パルボウイルス癌治療及び化学療法との組み合わせ
（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤を、好ましくは、別々の構成として有する医薬組成物に関する。パルボウイルスは、パルボウイルスＨ１、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）に基づいているか、上記ウイルス種に基づくベクタ及び／又は上記ウイルス種を活発に作成できる細胞であってよい。医薬組成物は腫瘍の治療に用いることができる。パルボウイルス又は本発明の適用が特に有益な腫瘍には、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫及び膵臓癌が包含される。好ましい化学療法剤はゲムシタビン及びテモゾロジンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）パルボウイルスと（ｂ）化学療法剤を有する医薬組成物、及び脳腫瘍又は膵臓癌などの癌治療のための該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＰＤＡＣ）は、最も致死性の高い胃腸悪性腫瘍の１つである。ＰＤＡＣは、北米では４番目、ヨーロッパでは６番目、英国では５番目に多い癌関連死亡の原因である（非特許文献１、２）。この疾患は、現在利用可能な治療法に対して高い抵抗性を示す。外科的切除は、長期生存の可能性が最も高いが、少数の患者に対してのみ適用可能であり、リスクがないわけではない（非特許文献３）。手術ができない進行した疾患の場合には、特にゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又は５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ：５−ＦＵ）を使用する化学療法が行われるが、その効果は依然として余り高くなく、常に強い一般毒性を伴う（非特許文献４）。ゲムシタビンは、局所進行性又は転移性膵臓癌患者の第一選択薬としてＦＤＡに承認されている。本薬は、代謝拮抗系の細胞周期依存性デオキシシチジン類似体であり、ヒト受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ｈｕｍａｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｈＥＮＴ）を介して細胞内に輸送され、デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｉｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ｄＣＫ）によりリン酸化されて活性型三リン酸塩型となる。ゲムシタビン治療における重要な問題は、この化学療法に対して耐性が生じることである。この耐性は、薬剤の取り込み及びリン酸化の低下、並びに／又は、ＡＢＣトランスポーターファミリのメンバであるＭＤＲ及びＭＲＰ１／２による細胞からの放出の亢進によるもので、ゲムシタビンの細胞内プールが枯渇する（非特許文献５）。耐性変異体を除去して抗癌作用を改良するか、又は化学療法剤の用量を下げて毒性を下げることができる、他の治療法とゲムシタビンとの組み合わせが探索されている。
【０００３】
腫瘍性形質転換細胞を特異的に殺す（腫瘍溶解）ウイルスや武装ベクタ誘導体を使用する癌治療は、この致死性疾患の新しい治療方法である（非特許文献６）。自律増殖型パルボウイルスには、腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれるカテゴリに属するものもある（非特許文献７）。パルボウイルスは、２つの非構造蛋白質（ＮＳ１、ＮＳ２）及び２つのキャプシド蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２）を発現する５．１ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、小さな非エンベロープ粒子（２５〜３０ｎｍ）である（非特許文献８）。パルボウイルスＨ−１ＰＶは、少なくとも脳腫瘍及び他のいくつかの腫瘍において独特の死亡過程を引き起こす、すなわち、リソソームプロテアーゼ（カテプシン）の細胞質への配置及び活性化を引き起こす点で、優れた利点を有する（非特許文献１２）。げっ歯類が自然宿主であるパルボウイルス属（Ｈ−１ＰＶ、ＭＶＭ、ＬｕＩＩＩ）のメンバのあるものは、宿主細胞を形質転換せず、ヒトへの無症候性感染が可能で、腫瘍性形質転換細胞に優先的に伝播し（腫瘍指向性）、殺す（腫瘍溶解）能力を有するため、現在、癌の遺伝子治療への応用が考えられている（非特許文献９、１０）。ＭＶＭｐ及びＨ−１ＰＶウイルスは、生体内で腫瘍抑制活性を発揮すること、すなわち、実験動物に対して、自然に、化学的に、又はウイルスによって誘発した癌の形成を抑制することができることが示されている。パルボウイルスの発現カセットに基づくベクタは、野生型ウイルスの腫瘍指向性を保有する（非特許文献１１）。優れた効果を達成しているもの、ヒトへの臨床応用が最も期待できるパルボウイルス候補（Ｈ−１ＰＶを含む）には、例えば、診断後の寿命を延ばすなどの抗癌活性における改良が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔら， Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２００２；５２：２３−４７．
【非特許文献２】Ｐｉｓａｎｉ Ｐ，Ｐａｒｋｉｎ ＤＭ，Ｂｒａｙ ＦＩら， Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ２５ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ １９９０．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９９；８３：１８−２９．
【非特許文献３】Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ Ｅ，Ｂｉｒｋｍｅｙｅｒ ＪＤ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔｓ：ａ ｄｅｃｉｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ ２００３；１９６：４１０−１７．
【非特許文献４】Ｂｕｒｒｉｓ ＨＡ ３ｒｄ， Ｍｏｏｒｅ ＭＪ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｊら， Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｗｉｔｈ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ａｓ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９７；１５：２４０３−１３．
【非特許文献５】Ｇｉｏｖａｎｎｅｔｔｉ Ｅ， Ｍｅｙ Ｖ， Ｎａｎｎｉｚｚｉ Ｓら， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００６；５：１３８７−９５．
【非特許文献６】Ｈｅｃｈｔ ＪＲ， Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｒ， Ａｂｂｒｕｚｚｅｓｅ ＪＬら， Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＯＮＹＸ−０１５ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｉｎ ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；９：５５５−６１．
【非特許文献７】Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ Ｊ， Ｃｏｒｎｅｌｌｓ Ｊ． Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９１；３３：２３３−５１．
【非特許文献８】Ｃｏｔｍｏｒｅ ＳＦ， Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ． Ｔｈｅ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ． Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １９８７；３３：９１−１７４．
【非特許文献９】Ｈａａｇ Ａ， Ｍｅｎｔｅｎ Ｐ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊら， Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ； ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００；ｌｌ：５９７−６０９．
【非特許文献１０】Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬら， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８．
【非特許文献１１】Ｏｌｉｊｓｌａｇｅｒｓ Ｓ， Ｄｅｇｅ ＡＹ， Ｄｉｎｓａｒｔ Ｃら, Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１；８：９５８−６５．
【非特許文献１２】Ｄｉ Ｐｉａｚｚａ Ｍ， Ｍａｄｅｒ Ｃ， Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ Ｋら, Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ＴＲＡＩＬ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００７；８１：４１８６−９８．
【発明の概要】
【０００５】
従って、本発明は、改良されたパルボウイルスに基づく治療方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明によれば、前記課題は特許請求の範囲に記載の内容により達成される。本発明は、パルボウイルスとゲムシタビン（現時点で膵臓癌及び他の癌に使用できる最も効力のある化学療法剤であるが、なお強い毒性プロファイルを有する）のような化学療法剤との併用治療によって、該薬剤の毒性が低減され、かつ、治療効率が改善されるという発見に基づく。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットに膵臓腫瘍を同所移植し、異なる治療レジメンで、ゲムシタビン、Ｈ−１ＰＶ又は両者の併用で治療した。骨髄、肝及び腎の機能を臨床的に関連するマーカのレベルによりコントロールしながら、腫瘍サイズをコンピュータ断層撮影法により測定した。ヒト膵細胞株とそのゲムシタビン耐性誘導株について、Ｈ−１ＰＶ又は薬剤との組み合わせに対する感受性を生体外で試験した。ゲムシタビン及びその後のＨ−１ＰＶの腫瘍内注入は、腫瘍の成長を遅らせ、ＣＴスキャンでは転移が認められず、動物の生存を引き伸ばすことが示された。毒物学的スクリーニングでは、Ｈ−１ＰＶは、ゲムシタビンとの併用によって組織に何ら損傷を与えることはないことが示された。生体外の検討では、パルボウイルス複製に対するゲムシタビンの負の効果にもかかわらず、併用によりそれぞれの治療効果が相乗的に働くことを示した。耐性細胞は、Ｈ−１ＰＶによる殺作用に対して感受性のままであり、ゲムシタビンの存在下でもウイルス発現を維持することができた。パルボウイルスと化学療法剤テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）の併用による神経膠腫の治療においても同様の結果を得た。従って、パルボウイルスは、ＰＤＡＣや神経膠腫のような癌の治療において、好ましくは、２段階プロトコルによる化学療法との併用による癌の治療において、非常に高い効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｈ−１ＰＶ単独又はゲムシタビンとの併用による毒性作用に対するヒトＰＤＡＣ細胞株の感受性を示す。（Ａ）示されたＭＯＩでのＨ−１ＰＶ感染後のＰａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞の残留コロニ形成能を示す。コロニは、クリスタル・バイオレット染色後に計数し、生存数を擬似処理細胞に対する百分率として示す。（Ｂ）異なる濃度でのゲムシタビン処理の２４時間後に、１０ｃｆｕ／細胞のＭＯＩでＨ−１ＰＶを感染させた上記細胞の死滅を示す図である。生存細胞を、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死として逆に表現した。平均値及びＳＤバーは、３回の独立した実験を３重で行って得たものを示す。
【図２】ゲムシタビン耐性細胞株及びそのＨ−１ＰＶに対する感受性の特徴を示す図である。Ａ：ＲＴ−ＰＣＲにより測定した、親（−）及びゲムシタビン耐性（Ｒ）Ｐａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞における薬剤耐性マーカの発現を示す。β−アクチン転写レベルを参照とした。Ｂ：ＭＯＩ＝１０ＲＵ／細胞でＨ−１ＰＶを感染させ（Ｈ−１ＰＶ）又は感染させていない（ｍｏｃｋ）、ゲムシタビン耐性（Ｒ）Ｐａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞の顕微鏡写真（４０倍）を示す。Ｃ：ゲムシタビン耐性（Ｒ）及び親の、Ｐａｎｃ−１細胞（上図）及びＢｘＰＣ−３細胞（下図）のＨ−１ＰＶ又はゲムシタビンに対する感受性を示す図である。細胞は、９６ウェルプレートに２×１０３個／ウェルの密度で播種し、Ｈ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞、Ｈ−１ＰＶカラム）又はゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅカラム）で処理した。ＭＴＴ細胞毒性アッセイは、処理の１４４時間後に行った。３回の独立した実験の結果を示す。統計的な有意差はアスタリスクで示す（＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．００５）。Ｄ：Ｐａｎｃ−１細胞及びＰａｎｃ−１Ｒ細胞への組換えＨ−１ＰＶによるＥＧＦＰの形質導入の結果を示す。培養物は、ゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ）で処理し（上図）又は処理せず（下図）、同時にウイルスベクタ（５ＲＵ／細胞）を感染させた。形質導入遺伝子を発現する細胞は、感染の４８時間後に蛍光顕微鏡により検出した。代表的な領域を示す。
【図３】ＰＤＡＣ形成ラットモデルに対するＨ−１ＰＶの効果を示す図である。皮下ＨＡ−ＲＰＣ腫瘍由来細胞懸濁液を、ラット（ｎ＝２６）の膵臓へ注入し、２週間後に、形成している腫瘍に対して１×１０９ＲＵのＨ−１ＰＶ（ｎ＝１６）を腫瘍内播種処理し、又は擬似処理（ｎ＝１０）した。
【図３Ａ】Ｈ−１ＰＶ処理及び擬似処理腫瘍の成長を示す図である。腫瘍の体積はｍＣＴスキャンによる時間の関数として測定し、平均値にＳＤバーを付して表した。
【図３Ｂ】Ｈ−１ＰＶ処理及び擬似処理動物の生存を示す図である。各群１０匹のラットを、実験を終了した１２０日目までモニタした。
【図３Ｃ】担癌ラットにおけるＨ−１ＰＶ発現の分布を示す図である。Ｈ−１ＰＶ処理群のラットを、感染後２日目、１０日目及び２０日目に２匹ずつ屠殺し、臓器をウイルス転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出用に処理した。腸（Ｉｎｔ）、パイエル板（Ｐｅｙ）、肝（Ｌｉｖ）、脾（Ｓｐｌ）、リンパ節（ＬＮ）、膵（Ｐａｎ）及び腫瘍（Ｔｕ）について、ウイルスＤＮＡ、前駆体ＲＮＡ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）及びｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物を示す。
【図３Ｄ】感染膵臓腫瘍におけるＨ−１ＰＶのＮＳ１蛋白質（矢印）の免疫組織化学的検出を示す図である。担ＰＤＡＣラットを、腫瘍内に接種した３時間後、３日後、及び７日後に３匹ずつ屠殺した。パラフィン包埋した腫瘍切片を免疫組織化学分析した（２０倍）。
【図３Ｅ】ラット腫瘍モデルの特徴：Ｈ−１ＰＶ感染に対する感受性及び組織構造を示す図である。（ａ）細胞を９６ウェルプレートで培養し、異なる濃度（４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）のゲムシタビンで処理し、２４時間後にＨ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）で感染させた。生存細胞は感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死率として逆に表現した。（ｂ）正常ラット膵臓及び膵臓腫瘍から得たパラフィン包埋腫瘍切片をヘマトキシリン−エオシン染色した。ＮＰは正常膵臓を、ＰＤＡＣは膵管癌を示す。
【図４】同所性膵臓腫瘍のｍＣＴイメージングを示す図である。Ａ：腫瘍発生後初期（２週間）におけるラット腹部ＣＴスキャンを示す。膵尾部において直径約５ｍｍの腫瘍（点線）がみられる。Ｂ：ウイルス治療をしない場合のＰＤＡＣの進行を示す。腫瘍発生の８週間後に、大きな原発腫瘍塊（点線）、並びにリンパ節及び肝臓における転移癌（矢印）が認められる。Ｃ：腫瘍発生の２週間後及び８週間後、Ｈ−１ＰＶ処理ラットにおいて原発腫瘍の退縮が認められ、転移は認められなかった。原発腫瘍及び転移癌の局在を説明するために矢状、軸状及び冠状ｍＣＴスキャンイメージを選択した。
【図５】ゲムシタビン及びパルボウイルスの併用治療後の担癌動物の生存を示す。Ａ：膵臓内腫瘍を有するラットを４群（ｎ＝１１）に分け、ＰＢＳ処理（対照）、ゲムシタビン単独処理（ゲムシタビン）、ゲムシタビンとウイルスとの同時処理（Ｈ−１パルボウイルス及びゲムシタビン）、又はゲムシタビンで最初に処理し、その１４日後にＨ−１ＰＶで処理（ゲムシタビン プレ Ｈ−１パルボウイルス）した。動物の生存を１００日に亘って観察し、カプラン・マイヤ曲線として示した。生存中央値及びＰ値をその下に示した。Ｂ：皮下にＢｘＰＣ−３腫瘍を有するヌードマウスを４群（ｎ＝５）に分け、腫瘍発生の２１日後にＰＢＳ処理（対照）、ゲムシタビン単独処理（ゲムシタビン）、ウイルス（３×１０８ＲＵ）単独処理（Ｈ−１パルボウイルス）、又はゲムシタビンで最初に処理し、７日後にＨ−１ＰＶで処理（ゲムシタビン プレ Ｈ−１パルボウイルス）した。
【図６】ゲムシタビンとＨ−１ＰＶとの併用の毒性評価を示す図である。最後の治療処理の２週間後に、対照群、ゲムシタビン群、及びゲムシタビンプレＨ−１パルボウイルス群（図４Ａ参照）の各群の担ＰＤＡＣラット３匹から血液を採取した。血液検体について、（Ａ）赤血球（ＲＢＣ）、血小板、白血球（ＷＢＣ）の数、及び関連パラメータ、並びに（Ｂ）肝臓（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＬＡＴ）、及び腎（クレアチニン）マーカを分析した。データはＳＤバー及び平均値で示す。
【図７】処理６日後の星状膠細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の６日後の生存ヒト星状膠細胞を百分率（％）で示す。
【図８】処理の３日後及び６日後のＲＧ２細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存ＲＧ２細胞を百分率（％）で示す。
【図９】処理の３日後及び６日後のＵ８７ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ８７ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１０】処理の３日後及び６日後のＵ３７３ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ３７３ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１１】処理の３日後及び６日後のＵ３４３ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ３４３ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１２】処理の３日後及び６日後のＡ１７２細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ａ１７２細胞を百分率（％）で示す。
【図１３】Ｈ−１ＰＶ単独又はゲムシタビンとの併用の毒性作用に対するヒトＰＤＡＣ細胞株の感受性を示すグラフである。Ｃｏｌｏ３５７細胞、Ｔ３Ｍ−４細胞、ＳＵ８６．８６細胞、ＭｉａＰａＣａ−２細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、及びＢｘＰＣ−３細胞を９６ウェルプレート上で、２×１０３細胞／ウェルの密度で培養し、ゲムシタビン（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後にＨ−１ＰＶ（１、１０又は１００ＲＵ／細胞）で処理した。生存細胞は、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死率として逆に表現した。データは、３回の独立した実験を４重で行った平均値である。
【図１４】処理後ＰＤＡＣ細胞株のカテプシンＢ活性を示す。Ｐａｎｃ−１細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、及びＣａｐａｎ−１細胞を、Ｈ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）、及びゲムシタビン（４ｎｇ／ｍＬ）の各単独又は組み合わせで処理し、細胞質及びリソソームのカテプシンＢ活性を測定した。グラフはリソソームに対する細胞質の比を３回の独立した実験の平均値と共にＳＤバーを示している。
【図１５】Ｈ−１ＰＶ誘導死に対するゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞の感受性を示す。反復薬剤被爆後にゲムシタビン耐性として選択した細胞を、播種の２４時間後にゲムシタビン（１ｎｇ／ｍＬ）又はＨ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）のいずれかで処理した。生存を評価するために、処理の１４４時間後にＭＴＴアッセイを行った。データは、擬似処理対照に対する死亡細胞の割合を示し、３回の独立した実験を４重で行った平均値と共にＳＤバーを示している。
【０００８】
本発明は、パルボウイルス及び化学療法剤を含む医薬組成物を提供し、好ましくは、（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤を独立した構成要素として、例えば、別々の容器内に含有する医薬組成物を提供する。
【０００９】
好ましくは、上記医薬組成物では、パルボウイルス及び化学療法剤の有効量が薬学的に許容される担体と組み合わせて含まれる。「薬学的に許容される」には、有効成分の生物学的活性の効果を妨げることなく、投与される患者に有毒でない、任意の担体が包含される。好適な薬学的担体の例は、本技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水乳液などの乳液、種々の湿潤剤、殺菌溶液などを含む。そのような担体を、従来の方法により製剤化し、有効量を患者に投与することができる。
【００１０】
「有効量」とは、疾患の経過及び重篤度に影響し、その病状を軽減又は寛解するのに十分な有効成分の量を意味する。これらの疾患や障害を治療及び／又は予防するために有用な「有効量」は、当業者に公知の方法により決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４６ （１９７５）参照）。
【００１１】
その他の薬学的に適合する担体としては、ゲル、生体吸収可能なマトリクス材料、治療剤含有移植用構成物、又は他の好適な運搬媒体、送達又は調剤の手段又は物質を含むことができる。
【００１２】
化合物の投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所又は皮内投与により行ってもよい。当然、投与経路は治療の種類、及び医薬組成物に含有される化合物の種類に依存する。好適な投与経路は静脈内投与である。パルボ治療剤と化学療法剤の投与レジメンは、患者データ、診断の他、例えば、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定のパルボウイルス、細胞や化学療法剤など、投与時間や経路、腫瘍の種類や特性、患者の全体的な健康状態、患者が受けている他の薬剤治療などの他の臨床因子に基づいて、担当医の技術の範囲で容易に決定することができる。
【００１３】
本発明による薬剤を組み合わせたパルボ治療薬が血液脳関門を通過できる感染性ウイルス粒子を有する場合、ウイルス治療剤、例えば、Ｈ１ウイルスの静脈注射により治療を行い、又は少なくとも治療を開始することができる。好ましい投与経路は腫瘍内投与である。
【００１４】
長期の静脈注射治療は、ウイルス治療薬に対する中和抗体の形成により効果がなくなりやすいので、静脈内投与によるウイルスの初回投与後に他の投与方法を採用することができる。あるいは、そのような他の投与方法、例えば、頭蓋内又は腫瘍内ウイルス投与を、パルボウイルス処理の全工程を通して使用することもできる。
【００１５】
その他の具体的投与方法としては、パルボ治療薬（ウイルス、ベクタ及び／又は細胞剤）は、患者に移植された放出源から患者に投与することができる。例えば、シリコーンや他の生体適合性物質のカテーテルを、腫瘍を摘出する際、又はこれと独立した手順によって患者に埋め込まれた小さな皮内リザーバ（リッカム（Ｒｉｃｋｈａｍ）リザーバ）に連結し、更なる外科的介入を必要とせずに、パルボ治療用組成物を局所的に、様々な回数注入することができる。パルボウイルス又はそれに由来するベクタは、定位手術法又はニューロナビゲーション標的法により、腫瘍に注入することもできる。
【００１６】
パルボウイルス剤又は組成物の投与は、埋め込み式カテーテルを介して、蠕動輸液ポンプや対流増進送達（ＣＥＤ）ポンプなどの適当なポンプシステムを使用して、低流速でウイルス粒子又はウイルス粒子を含有する液を持続的に注入することにより行うこともできる。
【００１７】
更に他のパルボ治療組成物の投与方法では、パルボ治療薬を目的の腫瘍組織に投与するように構築、配置した埋め込み式デバイスから投与する。例えば、パルボウイルスＨ１などのパルボ治療組成物を含浸させたウエハを用いることができ、当該ウエハは、外科的腫瘍摘出の結果生じた切除腔の端に取り付ける。そのような治療介入では複数のウエハを使用することができる。パルボウイルスＨ１やＨ１ベクタなどのパルボ治療剤を活発に産生する細胞を、腫瘍や腫瘍摘出後の腫瘍腔に注入することもできる。
【００１８】
本発明の併用治療は、癌、特に、脳腫瘍や膵臓癌、好適には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療に有用であり、当該疾患の予後を著しく改善することができる。パルボウイルスＨ１感染は、腫瘍細胞を死滅させる効果を有するが、正常細胞を傷つけない。また、そのような感染は、例えば、パルボウイルスＨ１などの好適なパルボウイルスや関連ウイルス、又はそれらのウイルスに基づくベクタを脳内で使用することにより、神経学的副作用や他の副作用なしに、腫瘍特異的治療を行うことができる。
【００１９】
本発明はまた、癌の治療用医薬組成物の製造のための（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤の使用に関し、好ましくは、（ａ）及び（ｂ）は連続して（又は別々に）投与される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、薬剤の併用は、（ａ）神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫などの脳腫瘍、又は（ｂ）膵臓癌の治療に用いることができる。神経膠腫は、好ましくはヒト悪性膠芽細胞腫である。
【００２１】
本明細書で使用される用語「パルボウイルス」は、野生型及び複製能を有するその修飾誘導体に加え、関連ウイルス又はそれらウイルスや誘導体に基づくベクタを含む。パルボウイルス、誘導体など、及びパルボウイルスを活発に産生し、治療に使用可能である細胞の公的な形態は、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本明細書の開示に基づいて容易に決定可能である。
【００２２】
本発明の他の好ましい実施形態では、組成物のパルボウイルスは、パルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又はＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（Ｒａｔ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（Ｒａｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＲＰＶ）、ラットウイルス（Ｒａｔ ｖｉｒｕｓ：ＲＶ）などの関連するパルボウイルスが含まれる。
【００２３】
本発明の薬剤の併用により治療可能な患者には、ヒトの他、非ヒト動物も含まれる。非ヒト動物は、これに限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどの動物を含む。
【００２４】
本発明の目的に有用な化学療法剤には、腫瘍の成長阻害に効果的な全ての化合物が含まれる。化学療法剤の投与は、非経口及び経腸経路による全身的な経路を含む、種々の方法（上記参照）により達成される。好ましくは、パルボウイルスと化学療法剤は別々の化合物として投与される。
【００２５】
更に好ましい実施形態では、パルボウイルスは化学療法剤の投与後に投与される。化学療法剤の投与とパルボウイルスの投与との間の好ましい期間は、１４〜３５日である。
【００２６】
好適な化学療法剤としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキルなどのアルキル化剤；葉酸、プリン及びピリミジン拮抗剤などの代謝拮抗物質；ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン誘導体などの分裂抑制剤；細胞毒性抗生物質；ＤＮＡ発現を損傷し又は妨げる化合物；成長因子レセプタ拮抗剤を挙げることができる。
【００２７】
併用治療に好適な化学療法剤の特別な例として、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特に、好ましい化学療法剤はゲムシタビンとテモゾロジンである。
【００２８】
最後に、本発明はまた、膵臓癌の治療用の医薬組成物の調製のための、パルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルス、例えば、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、ラットウイルス（ＲＶ）の使用に関する。好ましい使用は、薬剤耐性癌、例えば、ゲムシタビンに耐性を有する膵臓癌の治療である。
【００２９】
下記実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００３０】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）細胞培養及び処理
ヒト膵臓癌細胞株及び転移腫瘍（Ｃｏｌｏ３５７、Ｔ３Ｍ−４、及びＳＵ８６．８６）をＡＴＣＣ（マサチューセッツ、バージニア州）から取得し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した、ＲＰＭＩ１６４０（ＭｉａＰａＣａ−２、ＢｘＰＣ−３、及びＣａｐａｎ−１）又はＤＭＥＭ（Ｐａｎｃ−１）培地中で培養した。０．０００４μｇ／ｍＬの濃度で２時間から開始して０．００４μｇ／ｍＬの濃度で２４時間までゲムシタビン用量を増加させて細胞を複数回継代して耐性細胞を生成させた。
【００３１】
ＳＶ４０形質転換新生ヒト腎細胞２９３Ｔ細胞及びＮＢＫ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養した。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラット内に化学誘導した膵管腺癌から作成した癌細胞株ＨＡ−ＲＰＣを、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ内で培養した（Ｅｖｒａｒｄ Ｓ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｐ，Ｈａｊｒｉ Ａら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １９９４；８１：１１８５−８９）。全ての培地にペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃に保持した。ゲムシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ、インディアナポリス、インディアナ州、米国、より購入）を図に示す濃度で添加した。
【００３２】
細胞毒性の評価では、細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０３細胞の密度で播種し、図に示す通りに処理した。細胞の生存率は、比色３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、製造者（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）の推奨する方法に従って測定した。
【００３３】
（Ｂ）細胞の生存率
９６ウェルディッシュ上に播種し、図に示すように処理した細胞について、比色３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、その生存率を評価した。コロニ形成能の測定のため、細胞を６ｃｍ２皿当たり２５０（Ｐａｎｃ−１）又は８００（ＢｘＰＣ−３及びＣａｐａｎ−１）の密度で播種し、示す通りに処理し、更に１４日間培養した。培地を吸引後、細胞コロニをクリスタル・バイオレットで染色し、水道水で洗浄し、顕微鏡下で計数した。生存画分（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ:ＳＦ）は、式：ＳＦ＝コロニ数の平均／（播種細胞数×（ＰＥ／１００））により決定した。ここで、ＰＥは、処理を行わなかった場合の各細胞の播種効率である。
【００３４】
（Ｃ）顕微鏡法
培養物は、ライカ倒立顕微鏡を使用して４０倍で観察した。画像取込は、ライカＤＦＣ３５０ＦＸカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ケンブリッジ）及びマッキントッシュ用ライカＦｉｒｅＣａｍソフトウェアを使用して行った。ＥＧＦＰ蛍光は、ライカＤＭＲＢＥ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ドイツ）及び分析ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ドイツ）を使用して測定した。
【００３５】
（Ｄ）ウイルス作製及び検出
野生型Ｈ−１ウイルスをＮＢＫ細胞を感染させることにより作製し、イオジキサノール勾配遠心分離により精製し、リンガ液に対する透析を行った。Ｈ−１ＰＶＥＧＦＰ組換えウイルスは、２９３Ｔ細胞を組換えベクタＤＮＡ及びトランスにウイルスキャプシド遺伝子を発現するヘルパープラスミドでコトランスフェクトして作製した（Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ Ｃ，Ｔｅｓｆａｙ Ｌ，Ｓａｌｏｍｅ Ｎら， Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｏｃｋｓ ｗｉｔｈ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７：３８５１−８）。ウイルスの力価は、以前記述したとおりに測定し、複製中心作成ユニット（ｃｆｕ）として表す。すなわち、精製ウイルスの段階希釈物をＮＢＫ細胞に添加して行った。感染の４８時間後に、感染培養物をフィルタ上にブロットし、複製中心をＤＮＡ特異的放射性プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出した（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬら， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８）。
【００３６】
処理動物の臓器又はＰＤＡＣ細胞培養物におけるウイルス転写の分析のために、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用して製造者の取扱説明書に従い、採取組織又は細胞沈殿物試料から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、以前詳細に記載したＲＴ−ＰＣＲにより定量した（Ｇｉｅｓｅ ＮＡ，Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，ＤｅＭａｒｔｉｎｏ Ｌら， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ ｂｙ ａ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＭＶＭｐ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ＩＰ−１０ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；９：４３２−４２）。Ｈ−１ＰＶ転写産物は、一対のプライマ：５’−ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧ−３’（フォワード）及び５’−ＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（リバース）を使用して、短いイントロンの切除に基づく５１２及び４１５ｂｐのＰＣＲフラグメントの形で検出した。ｈＥＮＴ及びｄＣＫｍＲＮＡに特異的なプライマは以下の通りである：ｈＥＮＴについては、５’−ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣ−３’（フォワード）及び５’−ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＡ−３’（リバース）、ｄＣＫについては、５’−ＣＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣ−３’（フォワード）及び５’−ＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＣ−３’（リバース）。ヒトβ−アクチン、及びＭＤＲ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２遺伝子の発現を検出するために使用したプライマは、以前記載した通りである（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ，Ｍｅｒｋｏｒｄ Ｊ，Ａｄａｍ Ｕら， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ２００４；２８：４５−５２）。
【００３７】
（Ｅ）動物実験
（ｉ）麻酔：全ての外科的及び画像処置は、純粋酸素中に３％イソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ、Ｍａｕｒｅｐａｓ、フランス）を含有するガス麻酔下に行い、外科的処置では、鎮痛剤として２〜３ｍｇ／ｋｇの塩酸キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）を同時に筋肉内注射した。
【００３８】
（ｉｉ）腫瘍モデル：１８０〜２００ｇのオスのルイスラット（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ、フランス）を膵臓癌移殖用に使用した。５×１０６ＨＡ−ＲＰＣ細胞を膵臓実質に注入した。注入後最初の３週間では、腫瘍形成は膵臓尾部に限定されるが、４週目にリンパ節に浸潤する。肝臓への転移は５〜６週間で現れ、６〜９週間で肺転移を起こし死に至る（Ｍｕｔｔｅｒ Ｄ，Ｈａｊｒｉ Ａ，Ｔａｓｓｅｔｔｉ Ｖら，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ ａｆｔｅｒ ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｙ ｖｓ ｌａｐａｒｏｔｏｍｙ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇ Ｅｎｄｏｓｃ １９９９；１３：３６５−７０）。ラットは、バランスのとれたペレット餌と水を制限なく摂取できる、標準的状態（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、明暗周期：１２時間）に保持した。動物実験は、動物愛護に関するフランス及びヨーロッパコミュニティの指令（１９８６年１１月２４日、Ｎｏ．８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行った。
【００３９】
ゲムシタビンは腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）により投与した。Ｈ−１ＰＶは腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ：ｉ．ｔ．）に植菌した。血液試料は最後の治療処理の２週間後に尾部静脈より採取した。毒性マーカは、自動臨床検査分析（生化学的複数パラメータ解析装置Ｂｉｏｃｈｉｍｅ ＡＤＶＩＡ１６０：Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）を使用してストラスブルグ大学病院内でアッセイした。
【００４０】
（ｉｉｉ）画像取得及び再構築：画像は、８０ｋＶｐ Ｘ線電圧、５００μＡアノード電流を使用して、イムテックマイクロＣＴスキャナ（ｍｉｃｒｏＣＡＴ−ＩＩ、Ｉｍｔｅｋ Ｉｎｃ．、Ｋｎｏｗｖｉｌｌｅ、テネシー州）上に取得した。腹部臓器位置の変化及びそれによる像のぼやけを避けるために、呼吸ゲート取得を使用した。イメージングの９時間前に、肝臓及び持続血管造影のために、それぞれＦｅｎｅｓｔｒａ（登録商標）ＬＣ及びＦｅｎｅｓｔｒａ（登録商標）ＶＣ造影剤（Ａｌｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州) を腹腔内に同時に注入した。画像データは、Ｉｍｔｅｋ認可ソフトウェア（Ｃｏｂｒａ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１−４、Ｅｘｘｉｍ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、テネシー州）を使用して取得、再構築した。３Ｄ画像は、アミラソフトウェア（Ａｍｉｒａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｖ．３．１、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して可視化した。コントラスト化した肝又は膵葉内に黒い異常として現れる腫瘍又は転移は、アミラ３Ｄデータセットを使用して三次元的に測定した。
【００４１】
（Ｆ）免疫組織化学的解析
パラフィン包埋腫瘍切片をキシレンで脱蝋し、段階的なアルコール溶液で再水和した。内因性パーオキシダーゼ活性は、メタノール中０．３％過酸化水素で抑制した。非特異的結合を阻止するために、スライドを非免疫正常ウサギ血清（Ｄａｋｏ、チューリッヒ、スイス）で１時間処理した。Ｈ−１ＰＶ ＮＳ１蛋白質特異的３Ｄ９抗体（１：５０）（Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｓａｌｏｍｅ博士からの供与、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）と一晩静置（４℃）した後、スライドを洗浄し、ウサギ抗マウス西洋ワサビパーオキシダーゼ標識二次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）で処理し、ＤａｋｏＥｎｖｉｓｉｏｎ＋ＴＭシステム（Ｄａｋｏ）を使用して現像し、マイヤー・ヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ'ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）により対比染色した。
【００４２】
（Ｇ）統計的分析
（ｉ）生体外実験：３重で行った生体外実験から、平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビンが生体外で相乗的に相互作用するかどうかを調べるために、他の化学及びウイルス療法において既に説明されているように、ＭＴＴアッセイから得られたデータに基づいてアイソボログラフィック（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ）分析を行った（Ｎｏｗａｋ ＡＫ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＢＷ，Ｌａｋｅ ＲＡ．Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｅｘｅｒｔｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏ−ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；６２：２３５３−８）。ゲムシタビンとＨ−１ＰＶの５０％及び７５％有効濃度（ＥＣ）値（ＥＣ５Ｏ及びＥＣ７５）は、それぞれ濃度（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）及びＭＯＩ（１、１０、１００ＲＵ／細胞）の範囲に基づいて実験的に決定した。アイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）は、２つの薬剤の組み合わせから得られたデータにより作製した。組み合わせ（ＣＩ）及び感作（ＳＩ）の指標は、次の等式を使って算出した。ＣＩ＝（ＤＨ１．ｃ／ＤＨ１．ａ)＋（ＤＧ．ｃ／ＤＧ．ａ）＋（ＤＨ１．ｃ＊ＤＧ．ｃ／ＤＨ１．ａ＊ＤＧ．ａ）、ＳＩＨ−１ＰＶ＝ＤＨ１．ａ／ＤＨ１．Ｃ、ＳＩｇｅｍ＝ＤＧ．ａ／ＤＧ．ｃ、ここで、ＤＨ１．ｃ、ＤＨ１．ａ、ＤＧ．ｃ、ＤＧ．ａは、それぞれＨ−１ＰＶ又はゲムシタビン単独（Ｈｌ．ａ、Ｇ．ａ)又は組み合わせ（Ｈｌ．ｃ、Ｇ．ｃ)におけるＥＣ５０／７５用量である。ＣＩ＝１は、不変アイソボログラムを示し、相加効果を意味する。ＣＩ値が１以下の場合は、期待される相加効果よりも高い（相乗）ことを意味する。
【００４３】
（ｉｉ）生体内実験：３重で行った生体内実験から、平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。ｍＣＴスキャンサイズ測定により生体内で測定された腫瘍体積の差は、等分散性を示したバートレット検定としてパラメトリック不対スチューデントｔ−検定に従い一元配置分散分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合、値の相違は有意であると判断した。生存曲線はカプラン・マイヤ法により作成し、曲線間の相違は対数階数検定により評価した。Ｐ値＜０．０５の場合、統計学的に有意差を有すると判断した。Ｉｎｓｔａｔ２．００マッキントッシュソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用した。
【００４４】
（Ｈ）細胞分画及びプロテアーゼ活性測定
ゲムシタビン単独（４ｎｇ／ｍＬ）、Ｈ−１ＰＶ単独（１０ＲＵ／細胞）、又は両薬剤の組み合わせで処理したＰａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞から取得した細胞質及びリソソーム画分におけるカテプシンＢ活性を測定した。培養物をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で回収し、遠心分離でペレット化し、低張緩衝液（０．２５Ｍショ糖、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、細胞分解装置でホモジナイズした。４℃、２５００×ｇで、１０分間の遠心分離して、核及び重ミトコンドリアをペレット化した。上清部（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ:ＰＮＳ）を保存し、潜在する酵素の測定に使用した。ＰＮＳを４℃、１７０００×ｇで、２０分間遠心分離することにより、軽ミトコンドリア画分（ＬＭＦ）を得た。上清は細胞質抽出物として回収し、ＬＭＦペレットは低張緩衝液に再懸濁させた。細胞質及びＬＭＦ画分のそれぞれを、５０ｍＭモルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．０）、０．２５Ｍショ糖、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインからなる反応混合液に添加した。１０分間静置後、１ｍＭの基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、３６０ｎｍで励起後の、波長４５５ｎｍにおける発光をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ＆ＦＬ光度計（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍ）で１時間測定した。
【００４５】
（Ｉ）ゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７及びＴ３Ｍ−４細胞の単離
ゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞は、それぞれの親株について決定されたゲムシタビンＥＣ５０（Ｔ３Ｍ−４は、１．２ｎｇ／ｍＬ、Ｃｏｌｏ３５７は、１．５ｎｇ／ｍＬ）で４８時間細胞を処理することを含む選択サイクルを５回行って単離した。親細胞及び耐性細胞の薬剤感受性は、ＭＴＴとクローン生存アッセイの両方で評価した。
【００４６】
実施例２．Ｈ−１ＰＶは、単独及びゲムシタビンと協調して培養ヒト膵臓癌細胞を殺し、細胞質に活性カテプシンＢを遊離する
６つのヒトＰＤＡＣ細胞株、Ｃｏｌｏ３５７、Ｔ３Ｍ−４、ＳＵ８６．８６、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ−１、及びＢｘＰＣ−３について、Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン毒性に対する感受性を試験した（表１、図１、及び図１３）。ＭｉａＰａＣａ−２、ＳＵ８６．８６、及びＴ３Ｍ−４は、ウイルス誘導性細胞死に過敏であり、Ｃｏｌｏ３５７、ＳＵ８６．８６、及びＴ３Ｍ−４はゲムシタビンに対して最も感受性を示した。重要なことは、ゲムシタビン処理に強い抵抗性を示した細胞株（Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、及びＭｉａＰａＣａ−２）はＨ−１ＰＶに感受性を示したことである。
【００４７】
【表１】
【００４８】
培養物を９６ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルで播種し、ゲムシタビン（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に異なるＭＯＩ（１、１０、１００ＲＵ／細胞）でＨ−１ＰＶを感染させた。細胞毒性は、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより評価した。単独（ｍｏｎｏ）と併用（ｃｏｍｂ）処理におけるＥＣ５０は、異なるＭＯＩ（Ｈ−１ＰＶ）及び濃度（ゲムシタビン）で得られたＭＴＴ測定結果を使って作成したアイソボログラムから算出した。組み合わせ指標（ＣＩ）及び感作指標（ＳＩ）は、材料及び方法で説明したように決定した。
＊示す細胞株は、Ｈ−１ＰＶ殺作用に対して過敏であるため、統計分析にはＥＣ７５を使用した。Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン単独治療でのＥＣ５０値を括弧内に示す。
【００４９】
表１に示すように、併用治療の細胞毒作用はほとんどの場合に相乗的であり（ＣＩ＜１）、特に、ＭｉａＰａＣａ−２細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、及びＳＵ８６．８６細胞で相乗効果が高かった。効果的なウイルス用量は、１．３ｎｇ／ｍＬ（Ｃｏｌｏ３５７、組み合わせ１）から２００ｎｇ／ｍＬ（Ｐａｎｃ−１、組み合わせ１）までの用量範囲のゲムシタビン存在下において、因子（ＳＩＨ−１ＰＶ）で３５倍まで下げることができた。反対に、細胞増殖の阻害に必要な効果的な薬剤濃度は、細胞をＨ−１ＰＶ（ＭｉａＰａＣａ−２、組み合わせ２）を感染させた場合、因子（ＳＩＧｅｍ）で１５倍まで下げられた。２週間の全ての細胞株のコロニ形成能は、両方のＨ−１ＰＶにより効果的に阻害された（データは非図示）。
【００５０】
更に、ＰＤＡＣ由来株のカテプシンＢ活性の細胞内分布が上記処理後に変化したかどうかを決定した。これは、３つのヒトＰＤＡＣ細胞株を使用して試験した。図１４に示すように、機能性カテプシンＢの細胞質蓄積は、Ｈ−１ＰＶ／ゲムシタビン併用により著しく促進され、このメカニズムが観察された累積した毒性に関与していることが強く示唆された。
【００５１】
実施例３．Ｈ−１ＰＶはゲムシタビン感受性及び耐性細胞の両方を同様の効率で殺すことができる
ゲムシタビンに対する耐性の形成は、ＰＤＡＣ患者の本薬剤での長期治療の大きな障害であるため、ゲムシタビンに対する天然の感受性が異なる前記細胞株の２つ（Ｐａｎｃ−１及びＢｘＰＣ−３）から誘導したゲムシタビン耐性細胞変異体に対する、Ｈ−１ＰＶの細胞変性効果を試験した（表１）。耐性（Ｒ）群は、薬剤の用量を増加させて細胞を連続的に処理することにより単離した。耐性変異体は、ＭＤＲ及びＭＲＰ１／２薬剤送出マーカの発現促進など、その成長速度の低下及び安定な表現型の変化によりそれぞれの親細胞株から区別できた（図２Ａ）。取り込み（ｈＥＮＴ）及び活性化（ｄＣＫ）マーカのレベルは変化しないか又は僅かな減少にとどまっており（図２Ａ）、耐性表現型は、主により強いゲムシタビン送出によるものと思われる。薬剤耐性変異体はＨ−１ＰＶ感染への感受性を維持している（図２Ｂ、図２Ｃ、Ｈ−１ＰＶカラム）一方、元の細胞株に毒性であるゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ、１４４時間）との長時間の培養には耐性であった（図２Ｃ、ベムシタビンカラム）。Ｈ−１ＰＶにより誘導された細胞死が、ＢｘＰＣ−３細胞に対して、ＢｘＰＣ−３Ｒ細胞で僅かではあるが有意に上昇していることが観察された。これは、Ｈ−１ＰＶが、ゲムシタビンに対して獲得した耐性を回避するＰＤＡＣの第二選択治療として使用できる可能性を示唆している。更に、ゲムシタビン耐性表現型は、パルボウイルス生活環の進行に対する毒性薬剤用量による障害の低下に関連していることが見出された。実際、Ｐａｎｃ−１Ｒ細胞内における、組換えパルボウイルスベクタにより発現されるマーカ蛋白質ＥＧＦＰの発現は、親細胞におけるＥＧＦＰ形質導入を阻止するゲムシタビン用量で曝露した後であっても促進された（図２Ｄ）。従って、ゲムシタビン治療が続けられている状況下においても、化学療法剤耐性腫瘍細胞変異体はＨ−１ＰＶの標的のままであると結論づけることができる。効果的なウイルス殺作用は、高ゲムシタビン用量で短期処理して選択したゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞の感染後でも、同様に観察された（図１５）。これらのデータに一致して、耐性及び親のＣｏｌｏ３５７細胞株及びＴ３Ｍ−４細胞株はウイルス複製について同様の能力を有していた（データは非図示）。
【００５２】
以上、生体外実験により、Ｈ−１ＰＶが、薬剤耐性細胞に対する殺作用全体を強化し、かつ薬剤治療の後期に現れる化学療法剤耐性変異体を除去することによって、ゲムシタビンの治療効果を改善することが示された。
【００５３】
実施例４．Ｈ−１ＰＶは同所性膵臓腫瘍の部分的から完全な抑制を誘導し、それにより動物の生存を引き伸ばす
臨床状態をより近似させるために、ＰＤＡＣを同所的に移植した同系ラットモデルをＨ−１ＰＶの抗癌活性を評価するために使用した。ラットはＨ−１ＰＶの自然宿主であるので、前記系は、臨床応用に必須である、この腫瘍溶解性薬剤の毒性評価にも適している。モデル（ＨＡ−ＲＰＣ）に使用されるラットＰＤＡＣ細胞は、まずＨ−１ＰＶ感染に対する感受性を生体外で検査し、ウイルスとゲムシタビン毒性に対して前記ヒト細胞と同様の範囲の感受性を有することを確認した（図３Ｅ（ａ））。
【００５４】
膵臓へのＨＡ−ＲＰＣ細胞の移植の２週間後に、Ｈ−１ＰＶを単回腫瘍内注入により生体内に投与した。腫瘍の大きさ（ｍＣＴスキャンニング及び死後の肉眼検査により測定）、動物の生存、及びウイルス分布を測定した。ウイルス治療は腫瘍成長を遅らせ（図３Ａ）、図３Ｂに示すように、ウイルス処理群のラットは、擬似処理対照群より有意に長く生存し、１６週目（実験の最後まで）には２０％が無病であった。重要なことに、Ｈ−１ＰＶは、正常組織とは対照的に腫瘍選択的に発現していた。このことを確認するために、ウイルス転写産物の存在について内臓組織を検査した（ＲＴ−ＰＣＲ）。図３Ｃに示すように、感染後直ぐに腫瘍とその周りの膵臓組織に初期ウイルス発現を観察した。他のモデルによる以前の観察結果と一致して、Ｈ−１ＰＶはリンパ組織にも分布していた（Ｇｉｅｓｅ ＮＡ，Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，ＤｅＭａｒｔｉｎｏ Ｌら, Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ ｂｙ ａ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＭＶＭｐ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ＩＰ−１０ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；９：４３２−４２）。１０日目から、ウイルス発現は衰えた。これはウイルス中和抗体が現れ、ウイルスの広がりを低減したためと思われる（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍら，Ｃａｒｒｉｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；１０９：７４２−９）。しかし、ウイルス発現は接種の２０日後まで腫瘍内で続いた。また、ウイルスの腫瘍内分布は免疫組織化学分析により確認された（図３Ｄ）。
【００５５】
予め存在していた腫瘍の完全な消失がｍＣＴスキャンにより確認されたケースもある（図４、Ａ及びＣの比較）。原発腫瘍の局所的拡大に加えて、上部腹腔の内臓リンパ節及び肝臓にそれぞれ影響するリンパ及び血行性転移は、ＰＤＡＣの死亡に大きな役割を果たしている。予測されたとおり、非感染ラットのｍＣＴモニタリングでは、局所膵、幽門、肝リンパ節及び肝臓への転移浸潤が観察された（図４Ｂ、矢印）。初期段階で原発腫瘍にＨ−１ＰＶを播種した場合には（図４Ａの像に対応）、その後に、原発腫瘍と同様に遠隔転移が４５％まで抑制された（図４Ｃ）。興味深いことに、このモデルでの肝臓への転移疾患の広がりは、臓器での遅発性ウイルス発現と相互に関連しており（図３Ｃ）、これはＨ−１ＰＶが腫瘍浸潤を能動的に制御できることを示唆している。
【００５６】
実施例５．Ｈ−１ＰＶはゲムシタビン治療が効かないＰＤＡＣ腫瘍を抑制する
Ｈ−１ＰＶが、生体外で観察されたように、生体内でもゲムシタビンの治療効果を促進できるかどうかを検討した（表１、図１３）。臨床的状況に近似させるために、ＰＤＡＣ担持ラットをまずゲムシタビンで処理し、２週間後に手術的にＨ−１ＰＶを腫瘍に播種した。図５Ａ（ゲムシタビン プレ Ｈ１−パルボウイルス）に示すように、当該処置は、擬似処理（対照）、又は化学療法剤単独治療（ゲムシタビン）と比較してラットの生存を有意に伸ばした。両方を同時に投与した場合（Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン）には、Ｈ−１ＰＶはゲムシタビンの治療効果を改善しなかった。これは、遺伝毒性薬のパルボウイルス生活環への負の作用によるものと思われる（図２Ｄも参照）。
【００５７】
ヒト細胞を使用した異なる生体内モデルにおけるゲムシタビンとＨ−１ＰＶの効果について試験するために、ＢｘＰＣ−３腫瘍をヌードマウスに誘発し、ラットと同様な治療レジメンにより治療した（図５Ｂ）。治療を受けた全てに動物において、対照と比較した生存期間が長かった。併用治療（ゲムシタビン プレ Ｈ１−パルボウイルス、ｎ＝５）及びＨ−１ＰＶ単独治療（ｎ＝５）では、最高の抗腫瘍効果を達成し、各群において１匹は実験開始の７０日後まで無腫瘍であった。この時点で、併用処理群の動物の４０％は生存していた。一方で全ての対照群マウスは移植後４０日目までにサクリファイスされなければならなかった。
【００５８】
以上、これらのデータによりゲムシタビンはＰＤＡＣに対して一時的に保護効果を示し、それに続くＨ−１ＰＶの投与が動物の生存を引き伸ばすことができることが確認された。更に、ラットモデルで行われた本治療法の毒性評価により、ゲムシタビン処理による網状赤血球及び単球におけるレベルの低減を除けば、骨髄活性の血液伝播性マーカは概して影響を受けないことが示された（図６Ａ）。臨床的結果は、同様に肝臓及び腎臓機能をモニタすることを促すものであった（図６Ｂ）。ビリルビン、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルは、非治療及びゲムシタビン処理群で上昇しており、ＰＤＡＣ担持ラットの肝臓では溶菌作用が低いことを示していた。追加のパルボウイルス治療により、これらのマーカのレベルは生理的範囲に回復した。クレアチニンレベルは安定のままであり、腎クリアランスに影響しないことを証明した。すなわち、検出した血液パラメータの異常は、完全にゲムシタビン治療に起因するものであり、引き続くＨ−１ＰＶ投与により更に悪化しなかった。
【００５９】
実施例６．Ｈ１−ＰＶ感染は、生体外で膠芽細胞腫に対するテモゾロミドの治療効果を改良できる
まず、検討に使用された細胞株がＨ−１ＰＶ感染及びテモゾロジン（ＴＭＺ）処理に対して感受性であるかどうかを検査するために、これらの細胞株の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。また、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺの併用治療後の生存率を測定した。明らかに効果を示すが、細胞の完全な溶菌は起こさない濃度であると推定される、５ｐｆＵ／細胞のＭＯＩ及び２５μＭのＴＭＺで細胞を感染及び処理した。図７〜１１は、３日後及び６日後の結果を示すグラフである。処理３日後には既に明確な効果が観察された。処理６日後に対照細胞が既にコンフルエントな状態となったため実験を中止した。また、６日後には（特定の細胞株によるが）生存率が非常に低かったため、更なる分析は行えなかった。
【００６０】
対照として、ヒト星状膠細胞を、（ａ）Ｈ−１ＰＶで感染するか、（ｂ）ＴＭＺで処理するか、又は（ｃ）両者の併用治療を行った。図８に示されるように、これらの処理のいずれも星状膠細胞に何の影響も示さなかった。
【００６１】
図８に示すように、ＲＧ２細胞は、Ｈ−１ＰＶ感染に非常に感受性が高く、感染の３日後には約９０％の細胞が既に溶菌された。同様の結果が併用治療（Ｈ−１ＰＶ＋ＴＭＺ）により得られている。６日後には、全ての細胞が死滅した。また、結果は該細胞がＴＭＺ処理に感受性を有さないことを示している。
【００６２】
図９に示すように、Ｈ−１ＰＶ感染の３日後では、Ｕ８７ＭＧ細胞の約１０％のみが溶菌され、ＴＭＺ単独の処理後では、約２０％の細胞が死滅した。併用治療（Ｈ１−ＰＶ＋ＴＭＺ）は強い細胞溶解作用を示し、約４０％の細胞が死滅した。しかし、治療の６日後にはこの作用はもはや存在せず、併用治療を施された細胞の生存率は、ＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）細胞の生存率と同等であった。
【００６３】
図１０に示されるように、ＴＭＺでの処理はＵ３７３細胞に対して細胞毒性作用を示さなかった（処理の６日後）。Ｈ−１ＰＶでの感染では、約６０％の細胞が６日後には溶菌された。同様の結果が併用処理（Ｈ１−ＰＶ＋ＴＭＺ）でも得られた。
【００６４】
図１１は、ＴＭＺ処理に非常に感受性の高いＵ３４３細胞について得られた結果を示す。６日後には、８０％以上の細胞が死滅した。処理３日後では、Ｈ−１ＰＶ及びＴＭＺの併用は、単独処理に比較して強い細胞変性効果を示した。しかし、６日後には、この効果は低減し、併用治療後の生存細胞の割合がＴＭＺ単独処理後の生存細胞の割合に近づいた。
【００６５】
図１２に示すとおり、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用治療は、Ｈ−１ＰＶ単独及びＴＭＺ単独処理に比較して、細胞変性効果が促進されている。
【００６６】
要約すれば、樹立ヒト及び動物（ラット）膠芽細胞腫細胞株は、ヒト膠芽細胞腫由来の短期細胞株と同様、ウイルス仲介細胞死に非常に感受性が高いということが示された。この結果は、Ｈ−１ＰＶで溶菌的に感染させた樹立ラット細胞株ＴＧ２及び種々のヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｕ３４３ＭＧ及びＡ１７２（ｔｈｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ （ＤＫＦＺ）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツから入手可能）を使った本検討で確認することができた。細胞当たり感染性粒子５個という低用量で、７２時間後に明らかな細胞変性効果を得るのに十分であった。更に、Ｈ−１ＰＶで感染させたヒト星状膠細胞は溶菌しないことが示された。正常星状膠細胞、ＲＧ２細胞及びＵ３７３細胞を２５μＭのテモゾロミド（ＴＭＺ）で処理しても細胞死に至らなかった。これらの細胞は更に高用量の投与に対しても耐性を示した。
【００６７】
更に他のヒト細胞株もＴＭＺ処理に感受性を示した。Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用治療は、ウイルスの腫瘍溶解効果がＴＭＺ処理によって低減されないことを示した。一方、ウイルスはＴＭＺ処理による効果を抑制しなかった。膵臓癌のＨ−１ＰＶとゲムシタビンとの併用治療における結果と同様、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺの併用治療により、生体内において相加的を超えた相乗的効果が達成できると考えられる。
【００６８】
（参照文献）
Ｈａｒｒｏｐ Ｒ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＭＷ．Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ ２００６；１１：８０４−１７．
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）パルボウイルスと（ｂ）化学療法剤を有する医薬組成物、及び脳腫瘍又は膵臓癌などの癌治療のための該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＰＤＡＣ）は、最も致死性の高い胃腸悪性腫瘍の１つである。ＰＤＡＣは、北米では４番目、ヨーロッパでは６番目、英国では５番目に多い癌関連死亡の原因である（非特許文献１、２）。この疾患は、現在利用可能な治療法に対して高い抵抗性を示す。外科的切除は、長期生存の可能性が最も高いが、少数の患者に対してのみ適用可能であり、リスクがないわけではない（非特許文献３）。手術ができない進行した疾患の場合には、特にゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）又は５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ：５−ＦＵ）を使用する化学療法が行われるが、その効果は依然として余り高くなく、常に強い一般毒性を伴う（非特許文献４）。ゲムシタビンは、局所進行性又は転移性膵臓癌患者の第一選択薬としてＦＤＡに承認されている。本薬は、代謝拮抗系の細胞周期依存性デオキシシチジン類似体であり、ヒト受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ｈｕｍａｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｈＥＮＴ）を介して細胞内に輸送され、デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｉｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ｄＣＫ）によりリン酸化されて活性型三リン酸塩型となる。ゲムシタビン治療における重要な問題は、この化学療法に対して耐性が生じることである。この耐性は、薬剤の取り込み及びリン酸化の低下、並びに／又は、ＡＢＣトランスポーターファミリのメンバであるＭＤＲ及びＭＲＰ１／２による細胞からの放出の亢進によるもので、ゲムシタビンの細胞内プールが枯渇する（非特許文献５）。耐性変異体を除去して抗癌作用を改良するか、又は化学療法剤の用量を下げて毒性を下げることができる、他の治療法とゲムシタビンとの組み合わせが探索されている。
【０００３】
腫瘍性形質転換細胞を特異的に殺す（腫瘍溶解）ウイルスや武装ベクタ誘導体を使用する癌治療は、この致死性疾患の新しい治療方法である（非特許文献６）。自律増殖型パルボウイルスには、腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれるカテゴリに属するものもある（非特許文献７）。パルボウイルスは、２つの非構造蛋白質（ＮＳ１、ＮＳ２）及び２つのキャプシド蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２）を発現する５．１ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、小さな非エンベロープ粒子（２５〜３０ｎｍ）である（非特許文献８）。パルボウイルスＨ−１ＰＶは、少なくとも脳腫瘍及び他のいくつかの腫瘍において独特の死亡過程を引き起こす、すなわち、リソソームプロテアーゼ（カテプシン）の細胞質への配置及び活性化を引き起こす点で、優れた利点を有する（非特許文献１２）。げっ歯類が自然宿主であるパルボウイルス属（Ｈ−１ＰＶ、ＭＶＭ、ＬｕＩＩＩ）のメンバのあるものは、宿主細胞を形質転換せず、ヒトへの無症候性感染が可能で、腫瘍性形質転換細胞に優先的に伝播し（腫瘍指向性）、殺す（腫瘍溶解）能力を有するため、現在、癌の遺伝子治療への応用が考えられている（非特許文献９、１０）。ＭＶＭｐ及びＨ−１ＰＶウイルスは、生体内で腫瘍抑制活性を発揮すること、すなわち、実験動物に対して、自然に、化学的に、又はウイルスによって誘発した癌の形成を抑制することができることが示されている。パルボウイルスの発現カセットに基づくベクタは、野生型ウイルスの腫瘍指向性を保有する（非特許文献１１）。優れた効果を達成しているもの、ヒトへの臨床応用が最も期待できるパルボウイルス候補（Ｈ−１ＰＶを含む）には、例えば、診断後の寿命を延ばすなどの抗癌活性における改良が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔら， Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２００２；５２：２３−４７．
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【非特許文献３】Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ Ｅ，Ｂｉｒｋｍｅｙｅｒ ＪＤ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｓｐｉｔａｌｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔｓ：ａ ｄｅｃｉｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ ２００３；１９６：４１０−１７．
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【非特許文献９】Ｈａａｇ Ａ， Ｍｅｎｔｅｎ Ｐ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊら， Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ； ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００；ｌｌ：５９７−６０９．
【非特許文献１０】Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬら， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８．
【非特許文献１１】Ｏｌｉｊｓｌａｇｅｒｓ Ｓ， Ｄｅｇｅ ＡＹ， Ｄｉｎｓａｒｔ Ｃら, Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１；８：９５８−６５．
【非特許文献１２】Ｄｉ Ｐｉａｚｚａ Ｍ， Ｍａｄｅｒ Ｃ， Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ Ｋら, Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ＴＲＡＩＬ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００７；８１：４１８６−９８．
【発明の概要】
【０００５】
従って、本発明は、改良されたパルボウイルスに基づく治療方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明によれば、前記課題は特許請求の範囲に記載の内容により達成される。本発明は、パルボウイルスとゲムシタビン（現時点で膵臓癌及び他の癌に使用できる最も効力のある化学療法剤であるが、なお強い毒性プロファイルを有する）のような化学療法剤との併用治療によって、該薬剤の毒性が低減され、かつ、治療効率が改善されるという発見に基づく。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットに膵臓腫瘍を同所移植し、異なる治療レジメンで、ゲムシタビン、Ｈ−１ＰＶ又は両者の併用で治療した。骨髄、肝及び腎の機能を臨床的に関連するマーカのレベルによりコントロールしながら、腫瘍サイズをコンピュータ断層撮影法により測定した。ヒト膵細胞株とそのゲムシタビン耐性誘導株について、Ｈ−１ＰＶ又は薬剤との組み合わせに対する感受性を生体外で試験した。ゲムシタビン及びその後のＨ−１ＰＶの腫瘍内注入は、腫瘍の成長を遅らせ、ＣＴスキャンでは転移が認められず、動物の生存を引き伸ばすことが示された。毒物学的スクリーニングでは、Ｈ−１ＰＶは、ゲムシタビンとの併用によって組織に何ら損傷を与えることはないことが示された。生体外の検討では、パルボウイルス複製に対するゲムシタビンの負の効果にもかかわらず、併用によりそれぞれの治療効果が相乗的に働くことを示した。耐性細胞は、Ｈ−１ＰＶによる殺作用に対して感受性のままであり、ゲムシタビンの存在下でもウイルス発現を維持することができた。パルボウイルスと化学療法剤テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）の併用による神経膠腫の治療においても同様の結果を得た。従って、パルボウイルスは、ＰＤＡＣや神経膠腫のような癌の治療において、好ましくは、２段階プロトコルによる化学療法との併用による癌の治療において、非常に高い効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｈ−１ＰＶ単独又はゲムシタビンとの併用による毒性作用に対するヒトＰＤＡＣ細胞株の感受性を示す。（Ａ）示されたＭＯＩでのＨ−１ＰＶ感染後のＰａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞の残留コロニ形成能を示す。コロニは、クリスタル・バイオレット染色後に計数し、生存数を擬似処理細胞に対する百分率として示す。（Ｂ）異なる濃度でのゲムシタビン処理の２４時間後に、１０ｃｆｕ／細胞のＭＯＩでＨ−１ＰＶを感染させた上記細胞の死滅を示す図である。生存細胞を、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死として逆に表現した。平均値及びＳＤバーは、３回の独立した実験を３重で行って得たものを示す。
【図２】ゲムシタビン耐性細胞株及びそのＨ−１ＰＶに対する感受性の特徴を示す図である。Ａ：ＲＴ−ＰＣＲにより測定した、親（−）及びゲムシタビン耐性（Ｒ）Ｐａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞における薬剤耐性マーカの発現を示す。β−アクチン転写レベルを参照とした。Ｂ：ＭＯＩ＝１０ＲＵ／細胞でＨ−１ＰＶを感染させ（Ｈ−１ＰＶ）又は感染させていない（ｍｏｃｋ）、ゲムシタビン耐性（Ｒ）Ｐａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞の顕微鏡写真（４０倍）を示す。Ｃ：ゲムシタビン耐性（Ｒ）及び親の、Ｐａｎｃ−１細胞（上図）及びＢｘＰＣ−３細胞（下図）のＨ−１ＰＶ又はゲムシタビンに対する感受性を示す図である。細胞は、９６ウェルプレートに２×１０３個／ウェルの密度で播種し、Ｈ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞、Ｈ−１ＰＶカラム）又はゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅカラム）で処理した。ＭＴＴ細胞毒性アッセイは、処理の１４４時間後に行った。３回の独立した実験の結果を示す。統計的な有意差はアスタリスクで示す（＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．００５）。Ｄ：Ｐａｎｃ−１細胞及びＰａｎｃ−１Ｒ細胞への組換えＨ−１ＰＶによるＥＧＦＰの形質導入の結果を示す。培養物は、ゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ）で処理し（上図）又は処理せず（下図）、同時にウイルスベクタ（５ＲＵ／細胞）を感染させた。形質導入遺伝子を発現する細胞は、感染の４８時間後に蛍光顕微鏡により検出した。代表的な領域を示す。
【図３】ＰＤＡＣ形成ラットモデルに対するＨ−１ＰＶの効果を示す図である。皮下ＨＡ−ＲＰＣ腫瘍由来細胞懸濁液を、ラット（ｎ＝２６）の膵臓へ注入し、２週間後に、形成している腫瘍に対して１×１０９ＲＵのＨ−１ＰＶ（ｎ＝１６）を腫瘍内播種処理し、又は擬似処理（ｎ＝１０）した。
【図３Ａ】Ｈ−１ＰＶ処理及び擬似処理腫瘍の成長を示す図である。腫瘍の体積はｍＣＴスキャンによる時間の関数として測定し、平均値にＳＤバーを付して表した。
【図３Ｂ】Ｈ−１ＰＶ処理及び擬似処理動物の生存を示す図である。各群１０匹のラットを、実験を終了した１２０日目までモニタした。
【図３Ｃ】担癌ラットにおけるＨ−１ＰＶ発現の分布を示す図である。Ｈ−１ＰＶ処理群のラットを、感染後２日目、１０日目及び２０日目に２匹ずつ屠殺し、臓器をウイルス転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出用に処理した。腸（Ｉｎｔ）、パイエル板（Ｐｅｙ）、肝（Ｌｉｖ）、脾（Ｓｐｌ）、リンパ節（ＬＮ）、膵（Ｐａｎ）及び腫瘍（Ｔｕ）について、ウイルスＤＮＡ、前駆体ＲＮＡ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）及びｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物を示す。
【図３Ｄ】感染膵臓腫瘍におけるＨ−１ＰＶのＮＳ１蛋白質（矢印）の免疫組織化学的検出を示す図である。担ＰＤＡＣラットを、腫瘍内に接種した３時間後、３日後、及び７日後に３匹ずつ屠殺した。パラフィン包埋した腫瘍切片を免疫組織化学分析した（２０倍）。
【図３Ｅ】ラット腫瘍モデルの特徴：Ｈ−１ＰＶ感染に対する感受性及び組織構造を示す図である。（ａ）細胞を９６ウェルプレートで培養し、異なる濃度（４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）のゲムシタビンで処理し、２４時間後にＨ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）で感染させた。生存細胞は感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死率として逆に表現した。（ｂ）正常ラット膵臓及び膵臓腫瘍から得たパラフィン包埋腫瘍切片をヘマトキシリン−エオシン染色した。ＮＰは正常膵臓を、ＰＤＡＣは膵管癌を示す。
【図４】同所性膵臓腫瘍のｍＣＴイメージングを示す図である。Ａ：腫瘍発生後初期（２週間）におけるラット腹部ＣＴスキャンを示す。膵尾部において直径約５ｍｍの腫瘍（点線）がみられる。Ｂ：ウイルス治療をしない場合のＰＤＡＣの進行を示す。腫瘍発生の８週間後に、大きな原発腫瘍塊（点線）、並びにリンパ節及び肝臓における転移癌（矢印）が認められる。Ｃ：腫瘍発生の２週間後及び８週間後、Ｈ−１ＰＶ処理ラットにおいて原発腫瘍の退縮が認められ、転移は認められなかった。原発腫瘍及び転移癌の局在を説明するために矢状、軸状及び冠状ｍＣＴスキャンイメージを選択した。
【図５】ゲムシタビン及びパルボウイルスの併用治療後の担癌動物の生存を示す。Ａ：膵臓内腫瘍を有するラットを４群（ｎ＝１１）に分け、ＰＢＳ処理（対照）、ゲムシタビン単独処理（ゲムシタビン）、ゲムシタビンとウイルスとの同時処理（Ｈ−１パルボウイルス及びゲムシタビン）、又はゲムシタビンで最初に処理し、その１４日後にＨ−１ＰＶで処理（ゲムシタビン プレ Ｈ−１パルボウイルス）した。動物の生存を１００日に亘って観察し、カプラン・マイヤ曲線として示した。生存中央値及びＰ値をその下に示した。Ｂ：皮下にＢｘＰＣ−３腫瘍を有するヌードマウスを４群（ｎ＝５）に分け、腫瘍発生の２１日後にＰＢＳ処理（対照）、ゲムシタビン単独処理（ゲムシタビン）、ウイルス（３×１０８ＲＵ）単独処理（Ｈ−１パルボウイルス）、又はゲムシタビンで最初に処理し、７日後にＨ−１ＰＶで処理（ゲムシタビン プレ Ｈ−１パルボウイルス）した。
【図６】ゲムシタビンとＨ−１ＰＶとの併用の毒性評価を示す図である。最後の治療処理の２週間後に、対照群、ゲムシタビン群、及びゲムシタビンプレＨ−１パルボウイルス群（図４Ａ参照）の各群の担ＰＤＡＣラット３匹から血液を採取した。血液検体について、（Ａ）赤血球（ＲＢＣ）、血小板、白血球（ＷＢＣ）の数、及び関連パラメータ、並びに（Ｂ）肝臓（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＬＡＴ）、及び腎（クレアチニン）マーカを分析した。データはＳＤバー及び平均値で示す。
【図７】処理６日後の星状膠細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の６日後の生存ヒト星状膠細胞を百分率（％）で示す。
【図８】処理の３日後及び６日後のＲＧ２細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存ＲＧ２細胞を百分率（％）で示す。
【図９】処理の３日後及び６日後のＵ８７ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ８７ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１０】処理の３日後及び６日後のＵ３７３ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ３７３ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１１】処理の３日後及び６日後のＵ３４３ＭＧ細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ｕ３４３ＭＧ細胞を百分率（％）で示す。
【図１２】処理の３日後及び６日後のＡ１７２細胞を示す。Ｈ−１ＰＶ処理（ウイルス）、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用処理（Ｖ＋ＴＭＺ）、又はＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）の３日後（Ａ）及び６日後（Ｂ）の生存Ａ１７２細胞を百分率（％）で示す。
【図１３】Ｈ−１ＰＶ単独又はゲムシタビンとの併用の毒性作用に対するヒトＰＤＡＣ細胞株の感受性を示すグラフである。Ｃｏｌｏ３５７細胞、Ｔ３Ｍ−４細胞、ＳＵ８６．８６細胞、ＭｉａＰａＣａ−２細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、及びＢｘＰＣ−３細胞を９６ウェルプレート上で、２×１０３細胞／ウェルの密度で培養し、ゲムシタビン（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後にＨ−１ＰＶ（１、１０又は１００ＲＵ／細胞）で処理した。生存細胞は、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより測定し、擬似処理培養（１００％）と比較したものを、細胞死率として逆に表現した。データは、３回の独立した実験を４重で行った平均値である。
【図１４】処理後ＰＤＡＣ細胞株のカテプシンＢ活性を示す。Ｐａｎｃ−１細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、及びＣａｐａｎ−１細胞を、Ｈ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）、及びゲムシタビン（４ｎｇ／ｍＬ）の各単独又は組み合わせで処理し、細胞質及びリソソームのカテプシンＢ活性を測定した。グラフはリソソームに対する細胞質の比を３回の独立した実験の平均値と共にＳＤバーを示している。
【図１５】Ｈ−１ＰＶ誘導死に対するゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞の感受性を示す。反復薬剤被爆後にゲムシタビン耐性として選択した細胞を、播種の２４時間後にゲムシタビン（１ｎｇ／ｍＬ）又はＨ−１ＰＶ（１０ＲＵ／細胞）のいずれかで処理した。生存を評価するために、処理の１４４時間後にＭＴＴアッセイを行った。データは、擬似処理対照に対する死亡細胞の割合を示し、３回の独立した実験を４重で行った平均値と共にＳＤバーを示している。
【０００８】
本発明は、パルボウイルス及び化学療法剤を含む医薬組成物を提供し、好ましくは、（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤を独立した構成要素として、例えば、別々の容器内に含有する医薬組成物を提供する。
【０００９】
好ましくは、上記医薬組成物では、パルボウイルス及び化学療法剤の有効量が薬学的に許容される担体と組み合わせて含まれる。「薬学的に許容される」には、有効成分の生物学的活性の効果を妨げることなく、投与される患者に有毒でない、任意の担体が包含される。好適な薬学的担体の例は、本技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水乳液などの乳液、種々の湿潤剤、殺菌溶液などを含む。そのような担体を、従来の方法により製剤化し、有効量を患者に投与することができる。
【００１０】
「有効量」とは、疾患の経過及び重篤度に影響し、その病状を軽減又は寛解するのに十分な有効成分の量を意味する。これらの疾患や障害を治療及び／又は予防するために有用な「有効量」は、当業者に公知の方法により決定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４６ （１９７５）参照）。
【００１１】
その他の薬学的に適合する担体としては、ゲル、生体吸収可能なマトリクス材料、治療剤含有移植用構成物、又は他の好適な運搬媒体、送達又は調剤の手段又は物質を含むことができる。
【００１２】
化合物の投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所又は皮内投与により行ってもよい。当然、投与経路は治療の種類、及び医薬組成物に含有される化合物の種類に依存する。好適な投与経路は静脈内投与である。パルボ治療剤と化学療法剤の投与レジメンは、患者データ、診断の他、例えば、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定のパルボウイルス、細胞や化学療法剤など、投与時間や経路、腫瘍の種類や特性、患者の全体的な健康状態、患者が受けている他の薬剤治療などの他の臨床因子に基づいて、担当医の技術の範囲で容易に決定することができる。
【００１３】
本発明による薬剤を組み合わせたパルボ治療薬が血液脳関門を通過できる感染性ウイルス粒子を有する場合、ウイルス治療剤、例えば、Ｈ１ウイルスの静脈注射により治療を行い、又は少なくとも治療を開始することができる。好ましい投与経路は腫瘍内投与である。
【００１４】
長期の静脈注射治療は、ウイルス治療薬に対する中和抗体の形成により効果がなくなりやすいので、静脈内投与によるウイルスの初回投与後に他の投与方法を採用することができる。あるいは、そのような他の投与方法、例えば、頭蓋内又は腫瘍内ウイルス投与を、パルボウイルス処理の全工程を通して使用することもできる。
【００１５】
その他の具体的投与方法としては、パルボ治療薬（ウイルス、ベクタ及び／又は細胞剤）は、患者に移植された放出源から患者に投与することができる。例えば、シリコーンや他の生体適合性物質のカテーテルを、腫瘍を摘出する際、又はこれと独立した手順によって患者に埋め込まれた小さな皮内リザーバ（リッカム（Ｒｉｃｋｈａｍ）リザーバ）に連結し、更なる外科的介入を必要とせずに、パルボ治療用組成物を局所的に、様々な回数注入することができる。パルボウイルス又はそれに由来するベクタは、定位手術法又はニューロナビゲーション標的法により、腫瘍に注入することもできる。
【００１６】
パルボウイルス剤又は組成物の投与は、埋め込み式カテーテルを介して、蠕動輸液ポンプや対流増進送達（ＣＥＤ）ポンプなどの適当なポンプシステムを使用して、低流速でウイルス粒子又はウイルス粒子を含有する液を持続的に注入することにより行うこともできる。
【００１７】
更に他のパルボ治療組成物の投与方法では、パルボ治療薬を目的の腫瘍組織に投与するように構築、配置した埋め込み式デバイスから投与する。例えば、パルボウイルスＨ１などのパルボ治療組成物を含浸させたウエハを用いることができ、当該ウエハは、外科的腫瘍摘出の結果生じた切除腔の端に取り付ける。そのような治療介入では複数のウエハを使用することができる。パルボウイルスＨ１やＨ１ベクタなどのパルボ治療剤を活発に産生する細胞を、腫瘍や腫瘍摘出後の腫瘍腔に注入することもできる。
【００１８】
本発明の併用治療は、癌、特に、脳腫瘍や膵臓癌、好適には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療に有用であり、当該疾患の予後を著しく改善することができる。パルボウイルスＨ１感染は、腫瘍細胞を死滅させる効果を有するが、正常細胞を傷つけない。また、そのような感染は、例えば、パルボウイルスＨ１などの好適なパルボウイルスや関連ウイルス、又はそれらのウイルスに基づくベクタを脳内で使用することにより、神経学的副作用や他の副作用なしに、腫瘍特異的治療を行うことができる。
【００１９】
本発明はまた、癌の治療用医薬組成物の製造のための（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤の使用に関し、好ましくは、（ａ）及び（ｂ）は連続して（又は別々に）投与される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、薬剤の併用は、（ａ）神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫などの脳腫瘍、又は（ｂ）膵臓癌の治療に用いることができる。神経膠腫は、好ましくはヒト悪性膠芽細胞腫である。
【００２１】
本明細書で使用される用語「パルボウイルス」は、野生型及び複製能を有するその修飾誘導体に加え、関連ウイルス又はそれらウイルスや誘導体に基づくベクタを含む。パルボウイルス、誘導体など、及びパルボウイルスを活発に産生し、治療に使用可能である細胞の公的な形態は、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本明細書の開示に基づいて容易に決定可能である。
【００２２】
本発明の他の好ましい実施形態では、組成物のパルボウイルスは、パルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又はＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（Ｒａｔ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ：ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（Ｒａｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＲＰＶ）、ラットウイルス（Ｒａｔ ｖｉｒｕｓ：ＲＶ）などの関連するパルボウイルスが含まれる。
【００２３】
本発明の薬剤の併用により治療可能な患者には、ヒトの他、非ヒト動物も含まれる。非ヒト動物は、これに限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどの動物を含む。
【００２４】
本発明の目的に有用な化学療法剤には、腫瘍の成長阻害に効果的な全ての化合物が含まれる。化学療法剤の投与は、非経口及び経腸経路による全身的な経路を含む、種々の方法（上記参照）により達成される。好ましくは、パルボウイルスと化学療法剤は別々の化合物として投与される。
【００２５】
更に好ましい実施形態では、パルボウイルスは化学療法剤の投与後に投与される。化学療法剤の投与とパルボウイルスの投与との間の好ましい期間は、１４〜３５日である。
【００２６】
好適な化学療法剤としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキルなどのアルキル化剤；葉酸、プリン及びピリミジン拮抗剤などの代謝拮抗物質；ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン誘導体などの分裂抑制剤；細胞毒性抗生物質；ＤＮＡ発現を損傷し又は妨げる化合物；成長因子レセプタ拮抗剤を挙げることができる。
【００２７】
併用治療に好適な化学療法剤の特別な例として、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特に、好ましい化学療法剤はゲムシタビンとテモゾロジンである。
【００２８】
最後に、本発明はまた、膵臓癌の治療用の医薬組成物の調製のための、パルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルス、例えば、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、ラットウイルス（ＲＶ）の使用に関する。好ましい使用は、薬剤耐性癌、例えば、ゲムシタビンに耐性を有する膵臓癌の治療である。
【００２９】
下記実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００３０】
実施例１．材料及び方法
（Ａ）細胞培養及び処理
ヒト膵臓癌細胞株及び転移腫瘍（Ｃｏｌｏ３５７、Ｔ３Ｍ−４、及びＳＵ８６．８６）をＡＴＣＣ（マサチューセッツ、バージニア州）から取得し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した、ＲＰＭＩ１６４０（ＭｉａＰａＣａ−２、ＢｘＰＣ−３、及びＣａｐａｎ−１）又はＤＭＥＭ（Ｐａｎｃ−１）培地中で培養した。０．０００４μｇ／ｍＬの濃度で２時間から開始して０．００４μｇ／ｍＬの濃度で２４時間までゲムシタビン用量を増加させて細胞を複数回継代して耐性細胞を生成させた。
【００３１】
ＳＶ４０形質転換新生ヒト腎細胞２９３Ｔ細胞及びＮＢＫ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養した。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラット内に化学誘導した膵管腺癌から作成した癌細胞株ＨＡ−ＲＰＣを、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ内で培養した（Ｅｖｒａｒｄ Ｓ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｐ，Ｈａｊｒｉ Ａら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ １９９４；８１：１１８５−８９）。全ての培地にペニシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃に保持した。ゲムシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ、インディアナポリス、インディアナ州、米国、より購入）を図に示す濃度で添加した。
【００３２】
細胞毒性の評価では、細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０３細胞の密度で播種し、図に示す通りに処理した。細胞の生存率は、比色３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、製造者（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）の推奨する方法に従って測定した。
【００３３】
（Ｂ）細胞の生存率
９６ウェルディッシュ上に播種し、図に示すように処理した細胞について、比色３−（４，５−ジメチルチアゾイル-２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより、その生存率を評価した。コロニ形成能の測定のため、細胞を６ｃｍ２皿当たり２５０（Ｐａｎｃ−１）又は８００（ＢｘＰＣ−３及びＣａｐａｎ−１）の密度で播種し、示す通りに処理し、更に１４日間培養した。培地を吸引後、細胞コロニをクリスタル・バイオレットで染色し、水道水で洗浄し、顕微鏡下で計数した。生存画分（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ:ＳＦ）は、式：ＳＦ＝コロニ数の平均／（播種細胞数×（ＰＥ／１００））により決定した。ここで、ＰＥは、処理を行わなかった場合の各細胞の播種効率である。
【００３４】
（Ｃ）顕微鏡法
培養物は、ライカ倒立顕微鏡を使用して４０倍で観察した。画像取込は、ライカＤＦＣ３５０ＦＸカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ケンブリッジ）及びマッキントッシュ用ライカＦｉｒｅＣａｍソフトウェアを使用して行った。ＥＧＦＰ蛍光は、ライカＤＭＲＢＥ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ドイツ）及び分析ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ドイツ）を使用して測定した。
【００３５】
（Ｄ）ウイルス作製及び検出
野生型Ｈ−１ウイルスをＮＢＫ細胞を感染させることにより作製し、イオジキサノール勾配遠心分離により精製し、リンガ液に対する透析を行った。Ｈ−１ＰＶＥＧＦＰ組換えウイルスは、２９３Ｔ細胞を組換えベクタＤＮＡ及びトランスにウイルスキャプシド遺伝子を発現するヘルパープラスミドでコトランスフェクトして作製した（Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ Ｃ，Ｔｅｓｆａｙ Ｌ，Ｓａｌｏｍｅ Ｎら， Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｏｃｋｓ ｗｉｔｈ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７：３８５１−８）。ウイルスの力価は、以前記述したとおりに測定し、複製中心作成ユニット（ｃｆｕ）として表す。すなわち、精製ウイルスの段階希釈物をＮＢＫ細胞に添加して行った。感染の４８時間後に、感染培養物をフィルタ上にブロットし、複製中心をＤＮＡ特異的放射性プローブを使用するハイブリダイゼーションにより検出した（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ，Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇｅｒ Ａ，Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＣＬら， Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６：２８２１−８）。
【００３６】
処理動物の臓器又はＰＤＡＣ細胞培養物におけるウイルス転写の分析のために、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用して製造者の取扱説明書に従い、採取組織又は細胞沈殿物試料から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、以前詳細に記載したＲＴ−ＰＣＲにより定量した（Ｇｉｅｓｅ ＮＡ，Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，ＤｅＭａｒｔｉｎｏ Ｌら， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ ｂｙ ａ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＭＶＭｐ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ＩＰ−１０ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；９：４３２−４２）。Ｈ−１ＰＶ転写産物は、一対のプライマ：５’−ＴＣＡＡＴＧＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧ−３’（フォワード）及び５’−ＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（リバース）を使用して、短いイントロンの切除に基づく５１２及び４１５ｂｐのＰＣＲフラグメントの形で検出した。ｈＥＮＴ及びｄＣＫｍＲＮＡに特異的なプライマは以下の通りである：ｈＥＮＴについては、５’−ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣ−３’（フォワード）及び５’−ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＡ−３’（リバース）、ｄＣＫについては、５’−ＣＣＣＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣ−３’（フォワード）及び５’−ＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＣ−３’（リバース）。ヒトβ−アクチン、及びＭＤＲ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２遺伝子の発現を検出するために使用したプライマは、以前記載した通りである（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ，Ｍｅｒｋｏｒｄ Ｊ，Ａｄａｍ Ｕら， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ２００４；２８：４５−５２）。
【００３７】
（Ｅ）動物実験
（ｉ）麻酔：全ての外科的及び画像処置は、純粋酸素中に３％イソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ、Ｍａｕｒｅｐａｓ、フランス）を含有するガス麻酔下に行い、外科的処置では、鎮痛剤として２〜３ｍｇ／ｋｇの塩酸キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）を同時に筋肉内注射した。
【００３８】
（ｉｉ）腫瘍モデル：１８０〜２００ｇのオスのルイスラット（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ、フランス）を膵臓癌移殖用に使用した。５×１０６ＨＡ−ＲＰＣ細胞を膵臓実質に注入した。注入後最初の３週間では、腫瘍形成は膵臓尾部に限定されるが、４週目にリンパ節に浸潤する。肝臓への転移は５〜６週間で現れ、６〜９週間で肺転移を起こし死に至る（Ｍｕｔｔｅｒ Ｄ，Ｈａｊｒｉ Ａ，Ｔａｓｓｅｔｔｉ Ｖら，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ ａｆｔｅｒ ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｙ ｖｓ ｌａｐａｒｏｔｏｍｙ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇ Ｅｎｄｏｓｃ １９９９；１３：３６５−７０）。ラットは、バランスのとれたペレット餌と水を制限なく摂取できる、標準的状態（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、明暗周期：１２時間）に保持した。動物実験は、動物愛護に関するフランス及びヨーロッパコミュニティの指令（１９８６年１１月２４日、Ｎｏ．８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行った。
【００３９】
ゲムシタビンは腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）により投与した。Ｈ−１ＰＶは腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ：ｉ．ｔ．）に植菌した。血液試料は最後の治療処理の２週間後に尾部静脈より採取した。毒性マーカは、自動臨床検査分析（生化学的複数パラメータ解析装置Ｂｉｏｃｈｉｍｅ ＡＤＶＩＡ１６０：Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）を使用してストラスブルグ大学病院内でアッセイした。
【００４０】
（ｉｉｉ）画像取得及び再構築：画像は、８０ｋＶｐ Ｘ線電圧、５００μＡアノード電流を使用して、イムテックマイクロＣＴスキャナ（ｍｉｃｒｏＣＡＴ−ＩＩ、Ｉｍｔｅｋ Ｉｎｃ．、Ｋｎｏｗｖｉｌｌｅ、テネシー州）上に取得した。腹部臓器位置の変化及びそれによる像のぼやけを避けるために、呼吸ゲート取得を使用した。イメージングの９時間前に、肝臓及び持続血管造影のために、それぞれＦｅｎｅｓｔｒａ（登録商標）ＬＣ及びＦｅｎｅｓｔｒａ（登録商標）ＶＣ造影剤（Ａｌｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州) を腹腔内に同時に注入した。画像データは、Ｉｍｔｅｋ認可ソフトウェア（Ｃｏｂｒａ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１−４、Ｅｘｘｉｍ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、テネシー州）を使用して取得、再構築した。３Ｄ画像は、アミラソフトウェア（Ａｍｉｒａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｖ．３．１、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して可視化した。コントラスト化した肝又は膵葉内に黒い異常として現れる腫瘍又は転移は、アミラ３Ｄデータセットを使用して三次元的に測定した。
【００４１】
（Ｆ）免疫組織化学的解析
パラフィン包埋腫瘍切片をキシレンで脱蝋し、段階的なアルコール溶液で再水和した。内因性パーオキシダーゼ活性は、メタノール中０．３％過酸化水素で抑制した。非特異的結合を阻止するために、スライドを非免疫正常ウサギ血清（Ｄａｋｏ、チューリッヒ、スイス）で１時間処理した。Ｈ−１ＰＶ ＮＳ１蛋白質特異的３Ｄ９抗体（１：５０）（Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｓａｌｏｍｅ博士からの供与、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）と一晩静置（４℃）した後、スライドを洗浄し、ウサギ抗マウス西洋ワサビパーオキシダーゼ標識二次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）で処理し、ＤａｋｏＥｎｖｉｓｉｏｎ＋ＴＭシステム（Ｄａｋｏ）を使用して現像し、マイヤー・ヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ'ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）により対比染色した。
【００４２】
（Ｇ）統計的分析
（ｉ）生体外実験：３重で行った生体外実験から、平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビンが生体外で相乗的に相互作用するかどうかを調べるために、他の化学及びウイルス療法において既に説明されているように、ＭＴＴアッセイから得られたデータに基づいてアイソボログラフィック（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ）分析を行った（Ｎｏｗａｋ ＡＫ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＢＷ，Ｌａｋｅ ＲＡ．Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｅｘｅｒｔｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏ−ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；６２：２３５３−８）。ゲムシタビンとＨ−１ＰＶの５０％及び７５％有効濃度（ＥＣ）値（ＥＣ５Ｏ及びＥＣ７５）は、それぞれ濃度（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）及びＭＯＩ（１、１０、１００ＲＵ／細胞）の範囲に基づいて実験的に決定した。アイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）は、２つの薬剤の組み合わせから得られたデータにより作製した。組み合わせ（ＣＩ）及び感作（ＳＩ）の指標は、次の等式を使って算出した。ＣＩ＝（ＤＨ１．ｃ／ＤＨ１．ａ)＋（ＤＧ．ｃ／ＤＧ．ａ）＋（ＤＨ１．ｃ＊ＤＧ．ｃ／ＤＨ１．ａ＊ＤＧ．ａ）、ＳＩＨ−１ＰＶ＝ＤＨ１．ａ／ＤＨ１．Ｃ、ＳＩｇｅｍ＝ＤＧ．ａ／ＤＧ．ｃ、ここで、ＤＨ１．ｃ、ＤＨ１．ａ、ＤＧ．ｃ、ＤＧ．ａは、それぞれＨ−１ＰＶ又はゲムシタビン単独（Ｈｌ．ａ、Ｇ．ａ)又は組み合わせ（Ｈｌ．ｃ、Ｇ．ｃ)におけるＥＣ５０／７５用量である。ＣＩ＝１は、不変アイソボログラムを示し、相加効果を意味する。ＣＩ値が１以下の場合は、期待される相加効果よりも高い（相乗）ことを意味する。
【００４３】
（ｉｉ）生体内実験：３重で行った生体内実験から、平均値と標準偏差（ＳＤ）を算出した。ｍＣＴスキャンサイズ測定により生体内で測定された腫瘍体積の差は、等分散性を示したバートレット検定としてパラメトリック不対スチューデントｔ−検定に従い一元配置分散分析を行った。Ｐ＜０．０５の場合、値の相違は有意であると判断した。生存曲線はカプラン・マイヤ法により作成し、曲線間の相違は対数階数検定により評価した。Ｐ値＜０．０５の場合、統計学的に有意差を有すると判断した。Ｉｎｓｔａｔ２．００マッキントッシュソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用した。
【００４４】
（Ｈ）細胞分画及びプロテアーゼ活性測定
ゲムシタビン単独（４ｎｇ／ｍＬ）、Ｈ−１ＰＶ単独（１０ＲＵ／細胞）、又は両薬剤の組み合わせで処理したＰａｎｃ−１細胞及びＢｘＰＣ−３細胞から取得した細胞質及びリソソーム画分におけるカテプシンＢ活性を測定した。培養物をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で回収し、遠心分離でペレット化し、低張緩衝液（０．２５Ｍショ糖、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、細胞分解装置でホモジナイズした。４℃、２５００×ｇで、１０分間の遠心分離して、核及び重ミトコンドリアをペレット化した。上清部（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ:ＰＮＳ）を保存し、潜在する酵素の測定に使用した。ＰＮＳを４℃、１７０００×ｇで、２０分間遠心分離することにより、軽ミトコンドリア画分（ＬＭＦ）を得た。上清は細胞質抽出物として回収し、ＬＭＦペレットは低張緩衝液に再懸濁させた。細胞質及びＬＭＦ画分のそれぞれを、５０ｍＭモルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６．０）、０．２５Ｍショ糖、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインからなる反応混合液に添加した。１０分間静置後、１ｍＭの基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、３６０ｎｍで励起後の、波長４５５ｎｍにおける発光をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ＆ＦＬ光度計（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍ）で１時間測定した。
【００４５】
（Ｉ）ゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７及びＴ３Ｍ−４細胞の単離
ゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞は、それぞれの親株について決定されたゲムシタビンＥＣ５０（Ｔ３Ｍ−４は、１．２ｎｇ／ｍＬ、Ｃｏｌｏ３５７は、１．５ｎｇ／ｍＬ）で４８時間細胞を処理することを含む選択サイクルを５回行って単離した。親細胞及び耐性細胞の薬剤感受性は、ＭＴＴとクローン生存アッセイの両方で評価した。
【００４６】
実施例２．Ｈ−１ＰＶは、単独及びゲムシタビンと協調して培養ヒト膵臓癌細胞を殺し、細胞質に活性カテプシンＢを遊離する
６つのヒトＰＤＡＣ細胞株、Ｃｏｌｏ３５７、Ｔ３Ｍ−４、ＳＵ８６．８６、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ−１、及びＢｘＰＣ−３について、Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン毒性に対する感受性を試験した（表１、図１、及び図１３）。ＭｉａＰａＣａ−２、ＳＵ８６．８６、及びＴ３Ｍ−４は、ウイルス誘導性細胞死に過敏であり、Ｃｏｌｏ３５７、ＳＵ８６．８６、及びＴ３Ｍ−４はゲムシタビンに対して最も感受性を示した。重要なことは、ゲムシタビン処理に強い抵抗性を示した細胞株（Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、及びＭｉａＰａＣａ−２）はＨ−１ＰＶに感受性を示したことである。
【００４７】
【表１】
【００４８】
培養物を９６ウェルプレートに２×１０３細胞／ウェルで播種し、ゲムシタビン（０．４〜４０００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に異なるＭＯＩ（１、１０、１００ＲＵ／細胞）でＨ−１ＰＶを感染させた。細胞毒性は、感染の７２時間後にＭＴＴアッセイにより評価した。単独（ｍｏｎｏ）と併用（ｃｏｍｂ）処理におけるＥＣ５０は、異なるＭＯＩ（Ｈ−１ＰＶ）及び濃度（ゲムシタビン）で得られたＭＴＴ測定結果を使って作成したアイソボログラムから算出した。組み合わせ指標（ＣＩ）及び感作指標（ＳＩ）は、材料及び方法で説明したように決定した。
＊示す細胞株は、Ｈ−１ＰＶ殺作用に対して過敏であるため、統計分析にはＥＣ７５を使用した。Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン単独治療でのＥＣ５０値を括弧内に示す。
【００４９】
表１に示すように、併用治療の細胞毒作用はほとんどの場合に相乗的であり（ＣＩ＜１）、特に、ＭｉａＰａＣａ−２細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、及びＳＵ８６．８６細胞で相乗効果が高かった。効果的なウイルス用量は、１．３ｎｇ／ｍＬ（Ｃｏｌｏ３５７、組み合わせ１）から２００ｎｇ／ｍＬ（Ｐａｎｃ−１、組み合わせ１）までの用量範囲のゲムシタビン存在下において、因子（ＳＩＨ−１ＰＶ）で３５倍まで下げることができた。反対に、細胞増殖の阻害に必要な効果的な薬剤濃度は、細胞をＨ−１ＰＶ（ＭｉａＰａＣａ−２、組み合わせ２）を感染させた場合、因子（ＳＩＧｅｍ）で１５倍まで下げられた。２週間の全ての細胞株のコロニ形成能は、両方のＨ−１ＰＶにより効果的に阻害された（データは非図示）。
【００５０】
更に、ＰＤＡＣ由来株のカテプシンＢ活性の細胞内分布が上記処理後に変化したかどうかを決定した。これは、３つのヒトＰＤＡＣ細胞株を使用して試験した。図１４に示すように、機能性カテプシンＢの細胞質蓄積は、Ｈ−１ＰＶ／ゲムシタビン併用により著しく促進され、このメカニズムが観察された累積した毒性に関与していることが強く示唆された。
【００５１】
実施例３．Ｈ−１ＰＶはゲムシタビン感受性及び耐性細胞の両方を同様の効率で殺すことができる
ゲムシタビンに対する耐性の形成は、ＰＤＡＣ患者の本薬剤での長期治療の大きな障害であるため、ゲムシタビンに対する天然の感受性が異なる前記細胞株の２つ（Ｐａｎｃ−１及びＢｘＰＣ−３）から誘導したゲムシタビン耐性細胞変異体に対する、Ｈ−１ＰＶの細胞変性効果を試験した（表１）。耐性（Ｒ）群は、薬剤の用量を増加させて細胞を連続的に処理することにより単離した。耐性変異体は、ＭＤＲ及びＭＲＰ１／２薬剤送出マーカの発現促進など、その成長速度の低下及び安定な表現型の変化によりそれぞれの親細胞株から区別できた（図２Ａ）。取り込み（ｈＥＮＴ）及び活性化（ｄＣＫ）マーカのレベルは変化しないか又は僅かな減少にとどまっており（図２Ａ）、耐性表現型は、主により強いゲムシタビン送出によるものと思われる。薬剤耐性変異体はＨ−１ＰＶ感染への感受性を維持している（図２Ｂ、図２Ｃ、Ｈ−１ＰＶカラム）一方、元の細胞株に毒性であるゲムシタビン（４０ｎｇ／ｍＬ、１４４時間）との長時間の培養には耐性であった（図２Ｃ、ベムシタビンカラム）。Ｈ−１ＰＶにより誘導された細胞死が、ＢｘＰＣ−３細胞に対して、ＢｘＰＣ−３Ｒ細胞で僅かではあるが有意に上昇していることが観察された。これは、Ｈ−１ＰＶが、ゲムシタビンに対して獲得した耐性を回避するＰＤＡＣの第二選択治療として使用できる可能性を示唆している。更に、ゲムシタビン耐性表現型は、パルボウイルス生活環の進行に対する毒性薬剤用量による障害の低下に関連していることが見出された。実際、Ｐａｎｃ−１Ｒ細胞内における、組換えパルボウイルスベクタにより発現されるマーカ蛋白質ＥＧＦＰの発現は、親細胞におけるＥＧＦＰ形質導入を阻止するゲムシタビン用量で曝露した後であっても促進された（図２Ｄ）。従って、ゲムシタビン治療が続けられている状況下においても、化学療法剤耐性腫瘍細胞変異体はＨ−１ＰＶの標的のままであると結論づけることができる。効果的なウイルス殺作用は、高ゲムシタビン用量で短期処理して選択したゲムシタビン耐性Ｃｏｌｏ３５７細胞及びＴ３Ｍ−４細胞の感染後でも、同様に観察された（図１５）。これらのデータに一致して、耐性及び親のＣｏｌｏ３５７細胞株及びＴ３Ｍ−４細胞株はウイルス複製について同様の能力を有していた（データは非図示）。
【００５２】
以上、生体外実験により、Ｈ−１ＰＶが、薬剤耐性細胞に対する殺作用全体を強化し、かつ薬剤治療の後期に現れる化学療法剤耐性変異体を除去することによって、ゲムシタビンの治療効果を改善することが示された。
【００５３】
実施例４．Ｈ−１ＰＶは同所性膵臓腫瘍の部分的から完全な抑制を誘導し、それにより動物の生存を引き伸ばす
臨床状態をより近似させるために、ＰＤＡＣを同所的に移植した同系ラットモデルをＨ−１ＰＶの抗癌活性を評価するために使用した。ラットはＨ−１ＰＶの自然宿主であるので、前記系は、臨床応用に必須である、この腫瘍溶解性薬剤の毒性評価にも適している。モデル（ＨＡ−ＲＰＣ）に使用されるラットＰＤＡＣ細胞は、まずＨ−１ＰＶ感染に対する感受性を生体外で検査し、ウイルスとゲムシタビン毒性に対して前記ヒト細胞と同様の範囲の感受性を有することを確認した（図３Ｅ（ａ））。
【００５４】
膵臓へのＨＡ−ＲＰＣ細胞の移植の２週間後に、Ｈ−１ＰＶを単回腫瘍内注入により生体内に投与した。腫瘍の大きさ（ｍＣＴスキャンニング及び死後の肉眼検査により測定）、動物の生存、及びウイルス分布を測定した。ウイルス治療は腫瘍成長を遅らせ（図３Ａ）、図３Ｂに示すように、ウイルス処理群のラットは、擬似処理対照群より有意に長く生存し、１６週目（実験の最後まで）には２０％が無病であった。重要なことに、Ｈ−１ＰＶは、正常組織とは対照的に腫瘍選択的に発現していた。このことを確認するために、ウイルス転写産物の存在について内臓組織を検査した（ＲＴ−ＰＣＲ）。図３Ｃに示すように、感染後直ぐに腫瘍とその周りの膵臓組織に初期ウイルス発現を観察した。他のモデルによる以前の観察結果と一致して、Ｈ−１ＰＶはリンパ組織にも分布していた（Ｇｉｅｓｅ ＮＡ，Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，ＤｅＭａｒｔｉｎｏ Ｌら, Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ ｂｙ ａ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＭＶＭｐ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ＩＰ−１０ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；９：４３２−４２）。１０日目から、ウイルス発現は衰えた。これはウイルス中和抗体が現れ、ウイルスの広がりを低減したためと思われる（Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｂａｌｂｏｎｉ Ｇ，Ａｐｒａｈａｍｉａｎ Ｍら，Ｃａｒｒｉｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；１０９：７４２−９）。しかし、ウイルス発現は接種の２０日後まで腫瘍内で続いた。また、ウイルスの腫瘍内分布は免疫組織化学分析により確認された（図３Ｄ）。
【００５５】
予め存在していた腫瘍の完全な消失がｍＣＴスキャンにより確認されたケースもある（図４、Ａ及びＣの比較）。原発腫瘍の局所的拡大に加えて、上部腹腔の内臓リンパ節及び肝臓にそれぞれ影響するリンパ及び血行性転移は、ＰＤＡＣの死亡に大きな役割を果たしている。予測されたとおり、非感染ラットのｍＣＴモニタリングでは、局所膵、幽門、肝リンパ節及び肝臓への転移浸潤が観察された（図４Ｂ、矢印）。初期段階で原発腫瘍にＨ−１ＰＶを播種した場合には（図４Ａの像に対応）、その後に、原発腫瘍と同様に遠隔転移が４５％まで抑制された（図４Ｃ）。興味深いことに、このモデルでの肝臓への転移疾患の広がりは、臓器での遅発性ウイルス発現と相互に関連しており（図３Ｃ）、これはＨ−１ＰＶが腫瘍浸潤を能動的に制御できることを示唆している。
【００５６】
実施例５．Ｈ−１ＰＶはゲムシタビン治療が効かないＰＤＡＣ腫瘍を抑制する
Ｈ−１ＰＶが、生体外で観察されたように、生体内でもゲムシタビンの治療効果を促進できるかどうかを検討した（表１、図１３）。臨床的状況に近似させるために、ＰＤＡＣ担持ラットをまずゲムシタビンで処理し、２週間後に手術的にＨ−１ＰＶを腫瘍に播種した。図５Ａ（ゲムシタビン プレ Ｈ１−パルボウイルス）に示すように、当該処置は、擬似処理（対照）、又は化学療法剤単独治療（ゲムシタビン）と比較してラットの生存を有意に伸ばした。両方を同時に投与した場合（Ｈ−１ＰＶ及びゲムシタビン）には、Ｈ−１ＰＶはゲムシタビンの治療効果を改善しなかった。これは、遺伝毒性薬のパルボウイルス生活環への負の作用によるものと思われる（図２Ｄも参照）。
【００５７】
ヒト細胞を使用した異なる生体内モデルにおけるゲムシタビンとＨ−１ＰＶの効果について試験するために、ＢｘＰＣ−３腫瘍をヌードマウスに誘発し、ラットと同様な治療レジメンにより治療した（図５Ｂ）。治療を受けた全てに動物において、対照と比較した生存期間が長かった。併用治療（ゲムシタビン プレ Ｈ１−パルボウイルス、ｎ＝５）及びＨ−１ＰＶ単独治療（ｎ＝５）では、最高の抗腫瘍効果を達成し、各群において１匹は実験開始の７０日後まで無腫瘍であった。この時点で、併用処理群の動物の４０％は生存していた。一方で全ての対照群マウスは移植後４０日目までにサクリファイスされなければならなかった。
【００５８】
以上、これらのデータによりゲムシタビンはＰＤＡＣに対して一時的に保護効果を示し、それに続くＨ−１ＰＶの投与が動物の生存を引き伸ばすことができることが確認された。更に、ラットモデルで行われた本治療法の毒性評価により、ゲムシタビン処理による網状赤血球及び単球におけるレベルの低減を除けば、骨髄活性の血液伝播性マーカは概して影響を受けないことが示された（図６Ａ）。臨床的結果は、同様に肝臓及び腎臓機能をモニタすることを促すものであった（図６Ｂ）。ビリルビン、ＡＳＡＴ、及びＡＬＡＴレベルは、非治療及びゲムシタビン処理群で上昇しており、ＰＤＡＣ担持ラットの肝臓では溶菌作用が低いことを示していた。追加のパルボウイルス治療により、これらのマーカのレベルは生理的範囲に回復した。クレアチニンレベルは安定のままであり、腎クリアランスに影響しないことを証明した。すなわち、検出した血液パラメータの異常は、完全にゲムシタビン治療に起因するものであり、引き続くＨ−１ＰＶ投与により更に悪化しなかった。
【００５９】
実施例６．Ｈ１−ＰＶ感染は、生体外で膠芽細胞腫に対するテモゾロミドの治療効果を改良できる
まず、検討に使用された細胞株がＨ−１ＰＶ感染及びテモゾロジン（ＴＭＺ）処理に対して感受性であるかどうかを検査するために、これらの細胞株の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。また、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺの併用治療後の生存率を測定した。明らかに効果を示すが、細胞の完全な溶菌は起こさない濃度であると推定される、５ｐｆＵ／細胞のＭＯＩ及び２５μＭのＴＭＺで細胞を感染及び処理した。図７〜１１は、３日後及び６日後の結果を示すグラフである。処理３日後には既に明確な効果が観察された。処理６日後に対照細胞が既にコンフルエントな状態となったため実験を中止した。また、６日後には（特定の細胞株によるが）生存率が非常に低かったため、更なる分析は行えなかった。
【００６０】
対照として、ヒト星状膠細胞を、（ａ）Ｈ−１ＰＶで感染するか、（ｂ）ＴＭＺで処理するか、又は（ｃ）両者の併用治療を行った。図８に示されるように、これらの処理のいずれも星状膠細胞に何の影響も示さなかった。
【００６１】
図８に示すように、ＲＧ２細胞は、Ｈ−１ＰＶ感染に非常に感受性が高く、感染の３日後には約９０％の細胞が既に溶菌された。同様の結果が併用治療（Ｈ−１ＰＶ＋ＴＭＺ）により得られている。６日後には、全ての細胞が死滅した。また、結果は該細胞がＴＭＺ処理に感受性を有さないことを示している。
【００６２】
図９に示すように、Ｈ−１ＰＶ感染の３日後では、Ｕ８７ＭＧ細胞の約１０％のみが溶菌され、ＴＭＺ単独の処理後では、約２０％の細胞が死滅した。併用治療（Ｈ１−ＰＶ＋ＴＭＺ）は強い細胞溶解作用を示し、約４０％の細胞が死滅した。しかし、治療の６日後にはこの作用はもはや存在せず、併用治療を施された細胞の生存率は、ＴＭＺ単独処理（ＴＭＺ）細胞の生存率と同等であった。
【００６３】
図１０に示されるように、ＴＭＺでの処理はＵ３７３細胞に対して細胞毒性作用を示さなかった（処理の６日後）。Ｈ−１ＰＶでの感染では、約６０％の細胞が６日後には溶菌された。同様の結果が併用処理（Ｈ１−ＰＶ＋ＴＭＺ）でも得られた。
【００６４】
図１１は、ＴＭＺ処理に非常に感受性の高いＵ３４３細胞について得られた結果を示す。６日後には、８０％以上の細胞が死滅した。処理３日後では、Ｈ−１ＰＶ及びＴＭＺの併用は、単独処理に比較して強い細胞変性効果を示した。しかし、６日後には、この効果は低減し、併用治療後の生存細胞の割合がＴＭＺ単独処理後の生存細胞の割合に近づいた。
【００６５】
図１２に示すとおり、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用治療は、Ｈ−１ＰＶ単独及びＴＭＺ単独処理に比較して、細胞変性効果が促進されている。
【００６６】
要約すれば、樹立ヒト及び動物（ラット）膠芽細胞腫細胞株は、ヒト膠芽細胞腫由来の短期細胞株と同様、ウイルス仲介細胞死に非常に感受性が高いということが示された。この結果は、Ｈ−１ＰＶで溶菌的に感染させた樹立ラット細胞株ＴＧ２及び種々のヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｕ３４３ＭＧ及びＡ１７２（ｔｈｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ （ＤＫＦＺ）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツから入手可能）を使った本検討で確認することができた。細胞当たり感染性粒子５個という低用量で、７２時間後に明らかな細胞変性効果を得るのに十分であった。更に、Ｈ−１ＰＶで感染させたヒト星状膠細胞は溶菌しないことが示された。正常星状膠細胞、ＲＧ２細胞及びＵ３７３細胞を２５μＭのテモゾロミド（ＴＭＺ）で処理しても細胞死に至らなかった。これらの細胞は更に高用量の投与に対しても耐性を示した。
【００６７】
更に他のヒト細胞株もＴＭＺ処理に感受性を示した。Ｈ−１ＰＶとＴＭＺとの併用治療は、ウイルスの腫瘍溶解効果がＴＭＺ処理によって低減されないことを示した。一方、ウイルスはＴＭＺ処理による効果を抑制しなかった。膵臓癌のＨ−１ＰＶとゲムシタビンとの併用治療における結果と同様、Ｈ−１ＰＶとＴＭＺの併用治療により、生体内において相加的を超えた相乗的効果が達成できると考えられる。
【００６８】
（参照文献）
Ｈａｒｒｏｐ Ｒ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＭＷ．Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ ２００６；１１：８０４−１７．
Ｒａｙｋｏｖ Ｚ，Ｇｒｅｋｏｖａ Ｓ，Ｇａｌａｂｏｖ ＡＳら， Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｈ−１ ｉｎ ａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ２００７；１７：１４９３−９．
Ｐｌａｔｅ ＪＭ，Ｐｌａｔｅ ＡＥ，Ｓｈｏｔｔ Ｓら， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００５；５４：９１５−２５．
Ｂｅｎｎｅｔｔ ＪＪ，Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ Ｐ，Ｐｅｔｒｏｗｓｋｙ Ｈら, Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＤＤ３４ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ ａｎｄ ａ ｇａｍｍａｌ３４．５ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ（Ｇ２０７）．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００４；１８：１００１−３．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルボウイルス及び化学療法剤を含有する医薬組成物。
【請求項２】
（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤を別々の構成として含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
癌治療用医薬組成物の製造のためのパルボウイルス及び化学療法剤の使用。
【請求項４】
（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤が連続的に投与されることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
癌が脳腫瘍又は膵臓癌である、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
脳腫瘍が神経膠腫、髄芽腫又は髄膜腫であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
神経膠腫がヒト悪性膠芽細胞腫であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
パルボウイルスがＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物、あるいは請求項３〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
関連するげっ歯類パルボウイルスがＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１１】
化学療法剤がゲムシタビン又はテモゾロジンであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１２】
パルボウイルス（ａ）を化学療法剤（ｂ）の投与後に投与することを特徴とする、請求項３〜１１のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１３】
パルボウイルスを腫瘍内投与することを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１４】
膵臓癌治療用医薬組成物の製造のためのパルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルスの使用。
【請求項１５】
膵臓癌が薬剤耐性癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
薬剤がゲムシタビンであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
関連するげっ歯類パルボウイルスがＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１】
パルボウイルス及び化学療法剤を含有する医薬組成物。
【請求項２】
（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤を別々の構成として含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
癌治療用医薬組成物の製造のためのパルボウイルス及び化学療法剤の使用。
【請求項４】
（ａ）パルボウイルス及び（ｂ）化学療法剤が連続的に投与されることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
癌が脳腫瘍又は膵臓癌である、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
膵臓癌が膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
脳腫瘍が神経膠腫、髄芽腫又は髄膜腫であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
神経膠腫がヒト悪性膠芽細胞腫であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
パルボウイルスがＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物、あるいは請求項３〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
関連するげっ歯類パルボウイルスがＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１１】
化学療法剤がゲムシタビン又はテモゾロジンであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の医薬組成物又は使用。
【請求項１２】
パルボウイルス（ａ）を化学療法剤（ｂ）の投与後に投与することを特徴とする、請求項３〜１１のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１３】
パルボウイルスを腫瘍内投与することを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１４】
膵臓癌治療用医薬組成物の製造のためのパルボウイルスＨ１（Ｈ１ＰＶ）又は関連するげっ歯類パルボウイルスの使用。
【請求項１５】
膵臓癌が薬剤耐性癌であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
薬剤がゲムシタビンであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
関連するげっ歯類パルボウイルスがＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）であることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５０７９２３（Ｐ２０１１−５０７９２３Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４００７０（Ｐ２０１０−５４００７０）
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１１０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８３２３２
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０００３０６５５）
【出願人】（５０９１６１１４１）ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク (6)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｂｅｎｇａｓｓｅ １， Ｄ−６９１１７ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１１０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８３２３２
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５０００３０６５５）
【出願人】（５０９１６１１４１）ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク (6)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｂｅｎｇａｓｓｅ １， Ｄ−６９１１７ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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