮ複合体において、タンパク質ＰΔＮは、場合により、例えばＧＳＴ、ヒスチジンタグ、又はＮ−ＰΔＮ複合体の精製を容易にする他のあらゆる適当なタンパク質のような標識タンパク質と融合した形で提供され得る。
【００８７】
ＲＳＶについての複合体生成物の電子顕微鏡分析から、それが１０分子のＮタンパク質を含む環状化合物であり、この可溶性の環はまた、アガロースゲル電気泳動で確認することが可能な約７０塩基の小さなＲＮＡを含むことが明らかになった（図３）。この複合体中には同様の量のＮタンパク質とＰΔＮ−ＧＳＴタンパク質がみられる。ＲＮＡは、このタンパク質を変性させることなくＮタンパク質の環から分離することができない。
【００８８】
このように、本発明はまた、上記で定義したような、１０分子のＮタンパク質を含み、そのうちのそれぞれ又はその多数がＰタンパク質のＣ末端断片と関連し、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片がＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含みＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の単離された可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体にも関する。ＲＳＶのこのＮ−ＰΔＮ複合体は、さらに約７０塩基のＲＮＡを含む。
【００８９】
可溶性Ｎタンパク質を調製する方法
【００９０】
このＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から、又はさらに具体的にはＮ−ＰΔＮから、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）により、可溶性Ｎタンパク質を環状でそのＲＮＡと共に容易に単離することができる。この分離は、必要に応じて、トランケート型Ｐタンパク質と、場合によりトランケート型Ｐタンパク質が融合している標識タンパク質との、酵素切断による分離の後に行うことができる。
【００９１】
したがって、本発明はさらに、
ａ）上記に定義したような方法により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製すること、そして
ｂ）可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法に関する。
【００９２】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むか、またはＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００９３】
本発明は、さらに具体的には、
ａ）上記に定義したような方法により可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）を調製すること、そして
ｂ）可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法に関する。
【００９４】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスは、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００９５】
上記の方法により得ることができるパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質もまた、本発明の一部をなす。
【００９６】
ＲＳＶの場合、利用できる最大のＰタンパク質のＣ末端断片（ＰΔ１６１Ｎ）が１５ｋＤａの分子量を有するのに対し、Ｎタンパク質は４５０ｋＤａの分子量を有する。したがって、Ｎタンパク質の環は、例えば下記の実施例３（及び図２）に記載するようなセファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、Ｐタンパク質のＣ末端断片から分離することができる。
【００９７】
一実施形態によると、本発明はしたがって、可溶性のＲＳＶのＮタンパク質を提案し、この前記Ｎタンパク質は、約７ｎｍの直径を有し１０個のサブユニットを含む環を形成している。しかし、ある種の部分的で１０個より少ないサブユニットを含む環を除外することしかできない。環はさらに約７０塩基のＲＮＡを含む。
【００９８】
ワクチン組成物
【００９９】
ＲＳＶ、さらに一般的にはパラミクソウイルス科のＮタンパク質は、ワクチン接種にとって有益な抗原であるが、現在までのところ、可溶性の形でそれを精製することに誰も成功していない。本発明による方法は、極めて純度が高くかつ極めて均質な、環状構造のＮタンパク質を容易かつ大量に得ることを可能にする。
【０１００】
環状Ｎタンパク質の免疫原性を評価するため、本発明者は、本発明によるパラミクソウイルス科のＮ−ＰΔＮ複合体でマウスに免疫を付与した。ワクチンとして使用するために、Ｎタンパク質とＰΔＮは場合により分離され得るが、この操作は必要なものではなく、ＰΔＮが存在しても弊害はない。
【０１０１】
本発明者は、マウスにＲＳＶのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体でさらに特異的に免疫を付与し、ＲＳＶのＰΔ１６１Ｎポリペプチドをコントロールとして使用した。
【０１０２】
気道に対するこのウイルスの特異性を考慮して、非経口のワクチン接種の従来の方法である皮下経路、及び呼吸粘膜とそれに関連するリンパ組織レベルでの局所的な免疫付与の誘発を可能にする鼻経路の、二つの免疫付与経路を比較した。
【０１０３】
ワクチンアジュバントの不存在下で可溶性の組換えタンパク質に対する免疫応答を得ることが困難なので、本発明者は、粘膜経路でのアジュバント性が報告されている（ＭｃＮｅａｌ ｅｔ ａｌ． ２００２， Ｆｒｅｙｔａｇ ｅｔ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ２００５）、大腸菌（Ｒ１９２Ｇ）の無毒化リンホトキシン（ＬＴ）を共に使用した（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、アメリカ、から取得）。
【０１０４】
免疫応答のパラメーター、（ｉ）血清及び粘液の抗体産生（気管支肺胞洗浄による）、及び（ｉｉ）脾臓又は肺から単離された記憶Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γの産生を介した細胞性免疫応答について追跡した。
【０１０５】
アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下で、Ｎタンパク質（Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体）は、投与経路のいかんにかかわらず（経鼻又は皮下）血清抗体の産生を強く誘導する（図４Ａ）。この応答は最初の免疫付与の後（１４日目）に検出可能であり、二度目の免疫付与の後（２８日目）に増強される。アジュバントはまた、二度目の免疫付与の後にＰΔ１６１Ｎに対する抗体の産生を誘導することを可能にする。
【０１０６】
大いに注目すべきことには、アジュバントの不存在下でのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の経鼻及び皮下投与は、最初の免疫付与からすぐに血清抗体を多く産生させる。同じ条件下でＰΔ１６１Ｎは応答を誘導しない。比較した応答の特徴は、粘液の抗体、総Ｉｇの産生に見られる（図４Ｂ）。
【０１０７】
これに対して、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）存在下でＮタンパク質（Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体）を単独で経鼻投与すると、呼吸粘膜レベルでのＩｇＡ産生を可能にする（図４Ｂ）。
【０１０８】
細胞性免疫応答は、脾臓又は肺の白血球の、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ又はＰΔ１６１Ｎのみの存在下においてＩＦＮ−γをインビトロで産生する能力により測定した。ＩＦＮ−γは、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球により産生されるサイトカインである。ＣＤ４及びＣＤ８記憶Ｔリンパ球は、それらが特異的な抗原の存在下で、インビトロで反応性がある。ＩＦＮ−γは、ウイルスに対する防御における主要なエフェクターであるＴｈ１リンパ球及び細胞傷害性Ｔリンパ球により産生される。
【０１０９】
最も強い応答はＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体による再刺激後に得られる（図５）。抗体の場合のように、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の経鼻又は皮下投与により、Ｎタンパク質に特異的な末梢細胞（脾臓）の免疫性が刺激される。注目すべきことには、アジュバントとともに経鼻経路で投与したＮタンパク質により局所細胞（肺）の免疫が生じる（図５）。
【０１１０】
結論として、環状構造のＮタンパク質は局所応答（呼吸粘膜）を刺激することを含め、強い免疫原性を示す。
【０１１１】
したがって、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を含むワクチン組成物であって、前記可溶性Ｎタンパク質が医薬的に許容される担体中に存在するワクチン組成物を提案する。この可溶性Ｎタンパク質は、特に、上記のような可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、さらに具体的には可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離する方法により得ることが可能である。
【０１１２】
上述したように、可溶性Ｎタンパク質はＰタンパク質との複合体の形で、好ましくない作用を伴わずにワクチン接種に使用され得る。したがって、本発明によるワクチン組成物は、医薬的に許容される担体中にある、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質複合体を含むことができる。
【０１１３】
これら複合体の生産量の問題については、本発明は好ましくは、医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を含むワクチン組成物であって、前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができるワクチン組成物を対象とする。
【０１１４】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片を含むか、又はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【０１１５】
本発明はまた、さらに具体的には、医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体であって、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まず、Ｎタンパク質と相互作用することができる複合体に関する。
【０１１６】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質は、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の可溶性Ｎタンパク質である。
【０１１７】
一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いているＣ末端断片（ＰΔＮ）である。
【０１１８】
さらに具体的には、前記組成物において、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片は、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｃ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
であり得る。
【０１１９】
それらの断片は、特に、ＰΔ１２０Ｎ、ＰΔ１５０Ｎ、ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１８０Ｎ、ＰΔ２００Ｎ、ＰΔ２２０Ｎ、ＰΔ２３０Ｎ、及びＰΔ２３３Ｎから構成される群から選択されるＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【０１２０】
本発明はまた、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、上記のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片をＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質が含んでいる組成物に関する。
【０１２１】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合により構成され得る。それは、例えば配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸との連結により構成され得る。
【０１２２】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは麻疹ウイルスであり、前記Ｐタンパク質の断片は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成されている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である。さらに具体的には、麻疹ウイルスのＰタンパク質の前記Ｃ末端断片は、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５１４番アミノ酸（ＰΔ３８６Ｎ）から構成されていてもよく、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であってもよい。
【０１２３】
「医薬的に許容される担体」は、ヒト又は動物において例えばアレルギーのような副作用を生じさせない、あらゆる溶媒、分散媒、吸収遅延剤等を意味する。
【０１２４】
有利には、本発明によるワクチン組成物はさらにアジュバントを含み得る。「アジュバント」は、同時に投与された抗原に対する細胞性又は液性免疫反応を増大させ、刺激し、活性化し、強化し、又は調節する物質を指す。従来のアジュバントの例は、完全フロイントアジュバント、ＬＰＳ及びそれらの派生物、細菌毒素（コレラ毒素及びエンテロトキシン）及びその無毒化変異体（例えばＬＴ（Ｒ１９２Ｇ））のような細菌抗原、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド配列、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、リン酸カルシウム又はリン酸カリウムのような無機アジュバント、油性エマルジョン及び乳化剤（サポニン、例えばＱＳ２１）、サイトカインを含むアジュバントを含む。
【０１２５】
本発明によるワクチン組成物は、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染に対する防御を提供し、すなわちワクチン組成物により免疫を付与されていない対象と比較してこの感染の影響の程度を軽減する。
【０１２６】
本発明はまた、ワクチン接種方法における上記で定義したようなワクチン組成物の使用に関する。
【０１２７】
したがって、本発明は、少なくとも本発明によるワクチン組成物を対象に投与することを含む、ワクチン接種方法を対象とする。好ましくは、ワクチン接種方法は、対象へのワクチン組成物の最初の投与と、同じ対象に対する前記ワクチン組成物の二度目の投与を含む。二度目の投与は、患者を抗原に再びさらし、より強い二次免疫応答を誘導する。
【０１２８】
「対象」という記載は、パラミクソウイルス科ウイルスによる感染にさらされるか又はさらされるおそれがある、ヒト又はヒトでない動物、例えば鳥、又はウシ、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、サルといった哺乳類を指す。好ましくは、本発明の趣旨の範囲内の対象はヒト又はウシである。
【０１２９】
ワクチン組成物は、有利には、パラミクソウイルス科ウイルスによる感染に対する防御的又は治療的な免疫応答の誘導に有効な量を投与される。用量は当然、検討される有効成分、投与方法、対象の年齢及び状態に依存する。投与量当たりのＮ−Ｐ複合体、Ｎ−ＰΔＮ複合体、又はＮタンパク質は０．１〜２００μｇの間とすることができ、好ましくはワクチン投与量当たり１０〜１００μｇの間である。
【０１３０】
ワクチン組成物は、いかなる経路、特に粘膜経路（例えば眼内、鼻腔内、経口）、又は非経口経路（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、又は腹腔内）によっても投与することができる。
【０１３１】
診断への使用
【０１３２】
場合により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形である、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質は、加えて、前記パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する抗体を検出するための診断用途に使用することができる試薬を構成する。
【０１３３】
したがって、本発明はさらに、上記のような、場合によりＮタンパク質−Ｐタンパク質複合体の形であるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を含む診断試薬に関する。
【０１３４】
前記試薬と適当な検出手段を含む診断キットもまた、本発明の範囲にある。
【０１３５】
本発明はまた、インビトロ又はインビボで前記Ｎタンパク質に対する抗体を検出するための、本発明によるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質の使用を提案する。
【０１３６】
本発明はまた、生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法であって、
ａ）前記生物サンプルとパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とを接触させること、
ｂ）形成されたＮタンパク質／抗体複合体を検出すること
から構成される過程を含み、この複合体の存在が生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に特異的な抗体の存在の指標となる方法に関する。
【０１３７】
生物サンプルは、例えば筋肉、肝臓、心臓、脳などの生検により得られた組織サンプル、又は、例えば血液、血漿、又は脳脊髄液のような生体液のような液体サンプルであり得る。
【０１３８】
複合体の検出は、（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの）クロマトグラフィー又は非変性条件下での電気泳動のような、当業者に周知の常用の手段により実施され得る。
【０１３９】
上記で定義したようなＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法において、生物サンプルと接触させるＮタンパク質は、Ｎタンパク質−Ｐタンパク質複合体の形を有し得る。
【０１４０】
以下の実施例及び図面は本発明の範囲を限定することなく説明するものである。
【０１４１】
図１は、Ｐタンパク質に対するＰタンパク質−Ｎタンパク質の相互作用ドメインの位置決定を示す図である。Ｐタンパク質をＧＳＴに融合し、別のプラスミド上で発現したＮタンパク質と大腸菌内で同時発現させた。
【０１４２】
図２は、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の溶離特性を示している。図２ＡはＴＳＫカラムにおける２２０ｎｍでの溶離特性を示す。図２Ｂはクマシーブルーによる染色後の、種々の断片のアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。１７〜２２の断片はＲＮＡ−環状Ｎタンパク質のみを含んでいる。
【０１４３】
図３は、ＲＳＶのＮタンパク質の環状構造を示している。図３Ａは、Ｐ１６１−２４１により精製した環状Ｎタンパク質−ＲＮＡの電子顕微鏡分析の結果を示す。図３Ｂは、低温顕微鏡による再構築の結果を示す。図３Ｃは、環中に存在するＲＮＡのアガロースゲル上での分析結果を示す。
【０１４４】
図４は、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体に対する抗体の産生を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、粘液性アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下又は非存在下で２０μｇのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体又はＰΔ１６１Ｎを鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）又は皮下投与（ｓ．ｃ．）して、免疫を付与した。二週間後に二度目の投与を行う（１４日目）。マウスを二度目の投与の二週間後に安楽死させる（２８日目）。血清抗体を測定するため、血清を０日目、１４日目及び２８日目に採取する（図４Ａ）。粘液抗体を測定するため、気管支肺胞洗浄を２８日目に行う（図４Ｂ）。Ｎ−ＰΔ１６１Ｎに対する抗体の割合をＥＬＩＳＡにより測定する。データは、平均値±平均値における標準偏差（ｎ＝５）で示し、対数目盛で表示する。
【０１４５】
図５は、ＰΔ１６１Ｎ及びＮ−ＰΔ１６１Ｎに特異的な細胞性免疫応答を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、粘液性アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下又は非存在下で２０μｇのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体又はＰΔ１６１Ｎを鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）又は皮下投与（ｓ．ｃ．）して、免疫を付与した。二週間後に二度目の投与を行う（１４日目）。脾臓と肺を摘出するため、マウスを二度目の投与の二週間後に安楽死させる（２８日目）。脾臓細胞及び肺細胞を、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１６１Ｎの存在下で、又は再刺激を行わずに７２時間培養する。ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡにより測定する。再刺激を行わない場合、ＩＦＮ−γのベースレベルは１５ｐｇ／ｍｌ未満である。データは、平均値±平均値における標準偏差（ｎ＝５）で示す。
【実施例１】
【０１４６】
ＲＳＶのリンタンパク質のＣ末端領域を含むプラスミドの構築
【０１４７】
ＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質は２４１個のアミノ酸残基から構成される。
【０１４８】
ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端部分を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー配列（５’から３’）（ＢａｍＨＩ制限部位に下線を付し、Ｐタンパク質遺伝子の「開始」コドンＡＴＧは太字で表す）は以下である。
【０１４９】
【０１５０】
ＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質遺伝子のｃＤＮＡを、プライマーＬＯＮＧ−ＰＢａｍ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を用い、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株に感染させたＨｅｐ−２細胞からＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼすなわちＧＳＴをコードする遺伝子とクローニングした。このプラスミドをｐＧＥＸ−Ｐと称する。
【０１５１】
・Ｐ１６１−２４１（ＰΔ１６１Ｎ）のクローニング
Ｐタンパク質のＣ末端領域（１６１〜２４１番アミノ酸）を、以下の条件でプラスミドｐＧＥＸ−ＰからＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲプライマー：Ｐ１６１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−を各１００ｎｇ（各１μｌ）
ｐＧＥＸ−Ｐの鋳型ＤＮＡ：１０ｎｇ（１μｌ）
酵素：ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標）（μｌ当たりのユニット）：１μｌ
ｄＡＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＣＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＴＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
最終濃度１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
最終容量：１００μｌ
ＰＣＲは以下の条件下で実施した。
９４℃で１５秒、４０℃で２分、７２℃で１分を５サイクル、
９４℃で１５秒、５５℃で１分、７２℃で１分を２５サイクル
【０１５２】
増幅したＤＮＡを１体積のフェノール／クロロホルム（１体積／１体積）（１００μｌ）、次いで１体積のクロロホルムで抽出し、最後に１０分の１体積の５ＭのＮａＣｌ（１０μｌ）と２体積の１００％エタノール（２００μｌ）を加えて沈殿させた。ＤＮＡを１３０００ｇで２０分間遠心し、１体積の７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１体積の水９０μｌ中に再懸濁した。１０×ＢａｍＨＩ酵素緩衝液を１０μｌ加えたのち、ＤＮＡを１０ユニットのＢａｍＨＩ酵素の存在下で３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを、エチジウムブロマイドの存在下で、１×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）中の１．５％アガロースゲル上に置き、電気泳動した。Ｐ１６１−２４１のＤＮＡに対応するバンドを切り取り、ＤＮＡを電気溶出により抽出した。それをさらに１体積のフェノール−クロロホルム、１体積のクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿した。それを、１％アガロースゲルにおける精製の後、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターにライゲーションした。
ｐＧＥＸ４Ｔ−３のＤＮＡ：１００ｎｇ
Ｐ１６１−２４１のＤＮＡ：１００ｎｇ
最終濃度１×リガーゼ緩衝液
リガーゼ（５Ｕ／μｌ）：１μｌ
最終体積２０μｌ
【０１５３】
全体を１４℃で一晩インキュベートした。翌日、適当な細菌ＤＨ５−アルファＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０μｌのライゲーション産物で形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬ−寒天培地を含むペトリ皿上に塗布した。組換え細菌のコロニーをプラスミドのミニプレップと制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによる消化でスクリーニングした。組換えプラスミドはアガロースゲル上で、一方はベクター（４．９ｋｂ）に対応し、もう一方はＰタンパク質のＣ末端部分（２４６ｂｐ）に対応する、二つのバンドを示す。組換えプラスミド全体を配列決定した。
【０１５４】
・Ｐ１８０−２４１、Ｐ２０１−２４１、Ｐ２２１−２４１のクローニング
１８０〜２４１、２００〜２４１、２２０〜２４１番アミノ酸部分に対応するＰタンパク質の断片を、以下のプライマーを用いてｐＧＥＸ−ＰプラスミドからＰＣＲにより得た。
Ｐ１８０−２４１：プライマーＰ１８０Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ
Ｐ２００−２４１：プライマーＰ２０１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−
Ｐ２２０−２４１：プライマーＰ２２１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−
【０１５５】
これらを、Ｐ１６１−２４１（上記参照）と同様に増幅しクローニングした。
【０１５６】
・ＲＳＶのＬｏｎｇ株のヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子のクローニング
ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＮタンパク質をコードする遺伝子を、そのウイルスに感染したＨｅｐ−２細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得た。使用したプライマーは、
ＬＯＮＧ−Ｎｂａｍ＋：ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧ（配列番号１９）
ＬＯＮＧ−Ｎ−：ＴＴＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＧ（配列番号２０）
であった。
【０１５７】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位においてクローニングした。ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩでｐＧＥＸ−Ｎプラスミドを消化して、Ｎタンパク質（配列番号）をコードする領域をｐＥＴ２８＋プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、配列番号及び図面参照）中にサブクローニングした。
【０１５８】
・Ｐ２３１−２４１のクローニング
以下のプライマーを９４℃で５分間加熱して変性させ、室温で冷却した。
Ｐ２３１ＮＢ＋：ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＴＧＡ（配列番号２１）
Ｐ２３１Ｎ−：ＴＣＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＣＧ（配列番号２２）
【０１５９】
ハイブリダイズ後、１０ｎｇの二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩ酵素及びＳｍａＩ酵素で消化しアガロースゲル上での電気泳動により精製した、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３プラスミドのＤＮＡ１００ｎｇとライゲーションした。組換えプラスミドは、Ｎタンパク質遺伝子に関して配列決定することにより確認した。
【実施例２】
【０１６０】
複合体の発現と精製
【０１６１】
適当な細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＧＥＸ−ＰΔのＤＮＡ１μｇとｐＥＴ−ＮのＤＮＡ１μｇで形質転換し、次いで最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと最終濃度５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したＬ−寒天培地を含むペトリ皿に塗布した。コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ培地に移植し、３７℃で一晩生育させた。翌朝、コンフルエントな状態の培養物１ｍｌを、抗生物質を添加した１リットルのＬＢ培地に播種し、夕方まで生育させた。夕方に、１６０μｇ／ｍｌの濃度のＩＰＴＧ（タンパク質の発現を誘導する）を含む１体積の新鮮なＬＢ培地を培養物に加え、全体を２８℃で一晩生育させる。翌日、細菌を５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ペレットを１００ｍｌの以下の緩衝液中に再び入れる。
５０ｍＭのトリス（ＰＨ７．８）
６０ｍＭのＮａＣｌ
２ｍＭのＤＴＴ
１ｍＭのＥＤＴＡ
４ｍＭのベンズアミジン
１×アンチプロテアーゼ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ、参照番号１１８７３５８０００１）すなわち５０ｍｌの溶解緩衝液に対して一錠
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
【０１６２】
１０ｍｇ／ｍｌ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）のリゾチームを添加した同様の緩衝液１０ｍｌを加える。細菌を氷中で１時間インキュベートする（溶解）。全体が粘性になったら、全体を、混合物中に入れたプローブを用いて氷中で１分間の超音波処理を３回行い、各超音波処理の間に５分間放置する。全体を４℃、１００００ｇで３０分間遠心し、次いで上清を回収する。上清を４℃、１００００ｇで３０分間再び遠心し、次いで新たに上清を回収する。８ｍｌのビーズ緩衝液（体積／体積）混合物を回収して４ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解緩衝液で洗浄する。同量の緩衝液中にビーズを置き、澄ました細菌溶解液を加え、４℃で一晩回転させる。翌日、ビーズを２０００ｒｐｍで３分間遠心し、次いで上清を除去し、ビーズを、アンチプロテアーゼを含まない溶解緩衝液で三回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液で三回洗浄する。
【０１６３】
ビーズを、ビオチン化したＴｈｒｏｍｂｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をビーズ１ｍｌ当たりトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、 Ｎｏ．６９０２２−３ＦＲＺ）１μｌ（１Ｕ）の比率で用いて、トロンビン部位で切断する。ビーズを２０℃で一晩インキュベートし、翌日、２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を回収するため１５分間沈殿させる。等量の１×ＰＢＳをビーズに加え、混合物を攪拌し沈殿させる。上清を新たに回収し、あらかじめ採取しておいた上清に加える。回収した上清にストレプトアビジンアガロースビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号６９２０３）を樹脂１６μｌ（すなわち樹脂／緩衝液混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）３２μｌ）の割合で加える。混合物を一時間攪拌し、次いで２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を回収する。タンパク質濃縮物２ｍｇ／ｍｌを得る。
【０１６４】
切断産物を含む１０μｌの上清を、１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で変性し、沸騰させ、０．１％トリス−グリシンＳＤＳ緩衝液中の１２％ポリアクリルアミドゲル上に置き、次いでタンパク質を可視化するために、電気泳動後にクマシーブルーで染色する。
【実施例３】
【０１６５】
Ｎタンパク質とＰΔ１６１Ｎ（Ｐ１６１−２４１）の分離及びＮタンパク質の環の精製
【０１６６】
上清中に存在するタンパク質は、１×ＰＢＳ中におけるサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過、図２）により分離することができる。Ｎタンパク質は４５００００Ｄａの見かけのサイズで、ＰΔ１６１Ｎは１５ｋＤａの分子量で排除される。
【０１６７】
サイズ排除クロマトグラフィーにより得られた「Ｎタンパク質」画分を電子顕微鏡により観察した結果、Ｎタンパク質は、直径７ｎｍを有しＮタンパク質のサブユニットを１０個含む（図３Ｂ）、環の形（図３Ａ）であることが分かった。環は約７０ｂｐのＲＮＡを含む（図３Ｃ）。
【実施例４】
【０１６８】
環状構造の組換えＮタンパク質の免疫原性の評価
【０１６９】
・経鼻投与又は皮下投与によるワクチン接種を、アジュバントの存在下又は非存在下でマウスで実施する。
マウス：ｌ’Ｕｎｉｔｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ Ｒｏｎｇｅｕｒ（ＩＮＲＡ、Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ）で育成した１０〜１２週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス３０頭
抗原：トロンビンでの切断によりＧＳＴを分離し、ストレプトアビジンと結合したビーズによりビオチン化トロンビンを除去した後の、濃度１ｍｇ／ｍｌの可溶性のＰ１６１−２４１及び｛Ｐ１６１−２４１＋Ｎ｝複合体
アジュバント：１ｍｇ／ｍｌの、大腸菌のリンホトキシンＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）
サンプル採取
−０日目、１４日目及び２８日目に、眼窩後洞から血液を採取
−２８日目：
・１．５ｍｌのＨＢＳＳ培地及び１ｍＭのＥＤＴＡによる気管支肺胞洗浄物（ＬＢＡ）
・氷上での、抗生物質（１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ＰＳ）を加えたＲＰＭＩ培地における脾臓と肺の解剖
【０１７０】
実験計画：
【表１】
【０１７１】
・抗Ｎタンパク質抗体の産生
血清を血液から採取し（４℃で一晩滲出）、次いで−２０℃で凍結する。
【０１７２】
ＬＢＡを１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を集め（約１ｍｌ）、−２０℃で凍結する。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡにより血清及びＬＢＡにおける抗Ｎタンパク質抗体（総Ｉｇ、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＡ）を調べる。９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）において、Ｐ１６１−２４１＋Ｎタンパク質複合体（ウェル当たり２００ｎｇ）により４℃で一晩感作する。プレートをウェル当たり２００μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄する（自動装置Ｗｅｌｌｗａｓｈ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓを使用）。次にプレートを、３７℃で１時間、ウェル当たり１５０μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０及び５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳ）で満たす。５回洗浄した後、滴定サンプルをＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳで希釈する（血清については最初の希釈度から１／３０になるまで３倍の連続希釈を７回行い、ＬＢＡについては１／３になるまで行う）。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。５回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳで希釈した二次抗体をウェル当たり１００μｌの割合で添加する。使用する二次抗体は、ペルオキシダーゼと結合しており、マウスの免疫グロブリン、総ＩｇＧ（１／４０００、ＰＡＲＩＳ）、ＩｇＧ１（１／２０００、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｇＧ２ａ（１／２０００、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＩｇＡ（１／１０００、Ｃａｌｔａｇ）に対するものである。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、５回洗浄する。次にプレートをペルオキシダーゼの基質（ＴＭＢ、ウェル当たり１００μｌ）と共に１０分間暗所でインキュベートする。２ＭのＨ３ＰＯ４を５０μｌ加えて酵素反応を停止する。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取る（読み取り装置Ｄｙｎｅｘ）。ＯＤ４５０＝ｆ（希釈度）の曲線を、回帰曲線ｙ＝（ｂ＋ｃｘ）／（１＋ａｘ）によりモデル化する。抗体の力価は、最大限に希釈されたコントロールサンプル（０日目）の二倍のＯＤ４５０を示す希釈値として決定する。
【０１７４】
・Ｐ１６１−２４１及びＮタンパク質に特異的なＴリンパ球によるＩＦＮ−γの産生
摘出した脾臓及び肺を同じ手順で処理する。脾臓は個別に処理し、肺は実験群にグループ化する（群当たり５個の肺）。
【０１７５】
組織を薄切りにし、次いでＲＰＭＩ培地及びＰＳ培地中において、篩上（１００μｍのセルストレーナー、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）で注意深く破砕する。細胞懸濁液を１７００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心する。細胞を１ｍｌの赤血球溶解緩衝液（低張生理食塩緩衝液）中に懸濁し、室温で５分間インキュベートする。溶解反応は、１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ（ＰＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ＦＢＳ）を添加することにより停止する。膜の破片を沈殿させ、細胞を遠心（１７００ｒｐｍで１０分間、４℃）により３回洗浄する。細胞懸濁液を、Ｍａｌａｓｓｅｚの計算盤を用いて計数する。
【０１７６】
細胞を、細胞培養用に処理された９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で、２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地においてウェル当たり２０００００個の細胞の比率で培養する。
【０１７７】
各細胞懸濁液に対して、四つの培養条件を三回試験する。
−１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール１２ミリステート１３アセテート、Ｓｉｇｍａ）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）（ポジティブコントロール、ポリクローナル活性化）
−完全ＲＰＭＩ（ネガティブコントロール）
−１０μｇ／ｍｌのＰ１６１−２４１
−１０μｇ／ｍｌのＰ１６１−２４１＋Ｎ
【０１７８】
５％ＣＯ２下において３７℃で７２時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γを滴定するまで−２０℃で凍結する。
【０１７９】
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ：９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、 ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの重炭酸緩衝液（１００μｌ／ウェル）（ｐＨ９．５）中で、４μｇ／ｍｌのマウス抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で一晩感作する。プレートをウェル当たり２００μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで５回洗浄する（自動装置Ｗｅｌｌｗａｓｈ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓを使用）。次にプレートをウェル当たり１５０μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０及び２％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ）を加えたＰＢＳ緩衝液で、３７℃で２時間、コンフルエントな状態にする。５回洗浄した後、参照用の組換えマウスＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び滴定サンプルをＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで二倍連続希釈により希釈する。ＩＦＮ−γの希釈範囲は３３１２．５ｐｇ／ｍｌから３．２３５ｐｇ／ｍｌまでとする。四回の二倍連続希釈を純粋なサンプルに対して行う。続いてプレートを４℃で一晩インキュベートする。５回洗浄した後、ビオチン化した検出抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中に１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、４℃で３時間インキュベートする。５回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中に１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、４℃で１時間インキュベートする。５回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質（ＡＢＴＳ＋Ｈ２Ｏ２）をウェルに添加する。４５分間のインキュベーションの後、光学密度を４０５ｎｍで読み取る（読み取り装置ＥＬＩＳＡ Ｄｙｎｅｘ）。サンプルのＩＦＮ−γ濃度の計算は、ＩＦＮ−γの希釈範囲との比較から行う。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】Ｐタンパク質に対するＰタンパク質−Ｎタンパク質の相互作用ドメインの位置決定を示す図である。
【図２】サイズ排除クロマトグラフィーにおけるＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の溶離特性を示す図である。
【図３】ＲＳＶのＮタンパク質の環状構造を示す図である。
【図４】Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体に対する抗体の産生を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示す図である。
【図５】ＰΔ１６１Ｎ及びＮ−ＰΔ１６１Ｎに特異的な細胞性免疫応答を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示すグラフである。
【０１８１】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法、こうして調製した複合体、さらにこの複合体から単離することが可能な可溶性Ｎタンパク質に関する。また、本発明はパラミクソウイルス科のこのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体又はＮタンパク質を含むワクチン組成物に関する。好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【背景技術】
【０００２】
フランスでは、大部分の国と同様、ウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が、７０％以上の農場内の仔牛における、また約７０％の生後一年までの仔牛における重い呼吸器疾患（細気管支炎、肺炎）の主要な原因となる因子となっている（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９、 Ａｍｅｓ， １９９３、 Ｅｌｖａｎｄｅｒ， １９９６）。死亡率は２０％に達する（Ｗｅｌｌｅｍａｎｓ， １９９２）。これは、毎年冬のこの疾患の定期的な発生を止める術がない飼育業者にとって大きな悩みの種である。したがって、有効な予防法の開発という課題に対して牧畜業者の強い要求がある。ワクチンは市販されているが、実際、効果は少ないか、または効果が見られない。
【０００３】
ヒトにおいても同じ疾患が存在する。それは新生児の細気管支炎の原因となる因子である（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ、第７巻、２００３年１０月特別号、ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｅｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｅ参照）。このヒトの疾患についてのデータは極めて詳細である。ウシと同様、フランスでは、ヒトにおいて、それは冬に流行する疾患である。生後一年の間に、乳児の７０％がＲＳＶに感染し、生後二年の間に１００％が感染する。これは、フランスでは毎年５００，０００人の小児が感染していることを意味する。感染した乳児の２０％で下気道の疾患（細気管支炎）が生じ、フランスにおいては入院率が２〜５％であり、それは８〜９日間にわたり、未熟児の１０〜２５％、肺異形成の場合では１４〜４５％、先天性心異常の場合では１５〜２５％で下気道の疾患が生じる。入院患者の約１０％が集中治療室で治療されなければならない。死亡率は０．１％に近い。世界保健機関の最近の報告によれば、毎年世界で６４００万人が感染し１６０，０００人がＲＳＶにより死亡すると推定されている。アメリカでは毎年１８，０００〜７５，０００人が入院し、２，０００人近くが直接的に、１７，０００人が間接的に死亡している（Ｍａｇｏｎ ａｎｄ Ｂａｒｉｋ，２００４）。ＲＳＶはまた、成人におけるインフルエンザ症状の原因の３分の１を占める。実際、ＲＳＶにより小児の４倍の高齢者が死亡すると推定されている。全体では、ＲＳＶにより年間３００万〜５００万人が死亡する。さらに、極めて若い年齢（生後４か月前）で罹患した成人において、まだ明らかでない複雑な免疫機構により、この疾患はぜんそくを起こすリスクを増加させると考えられる。
【０００４】
たとえヒトＲＳＶ及びウシＲＳＶが異なる二種のウイルスであるとしても、構造的、分子的、抗原的側面、またそれらが誘発する疾患（臨床像、感染の季節性、若年者の感染）が等しいこと、そして、非常に高価であるため稀にしか使用されないモノクローナル抗体と、効果が弱く細胞内で実際にＡＴＰを消費してしまい毒性が強い抗ウイルス剤の他には有効なワクチンも抗ウイルス剤も存在しないという事実から、それらは極めて近いものである。
【０００５】
１９６０年代に、ホルマリンで固定したウイルスを用いた、幼い小児に対するワクチン接種の試験がアメリカで行われた。結果は悲惨なものであり、ワクチン接種を受けた小児は数ヵ月後のウイルスの自然感染の際に激しい症状を発し、しかもそのうちの数人は死亡する結果となった。
【０００６】
この不幸な試験の後、この疾患に対するヒト用のワクチンは未だ存在しておらず、また、たとえフランスにおいてこの課題について本格的な研究がなされていなくても、ウシ用の市販ワクチンの効果は極めて疑わしい。しかし、複数のワクチンが、ウシにおけるワクチン接種後の事故の後に市場からなくなった。
【０００７】
ＲＳＶに対するワクチンの開発の困難性は、次のような理由により説明することができる。
（１）ＲＳＶに対する局所的免疫記憶が短期的であるため、自然感染は再感染に対する防御免疫を付与しないこと、
（２）強い細胞性免疫及び液性免疫の誘導が、疾患の重篤さの増大と関連すること（ワクチン接種による感作）、
（３）経粘膜投与で効果的なワクチン接種を可能にする、アジュバント又はワクチン戦略が存在しないこと、
（４）新生児（生後２ヵ月以内）がワクチン接種の主要な対象であるが、彼らの免疫系は従来のワクチンに対する反応が悪いこと、
（５）感染を防がない移行抗体が血液中に存在すること、
（６）流行しているウイルス株が変化すること。
【０００８】
サブユニットワクチンが開発されつつあり、そのいくつかはＧ表面タンパク質に基づいている。新しいタイプのワクチンは逆遺伝学によって（すなわち遺伝的修飾による株の弱毒化によって）得られ、ＢＲＳＶと同様ＨＲＳＶに対しても数年前から開発されている。目下のところ、ヒトに対する弱毒株の使用は確認されていない。これはおそらく弱毒株の免疫応答が弱いためであろう。
【０００９】
仔牛に対するものも含めて、ＨＲＳＶ又はＢＲＳＶのＦ膜タンパク質及びＧ膜タンパク質に基づくＤＮＡワクチンが開発中である（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． ２００５、 Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ． １９９９）。このタイプのワクチンはいくつかの免疫病理学的研究に関連する防御免疫を付与する。このワクチンの効果は改良の余地がある。
【００１０】
ＲＳＶは、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムを有するエンベロープウイルスである。このＲＮＡは１１個のタンパク質をコードし、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質によりカプシドに包まれ、Ｌ（ラージ）つまりポリメラーゼとコファクターＰ（リンタンパク質）の二つのタンパク質から成る、ポリメラーゼ複合体と関連する（図１）。この分子は、ＰによりＬがゲノムＲＮＡを認識することが可能になるという、ポリメラーゼの機能における重要な役割を有する。さらにＲＳＶには二つのコファクターＭ２−１及びＭ２−２が存在し、これらはプロセシング（Ｍ２−１）及び転写／複製バランスの調節（Ｍ２−２）において役割を有する。
【００１１】
ウイルス粒子の表面上には二つの主要なＦタンパク質及びＧタンパク質がある。Ｆタンパク質はウイルスのエンベロープと細胞膜の融合を可能にし、合胞体の形成に関与する。Ｇタンパク質はウイルスが細胞の表面に付着することを可能にする。Ｍタンパク質（マトリックス）はウイルスのエンベロープとポリメラーゼ／ゲノム複合体の仲介をする。Ｆ表面タンパク質及びＧ表面タンパク質の二つのタンパク質は、中和抗体の標的であるため、ＲＳＶの主要な免疫原性タンパク質である。
【００１２】
しかし、マウスについてなされた研究は、Ｇタンパク質がＴｈ２型の免疫病理学的ワクチン反応（ＩＬ−４とＩＬ−５の産生及び好酸球の集合）の誘発に関与することを示した（Ｓｐａｒｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。それに対して、ウシの場合には、これら二つのタンパク質のいずれも免疫病理学的応答に関与せず、これらの二つのタンパク質は防御応答の確立を可能にする（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。
【００１３】
現在、新規なワクチン候補の研究は、多数がＦタンパク質及びＧタンパク質に関するものである。
【００１４】
しかし、ヒト及びウシにおいては、細胞を介する免疫、特に細胞傷害性Ｔ細胞の応答は、ＲＳＶに対する防御の不可欠な構成要素である。ウシの場合と同様ヒトの場合以外では、Ｎタンパク質が細胞傷害性Ｔ細胞の応答の主要な基礎である（Ｇｏｕｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。仔牛がＲＳＶに対するワクチン接種に適切なモデルである。ＲＳＶのＮタンパク質を発現する組換えワクチンを使用すると、免疫応答のバランスの回復を可能にする細胞型（Ｔｈ１）の応答が生じることが示されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｇａｄｄｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、現在の研究全体が、複数のタンパク質、特にＦ表面タンパク質及びＧ表面タンパク質並びに内部のＮタンパク質の組み合わせで構成される抗ＲＳＶワクチンに有利に働く。
【００１５】
Ｎタンパク質は、感染細胞で最も多く発現するタンパク質であり、ウイルス粒子中で量的観点から最も重要なタンパク質の一つである（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。それは、一本鎖ＲＮＡから構成されるウイルスゲノムを包囲し、大きなサイズのらせん構造を形成している。それが組換え体の形で単独で発現した時、Ｎタンパク質は非特異的に細胞ＲＮＡ上に重合する。それらはそこで極めて巨大な、不溶性で精製不可能な、感染細胞で見られるヌクレオカプシドに似たらせん構造（ＲＮＡ／Ｎ）を形成する（Ｍｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９４、 Ｂｈｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。
【００１６】
このＮタンパク質は、ウイルスポリメラーゼＬのコファクターであるＲＳＶのＰタンパク質と相互作用することができる。ツーハイブリッド法と免疫沈降法を主として使用する相互作用ドメインの位置決定の研究が、様々なグループにより行われたが、スクリーニングの結果は否定的（相互作用は認められない）であった。ヒトウイルス又はウシウイルスのＰタンパク質のＣ末端ドメインはＮタンパク質との相互作用において重要な役割を有する疑いがあった（Ｇａｒｃｉａ Ｂａｒｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６、 Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６、 Ｓｌａｃｋ ａｎｄ Ｅａｓｔｏｎ， １９９８、 Ｋｈａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１ａ， ２００１ｂ）。しかし、ツーハイブリッドシステムはＮタンパク質とＰタンパク質との間の相互作用の実際の性質を反映しないことが分かった（Ｋｈａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１ａ）。その上、Ｐ−Ｎ複合体の正確な性質（各分子の数又は化学量、構造）は報告されておらず、相互作用のドメインは明示されても特徴を明らかにされてもいない。
【００１７】
パラミクソウイルス科に属する近縁のウイルス（センダイウイルス、麻疹ウイルス）についてなされた研究から、Ｐタンパク質は、Ｎタンパク質と共にＮ°Ｐと呼ばれる可溶性複合体を形成し、細胞ＲＮＡに自身が非特異的に固定することを防ぐとの考えが導かれた（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。Ｐタンパク質は、ＰがＬのコファクターとして作用してＬがその基質を「発見する」ことを可能にするため、Ｎタンパク質によりカプシドに包まれたＲＮＡから形成されるヌクレオカプシドを認識することもできる。
【００１８】
パラミクソウイルス科については、二つの相互作用ドメインがＰ上に発見されている。一方は、タンパク質のＣ末端の位置にあり、Ｎ−ＲＮＡ複合体を認識するドメインを構成し、もう一方は、Ｎ末端の位置にあり、Ｎ°Ｐ複合体の形成を可能にする（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＲＳＶについては、これらの複合体は明確に同定されておらず、Ｎと相互作用するＰタンパク質のＣ末端ドメインの役割は明確に定義されていない。
【００１９】
現在まで、Ｎタンパク質に基づくサブユニットワクチンの開発は、可溶性の形でＮタンパク質を単離することが困難なため不可能であった。
【００２０】
最近、本発明者は、細菌におけるＰタンパク質及びＮタンパク質の同時発現系を開発し、これをパラミクソウイルス科のＲＳＶのモデルとして選んだ（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。Ｐタンパク質は、アンピシリン耐性を有するプラスミドにおいてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させ、Ｎタンパク質はカナマイシン耐性を有するプラスミド中にクローニングした。同じ細菌中におけるこれらプラスミドの同時発現により、融合タンパク質ＧＳＴ−Ｐを精製すること及びＮタンパク質を伴わせることが可能になった。
【非特許文献１】Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ Ｄ， Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｐ， Ｉｓｅｎｉ Ｆ， Ｇａｒｃｉｎ Ｄ． ２００４． Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｙｍｎａｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； ３１８（２）：４６３−７３． Ｒｅｖｉｅｗ．
【非特許文献２】Ｃａｓｔａｇｎｅ， Ｎ．， Ａ． Ｂａｒｂｉｅｒ， Ｊ． Ｂｅｒｎａｒｄ， Ｈ． Ｒｅｚａｅｉ， Ｊ．−Ｃ． Ｈｕｅｔ， Ｃ． Ｈｅｎｒｙ， Ｂ． Ｄａ Ｃｏｓｔａ， ａｎｄ Ｊ．−Ｆ． Ｅｌｅｏｕｅｔ． ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｐ−Ｐ ａｎｄ Ｐ−Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ； ８５： １６４３−１６５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、依然として溶解性の問題が間違いなく存在するため、可溶性の形でのＮタンパク質の生産量が、工業的規模におけるこの系の実施を検討するには依然として著しく不十分である。その上、こうして生産されたＮタンパク質の性質も明らかにされなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、Ｐタンパク質のＮ末端が欠失した突然変異体とＲＳＶのＮタンパク質との同時発現により、完全なＰタンパク質で得られる場合と比較して格段に多い量のＮタンパク質を精製することが可能になるということを明らかにした。
【００２３】
定義
「パラミクソウイルス科」なる科は、パラミクソウイルス亜科とニューモウイルス亜科に再分類される。パラミクソウイルス亜科は、プロトタイプがセンダイウイルスであるレスピロウイルス属、そして、ルブラウイルス属（特に流行性耳下腺炎ウイルス）、及び麻疹ウイルスのようなモービリウイルス属を含む。レスピロウイルス属とルブラウイルス属の各属は、パラインフルエンザウイルス株を構成する。ニューモウイルス亜科は、ニューモウイルス属とメタニューモウイルス属の二つの属に再分類され、後者はヒトメタニューモウイルスを含む。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、ニューモウイルス亜科に属するニューモウイルス属のプロトタイプのウイルスを構成する。ニューモウイルス属はまた、ウシＲＳＶ株及びマウスＲＳＶ株を含む。
【００２４】
他に明言しない限り、「呼吸器合胞体ウイルス」は通常、考えられるあらゆる形態（ヒト、ウシ・・・）、サブグループ（例えばヒトＲＳＶで同定されているサブグループＡ、Ｂ及びＳ）又は株であるＲＳＶを指す。
【００２５】
「Ｐタンパク質」という記載は、パラミクソウイルス科ウイルスのポリメラーゼ複合体から得られるリンタンパク質すなわちＰタンパク質を指す。Ｐタンパク質はウイルスポリメラーゼ（レプリカーゼ／トランスクリプターゼ）のコファクターであり、リン酸化され得る。パラミクソウイルス科のＰタンパク質の配列は当業者に知られている。例えば、ヒトＲＳＶのＬｏｎｇ株のＰタンパク質は２４１個のアミノ酸からなる配列を有し、これは受託番号Ｐ１２５７９でＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに寄託されている。この配列は、配列番号１に示されている。ウシＲＳＶのＰタンパク質も同様に２４１個のアミノ酸からなる（配列番号２３）。センダイウイルス（Ｈａｒｒｉｓ株）、麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）、流行性耳下腺炎ウイルス（ＳＢＬ−１株）、及びヒトメタニューモウイルス（００−１株）のＰタンパク質も同様に、受託番号Ｐ０４８５９（配列番号２）、ＣＡＡ９１３６４（配列番号３）、Ｐ１９７１７（配列番号４）、及びＱ９１ＫＺ５（配列番号５）でそれぞれＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに登録されている。「Ｐタンパク質」という記載は、完全なＰタンパク質、トランケート型Ｐタンパク質、又はＰタンパク質の断片を示し得る。
【００２６】
パラミクソウイルス科のＰタンパク質は、例えばセンダイウイルス又はＲＳＶの場合、ホモオリゴマー特にホモテトラマーを形成する。ＲＳＶについては、オリゴマー化（Ｐ−Ｐオリゴマー化）することが可能なＰタンパク質のドメインは、このタンパク質の１２０〜１５０番アミノ酸のところに位置決定されている（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。したがって、例えば、ＲＳＶのＰタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸で構成される断片はオリゴマーを形成しない。センダイウイルスのＰタンパク質のオリゴマー化ドメインは、Ｔａｒｂｏｕｒｉｅｃｈら（２０００）により、Ｐタンパク質の３２０〜４４６番残基で構成されるものとして報告されている。他方、麻疹ウイルスのＰタンパク質については、Ｐタンパク質のオリゴマー化領域は３０４〜３７６番アミノ酸のところに同定されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。
【００２７】
「トランケート型Ｐタンパク質」という記載は、連続する一つ又は複数のアミノ酸配列が欠失したＰタンパク質を指す。それらの欠失は、Ｐタンパク質の一次配列に関する、Ｃ末端配列、Ｎ末端配列、及び「内側」配列のトランケーション、又はこれらのトランケーションの組み合わせであり得る。
【００２８】
本発明によるトランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まず、Ｎタンパク質と相互作用することができる。パラミクソウイルス科のＰタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインがＣ末端のところに位置決定されたので、トランケート型Ｐタンパク質の例は好ましくは、Ｐタンパク質のＣ末端断片、又はＰタンパク質のＣ末端断片（Ｎタンパク質と相互作用することができる）とＰタンパク質の連続する少なくとも一つの他のアミノ酸配列との融合により構成された「キメラ」Ｐタンパク質を含む。前記Ｃ末端断片と前記Ｐタンパク質の他の配列は、それ自体は天然に連続しておらず、その中に配列のオーバーラップは存在しない。例えば、ＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は天然Ｐタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸から構成される配列を有し得る。参照ポリペプチドの「断片」は、参照ポリペプチド配列中に見られるあらゆる連続したアミノ酸配列を指す。
【００２９】
「Ｐタンパク質の断片」又は「ＰΔ」は、配列がＰタンパク質のアミノ酸鎖からなり、Ｐタンパク質の連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端及び／又はＣ末端の末端から欠失しているポリペプチドを指す。
【００３０】
「Ｐタンパク質のＣ末端断片」又は「ＰΔＮ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を指す。好ましくは、Ｐタンパク質のＣ末端断片はＰタンパク質の一次配列のＣ末端側の半分にあるアミノ酸鎖を指す（配列のアミノ酸の数が奇数の場合には、Ｎ末端側の半分との兼ね合いで、一個の追加のアミノ酸をタンパク質のＣ末端側の半分に任意に加えることができる）。例えば、２４１個のアミノ酸を含むＲＳＶのＰタンパク質では、ＰΔ１６１ＮはＰタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸により構成されるＣ末端断片を指す。同様に、例えば、５０７個のアミノ酸からなる麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）のＰタンパク質では、ＰΔ３８６ＮはＰタンパク質の３８６〜５０７番アミノ酸により構成されるＣ末端断片を指す。
【００３１】
「Ｐタンパク質のＮ末端断片」又は「ＰΔＣ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＣ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を意味する。
【００３２】
「Ｐタンパク質の内側断片」又は「ＰΔＮＣ」は、連続する一つ又は複数のアミノ酸がＮ末端の末端から欠失し、かつ連続する一つ又は複数のアミノ酸がＣ末端の末端から欠失しているＰタンパク質を意味する。
【００３３】
「Ｎタンパク質」は、ウイルスゲノムを囲むためにらせん構造を形成している、パラミクソウイルス科のヌクレオカプシドタンパク質を指す。ヒトＲＳＶのＬｏｎｇ株のＮタンパク質は、３９１個のアミノ酸からなる配列を有し、これは配列番号６に示されている。ウシＲＳＶのＮタンパク質も同様に３９１個のアミノ酸からなる（配列番号２４参照）。センダイウイルス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ株）、麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株）、流行性耳下腺炎ウイルス（ＳＢＬ−１株）、及びヒトメタニューモウイルス（００−１株）のＮタンパク質も同様に、受託番号Ｑ９ＤＵＥ３（配列番号７）、受託番号Ｑ８９９３３（配列番号８）、受託番号Ｐ２１２７７（配列番号９）、及び受託番号Ｑ９１Ｆ５７（配列番号１０）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにそれぞれ登録されている。
【００３４】
上記Ｐタンパク質及びＮタンパク質の配列は例示的な特徴を有し、これらの配列は所与のウイルスについて考えられる特定の株に応じて変化する可能性がある。このように、本出願の明細書の以下に記載されるアミノ酸の位置はこれらの参照配列について示したものである。当業者は、これらの例示以外のウイルス株における対応するドメインを完全に同定することが可能である。
【００３５】
パラミクソウイルス科ウイルスのこれらのＮタンパク質及びＰタンパク質をコードする配列も当業者に知られている。
【００３６】
「タグタンパク質」とも呼ばれる「標識タンパク質」は、関心のあるタンパク質と融合して精製を容易にするために使用されるタンパク質を指す。標識タンパク質は当業者に知られている。標識タンパク質の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又は４〜１０個のヒスチジン残基鎖を通常含む配列であるヒスチジンタグが挙げられる。
【００３７】
本発明の内容においては、「相同」という語は、同じ進化上の起源を有するタンパク質間、例えば異なる種、又はウイルスの場合では異なるウイルス株が有する相同タンパク質間に存在する関係に関するものである。このようなタンパク質（及びそれをコードする遺伝子）は配列の相同性を示すものであるが、その相同性は、それらタンパク質の配列の類似性に、つまり、類似の割合、すなわち保存された位置における特定の残基又はモチーフの存在に関して反映される。
【００３８】
「配列の類似性」という表現は、同じ進化上の起源を共有し得るか又はそうでない核酸配列間又はタンパク質のアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。通常、相同と類似性という語は区別なく使用される。二つのアミノ酸が少なくとも８０％同一又は少なくとも９０％類似（すなわち機能的に同一）の際、それら二つのアミノ酸の配列は「基本的に相同」である。類似又は相同の配列は、例えばＢＬＡＳＴプログラム又はＦＡＳＴＡプログラムを使用して、アラインメントにより同定することができる。
【００３９】
本発明によるタンパク質又は複合体の溶解度は、１×ＰＢＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを加えた１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）、０．２×ＴＢＥ、さらに例えば、６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加えた５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を含む細菌溶解緩衝液のような、緩衝化水性溶媒に対して定義される。
【００４０】
可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法
本発明者は、Ｐタンパク質とＧＳＴとの融合物及びパラミクソウイルス科のＮタンパク質をそれぞれコードするプラスミドの同時発現により、Ｎタンパク質を伴う融合タンパク質ＧＳＴ−Ｐを得ることが可能になることを先に示した（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。しかし、Ｎ−Ｐ複合体の生産量は少ないので、この複合体の工業的規模における生産と相容れない。
【００４１】
本発明者は、Ｐタンパク質の欠失突然変異体の特徴を明らかにし、Ｎタンパク質と相互作用するその能力を判定した。そして、この突然変異体のいくつかもまたＲＮＡ−Ｎ複合体すなわちリボヌクレオカプシド（ＲＮＰ）の形のＮタンパク質と相互作用することができること、また同時に、完全なＰタンパク質で得られるものよりも極めて顕著に多い収量のＮ−Ｐ複合体の調製を可能にすることを明らかにした。この特定の突然変異体は、分子のＣ末端部分を含みＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを欠くＰタンパク質の断片に相当する。
【００４２】
したがって、これらＰタンパク質の突然変異体とＮタンパク質との同時発現は、大量の、可溶性ＲＮＰの形、特にＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、特にＮタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体の形でのＮタンパク質の調製を可能にする。
【００４３】
したがって、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製する方法に関するものであって、前記方法は、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を、パラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質と同時発現させること、及び
ｂ）こうして形成された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を回収すること
から成る過程を含む。
【００４４】
トランケート型Ｐタンパク質は、好ましくはＰタンパク質のＣ末端断片からなる。パラミクソウイルス科のＰタンパク質と、場合によりＮ−ＲＮＡ複合体の形であるＮタンパク質との相互作用ドメインは、実際、Ｐタンパク質のＣ末端側に位置する。
【００４５】
トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片とＰタンパク質の連続する少なくとも一つの他のアミノ酸配列との融合により構成された、上に定義したような「キメラ」Ｐタンパク質であり得る。
【００４６】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００４７】
従って、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）を調製する方法に関するものであって、前記方法は、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とパラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、Ｐタンパク質のＣ末端断片とを同時発現させること、
ｂ）こうして形成されたＮ−ＰΔＮ可溶性複合体を回収すること
から成る過程を含むものである。
【００４８】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスはヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００４９】
当業者は、Ｎタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質、又はさらに具体的にはＰタンパク質のＣ末端断片を知っているか又は決定することができる。
【００５０】
例えば、ＲＳＶの場合、本発明者はＰタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインの位置決定をするために、先に報告された、大腸菌におけるＮタンパク質及びＰタンパク質の同時発現手段（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を使用した。そのために、Ｎタンパク質を、ＧＳＴと融合したＰタンパク質の欠失突然変異体と同時発現させた。本発明者はまた、Ｐタンパク質とＮタンパク質との相互作用ドメインがＰタンパク質のＣ末端の末端のところに位置していることを明らかにした（図１）。本発明者は、特に、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の９個のアミノ酸から構成されるオリゴペプチド（２３３〜２４１番アミノ酸）までのＰタンパク質のＣ末端断片が、Ｎタンパク質と相互作用することができることを示した。
【００５１】
他方で、例えば、センダイウイルスのＰタンパク質の、「Ｘドメイン」又はＸＤと呼ばれる、ＲＮＡ−Ｎ複合体すなわちＲＮＰの形のＮタンパク質との相互作用ドメインが、４７３〜５６８番アミノ酸に該当することが報告されている（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【００５２】
それ以外のパラミクソウイルス科については、必要に応じて、当業者は本発明者が報告した手段を使用して、ヌクレオカプシドの形のＮタンパク質と相互作用するドメインをＰタンパク質に同定することができる。
【００５３】
本発明者はまた、ＲＳＶのＰタンパク質の特定のＣ末端断片、とりわけＰΔ１６１Ｎ断片（１６１〜２４１番アミノ酸）が、実際には工業的規模に充分な収量を得ることができない完全なＰタンパク質の場合と比較して、大量のＮタンパク質の調製を可能にすることを明らかにした。非常に小さな、９個のアミノ酸しか有さないＰΔ２３３Ｎ（２３３〜２４１番アミノ酸）までの欠失突然変異体が、ＰΔ１６１Ｎの場合の収量に匹敵する収量を得ることを可能にする。
【００５４】
ＰΔ１６１Ｎよりも小さいこれらの断片は、Ｎタンパク質と相互作用することはできるがもはやオリゴマー化することができない、すなわちもはやＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まない、ＲＳＶタンパク質の断片に対応する。ＲＳＶのＰタンパク質の最小のオリゴマー化ドメインは、実際、Ｐタンパク質の１２０〜１５０番アミノ酸付近で定義される。
【００５５】
この同じ手段により、本発明者は、３８６〜５０７番アミノ酸残基から構成される麻疹ウイルスのＰタンパク質のＣ末端断片（ＰΔ３８６Ｎ）が、このウイルスのＮタンパク質と相互作用し、その精製を可能にするということを示すことができた。一方、Ｐタンパク質のＮ末端部分において４５６番残基までが欠失していると（ＰΔ４５７Ｎ断片を含む）、Ｎタンパク質の精製はできない。リボヌクレオカプシドと相互作用するＰタンパク質のＣ末端領域の構造は、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）により特定されている。Ｐタンパク質のオリゴマー化領域は、３０４〜３７６番アミノ酸で定義されたような推定と欠失により特定された。
【００５６】
したがって、ＲＮＰの形のＮタンパク質と相互作用するドメインを含むがＰタンパク質のオリゴマー化ドメインが欠失している、Ｐタンパク質のＣ末端断片を使用すると、Ｐタンパク質断片とＮタンパク質との相互作用、可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体の形成、及び高収量でのこの複合体の生産が同時に可能になる。特定のメカニズムに結びつけることはしないが、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインが存在しないと、この複合体のＰタンパク質同士間の相互作用に関連したＮ−ＰΔＮ複合体の不溶性の問題が回避されると推定される。
【００５７】
さらに、一実施形態によると、Ｎ−ＰΔＮ複合体を調製する方法は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠失する、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を発現させることを含む。
【００５８】
さらに具体的には、本発明による方法では、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を、ＲＳＶのＮタンパク質と同時発現させることができる。
【００５９】
ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片は、例えば、ＰΔ１２０Ｎ（Ｐタンパク質の１２０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１５０Ｎ（Ｐタンパク質の１５０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１６１Ｎ（Ｐタンパク質の１６１〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ１８０Ｎ（Ｐタンパク質の１８０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２００Ｎ（Ｐタンパク質の２００〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２２０Ｎ（Ｐタンパク質の２２０〜２４１番アミノ酸）、ＰΔ２３０Ｎ（Ｐタンパク質の２３０〜２４１番アミノ酸）、及びＰΔ２３３Ｎ（Ｐタンパク質の２３３〜２４１番アミノ酸）から構成される群から選択され得る。
【００６０】
本発明はまた、ＲＳＶのＮタンパク質と、上記のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、トランケート型Ｐタンパク質とを同時発現させる方法に関するものである。
【００６１】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合から構成され得る。それは例えば、配列番号１に示すようなヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸と１６１〜２４１番アミノ酸との連結から構成され得る。
【００６２】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科は麻疹ウイルスであり、Ｎ−ＰΔＮ複合体を調製する方法は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか、又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成される、麻疹ウイルスのＰタンパク質のＣ末端断片を発現させることを含む。それらの断片は、特に、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５０７番アミノ酸から構成されるＣ末端断片（ＰΔ３８６Ｎ）、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【００６３】
本発明による方法を利用するに当たり、分子生物学、微生物学、又は組換えＤＮＡにおける通常のあらゆる技術を使用することができる。このような技術は当業者に既知であり、特に次のものに記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９」）。ＤＮＡクローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻及び第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）。オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）。核酸のハイブリダイゼーション［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］。転写及び翻訳［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］。動物細胞の培養［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］。固定化細胞及び固定化酵素［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］。Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００６４】
「発現する」又は「発現」は、遺伝子又はＤＮＡ配列に含まれる情報が現れることを可能にすること又は現れるようにすること、例えば、対応する遺伝子配列又はＤＮＡ配列の転写と翻訳に関与する細胞の機能を活性化することによるタンパク質の産生を意味する。二つの遺伝子又はＤＮＡ配列に含まれる情報が同じ宿主細胞内で発現することを「同時発現」という。
【００６５】
「コード配列」は、それが発現するとＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質等が生成するヌクレオチド配列を意味する。タンパク質をコードする配列は一般に開始コドン（ＡＴＧ）と終止コドンを含む。
【００６６】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡ、特にｍＲＮＡに転写し、次いでそれがイントロンを含む場合にはスプライシングされ、コードする配列によりコードされているタンパク質に翻訳されるとき、転写及び翻訳の制御配列「の制御下にある」か又はそれら「と機能的に関連している」。
【００６７】
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という記載は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば異種遺伝子）を宿主細胞に導入し、その結果、宿主細胞を形質転換し、導入された配列を発現させることができる担体を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、ファージ、ウイルスが挙げられる。もっとも一般的なベクターは、通常は細菌に由来する、自己複製ユニットである、二本鎖ＤＮＡの形態であり得るプラスミドである。プラスミドは外来ＤＮＡ配列を容易に組み込むことができ、それを適当な宿主内に容易に導入することができる。一つのプラスミドベクターは通常、一つのコードＤＮＡ配列、一つのプロモーターＤＮＡ配列を含み、外来ＤＮＡの導入が可能な一つ又は複数の制限部位を有する。プラスミドの非制限的な例としては、ｐＫＫ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣ及びｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン州）、ｐＲＳＥＴ及びｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）、又はｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のプラスミドが挙げられる。
【００６８】
「宿主細胞」は、細胞による物質の生産、例えば、細胞による、遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列、タンパク質又は酵素の発現のために選択され、修飾され、培養され又は操作される、あらゆる細胞又は生物を意味する。
【００６９】
「発現系」は、ベクターにより担持され宿主細胞内に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の生産に適した条件下で使用される、宿主細胞及び適当なベクターを指す。通常の発現系は、大腸菌宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫細胞、及びバキュロウイルスベクター、またさらには哺乳類細胞及びベクターを含む。
【００７０】
本発明の方法による発現系は、有利には、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ−３のようなベクターを有する、細菌特に大腸菌の発現系である。細菌の発現系は実際、一般にきわめて高い生産量が得られることを可能にする発現系である。
【００７１】
有利には、トランケート型Ｐタンパク質及び特にＰタンパク質のＣ末端断片は、Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の精製を容易にするタンパク質と融合した形、とりわけアフィニティークロマトグラフィーに使用できるタンパク質と融合した形で発現する。それらのタンパク質は、トランケート型Ｐタンパク質−ＧＳＴ融合タンパク質が、グルタチオンを結合した固体支持体上でのクロマトグラフィーにより単離できる場合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような標識タンパク質であり得る。ポリヒスチジンすなわち「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」のような他の標識又は「タグ」も使用することができる。
【００７２】
こうして、Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質−標識タンパク質複合体（トランケート型Ｐタンパク質、特にＰΔＮ断片と融合したＧＳＴ又は他の標識タンパク質）が得られ、標識タンパク質は酵素切断により除去することができる。例えば、ＧＳＴはトロンビンによる切断により、又は融合体がＧＳＴ以外のタンパク質を含む場合は他の全ての適当な酵素により除去することができる。
【００７３】
本発明による方法の利用を可能にするベクター構築物の具体例を以下の実施例に示す。
【００７４】
可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体
【００７５】
上述したような、可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、特に可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体の調製方法により、単離又は精製された形でＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を容易に得ることを可能にする。
【００７６】
したがって、本発明はまた、本発明の調製方法により得ることが可能な、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体に関するものである。
【００７７】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むか、又はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００７８】
本発明は、さらに具体的には、本発明の調製方法により得ることが可能な、パラミクソウイルス科のウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）に関するものである。
【００７９】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスは、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００８０】
一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている。
【００８１】
さらに具体的には、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びているか、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片を含む
ことができる。
【００８２】
それらの断片は、特に、ＰΔ１２０Ｎ、ＰΔ１５０Ｎ、ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１８０Ｎ、ＰΔ２００Ｎ、ＰΔ２２０Ｎ、ＰΔ２３０Ｎ、及びＰΔ２３３Ｎから構成される群から選択されるＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【００８３】
また、本発明は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、上記に記載のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質を含む、可溶性の複合体に関する。
【００８４】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合により構成され得る。それは、例えば配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸との連結により構成され得る。
【００８５】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは麻疹ウイルスであり、前記Ｐタンパク質の断片は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成されている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である。さらに具体的には、麻疹ウイルスのＰタンパク質の前記Ｃ末端断片は、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５１４番アミノ酸（ＰΔ３８６Ｎ）から構成されていてもよく、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であってもよい。
【００８６】
Ｎ−ＰΔＮ複合体において、タンパク質ＰΔＮは、場合により、例えばＧＳＴ、ヒスチジンタグ、又はＮ−ＰΔＮ複合体の精製を容易にする他のあらゆる適当なタンパク質のような標識タンパク質と融合した形で提供され得る。
【００８７】
ＲＳＶについての複合体生成物の電子顕微鏡分析から、それが１０分子のＮタンパク質を含む環状化合物であり、この可溶性の環はまた、アガロースゲル電気泳動で確認することが可能な約７０塩基の小さなＲＮＡを含むことが明らかになった（図３）。この複合体中には同様の量のＮタンパク質とＰΔＮ−ＧＳＴタンパク質がみられる。ＲＮＡは、このタンパク質を変性させることなくＮタンパク質の環から分離することができない。
【００８８】
このように、本発明はまた、上記で定義したような、１０分子のＮタンパク質を含み、そのうちのそれぞれ又はその多数がＰタンパク質のＣ末端断片と関連し、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片がＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含みＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の単離された可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体にも関する。ＲＳＶのこのＮ−ＰΔＮ複合体は、さらに約７０塩基のＲＮＡを含む。
【００８９】
可溶性Ｎタンパク質を調製する方法
【００９０】
このＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から、又はさらに具体的にはＮ−ＰΔＮから、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）により、可溶性Ｎタンパク質を環状でそのＲＮＡと共に容易に単離することができる。この分離は、必要に応じて、トランケート型Ｐタンパク質と、場合によりトランケート型Ｐタンパク質が融合している標識タンパク質との、酵素切断による分離の後に行うことができる。
【００９１】
したがって、本発明はさらに、
ａ）上記に定義したような方法により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製すること、そして
ｂ）可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法に関する。
【００９２】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むか、またはＰタンパク質のＣ末端断片である。
【００９３】
本発明は、さらに具体的には、
ａ）上記に定義したような方法により可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体（「Ｎ−ＰΔＮ複合体」）を調製すること、そして
ｂ）可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法に関する。
【００９４】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、ウイルスは、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のようなニューモウイルスである。
【００９５】
上記の方法により得ることができるパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質もまた、本発明の一部をなす。
【００９６】
ＲＳＶの場合、利用できる最大のＰタンパク質のＣ末端断片（ＰΔ１６１Ｎ）が１５ｋＤａの分子量を有するのに対し、Ｎタンパク質は４５０ｋＤａの分子量を有する。したがって、Ｎタンパク質の環は、例えば下記の実施例３（及び図２）に記載するようなセファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、Ｐタンパク質のＣ末端断片から分離することができる。
【００９７】
一実施形態によると、本発明はしたがって、可溶性のＲＳＶのＮタンパク質を提案し、この前記Ｎタンパク質は、約７ｎｍの直径を有し１０個のサブユニットを含む環を形成している。しかし、ある種の部分的で１０個より少ないサブユニットを含む環を除外することしかできない。環はさらに約７０塩基のＲＮＡを含む。
【００９８】
ワクチン組成物
【００９９】
ＲＳＶ、さらに一般的にはパラミクソウイルス科のＮタンパク質は、ワクチン接種にとって有益な抗原であるが、現在までのところ、可溶性の形でそれを精製することに誰も成功していない。本発明による方法は、極めて純度が高くかつ極めて均質な、環状構造のＮタンパク質を容易かつ大量に得ることを可能にする。
【０１００】
環状Ｎタンパク質の免疫原性を評価するため、本発明者は、本発明によるパラミクソウイルス科のＮ−ＰΔＮ複合体でマウスに免疫を付与した。ワクチンとして使用するために、Ｎタンパク質とＰΔＮは場合により分離され得るが、この操作は必要なものではなく、ＰΔＮが存在しても弊害はない。
【０１０１】
本発明者は、マウスにＲＳＶのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体でさらに特異的に免疫を付与し、ＲＳＶのＰΔ１６１Ｎポリペプチドをコントロールとして使用した。
【０１０２】
気道に対するこのウイルスの特異性を考慮して、非経口のワクチン接種の従来の方法である皮下経路、及び呼吸粘膜とそれに関連するリンパ組織レベルでの局所的な免疫付与の誘発を可能にする鼻経路の、二つの免疫付与経路を比較した。
【０１０３】
ワクチンアジュバントの不存在下で可溶性の組換えタンパク質に対する免疫応答を得ることが困難なので、本発明者は、粘膜経路でのアジュバント性が報告されている（ＭｃＮｅａｌ ｅｔ ａｌ． ２００２， Ｆｒｅｙｔａｇ ｅｔ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ２００５）、大腸菌（Ｒ１９２Ｇ）の無毒化リンホトキシン（ＬＴ）を共に使用した（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、アメリカ、から取得）。
【０１０４】
免疫応答のパラメーター、（ｉ）血清及び粘液の抗体産生（気管支肺胞洗浄による）、及び（ｉｉ）脾臓又は肺から単離された記憶Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γの産生を介した細胞性免疫応答について追跡した。
【０１０５】
アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下で、Ｎタンパク質（Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体）は、投与経路のいかんにかかわらず（経鼻又は皮下）血清抗体の産生を強く誘導する（図４Ａ）。この応答は最初の免疫付与の後（１４日目）に検出可能であり、二度目の免疫付与の後（２８日目）に増強される。アジュバントはまた、二度目の免疫付与の後にＰΔ１６１Ｎに対する抗体の産生を誘導することを可能にする。
【０１０６】
大いに注目すべきことには、アジュバントの不存在下でのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の経鼻及び皮下投与は、最初の免疫付与からすぐに血清抗体を多く産生させる。同じ条件下でＰΔ１６１Ｎは応答を誘導しない。比較した応答の特徴は、粘液の抗体、総Ｉｇの産生に見られる（図４Ｂ）。
【０１０７】
これに対して、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）存在下でＮタンパク質（Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体）を単独で経鼻投与すると、呼吸粘膜レベルでのＩｇＡ産生を可能にする（図４Ｂ）。
【０１０８】
細胞性免疫応答は、脾臓又は肺の白血球の、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ又はＰΔ１６１Ｎのみの存在下においてＩＦＮ−γをインビトロで産生する能力により測定した。ＩＦＮ−γは、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球により産生されるサイトカインである。ＣＤ４及びＣＤ８記憶Ｔリンパ球は、それらが特異的な抗原の存在下で、インビトロで反応性がある。ＩＦＮ−γは、ウイルスに対する防御における主要なエフェクターであるＴｈ１リンパ球及び細胞傷害性Ｔリンパ球により産生される。
【０１０９】
最も強い応答はＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体による再刺激後に得られる（図５）。抗体の場合のように、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の経鼻又は皮下投与により、Ｎタンパク質に特異的な末梢細胞（脾臓）の免疫性が刺激される。注目すべきことには、アジュバントとともに経鼻経路で投与したＮタンパク質により局所細胞（肺）の免疫が生じる（図５）。
【０１１０】
結論として、環状構造のＮタンパク質は局所応答（呼吸粘膜）を刺激することを含め、強い免疫原性を示す。
【０１１１】
したがって、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を含むワクチン組成物であって、前記可溶性Ｎタンパク質が医薬的に許容される担体中に存在するワクチン組成物を提案する。この可溶性Ｎタンパク質は、特に、上記のような可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体、さらに具体的には可溶性Ｎ−ＰΔＮ複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離する方法により得ることが可能である。
【０１１２】
上述したように、可溶性Ｎタンパク質はＰタンパク質との複合体の形で、好ましくない作用を伴わずにワクチン接種に使用され得る。したがって、本発明によるワクチン組成物は、医薬的に許容される担体中にある、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質複合体を含むことができる。
【０１１３】
これら複合体の生産量の問題については、本発明は好ましくは、医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を含むワクチン組成物であって、前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができるワクチン組成物を対象とする。
【０１１４】
好ましくは、トランケート型Ｐタンパク質はＰタンパク質のＣ末端断片を含むか、又はＰタンパク質のＣ末端断片である。
【０１１５】
本発明はまた、さらに具体的には、医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体であって、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まず、Ｎタンパク質と相互作用することができる複合体に関する。
【０１１６】
前記パラミクソウイルス科のウイルスは、パラミクソウイルス亜科又はニューモウイルス亜科であり得る。特に、ウイルスは、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、及びパラインフルエンザウイルスから構成される群から選択され得る。好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質は、例えばヒト又はウシの、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の可溶性Ｎタンパク質である。
【０１１７】
一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、前記Ｐタンパク質のＣ末端断片は、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いているＣ末端断片（ＰΔＮ）である。
【０１１８】
さらに具体的には、前記組成物において、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片は、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から、１２０位、好ましくは１５０位、さらに好ましくは１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｃ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
であり得る。
【０１１９】
それらの断片は、特に、ＰΔ１２０Ｎ、ＰΔ１５０Ｎ、ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１８０Ｎ、ＰΔ２００Ｎ、ＰΔ２２０Ｎ、ＰΔ２３０Ｎ、及びＰΔ２３３Ｎから構成される群から選択されるＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片であり得る。
【０１２０】
本発明はまた、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１１９個、好ましくは１４９個、さらに好ましくは１６０個のアミノ酸を欠いている、上記のようなＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片をＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質が含んでいる組成物に関する。
【０１２１】
例えば、Ｐタンパク質のＣ末端断片を含むＲＳＶのトランケート型Ｐタンパク質は、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の先端の１２２個のアミノ酸とＣ末端の先端の８０個のアミノ酸との融合により構成され得る。それは、例えば配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の１〜１２１番アミノ酸及び１６１〜２４１番アミノ酸との連結により構成され得る。
【０１２２】
別の一実施形態によれば、パラミクソウイルス科のウイルスは麻疹ウイルスであり、前記Ｐタンパク質の断片は、Ｐタンパク質のＣ末端のアミノ酸を最大１２２個含むか又はＰタンパク質のＣ末端の１２２個のアミノ酸で構成されている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である。さらに具体的には、麻疹ウイルスのＰタンパク質の前記Ｃ末端断片は、配列番号３に示すような、麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株のＰタンパク質の３８６〜５１４番アミノ酸（ＰΔ３８６Ｎ）から構成されていてもよく、又はＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰタンパク質について定義したものと相同な、麻疹ウイルスの他の株に由来するＰタンパク質のＣ末端断片であってもよい。
【０１２３】
「医薬的に許容される担体」は、ヒト又は動物において例えばアレルギーのような副作用を生じさせない、あらゆる溶媒、分散媒、吸収遅延剤等を意味する。
【０１２４】
有利には、本発明によるワクチン組成物はさらにアジュバントを含み得る。「アジュバント」は、同時に投与された抗原に対する細胞性又は液性免疫反応を増大させ、刺激し、活性化し、強化し、又は調節する物質を指す。従来のアジュバントの例は、完全フロイントアジュバント、ＬＰＳ及びそれらの派生物、細菌毒素（コレラ毒素及びエンテロトキシン）及びその無毒化変異体（例えばＬＴ（Ｒ１９２Ｇ））のような細菌抗原、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド配列、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、リン酸カルシウム又はリン酸カリウムのような無機アジュバント、油性エマルジョン及び乳化剤（サポニン、例えばＱＳ２１）、サイトカインを含むアジュバントを含む。
【０１２５】
本発明によるワクチン組成物は、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染に対する防御を提供し、すなわちワクチン組成物により免疫を付与されていない対象と比較してこの感染の影響の程度を軽減する。
【０１２６】
本発明はまた、ワクチン接種方法における上記で定義したようなワクチン組成物の使用に関する。
【０１２７】
したがって、本発明は、少なくとも本発明によるワクチン組成物を対象に投与することを含む、ワクチン接種方法を対象とする。好ましくは、ワクチン接種方法は、対象へのワクチン組成物の最初の投与と、同じ対象に対する前記ワクチン組成物の二度目の投与を含む。二度目の投与は、患者を抗原に再びさらし、より強い二次免疫応答を誘導する。
【０１２８】
「対象」という記載は、パラミクソウイルス科ウイルスによる感染にさらされるか又はさらされるおそれがある、ヒト又はヒトでない動物、例えば鳥、又はウシ、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、サルといった哺乳類を指す。好ましくは、本発明の趣旨の範囲内の対象はヒト又はウシである。
【０１２９】
ワクチン組成物は、有利には、パラミクソウイルス科ウイルスによる感染に対する防御的又は治療的な免疫応答の誘導に有効な量を投与される。用量は当然、検討される有効成分、投与方法、対象の年齢及び状態に依存する。投与量当たりのＮ−Ｐ複合体、Ｎ−ＰΔＮ複合体、又はＮタンパク質は０．１〜２００μｇの間とすることができ、好ましくはワクチン投与量当たり１０〜１００μｇの間である。
【０１３０】
ワクチン組成物は、いかなる経路、特に粘膜経路（例えば眼内、鼻腔内、経口）、又は非経口経路（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、又は腹腔内）によっても投与することができる。
【０１３１】
診断への使用
【０１３２】
場合により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形である、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質は、加えて、前記パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する抗体を検出するための診断用途に使用することができる試薬を構成する。
【０１３３】
したがって、本発明はさらに、上記のような、場合によりＮタンパク質−Ｐタンパク質複合体の形であるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を含む診断試薬に関する。
【０１３４】
前記試薬と適当な検出手段を含む診断キットもまた、本発明の範囲にある。
【０１３５】
本発明はまた、インビトロ又はインビボで前記Ｎタンパク質に対する抗体を検出するための、本発明によるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質の使用を提案する。
【０１３６】
本発明はまた、生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法であって、
ａ）前記生物サンプルとパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とを接触させること、
ｂ）形成されたＮタンパク質／抗体複合体を検出すること
から構成される過程を含み、この複合体の存在が生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に特異的な抗体の存在の指標となる方法に関する。
【０１３７】
生物サンプルは、例えば筋肉、肝臓、心臓、脳などの生検により得られた組織サンプル、又は、例えば血液、血漿、又は脳脊髄液のような生体液のような液体サンプルであり得る。
【０１３８】
複合体の検出は、（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの）クロマトグラフィー又は非変性条件下での電気泳動のような、当業者に周知の常用の手段により実施され得る。
【０１３９】
上記で定義したようなＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法において、生物サンプルと接触させるＮタンパク質は、Ｎタンパク質−Ｐタンパク質複合体の形を有し得る。
【０１４０】
以下の実施例及び図面は本発明の範囲を限定することなく説明するものである。
【０１４１】
図１は、Ｐタンパク質に対するＰタンパク質−Ｎタンパク質の相互作用ドメインの位置決定を示す図である。Ｐタンパク質をＧＳＴに融合し、別のプラスミド上で発現したＮタンパク質と大腸菌内で同時発現させた。
【０１４２】
図２は、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の溶離特性を示している。図２ＡはＴＳＫカラムにおける２２０ｎｍでの溶離特性を示す。図２Ｂはクマシーブルーによる染色後の、種々の断片のアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。１７〜２２の断片はＲＮＡ−環状Ｎタンパク質のみを含んでいる。
【０１４３】
図３は、ＲＳＶのＮタンパク質の環状構造を示している。図３Ａは、Ｐ１６１−２４１により精製した環状Ｎタンパク質−ＲＮＡの電子顕微鏡分析の結果を示す。図３Ｂは、低温顕微鏡による再構築の結果を示す。図３Ｃは、環中に存在するＲＮＡのアガロースゲル上での分析結果を示す。
【０１４４】
図４は、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体に対する抗体の産生を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、粘液性アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下又は非存在下で２０μｇのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体又はＰΔ１６１Ｎを鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）又は皮下投与（ｓ．ｃ．）して、免疫を付与した。二週間後に二度目の投与を行う（１４日目）。マウスを二度目の投与の二週間後に安楽死させる（２８日目）。血清抗体を測定するため、血清を０日目、１４日目及び２８日目に採取する（図４Ａ）。粘液抗体を測定するため、気管支肺胞洗浄を２８日目に行う（図４Ｂ）。Ｎ−ＰΔ１６１Ｎに対する抗体の割合をＥＬＩＳＡにより測定する。データは、平均値±平均値における標準偏差（ｎ＝５）で示し、対数目盛で表示する。
【０１４５】
図５は、ＰΔ１６１Ｎ及びＮ−ＰΔ１６１Ｎに特異的な細胞性免疫応答を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、粘液性アジュバントＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）の存在下又は非存在下で２０μｇのＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体又はＰΔ１６１Ｎを鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）又は皮下投与（ｓ．ｃ．）して、免疫を付与した。二週間後に二度目の投与を行う（１４日目）。脾臓と肺を摘出するため、マウスを二度目の投与の二週間後に安楽死させる（２８日目）。脾臓細胞及び肺細胞を、Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ、ＰΔ１６１Ｎの存在下で、又は再刺激を行わずに７２時間培養する。ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡにより測定する。再刺激を行わない場合、ＩＦＮ−γのベースレベルは１５ｐｇ／ｍｌ未満である。データは、平均値±平均値における標準偏差（ｎ＝５）で示す。
【実施例１】
【０１４６】
ＲＳＶのリンタンパク質のＣ末端領域を含むプラスミドの構築
【０１４７】
ＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質は２４１個のアミノ酸残基から構成される。
【０１４８】
ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端部分を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマー配列（５’から３’）（ＢａｍＨＩ制限部位に下線を付し、Ｐタンパク質遺伝子の「開始」コドンＡＴＧは太字で表す）は以下である。
【０１４９】
【０１５０】
ＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質遺伝子のｃＤＮＡを、プライマーＬＯＮＧ−ＰＢａｍ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−（Ｃａｓｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を用い、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株に感染させたＨｅｐ−２細胞からＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼすなわちＧＳＴをコードする遺伝子とクローニングした。このプラスミドをｐＧＥＸ−Ｐと称する。
【０１５１】
・Ｐ１６１−２４１（ＰΔ１６１Ｎ）のクローニング
Ｐタンパク質のＣ末端領域（１６１〜２４１番アミノ酸）を、以下の条件でプラスミドｐＧＥＸ−ＰからＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲプライマー：Ｐ１６１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−を各１００ｎｇ（各１μｌ）
ｐＧＥＸ−Ｐの鋳型ＤＮＡ：１０ｎｇ（１μｌ）
酵素：ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標）（μｌ当たりのユニット）：１μｌ
ｄＡＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＣＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
ｄＴＴＰ：最終濃度０．２ｍＭ
最終濃度１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
最終容量：１００μｌ
ＰＣＲは以下の条件下で実施した。
９４℃で１５秒、４０℃で２分、７２℃で１分を５サイクル、
９４℃で１５秒、５５℃で１分、７２℃で１分を２５サイクル
【０１５２】
増幅したＤＮＡを１体積のフェノール／クロロホルム（１体積／１体積）（１００μｌ）、次いで１体積のクロロホルムで抽出し、最後に１０分の１体積の５ＭのＮａＣｌ（１０μｌ）と２体積の１００％エタノール（２００μｌ）を加えて沈殿させた。ＤＮＡを１３０００ｇで２０分間遠心し、１体積の７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１体積の水９０μｌ中に再懸濁した。１０×ＢａｍＨＩ酵素緩衝液を１０μｌ加えたのち、ＤＮＡを１０ユニットのＢａｍＨＩ酵素の存在下で３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを、エチジウムブロマイドの存在下で、１×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）中の１．５％アガロースゲル上に置き、電気泳動した。Ｐ１６１−２４１のＤＮＡに対応するバンドを切り取り、ＤＮＡを電気溶出により抽出した。それをさらに１体積のフェノール−クロロホルム、１体積のクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿した。それを、１％アガロースゲルにおける精製の後、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターにライゲーションした。
ｐＧＥＸ４Ｔ−３のＤＮＡ：１００ｎｇ
Ｐ１６１−２４１のＤＮＡ：１００ｎｇ
最終濃度１×リガーゼ緩衝液
リガーゼ（５Ｕ／μｌ）：１μｌ
最終体積２０μｌ
【０１５３】
全体を１４℃で一晩インキュベートした。翌日、適当な細菌ＤＨ５−アルファＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０μｌのライゲーション産物で形質転換し、最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬ−寒天培地を含むペトリ皿上に塗布した。組換え細菌のコロニーをプラスミドのミニプレップと制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによる消化でスクリーニングした。組換えプラスミドはアガロースゲル上で、一方はベクター（４．９ｋｂ）に対応し、もう一方はＰタンパク質のＣ末端部分（２４６ｂｐ）に対応する、二つのバンドを示す。組換えプラスミド全体を配列決定した。
【０１５４】
・Ｐ１８０−２４１、Ｐ２０１−２４１、Ｐ２２１−２４１のクローニング
１８０〜２４１、２００〜２４１、２２０〜２４１番アミノ酸部分に対応するＰタンパク質の断片を、以下のプライマーを用いてｐＧＥＸ−ＰプラスミドからＰＣＲにより得た。
Ｐ１８０−２４１：プライマーＰ１８０Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ
Ｐ２００−２４１：プライマーＰ２０１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−
Ｐ２２０−２４１：プライマーＰ２２１Ｂ＋及びＬＯＮＧ−Ｐ−
【０１５５】
これらを、Ｐ１６１−２４１（上記参照）と同様に増幅しクローニングした。
【０１５６】
・ＲＳＶのＬｏｎｇ株のヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子のクローニング
ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＮタンパク質をコードする遺伝子を、そのウイルスに感染したＨｅｐ−２細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得た。使用したプライマーは、
ＬＯＮＧ−Ｎｂａｍ＋：ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧ（配列番号１９）
ＬＯＮＧ−Ｎ−：ＴＴＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＧ（配列番号２０）
であった。
【０１５７】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位においてクローニングした。ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩでｐＧＥＸ−Ｎプラスミドを消化して、Ｎタンパク質（配列番号）をコードする領域をｐＥＴ２８＋プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、配列番号及び図面参照）中にサブクローニングした。
【０１５８】
・Ｐ２３１−２４１のクローニング
以下のプライマーを９４℃で５分間加熱して変性させ、室温で冷却した。
Ｐ２３１ＮＢ＋：ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＴＧＡ（配列番号２１）
Ｐ２３１Ｎ−：ＴＣＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＣＧ（配列番号２２）
【０１５９】
ハイブリダイズ後、１０ｎｇの二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩ酵素及びＳｍａＩ酵素で消化しアガロースゲル上での電気泳動により精製した、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３プラスミドのＤＮＡ１００ｎｇとライゲーションした。組換えプラスミドは、Ｎタンパク質遺伝子に関して配列決定することにより確認した。
【実施例２】
【０１６０】
複合体の発現と精製
【０１６１】
適当な細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＧＥＸ−ＰΔのＤＮＡ１μｇとｐＥＴ−ＮのＤＮＡ１μｇで形質転換し、次いで最終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと最終濃度５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したＬ−寒天培地を含むペトリ皿に塗布した。コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ培地に移植し、３７℃で一晩生育させた。翌朝、コンフルエントな状態の培養物１ｍｌを、抗生物質を添加した１リットルのＬＢ培地に播種し、夕方まで生育させた。夕方に、１６０μｇ／ｍｌの濃度のＩＰＴＧ（タンパク質の発現を誘導する）を含む１体積の新鮮なＬＢ培地を培養物に加え、全体を２８℃で一晩生育させる。翌日、細菌を５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ペレットを１００ｍｌの以下の緩衝液中に再び入れる。
５０ｍＭのトリス（ＰＨ７．８）
６０ｍＭのＮａＣｌ
２ｍＭのＤＴＴ
１ｍＭのＥＤＴＡ
４ｍＭのベンズアミジン
１×アンチプロテアーゼ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ、参照番号１１８７３５８０００１）すなわち５０ｍｌの溶解緩衝液に対して一錠
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
【０１６２】
１０ｍｇ／ｍｌ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）のリゾチームを添加した同様の緩衝液１０ｍｌを加える。細菌を氷中で１時間インキュベートする（溶解）。全体が粘性になったら、全体を、混合物中に入れたプローブを用いて氷中で１分間の超音波処理を３回行い、各超音波処理の間に５分間放置する。全体を４℃、１００００ｇで３０分間遠心し、次いで上清を回収する。上清を４℃、１００００ｇで３０分間再び遠心し、次いで新たに上清を回収する。８ｍｌのビーズ緩衝液（体積／体積）混合物を回収して４ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解緩衝液で洗浄する。同量の緩衝液中にビーズを置き、澄ました細菌溶解液を加え、４℃で一晩回転させる。翌日、ビーズを２０００ｒｐｍで３分間遠心し、次いで上清を除去し、ビーズを、アンチプロテアーゼを含まない溶解緩衝液で三回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液で三回洗浄する。
【０１６３】
ビーズを、ビオチン化したＴｈｒｏｍｂｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をビーズ１ｍｌ当たりトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ、 Ｎｏ．６９０２２−３ＦＲＺ）１μｌ（１Ｕ）の比率で用いて、トロンビン部位で切断する。ビーズを２０℃で一晩インキュベートし、翌日、２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を回収するため１５分間沈殿させる。等量の１×ＰＢＳをビーズに加え、混合物を攪拌し沈殿させる。上清を新たに回収し、あらかじめ採取しておいた上清に加える。回収した上清にストレプトアビジンアガロースビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号６９２０３）を樹脂１６μｌ（すなわち樹脂／緩衝液混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）３２μｌ）の割合で加える。混合物を一時間攪拌し、次いで２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を回収する。タンパク質濃縮物２ｍｇ／ｍｌを得る。
【０１６４】
切断産物を含む１０μｌの上清を、１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で変性し、沸騰させ、０．１％トリス−グリシンＳＤＳ緩衝液中の１２％ポリアクリルアミドゲル上に置き、次いでタンパク質を可視化するために、電気泳動後にクマシーブルーで染色する。
【実施例３】
【０１６５】
Ｎタンパク質とＰΔ１６１Ｎ（Ｐ１６１−２４１）の分離及びＮタンパク質の環の精製
【０１６６】
上清中に存在するタンパク質は、１×ＰＢＳ中におけるサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過、図２）により分離することができる。Ｎタンパク質は４５００００Ｄａの見かけのサイズで、ＰΔ１６１Ｎは１５ｋＤａの分子量で排除される。
【０１６７】
サイズ排除クロマトグラフィーにより得られた「Ｎタンパク質」画分を電子顕微鏡により観察した結果、Ｎタンパク質は、直径７ｎｍを有しＮタンパク質のサブユニットを１０個含む（図３Ｂ）、環の形（図３Ａ）であることが分かった。環は約７０ｂｐのＲＮＡを含む（図３Ｃ）。
【実施例４】
【０１６８】
環状構造の組換えＮタンパク質の免疫原性の評価
【０１６９】
・経鼻投与又は皮下投与によるワクチン接種を、アジュバントの存在下又は非存在下でマウスで実施する。
マウス：ｌ’Ｕｎｉｔｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ Ｒｏｎｇｅｕｒ（ＩＮＲＡ、Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ）で育成した１０〜１２週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス３０頭
抗原：トロンビンでの切断によりＧＳＴを分離し、ストレプトアビジンと結合したビーズによりビオチン化トロンビンを除去した後の、濃度１ｍｇ／ｍｌの可溶性のＰ１６１−２４１及び｛Ｐ１６１−２４１＋Ｎ｝複合体
アジュバント：１ｍｇ／ｍｌの、大腸菌のリンホトキシンＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）
サンプル採取
−０日目、１４日目及び２８日目に、眼窩後洞から血液を採取
−２８日目：
・１．５ｍｌのＨＢＳＳ培地及び１ｍＭのＥＤＴＡによる気管支肺胞洗浄物（ＬＢＡ）
・氷上での、抗生物質（１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ＰＳ）を加えたＲＰＭＩ培地における脾臓と肺の解剖
【０１７０】
実験計画：
【表１】
【０１７１】
・抗Ｎタンパク質抗体の産生
血清を血液から採取し（４℃で一晩滲出）、次いで−２０℃で凍結する。
【０１７２】
ＬＢＡを１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を集め（約１ｍｌ）、−２０℃で凍結する。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡにより血清及びＬＢＡにおける抗Ｎタンパク質抗体（総Ｉｇ、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＡ）を調べる。９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）において、Ｐ１６１−２４１＋Ｎタンパク質複合体（ウェル当たり２００ｎｇ）により４℃で一晩感作する。プレートをウェル当たり２００μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄する（自動装置Ｗｅｌｌｗａｓｈ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓを使用）。次にプレートを、３７℃で１時間、ウェル当たり１５０μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０及び５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳ）で満たす。５回洗浄した後、滴定サンプルをＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳで希釈する（血清については最初の希釈度から１／３０になるまで３倍の連続希釈を７回行い、ＬＢＡについては１／３になるまで行う）。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。５回洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ−ＦＢＳで希釈した二次抗体をウェル当たり１００μｌの割合で添加する。使用する二次抗体は、ペルオキシダーゼと結合しており、マウスの免疫グロブリン、総ＩｇＧ（１／４０００、ＰＡＲＩＳ）、ＩｇＧ１（１／２０００、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｇＧ２ａ（１／２０００、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＩｇＡ（１／１０００、Ｃａｌｔａｇ）に対するものである。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、５回洗浄する。次にプレートをペルオキシダーゼの基質（ＴＭＢ、ウェル当たり１００μｌ）と共に１０分間暗所でインキュベートする。２ＭのＨ３ＰＯ４を５０μｌ加えて酵素反応を停止する。光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読み取る（読み取り装置Ｄｙｎｅｘ）。ＯＤ４５０＝ｆ（希釈度）の曲線を、回帰曲線ｙ＝（ｂ＋ｃｘ）／（１＋ａｘ）によりモデル化する。抗体の力価は、最大限に希釈されたコントロールサンプル（０日目）の二倍のＯＤ４５０を示す希釈値として決定する。
【０１７４】
・Ｐ１６１−２４１及びＮタンパク質に特異的なＴリンパ球によるＩＦＮ−γの産生
摘出した脾臓及び肺を同じ手順で処理する。脾臓は個別に処理し、肺は実験群にグループ化する（群当たり５個の肺）。
【０１７５】
組織を薄切りにし、次いでＲＰＭＩ培地及びＰＳ培地中において、篩上（１００μｍのセルストレーナー、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）で注意深く破砕する。細胞懸濁液を１７００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心する。細胞を１ｍｌの赤血球溶解緩衝液（低張生理食塩緩衝液）中に懸濁し、室温で５分間インキュベートする。溶解反応は、１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ（ＰＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ＦＢＳ）を添加することにより停止する。膜の破片を沈殿させ、細胞を遠心（１７００ｒｐｍで１０分間、４℃）により３回洗浄する。細胞懸濁液を、Ｍａｌａｓｓｅｚの計算盤を用いて計数する。
【０１７６】
細胞を、細胞培養用に処理された９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で、２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地においてウェル当たり２０００００個の細胞の比率で培養する。
【０１７７】
各細胞懸濁液に対して、四つの培養条件を三回試験する。
−１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール１２ミリステート１３アセテート、Ｓｉｇｍａ）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）（ポジティブコントロール、ポリクローナル活性化）
−完全ＲＰＭＩ（ネガティブコントロール）
−１０μｇ／ｍｌのＰ１６１−２４１
−１０μｇ／ｍｌのＰ１６１−２４１＋Ｎ
【０１７８】
５％ＣＯ２下において３７℃で７２時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γを滴定するまで−２０℃で凍結する。
【０１７９】
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ：９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、 ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの重炭酸緩衝液（１００μｌ／ウェル）（ｐＨ９．５）中で、４μｇ／ｍｌのマウス抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で一晩感作する。プレートをウェル当たり２００μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで５回洗浄する（自動装置Ｗｅｌｌｗａｓｈ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓを使用）。次にプレートをウェル当たり１５０μｌの、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０及び２％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ）を加えたＰＢＳ緩衝液で、３７℃で２時間、コンフルエントな状態にする。５回洗浄した後、参照用の組換えマウスＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び滴定サンプルをＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで二倍連続希釈により希釈する。ＩＦＮ−γの希釈範囲は３３１２．５ｐｇ／ｍｌから３．２３５ｐｇ／ｍｌまでとする。四回の二倍連続希釈を純粋なサンプルに対して行う。続いてプレートを４℃で一晩インキュベートする。５回洗浄した後、ビオチン化した検出抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中に１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、４℃で３時間インキュベートする。５回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中に１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、４℃で１時間インキュベートする。５回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質（ＡＢＴＳ＋Ｈ２Ｏ２）をウェルに添加する。４５分間のインキュベーションの後、光学密度を４０５ｎｍで読み取る（読み取り装置ＥＬＩＳＡ Ｄｙｎｅｘ）。サンプルのＩＦＮ−γ濃度の計算は、ＩＦＮ−γの希釈範囲との比較から行う。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】Ｐタンパク質に対するＰタンパク質−Ｎタンパク質の相互作用ドメインの位置決定を示す図である。
【図２】サイズ排除クロマトグラフィーにおけるＮ−ＰΔ１６１Ｎ複合体の溶離特性を示す図である。
【図３】ＲＳＶのＮタンパク質の環状構造を示す図である。
【図４】Ｎ−ＰΔ１６１Ｎ複合体に対する抗体の産生を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示す図である。
【図５】ＰΔ１６１Ｎ及びＮ−ＰΔ１６１Ｎに特異的な細胞性免疫応答を測定することによる、環状構造のＮタンパク質の免疫原性の分析結果を示すグラフである。
【０１８１】
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−Ａｍｅｓ，Ｔ．Ｒ．１９９３．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＢＲＳＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．８８１−８８４．
−Ｂｈｅｌｌａ，Ｄ．，Ｒａｌｐｈ，Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ Ｌ．Ｂ．，＆ Ｙｅｏ，Ｒ．Ｐ．２００２．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ； ８３，１８３１−１８３９．
−Ｃａｓｔａｇｎｅ，Ｎ．，Ａ．Ｂａｒｂｉｅｒ，Ｊ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｒｅｚａｅｉ，Ｊ．−Ｃ．Ｈｕｅｔ，Ｃ．Ｈｅｎｒｙ，Ｂ．Ｄａ Ｃｏｓｔａ，ａｎｄ Ｊ．−Ｆ．Ｅｌｅｏｕｅｔ．２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｐ−Ｐ ａｎｄ Ｐ−Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ； ８５： １６４３−１６５３．
−Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ３８，ｐｐ２０５
−Ｅｌｖａｎｄｅｒ，Ｍ．１９９６．Ｓｅｖｅｒｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ．Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．； １３８，１０１−１０５．
−Ｆｒｅｙｔａｇ，ＬＣ ｅｔ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ＪＤ．２００５．Ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．； ２３（１５）： １８０４−１３．
−Ｇａｄｄｕｍ，Ｒ．Ｍ．，Ｒ．Ｓ．Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｍ．Ｆｕｒｚｅ，Ｓ．Ａ．Ｅｌｌｉｓ ＆ Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ．２００３．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ＣＤ８ａ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ； １０８，２２０−２２９；
−Ｇｏｕｌｄｅｒ ＰＪ，Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｆ，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ Ｐ，Ｍｃｌｎｔｏｓｈ Ｋ，Ｗａｌｋｅｒ ＢＤ．２０００．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．； ７４（１６）： ７６９４−７．
−Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．２７８ ｐ ４４５６７−４４５７３．
−Ｋｈａｔｔａｒ ＳＫ，Ｙｕｎｕｓ ＡＳ，Ｓａｍａｌ ＳＫ．２００１ａ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｎ−Ｐ ａｎｄ Ｐ−Ｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｎｉｇｅｎｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．； ８２（Ｐｔ４）：７７５−９．
−Ｋｈａｔｔａｒ ＳＫ，Ｙｕｎｕｓ ＡＳ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＰＬ，Ｓａｍａｌ ＳＫ．．２００１ｂ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； ２８５（２）： ２５３−６９．
−Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ Ｄ，Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｐ，Ｉｓｅｎｉ Ｆ，Ｇａｒｃｉｎ Ｄ．２００４．Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｙｍｎａｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； ３１８（２）： ４６３−７３．Ｒｅｖｉｅｗ．
−Ｍａｇｇｏｎ Ｋ，Ｂａｒｉｋ Ｓ．２００４．Ｎｅｗ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．１４（３）： １４９−６８．Ｒｅｖｉｅｗ．
−Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ＳＫ，Ｌｕｐｉａｎｉ Ｂ，Ｓａｍａｌ ＳＫ．１９９６．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｎ−Ｐ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．； ７７（Ｐｔ５）： １０１９−２３．
−Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｘ，Ｌｉ Ｘ，Ｋｏｖａｒｉｋ Ｊ，Ｋｌｅｉｎ Ｍ，Ｌａｍｂｅｒｔ ＰＨ，Ｓｉｅｇｒｉｓｔ ＣＡ．１９９９．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｌｉｆｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．； ２９（１０）： ３３９０−４００．
−Ｍａｖｒａｋｉｓ Ｍ，Ｉｓｅｎｉ Ｆ，Ｍａｚｚａ Ｃ，Ｓｃｈｏｅｈｎ Ｇ，Ｅｂｅｌ Ｃ，Ｇｅｎｔｚｅｌ Ｍ，Ｆｒａｎｚ Ｔ，Ｒｕｉｇｒｏｋ ＲＷ．２００３．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ Ｎ゜−Ｐ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； ３０５（２）： ４０６−１４．
−ＭｃＮｅａｌ ＭＭ，ＶａｎＣｏｔｔ ＪＬ，Ｃｈｏｉ ＡＨ，Ｂａｓｕ Ｍ，Ｆｌｉｎｔ ＪＡ，Ｓｔｏｎｅ ＳＣ，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＪＤ，Ｗａｒｄ ＲＬ．２００２．ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｎｅｅｄｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＶＰ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．； ７６（２）： ５６０−８．
−Ｍｅｒｉｃ Ｃ，Ｓｐｅｈｎｅｒ Ｄ，Ｍａｚａｒｉｎ Ｖ．１９９４．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｎ） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒｍｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１（２）： １８７−２０１．
−Ｐｅｒｒｉｎ，Ｂ．，Ｄａｎｎａｃｈｅｒ，Ｇ．，ｅｔ Ｓｏｌｓｏｎａ，Ｍ．１９７９．Ｍｉｓｅ ｅｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｄｅｓ ａｎｔｉｃｏｒｐｓ ｃｏｎｔｒｅ ｌｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｃｈｅｚ ｌｅｓ ｂｏｖｉｎｓ ｆｒａｎｃａｉｓ．Ｒｅｃ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．１５５，４６５−４７１．
−Ｓａｍａｌ ＳＫ，Ｐａｓｔｅｙ ＭＫ，ＭｃＰｈｉｌｌｉｐｓ ＴＨ，Ｍｏｈａｎｔｙ ＳＢ．１９９３．Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍ２ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．； １９３（１）：４７０−３．
−Ｓｌａｃｋ ＭＳ，Ｅａｓｔｏｎ ＡＪ．１９９８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．； ５５（２）： １６７−７６．
−Ｓｐａｒｅｒ ＴＥ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｓ，Ｈｕｓｓｅｌｌ Ｔ，Ｒａｅ ＡＪ，Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ Ｂ，Ｍｅｌｅｒｏ ＪＡ，Ｏｐｅｎｓｈａｗ ＰＪ．１９９８．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｌｏｗｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｖａｃｃｉｎｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｕｎｇ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ； １８７（１１）： １９２１−６．
−Ｔａｒｂｏｕｒｉｅｃｈ，Ｎ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．，Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．，＆ Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，Ｗ．Ｐ．（２０００）．Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７，７７７−７８１．
−Ｔａｙｌｏｒ Ｇ，Ｂｒｕｃｅ Ｃ，Ｂａｒｂｅｔ ＡＦ，Ｗｙｌｄ ＳＧ，Ｔｈｏｍａｓ ＬＨ．２００５．ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｃａｌｖｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ； ２３（１０）： １２４２−５０
−Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｌ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｍ．Ｆｕｒｚｅ，Ｒ．Ｓ．Ｃｏｏｋ，Ｓ．Ｇ．Ｗｙｌｄ，Ｒ．Ｌｅｒｃｈ，Ｒ．Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｇ．Ｗ．Ｗｅｒｔｚ．１９９７．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆ，Ｇ ｏｒ Ｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ Ｍ２，ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ （ＢＲＳＶ） ｉｎｄｕｃｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＢＲＳＶ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｆ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｎｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ； ７８，３１９５−３２０６．
−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｗ．Ｗ．，Ｄ．Ｋ．Ｓｈａｙ，Ｅ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｌ Ｂｒａｍｍｅｒ，Ｎ．Ｃｏｘ，Ｌ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｆｕｋｕｄａ．２００３．Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．ＪＡＭＡ．； ２８９（２）： １７９−８６．
−Ｗｅｌｌｅｍａｎｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｊ．Ｌｅｕｎｅｎ．１９７５．Ｌｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｅｔ ｌｅｓ ｔｒｏｕｂｌｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｉｒｅｓ ｄｅｓ ｂｏｖｉｎｓ． Ａｎｎ． Ｍｅｄ． Ｖｅｔ．； １１９，３５９−３６９．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質の複合体を調製する方法であって、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を、パラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質と同時発現させること、及び
ｂ）こうして形成された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を回収すること
から構成される過程を含む方法。
【請求項２】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パラミクソウイルス科ウイルスが、ヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位〜１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を同時発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランケート型Ｐタンパク質が標識タンパク質との融合タンパク質の形で発現する、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎタンパク質と前記トランケート型Ｐタンパク質とが、細菌の発現系中で同時発現する、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法により得ることができる、パラミクソウイルス科ウイルスの単離された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体。
【請求項９】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項８に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１０】
パラミクソウイルス科ウイルスがヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項９に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１１】
前記Ｐタンパク質のＣ末端断片が、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｃ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
である、請求項１０に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１２】
１０分子のＮタンパク質を含み、Ｐタンパク質のＣ末端断片がＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含みＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の単離された可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体。
【請求項１３】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製すること、及び
ｂ）可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む方法。
【請求項１４】
前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のＣ末端断片である、請求項１３に記載の可溶性Ｎタンパク質を調製する方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の方法により得ることができる、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質。
【請求項１６】
医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を含むワクチン組成物。
【請求項１７】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質が請求項１９又は２０に記載の方法により得ることができる、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
パラミクソウイルス科ウイルスが、ヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１３又は１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を含むワクチン組成物であって、前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができるワクチン組成物。
【請求項２０】
前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のＣ末端断片である、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項１９又は２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
パラミクソウイルス科ウイルスがヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１９〜２１のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｐタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を含む、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を含む診断試薬。
【請求項２６】
前記Ｎタンパク質が、請求項８〜１２のいずれか一つで定義したようなパラミクソウイルス科の同じウイルスのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形である、請求項２５に記載の診断試薬。
【請求項２７】
前記Ｎタンパク質に対する抗体をインビトロで検出するための、請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質の使用方法。
【請求項２８】
生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法であって、
ａ）前記生物サンプルと請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とを接触させること、及び
ｂ）形成されたＮタンパク質／抗体複合体を検出すること
から構成される過程を含み、この複合体の存在が生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に特異的な抗体の存在の指標となる方法。
【請求項２９】
Ｎタンパク質を、請求項８〜１２のいずれか一つに定義したようなパラミクソウイルス科の同じウイルスのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形で生物サンプルと接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質の複合体を調製する方法であって、
ａ）パラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を、パラミクソウイルス科の同じウイルスの、Ｐタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができる、トランケート型Ｐタンパク質と同時発現させること、及び
ｂ）こうして形成された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を回収すること
から構成される過程を含む方法。
【請求項２】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パラミクソウイルス科ウイルスが、ヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位〜１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を同時発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランケート型Ｐタンパク質が標識タンパク質との融合タンパク質の形で発現する、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎタンパク質と前記トランケート型Ｐタンパク質とが、細菌の発現系中で同時発現する、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法により得ることができる、パラミクソウイルス科ウイルスの単離された可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体。
【請求項９】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項８に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１０】
パラミクソウイルス科ウイルスがヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項９に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１１】
前記Ｐタンパク質のＣ末端断片が、
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｃ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
である、請求項１０に記載の単離された可溶性の複合体。
【請求項１２】
１０分子のＮタンパク質を含み、Ｐタンパク質のＣ末端断片がＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含みＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の単離された可溶性Ｎタンパク質−Ｐタンパク質Ｃ末端断片複合体。
【請求項１３】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を調製する方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法により可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を調製すること、及び
ｂ）可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体から可溶性Ｎタンパク質を分離すること
から構成される過程を含む方法。
【請求項１４】
前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のＣ末端断片である、請求項１３に記載の可溶性Ｎタンパク質を調製する方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の方法により得ることができる、パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質。
【請求項１６】
医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質を含むワクチン組成物。
【請求項１７】
パラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質が請求項１９又は２０に記載の方法により得ることができる、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
パラミクソウイルス科ウイルスが、ヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１３又は１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
医薬的に許容される担体中のパラミクソウイルス科ウイルスの可溶性Ｎタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体を含むワクチン組成物であって、前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のオリゴマー化ドメインを含まずＮタンパク質と相互作用することができるワクチン組成物。
【請求項２０】
前記トランケート型Ｐタンパク質がＰタンパク質のＣ末端断片である、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
パラミクソウイルス科ウイルスがニューモウイルスである、請求項１９又は２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
パラミクソウイルス科ウイルスがヒト又はウシの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１９〜２１のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記トランケート型Ｐタンパク質が、ＲＳＶのＰタンパク質のＣ末端の先端の９個のアミノ酸を含み、ＲＳＶのＰタンパク質のＮ末端の少なくとも１６０個のアミノ酸を欠いている、Ｐタンパク質のＣ末端断片である、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
ａ）配列番号１に示すような、ヒトＲＳＶのＬＯＮＧ株のＰタンパク質の２３３〜２４１番のアミノ酸配列を含み、配列番号１に示すような、ＲＳＶのＰタンパク質配列の２３３位から１６１位までの間に含まれるアミノ酸残基までＮ末端の方向に延びている、Ｐタンパク質のＣ末端断片、又は
ｂ）他のヒトＲＳＶ株又はウシＲＳＶ株に由来するＰタンパク質の、ａ）で定義した断片と相同であるＣ末端断片
を含む、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質を含む診断試薬。
【請求項２６】
前記Ｎタンパク質が、請求項８〜１２のいずれか一つで定義したようなパラミクソウイルス科の同じウイルスのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形である、請求項２５に記載の診断試薬。
【請求項２７】
前記Ｎタンパク質に対する抗体をインビトロで検出するための、請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質の使用方法。
【請求項２８】
生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に対する特異的な抗体の検出方法であって、
ａ）前記生物サンプルと請求項１５に記載のパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質とを接触させること、及び
ｂ）形成されたＮタンパク質／抗体複合体を検出すること
から構成される過程を含み、この複合体の存在が生物サンプルにおけるパラミクソウイルス科ウイルスのＮタンパク質に特異的な抗体の存在の指標となる方法。
【請求項２９】
Ｎタンパク質を、請求項８〜１２のいずれか一つに定義したようなパラミクソウイルス科の同じウイルスのＮタンパク質−トランケート型Ｐタンパク質複合体の形で生物サンプルと接触させる、請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５３８９０５（Ｐ２００８−５３８９０５Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０８２５９（Ｐ２００８−５０８２５９）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００９４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１７４５６
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０７３５６３０５）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック （インラ） (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ （ＩＮＲＡ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００９４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１７４５６
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０７３５６３０５）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック （インラ） (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ （ＩＮＲＡ）
【Ｆターム（参考）】
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