ヒアルロン酸エステル、それらの製造および皮膚科学における使用
【課題】粘弾性増強作用、保湿作用、軟化活性を有する化合物として皮膚保護に用いるための、あるいは光線照射により誘発される紅斑性病態の抗発赤作用または鎮痛作用を有する新規多糖類エステルの提供。
【解決手段】ヒドロキシ−ケイ皮酸とヒアルロン酸の新規エステル誘導体、それらのレオロジー的性質および抗ラジカル性、ならびに皮膚科学における保護薬としての局所組成物、それらの使用。該ヒドロキシ−ケイ皮酸がフェルラ酸およびカフェイン酸である。
【解決手段】ヒドロキシ−ケイ皮酸とヒアルロン酸の新規エステル誘導体、それらのレオロジー的性質および抗ラジカル性、ならびに皮膚科学における保護薬としての局所組成物、それらの使用。該ヒドロキシ−ケイ皮酸がフェルラ酸およびカフェイン酸である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）といったグリコスアミノグリカン（ＧＡＧ）とフェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体の新規エステル誘導体に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡは、グルクロン酸およびＮ−アセチル−グルコサミンにより形成される二糖単位の繰り返し配列を含むＧＡＧである。
【０００３】
ＨＡは、組織における水の制御から細胞の運動性に亘るいくつかの生物学的機能を実行し、さらに、皮膚において、他の物質と結合して皮膚に緊密性を付与する巨大分子複合体を形成することにより、支持体としての機能も有する。
【０００４】
フェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体は、遊離型、またはリグニンもしくは他の生体高分子と共有結合した形態において植物界の種子および葉に広く分布している。そのフェノール骨格および側鎖の幅広い共役により、それらは、強力な抗酸化作用、ならびに様々な炎症性病変および紫外線照射に曝された細胞の保護特性における保護機能を作り出す共鳴により安定化されるフェノキシラジカルを形成する。
【０００５】
ヒアルロン酸は、皮膚のレベルにおいて、経表皮水を保持することにより作動する保湿物質である。しかしながら、それは非常に親水性が高い分子であるために親油性の角質層への浸透には困難が伴い、さらに、迅速に分解される物質でもある。本発明の化合物の１つのアドバンテージは、修飾したポリマーにおけるヒドロキシ−ケイ皮酸置換基の存在により、組織に存在するヒアルロニダーゼが行う酵素分解から保護されることであり；さらに、ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体によるＨＡのエステル化により、天然のポリマーに比べて高い親油性を有し、故に、経皮生体吸収が容易となる化合物の獲得が可能となる。
【０００６】
その化学的、物理学的および生物学的性質の観点からＨＡは特に研究、構造修飾の対象とされてきており、新たな誘導体に関する刊行物および特許がいくつか存在する。
【０００７】
例えば、欧州特許番号第０３４１７４５号のように主に関節症治療における関節内投与に用いるための、あるいは、例えば、米国特許番号第４，５８２，８６５号のように術後の癒着防止剤として用いるための粘弾性生成物を得るために、ＨＡを架橋する加工に関し、いくつかの研究が行われた。
【０００８】
ＨＡのヒドロキシ基を有機酸でエステル化して得られるエステルに関する特許または刊行物の数は比較的少ない。
【０００９】
これらの内、異なる置換度のアセチル化ＨＡの製造を開示する米国特許番号第５，６７９，５６７号を引用することができよう。WO2005/092929および Inv. New Drugs (2004), 22 (3), 207-217 は、抗増殖作用を有し、故に、抗腫瘍的使用に潜在的に有用である酪酸とＨＡのエステル誘導体を開示し、一方で、WO2008/081255は、酪酸とＨＡのエステル誘導体であるが、高い架橋度を有し、主に関節内投与のための粘弾性増強剤として有用であるものを開示する。ＨＡの他のエステル誘導体は、Picotti et al., WO2009/080220に記載され、ここで、ＨＡはリポ酸でエステル化され、デルモコスメティックな使用のための誘導体、または関節内治療のための医療機器としての誘導体が提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
我々の知る限り、現在のところ、粘弾性増強作用、保湿作用、軟化活性を有する化合物として皮膚保護に用いるための、あるいは光線照射により誘発される紅斑性病態の抗発赤作用または鎮痛作用を有する医療機器もしくは粘弾性補足剤として用いるための多糖類のエステル、より具体的にはＨＡとヒドロキシ−ケイ皮酸のエステルの記載は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、酢酸、酪酸およびリポ酸などの異なる酸でエステル化された前述の多糖類誘導体とは異なる、フェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸とヒアルロン酸の新規エステル誘導体を開示する。
【００１２】
本発明のエステル化されたヒアルロン酸の置換度は調整されてもよく、例えば、ヒアルロン酸とカルボニル−ジ−イミダゾールで前もって活性化したヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体の化学量論比、用いられる触媒塩基の量および反応時間といった適用される反応条件に依存し、評価された実験条件の範囲内である２％から２０％の間を含む。
【発明の効果】
【００１３】
故に、本発明により得られる誘導体の化学的、物理学的およびレオロジー的特性は、ヒドロキシ−ケイ皮酸によるヒアルロン酸のエステル化度を変更することにより改変することができる。かかる誘導体は、保湿剤、粘弾性増強剤、抗老化薬、抗挫創薬として、あるいは、創傷、アトピー性皮膚炎、光線照射による皮膚の発熱といった異なる性質の皮膚損傷の治療のためにも用いられ得る。
【００１４】
本発明はまた、先行技術とは異なった新規のものであるかかる誘導体の製造方法を請求する。実際、かかる方法は、アセトンによる沈殿とそれに次ぐメタノール処理、濾過、減圧乾燥による反応生成物の回収を包含し、それにより、透析またはタンジェント濾過（tangential filtration）といった時間がかかり高価である工程を用いる必要なく合成工程の不純物を除去することが可能となり、次いで、最終生成物が凍結乾燥または噴霧乾燥により回収される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
原文に記載なし。
【実施例】
【００１６】
ＮＭＲの実験はBruker Avance 400 instrumentを用いて記録された。約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＫＯＤを１滴用いて化合物をｐＨ１２のＤ２Ｏに溶解した。
【００１７】
６から８ｐｐｍの間の芳香族領域ではエステル化による芳香環のシグナルが観察でき、ヒアルロン酸のメチルのシングレットの非常に強いシグナルは約１．８ｐｐｍで見られた。これらのシグナルの積算により、サンプルにおけるエステル化度が得られる。
【００１８】
実施例１：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（中置換度）の製造（化合物１）
３ｇのヒアルロン酸Ｎａ（ｍｗ４０４；７．９ ｍｅｑ.（モノマー単位）、分子量３００ｋＤ）を９０℃で６０ｍｌのホルムアミドに溶解した。室温に冷却後、１．０５ｍｌのトリエチルアミン（７．５ｍｅｑ.）、ならびに１０ｍｌのホルムアミドに懸濁し、Molecules 2007, 12, p. 2540-2544、化合物１２のようにして製造した０．５ｇのフェルロイルイミダゾリド（ｍｗ２４４；１．９９ｍｅｑ.）を得られた溶液に加えた。
【００１９】
室温で終夜反応させた後、反応混合物を１５ｍｌの５％ＮａＣｌで希釈した。最初は粘稠性の高かった溶液はより流動性の高いものとなり、それを１リットルの無水アセトンに滴下して注いだ。生じた沈殿物を濾取し、４００ｍｌの無水アセトンで再撹拌し、再度濾取し、２００ｍｌの無水メタノールで再び撹拌した。
【００２０】
濾取し、４０℃で減圧乾燥した後、サンプルの無水物（３．１ｇ）を回収した。
【００２１】
このようにして得られた化合物を、ＩＲ、ＮＭＲ分光法および元素分析で解析した。
【００２２】
ＨＡのメチル基のシグナルおよびフェルラ酸のダブレットシグナル間のシグナルの積分中間体（ＮＭＲ）の比を算出することにより、８％の置換度（エステル化）を得た（図１のＮＭＲを参照）。
【００２３】
実施例２：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（低置換度）の製造
実施例１と同じ工程に従い、ただし、ＮａＣｌを加える前の反応時間を２時間のみに短縮し、４％のエステル化度の無水化合物２．８ｇを得た（図２のＮＭＲを参照）。
【００２４】
実施例３：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（高置換度）の製造
実施例１の工程に従い、ただし、ＮａＣｌを加える前の反応時間を２４時間に延長、イミダゾリドの量を１．９ｇ（７．９ｍｅｑ.）に増加し、１７％のエステル化度の無水化合物３．３ｇを得た（図３のＮＭＲを参照）。
【００２５】
実施例４：ヒアルロン酸のカフェイン酸エステルの製造
カフェイン酸（０．５１ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、０．９２ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を還流状態で１時間維持し、反応混合物を直接次工程に用いた。
【００２６】
ヒアルロン酸ナトリウム（３．０ｇ、７．９２ｍｍｏｌ、モノマー単位）を、砂浴内に置いた2-neck バルーン中において、７０℃で１時間ホルムアミド（６０ｍｌ）に溶解した。得られた粘稠性の無色の溶液を室温に冷却し、ＴＥＡ（１．１ｍｌ、７．９２ｍｍｏｌ）、およびイミダゾリド（約２．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加えた。均一なオレンジ−赤味がかった溶液が得られるまで混合物を撹拌した。数分以内に溶液の粘度および稠度はゼラチン状のオレンジ−赤味がかった（ゴミの様で弾性に富んだ）凝集物が形成される程度に上昇した。室温で終夜静置した後、凝集物をＮａＣｌ溶液（５％ ｗ／ｖ、１５ｍｌ）に加えた。
【００２７】
得られたゲル状物質を２００ｍｌのアセトンで処理し、濾取し、１００ｍｌのメタノールで撹拌しながら２回再懸濁し、濾取し、減圧乾燥し、黄褐色の無水生成物（２．５ｇ）を得た。
【００２８】
約６ｍｇのポリマーの試料を０．７ｍｌのＤ２Ｏ中で膨潤させ、完全に透明で無色のゲル状物質を得た。該ゲル状物質をＮＭＲチューブに移し、分析したところ（図４）、エステル化されたカフェイン酸の芳香族水素に帰属できる６および７．２ｐｐｍの間のダブレットシグナル、および１．８ｐｐｍにおけるメチル基の強いシングレットシグナルを示した。４０％ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏを１滴加えることにより、ヒアルロン酸ナトリウムの誘導体化の度合いを定量することが可能となり、７％と同等であることが分かった。
【００２９】
実施例５：酵素的分解に対する抵抗性の評価
表皮における微生物の存在によりそれに関連する生物学的活性が皮膚において発生するが、活性は様々な酵素的機能の形態で示され、その中にヒアルロニダーゼ酵素によるものがある。ヒアルロン酸（ＨＡ）は天然において該酵素により分解されるが、該酵素は、多糖鎖のモノマー単位間のグリコシド１，４−ベータ結合を加水分解することによりヒアルロン酸の分解を触媒する。架橋ＨＡはヒアルロニダーゼの酵素作用に強い抵抗性を有し、かかる抵抗性は架橋度の上昇と共に上昇する。本発明のヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体のような適切な化学構造を有する分子によるＨＡのエステル化により、架橋ＨＡと同様のレオロジー的特性を有しながら良好な水溶性を維持する化合物を得ることができる。
【００３０】
前記の合成で用いたような市販のＨＡのナトリウム塩（分子量３００ｋＤ）、ならびに実施例２および３でそれぞれ記載されるフェルラ酸でエステル化した低エステル化度および高エステル化度のＨＡエステルの２つのサンプルを用いた。
【００３１】
実験は一般的な方法により行われた。
【００３２】
簡潔に述べると、３７℃で維持した、０．１ｍｇ／ｍｌ（ウシ精巣ヒアルロニダーゼ、Ｉ−Ｓ型、Sigma、１０００Ｕ／ｍｇ）と同等の量の酵素を含む多糖類の溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃でインキュベートした。０−２時間の範囲の定期的な間隔で０．５ｍｌのサンプルを採取し、１００℃で５分間置き、濾過して酵素を除去し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー分析により分析した：クロマトグラムの加工により分子量分布を算出した。
【００３３】
酵素とインキュベートしてから３０分後、市販の非エステル化ＨＡは、約３００ｋＤの分子量から約１０分の１の分子量に激しく分解された。実施例２に由来するサンプルは、約４％のエステル化度であり、約６０％分解されたが、実施例３に由来するサンプルでは、平均分子量が約２５０ｋＤに変化するわずかな加水分解過程しか行われなかった。
【００３４】
実施例６：フェルラ酸でエステル化したＨＡのサンプルのレオロジー的研究
本発明の化合物（実施例１の化合物）のレオロジー的挙動を、本発明の化合物のエステルの製造において未加工の出発物質として用いたＨＡのナトリウム塩（分子量３００ｋＤ）のものと比較した。
【００３５】
レオロジー測定は Rotovisco 1-Haake レオメータ、plate/plate システム、Rheowin 323 ソフトウェアを用いて行った。粘度は、０．０１ｓ−１から５００ｓ−１のディスクの速度勾配、「せん断速度」により測定し、サンプルはＮａＣｌ ５％食塩水に２％の量において溶解した。
【００３６】
実施例１に関連するサンプルは擬塑性のレオロジー的挙動を示し、粘度はせん断速度（図５ａおよび図５ｂ参照）と共に増加した。Ostwald de Waeleの関係を適用することにより得られたフローダイヤグラムの算出パラメーターは、それぞれ:Ｋ（Ｐａ.ｓ）、即ち、９．９７＋／−０．５３（ｎ＝３）およびｎ＝０．４７と同等のフローコンシステンシーインデックス（流動性指数、即ち、速度勾配の関数としての対数スケールにおける粘度曲線の傾き）である。
【００３７】
実際、この結果から、フェルラ酸によるＨＡのエステル化により、低せん断において互いに相互作用可能である無視できない非直線形の立体障害構造を有する鎖が提供されるという結論が導かれる。適用するせん断を上昇させることにより、鎖は流れに沿って一直線となる傾向にあり、故に、系はネイティブな挙動に戻ることとなる。
【００３８】
逆に、非修飾ネイティブＨＡは、非常に低いＫ値（Ｋ＝０．４０ Ｐａ.ｓ）である、溶液の典型的なプロファイルを有していた。
【００３９】
実施例７：ヒト活性化好中球におけるフェルラ酸ＨＡ化合物（実施例１）の抗ＲＯＳ活性
本発明の化合物が、ＨＡのエステル化に用いたヒドロキシ−ケイ皮酸物質の抗酸化的、抗ラジカル的なスカベンジング活性を保持できているかを調べた。
【００４０】
インビトロにおいて、化合物１の、ホルボール−ミリステート−アセテート（ＰＭＡ）で活性化したヒト好中球白血球により産生される活性酸素分子（ＲＯＳ）の活性の阻害能を、Luminol（Ｈ２Ｏ２などの酸化剤の存在下において、化学発光を示す物質）の存在下で評価した。
【００４１】
かくして、白血球の細胞懸濁液（１０６細胞／ｍｌ）を、Luminol（５μＭ）の存在下において適切なバッファーに溶解した化合物１と共にインキュベートした。細胞を、３７℃で１０分間、０．０２および０．２ｍＭの化合物１、あるいはネイティブなＨＡのナトリウム塩と共にインキュベートした。その後、細胞を０．１μＭ ＰＭＡで活性化し、２０分間、４分間隔において蛍光リーダーHTS7000（Perkin Elmer）で化学発光をモニターした。
【００４２】
より高濃度の試験濃度において化合物１は最大７８％の阻害を示したが、ＨＡは事実上不活性であり、多糖類にフェルラ酸を導入することにより、出発物質の抗ラジカル活性が低下することが示された。
【００４３】
実施例８：遮光機能を備えたＯ／Ｗソフニング・クリームの製造
本発明の限定されない例として、本発明のエステル誘導体を含み、ガンマ−オリザノールなどの太陽光線（ＵＶＢ）保護指数を付与された物質を添加することにより強化され、故に、発色団部分の作用が統合されたクリーム製剤を製造した。
【００４４】
該製剤は、２％の濃度の実施例１に記載される化合物１を、乳化剤、防腐剤、無痛化剤、および溶剤といった皮膚科学において一般的に用いられる賦形剤、ならびに、太陽光線照射に対し保護作用を有する薬剤、即ちガンマ−オリザノールとの混合物において含有する。
【００４５】
簡潔に述べると、製造方法は以下である：
ａ）油脂相：炭酸ジ−カプリリル、カプリル酸ヤシ油アルキル（coco−caprylate）、ポリ−グリセリル−２−ジポリ−ヒドロキシステアレートおよびフェノキシ−エタノールを撹拌下において約８０℃で加熱することにより溶解し；得られた溶解物に、ガンマ−オリザノールを加えた；
ｂ）水相：水、デヒドロ酢酸ナトリウムおよび化合物１をターボ乳化機に入れ；溶解するまで約６０℃で加熱した後、常に緩やかに撹拌しながら、他の成分、即ち、乳化用混合物ナトリウムラウリルグルコースカルボスシレート／ラウリルグルコシドおよび防腐剤混合物メチルプロパンジオール／フェニルプロパノールを加えた；
ｃ）エマルジョン：油脂相を撹拌下において水相に注ぎ、タービンを１０分間活性化した；反応物を常に撹拌しながら最終的に２０／２５℃の温度まで冷却した。
以下の組成（重量％）を有するクリームが得られた：
【００４６】
実施例９：デルモコスメティック活性の機能アッセイ
皮膚保水性および弾力性といったデルモコスメティックな機能活性を、前記の実施例で示されるプロトタイプ製剤を用い、目的に沿って訓練した志願者の集団において評価した。本実験では、実施例８の製剤の活性を、活性成分を含まない同様の製剤（コントロール）と、４週間、１日２回処置した志願者の２つの群で比較した（Ｔ０およびＴ４ｗの時点）。
【００４７】
ａ）皮膚弾力性：皮膚弾力性の評価は、プローブを皮膚に適用することにより該プローブ内で負の圧力（吸引力）を１秒間発生し、次いで解除する測定装置である「皮膚測定装置」を用いて行った。弾力性は、皮膚に残った変形と皮膚の最大伸張の比により算出した。かかる比は、文献ではパラメーターＲ２として知られ、ストレス事象後に皮膚が元の状態に戻る能力を示す。かかる比が１に近いほど、皮膚の弾力性は高くなる。
【００４８】
実施例８の製剤と関連する処置群では、開始時点のＴ０からＴ４ｗの時点のＲ２パラメーターの百分率変化は２７．５％（ｐ＜０．０５、ｔ検定）であったが、コントロール群におけるその百分率変化は有意なものではなかった。この結果により、本発明の化合物１が、関連する弾力性増強活性を付与されたものであり、同じ賦形剤を用いて製造されたコントロールで処置した群では見られなかったＲ２パラメーターの上昇を引き起こしたことが示された。
【００４９】
ｂ）皮膚保水性：顔の皮膚の水分量は、静電容量の物理的法則に基づき皮膚水分量を測定する装置である「コルネオメーター」で測定した。該装置は、４９ｍｍ２の面積の正方形のセンサーからなる。センサー表面を顔の皮膚の平坦な領域に押し付けることにより、該装置から角質層の水含量に比例する数字が提供される。故に、該数字は、該装置の任意単位であるコルネオメトリー単位（０から１５０ｃ.ｕ.）で表される皮膚表面の皮膚水分量の尺度を提供する。
【００５０】
試験の終了時、実施例８の製剤で処置した群では、４．８％に相当する皮膚水分量の百分率変化の増加が記録されたが、比較に用いたコントロール群では変化は記録されなかった。しかしながら、この増加は有意性の限界に近いことが分かり、これはおそらくは、用いた被験群の比較的少ないメンバー数（ｎ＝１０）による結果である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）といったグリコスアミノグリカン（ＧＡＧ）とフェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体の新規エステル誘導体に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡは、グルクロン酸およびＮ−アセチル−グルコサミンにより形成される二糖単位の繰り返し配列を含むＧＡＧである。
【０００３】
ＨＡは、組織における水の制御から細胞の運動性に亘るいくつかの生物学的機能を実行し、さらに、皮膚において、他の物質と結合して皮膚に緊密性を付与する巨大分子複合体を形成することにより、支持体としての機能も有する。
【０００４】
フェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体は、遊離型、またはリグニンもしくは他の生体高分子と共有結合した形態において植物界の種子および葉に広く分布している。そのフェノール骨格および側鎖の幅広い共役により、それらは、強力な抗酸化作用、ならびに様々な炎症性病変および紫外線照射に曝された細胞の保護特性における保護機能を作り出す共鳴により安定化されるフェノキシラジカルを形成する。
【０００５】
ヒアルロン酸は、皮膚のレベルにおいて、経表皮水を保持することにより作動する保湿物質である。しかしながら、それは非常に親水性が高い分子であるために親油性の角質層への浸透には困難が伴い、さらに、迅速に分解される物質でもある。本発明の化合物の１つのアドバンテージは、修飾したポリマーにおけるヒドロキシ−ケイ皮酸置換基の存在により、組織に存在するヒアルロニダーゼが行う酵素分解から保護されることであり；さらに、ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体によるＨＡのエステル化により、天然のポリマーに比べて高い親油性を有し、故に、経皮生体吸収が容易となる化合物の獲得が可能となる。
【０００６】
その化学的、物理学的および生物学的性質の観点からＨＡは特に研究、構造修飾の対象とされてきており、新たな誘導体に関する刊行物および特許がいくつか存在する。
【０００７】
例えば、欧州特許番号第０３４１７４５号のように主に関節症治療における関節内投与に用いるための、あるいは、例えば、米国特許番号第４，５８２，８６５号のように術後の癒着防止剤として用いるための粘弾性生成物を得るために、ＨＡを架橋する加工に関し、いくつかの研究が行われた。
【０００８】
ＨＡのヒドロキシ基を有機酸でエステル化して得られるエステルに関する特許または刊行物の数は比較的少ない。
【０００９】
これらの内、異なる置換度のアセチル化ＨＡの製造を開示する米国特許番号第５，６７９，５６７号を引用することができよう。WO2005/092929および Inv. New Drugs (2004), 22 (3), 207-217 は、抗増殖作用を有し、故に、抗腫瘍的使用に潜在的に有用である酪酸とＨＡのエステル誘導体を開示し、一方で、WO2008/081255は、酪酸とＨＡのエステル誘導体であるが、高い架橋度を有し、主に関節内投与のための粘弾性増強剤として有用であるものを開示する。ＨＡの他のエステル誘導体は、Picotti et al., WO2009/080220に記載され、ここで、ＨＡはリポ酸でエステル化され、デルモコスメティックな使用のための誘導体、または関節内治療のための医療機器としての誘導体が提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
我々の知る限り、現在のところ、粘弾性増強作用、保湿作用、軟化活性を有する化合物として皮膚保護に用いるための、あるいは光線照射により誘発される紅斑性病態の抗発赤作用または鎮痛作用を有する医療機器もしくは粘弾性補足剤として用いるための多糖類のエステル、より具体的にはＨＡとヒドロキシ−ケイ皮酸のエステルの記載は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、酢酸、酪酸およびリポ酸などの異なる酸でエステル化された前述の多糖類誘導体とは異なる、フェルラ酸およびカフェイン酸といったヒドロキシ−ケイ皮酸とヒアルロン酸の新規エステル誘導体を開示する。
【００１２】
本発明のエステル化されたヒアルロン酸の置換度は調整されてもよく、例えば、ヒアルロン酸とカルボニル−ジ−イミダゾールで前もって活性化したヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体の化学量論比、用いられる触媒塩基の量および反応時間といった適用される反応条件に依存し、評価された実験条件の範囲内である２％から２０％の間を含む。
【発明の効果】
【００１３】
故に、本発明により得られる誘導体の化学的、物理学的およびレオロジー的特性は、ヒドロキシ−ケイ皮酸によるヒアルロン酸のエステル化度を変更することにより改変することができる。かかる誘導体は、保湿剤、粘弾性増強剤、抗老化薬、抗挫創薬として、あるいは、創傷、アトピー性皮膚炎、光線照射による皮膚の発熱といった異なる性質の皮膚損傷の治療のためにも用いられ得る。
【００１４】
本発明はまた、先行技術とは異なった新規のものであるかかる誘導体の製造方法を請求する。実際、かかる方法は、アセトンによる沈殿とそれに次ぐメタノール処理、濾過、減圧乾燥による反応生成物の回収を包含し、それにより、透析またはタンジェント濾過（tangential filtration）といった時間がかかり高価である工程を用いる必要なく合成工程の不純物を除去することが可能となり、次いで、最終生成物が凍結乾燥または噴霧乾燥により回収される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
原文に記載なし。
【実施例】
【００１６】
ＮＭＲの実験はBruker Avance 400 instrumentを用いて記録された。約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＫＯＤを１滴用いて化合物をｐＨ１２のＤ２Ｏに溶解した。
【００１７】
６から８ｐｐｍの間の芳香族領域ではエステル化による芳香環のシグナルが観察でき、ヒアルロン酸のメチルのシングレットの非常に強いシグナルは約１．８ｐｐｍで見られた。これらのシグナルの積算により、サンプルにおけるエステル化度が得られる。
【００１８】
実施例１：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（中置換度）の製造（化合物１）
３ｇのヒアルロン酸Ｎａ（ｍｗ４０４；７．９ ｍｅｑ.（モノマー単位）、分子量３００ｋＤ）を９０℃で６０ｍｌのホルムアミドに溶解した。室温に冷却後、１．０５ｍｌのトリエチルアミン（７．５ｍｅｑ.）、ならびに１０ｍｌのホルムアミドに懸濁し、Molecules 2007, 12, p. 2540-2544、化合物１２のようにして製造した０．５ｇのフェルロイルイミダゾリド（ｍｗ２４４；１．９９ｍｅｑ.）を得られた溶液に加えた。
【００１９】
室温で終夜反応させた後、反応混合物を１５ｍｌの５％ＮａＣｌで希釈した。最初は粘稠性の高かった溶液はより流動性の高いものとなり、それを１リットルの無水アセトンに滴下して注いだ。生じた沈殿物を濾取し、４００ｍｌの無水アセトンで再撹拌し、再度濾取し、２００ｍｌの無水メタノールで再び撹拌した。
【００２０】
濾取し、４０℃で減圧乾燥した後、サンプルの無水物（３．１ｇ）を回収した。
【００２１】
このようにして得られた化合物を、ＩＲ、ＮＭＲ分光法および元素分析で解析した。
【００２２】
ＨＡのメチル基のシグナルおよびフェルラ酸のダブレットシグナル間のシグナルの積分中間体（ＮＭＲ）の比を算出することにより、８％の置換度（エステル化）を得た（図１のＮＭＲを参照）。
【００２３】
実施例２：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（低置換度）の製造
実施例１と同じ工程に従い、ただし、ＮａＣｌを加える前の反応時間を２時間のみに短縮し、４％のエステル化度の無水化合物２．８ｇを得た（図２のＮＭＲを参照）。
【００２４】
実施例３：ヒアルロン酸のフェルラ酸エステル（高置換度）の製造
実施例１の工程に従い、ただし、ＮａＣｌを加える前の反応時間を２４時間に延長、イミダゾリドの量を１．９ｇ（７．９ｍｅｑ.）に増加し、１７％のエステル化度の無水化合物３．３ｇを得た（図３のＮＭＲを参照）。
【００２５】
実施例４：ヒアルロン酸のカフェイン酸エステルの製造
カフェイン酸（０．５１ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、０．９２ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を還流状態で１時間維持し、反応混合物を直接次工程に用いた。
【００２６】
ヒアルロン酸ナトリウム（３．０ｇ、７．９２ｍｍｏｌ、モノマー単位）を、砂浴内に置いた2-neck バルーン中において、７０℃で１時間ホルムアミド（６０ｍｌ）に溶解した。得られた粘稠性の無色の溶液を室温に冷却し、ＴＥＡ（１．１ｍｌ、７．９２ｍｍｏｌ）、およびイミダゾリド（約２．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加えた。均一なオレンジ−赤味がかった溶液が得られるまで混合物を撹拌した。数分以内に溶液の粘度および稠度はゼラチン状のオレンジ−赤味がかった（ゴミの様で弾性に富んだ）凝集物が形成される程度に上昇した。室温で終夜静置した後、凝集物をＮａＣｌ溶液（５％ ｗ／ｖ、１５ｍｌ）に加えた。
【００２７】
得られたゲル状物質を２００ｍｌのアセトンで処理し、濾取し、１００ｍｌのメタノールで撹拌しながら２回再懸濁し、濾取し、減圧乾燥し、黄褐色の無水生成物（２．５ｇ）を得た。
【００２８】
約６ｍｇのポリマーの試料を０．７ｍｌのＤ２Ｏ中で膨潤させ、完全に透明で無色のゲル状物質を得た。該ゲル状物質をＮＭＲチューブに移し、分析したところ（図４）、エステル化されたカフェイン酸の芳香族水素に帰属できる６および７．２ｐｐｍの間のダブレットシグナル、および１．８ｐｐｍにおけるメチル基の強いシングレットシグナルを示した。４０％ＮａＯＤ／Ｄ２Ｏを１滴加えることにより、ヒアルロン酸ナトリウムの誘導体化の度合いを定量することが可能となり、７％と同等であることが分かった。
【００２９】
実施例５：酵素的分解に対する抵抗性の評価
表皮における微生物の存在によりそれに関連する生物学的活性が皮膚において発生するが、活性は様々な酵素的機能の形態で示され、その中にヒアルロニダーゼ酵素によるものがある。ヒアルロン酸（ＨＡ）は天然において該酵素により分解されるが、該酵素は、多糖鎖のモノマー単位間のグリコシド１，４−ベータ結合を加水分解することによりヒアルロン酸の分解を触媒する。架橋ＨＡはヒアルロニダーゼの酵素作用に強い抵抗性を有し、かかる抵抗性は架橋度の上昇と共に上昇する。本発明のヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体のような適切な化学構造を有する分子によるＨＡのエステル化により、架橋ＨＡと同様のレオロジー的特性を有しながら良好な水溶性を維持する化合物を得ることができる。
【００３０】
前記の合成で用いたような市販のＨＡのナトリウム塩（分子量３００ｋＤ）、ならびに実施例２および３でそれぞれ記載されるフェルラ酸でエステル化した低エステル化度および高エステル化度のＨＡエステルの２つのサンプルを用いた。
【００３１】
実験は一般的な方法により行われた。
【００３２】
簡潔に述べると、３７℃で維持した、０．１ｍｇ／ｍｌ（ウシ精巣ヒアルロニダーゼ、Ｉ−Ｓ型、Sigma、１０００Ｕ／ｍｇ）と同等の量の酵素を含む多糖類の溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃でインキュベートした。０−２時間の範囲の定期的な間隔で０．５ｍｌのサンプルを採取し、１００℃で５分間置き、濾過して酵素を除去し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー分析により分析した：クロマトグラムの加工により分子量分布を算出した。
【００３３】
酵素とインキュベートしてから３０分後、市販の非エステル化ＨＡは、約３００ｋＤの分子量から約１０分の１の分子量に激しく分解された。実施例２に由来するサンプルは、約４％のエステル化度であり、約６０％分解されたが、実施例３に由来するサンプルでは、平均分子量が約２５０ｋＤに変化するわずかな加水分解過程しか行われなかった。
【００３４】
実施例６：フェルラ酸でエステル化したＨＡのサンプルのレオロジー的研究
本発明の化合物（実施例１の化合物）のレオロジー的挙動を、本発明の化合物のエステルの製造において未加工の出発物質として用いたＨＡのナトリウム塩（分子量３００ｋＤ）のものと比較した。
【００３５】
レオロジー測定は Rotovisco 1-Haake レオメータ、plate/plate システム、Rheowin 323 ソフトウェアを用いて行った。粘度は、０．０１ｓ−１から５００ｓ−１のディスクの速度勾配、「せん断速度」により測定し、サンプルはＮａＣｌ ５％食塩水に２％の量において溶解した。
【００３６】
実施例１に関連するサンプルは擬塑性のレオロジー的挙動を示し、粘度はせん断速度（図５ａおよび図５ｂ参照）と共に増加した。Ostwald de Waeleの関係を適用することにより得られたフローダイヤグラムの算出パラメーターは、それぞれ:Ｋ（Ｐａ.ｓ）、即ち、９．９７＋／−０．５３（ｎ＝３）およびｎ＝０．４７と同等のフローコンシステンシーインデックス（流動性指数、即ち、速度勾配の関数としての対数スケールにおける粘度曲線の傾き）である。
【００３７】
実際、この結果から、フェルラ酸によるＨＡのエステル化により、低せん断において互いに相互作用可能である無視できない非直線形の立体障害構造を有する鎖が提供されるという結論が導かれる。適用するせん断を上昇させることにより、鎖は流れに沿って一直線となる傾向にあり、故に、系はネイティブな挙動に戻ることとなる。
【００３８】
逆に、非修飾ネイティブＨＡは、非常に低いＫ値（Ｋ＝０．４０ Ｐａ.ｓ）である、溶液の典型的なプロファイルを有していた。
【００３９】
実施例７：ヒト活性化好中球におけるフェルラ酸ＨＡ化合物（実施例１）の抗ＲＯＳ活性
本発明の化合物が、ＨＡのエステル化に用いたヒドロキシ−ケイ皮酸物質の抗酸化的、抗ラジカル的なスカベンジング活性を保持できているかを調べた。
【００４０】
インビトロにおいて、化合物１の、ホルボール−ミリステート−アセテート（ＰＭＡ）で活性化したヒト好中球白血球により産生される活性酸素分子（ＲＯＳ）の活性の阻害能を、Luminol（Ｈ２Ｏ２などの酸化剤の存在下において、化学発光を示す物質）の存在下で評価した。
【００４１】
かくして、白血球の細胞懸濁液（１０６細胞／ｍｌ）を、Luminol（５μＭ）の存在下において適切なバッファーに溶解した化合物１と共にインキュベートした。細胞を、３７℃で１０分間、０．０２および０．２ｍＭの化合物１、あるいはネイティブなＨＡのナトリウム塩と共にインキュベートした。その後、細胞を０．１μＭ ＰＭＡで活性化し、２０分間、４分間隔において蛍光リーダーHTS7000（Perkin Elmer）で化学発光をモニターした。
【００４２】
より高濃度の試験濃度において化合物１は最大７８％の阻害を示したが、ＨＡは事実上不活性であり、多糖類にフェルラ酸を導入することにより、出発物質の抗ラジカル活性が低下することが示された。
【００４３】
実施例８：遮光機能を備えたＯ／Ｗソフニング・クリームの製造
本発明の限定されない例として、本発明のエステル誘導体を含み、ガンマ−オリザノールなどの太陽光線（ＵＶＢ）保護指数を付与された物質を添加することにより強化され、故に、発色団部分の作用が統合されたクリーム製剤を製造した。
【００４４】
該製剤は、２％の濃度の実施例１に記載される化合物１を、乳化剤、防腐剤、無痛化剤、および溶剤といった皮膚科学において一般的に用いられる賦形剤、ならびに、太陽光線照射に対し保護作用を有する薬剤、即ちガンマ−オリザノールとの混合物において含有する。
【００４５】
簡潔に述べると、製造方法は以下である：
ａ）油脂相：炭酸ジ−カプリリル、カプリル酸ヤシ油アルキル（coco−caprylate）、ポリ−グリセリル−２−ジポリ−ヒドロキシステアレートおよびフェノキシ−エタノールを撹拌下において約８０℃で加熱することにより溶解し；得られた溶解物に、ガンマ−オリザノールを加えた；
ｂ）水相：水、デヒドロ酢酸ナトリウムおよび化合物１をターボ乳化機に入れ；溶解するまで約６０℃で加熱した後、常に緩やかに撹拌しながら、他の成分、即ち、乳化用混合物ナトリウムラウリルグルコースカルボスシレート／ラウリルグルコシドおよび防腐剤混合物メチルプロパンジオール／フェニルプロパノールを加えた；
ｃ）エマルジョン：油脂相を撹拌下において水相に注ぎ、タービンを１０分間活性化した；反応物を常に撹拌しながら最終的に２０／２５℃の温度まで冷却した。
以下の組成（重量％）を有するクリームが得られた：
【００４６】
実施例９：デルモコスメティック活性の機能アッセイ
皮膚保水性および弾力性といったデルモコスメティックな機能活性を、前記の実施例で示されるプロトタイプ製剤を用い、目的に沿って訓練した志願者の集団において評価した。本実験では、実施例８の製剤の活性を、活性成分を含まない同様の製剤（コントロール）と、４週間、１日２回処置した志願者の２つの群で比較した（Ｔ０およびＴ４ｗの時点）。
【００４７】
ａ）皮膚弾力性：皮膚弾力性の評価は、プローブを皮膚に適用することにより該プローブ内で負の圧力（吸引力）を１秒間発生し、次いで解除する測定装置である「皮膚測定装置」を用いて行った。弾力性は、皮膚に残った変形と皮膚の最大伸張の比により算出した。かかる比は、文献ではパラメーターＲ２として知られ、ストレス事象後に皮膚が元の状態に戻る能力を示す。かかる比が１に近いほど、皮膚の弾力性は高くなる。
【００４８】
実施例８の製剤と関連する処置群では、開始時点のＴ０からＴ４ｗの時点のＲ２パラメーターの百分率変化は２７．５％（ｐ＜０．０５、ｔ検定）であったが、コントロール群におけるその百分率変化は有意なものではなかった。この結果により、本発明の化合物１が、関連する弾力性増強活性を付与されたものであり、同じ賦形剤を用いて製造されたコントロールで処置した群では見られなかったＲ２パラメーターの上昇を引き起こしたことが示された。
【００４９】
ｂ）皮膚保水性：顔の皮膚の水分量は、静電容量の物理的法則に基づき皮膚水分量を測定する装置である「コルネオメーター」で測定した。該装置は、４９ｍｍ２の面積の正方形のセンサーからなる。センサー表面を顔の皮膚の平坦な領域に押し付けることにより、該装置から角質層の水含量に比例する数字が提供される。故に、該数字は、該装置の任意単位であるコルネオメトリー単位（０から１５０ｃ.ｕ.）で表される皮膚表面の皮膚水分量の尺度を提供する。
【００５０】
試験の終了時、実施例８の製剤で処置した群では、４．８％に相当する皮膚水分量の百分率変化の増加が記録されたが、比較に用いたコントロール群では変化は記録されなかった。しかしながら、この増加は有意性の限界に近いことが分かり、これはおそらくは、用いた被験群の比較的少ないメンバー数（ｎ＝１０）による結果である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体とのヒアルロン酸エステル。
【請求項２】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸がフェルラ酸およびカフェイン酸である、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項３】
該ヒアルロン酸の分子量が２０００００から４０００００ダルトンの間である、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項４】
多糖部分におけるカフェイン酸およびフェルラ酸による置換度が２％から２０％の間である、請求項２に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項５】
ヒアルロン酸ナトリウム塩をホルムアミドに溶解し、該塩化合物を、当量の３級塩基の存在下において、先に室温においてカルボニル−ジ−イミダゾール（ＣＤＩ）で活性化したヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体と反応させ、得られた粘稠性の反応物をＮａＣｌ水溶液で希釈し、反応生成物をアセトンで沈殿させて回収し、次いでメタノールで精製し、濾過し、減圧乾燥する、請求項１に記載されるヒアルロン酸（ＨＡ）エステルの製造方法。
【請求項６】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体がフェルラ酸である、請求項５に記載される方法。
【請求項７】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体がカフェイン酸である、請求項５に記載される方法。
【請求項８】
２％から２０％の間を含む所望のエステル化度に応じて、ＣＤＩで活性化された酸がＨＡに対して０．２５から１当量の間の比で存在する、請求項５に記載される方法。
【請求項９】
２％から２０％の間である所望のエステル化度に応じて１から２４時間の間の時間で、ＨＡをＣＤＩで活性化された酸と反応させる、請求項５に記載される方法。
【請求項１０】
創傷、潰瘍、皮膚炎、乾癬、光線照射により誘発される発熱のような皮膚病変の局所的治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１１】
保湿剤、粘弾性増加剤、抗老化剤および抗挫創剤として局所的治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１２】
粘稠性補足剤として関節内治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１３】
請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル、および皮膚科学的に許容される不活性な賦形剤を含む局所組成物。
【請求項１４】
該組成物の０．１重量％から５重量％の間のパーセントのヒアルロン酸エステルを含む、請求項１３に記載される局所組成物。
【請求項１５】
クリーム剤、ジェル剤、軟膏、水性もしくは水アルコール性ローション剤、油／水もしくは水／油型乳剤の剤形である、請求項１３に記載される局所組成物。
【請求項１６】
カルボキシル基がナトリウム塩となっている、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１】
ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体とのヒアルロン酸エステル。
【請求項２】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸がフェルラ酸およびカフェイン酸である、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項３】
該ヒアルロン酸の分子量が２０００００から４０００００ダルトンの間である、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項４】
多糖部分におけるカフェイン酸およびフェルラ酸による置換度が２％から２０％の間である、請求項２に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項５】
ヒアルロン酸ナトリウム塩をホルムアミドに溶解し、該塩化合物を、当量の３級塩基の存在下において、先に室温においてカルボニル−ジ−イミダゾール（ＣＤＩ）で活性化したヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体と反応させ、得られた粘稠性の反応物をＮａＣｌ水溶液で希釈し、反応生成物をアセトンで沈殿させて回収し、次いでメタノールで精製し、濾過し、減圧乾燥する、請求項１に記載されるヒアルロン酸（ＨＡ）エステルの製造方法。
【請求項６】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体がフェルラ酸である、請求項５に記載される方法。
【請求項７】
該ヒドロキシ−ケイ皮酸誘導体がカフェイン酸である、請求項５に記載される方法。
【請求項８】
２％から２０％の間を含む所望のエステル化度に応じて、ＣＤＩで活性化された酸がＨＡに対して０．２５から１当量の間の比で存在する、請求項５に記載される方法。
【請求項９】
２％から２０％の間である所望のエステル化度に応じて１から２４時間の間の時間で、ＨＡをＣＤＩで活性化された酸と反応させる、請求項５に記載される方法。
【請求項１０】
創傷、潰瘍、皮膚炎、乾癬、光線照射により誘発される発熱のような皮膚病変の局所的治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１１】
保湿剤、粘弾性増加剤、抗老化剤および抗挫創剤として局所的治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１２】
粘稠性補足剤として関節内治療に用いるための、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【請求項１３】
請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル、および皮膚科学的に許容される不活性な賦形剤を含む局所組成物。
【請求項１４】
該組成物の０．１重量％から５重量％の間のパーセントのヒアルロン酸エステルを含む、請求項１３に記載される局所組成物。
【請求項１５】
クリーム剤、ジェル剤、軟膏、水性もしくは水アルコール性ローション剤、油／水もしくは水／油型乳剤の剤形である、請求項１３に記載される局所組成物。
【請求項１６】
カルボキシル基がナトリウム塩となっている、請求項１に記載されるヒアルロン酸エステル。
【公開番号】特開２０１２−２４１１９２（Ｐ２０１２−２４１１９２Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１０９７５７（Ｐ２０１２−１０９７５７）
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【出願人】（５９８１０５８２４）ロッタファルム・ソシエタ・ペル・アチオニ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＴＴＡＰＨＡＲＭ Ｓ．ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０９７５７（Ｐ２０１２−１０９７５７）
【出願日】平成２４年５月１１日（２０１２．５．１１）
【出願人】（５９８１０５８２４）ロッタファルム・ソシエタ・ペル・アチオニ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＴＴＡＰＨＡＲＭ Ｓ．ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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